CN101182570A - 一种检测wt1和mdr1基因异常表达的多重定量pcr试剂盒 - Google Patents

一种检测wt1和mdr1基因异常表达的多重定量pcr试剂盒 Download PDF

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CN101182570A CNA2007100314047A CN200710031404A CN101182570A CN 101182570 A CN101182570 A CN 101182570A CN A2007100314047 A CNA2007100314047 A CN A2007100314047A CN 200710031404 A CN200710031404 A CN 200710031404A CN 101182570 A CN101182570 A CN 101182570A
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徐兵
宋小燕
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Abstract

一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量PCR缓冲液，DNA聚合酶，标准品，检测WT1基因的引物和探针，检测MDR1基因的引物和探针组成，其中标准品是重组pMD18载体，该重组载体的外源基因是WT1基因和MDR1基因；检测WT1基因的上游引物是SEQ NO.1，下游引物是SEQ NO.2，探针的核苷酸序列是SEQ NO.3；检测MDR1基因的上游引物是SEQ NO.4，下游引物是SEQ NO.5，探针的核苷酸序列分别是SEQ NO.6。

Description

一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及用于诊断疾病的试剂盒，具体是用于诊断白血病的试剂盒，特别是利用荧光定量PCR诊断白血病的试剂盒。
背景技术
难治复发是导致急性白血病治疗失败的根本原因，目前研究发现某些基因和急性白血病的难治复发存在密切关系，其中最主要的有人类多药耐药基因MDR1基因和Wilm’s瘤I型(WT1)基因，MDR1基因所编码的P糖蛋白(P-gp)可将白血病细胞内药物泵至细胞外，降低细胞内药物蓄积，导致化学治疗的效果下降乃至消失。WT1基因是一种抑癌基因，定位于11p13，所编码的锌指蛋白是序列特异性转录调控因子，具有转录抑制和转录激活的双重作用，研究发现MDR1，WT1基因的异常表达均与难治复发白血病有关，而且发现这两个基因表达水平有明显的相关性，且与临床预后有关，目前关于WT1和MDR1异常表达与难治复发急性白血病关系的研究已成为国内外研究的热点。
目前国内外研究一般是对WT1和MDR1基因进行单独检测，并没有建立对WT1和MDR1基因同时进行检测的体系方法。国内有研究者用PCR分别扩增WT1和MDR1基因，通过琼脂糖凝胶电泳进行半定量分析，研究两种不同的基因在白血病临床耐药中的作用及相互关系，Galimberti S等人应用荧光实时定量PCR分别检测50例AML患者WT1和MDR1基因的表达水平，发现WT1和MDR1基因在表达水平上明显相关。但是，这些检测方法都是存下述缺陷：(1)国内多使用半定量的方法检测WT1和MDR1基因，不能准确地对这两个基因的表达水平进行定量，判断阳性、阴性带有一定的主观性；(2)国外应用Taqman探针法分别检测WT1和MDR1基因，虽能准确地对两者的表达水平进行定量，但是不同反应体系中不同干扰因素对MDR1和WT1基因扩增效率有不同的影响；(3)不同反应管存在加样误差而导致对同一样本MDR1和WT1基因定量结果受到影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可同管检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒具有试剂用量少，大大地节约了成本，缩短检测时间的优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量PCR缓冲液，DNA聚合酶，标准品，检测WT1基因的引物和探针，检测MDR1基因的引物和探针组成，其特征在于：
(1)标准品是重组pMD18载体，其中的外源基因是WT1基因和MDR1基因；
(2)检测WT1基因的引物和探针的核苷酸序列分别是：
WT1-F：5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3(SEQ NO.1)，
WT1-R：5-GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3(SEQ NO.2)，
