CN112980966A - 一种使用判别分析鉴定待测体液为外周血、月经血、唾液、精液还是阴道分泌液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用判别分析鉴定待测体液为外周血、月经血、唾液、精液还是阴道分泌液的方法。该方法为检测has‑miR‑451a、has‑miR‑214‑3P、has‑miR‑203‑3p、has‑miR‑205‑5P、has‑miR‑144‑5P、has‑miR‑654‑5P、has‑miR‑888‑5P、has‑miR‑891a‑5P和has‑miR‑124‑3P在待测体液中的相对表达量，然后代入Fisher判别函数，判断待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液，准确性可达到100％。本发明为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于法医技术学领域，具体涉及一种使用判别分析鉴定待测体液为外周血、月经血、唾液、精液还是阴道分泌液的方法。
背景技术
通过鉴别案发现场体液斑迹的组织来源，可推断案发现场可能发生过的犯罪活动，从而为案发现场的重建及案件的侦破提供有力的证据支持。案件现场常见的体液包括外周血、月经血、唾液、精液、阴道分泌液等。血液是案发现场最常见也是最重要的检材之一，血液与非血液类样本最大的不同在于血液中含有大量的血细胞，而外周血与月经血虽然均含有大量红细胞，但与外周血相比，月经血中还含有大量的子宫内膜碎片、子宫颈粘液和阴道分泌物等混合物。现场血液类检材是属于外周血还是月经血是非常重要的法庭科学问题，往往对案件定性及重建案发现场、提供法庭证据具有十分重要的意义；尤其是针对性侵案件、女性失踪案以及某些伤害案中，女性受害者称因受暴力攻击出现血尿，在这种情况下，需要确定尿液中的血细胞来源是否存在月经血污染。外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液是案发现场最常见的五种体液，五种体液的鉴别对案发现场重建及案件侦破具有重要意义，目前，五种体液的准确鉴别仍是一个挑战。
miRNA是一类广泛存在于真核细胞中约由18-25个核酸组成的内源性非编码小分子RNA，在生物体内起基因表达调控作用。由于其具有稳定性高、保守性强和组织特异性好等生物学特性，被国内外法医学者认为有很大的潜能成为法医学体液来源鉴别的有力工具。目前已有大量利用miRNA进行体液组织来源鉴别的研究，然而利用miRNA进行法医学体液组织来源鉴别的研究仍存在问题及难点，如不同实验室结果不可重复、唾液与阴道分泌液及外周血与月经血的鉴别困难等。
发明内容
本发明的目的是鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液。
本发明首先保护一种鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的产品，可包括检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂；
所述miRNA组合可为a1)或a2)：
a1)由has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P组成；
a2)包括has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P；
has-miR-451a的核苷酸序列如如SEQ ID NO：1所示；
has-miR-214-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
has-miR-203-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
has-miR-205-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
has-miR-144-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
has-miR-654-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
has-miR-888-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
has-miR-891a-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
has-miR-124-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
所述产品具体可由检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂组成。
所述产品还可包括装置；
所述装置可包括数据输入设备、数据记录模块、数据处理模块1、数据处理模块2、数据比较模块和结论输出模块。
数据输入设备用于输入has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量。
数据记录模块用于存储has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量数值。
数据处理模块1用于以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量作为自变量，根据若干外周血样本、若干唾液样本、若干月经血样本、若干精液样本和若干阴道分泌液样本的数据分别建立外周血Fisher判别函数、唾液Fisher判别函数、月经血Fisher判别函数、精液Fisher判别函数和阴道分泌液Fisher判别函数。Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Differentiation of five body fluids from forensic samples by expressionanalysis of four microRNAs using quantitative PCR.
