KR101151690B1

KR101151690B1 - 비만 치료 대상을 선별하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR101151690B1
Application number: KR1020100084030A
Authority: KR
Inventors: 최형균; 차연수; 채수완
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2012-06-14
Also published as: KR20120020420A

Abstract

본 발명은 비만 치료 대상을 선별하는 방법 및 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상을 선별하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 바이오마커로서 하이포잔틴을 사용하여 다양한 유전적, 환경적 차이를 지닌 치료 대상 후보군으로부터 비만 치료 대상체를 정확하게 선별할 수 있다.

Description

비만 치료 대상을 선별하는 방법 및 조성물{Method and Composition for Screening Subject for Obesity Treatment}

본 발명은 비만 치료 대상을 선별하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 후보자의 생물학적 시료 내 하이포잔틴(hypoxanthine)의 양을 측정하여 비만 치료가 가능한 대상을 선별하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.

전세계적으로 비만 인구는 증가 추세에 있으며, 비만은 고혈압, 당뇨병, 골관절염, 뇌졸중 및 암을 일으킬 수 있기 때문에 사회 경제적 측면에서 심각한 문제로 여겨지고 있다[1,2].

종전 연구에 따르면, 비만은 지질단백질(lipoprotein) 대사에 현저한 영향을 미쳐 저-밀도 지질단백질(LDL) 및 총 콜레스테롤(TC) 레벨의 상승을 야기하는 것으로 알려지고 있다[3].

혈중 LDL 및 TC 레벨이 상승하는 고지혈증은 그 발생원인에 따라 LDL 및 TC의 합성이나 분해과정에 1차적인 결함이 있어서 유발되는 1차성(원발성)고지혈증과 다른 질환에 의하여 혈청지단백이 증가되어 발생하는 2차성(속발성) 고지혈증으로 분류하기도 하는데 원발성고지혈증에는 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 복합지단백혈증, 가족성 고중성지방혈증 등이 있고, 속발성 고지혈증에는 갑상선기능저하증, 당뇨병, 신부전증, 간외담도의 폐색, 홍반성 낭창(SLE), 술(alcohol), 스테로이드(steroid), 구임?피임약, 비만증 등에 의한 것이 있다.

콜레스테롤 생합성 과정중 HMG-CoA(3-hydroxy-methyl glutaryl coenzyme A)로 부터 메발로네이트(mevalonate)로 전화시키는 효소인 HMG-Co A 리덕타제는 콜레스테롤 합성속도의 율속효소이며 간장 중 HMG-CoA 리덕타제 활성의 저하는 간장 LDL-수용체의 활성을 증가시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 작용기전이 알려져 있어 관련 질환의 치료에 널리 이용되고 있다.

혈청 콜레스테롤 강하제로서는 담즙산 결합수지계통과 콜레스테롤 합성 억제제, 니코틴산과 유도체 및 probucol이 있으며, 이들 중 콜레스테롤 합성억제제인 simvastatin이나 lovastatin 제제가 HMG-CoA 리덕타제를 억제함과 동시에 LDL 수용체 mRNA 발현을 유발시켜 혈중 콜레스테롤을 낮추는 효과가 있는 것으로 알려지고 있다.

이러한 콜레스테롤 합성 저해제들 뿐만 아니라 최근 들어 장기 복용에 적합하면서 콜레스테롤 저하기능성이 우수한 천연물질에 대한 조명이 이루어지고 있다.

고추장(Fermented red pepper paste(FRPP), CODEX 규격번호 294R-2009)은 가장 널리 알려진 한국의 전통 음식 중 하나로서 쌀, 메주, 소금 및 고춧가루로 만들며, 수개월 이상 발효시킨다. 고추장의 독특한 향, 맛 및 색깔은 발효과정에서의 박테리아, 이스트 및 곰팡이와 같은 미생물 작용에 따른 것이다[5,6].