WT1-探针：5-AAGCTGTCCCACTTA-3(SEQ NO.3)；
(3)检测MDR1基因的引物和探针的核苷酸序列分别是：
MDR1-F：5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3(SEQ NO.4)，
MDR1-R：5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3(SEQ NO.5)，
MDR1-探针：5-ACGTCAGCCTTGGAC-3(SEQ NO.6)。
上述检测WT1基因的探针和检测MDR1基因的探针分别标记有不同的标记物，这些标记物可以是VIC、FAM等；定量PCR缓冲液为常用的或商业化的定量PCR buffer，如PCR buffer(5×)，其成分为：10 mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl2。。
本发明所述的标准品的可由以下方法制备得到：
用RT-PCR法从K562细胞的总RNA中逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA；通过BamHI，BglII酶切后连接成WT1+MDR1重组片断，并对其进行PCR扩增，扩增产物纯化后将其与pMD18载体进行连接，转化宿主菌DH-5α，然后提取重组质粒DNA，即可。
本发明试剂盒检测白血病患者WT1和MDR1基因异常表达是通过多重荧光实时定量PCR实现的，即WT1基因和MDR1基因的扩增是在同一反应管中进行，检测过程如下：
(1)PCR的反应体系的总体积最好为50μl，其中定量PCR buffer(5×)10μl，WT1-F(10μM)1μl，WT1-R(10μM)1μl，WT1-探针(10μM)1μl，MDR1-F(10μM)1μl，MDR1-R(10μM)1μl，MDR1-探针(10μM)1μl，Taq酶(2U/μl)2μl，模板5μl，加水补足至50μl。PCR的反应程序是93℃热启动3min，再按以下的过程循环40次：93℃变性45s，然后降温至55℃退火45s。上述PCR的反应程序也可采用本领域常见的方法表达如下：
                     93℃         3min
(2)本发明试剂盒标准曲线的建立：把质粒按108，107，106，105，104，103，102，101个拷贝进行倍比稀释作为PCR反应的模板按(1)进行多重荧光实时定量PCR，反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b，R2，其中Y表示起始模板拷贝数的对数，X表示C(t)值。
(3)本发明试剂盒检测白血病患者WT1和MDR1基因异常表达的方法是：取患者骨髓单个核细胞，提取总RNA，然后合成cDNA，以cDNA为反应模板按(1)进行多重荧光实时定量PCR。
(4)结果判断：
当检测样品来自于白血病患者，则能扩增出WT1和MDR1基因，WT1和MDR1基因的表达量可通过将C(t)值代入标准曲线方程计算；
当检测样本来自于正常人，则不能扩增出WT1和MDR1基因。
本发明试剂盒采用多重荧光实时定量PCR对白血病患者WT1和MDR1基因异常表达同时进行检测具有以下优点：
(1)标准对照管与待测基因的反应条件相同，消除了不同反应体系中不同干扰因素对MDR1和WT1基因扩增效率的不同影响；
(2)避免由于不同反应管存在加样误差而导致对同一样本MDR1和WT1基因定量结果的影响；
(3)用本发明设计的的内引物对MDR1和WT1基因进行扩增，使扩增片段缩短，减少应用两对相邻引物时的空间位阻效应，实现两个基因的同管扩增，并使扩增效率得到有效的提高；
(4)同时检测MDR1和WT1基因可了解基因之间表达变化的相互关系与难治复发白血病的关系；
(5)如果采用两种质粒相互混合的方法构建标准品，难以做到准确绝对定量，而采用MDR1+WT1重组质粒作为标准品可做到准确绝对定量；
(6)构建MDR1+WT1重组质粒作为标准品可实现同管检测同一样本中MDR1和WT1基因的拷贝数，比分管检测要准确，而且还具有省时，省力，减低成本。
附图说明
图1是PCR扩增mdr1基因的电泳图，其中，M：标准DNA分子量(250bp ladder)；1，2：MDR1 PCR产物。
图2是PCR扩增WT1基因的电泳图，其中，M：标准DNA分子量(250bp ladder)；1～3：WT1 PCR产物。
图3是EcoR1酶切重组质粒的电泳图，其中，M-标准DNA分子量(250bp ladder)；1-小量提取质粒电泳；2-酶切鉴定；3-WT1+MDR1 PCR；4-WT1 PCR产物；5-MDR1 PCR产物；
图4是不同浓度的标准品的定量PCR扩增曲线图，其中1为108拷贝/ml标准品的扩增曲线，2为107拷贝/ml标准品的扩增曲线，3为106拷贝/ml，4为105拷贝/ml标准品的扩增曲线；5为104拷贝/ml标准品的扩增曲线，6为103拷贝/ml标准品的扩增曲线，7为102拷贝/ml标准品的扩增曲线，8为101拷贝/ml标准品的扩增曲线。
