NO316104B1 - Blanding for vedvarende frigjöring av humant veksthormon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører blanding for vedvarende frigjøring av humant veksthormon Humant veksthormon (hGH) er et protein som utskilles av hypofysen og som kan fremstilles ved rekombinant genetisk manipulering hGH vil bevirke vekst i alt kroppsvev som kan vokse

hGH benyttes i alminnelighet for å behandle pasienter som lider av hypopituitær dvergvekst For tiden administreres vandig hGH som en subkutan bolus tre ganger per uke eller en gang per dag, til pasienter for å opprettholde passende serummvåer av hGH For pasienter som kronisk får hGH resulterer de hyppige injeksjonene i etterievelses-problemer hos pasienten

For å løse problemene assosiert med gjentatte injeksjoner av vandig hGH, er det gjort forsøk på å formulere anordninger med kontrollert fngjønng inneholdende høyere doser av hGH enn en bolusmjeksjon, innkapslet i en polymer matriks hvor hGH vil bli frigjort in vivo over et tidsrom på ca 1 uke eller mer

Disse anordningene med kontrollert frigjøring har imidlertid ofte vist høye utbrudd av hGH-frigjønng til å begynne med og deretter minimal hGH-frigjønng Som følge av den høye hGH-konsentrasjon i disse anordningene med kontrollert fngjønng, har hGH-molekylene dessuten hatt tendens til etter noen dager å aggregere under dannelse av aggregert hGH som er immunogen in vivo og sannsynligvis har redusert biologisk virkning

Det eksisterer således et behov for anordninger for vedvarende frigjøring av biologisk aktiv hGH in vivo, som ikke forårsaker en immunsystem-respons i løpet av frigjønngsperioden for hGH

Denne oppfinnelse vedrører en blanding for vedvarende frigjøring av biologisk aktivt, stabilisert, humant veksthormon (hGH), og det besknves fremgangsmåter for fremstilling og bruk av blandingen Blandingen med vedvarende frigjøring omfatter ifølge oppfinnelsen en polymer matriks av en bioforlikelig polymer og partikler av biologisk aktivt, metallkation-stabilisert hGH, hvor de nevnte partikler er dispergert i den bioforlikelige polymer

Blandingen for vedvarende fngjønng av humant veksthormon ifølge foreliggende oppfinnelse, er kjennetegnet ved at den omfatter a) en bioforlikelig polymer, og b) partikler av metallkation-kompleksert humant veksthormon, hvor molforholdet mellom metallkation og protein er større enn 4 1 og mindre enn eller lik 10 1, og hvor blandingen ikke er en poly(laktid-koglykohd)mikrokule inneholdende partikler på 1 til 16 vekt% Zn<+2->stabilisert humant veksthormon med en molar ratio av 2n<+2> til humant veksthormon på 6 1

Det beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av en blanding for vedvarende frigjøring av hGH som omfatter oppløsning av en bioforlikelig polymer i et polymer-løsningsmiddel for å danne en polymerløsning, dispergenng av partikler av biologisk aktivt stabilisert hGH i polymerløsningen, og påfølgende størkning av polymeren for å danne en polymer matriks som inneholder en dispersjon av de nevnte hGH-partiklene

Blandingen med vedvarende frigjøring ifølge foreliggende oppfinnelse, kan anvendes ved at det i et individ opprettes et terapeutisk effektivt nivå av biologisk aktivt, ikke-aggregert humant veksthormon i blodet over et forlenget tidsrom, ved at vedkommende administreres en dose av nevnte blanding med vedvarende frigjøring

Fordelene ved denne formulering med vedvarende fngjønng av hGH, er

bl a lengre, mer konstante in vivo hGH-nivåer i blodet, lavere initiale utbrudd av hGH og større terapeutiske fordeler ved at fluktuasjoner i serum hGH-nivåene elimineres Fordelene medfører også forbedret etterlevelse og aksept hos pasienten ved å redusere det antall injeksjoner som trengs Fordelene innbefatter også muligheten for å benytte mindre mengder hGH sammenlignet med bolusinjeksjon, siden serum hGH-nivåer nærmere de terapeutiske terskelverdier opprettholdes

Det humane veksthormon (hGH) som benyttes for oppfinnelsen er biologisk aktivt hGH i dets molekylære (monomere eller ikke-aggregerte) form Molekylært hGH er typisk ikke-immunogent

