SK281571B6

SK281571B6 - Prostriedok na trvalé uvoľňovanie ľudského rastového hormónu

Info

Publication number: SK281571B6
Application number: SK1671-97A
Authority: SK
Inventors: Olufunmi Lily Johnson; Medha M. Ganmukhi; Howard Bernstein; Henry Auer; Amin M. Khan
Original assignee: Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2001-05-10
Also published as: ATE204468T1; JPH11506740A; PL184531B1; NO316104B1; NO975708D0; CN1102854C; RU2161502C2; SK167197A3; AU708756B2; PT831787E; CZ288147B6; CA2223436A1; EP0831787B1; ES2161366T3; NO975708L; IL122385A0; DE69614685D1; MX9709698A; WO1996040072A3; NZ310644A

Abstract

Prostriedok na trvalé uvoľňovanie ľudského rastového hormónu obsahuje biozlučiteľný polymér a častice ľudského rastového hormónu stabilizovaného katiónom, pričom katiónom kovu je zinočnatý ión.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa zaoberá prostriedkom na trvalé uvoľňovanie ľudského rastového hormónu.

Doterajší stav techniky

Ľudský rastový hormón (hGH) je proteín, ktorý je sekretovaný hypofýzou a ktorý môže byť vyrobený spôsobom rekombinantného genetického inžinierstva. hGH spôsobuje rast všetkých telesných tkanív, ktoré sú schopné rásť.

hGH sa väčšinou používa na liečenie pacientov, ktorí trpia hypopituitámym nanizmom. Vhodný hGH sa pacientom bežne podáva ako subkutánny bolus trikrát za týždeň alebo raz denne, aby sa udržali vhodné hladiny hGH v sére. U pacientov, ktorí chronicky dostávajú hGH, vedú časté injekcie k problémom znášanlivosti.

Aby sa vyriešili problémy, ktoré súvisia s opakovanými injekciami vodného hGH, boli uskutočnené pokusy pripraviť zariadenie na regulované uvoľňovanie obsahujúce vyššie dávky hGH ako bolus injekcie, ktoré by boli obalené polymémou matricou, pričom hGH by sa uvoľňoval in vivo počas okolo jedného týždňa alebo dlhšie.

Tieto zariadenia na regulované uvoľňovanie ale často vykazujú vyššie začiatočné uvoľnenie hGH a minimálne nasledujúce uvoľňovanie hGH. Ďalej potom vďaka vysokej koncentrácii hGH v zariadeniach s týmto regulovaným uvoľňovaním majú molekuly hGH tendenciu po niekoľkých dňoch agregovať za vzniku agregovaného hGH, ktorý je imunogénny in vivo a pravdepodobne má zníženú biologickú aktivitu.

Existuje teda potreba prostriedkov na trvalé uvoľňovanie biologicky aktívneho hGH in vivo bez toho, aby toto uvoľňovanie spôsobilo imunitnú systémovú odpoveď v čase uvoľnenia hGH.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa zaoberá prostriedkami a spôsobmi prípravy a používania tohto prostriedku na trvalé uvoľňovanie biologicky aktívneho stabilizovaného ľudského rastového hormónu (hGH). Prostriedok s trvalým uvoľňovaním podľa tohto vynálezu obsahuje polymému matricu biozlučiteľného polyméru a častice biologicky aktívneho katiónom kovu stabilizovaného hGH, pričom tieto častice sú dispergované v biozlučiteľnom polyméri.

Spôsob prípravy prostriedku na trvalé uvoľňovanie hGH podľa vynálezu zahrnuje rozpúšťanie biozlučiteľného polyméru v polymémom rozpúšťadle za vzniku polymérneho roztoku dispergujúceho častice biologicky aktívneho stabilizovaného hGH v polymémom roztoku a potom spevnenie polyméru za vzniku polymémej matrice obsahujúcej disperziu hGH častíc.

Spôsob používania prostriedku s trvalým uvoľňovaním podľa predloženého vynálezu zahŕňa všetky terapeuticky účinné hladiny biologicky aktívneho, neagregovaného ľudského rastového hormónu v krvi subjektu počas trvalého uvoľňovania podávaním dávky prostriedku s trvalým uvoľňovaním tomuto subjektu.

Výhody tohto prostriedku s trvalým uvoľňovaním hGH zahrnujú ďalšie konzistentnejšie hladiny hGH v krvi, nižší začiatočný vzostup hGH a zvýšené terapeutické výhody odstránením kolísania množstva hGH v sére. Tieto výhody zahrnujú tiež zvýšenú znášanlivosť s pacientom a zníženie potrebného počtu injekcii. Medzi tieto výhody ďalej patrí schopnosť používať menšie množstvo hGH v porovnaní s režimom bolus injekcií, pretože hladiny hGH v sére sú udržované bližšie k terapeutickému prahu.

Ľudský rastový hormón (hGH) používaný podľa tohto vynálezu je biologicky aktívny hGH vo svojej molekulárnej (monomemej alebo neagregovanej) forme. Molekulárny hGH je typicky neimunogénny.

Agregovaný hGH môže indukovať imunitnú odpoveď vedúcu k protilátkam vzniknutým proti hGH. To môže viesť proti účinnosti dlhotrvajúcej hGH terapie. Agregovaný hGH môže tiež stimulovať autoimunitnú odpoveď na endogenný hGH.

Trvalé uvoľňovanie biologicky aktívneho neagregovaného ľudského rastového hormónu znamená uvoľňovanie, ktoré vedie k merateľným hladinám biologicky aktívneho monomemého hGH v sére počas dlhšieho obdobia, ako je obdobie priameho podávania vodného hGH. Je výhodné, aby trvalé uvoľňovanie znamenalo uvoľňovanie hGH v priebehu týždňa alebo v priebehu dlhšieho času, najvýhodnejšie v priebehu dvoch alebo viac týždňov.

Trvalé uvoľňovanie biologicky aktívneho neagregovaného hGH z polymémej matrice môže znamenať kontinuálne alebo nekontinuálne uvoľňovanie s relatívne stálou alebo meniacou sa rýchlosťou uvoľňovania. Kontinuita uvoľňovaného hGH a hladina uvoľňovaného hGH môže byť daná použitím, okrem iného, jedného alebo viacerých typov polymémych prostriedkov, náplňou hGH a/alebo výberom excipientov, ktoré poskytujú požadovaný účinok.

Stabilizovaný hGH obsahuje biologicky aktívny, neagregovaný hGH, ktorý je komplexovaný aspoň s jedným typom viacmocného katiónu kovu, ktorý má väznosť +2 alebo viac, zo zložky katiónu kovu. Stabilizovaný hGH v prostriedku s trvalým uvoľňovaním podľa predloženého vynálezu je vo forme čiastočiek.

Medzi vhodné viacmocné katióny kovov patria katióny kovov obsiahnuté v biokompatibilných zložkách katiónu kovu. Zložka katiónu kovu je biokompatibilná, ak zložka katiónu nie je toxická pre príjemcu v používaných množstvách a ak nepredstavuje významné škodlivé alebo nevhodné účinky pre telo príjemcu, ako je imunologická reakcia v mieste injekcie.

Molámy pomer zložky katiónu kovu k hGH je pre katión kovu stabilizujúce hGH typicky medzi 4 :1 a 10:1.