图5是不同浓度的标准品的定量PCR扩增MDR1基因曲线图，其中1为108拷贝/ml标准品的扩增曲线，2为107拷贝/ml标准品的扩增曲线，3为106拷贝/ml，4为105拷贝/ml标准品的扩增曲线；5为104拷贝/ml标准品的扩增曲线，6为103拷贝/ml标准品的扩增曲线，7为102拷贝/ml标准品的扩增曲线，8为101拷贝/ml标准品的扩增曲线。
图6是使用本发明试剂盒扩增WT1基因的标准曲线。
图7是使用本发明试剂盒扩增MDR1基因的标准曲线。
图8是本发明试剂盒检测白血病患者骨髓细胞样品的扩增曲线图，其中实线表示WT1基因扩增的标准曲线，虚线表示MDR1基因扩增的标准曲线。
具体实施方式
制备例
本发明试剂盒的组成：Master mix(2×)，标准品，引物WT1-F、WT1-R、MDR1-F和MDR1-R，探针WT1-probe-VIC和MDR1-probe-FAM。其中，
WT1-F：5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3(SEQ NO.1)，
WT1-R：5-GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3(SEQ NO.2)，
MDR1-F：5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3(SEQ NO.3)，
MDR1-R：5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3(SEQ NO.4)，
WT1-probe-VIC：5-AAGCTGTCCCACTTA-3(SEQ NO.5)，
MDR1-probe-FAM：5-ACGTCAGCCTTGGAC-3(SEQ NO.6)；
标准品为含有含有WT1基因和MDR1基因的重组pMD18载体，其制备方法为：
1、3×106K562细胞加TRIZol(Invitrogen公司)1mL，混匀，转置于1.5mL Eppendorf管，15-30℃孵育5min，加入氯仿0.2ml，盖紧盖子，用力摇动15s，15-30℃孵育2-3min，4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5ml Eppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，15-30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心10min，弃上清液，75％乙醇(DEPC处理水配制)洗涤沉淀一次(至少1ml 75％乙醇/ml TRIzol)，4℃7500r/min离心5min，弃乙醇，空气或真空干燥5-10min(不要完全干燥)，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。样品在紫外分光光度计上测定波长为260nm时的吸光度值。浓度计算公式：
浓度(g/L)＝OD260×稀释倍数×40/1000
2、随机六聚体法进行逆转录反应：从K562细胞的总RNA中逆转录为cDNA，反应体系如下：
5×逆转录buffer                              4μl
随机六聚体                                   2μl
dNTPs(25mM)                                  0.8μl
MMLV(10U/μl)                                1μl
DEPC水                                       10μl
RNA模板                                      4μl
总体积：                                     20μl
逆转录buffer成分：50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，4mM MgCl2，10mM DTT
反应条件：37℃1h，然后95℃3分钟。
3、PCR扩增WT1基因(引物为SEQNO.1，2)和MDR1基因片段(引物为SEQ NO.4，5)，PCR的反应条件：取上述cDNA2μl，用引物分别扩增WT1和MDR1。PCR反应体系：
5×缓冲液              10μl
上、下游引物           2μl
dNTP(10Mm)             4μl
Taq酶                  0.5μl
cDNA                   2μl
总体积                 50μl.