数据处理模块2用于将待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量分别代入外周血Fisher判别函数、唾液Fisher判别函数、月经血Fisher判别函数、精液Fisher判别函数和阴道分泌液Fisher判别函数，依次得到待测体液的外周血Fisher判别函数值Y1、唾液Fisher判别函数值Y2、月经血Fisher判别函数值Y3、精液Fisher判别函数值Y4和阴道分泌液Fisher判别函数值Y5。
数据比较模块用于比较Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。
结论输出模块用于显示结论，即如果Y1最大，则结论输出模块显示外周血；如果Y2最大，则结论输出模块显示唾液；如果Y3最大，则结论输出模块显示月经血；如果Y4最大，则结论输出模块显示精液；如果Y5最大，则结论输出模块显示阴道分泌液。
所述产品具体可由检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂和所述装置组成。
本发明还保护一种鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的方法，可包括如下步骤：
(1)以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量作为自变量，根据若干外周血样本、若干唾液样本、若干月经血样本、若干精液样本和若干阴道分泌液样本的数据分别建立外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液的Fisher判别函数；
(2)检测待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量并代入步骤(1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的外周血判别函数值、唾液判别函数值、月经血判别函数值、精液判别函数值和阴道分泌液判别函数值；
(3)比较外周血判别函数值、唾液判别函数值、月经血判别函数值、精液判别函数值和阴道分泌液判别函数值，数值最大的判别函数值对应的体液即为待测体液的来源。即如果外周血判别函数值最大，则待测体液为外周血；如果唾液判别函数值最大，则待测体液为唾液；如果月经血判别函数值最大，则待测体液为月经血；如果精液判别函数值最大，则待测体液为精液；如果阴道分泌液判别函数值最大，则待测体液为阴道分泌液。
本发明还保护上述任一所述miRNA组合。
本发明还保护上述任一所述miRNA组合在鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液中的应用。
本发明还保护上述任一所述产品在鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液中的应用。
上述任一所述待测体液可为外周血、唾液、月经血、精液或阴道分泌液。
上述任一所述目的miRNA的表达量可为目的miRNA的相对表达量；目的miRNA为has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P或has-miR-124-3P。所述目的miRNA的相对表达量具体可为目的miRNA相对内参的表达量。所述内参可为RNU6b。
以has-miR-451a为例，检测has-miR-451a的相对表达量步骤如下：
1)以待测体液的Total RNA为模板，以has-miR-451a的特异茎环反转录引物进行逆转录，得到的cDNA；has-miR-451a的特异茎环反转录引物为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA-3’；
2)以步骤1)得到cDNA为模板，采用通用正向扩增引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’和has-miR-451a的特异性反向扩增引物：5’-CGGAAACCGTTACCATTACTGAG-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，即为Cthas-miR-451a；
3)以待测体液的Total RNA为模板，以RNU6b的RT引物进行逆转录，得到的cDNA；RNU6b的RT引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；
4)以步骤3)得到cDNA为模板，采用5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值，即为CtRNU6b；
5)计算has-miR-451a的ΔCt，ΔCt＝Cthas-miR-451a-CtRNU6b，ΔCt即为has-miR-451a的相对表达量(以RNU6b为内参)。
各个miRNA的特异茎环反转录引物的核苷酸序列具体见表2。
各个miRNA的特异性反向扩增引物的核苷酸序列具体见表3。
在本发明的一个实施例中，从北京地区、杭州地区的350个志愿者(年龄在25-35周岁)中获得70份外周血样本、70份唾液样本、70份精液样本、70份月经血样本和70份阴道分泌液样本。以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的ΔCt作为自变量，根据60份外周血样本、60份唾液样本、60份月经血样本、60份精液样本和60份阴道分泌液样本的数据，建立外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液的Fisher判别函数。外周血的Fisher判别函数为：Y1＝-5.248ΔCt(has-miR-451a)+1.391ΔCt(has-miR-888-5P)-0.452ΔCt(has-miR-891a-5P)+2.165ΔCt(has-miR-205-5P)+0.447ΔCt(has-miR-214-3P)+0.434ΔCt(has-miR-124-3P)+4.729ΔCt(has-miR-654-5P)-1.235ΔCt(has-miR-144-5P)+2.088ΔCt(has-miR-203-3p)-96.661。