Výhodným katiónom kovu používaným na stabilizovanie hGH je katión zinku. Vo výhodnejšom uskutočnení je molámy pomer zložky katiónu kovu, obsahujúci katióny zinku, k hGH 6 : 1.

Vhodnosť katiónu kovu na stabilizovanie hGH môže stanoviť zručný odborník pomocou rôznych spôsobov indukujúcich stabilitu, ako je elektroforéza na polyakrylamidovom géli, izoelektrická fokusácia, chromatografia na obrátenej fáze, HPLC a testy účinnosti na časticiach lyofilizovaného hGH obsahujúceho katióny kovu, aby sa stanovila aktivita hGH po lyofilizácii a počas trvania uvoľňovania z mikročastic. Pri stabilizovanom hGH je tendencia hGH agregovať v mikročasticiach počas hydratácie in vivo a/alebo strata biologickej aktivity alebo účinnosti počas hydratácie, alebo vďaka procesu tvorenia prostriedku s trvalým uvoľňovaním, alebo vďaka chemickým vlastnostiam prostriedku s trvalým uvoľňovaním, znížená vytvorením komplexu aspoň jedného typu katiónu kovu s hGH pred uvedením hGH do kontaktu s roztokom polyméru.

Stabilizovaný hGH je typicky stabilizovaný proti významnej agregácii in vivo v čase trvalého uvoľňovania. Významná agregácia je definovaná ako také množstvo agregácie, ktoré vedie k agregácii 15 alebo viac % hmotn. z pôvodného množstva monoméru hGH uzatvoreného v kap sule. Agregácia sa výhodne udržuje pod 5 % hmotn. z pôvodnej dávky monoméru hGH. Agregácia sa výhodnejšie udržuje pod 2 % hmotn. z pôvodnej dávky.

hGH v prostriedku s trvalým uvoľňovaním hGH sa môže zmiešať tiež s inými koncipientmi, ako sú činidlá zväčšujúce objem alebo ďalšie stabilizačné činidlá, ako sú pufre, aby sa hGH počas lyofdizácie stabilizoval.

Činidlá zväčšujúce objem typicky obsahujú inertné materiály. Vhodné činidlá zväčšujúce objem sú známe odborníkom z oblasti techniky.

Polymér alebo polyméme matrice, ktoré sú vhodné pre prostriedok s trvalým uvoľňovaním podľa predloženého vynálezu, musia byť biozlučiteľné. Polymér je biozlučitelný, keď polymér alebo akékoľvek degradačné produkty polyméru nie sú pre príjemcu toxické a ak tiež neznamenajú významné škodlivé alebo nevhodné účinky pre telo príjemcu, ako je imunologická reakcia v mieste injekcie.

Polymér prostriedku s trvalým uvoľňovaním hGH musí byť tiež biodegradovateľný. Biodegradovateľný, ako je definované, znamená to, že prostriedok bude reagovať alebo erodovať in vivo za vzniku menších chemických častíc. Degradácia môže byť dôsledkom napríklad enzymatických, chemických a fyzikálnych procesov.

Medzi vhodné biozlučiteľné, biodegradovateľné polyméry patria napríklad poly(laktidy), poly(glykolidy), poly(laktid-ko-glykolidy), poly(mliečne kyseliny), poly(glykolové kyseliny), poly (mliečna kyselina-ko-glykolová kyselina), polykaprolaktún, polyuhličitany, polyesteramidy, polyanhydridy, poly(aminové kyseliny), polyortoestery, polykyanakryláty, poly(p-dioxanóny), poly(alkylén-oxaláty), biodegradovateľné polyuretány, ich zmesi a ich kopolyméry.

Koncové funkčné skupiny polyméru môžu byť tiež modifikované. Napríklad polyestery môžu byť blokované, neblokované alebo môžu znamenať zmes blokovaných a neblokovaných polymérov. Blokovaný polymér je klasicky definovaný v oblasti techniky, špecificky s blokovanými karboxylovými koncovými skupinami. Všeobecne sú blokujúce skupiny odvodené od iniciátorov polymerizácie a typicky znamenajú alkylovú skupinu. Neblokovaný polymér je klasicky definovaný v oblasti techniky, špecificky ako polymér s voľnými karboxylovými koncovými skupinami. Prijateľné molekulové hmotnosti polymérov používaných podľa tohto vynálezu môžu byť stanovené osobou z oblasti techniky, ktorá zoberie do úvahy také faktory, ako je žiadaná rýchlosť degradácie polyméru, fyzikálnych vlastností, ako je mechanická pevnosť a rýchlosť rozpúšťania polyméru v rozpúšťadle. Prijateľný rozsah molekulových hmotnosti je typicky v rozmedzí od 2000 do 2000 000. Vo výhodnom uskutočnení polymér znamená biodegradovateľný polymér alebo kopolymér. Vo výhodnejšom uskutočnení polymér znamená poly(laktid-koglykolid) (tu ďalej označovaný „PLGA“) s pomerom laktid:glykolid 1 : 1 s molekulovou hmotnosťou 5 000 až 70 000. Ešte vo výhodnejšom uskutočnení má PLGA, použitý podľa predloženého vynálezu, molekulovú hmotnosť 6000 až 31 000.

Množstvo hGH, ktoré je obsiahnuté v dávke mikročastíc s trvalým uvoľňovaním alebo v inom zariadení s trvalým uvoľňovaním, obsahujúcim biologicky aktívne, stabilizujúce hGH častice, je terapeuticky alebo profylaktický efektívne množstvo, ktoré môže byť stanovené odborníkom z oblasti techniky, pričom sa berú do úvahy také faktory, ako je telesná hmotnosť, stav, ktorý má byť liečený, typ použitého polyméru a rýchlosť uvoľňovania z polyméru.

V jednom uskutočnení prostriedok s trvalým uvoľňovaním hGH obsahuje od 0,01 do 50 % hmotn. biologicky aktívnych častíc so stabilizovaným hGH. Množstvo používaných častíc hGH sa bude meniť podľa požadovaného účinku hGH, podľa plánovaného uvoľňovaného množstva, podľa času, v priebehu ktorého by sa mal hGH uvoľňovať a podľa času, v priebehu ktorého sa bude hGH uvoľňovať. Výhodné rozmedzie náplne častíc hGH je medzi 0,1 a 30 % hmotn. častíc hGH. Výhodnejšie rozmedzie náplne častíc hGH je medzi 0,1 a 20 % hmotn. častíc hGH. Najvýhodnejšia náplň biologicky aktívnych častíc so stabilizovaným hGH je 15 % hmotn.

V inom uskutočnení prostriedok s trvalým uvoľňovaním hGH obsahuje tiež druhú zložku katiónu kovu, ktorá nie je obsiahnutá v časticiach so stabilizovaným hGH a ktorá je dispergovaná v polyméri. Druhá zložka katiónu kovu výhodne obsahuje rovnaké druhy katiónov kovu ako katión v stabilizovanom hGH. Druhá zložka katiónu kovu môže tiež obsahovať jeden alebo viac rôznych druhov katiónov kovov.

Druhá zložka katiónu kovu pôsobí ako modulácia uvoľnenia hGH z polymémej matrice prostriedku s trvalým uvoľňovaním, ako je pôsobenie ako zásobník katiónov kovu na ďalšie predĺženie času, v ktorom je hGH stabilizovaný katiónom kovu, aby sa zvýšila stabilita hGH v prostriedku.