用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：以cDNA为模板，WT1和MDR1的上下游引物，经PCR扩增应分别得到297bp，300bp长的目的片段，经15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合，如图1、2所示。
4、通过BamHI，BglII分别酶切WT1、MDR1片断[酶切反应条件：反应缓冲液：100mM NaCl，50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT(pH 7.9 25℃)，37℃温育1小时]，纯化后通过T4连接酶连接[连接条件：反应缓冲液：300mM Tris-HCl(pH 7.8 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP，37℃温育1小时]，利用上述连接产物为模板，通过WT1上游引物与MDR1下游引物(SEQ NO.1、4)进行PCR扩增，扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收、备用。
5、20ul连接反应液含pMD 18-T载体1μl、步骤4所得的连接产物9μl、连接液10μl，于22℃反应30分钟，所得重组DNA质粒转化大肠杆菌DH5α感受态(100μl)，涂布在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB平板培养基上，倒置37℃培养12～16小时，筛选白斑菌落进一步扩增，抽提质粒。并对其进行纯化后将其与pMD18载体进行连接，转化宿主菌DH-5α，然后提取重组质粒DNA。
6、重组质粒DNA的鉴定：
①将步骤5得到的重组质粒DNA，分别用引物SEQ.NO1和2，SEQ.NO4和5以及SEQ.NO1和5扩增WT1，MDR1，WT1+MDR1片段，扩增后进行15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合。以EcoR1酶切(50mM NaCl，100mM Tris-HCl，10mM MgCl2，0.025％Triton X-100(pH7.5 25℃)。37℃温育1小时)重组质粒DNA，经15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示与预期值相符合(图3)。
效果例
下述实验均采用制备例所述的试剂盒进行。
1、本发明试剂盒检测AML患者骨髓中的WT1基因和MDR1基因。
(1)取患者骨髓单个核细胞，提取总RNA，RT-PCR法合成cDNA，作为荧光实时定量PCR的模版，荧光实时定量PCR反应体系为：
5×定量buffer                              10μl
WT1上游引物F：SEQNO.1(10pmol/μl)           1μl
WT1下游引物R：SEQNO.2(10pmol/μl)           1μl
MDR1上游引物F：SEQNO.4(10pmol/μl)          1μl
MDR1下游引物R：SEQ NO.5(10pmol/μl)         1μl
WT1探针：SEQ NO.3                           1μl
MDR1探针：SEQ NO.6                          1μl
dNTPs(10mM)                                 1μl
Taq酶(2U/ul)                                2μl
cDNA                                        5μl
ddH2O                                       26μl
总体积：                                    50μl
其中，PCR buffer成分：10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl2。PCR的反应程序如下：
93℃                   3min
Figure S2007100314047D00061
定量PCR在美国Bio-rad公司生产的iCycler Iq热循环仪中完成，结果采用Opticon Monitor 3.0软件进行分析。
(2)标准曲线的建立：把质粒按108，107，106，105，104，103，102，101个拷贝进行倍比稀释作为PCR反应的模板按上述条件进行多重实时定量PCR，反应结束后计算机自动绘制标准曲线。PCR结果如图4～7所示，WT1基因的标准曲线方程为Y＝-0.3627X+10.52，R2＝0.998，MDR1基因的标准方程为Y＝-0.3831X+10.85，R2＝0.997，其中Y表示起始模板拷贝数的对数，X表示C(t)值。
样本的检测：取患者骨髓单个核细胞，提取总RNA，然后合成cDNA，以cDNA为反应模板按上述条件进行多重荧光实时定量PCR，其中一个样品的检测结果如图7所示。
2、对WT1和MDR1基因进行单独荧光定量PCR检测(传统方法)
(1)取患者骨髓单个核细胞，提取总RNA，RT-PCR法合成cDNA，作为荧光实时定量PCR的模版，荧光实时定量PCR反应体系为：
WT1基因检测：5×定量buffer               10μl
WT1上游引物F：SEQNO.1(10pmol/μl)        1μl
WT1下游引物R：SEQNO.2(10pmol/μl)        1μl
WT1探针：SEQ NO.3                        1μl
dNTPs(10mM)                          1μl
Taq酶(2U/ul)                         2μl
cDNA                                 5μl
ddH2O                                29μl
总体积：                             50μl
MDR1基因检测：5×定量buffer          10μl
WT1上游引物F：SEQNO.1(10pmol/μl)    1μl
WT1下游引物R：SEQNO.2(10pmol/μl)    1μl
WT1探针：SEQ NO.3                    1μl
dNTPs(10mM)                          1μl
Taq酶(2U/ul)                         2μl