고추장의 항비만 효과에 관하여 동물 모델 및 세포 배양 연구가 수차례 있어왔다. 고추장 투여 후 지방세포 및 혈청 내 지방 레벨의 감소를 보고한 문헌[7]이 있으며, 고추장이 에너지 소비량을 증가시켜 신체 내 지방 축적 감소 결과를 나타냄을 보고한 문헌도 있다[8]. 또 다른 연구에 따르면, 고추장을 3T3-L1 지방세포에 투여하자 지방세포분화 및 지방분해 조절에 의해 지방 축적이 감소되었다고 한다[9]. 그러나 이들 연구들은 인간보다는 다른 동물 및 세포 데이터 분석에 초점을 맞추었다.

인간은 유전적, 환경적 차이로 인한 다양한 대사 조절 시스템을 가지고 있다. 따라서, 영양중재의 효과는 개개인에 특수한 것일 수 있다[10]. 혈중 지질농도는 인종, 성별, 나이, 지역적 기후조건과 음식 등 환경요인에 따라 차이가 있으며, 이렇한 다양한 유전 및 환경 요인 때문에 혈중 지질농도를 조절하는 것으로 알려진 비만치료제라 하더라고 각 개인에 미치는 영향은 상이할 수 있으며, 특히 천연물에 기반을 둔 다양한 비만 치료제들의 생화학적 효능은 아직까지 밝혀지지 않았기 때문에, 어느 개인에게 그 효과가 나타날 지 여부를 예측하는 것은 더욱 어려운 일이라 할 것이다.

독성 스크리닝, 약물 대사 및 식품을 포함하는 다양한 천연물의 생화학적 효능을 밝히는 데에 있어 대사체학적 접근이 사용되어 왔다[1113]. 콜레스테롤의 80％ 이상이 간에서 합성되며 식품으로부터의 흡수량은 상대적으로 크지 않은 점과 LDL, 콜레스테롤 수용체의 수에 의한 영향이 클 수 밖에 없음을 고려할 때 비만 치료제의 기능성은 콜레스테롤의 생합성 저해활성 및 콜레스테롤 흡수억제 효과가 중요한 결정요인이 될 수 있으며 비만에 있어서 혈중 LDL 및 TC 레벨의 상승은 대사의 비정상화가 주요 요인이 되는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 비만에 있어서 혈중 LDL 및 TC 레벨의 상승과 관련한 대사연구는 무엇보다 중요하다고 할 것이다.

상기 연구들에 있어, 소변은 대사체학 연구의 유용한 샘플로 밝혀졌다[14]. 김(Kim) 등은 래트를 정상식 저열량군, 정상식 고열량군, 고지방식 저열량군 및 고지방식 고열량군의 4 그룹으로 분류하고 소변 내 대사체간 차이점을 조사하였고[15], 아키라(Akira) 등은 자연 발생 고혈압의 어린 래트를 가지고 고혈압 초기 단계에서의 소변 대사 프로파일 특성을 기술하였으며[16], 윌리암(William) 등은 ¹H-핵 자기 공명(NMR)-기초 대사체학 기술을 이용하여 자성 및 웅성 비만 래트의 대사 지문을 결정하였다[17]. 그 뿐만 아니라, 다른 생물학적 유체(예컨대 혈청) 및 조직의 대사적 지문 연구에 있어서, 다-변수 통계적 분석법과 결합시킨 대사체학의 성공적 적용 사례가 다수 존재한다[18,19].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 비만치료제의 인간 대상체에 대한 혈중 지질 농도 조절 활성 효능 여부를 예측할 수 있는 바이오마커의 발굴을 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과 비만 치료 대상체 스크리닝의 바이오마커로서 하이포잔틴이 사용될 수 있음을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 비만 치료 대상을 선별하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상을 선별하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 후보자의 생물학적 시료 내 하이포잔틴(hypoxanthine)의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 하이포잔틴의 양을 대조군 생물학적 시료 내 하이포잔틴 양과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 후보자의 하이포잔틴 양이 대조군의 하이포잔틴 양 보다 낮은 경우 상기 비만 치료제의 비만 치료 대상으로 판정하는 비만 치료 대상(subject)을 선별하는 방법을 제공한다. 여기에서 상기 비만 치료제는 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol: TC) 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 것이다.