Zložka katiónu kovu používaná pri modulácii uvoľňovania typicky obsahuje aspoň jeden typ viacmocného katiónu kovu. Príklady druhých zložiek katiónu kovu, ktoré sú vhodné na moduláciu uvoľňovania hGH, zahrnujú alebo obsahujú napríklad Mg(OH)₂, MgCO₃ (ako je 4 MgCCfy.. . Mg (OHJj. 5 H₂O), ZnCOj (ako je 3 Zn(OH)2.2 ZnCOj), CaCO₃, ZN₃(C₆H₅O₇)₂, Mg(OAC)₂, MgSO₄, Zn(OAc)₂, ZnSO₄, ZnCl₂, MgCl₂ a Mg₃(C6H₅O₇)₂. Vhodný pomer druhej zložky katiónu kovu k polyméru je medzi 1 : 99-a 1 : 2 hmotn. dielov. Optimálny pomer závisí od použitého polyméru a od použitej druhej zložky katiónu kovu. _{3 c}

Polyméma matrica obsahujúca dispergovaná zložku katiónu kovu na moduláciu uvoľnenia biologicky aktívneho činidla z polymémej matrice je ďalej opísaná v sprievodnej USA patentovej prihláške č. 0/237 057, podanej 3. mája 1994, a v sprievodnej PCT patentovej prihláške PCI7US95/05511, ktorých celé opisy sú tu zahrnuté ako odkazy.

Prostriedok na trvalé uvoľňovanie hGH podľa tohto vynálezu sa môže vyrábať vo viacerých tvaroch, ako je film, paleta, valček, disk alebo mikročastice. Mikročastice, ako sú tu definované, obsahujú polymérmi zložku s priemerom menším ako 1 mm, ktorá obsahuje dispergované častice stabilizovaného hGH. Mikročastice môžu byť guľaté, neguľaté alebo nepravidelného tvaru. Je výhodné, aby mikročastice boli mikroguľôčkami. Mikročastice môžu mať taký typický tvar, ktorý je vhodný na injekčné podávanie. Výhodným rozmedzím veľkosti mikročastíc je rozmedzie priemeru častíc od 1 do 180 pm.

Podľa spôsobu výroby prostriedku na trvalé uvoľňovanie biologicky aktívneho, neagregovaného hGH podľa vynálezu sa množstvo častíc biologicky aktívneho, stabilizovaného hGH disperguje v polymérnom roztoku.

Vhodný polymémy roztok obsahuje medzi 1 a 30 % hmotn. vhodného biozlučiteľného polyméru, pričom biozlučitelný polymér je typicky rozpustený vo vhodnom polymémom rozpúšťadle. Polymémy roztok výhodne obsahuje 2 až 20 % hmotn. polyméru. Najvýhodnejší je taký polymémy roztok , ktorý obsahuje 5 až 10 % hmotn. polyméru.

Vhodným polymémym rozpúšťadlom, ako je tu definované, je také rozpúšťadlo, v ktorom je polymér rozpustný, ale v ktorom sú častice stabilizovaného hGH v podstate

SK 281571 Β6 nerozpustné a nereaktívne. Medzi príklady vhodných polymémych rozpúšťadiel patria poláme organické kvapaliny, ako je metylénchlorid, chloroform, etylacetát a acetón.

Pri príprave biologicky aktívnych častíc stabilizovaného hGH sa hGH zmieša vo vhodnom vodnom rozpúšťadle aspoň s jednou vhodnou zložkou katiónu kovu pri takých podmienkach pH, ktoré sú vhodné na vytvorenie komplexu katiónu kovu s hGH. Komplexovaný hGH bude typicky vo forme mliečnej zrazeniny, ktorá je suspendovaná v rozpúšťadle. Komplexovaný hGH však môže byť tiež v roztoku. V ešte výhodnejšom uskutočnení je hGH komplexovaný so zinočnatými iónmi.

Medzi vhodné podmienky pH na vytvorenie komplexu hGH typicky patria pH hodnoty medzi 7,0 a 7,4. Vhodné podmienky pH sa typicky dosiahnu použitím vodného pufra, ako je hydrogenuhličitan sodný ako rozpúšťadla.

Vhodnými rozpúšťadlami sú také rozpúšťadlá, v ktorých hGH a zložka katiónu kovu sú aspoň mierne rozpustné, ako je tomu vo vodnom pufri hydrogenuhličitanu sodného. Pri vodných rozpúšťadlách je výhodné, aby použitou vodou bola buď deionizovaná voda alebo voda pre injekcie (WFI).

Tomu je treba rozumieť tak, že hGH môže byť vo forme pevnej látky alebo v rozpustenom stave predtým, ako je uvedený do kontaktu so zložkou katiónu kovu. Tomu je treba rozumieť tiež tak, že zložka katiónu kovu môže byť v pevnom stave alebo v rozpustenom stave predtým, ako je uvedená do kontaktu s hGH. Vo výhodnom uskutočnení sa pufrovaný roztok hGH zmieša s vodným roztokom zložky katiónu kovu.

Komplexovaný hGH bude existovať typicky vo forme mliečnej zrazeniny, ktorá je suspendovaná v rozpúšťadle. Komplexovaný hGH však môže byť tiež v roztoku. V ešte výhodnejšom uskutočnení je hGH komplexovaný so zinočnatými iónmi.

Komplexovaný hGH sa potom vysuší, ako napríklad lyofilizáciou, za vzniku stabilizovaného hGH vo forme čiastočiek. Komplexovaný hGH, ktorý je suspendovaný alebo ktorý je v roztoku, sa môže lyofilizovať vo veľkom meradle, alebo ho možno rozdeliť na menšie objemy a potom lyofilizovať. Vo výhodnom uskutočnení je suspenzia komplexovaného hGH mikronizovaná, ako napríklad použitím ultrazvukovej dýzy, a potom sa lyofilizuje za vzniku stabilizovaného hGH. Prijateľnými prostriedkami na lyofílizáciu zmesi komplexovaného hGH sú tie prostriedky, ktoré sú známe z oblasti techniky.

Priemer častíc stabilizovaného hGH je výhodne medzi 1 a 6 pm. Častice hGH sa môžu fragmentovať oddelene, ako je opísané v sprievodnej USA patentovej prihláške č. 08/006 682, podanej 21. januára 1993, ktorá opisuje spôsob výroby malých častíc biologicky aktívnych činidiel, ktorá je tu celá zahrnutá ako odkaz. Častice hGH sa môžu tiež fragmentovať vtedy, ak sú pridané k polymémemu roztoku, ako napríklad ultrazvukovou sondou alebo dýzou.

V inom uskutočnení sa druhá zložka katiónu kovu, ktorá nie je obsiahnutá v časticiach stabilizovaného hGH, tiež disperguje v polymémom roztoku.

Tomu je treba rozumieť tak, že druhá zložka katiónu kovu a stabilizovaný hGH sa môžu dispergovať v polymérnom roztoku postupne, v obrátenom poradí, striedavo, oddelene alebo súčasným pridávaním. Polymér, druhá zložka katiónu kovu a stabilizovaný hGH sa tiež môžu vmiešať do polymérneho rozpúšťadla postupne, v obrátenom poradí, striedavo, oddelene alebo súčasným pridávaním.