cDNA                                 5μl
ddH2O                                29μl
总体积：                             50μl
PCR的反应程序如下：
93℃                  3min
定量PCR在美国Bio-rad公司生产的iCycler Iq热循环仪中完成，结果采用Opticon Monitor 3.0软件进行分析。
(3)标准曲线的建立：把质粒进行倍比稀释作为PCR反应的模板按上述条件进行实时定量PCR，反应结束后计算机自动绘制标准曲线。
样本的检测：取患者骨髓单个核细胞，提取总RNA，然后合成cDNA，以cDNA为反应模板按上述条件分别对WT1和MDR1基因进行单独荧光定量PCR检测。
3、对比结果：通过荧光定量PCR单独检测63例初治AML患者WT1和MDR1基因，及通过多重荧光定量PCR同时检测63例初治AML患者WT1和MDR1基因，其中一部分检测结果如表1所示，通过两种方法所检测同一标本WT1和MDR1基因的拷贝数基本一致，但通过本试剂盒多重荧光实时定量PCR同时检测WT1和MDR1基因的方法，相对于荧光定量PCR单独检测WT1和MDR1基因的方法，此试剂盒更加简便，节约大量时间和试剂。
表1  两种方法检测MDR1和WT1mRNA的结果(拷贝数/μgRNA)
    患者编号     WT1-old     WT1-new     MDR1-old     MDR1-new
    1     52700     52340     286300     286200
    2     42360     42310     452100     452200
    3     512300     512100     789000     789600
    4     20010     20000     180010     180050
    5     101300     101200     219800     219900
    6     79000     79300     562000     562300
    7     56800     56700     432000     423100
    8     12300     12500     56700     56780
    9     432500     432800     198200     199000
    10     798300     798200     56000     56120
    11     980000     983000     690000     691300
    12     156000     157000     12390     12400
说明：WT1-old表示用传统方法检测WT1基因的拷贝数，WT1-new表示WT1-old表示用本发明试剂盒检测WT1基因的拷贝数，MDR1-old表示用传统方法检测MDR1基因的拷贝数，MDR1-new表示用本发明试剂盒检测MDR1基因的拷贝数。
SEQUENCE LISTING
<110>南方医科大学
<120>一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cccaggctgc aataagagat attt                                   24
<210>
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gtgtgcttcc tgctgtgcat                                        20
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
aagctgtccc actta                             15
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caagatcctc ctgctggatg a                      21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gaaccactgc ttcgctttct g                      21
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
acgtcagcct tggac                            15

Claims (2)

1.一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量PCR缓冲液，DNA聚合酶，标准品，检测WT1基因的引物和探针，检测MDR1基因的引物和探针组成，其特征在于：
(1)标准品是重组pMD18载体，其中的外源基因是WT1基因和MDR1基因；
(2)检测WT1基因的引物和探针的核苷酸序列是：
WT1-F：5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3，
WT1-R：5-GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3，
WT1-探针：5-AAGCTGTCCCACTTA-3；
(3)检测MDR1基因的引物和探针的核苷酸序列是：
MDR1-F：5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3，
MDR1-R：5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3，
MDR1-探针：5-ACGTCAGCCTTGGAC-3。
2.一种使用权利要求1所述的试剂盒检测WT1和MDR1基因异常表达的方法，其特征在于将WT1基因和MDR1基因在同一反应管中反应，反应的程序是93℃热启动3min，再按以下的过程循环40次：93℃变性45s，然后降温至55℃退火45s。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102912018A (zh) * 2012-09-29 2013-02-06 童永清 一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒
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