본 발명에 사용되는 하이포잔틴은 자연적으로 발생하는 퓨린 유도체로서, 그 IUPAC 네임은 1H-퓨린-6(9H)-온(1H-purin-6(9H)-one)이다. 하이포잔틴은 퓨린 분해과정에서 자주 발생되는 물질로서 잔틴 옥시도리덕타제의 작용에 의해 잔틴으로부터 형성되며, 또한 아데닌의 자발적인 탈아민화(deamination)에 의해 발생되기도 한다.

본 발명에 사용되는 후보자의 생물학적 시료는 생체 내 하이포잔틴의 양을 측정할 수 있는 시료로서 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 복수 또는 양막액일 수 있으며, 바람직하게는 후보자의 소변 샘플을 사용할 수 있다.

상기 하이포잔틴 양은 전압전류법, HPLC(High-performance liquid chromatography), 효소발색법, ¹H-핵 자기 공명(¹H-NMR) 분석법, 직교부분최소자승판별 분석법(Orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis) 등으로 측정할 수 있으며, 하이포잔틴 양의 측정방법은 문헌에 자세히 설명되어 있다(WO2008/056990, METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING HYPOXANTHINE IN BIOLOGICAL SAMPLES; 및 WO2007/091033, PORTABLE KIT AND METHOD FOR THE ESTIMATION OF TIME OF DEATH OF A CORPSE BY DETERMINING THE HYPOXANTHINE CONCENTRATION IN THAT CORPSE DEPENDENT ON TEMPERATURE AND TIME).

본 발명에 사용되는 대조군 생물학적 시료는 비만 치료제 투여 전후의 혈중 TC 및 LDL의 양에 변화가 없는 것으로 확인된 자의 생물학적 시료로서 상기 사용되는 후보자의 생물학적 시료와 동종의 것을 사용한다. 즉 후보자의 소변 샘플을 사용하는 경우에는 대조군 생물학적 시료로도 소변 샘플을 사용한다.

본 발명에 사용되는 상기 비만 치료제란 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol: TC) 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 콜레스테롤 합성 억제제로서 HMG-CoA 리덕타제를 억제함과 동시에 LDL 수용체 mRNA 발현을 유발시키는 심바스타틴(simvastatin), 로바스타틴(lovastatin), CB(cannabinoid)-I 수용체 안타고니스트, PDE(phospholipid diesterase)-10 억제제, 오렉신(orexin)-1 안타고니스트, 리파아제(lipase) 억제제 및 지방 흡수 수용체 억제제 등이 사용될 수 있으며 반드시 이에 제한 되는 것은 아니다.

식품을 포함하는 천연물질로서의 상기 비만 치료제로서는 혈중 TC 및 LDL의 양을 조절하는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 키다치아로에, 알로에베라, 코에비스구사, 에비스구사, 아몬드(almond), 월계수, 아니스(anis), 사프란(saffraan), 생강, 쿠민, 고추, 된장, 쌈장, 청국장 또는 고추장을 사용할 수 있다. 고추장과 같은 식품을 포함하는 천연물질 비만 치료제의 경우 식품적 측면에서 기술한다면 이를 비만 개선제로서 표현할 수도 있다. 혈중 TC 및 LDL의 양을 조절하는 효능을 갖는 상기 천연물 비만 치료제 또는 비만 개선제에 관한 기재는 문헌(일본 특허 공개 제2003-206225호)에 자세히 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 비만 치료제는 고추, 된장, 쌈장, 청국장 또는 고추장이며, 가장 바람직하게는 고추장을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하이포잔틴(hypoxanthine)에 대한 결합제 또는 하이포잔틴을 기질로서 이용하는 효소를 포함하는 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상(subject)을 선별하기 위한 조성물로서, 상기 비만 치료제는 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol: TC) 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 것인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 비만 치료 대상(subject)을 선별하기 위한 조성물은 상술한 비만 치료 대상(subject)을 선별을 용이하게 수행하기 위한 것으로서, 상술한 내용과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 하이포잔틴에 대한 결합제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 상기 효소는 하이포잔틴을 기질로서 이용하는 효소라면 제한없이 사용될 수 있으며, 산화-환원 효소, 트랜스퍼라아제, 하이드로라아제, 라이아제(lyases), 이소머라아제 및 리가아제를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 하이포잔틴을 기질로서 이용하는 효소는 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 잔틴 옥시도리덕타제(xanthine oxidoreductase), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 및 잔틴 디하이드로제나제(xanthine dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 비만 치료 대상을 선별하는 방법 및 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상을 선별하기 위한 조성물에 관한 것이다.