Spôsob výroby prostriedku na moduláciu uvoľňovania biologicky aktívneho činidla z biodegradovateľného poly méru je ďalej opísaný v sprievodnej patentovej prihláške USA č. 08-237 057.

Podľa tohto spôsobu sa polyméme rozpúšťadlo nechá stuhnúť za vzniku polymémej matrice obsahujúcej disperziu častíc stabilizovaného hGH.

Iným vhodným spôsobom vytvorenia prostriedku s trvalým uvoľňovaním hGH z polymérneho roztoku je spôsob odparovania rozpúšťadla opísaný v USA patente č. 3 737 337 Schnoriga a kol., USA patente č. 3 523 906 Vrancheana a kol., USA patente č. 3 691 090 Kitajamy a kol. alebo v USA patente č. 4 389 330 Ticeho a kol. Odparenie rozpúšťadla sa typicky používa ako spôsob výroby mikročastíc na trvalé uvoľňovanie hGH.

V spôsobe odparovania rozpúšťadla sa polymémy roztok obsahujúci disperziu častíc stabilizovaného hGH vmieša alebo premieša s kontinuálnou fázou, v ktorej je polyméme rozpúšťadlo čiastočne miešateľné, za vzniku emulzie. Kontinuálna fáza je obyčajne vo vodnom rozpúšťadle. Do kontinuálnej fázy sú často zahrnuté emulgačné činidlá, aby sa emulzia stabilizovala. Polyméme rozpúšťadlo sa potom počas niekoľkých hodín alebo počas dlhšieho času odparí, čím sa polymér vystuží tak, že sa vytvorí polyméma matrica, ktorá v sebe obsahuje disperziu častíc stabilizovaného hGH.

Výhodný spôsob vzniku mikročastíc s trvalým uvoľňovaním hGH z polymérneho roztoku je opísaný v USA patente č. 5 019 400 Gombotze a kol. a v sprievodnej USA patentovej prihláške č. 08/443 726, podanej 18. 05. 1995, ich opisy sú uvedené ako odkazy. Tento spôsob vzniku mikroguľôčok pri porovnaní s inými spôsobmi, ako je delenie fáz, ďalej znižuje množstvo hGH, ktoré je nutné na výrobu prostriedku s trvalým uvoľňovaním so špecifickým obsahom hGH.

Podľa tohto spôsobu sa polymémy roztok, ktoiý obsahuje disperziu častíc stabilizovaného hGH, spracuje tak, aby sa vytvorili kvapôčky, pričom aspoň významná časť týchto kvapôčok obsahuje polymémy roztok a častice stabilizovaného hGH. Tieto kvapôčky sa potom nechajú zmrznúť prostriedkami vhodnými na vznik mikročastíc. Príklady prostriedkov na spracovanie disperzie polymémeho roztoku za vzniku kvapôčok zahrnujú smerovanie disperzie do ultrazvukovej dýzy, tlakovej dýzy, Rayleighovej dýzy alebo iných známych prostriedkov na vytvorenie kvapôčok z roztoku.

Prostriedky, ktoré sú vhodné na zmrazovanie kvapôčok, zahrnujú smerovanie kvapôčok do alebo blízko skvapalneného plynu, ako je kvapalný argón a kvapalný dusík, pričom sa vytvoria zmrazené mikrokvapôčky, ktoré sa potom oddelia od kvapalného plynu. Zmrazené mikrokvapôčky sa potom vystavia pôsobeniu kvapalného ne-rozpúšťadla, ako je etanol alebo zmes etanolu s hexánom alebo pentánom.

Rozpúšťadlo v zmrazených mikrokvapôčkach sa extrahuje ako pevná látka a/alebo kvapalina do nerozpúšťadla za vzniku mikročastíc obsahujúcich stabilizovaný hGH. Zmiešanie etanolu s inými nerozpúšťadlami, ako je hexán alebo pentán, môže zvýšiť rýchlosť extrakcie rozpúšťadlom nad rýchlosť dosiahnutú samotným etanolom, z niektorých polymérov, ako sú poly-(laktid-ko-glykolid)ové polyméry.

Veľký rozsah veľkosti mikročastíc s trvalým uvoľňovaním hGH možno vyrobiť menením veľkosti kvapôčok, napríklad zmenou priemeru ultrazvukovej dýzy. Ak sú žiaduce veľmi veľké mikročastice, mikročastice môžu byť vtláčané ihlou priamo do studenej kvapaliny. Zvýšením viskozity polymérového roztoku sa môže zvýšiť aj veľkosť mikročastíc. Týmto spôsobom sa môžu vyrábať mikročas tice s veľkosťou napr. v rozmedzí priemeru väčšom ako od 1000 do 1 pm.

Ešte iný spôsob vzniku prostriedku s trvalým uvoľňovaním hGH z polymémeho roztoku zahrňuje liatie filmu, ako napríklad do foriem, za vzniku filmu alebo nejakého tvaru. Napríklad po vliatí polymémeho roztoku obsahujúceho disperziu častíc stabilizovaného hGH do formy sa polymémy roztok odstraňuje spôsobmi známymi v oblasti techniky alebo sa teplota polymémeho roztoku znižuje, až kým sa nezíska film alebo tvar so stálou suchou hmotnosťou. Odlievanie filmu polymémeho roztoku, ktorý obsahuje biologicky aktívne činidlo, je ďalej opísané v sprievodnej USA patentovej prihláške č. 08/237 057, ktorej opis je tu zahrnutý ako odkaz.

Predpokladá sa, že hGH sa môže uvoľňovať dvoma rôznymi mechanizmami. hGH sa môže uvoľňovať difúziou vodou naplnenými kanálmi, ktoré vzniknú v polymémej matrici, keď sa rozpúšťa hGH, alebo prázdnymi miestami vytvorenými odstránením polymémych rozpúšťadiel počas syntézy prostriedku s trvalým uvoľňovaním.

Druhým mechanizmom je uvoľňovanie hGH degradáciou polyméru. Rýchlosť degradácie môže byť regulovaná zmenou vlastnosti polyméru, ktoré ovplyvňujú rýchlosť hydratácie polyméru. Medzi tieto vlastnosti patrí napr. pomer rôznych monomérov, ako je laktid a glykolid, obsiahnutý v polyméri, použitie L-izoméru monoméru miesto racemickej zmesi a molekulová hmotnosť polyméru. Tieto vlastnosti môžu ovplyvňovať hydrofilnosť a kryštalickú schopnosť, ktoré regulujú rýchlosť hydratácie polyméru. Do prostriedku je možné zahrnúť tiež aj hydrofilné excipienty, ako sú soli, cukry a povrchovo aktívne činidlá, aby sa zvýšila hydratácia. Tieto excipienty môžu meniť rýchlosť erózie polyméru.

Zmenou vlastností polyméru sa dajú regulovať príspevky difúzie a/alebo degradácie polyméru na uvoľňovanie hGH. Napríklad zvýšením obsahu glykolidu v poly(laktid-ko-glykolid)ovom polyméri a znížením molekulovej hmotnosti polyméru je možné zvýšiť hydrolýzu polyméru, a teda dosiahnuť zvýšené uvoľňovanie hGH z polymérovej erózie.

Rýchlosť hydrolýzy polyméru je zvýšená tiež pri neutrálnom pH. K polymémemu roztoku sa teda môžu pridávať kyslé alebo bázické excipienty, používané pri vzniku mikroguľôčok, aby sa zmenila rýchlosť erózie polyméru.