唾液的Fisher判别函数为：Y2＝-0.345ΔCt(has-miR-451a)+0.017ΔCt(has-miR-888-5P)+2.210ΔCt(has-miR-891a-5P)-1.260ΔCt(has-miR-205-5P)-1.256ΔCt(has-miR-214-3P)+1.701ΔCt(has-miR-124-3P)+1.843ΔCt(has-miR-654-5P)+2.980ΔC(has-miR-144-5P)-1.631ΔCt(has-miR-203-3p)-41.779。月经血的Fisher判别函数为：Y3＝-3.583ΔCt(has-miR-451a)+3.676ΔCt(has-miR-888-5P)+1.303ΔCt(has-miR-891a-5P)-0.566ΔCt(has-miR-205-5P)-2.715ΔCt(has-miR-214-3P)+2.172ΔCt(has-miR-124-3P)+4.511ΔCt(has-miR-654-5P)+0.261ΔCt(has-miR-144-5P)-1.465ΔCt(has-miR-203-3p)-68.832。精液的Fisher判别函数为：Y4＝0.244ΔCt(has-miR-451a)-2.487ΔCt(has-miR-888-5P)-0.389ΔCt(has-miR-891a-5P)-0.335ΔCt(has-miR-205-5P)-1.008ΔCt(has-miR-214-3P)+1.702ΔCt(has-miR-124-3P)+2.840ΔCt(has-miR-654-5P)+2.880ΔCt(has-miR-144-5P)-0.223ΔCt(has-miR-203-3p)-37.295。阴道分泌液的Fisher判别函数为：Y5＝0.042ΔCt(has-miR-451a)+0.291ΔCt(has-miR-888-5P)+1.880ΔCt(has-miR-891a-5P)-2.192ΔCt(has-miR-205-5P)+0.370ΔCt(has-miR-214-3P)-0.336ΔCt(has-miR-124-3P)+2.703ΔCt(has-miR-654-5P)+2.756ΔCt(has-miR-144-5P)-2.127ΔCt(has-miR-203-3p)-44.448。
本发明的发明人使用九种miRNA(has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P)，收集五种法医学常见体液(即外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液)，采用SYBRGreen荧光实时定量PCR技术检测目标分子在样本中的相对表达量。通过对检测结果统计分析，建立了基于Fisher判别函数的外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液鉴别策略，即通过检测has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P在待测体液中的相对表达量数值，判别待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液，准确性可达到100％。本发明为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为300份训练集样本10种miRNA的ΔCt平均值结果箱式图。PB：外周血；MB：月经血；SA：唾液；SE：精液；VA：阴道分泌液。
图2为10种miRNA经Bonferroni校正法进行体液间两两比较结果距离网络图。PB：外周血；MB：月经血；SA：唾液；SE：精液；VA：阴道分泌液。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，所有引物均有sangon公司合成。miRNeasy Mini Kit为德国Qiagen公司的产品。Nanodrop2000c为美国Thermo Scientific公司的产品。QuantStudioTM7 FlexReal-Time PCR System为美国Applied Biosystems公司的产品。Power SYBR GreenPCRMaster Mix(2×)为Applied Biosystems公司的产品。5×First-Strand Buffer、DTT(0.1M)和M-MLV Reverse Transcriptase(200U/μL)均为invitrogen公司的产品。dNTPMixture和无核酸酶水为TaKaRa公司的产品。Recombinant 
RNase Inhibitor为Promega公司的产品。M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒为美国Invitrogen公司的产品。
下述实施例中，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
下述实施例中，10种miRNA的名称和核苷酸序列如表1中第2行至第11行所示，RNU6b的核苷酸序列如表1中第12行所示。
表1
| 目的miRNA | 核苷酸序列(5’-3’) | 在序列表中的位置 |
| has-miR-451a | AAACCGUUACCAUUACUGAGUU | SEQ ID NO：1 |
| has-miR-214-3P | ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU | SEQ ID NO：2 |
| has-miR-203-3p | GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG | SEQ ID NO：3 |
| has-miR-205-5P | UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG | SEQ ID NO：4 |