(ii) 본 발명은 바이오마커로서 하이포잔틴을 사용하여 다양한 유전적, 환경적 차이를 지닌 치료 대상 후보군으로부터 비만 치료 대상체를 정확하게 선별할 수 있다.

도 1. 고추장 처리 전 소변 샘플에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2a는 처리 전 샘플의 OPLS-DA-유래 스코어 플롯(■, TC/LDL-무변화군의 처리 전; ◇, TC/LDL-감소군의 처리 전)을 나타낸다.
도 2b는 TC/LDL-무변화군 및 TC/LDL-감소군의 처리 전 샘플에 대한 OPLS-DA-유래 스코어 플롯(1, 루이신; 2, 이소루이신; 3, 발린; 4, 메틸숙시네이트; 5, 2-메틸글루타레이트; 6, 락테이트; 7, 알라닌; 8, 아세테이트; 9, 시트레이트; 10, 크레아틴; 11, 타우린; 12, 말로네이트; 13, 글리신; 14, 만니톨; 15, t-메틸히스티딘; 16, 히스티딘; 17, 히푸레이트; 18, 하이포잔틴; 19, 포르메이트)을 나타낸다.
도 3. 두 고추장 처리군(TC/LDL-무변화군 및 TC/LDL-감소군)의 처리 전 소변 샘플 내 하이포잔틴의 상대적 강도(크레아틴 강도에 대해 표준화함)를 나타낸다. 두 그룹 간 통계적으로 유의한 차이를 산정하기 위해 독립적 t-테스트를 수행하였다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다(n=6 또는 8). *P<0.05에서 유의적 차이가 남; 파우더 값은 0.79(파우더 분석법으로 얻음).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 고추장 샘플의 제조

메주를 준비하고 이를 쌀(glutinous rice)에 첨가하여 제조하는 다음의 전통적인 발효 방식에 따라 고추장을 준비하였다.

대두는 수분 10.5%, 회분 5.4%, 지방 17.9%, 조단백질 38.7% 및 탄수화물 26.2%을 포함하는 것을 사용하였다. 상기 대두를 20℃에서 9시간 침지하고, 건조시키고, 121℃에서 30분간 멸균시키고 30℃로 식힌 다음, 이를 분쇄하여 가루로 만들었다. 쌀은 12시간 침지하고, 멸균 후 상기와 같은 조건으로 식혔다. 상기와 같이 준비한 대두분 및 쌀을 6:4의 비율로 혼합하고, 황국균(Aspergilus sojae)을 이용해 만든 0.5%(w/w) 쌀 코오지 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 배양 브로스를 첨가한 후, 이를 18 cm x 10 cm x 3 cm의 상자에서 성형하여 메주를 제조하였다. 상기와 같이 준비한 메주를 35℃, 90% 상대습도에서 3일 동안 보관하였다. 이렇게 발효된 메주는 3-4일 동안 건조시키고 플랫 롤러(대열산업, 대전, 대한민국)로 분쇄하여 고추장 제조에 사용하였다. 고추장은 순창 문옥래 식품(순창, 대한민국)의 표준 프로토콜에 따라 쌀 18.0%, 메주분 6.0%, 건조 보리싹 4.0%, 소금 10.5%, 고춧가루 17.5% 및 증류수 44.0%를 혼합하여 제조하였다. 이를 100 kg 들이 단지 8개에 담고 순창 문옥래 식품의 장 제조 설비에서 3개월 동안 발효 숙성시켜 고추장을 제조하였다.