Prostriedok podľa tohto vynálezu sa môže podávať človeku alebo inému živočíchovi injekčné, implantáciou (napr. subkutánne, intramuskuláme, intraperitoálne, intrakrainálne, intravaginálne a intradermálne), podávaním do mukóznych membrán (napr. intranazálne alebo pomocou čapíkov) alebo podávaním in situ (napr. klystírom alebo aerosólovým sprejom), aby sa dosiahla žiadaná dávka hGH na základe známych parametrov na liečenie hGH rôznych lekárskych stavov.

Vynález bude teraz ďalej a podrobne opísaný nasledujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Tvorba hGH stabilizovaného zinočnatými iónmi V tomto príklade bol použitý ľudský rastový hormón (hGH), ktorého DNA sekvencia je opísaná v USA patente 4 898 830 Goeddela a spol. Ľudský rastový hormón bol stabilizovaný vytvorením nerozpustných komplexov so zinkom.

hGH bol rozpustený vo vzorkách 4mM pufia hydrogenuhličitanu sodného (pH 7,2). Vznikli hGH roztoky s 0,1 a 0,5 mM koncentráciou hGH. Z deionizovanej vody a dihydrátu octanu zinočnatého sa pripraví 0,9 mM roztok zinočnatých iónov, a ten sa potom pridá k hGH roztokom za vzniku Zn²⁺-hGH komplexu. pH tohto komplexu sa potom pridaním 1 % (hmotn.) kyseliny octovej upraví na 0,7 až

7,4. Vytvorí sa mliečna suspendovaná zrazenina obsahujúca vytvorený hGH stabilizovaný zinočnatými iónmi.

Na suspenziu hGH stabilizovaného zinočnatými iónmi sa potom ultrazvukovou dýzou (typ VI A, Sonics and Materials, Danbury, Kt.) pôsobí ultrazvukom a potom sa táto suspenzia nastrieka do polypropylénovej nádoby (priemer 17 cm, výška 8 cm), ktorá obsahuje kvapalný dusík. Vytvoria sa zmrznuté častice. Polypropylénová nádoba sa potom umiestni do mrazáku nastaveného na -80 °C, až kým sa kvapalný dusík neodparí. Zmrazené častice, ktoré obsahujú hGH stabilizovaný zinočnatými iónmi, sa potom lyofilizujú za vzniku častíc hGH stabilizovaného zinočnatými iónmi.

Príklad 2

Príprava PLGA mikročastíc obsahujúcich biologicky aktívny hGH stabilizovaný proti agregácii

Mikroguľôčky, ktoré obsahujú ľudský rastový hormón (hGH) stabilizovaný zinočnatými iónmi, sa pripraví z hydrofilného poly(laktid-ko-glykolid)ového polyméru RG502H, ktorý má voľné karboxylové koncové skupiny (tu ďalej „neblokovaný PLGA“) (50 : 50 PLGA, molekulová hmotnosť 9300, Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc.) alebo hydrofóbnejšieho PLGA polyméru s blokovanými karboxylovými koncovými skupinami (tu ďalej „blokovaný PLGA“) (50 : 50 PLGA, molekulová hmotnosť 10 0Q0, šarža č. 115-56-1, Birmingham Polymers, Inc., Birmiri' gham, Al.). _Ä

Polymér sa rozpustí v metylénchloride pri teplote miestnosti. Častice lyofilizovaného hGH sa pridajú k polymémemu roztoku a pridá sa tiež uhličitan zinočnatý. Na zmes sa potom pôsobí ultrazvukom. Získa sa homogénna suspenzia. Táto suspenzia sa atomizuje ultrazvukovou dýzou do vrstvy zmrazeného etanolu prevrstveného kvapalným dusíkom. Nádoba, ktorá obsahuje mikroguľôčky, sa skladuje pri -80 °C, aby sa extrahoval metylénchlorid,. a potom sa vysuší vymrazením. Získa sa tak voľne sypký prášok.

Príklad 3

Analýza hGH proteínu uzatvoreného v kapsulách

Integrita hGH uzatvoreného v kapsulách sa stanovuje rozpustením nehydratovaných mikroguľôčok v metylénchloride a acetóne obsahujúcom proteín, vysušením, vymrazením a opätovným uvedením do HEPES pufra, ktorý obsahuje 10 mM EDTA. Urobia sa príslušné kontroly, aby sa zabezpečilo, že proces extrakcie neovplyvňuje integritu proteínu.

Integrita hGH uzatvoreného v kapsulách sa analyzuje vytesňovacou chromatografiou (SEC) zmeraním percent monoméru hGH obsiahnutého v hGH po uzatvorení toboliek.

Výsledky tejto SEC analýzy integrity hGH mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH sú uvedené nižšie:

prostriedok (polymér, percentá % monoméru uhličitanu zinočnatého(SEC)

31K neblokovaný, 6 % ZnCO₃98,6

31K neblokovaný, 6 % ZnCO₃99,2

31K neblokovaný, 3 % ZnCO₃97,7

31K neblokovaný, 3 % ZnCO₃97,8

SK 281571 Β6

31K neblokovaný, 1 %ZnCO₃97,6

IK neblokovaný, 0%ZnCO₃97,8

31K neblokovaný, 0%ZnCO₃97,1

10K blokovaný, 1 % ZnCO₃98,2

10K blokovaný, 1 %ZnCO₃98,4

8K neblolkovaný, 0 % ZnCO₃98,5

10K blokovaný, 1 %ZnCO₃98,4

Výsledky ukazujú, že spôsob zahrnutia do kapsúl nespôsobuje agregáciu proteínu. Výťažok (v percentách) proteínu izolovaného postupom extrakcie (vzhľadom na množstvo meraného obsahom dusíka mikroguľôčok) je v rozsahu od 40 do 98 % hmotn. Predpokladá sa, že premenlivosť súvisí so stratami materiálu počas stupňov prenosu počas postupu. Postup extrakcie je modifikovaný tak, aby sa zvýšil výťažok proteínu.

Príklad 4

Stanovenie účinku uhličitanu zinočnatého na kinetiky uvoľňovania in vitro

Mikroguľôčky boli vyrobené podľa toho, ako je to opísané v príklade 2, a obsahovali 15 % hmotn. hGH (komplex Zn:hGH proteín 6 : 1), 0, 1, 6, 10 alebo 20 % hmotn. uhličitanu zinočnatého a poly(laktid-ko-glykolid)ový polymér.

Kinetiky in vitro uvoľňovania prostriedkov mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH obsahujúcich rôzne koncentrácie uhličitanu zinočnatého boli stanovené suspendovaním podielu (10 mg) každého typu mikroguľôčok v rôznych 1,5 ml vzorkách pufra HEPES (50mM HEPES, 10 mM KC1, 0,1 % (hmotn.) NaN₃), pH 7,2, a potom boli inkubované pri 37 °C. Množstvo uvoľneného proteínu bolo kvantitatívne stanovené odobratím vzoriek pufra 1., 3., 7., 10., 14., 21. a 28. deň po inkubácii a nahradením čerstvým pufrom po každom odobratí.

Bola vynesená krivka súhrnného počtu uvoľnených percent (vzhľadom na pôvodný obsah hGH v začiatočnej hmote mikroguľôčok) oproti času. Vzorky uvoľneného proteínu z každého bodu krivky boli testované na obsah monoméru hGH vytesňovacou chromatografiou.