| has-miR-144-5P | GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAG | SEQ ID NO：5 |
| has-miR-654-5P | UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC | SEQ ID NO：6 |
| has-miR-888-5P | UACUCAAAAAGCUGUCAGUCA | SEQ ID NO：7 |
| has-miR-891a-5P | UGCAACGAACCUGAGCCACUGA | SEQ ID NO：8 |
| has-miR-124-3P | UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA | SEQ ID NO：9 |
| has-miR-144-3P | UACAGUAUAGAUGAUGUACU | SEQ ID NO：10 |
| RNU6b | CTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT | 无 |
实施例、
一、样本采集
350份样本来自北京地区、杭州地区的350个志愿者(年龄在25-35周岁之间)。350个志愿者为无关个体，且均知情同意。
样本编号为PB1-PB70的70份样本均为外周血样本。70份外周血样本为抽取部分志愿者手臂处静脉血获得，-80℃保存。
样本编号为MB1-MB70的70份样本均为月经血样本。70份月经血样本为部分志愿者用卫生棉条在月经周期前4天采集，室温晾干1天后-80℃保存。
样本编号为SA1-SA70的70份样本均为唾液样本。70份唾液样本为将部分志愿者唾液收集在无菌塑料管中获得(收集前志愿者禁食1h)，-80℃保存。
样本编号为SE1-SE70的70份样本均为精液样本。70份精液样本为将部分志愿者新鲜精液收集在无菌广口塑料杯中获得(收集前志愿者禁欲2天)，-80℃保存。
样本编号为VA1-VA70的70份样本均为阴道分泌液样本。70份阴道分泌液样本为部分志愿者用卫生棉条在非月经期采集，室温晾干1天后-80℃保存。
二、cDNA的获得
1、采用miRNeasy Mini Kit分别提取350份样本的Total RNA，得到350份样本的Total RNA。
2、完成步骤1后，分别取(少量)350份样本的Total RNA进行琼脂糖凝胶电泳(目的为检测350份样本的Total RNA的完整性)。
3、完成步骤2后，取350份样本的Total RNA，使用Nanodrop2000c进行定量(即测量350份样本的Total RNA的浓度)。
4、完成步骤3后，分别以350份样本的Total RNA为模板(含100ng RNA)，采用M-MLVReverse Transcriptase反转录试剂盒进行逆转录，得到相应的cDNA。进行逆转录的RT引物分别为表2中的特异茎环反转录引物。
表2
| 目的miRNA | 特异茎环反转录引物的核苷酸序列(5’-3’) |
| has-miR-451a | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA |
| has-miR-214-3P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC |
| has-miR-203-3p | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG |
| has-miR-205-5P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGACT |
| has-miR-144-5P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTACA |
| has-miR-654-5P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCACAT |
| has-miR-888-5P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGACTG |
| has-miR-891a-5P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTG |
| has-miR-124-3P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT |
| has-miR-144-3P | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTACA |
| RNU6b | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
逆转录的反应体系为20μL，由1μL特异茎环反转录引物、4μL 5×First-StrandBuffer、2μL DTT(0.1M)、0.5μL dNTP Mixture、1μL反转录酶M-MLV、0.2μL Recombinant
RNase Inhibitor(40U/μL)、无核酸酶水和模板组成。
逆转录的反应条件：16℃30min，37℃30min，65℃5min，4℃保存。
以无核酸酶水为模板，采用M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒进行逆转录，作为阴性对照，用于排除cDNA合成时外源基因组RNA的污染。
三、基于9种miRNA的相对表达量鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的方法
目的miRNA为has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P或has-miR-144-3P。
1、实时荧光定量PCR检测