고추장 환제(pill)는 쌀, 고추장분, 메주분, 건조 보리싹, 소금, 간장, 흑눈콩(black-eyed pea)가루 및 코코아 분을 하기 표 1에 기재한 비율로 혼합하여 제조하였다. 위약 투여군을 위한 환제 또한 표 1에 기재한 혼합비율로 제조하였으며, 고추장 대신에 양념맛분, 고추 향, 메주분, 간장, 지방분, 밀가루, 흑눈콩가루, 코코아분, 소금, 꿀, 캬라멜 색소 및 적색소를 포함하도록 하였다. 상기 모든 샘플들은 실험대상군에게 투여할 때까지 -70℃에서 냉동 보관한 후 상온에서 해동하여 사용하였다.

주요성분	구성성분	고추장	위약
	구성성분	함량 (g)	함량 (g)
	고추장분 쌀가루 건조 보리싹 소금 메주분 간장	11.9 10.9 5.2 5.2 4.7 2.1	- - - 1.1 1.4 6.7
증진제	흑눈콩가루 코코아분 밀가루 지방분 꿀 고추 향 양념맛 분 캬라멜 색소	7.5 2.5 - - - - - -	9.3 1.4 13.1 6.3 1.4 0.3 0.1 0.1
첨가물	적색소	-	1.5
총중량	-	50.0	41.3
냉동건조중량	-	32.0	32.0
열량(kcal)	-	114.0	113.1

2. 실험대상군

BMI 지수가 23 kg/m² 이상인 28명의 여성 자원자(19-60세)를 모집하고, 고추장 환제 투여군 및 위약 환제 투여군의 두 그룹으로 임의로 나누었다. 고추장 환제 및 위약 환제의 열량은 각각 114 및 113 kcal/g로 맞추었다. 사전에 모든 28명의 자원자들로부터 처방에 대한 동의를 얻은 후, 이들에게 고추장 환제 또는 위약 환제를 매일 3회, 12주간 투여하였다. 상기 프로토콜은 전북대학병원의 ‘기능성 식품 협회 검토 위원회’의 승인을 받아 수행하였다.

3. 혈장 및 소변 샘플의 준비 및 콜레스테롤 분석

12시간 경과 후 실험자의 혈액을 채취하고 전북대학병원에 의뢰하여 혈장 샘플을 준비하였다. 전북대학병원의 생화학 실험실 표준 방법에 따라, 히타치 7600-110 분석기(Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan)를 사용하여 혈장 내 LDL 및 TC 농도를 측정하였다. 실험자의 24시간 동안의 소변 샘플을 전북대학병원에서 수집하였다. 상기 소변 샘플 10 ㎖를 1% 소듐 아자이드와 함께 15 ㎖ 원뿔형 튜브에 넣은 후 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

4. NMR 분석

처리 전(기저수준) 샘플을 40℃ 수조에서 녹이고, 5초간 볼텍스한 후, 각 소변 샘플 0.3 ㎖을 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 그 다음 100 g의 D₂O에 완충액으로서 KH₂PO₄ 1.232 g을 첨가하고, 1 N NaOD를 가하여 pH를 6으로 조절(pH는 pH 미터로 측정함, 모델 720P, Istek, 한국)하여 0.1 M D₂O(D₂O 내부 표준으로서 0.05% 3-(트리메틸실릴)-프로피오닉-2,2,3,3-d4 산, 소듐 염 포함)를 준비하였다. 0.2 ㎖ 분량의 D₂O를 0.3 ㎖ 분량의 소변 샘플에 첨가하고 수 초간 볼텍스하여 완전히 혼합하였다. 상기와 같이 준비한 혼합물을 피펫을 이용하여 5 mm NMR 튜브(Norell, Landisville, NJ)에 담았다[20].

NMR 분광기(Avance 600 FT-NMR, Bruker, Germany)를 사용하여 600.13 MHz, 절대온도 298 K의 조건에서 샘플을 분석하였다. 잔류 수분 신호를 억제하기 위하여 noesygpprld 펄스 시퀀스를 사용하였다. 너비 10775.9의 스펙트럼에서 총 64개의 전이(transient) 데이터가 수집되었다. 3.04초의 스캔 당 영상회복시간(acquisition time) 및 1초의 회복지연(relaxation delay)을 사용하였다. FT(Fourier transform)에 앞서 FID(free induction decays)에 0.30 Hz의 지수 선 너비증가 함수(exponential line-broadening function)를 적용하였다.