O uhličitane zinočnatom sa predpokladá, že pôsobí ako nádržka zinočnatých iónov, teda je zvýhodnená tvorba komplexu Zn-hGH a znevýhodnená disociácia na rozpustný hGH. Pretože rozpustnosť uhličitanu zinočnatého vo vode je malá, uvoľňovanie zinočnatých iónov zo zásobníka je pomalé, čo moduluje rozpustnosť proteínu.

Analýza zistila, že v neprítomnosti uhličitanu zinočnatého bola rýchlosť uvoľňovania hGH uzatvoreného v kapsule veľmi veľká a všetok proteín bol uvoľnený vo veľmi krátkom čase.

Príklad 5

Test hGH po in vivo degradácii mikroguľôčok blokovaných PLGA s hGH stabilizovaným zinočnatými iónmi

Mikroguľôčky blokovaného PLGA, obsahujúce 15 % hmotn. hGH stabilizovaného zinočnatými iónmi a 0,6 alebo 20 % hmotn. uhličitanu zinočnatého, boli vyrobené podľa spôsobu z príkladu 2. Skupinám testovacích myší boli injekciou subkutánne podané 50 mg vzorky rôznych mikroguľôčok hGH. Myši boli po 60 dňoch usmrtené a z miest injekcie boli odobrané vzorky kože. Vzorky odobratej kože boli umiestnené do 10 % (hmotn.) neutrálneho pufrovaného formalínu na aspoň 24 h. Potom boli orezané žiletkou, aby sa odstránila nadbytočná koža a boli umiestnené do PBS.

Vzorky tkaniva boli spracované v Pathology Associates, Inc. (Frederick, Md.). Vzorky kože boli uložené do glykometakrylátu, boli z nich pripravené rezy a tie boli analyzované na prítomnosť hGH použitím zostavy HistoS can/LymphoScan Staining Kit (výrobok č. 24 - 408M, Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N. Y.) podľa pokynov výrobcu. Vzorky tkanív boli vyhodnotené na prítomnosť alebo neprítomnosť zafarbenia, ktoré indikovalo prítomnosť alebo neprítomnosť hGH vo vzorke.

Všetky vzorky kože, ktoré súviseli s injekciami mikroguľôčok hGH, boli testované pozitívne na prítomnosť hGH, čo teda ukazuje, že mikroguľôčky blokovaného PLGA obsahovali hGH ešte po 60 dňoch in vivo.

Spôsob opísaný v príklade 2 bol použitý na prípravu mikroguľôčok zahrnutím 0 alebo 15 % hmotn. hGH do kapsúl vo forme komplexu Zn:hGH a tiež 0, 1 alebo 6 % hmotn. soli uhličitanu zinočnatého v blokovanom PLGA a v neblokovanom PLGA.

In vivo degradácie mikroguľôčok neblokovaného PLGA boli porovnané s mikroguľôčkami blokovaného PLGA podaním injekcií vzoriek mikroguľôčok myšiam a následným analyzovaním mikroguľôčok ostávajúcich v mieste injekcie v rôznom čase po injekcii. V každom čase boli testované tri myši na každú vzorku mikroguľôčok. V deň podania mikroguľôčok bolo do ampuliek obsahujúcich 50 ±1 mg mikroguľôčok pridané 750 μί riedidla (3 % (hmotn.) karboxymetylcelulózy (s nízkou viskozitou) a 1 % hmotn. Tweenu 20 v soľnom roztoku). Ampulky sa potom hneď intenzívne trepú. Vytvorí sa suspenzia, ktorá sa potom prenesie do 1 ml injekčnej striekačky bez ihly.

Myši (samci Sprague-Dawley) boli anestetizované zmesou halotanu a kyslíka. Miesta vpichu injekcie (intraskapuláma oblasť) bola oholená a označená stálou Letovacou farbou, aby sa získalo presné miesto kože, kde bola vzorka podaná. Každej myši bola injekčné podaná celá ampulka mikroguľôčok ihlou s veľkosťou rozmeru 18 až 21.

Vo vopred určený deň (15., 30., 59. a 90. po injekcii, keď zviera dostalo mikroguľôčky blokovaného PLGA, alebo 7., 14., 21., 28. a 45. deň po podaní injekcie zvieraťu, ktoré dostalo mikroguľôčky neblokovaného PLGA) boli myši usmrtené zadusením oxidom uhličitým a koža v mieste vpichu (včítane mikroguľôčok) bola odobratá. Keďže mikroguľôčky majú tendenciu tvoriť v mieste vpichu zhluky, prítomnosť alebo neprítomnosť mikroguľôčok bola stanovená vizuálne.

Vizuálna inšpekcia zistila, že mikroguľôčky neblokovaného PLGA degradovali podstatne rýchlejšie ako mikroguľôčky blokovaného PLGA a že pridaním uhličitanu zinočnatého k blokovanému PLGA podstatne spomalilo polymérmi degradáciu.

Napríklad u myší, ktorým boli injekčné podané mikroguľôčky nablokovaného PLGA ktoré obsahujú 0 % hmotn. hGH a 0 alebo 1 % hmotn. uhličitanu zinočnatého, neboli vidieť žiadne guľôčky 21. deň. Navyše u myší, ktorým boli injekčné podané mikroguľôčky blokovaného PLGA obsahujúce 0 % hmotn. hGH a 0 % hmotn. uhličitanu zinočnatého, bolo niekoľko mikroguľôčok vidieť 60. deň, žiadnu nebolo vidieť 90. deň. Navyše u myší, ktorým boli injekčné podané mikroguľôčky blokovaného PLGA ktoré obsahujú 0 alebo 15 % hmotn. hGH a 6 % hmotn. uhličitanu zinočnatého, bolo mikroguľôčky vidieť 90. deň.

Príklad 6

Farmakokinetické štúdie in vivo mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH u krýs

U krýs boli uskutočnené štúdie, ktoré testovali rôzne prostriedky mikroguľôčok s hGH. Boli stanovené farmakokinetické parametre po intravenóznom (i. v.) podaní, subkutánnom podaní a podaní SC osmotickou pumpou (Alzet) hGH. Boli vyhodnotené profily v sére a in vivo rýchlosti uvoľňovania rôznych prostriedkov mikroguľôčok hGH.

SK 281571 Β6

Krysy Sprague-Dawley boli rozdelené do skupín po troch zvieratách, náhodne podľa telesnej hmotnosti, a každej skupine bol podaný jeden prostriedok mikroguľôčok hGH. Krysám bolo injekčné subkutánne podané približne

7,5 mg hGH v 50 mg jedného typu rôznych mikroguľôčok, suspendovaných v 0,75 ml vodného riedidla pre injekcie. Prostriedok riedidla obsahoval 3 % hmotn. CMC (s nízkou viskozitou) a 1 % hmotn. Polysorbátu 20 v 0,9 % (hmotn.) NaCl. Podaná dávka mikroguľôčok bola stanovená nepriamo odvážením celej dávky v injekčnej ampulke a opravou na zostatkové injekčné riedidlo. Dávka hGH bola vypočítaná na každú náplň proteínu mikroguľôčok stanovením analýzy dusíka.