分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用正向扩增引物和相应的目的miRNA的特异性反向扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)。通过实时荧光定量PCR检测目的miRNA的相对表达量(以RNU6b为内参)。实时荧光定量PCR在QuantStudioTM7Flex Real-Time PCR System上进行。通用正向扩增引物和特异性反向扩增引物的核苷酸序列见表3。检测RNU6b的引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
表3
| 核苷酸序列(5’-3’) | |
| 通用正向扩增引物 | GTGCAGGGTCCGAGGT |
| has-miR-451a的特异性反向扩增引物 | CGGAAACCGTTACCATTACTGAG |
| has-miR-214-3P的特异性反向扩增引物 | TGATGACAGCAGGCACAGACA |
| has-miR-203-3p的特异性反向扩增引物 | CCCGTGAAATGTTTAGGACCA |
| has-miR-205-5P的特异性反向扩增引物 | AGATCTCCTTCATTCCACCGG |
| has-miR-144-5P的特异性反向扩增引物 | CCGTAGCGGGATATCATCATATAC |
| has-miR-654-5P的特异性反向扩增引物 | ATATGGTGGGCCGCAGAA |
| has-miR-888-5P的特异性反向扩增引物 | CGTCTCATACTCAAAAAGCTGTCAG |
| has-miR-891a-5P的特异性反向扩增引物 | ACAACTGCAACGAACCTGAGC |
| has-miR-124-3P的特异性反向扩增引物 | ATCTCACTAAGGCACGCGGT |
| has-miR-144-3P的特异性反向扩增引物 | CGCGCCTTACAGTATAGATGATG |
实时荧光定量PCR的反应体系见表4。
表4
| 组分 | 体积 |
| Power SYBR GreenPCR Master Mix(2×) | 5μL |
| 通用正向扩增引物(浓度为10μM) | 0.25μL |
| 特异性反向扩增引物(浓度为10μM) | 0.25μL |
| 无核酸酶水 | 4μL |
| 模板 | 0.5μL |
实时荧光定量PCR的反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环；95℃15s；60℃1min条件下分析熔解曲线。
将步骤二得到的cDNA替换为无核酸酶水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
结果表明，目的miRNA的熔解曲线均呈现单一峰。
2、将步骤1得到的实时荧光定量PCR的结果通过QuantStudioTM Real-Time PCRSoftware V1.3(美国Thermo Fisher Scientific公司的产品)输出，即每个样本的Ct值。Ct值越小，目的miRNA的表达量越高(经统计分析，将Ct值大于35视作不表达)。同时计算目的miRNA的ΔCt，ΔCt＝Ct目的miRNA-CtRNU6b。ΔCt即为目的miRNA的相对表达量(以RNU6b为内参)。
350份样本的目的miRNA的ΔCt见表5。
表5
注：1为has-miR-451a的ΔCt，2为has-miR-214-3P的ΔCt，3为has-miR-203-3p的ΔCt，4为has-miR-205-5P的ΔCt，5为has-miR-144-5P的ΔCt，6为has-miR-654-5P的ΔCt，7为has-miR-888-5P的ΔCt，8为has-miR-891a-5P的ΔCt，9为has-miR-124-3P的ΔCt，10为has-miR-144-3P的ΔCt。
3、训练集样本和测试集样本的获得
训练集样本共300份，由60份外周血样本、60份唾液样本、60份精液样本、60份月经血样本和60份阴道分泌液样本组成。各个样本均从步骤一采集的样本中随机选取。60份外周血样本组成外周血样本组。60份唾液样本组成唾液样本组。60份精液样本组成精液样本组。60份月经血样本组成月经血样本组。60份阴道分泌液样本组成阴道分泌液样本组。
测试集样本共50份，由剩余的10份外周血样本、剩余的10份唾液样本、剩余的10份精液样本、剩余的10份月经血样本和剩余的10份阴道分泌液样本组成。
4、将训练集样本ΔCt值结果进行正态分布检验(Shapiro-Wilks检验)；服从正态分布的计量资料，同时进行方差齐性检验；若服从方差齐性，则采用均数±标准差描述，采用单因素方差分析；对于不服从正态分布或不服从方差齐性的计量资料，采用中位数(四分位间距)描述，采用非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)分析，组间进一步两两比较采用Bonferroni校正法。
正态分布检验结果表明，仅has-miR-144-5P的各组样本服从正态分布，P值均大于0.05，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P均有组样本不服从正态分布。对has-miR-144-5P进行方差齐性检验，结果显示has-miR-144-5P不服从方差齐性(p<0.05)。因此，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P均采用非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)分析。
非参数检验分析结果见图1(纵坐标ΔCt为目的miRNA的ΔCt，横坐标为体液类型，圆圈表示超过四分位间距1.5倍的离群值，星星表示超过四分位间距3倍的离群值，miR-451a为has-miR-451a，miR-144-3P为has-miR-144-3P，miR-891a-5P为has-miR-891a-5P，miR-888-5P为has-miR-888-5P，miR-205-5P为has-miR-205-5P，miR-214-3P为has-miR-214-3P，miR-124-3P为has-miR-124-3P，miR-654-5P为has-miR-654-5P，miR-144-5P为has-miR-144-5P，miR-203-3p为has-miR-203-3p)。结果表明，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P均至少有一组体液间表达差异具有统计学意义。