5. 통계학적 분석

Amix 소프트웨어(버전 3.7, Bruker Biospin)를 사용하여 δ= 0.00 내지 10.00의 스펙트럼 영역을 0.04-ppm으로 분할하였다. δ = 5.60부터 6.00까지의 우레아 영역과 함께, δ = 4.60에서 4.90까지의 잔류 수분 신호영역을 액상 추출물에서 제외하였다[21]. 전처리 방법으로서, 모든 데이터는 UV(unit-variance)로의 스케일링과 함께 평균을 중심으로 조정되었고, OPLS-DA(orthogonal projections of latent structure-discriminant analysis)는 SIMCA-P 소프트웨어(버전 12.0, Umetrics, Ume, Sweden)을 사용하여 수행하였다. ANOVA 및 독립적 t-테스트는 SPSS 소프트웨어(버전 17, SPSS Inc., Chicago, USA)을 사용하여 수행하였고, t-테스트 파워 분석은 Power 및 Precision 소프트웨어(버전 3.2.0, Biostat, NJ, USA)를 사용하여 수행하였다. 파워 값 계산을 위하여 평균차, 표준편차, 중요도 레벨(p=0.05) 및 샘플 사이즈를 사용하였다.

실험결과 및 추가논의

1. 생화학적 매개변수

하기 표 2에 기재되어 있는 바와 같이 BMI(body mass index) 값은 실험 전후를 비교하여 고추장 및 위약 처리군 간에 현저한 차이를 보이지 않았다. 즉 고추장은 체중에는 별다른 영향을 미치지 못하였다. 그러나, 콜레스테롤 조절 효능은 위약 투여군과 비교하여 고추장 투여군에서 현저히 뛰어난 것으로 나타났다. 위약 투여군의 TC 및 LDL 수준은 12주에 걸친 실험 기간 동안 별다른 변화를 나타내지 않았다. 그러나, 고추장 투여군은 TC 및 LDL에 있어서 각각 10.7% 및 15.7%이상의 현저한 감소를 보이거나, 또는 12주간의 실험기간 동안 거의 변화를 나타내지 않았다. 다시 말해, 기저 수준 TC/LDL 레벨 및 BMI 수치에 있어 별다른 차이가 없었던 인간군에 대하여 고추장은 두 가지의 다른 효능을 행사하는 것으로 나타났다. 이러한 효능에 대한 추가적인 실험으로서, ¹H-NMR-기초 대사체학적 기법을 사용하여 고추장 처리군의 실험 전 소변 샘플의 대사체학적 프로파일을 조사하였다.

고추장(n=14)					위약(n=14)
	TC/LDL 감소군 (n=8)		TC/LDL 무변화군 (n=6)		처리 전	처리 후
	처리 전	처리 후	처리 전	처리 후	처리 전	처리 후
TC (mg/dL)	197.0±16.8	175.0±14.2* 10.7%^a	207.0±32.8	224.2±23.8	202.2±27.2	197.7±25.9
LDL (mg/dL)	134.3±17.3	112.8±14.7* 15.7%^a	134.8±25.3	149.5±24.8	126.3±27.8	122.9±27.8
BMI	26.4±2.4	26.4±2.3	26.3±2.6	26.5±2.2	27.3±3.1	26.4±3.4

각각의 값은 평균 ± 표준편차를 나타낸다(n=6 or 8).

*는 투여 전 그룹 및 투여 후 그룹 간 P<0.05에서의 유의적 차이를 나타내며, TC/LDL 감소군에서 TC 및 LDL의 t-테스트 결과에 관한 파워 값은 각각 0.75 및 0.70이었다.