Aggregert hGH kan indusere en immunrespons som resulterer i at det dannes antistoffer mot hGH Dette kan nedsette effektiviteten av langvarig hGH-terapi Dessuten kan aggregert hGH stimulere en autoimmunrespons mot endogent hGH En vedvarende frigjøring av biologisk aktivt, ikke-aggregert humant veksthormon, er en fngjønng som resulterer i målbare serummvåer av biologisk aktivt monomert hGH over lengre tidsrom enn hva som oppnås etter direkte administrering av vandig hGH Det er å foretrekke at en vedvarende fngjønng består i en frigjøring av hGH i et tidsrom på ca 1 uke eller mer, og helst i et tidsrom på ca 2 uker eller mer

En vedvarende frigjøring av biologisk aktivt, ikke-aggregert hGH fra en polymer matriks kan være kontinuerlig eller ikke-kontinuerhg frigjøring med relativt konstante eller varierende fngjønngshastigheter Kontinuiteten av frigjort hGH og nivået av frigjort hGH kan fastslås ved blant annet å benytte en eller flere typer polymerblandinger, hGH-ladninger og/eller seleksjon av hjelpestoffer for å frembringe den ønskede effekt

Stabilisert hGH omfatter biologisk aktivt, ikke-aggregert hGH som er kompleksert med minst én type multivalent metallkation som har valensen +2 eller høyere, fra en metallkation-komponent Stabilisert hGH i blandingen med vedvarende frigjøring ifølge foreliggende oppfinnelse har partikkelform

Passende multivalente metallkationer innbefatter metallkationer som inngår i bioforlikehge metallkation-komponenter En metallkation-komponent er bioforlikelig dersom kation-komponenten i de anvendte mengder, er ugiftig for mottageren og heller ikke medfører vesentlige skadelige eller uønskede effekter i mottagerens kropp, som f eks en immunologisk reaksjon på injeksjonsstedet

Det molare forhold mellom metallkation-komponent og hGH for det metallkation som stabiliserer hGH, er i alminnelighet mellom 4 1 og 10 1

Et foretrukket metallkation benyttet til stabihsenng av hGH er Zn<+2> I en mer foretrukket utførelsesform er molforholdet mellom metallkation-komponenten som inneholder Zn<+2->kationer, og hGH, ca 10 1

Et metallkations egnethet for stabihsenng av hGH kan bestemmes av fagmannen gjennom en rekke stabihtetsindikerende teknikker, så som polyakrylamid-gelelektroforese, isoelektnsk fokusenng, omvendt-fase kromatografi, HPLC og styrketester på hGH-lyofiltserte partikler inneholdende metallkationer, for å bestemme styrken av hGH etter lyofilisenng og varigheten av frigjøring fra mikropartikler I stabilisert hGH reduseres den tendens som hGH har til i en mikropartikkel å aggregere under hydratisering in vivo og/eller til å tape biologisk aktivitet eller styrke som følge av hydratisering eller som følge av prosessen for å danne en blanding med vedvarende fngjønng, eller som følge av de kjemiske karaktensttka av en blanding med vedvarende frigjøring, ved kompleksenng av minst én type metallkation med hGH før hGH bringes i kontakt med en polymerløsnmg

Stabilisert hGH er i alminnelighet stabilisert mot vesentlig aggregering in vivo i løpet av penoden med vedvarende frigjøring Vesentlig aggregering defineres som en aggregenngsgrad som resulterer i aggregasjon av ca 15% eller mer, av den oppnnnelige mengde innkapslet hGH-monomer Fortrinnsvis holdes aggregasjonen lavere enn ca 5% av den opprinnelige hGH-monomerdose Helst holdes aggregasjonen lavere enn ca 2% av den opprinnelige dose

hGH i en hGH-blanding med vedvarende frigjøring, kan også blandes med andre hjelpestoffer, som fyllmidler, eller ytterligere stabiliserende midler, som f eks buffere, for å stabilisere hGH under lyofilisering

Fyllmidler er i alminnelighet inerte materialer Egnede fyllmidler vil være kjent for fagmannen

En polymer, eller polymer matriks som egner seg for blandingen med vedvarende frigjøring i henhold til foreliggende oppfinnelse, må være bioforlikelig En polymer er bioforlikelig dersom polymeren, og eventuelle nedbrytningsprodukter av polymeren, er ugiftige for mottageren og heller ikke medfører vesentlige skadelige eller uheldige virkninger, som f eks en immunologisk reaksjon omkring injeksjonsstedet på mottagerens kropp