采用Bonferroni校正法进行组间两两比较，以确定具体哪两种体液间存在有意义的表达差异。has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P经Bonferroni校正法进行体液间两两比较结果距离网络图见图2(节点代表体液类型，节点旁数值代表该组的平均秩次(平均秩次即为将数据从小到大排序并编号之后序号的平均数。对于元素互不相同的一组数据，设数据个数为n，则其平均秩次即为n/2(n为偶数)或(n+1)/2(n为奇数)，若有相同元素，则需手工计算平均秩次。如数据5、6、7、7、7、9，其秩次为1、2、3、3、3、6；平均秩次即为(1+2+3+3+3+6)/6＝18/6＝3。Kruskal-Wallis法属秩和检验，考察各组秩的均值是否存在显著差异)；连接线代表两两比较的结果，灰色连接线代表两组间差异不具有统计学意义，连接线代表两组差异具有统计学意义，miR-451a为has-miR-451a，miR-144-3P为has-miR-144-3P，miR-891a-5P为has-miR-891a-5P，miR-888-5P为has-miR-888-5P，miR-205-5P为has-miR-205-5P，miR-214-3P为has-miR-214-3P，miR-124-3P为has-miR-124-3P，miR-654-5P为has-miR-654-5P，miR-144-5P为has-miR-144-5P，miR-203-3p为has-miR-203-3p)。结果显示，has-miR-451a除了在外周血与月经血之间、唾液与阴道分泌液之间、阴道分泌液与精液间之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-144-3P除了在外周血与月经血之间、唾液与阴道分泌液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-888-5P和has-miR-891a-5P除了在外周血与月经血之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-205-5P除了在月经血与唾液之间、唾液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-214-3P除了在月经血与唾液之间、月经血与精液之间、唾液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-124-3P除了在外周血与月经血之间、唾液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-654-5P除了在唾液与阴道分泌液之间、唾液与精液之间、阴道分泌液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-144-5P除了在外周血与月经血之间、唾液与精液之间、阴道分泌液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义；has-miR-203-3p除了在月经血与唾液之间、月经血与精液之间、唾液与精液之间表达差异不具有统计学意义，其余体液间表达差异均具有统计学意义。由此可见，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P在五种体液间具有不同程度的鉴别能力。
5、筛选对五种体液的鉴别分类有显著影响的miRNA标记
采用逐步判别法筛选对五种体液的鉴别分类有显著影响的miRNA标记。实验的实质是多变量检验，因此采用了Wilks’lambda逐步判别法，即方差分析阈值法。当方差分析的F值小于删除值(2.71)时，数据变量从判别函数中删除；当方差分析的F值大于输入值(3.84)时，数据变量留在判别函数中。在逐步判别分析中，以月经血、外周血、唾液、精液和阴道分泌液作为因变量，训练集中has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P、has-miR-124-3P和has-miR-144-3P的ΔCt作为自变量，逐一引入判别函数，在每一步中都引入了对剩余变量的判别分析影响最大的变量。逐步判别结果显示：除has-miR-144-3P外，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P被引入判别函数，结果具有统计学意义。
6、基于9种miRNA的相对表达量鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的方法
(1)以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的ΔCt作为自变量，以60份外周血样本、60份唾液样本、60份月经血样本、60份精液样本和60份阴道分泌液样本的数据作为训练集，建立外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液的Fisher判别函数(Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Differentiation of five body fluids from forensicsamples by expression analysis of four microRNAs using quantitative PCR)。