^aTC 및 LDL 감소율(%)=(처리 후 TC/LDL-처리 전 TC/LDL) x 100/ (처리 전 TC/LDL)

2. ¹ H- NMR 분광분석결과

도 1은 고추장 처리전 소변 샘플에 대한 대표적인 ¹H-NMR 스펙트럼의 각각의 피크 값을 나타내고 있다. 하기의 신호들은 Chenomx NMR 스위트 소프트웨어(version 5.1, Chenomx, In., Edmonton, Canada)를 이용해 표준 화합물과의 화학적 이동(chemical shift)을 대비하여 산정한 값이다: 루이신 = 0.94 (d, J = 6.78 Hz); 이소루이신 = 0.94 (d, J = 6.78 Hz); 발린 = 0.98 (d, J = 6.9 Hz) 및 1.02 (d, J = 6.24 Hz); 메틸 숙시네이트(methylsuccinate) = 1.06 (d, J = 7.1 Hz); 2-메틸 글루타레이트(2-methylglutarate) = 1.06 (d, J = 7.1 Hz); 락테이트(lactate) = 1.34 (d, J = 7.3 Hz); 알라닌 = 1.46 (d, J = 7.9 Hz); 아세테이트 = 1.94 (s); 시트레이트(citrate) = 2.54 (d, J = 14.6 Hz) 및 = 2.74 (d, J = 17.7 Hz); 크레아틴(creatine) = 3.02 (s) 및 = 3.90 (s); 크레아티닌(creatinine) = 3.06 (s) 및 = 4.10; 타우린(taurine) = 3.42 (t, J = 6.0 Hz); 말로네이트(malonate) = 3.34 (s); 글리신 = 3.54 (s); 만니톨(mannitol) = 3.66 (dd, J ₁ = 6.5 Hz, J ₂ = 6.0 Hz), = 3.74 (m), = 3.78 (d, J = 9.4 Hz), 및 = 3.86 (dd, J ₁ = 2.8 Hz, J ₂ = 3.4 Hz); t-메틸히스티딘(t-methylhistidine) = 3.86 (s), = 7.34 (s), 및 = 8.34 (s), 히스티딘(histidine) = 7.34 (s) 및 = 8.34 (s); 히푸레이트(hippurate) = 7.54 (t, J = 7.2 Hz), = 7.62 (t, J = 7.1 Hz), 및 = 7.82 (d, J = 7.9 Hz); 하이포잔틴(hypoxanthine) = 8.18 (s); 및 포르메이트(formate) = 8.42 (s).

3. 고추장 처리 투여 전( pre - dose ) 샘플의 직교부분최소자승판별 분석( OPLS - DA )

OPLS-DA(Orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis)은 PLS-DA(partial least squares discriminant analysis)보다 개선된 시각화 및 판독을 제공하는 전처리 접근법(preprocessing method)이다. 예측 성분(predictive component)은 그룹 간 변화를 나타내는데, 이는 그룹 내 변화를 나타내는 직교 성분(orthogonal component)에 근거하여 예측될 수 있다[22]. 따라서, OPLS-DA는 관심 대상 그룹 간을 분리하여 화합물을 구별할 수 있는 유용한 도구이다.

고추장 투여시 TC/LDL에 변화가 없었던 군(TC/LDL-무 변화군) 및 고추장 투여시 TC/LDL에 감소를 보인 군(TC/LDL-감소군)에 대해, 처리 전 소변 샘플 내 대사 차이를 조사하기 위하여 OPLS-DA를 사용하였다. 도 2A는 OPLS-DA-유래 스코어 플롯을 나타낸 것으로, 그룹들이 명확하게 구분될 수 있음을 보여준다. 이는 고추장의 효능이 개인의 처리전 대사 상태에 따라 달라짐을 의미한다. OPLS-DA 모델에서 각각의 샘플을 분리하는데 기여할 수 있는 화합물을 동정하기 위하여, 로딩 플롯 분석법을 수행하였다(도 2B). 로딩 플롯의 위치는 상기 스코어 플롯에 상응한다. 그러므로, 이는 본 연구에 있어서 스코어 플롯의 X축을 따라 포지티브 위치에 존재하는 포지티브 로딩 플롯의 피크가 샘플 내에서 우세함을 의미한다.