Vzorky krvi boli odobrané vo vopred stanovených intervaloch až do 30 dní po injekcii. Vzorky krvi po 250 1 boli odobrané počas prvých 24 h a aspoň po 400 1 v každom časovom bode po 24 h. Vzorky krvi boli zrazené a koncentrácie hGH v sére boli stanovené rádioimunotestom. Rádioimunotestovacia (RIA) zostava od ICN bola otestovaná a použitá na stanovenie hladín hGH v kyslom sére.

Na stanovenie farmakokinetických parametrov bol hGH v soľnom roztoku podaný krysám subkutánne bolus injekciou, intravenózne alebo bol dodávaný osmotickou pumpou (Alzet model 2ML4), ktorá bola subkutánne implantovaná.

Tri skupiny krýs dostali jedinú subkutánnu injekciu hGH v 0,9 % (hmotn.) NaCl v dávke 0,5 alebo 7,5 mg/kg pri objeme dávky 1,0 mg/kg. Dve skupiny dostali jedinú intravenóznu bolus injekciu hGH v 0,9 % (hmotn.) NaCl v dávke 1,0 a 5,0 mg hGH na kg kiýs pri objeme dávky 1,0 mg/kg. Pri štúdiu s Alzetovou pumpou boli krysy rozdelené do štyroch skupín po troch krysách, náhodne podľa telesnej hmotnosti, a dostali dávku 20 mg/ml a 40 mg/ml hGH v 0,9 % (hmotn.) NaCl naplnenú v pumpách (Alzet model 2002,200 1, uvoľňovanie 14 dní) a dávku 4 mg/ml a 12 mg/ml hGH v 0,9 % (hmotn.) soľného roztoku naplneného v pumpách (Alzet model 2ML4, 2 ml, uvoľňovanie 28 dní). Očakávaná rýchlosť uvoľňovania z púmp zodpovedala 2 a 4 až 6 % hmotn. dávky ProLease hGH (okolo 15 mg/kg) za deň. Alzetové pumpy boli implantované subkutánne v interskapulámej oblasti po namočení v sterilnom soľnom roztoku v čase 1 až 2 minút.

Prostriedky mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH syntetizované, ako je opísané v príklade 2 obsahovali 15 % hmotn. hGH komplexovaného so Zn v pomere 6 : 1 (Zn : hGH), 0, l, 3 alebo 6 % hmotn. uhličitanu zinočnatého a 8K neblokovaný PLGA, 10K blokovaný PLGA alebo 31K neblokovaný PLGA.

Na vyhodnotenie rôznych prostriedkov s trvalým uvoľňovaním hGH boli použité in vivo indexy Cmax, Cd5 a Cmax/CdS, kde Cmax znamená maximálnu pozorovanú koncentráciu v sére a Cd5 znamená koncentráciu v sére 5. deň, čo by mala byť približne koncentrácia v stabilnom stave. Výsledky boli nasledujúce:

prostriedok „zvýšenie“ % hmotn. Cmax Cd5 Cmax/Css invitro monoméru (mg/ml)(mg/ml) (% hmotn.) 7, deň

8KPLGA	22,0±	99,3*	323,3±	20,4±	19,5±
neblokovaný	0,9		98,6	14,2	10,6
0%ZnCO₃
8KPLGA	16,4±	97,3*	309,0±	20,4±	39,5±
neblokovaný	1,6		67,1	14,2	17,7
1 %ZnCO₃
8KPLGA	15,9±	98,7	670,5±	9,0±	44,8±
neblokovaný	6,9		244,4	4,2	22,6
3%ZnCO₃

8KPLGA 17,6± 99,3 358,0± 18,8± 42,4± neblokovaný 2,7 58,9 14,7 6,8

6%ZnCO₃

31 PLGA	12,3±	98,2	592,0±	4,5± 132,5±
neblokovaný 0%ZnCO₃	1,1		318,2	1,5 47,9
31 PLGA	11,4±	98,8	432,7±	5,1± 84,1±
neblokovaný 1 %ZnCO₃	1,3		91,6	0,3 14,9
31 PLGA	7,9±	99,4	643,6±	8,0± 93,3±
neblokovaný 3%ZnCO₃	1,9		203,9	2,6 62,0
31 PLGA	15,8±	99,8	1691,8±	6,6± 262,2±
neblokovaný 6%ZnCO₃	0,5		340,0	0,8 83,5
10 PLGA	12,7±	99,3	615,9±	4,5± 155,6±
neblokovaný l%ZnCO₃	0,1		384,3	1,0 126,8
10 PLGA	18,1±	99,6	1053,2±	3,6± 291,7±
neblokovaný 3%ZnCO₃	3,2		293,3	0,8 71,1
10 PLGA	9,9±	99,0	1743,5±	4,9± 516,1±
neblokovaný 6%ZnCO₃	1,4		428,4	2,7 361,6

* Hodnoty získané z dvojitej dávky rovnakého prostriedku

Výsledky testovania ukázali, že dva neblokované polyméry (8K a 31K) mali odlišné in vivo kinetiky uvoľňovania pri porovnaní s pôvodným prostriedkom, ktorý používa blokovaný 10K PLGA a 6 % hmotn. uhličitanu zinočnatého. Cmax hodnoty boli všeobecne nižšie v prostriedkoch s neblokovaným polymérom ako pri vedúcom prostriedku, čo predpokladá, že začiatočné „zvýšenia“ môžu byť nižšie pri prostriedkoch s neblokovaným polyméroih. „Zvýšenie“ bolo definované ako percento uvoľnenia hGH v prvých 24 h po injekcii. Hodnoty „zvýšenia“ in vitro boli medzi 8 a 22 % hmotn. Obsah uhličitanu zinočnatého- v prostriedkoch mal vplyv na „zvýšenie“ alebo na in vitro profil uvoľňovania.

Koncentrácie v sére medzi 4. - 6. dňom boli udržované na dosť konštantnej hladine nad základnou hladinou (alebo hladinami pred vykrvácaním) v prostriedkoch s neblokovaným polymérom, zatiaľ čo koncentrácia v sére blokovaných polymérov bola v rovnakom čase blízko základnej hladiny. Údaje uvoľňovania in vitro až do 7. dní ukázali, že uvoľňovaný hGH proteín bol monomémy. Užitočné údaje nemožno získať po 6. dni v dôsledku tvorby prostriedku anti-hGH protilátky u krýs.

Príklad 7

Farmakokinetické štúdie u opice Rhesus

Predmetom tejto štúdie na primátoch bolo vyhotoviť farmakokinetické profily rôznych prostriedkov trvalo uvoľňujúcich hGH pri porovnaní s tradičnými spôsobmi podávania hGH (napr. bolus s. k. injekciou, denný s. k. injekciou a s. k. injekciou kombinovanou s použitím osmotickej pumpy) a stanoviť, či prostriedok s trvalým uvoľňovaním ponúka optimálny koncentračný profil hGH v krvi.

Prostriedky mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH, ktoré boli testované, predstavovali 1. 15 % hmotn. hGH (komplexovaný so Zn v pomere hGH : Zn 1 : 6), 6 % hmotn. uhličitanu zinočnatého a 10K blokovaný PLGA,

2. 15 % hmotn. hGH (komplexovaný so Zn v pomere hGH : Zn 1 : 6), 1 % hmotn. uhličitanu zinočnatého a 8K neblokovaný PLGA („RG502H“ PLGA polymér) a

3. 15 % hmotn. hGH (komplexovaný so Zn v pomere

SK 281571 Β6 hGH : Zn 1 : 6), 1 % hmotn. uhličitanu zinočnatého a 31K neblokovaný PLGA („RG503H“ PLGA polymér).