外周血的Fisher判别函数为：Y1＝-5.248ΔCt(has-miR-451a)+1.391ΔCt(has-miR-888-5P)-0.452ΔCt(has-miR-891a-5P)+2.165ΔCt(has-miR-205-5P)+0.447ΔCt(has-miR-214-3P)+0.434ΔCt(has-miR-124-3P)+4.729ΔCt(has-miR-654-5P)-1.235ΔCt(has-miR-144-5P)+2.088ΔCt(has-miR-203-3p)-96.661
唾液的Fisher判别函数为：Y2＝-0.345ΔCt(has-miR-451a)+0.017ΔCt(has-miR-888-5P)+2.210ΔCt(has-miR-891a-5P)-1.260ΔCt(has-miR-205-5P)-1.256ΔCt(has-miR-214-3P)+1.701ΔCt(has-miR-124-3P)+1.843ΔCt(has-miR-654-5P)+2.980ΔC(has-miR-144-5P)-1.631ΔCt(has-miR-203-3p)-41.779
月经血的Fisher判别函数为：Y3＝-3.583ΔCt(has-miR-451a)+3.676ΔCt(has-miR-888-5P)+1.303ΔCt(has-miR-891a-5P)-0.566ΔCt(has-miR-205-5P)-2.715ΔCt(has-miR-214-3P)+2.172ΔCt(has-miR-124-3P)+4.511ΔCt(has-miR-654-5P)+0.261ΔCt(has-miR-144-5P)-1.465ΔCt(has-miR-203-3p)-68.832
精液的Fisher判别函数为：Y4＝0.244ΔCt(has-miR-451a)-2.487ΔCt(has-miR-888-5P)-0.389ΔCt(has-miR-891a-5P)-0.335ΔCt(has-miR-205-5P)-1.008ΔCt(has-miR-214-3P)+1.702ΔCt(has-miR-124-3P)+2.840ΔCt(has-miR-654-5P)+2.880ΔCt(has-miR-144-5P)-0.223ΔCt(has-miR-203-3p)-37.295
阴道分泌液的Fisher判别函数为：Y5＝0.042ΔCt(has-miR-451a)+0.291ΔCt(has-miR-888-5P)+1.880ΔCt(has-miR-891a-5P)-2.192ΔCt(has-miR-205-5P)+0.370ΔCt(has-miR-214-3P)-0.336ΔCt(has-miR-124-3P)+2.703ΔCt(has-miR-654-5P)+2.756ΔCt(has-miR-144-5P)-2.127ΔCt(has-miR-203-3p)-44.448
经检测，判别函数自身验证准确率达99.7％，交叉验证准确率达99.3％。
(2)完成步骤(1)后，将待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的ΔCt分别代入外周血的Fisher判别函数、唾液的Fisher判别函数、月经血的Fisher判别函数、精液的Fisher判别函数和阴道分泌液的Fisher判别函数，依次得到判别函数值Y1、Y2、Y3、Y4和Y5；比较判别函数值Y1、Y2、Y3、Y4和Y5，最大判别函数值对应的体液即为待测体液的来源；即如果Y1最大，则待测体液为外周血；如果Y2最大，则待测体液为唾液；如果Y3最大，则待测体液为月经血；如果Y4最大，则待测体液为精液；如果Y5最大，则待测体液为阴道分泌液。
7、步骤6建立的方法的准确度验证
将步骤6中(2)的“待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3PΔCt”分别替换为50份测试集样本的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3PΔCt，其它步骤均不变，根据结果验证步骤6建立的方法的准确度。
结果见表6。10份外周血样本均被鉴定为外周血，10份月经血样本均被鉴定为月经血，10份唾液样本均被鉴定为唾液，10份阴道分泌液样本均被鉴定为阴道分泌液，10份精液样本均被鉴定为精液。由此可见，步骤6建立的鉴定待测体液为月经血、外周血、唾液、精液还是阴道分泌液准确率高，准确率达到100％。
表6
注：n表示样本数。
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种使用判别分析鉴定待测体液为外周血、月经血、唾液、精液还是阴道分泌液的方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
aaaccguuac cauuacugag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acagcaggca cagacaggca gu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gugaaauguu uaggaccacu ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ggauaucauc auauacugua ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
uggugggccg cagaacaugu gc 22
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
uacucaaaaa gcugucaguc a 21
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ugcaacgaac cugagccacu ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
uacaguauag augauguacu 20
Claims (10)
1.一种鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的产品，包括检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂；