전 처리 조건에서, 크레아틴, 타우린, 말로네이트, τ-메틸히스티딘, 히스티딘 및 히푸레이트는 TC/LDL-감소군 내에서 더 높았고, 로딩 플롯의 네거티브 영역에 위치하였다. 반면에, TC/LDL-무변화군에서는 루이신, 이소루이신, 발린, 메틸 숙시네이트, 2-메틸 글루타레이트, 락테이트, 알라닌, 아세테이트, 시트레이트, 글라이신, 만니톨, 하이포잔틴 및 포르메이트(formate)가 더 높게 나타났으며, 이들은 로딩 플롯의 포지티브 영역에 위치하였다.

두 그룹 간 선택된 화합물의 상대적 강도 차이의 중요성을 입증하기 위하여 독립적인 t-테스트를 수행하였다. 하이포잔틴을 제외하고는 상기 선택된 화합물의 상대적 레벨 간에 큰 차이점은 존재하지 않았다. 하이포잔틴의 상대적 강도를 도 3에 나타내었는데 TC/LDL-무변화군에서 하이포잔틴 레벨이 TC/LDL-감소군보다 훨씬 높게 나타났다. 종전 연구에 따르면, 하이포잔틴의 혈청 레벨은 비만 및 산화 스트레스 조건에서 증가하는 경향을 보인다고 한다[23].

TC/LDL-무변화군 및 TC/LDL-감소군 사이의 FRPP 효능의 차이는 생활 양식, 식생활, 체질 및/또는 유전적 요인에 의한 것일 수 있다. 전처리 조건에서, 하이포잔틴의 소변 내 레벨은 TC/LDL-무변화군과 비교하여 TC/LDL-감소군에서 현저하게 낮았다. 따라서, 고추장의 콜레스테롤 조절 효능에 대한 스크리닝 지시자로서 소변 내 대사체를 사용할 수 있다는 본 연구의 가설이 검증되었다고 할 것이다. 처리 전 소변 하이포잔틴 레벨과 각 개인마다 다른 환경적 또는 유전적 요인 간의 상관관계를 결정하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.

본 발명자들은 고추장의 콜레스테롤-조절 효능을 확인하기 위한 대상체 스크리닝의 잠재적 바이오마커로서 하이포잔틴이 사용될 수 있음을 제안한다. 즉 본 연구의 발견은 상기 방법론이 다른 천연 자원의 인간에 대한 생물학적 활성을 분석하고 비만을 포함하는 다양한 질병의 개인마다의 치료를 위한 잠재적인 바이오 마커를 동정하는데 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

다음 단계를 포함하는 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상(subject)을 선별하는 방법:
(a) 후보자의 생물학적 시료 내 하이포잔틴(hypoxanthine)의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 하이포잔틴의 양을 대조군 생물학적 시료 내 하이포잔틴 양과 비교하는 단계로서, 상기 비만 치료제는 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol: TC) 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 것이고, 상기 후보자의 하이포잔틴 양이 대조군의 하이포잔틴 양 보다 낮은 경우 상기 비만 치료제의 비만 치료 대상으로 판정된다.
제 1 항에 있어서, 상기 대조군 생물학적 시료는 상기 비만 치료제 투여 전후의 혈중 TC 및 LDL의 양에 변화가 없는 자의 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혈중 TC 및 LDL의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 비만 치료제는 CB(cannabinoid)-I 수용체 안타고니스트, PDE(phospholipid diesterase)-10 억제제, 오렉신(orexin)-1 안타고니스트, 리파아제(lipase) 억제제, 지방 흡수 수용체 억제제, 알로에베라, 아몬드(almond), 월계수, 아니스(anis), 사프란(saffraan), 생강, 고추, 된장, 쌈장, 청국장 및 고추장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비만 치료제는 고추장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 복수 또는 양막액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
하이포잔틴(hypoxanthine)에 대한 결합제 또는 하이포잔틴을 기질로서 이용하는 효소를 포함하는 비만 치료제에 대한 비만 치료 대상(subject)을 선별하기 위한 조성물로서, 상기 비만 치료제는 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol: TC) 및 저밀도 지질단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 양을 감소시켜 비만을 치료하는 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 하이포잔틴에 대한 결합제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 하이포잔틴을 기질로서 이용하는 효소는 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 잔틴 옥시도리덕타제(xanthine oxidoreductase), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 및 잔틴 디하이드로제나제(xanthine dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.