V každej skupine boli štyri opice a každé zviera dostalo jednu subkutánnu injekciu do dorzálnej cervikálnej oblasti

1. deň. Dávka 160 mg mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH (24 mg hGH) bola podávaná každej opici v

1,2 ml injekčného riedidla ihlou s veľkosťou rozmeru 20. Injekčným riedidlom bolo vodné riedidlo obsahujúce 3 % hmotn. karboxymetylcelulózy (sodná soľ), 1 % hmotn. Tweenu 20 (polysorbát 20) a 0,9 % hmotn. chloridu sodného.

Dávka hGH bola taká, aby ponúkla merateľné koncentrácie hGH v sére pre farmakokinetické štúdie. Na získanie farmakokinetických parametrov boli zahrnuté do štúdie ďalšie skupiny po štyroch zvieratách, špecificky 1. jedna subkutánna injekcia (24 mg hGH), 2. denne subkutánna injekcia (24 mg/28 dní - 0,86 mg hGH/deň), 3. subkutánna injekcia (3,6 mg hGH) kombinovaná s Alzetovou osmotickou pumpou (20,4 mg hGH) (celková dávka 24 mg hGH) a 4. subkutánna injekcia injekčného riedidla ako kontrola (pre kontrolnú skupinu s riedidlom boli použité iba tri opice).

Na analýzy hGH, IGF1, IGFBP3 a anti-hGH protilátky boli vzorky krvi zhromažďované v nasledujúcich intervaloch: -7, -5, -3, deň pred dávkou, pol hodiny po dávke 1, 2, 3, 5, 8, 10,12,24,28, 32 a 48 hodín a 5,4, 6, 8,11,14,17, 20, 23, 26, 29, 32, 25, 28, 41, 44, 47, 50, 53 a 56 deň po dávke.

Boli merané koncentrácie IGF-1 a hGH v sére. Na kvantitatívne vyhodnotenie hGH v sére opič bola použitá zostava IRMA súprava od RADÍM (dodávaná WEIN Laboratories, P.O. Box 227, Succasunna, N.J.). Test IRMA mal limit kvantitatívneho hodnotenia v PBS pufri 0,1 ng/ml a v zobranom sére juvenilnej opice Rhesus 1,5 ng/ml so základnou hladinou GH okolo 4 ng/ml.

Test IRMA bol vyhodnocovaný pri koncentrácii 1,5 až 75 ng/ml pri zobranom sére juvenilnej opice Rhesus. Presnosť merania je v rozmedzi ±10 %.

Výsledky ukázali, že mikroguľôčky s trvalým uvoľňovaním hGH uvoľňovali významné trvalé hladiny hGH dlhšie ako jeden mesiac, zatiaľ čo subkutánne injekcie neboli schopné udržovať v sére rovnaké hladiny.

Sérový profil IGF-1 ukazoval, že koncentrácie IGF-1 v sére boli vyhodnocované nad základnými hodnotami medzi 2. a 29. dňom po podaní mikročastic. To ukazuje, že sa z mikroguľôčok s trvalým uvoľňovaním hGH uvoľňuje dostatok hGH, aby spôsobil farmakodynamický efekt. To tiež ukazuje, že uvoľňovaný hGH bol biologicky aktívny, čo predpokladá, že proces zahrnutia do kapsúl neovplyvňuje nepriaznivo biologickú aktivitu hGH.

Zručný odborník z oblasti techniky rozpozná alebo je schopný použitím nie viac ako rutinnej experimentácie rozpoznať veľa ekvivalentov špecifických uskutočnení vynálezu, ktoré sú tu opísané. Tieto ekvivalenty, sú myslené ako ekvivalenty, ktoré sú zahrnuté v rozsahu nasledujúcich nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostriedok na trvalé uvoľňovanie ľudského rastového hormónu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

a) biozlučiteľný polymér a

b) častice katiónmi kovu viazaného ľudského rastového hormónu, kde molámy pomer katiónu kovu k proteínu je viac ako 4 : 1 až 10 : 1, pričom častice katiónmi kovu via zaného ľudského rastového hormónu sú prítomné v uvedenom polyméri v koncentrácii 0,01 až 50 % hmotn.
2. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molámy pomer katiónu kovu k proteínu je najmenej 6:1.
3. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molámy pomer katiónu kovu k proteínu je približne 10 :1.
4. Prostriedok podľa nároku laž3, vyznačujúci sa tým, že katiónom kovu je zinočnatý ión.
5. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že katiónom kovu viazaného ľudského rastového hormónu je vodorozpustná kovová soľ katiónu kovu.
6. Prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že vodorozpustnou kovovou soľou je acetát zinočnatý.
7. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že častice katiónmi kovu viazaného ľudského rastového hormónu sú dispergované v biozlučiteľnom polyméri.
8. Prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že polymérje vybraný zo skupiny obsahujúcej poly(laktid), poly(glykolid), poly(laktid-ko-glykolid), poly(glykolovú) kyselinu, polykaprolaktón, polyuhličitan, polyesteramid, polyanhydrid, poly(amínová) kyselina, polyortoester, polykyanakrylát, poly(dioxanó), poly(alkylén-oxalát), polyuretán, ich zmesi a ich kopolyméry.
9. Prostriedok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že polymér je vybraný zo skupiny obsahujúcej poly(laktid), poly(glykolid) a poly(laktid-ko-glykolid).
10. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že častice ľudského rastového hormónu stabilizovaného katiónom kovu sú v polyméri prítomné v množstve 0,1 až 30, výhodne 0,1 až 20 % hmotn.
11. Prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že častice ľudského rastového hormónu stabilizovaného katiónom kovu sú v polyméri prítomné v množstve 15 % hmotn.
12. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 11, v y z n a č u j ú c i sa tým, že biozlučiteľný polymér ďalej obsahuje zložku katiónu kovu.
13. Prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že zložkou katiónu kovu je zinočnatý ión.
14. Prostriedok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že zložka katiónu kovu je vybraná zo skupiny pozostávajúcej zo ZnCO₃, ZN^C^Ov), Zn(OAc)₂, ZnSO₄ a ZnCl₂.
15. Prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že zložkou katiónu kovu je horečnatý ión.
16. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že zložka katiónu kovu je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z Mg(OH)2, MgCO₃, Mg₃(C₆H₅O₇)₂, Mg(OAc)₂, MgSO₄ a MgCl₂.
17. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 13 až 16, vyznačujúci sa tým, že pomer zložky katiónu kovu k polyméru je 1:99 až: 2 % hmotn., výhodne 1 % hmotn.
18. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

a) biozlučiteľný poly(laktid-ko-glykolid), v ktorom je dispergovaný zinočnatý ión ako uhličitan zinočnatý, a

SK 281571 Β6

b) častice zinočnatým katiónom viazaného ľudského rastového hormónu, ktorým je acetát zinočnatý v molámom pomere zinočnatý katión : ľudský rastový hormón 10 : 1, pričom častice katiónmi kovu viazaného ľudského rastového hormónu sú prítomné v uvedenom polyméri v koncentrácii 15 % hmotn.