所述miRNA组合为a1)或a2)：
a1)由has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P组成；
a2)包括has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P；
has-miR-451a的核苷酸序列如如SEQ ID NO：1所示；
has-miR-214-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
has-miR-203-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
has-miR-205-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
has-miR-144-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
has-miR-654-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
has-miR-888-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
has-miR-891a-5P的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
has-miR-124-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
2.如权利要求1所述的产品，其特征在于：所述产品还包括装置；
所述装置包括数据输入设备、数据记录模块、数据处理模块1、数据处理模块2、数据比较模块和结论输出模块；
数据输入设备用于输入has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量；
数据记录模块用于存储has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量数值；
数据处理模块1用于以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量作为自变量，根据若干外周血样本、若干唾液样本、若干月经血样本、若干精液样本和若干阴道分泌液样本的数据分别建立外周血Fisher判别函数、唾液Fisher判别函数、月经血Fisher判别函数、精液Fisher判别函数和阴道分泌液Fisher判别函数；
数据处理模块2用于将待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量分别代入外周血Fisher判别函数、唾液Fisher判别函数、月经血Fisher判别函数、精液Fisher判别函数和阴道分泌液Fisher判别函数，依次得到待测体液的外周血Fisher判别函数值Y1、唾液Fisher判别函数值Y2、月经血Fisher判别函数值Y3、精液Fisher判别函数值Y4和阴道分泌液Fisher判别函数值Y5；
数据比较模块用于比较Y1、Y2、Y3、Y4和Y5；
结论输出模块用于显示结论，即如果Y1最大，则结论输出模块显示外周血；如果Y2最大，则结论输出模块显示唾液；如果Y3最大，则结论输出模块显示月经血；如果Y4最大，则结论输出模块显示精液；如果Y5最大，则结论输出模块显示阴道分泌液。
3.一种鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液的方法，包括如下步骤：
(1)以外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液作为因变量，has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量作为自变量，根据若干外周血样本、若干唾液样本、若干月经血样本、若干精液样本和若干阴道分泌液样本的数据分别建立外周血、唾液、月经血、精液和阴道分泌液的Fisher判别函数；
(2)检测待测体液的has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P和has-miR-124-3P的表达量并代入步骤(1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的外周血判别函数值、唾液判别函数值、月经血判别函数值、精液判别函数值和阴道分泌液判别函数值；
(3)比较外周血判别函数值、唾液判别函数值、月经血判别函数值、精液判别函数值和阴道分泌液判别函数值，数值最大的判别函数值对应的体液即为待测体液的来源。
4.权利要求1中所述miRNA组合。
5.权利要求1中所述miRNA组合在鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液中的应用。
6.权利要求1或2所述的产品在鉴定待测体液为外周血、唾液、月经血、精液还是阴道分泌液中的应用。
7.如权利要求1或2所述的产品、或、权利要求3所述的方法、或、权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述待测体液为外周血、唾液、月经血、精液或阴道分泌液。
8.如权利要求1、2或7所述的产品、或、权利要求3或7所述的方法，其特征在于：目的miRNA的表达量为目的miRNA的相对表达量；
目的miRNA为has-miR-451a、has-miR-214-3P、has-miR-203-3p、has-miR-205-5P、has-miR-144-5P、has-miR-654-5P、has-miR-888-5P、has-miR-891a-5P或has-miR-124-3P。
9.如权利要求8所述的产品或方法，其特征在于：所述目的miRNA的相对表达量为目的miRNA相对内参的表达量。
10.如权利要求9所述的产品或方法，其特征在于：所述内参为RNU6b。
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