Polymeren for hGH-blandingen med vedvarende fngjønng må også være bionedbrytbar Bionedbrytbar betyr i denne sammenheng at blandingen vil nedbrytes eller eroderes in vivo under dannelse av mindre kjemiske forbindelser Nedbrytning kan for eksempel skje ved enzymatiske, kjemiske og fysiske prosesser

Egnede bioforlikelige, bionedbrytbare polymerer innbefatter for eksempel poly(laktider), poly(glykolider), poly(laktid-koglykolider), poly(melkesyre)r, poly-(glykolsyre)r, poly(melkesyre-koglykolsyre)r, polykaprolakton, polykarbonater, polyesteramider, polyanhydnder, poly(aminosyrer), polyortoestere, polycyano-akryiater, poly(p-dioksanon), poly(alkylenoksalat)er, bionedbrytbare polyuretaner, blandinger og kopolymerer derav

Polymerenes terminale funksjonaliteter kan dessuten modifiseres For eksempel kan polyestere være blokkert, ublokkert eller utgjøre en blanding av blokkerte og ublokkerte polymerer En blokkert polymer er blokkert i henhold til klassisk definisjon på området, nærmere bestemt med blokkerte karboksyl-endegrupper Generelt sknver den blokkerende gruppe seg fra polymensasjons-imtiatoren og er typisk en alkylgruppe En ublokkert polymer er ublokkert i henhold til klassisk definisjon på området, og har frie karboksyl-endegrupper

Akseptable molekylvekter for polymerer som benyttes for foreliggende oppfinnelse vil kunne bestemmes av fagmannen ved å ta i betraktning slike faktorer som ønsket nedbrytningshastighet av polymeren, fysikalske egenskaper, som f eks mekanisk styrke og løsningshastigheten av polymeren i løsningsmidlet Et akseptabelt molekylvektområde er typisk ca 2000 dalton til ca

2 000 000 dalton I en foretrukket utførelsesform er polymeren en bionedbrytbar polymer eller kopolymer I en mer foretrukket utførelsesform er polymeren et poly(laktid-koglykohd) (heretter betegnet «PLGA») med et laktid glykolid-forhold på ca 1 1 og en molekylvekt på ca 5000 dalton til ca 70 000 dalton I en enda mer foretrukket utførelsesform er molekylvekten av det PLGA som benyttes i henhold til foreliggende oppfinnelse, ca 6000 til ca 31 000 dalton

Mengden av hGH som inngår i en dose mikropartikler med vedvarende frigjøring, eller i en alternativ anordning med vedvarende frigjøring som inneholder biologisk aktive, stabiliserte hGH-partikler, er en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde som kan fastsettes av fagmannen ved å ta hensyn til slike faktorer som kroppsvekt, hvilken tilstand som skal behandles, anvendt polymertype og fngjønngshastighet fra polymeren

I en utførelsesform inneholder en blanding med vedvarende hGH-frigjønng fra ca 0,01 vekt% til ca 50 vekt% biologisk aktive, stabiliserte hGH-partikler Den mengde av slike hGH-partikler som benyttes vil avhenge av den ønskede hGH-virkning, ønskede fngjønngsnivåer, tidspunktet for når hGH bør frigjøres og tidsforløpet som hGH skal frigjøres over Et foretrukket område av hGH-partikkel-ladning er mellom ca 0,1 vekt% og ca 30 vekt% hGH-partikler Et mer foretrukket område av hGH-partikkel-ladning er mellom ca 0,1 vekt% og ca 20 vekt% hGH-partikler Den mest foretrukne ladning av de biologisk aktive, stabiliserte hGH-partiklene er ca 15vekt%

I en annen utførelsesform inneholder en blanding med vedvarende hGH-fngjønng også en ytterligere metallkation-komponent, som ikke inngår i de stabiliserte hGH-partiklene og som er dispergert i polymeren Den andre metallkation-komponenten inneholder fortrinnsvis samme type metallkation som den som inngår i det stabiliserte hGH Som et alternativ kan den andre metallkation-komponenten inneholde én eller flere andre typer metallkation

Den andre metallkation-komponenten tjener til å modulere frigjøringen av hGH fra den polymere matnks i blandingen med vedvarende frigjøring, for eksempel ved å virke som et reservoar av metallkationer for ytterligere å forlenge det tidsrom som hGH stabiliseres over av et metallkation, for å øke stabiliteten av hGH i blandingen

En metallkation-komponent som benyttes for modulering av frigjøring inneholder i alminnelighet minst én type multivalent metallkation Eksempler på de andre metallkation-komponentene som er egnet til modulering av hGH-frigjønng, inkluderer, eller inneholder, for eksempel Mg(OH)2, MgC03 (som f eks 4MgC03 Mg(OH)2 5H20), ZnC03 (så som 3Zn(OH)2 2ZnC03), CaC03, Zn3(C6H507}2, Mg(OAc)2, MgS04, Zn(OAc)2, ZnS04l ZnCI2, MgCI2 og Mg3(CeH507)2 Et passende forhold mellom den andre metallkation-komponenten og polymeren er mellom ca 1 99 og ca 12 vektdeler Det optimale forhold avhenger av hvilken polymer og hvilken andre metallkation-komponent som benyttes

En polymermatriks som inneholder en dispergert metallkation-komponent for å modulere frigjøringen av et biologisk aktivt middel fra den polymere matriks, er ytterligere beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad nr 08/237 057, av 3 mai, 1994, og samtidig verserende PCT-patentsøknad PCT/US95/05511, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse

Blandingen med vedvarende hGH-frigjønng kan tilberedes i mange fasonger, som f eks en film, en pellet, en sylinder, en skive eller en mikropartikkel En mikropartikkel er her definert som en polymerkomponent som har en diameter på mindre enn ca 1 mm og som i denne har dispergert stabiliserte hGH-partikler En mikropartikkel kan ha en sfærisk, ikke-sfænsk eller uregelmessig form Det er å foretrekke at mikropartikkelen er en mikrokule I alminnelighet vil mikropartikkelen ha en størrelse som egner seg for injeksjon Et foretrukket størrelsesområde for mikropartikler er diametere fra ca 1 til 180 mikron

Ved fremgangsmåten for dannelse av en blanding for vedvarende fngjønng av biologisk aktivt, ikke-aggregert hGH, dispergeres en passende mengde partikler av biologisk aktivt, stabilisert hGH i en polymerløsning

En passende polymerløsning inneholder mellom ca 1 vekt% og ca

30 vekt% av en passende bioforlikelig polymer, hvor den bioforlikehge polymer i alminnelighet løses i en egnet polymerløsning Fortrinnsvis inneholder en polymerløsning ca 2% (vekt/vol) til ca 20% (vekt/vol) polymer En polymer-løsning som inneholder 5 vekt% til ca 10 vekt% polymer er mest foretrukket

Et passende polymer-løsnmgsmiddel er i denne sammenheng et løsnings-middel hvor polymeren er løselig, men hvor de stabiliserte hGH-partiklene er tilnærmet uløselige og ikke-reaktive Eksempler på passende polymer-løsnings-midler er polare organiske væsker, så som metylenklorid, kloroform, etylacetat og aceton

For å fremstille biologisk aktive, stabiliserte hGH-partikler blandes hGH i et passende vandig løsningsmiddel med minst én passende metallkation-komponent under pH-betmgelser som egner seg for dannelse av et kompleks av metallkation og hGH Det kompleksene hGH vil i alminnelighet ha form av et blakket bunnfall suspendert i løsningsmidlet Det komplekserte hGH kan imidlertid også være i løsning I en ytterligere foretrukket utførelsesform er hGH kompleksert med Zn<*2>;Passende pH-betmgelser for å danne et kompleks av hGH er i alminnelighet pH-verdier mellom ca 7,0 og ca 7,4 Passende pH-betmgelser oppnås i alminnelighet ved å benytte en vandig buffer, som f eks natnumbikarbonat, som løsningsmiddel ;Passende løsningsmidler er slike hvori hGH og metallkation-komponenten begge er minst noe løselige, som f eks i en vandig natnumbikarbonat-buffer Når det gjelder vandige løsningsmidler foretrekkes det at det anvendte vann enten er deionisert vann eller vann for injeksjon (WFI) ;Det vil være klart at hGH før det bringes i kontakt med metallkation-komponenten, kan være i fast eller oppløst tilstand Det er også klart at metallkation-komponenten kan være i en fast eller oppløst tilstand før den bringes i kontakt med hGH I en foretrukket utførelsesform blandes en buffer-holdig vandig løsning av hGH med en vandig løsning av metallkation-komponenten ;Det komplekserte hGH vil i alminnelighet ha form av et blakket bunnfall som er suspendert i løsningsmidlet Det komplekserte hGH kan imidlertid også være i løsning I en ytterligere foretrukket utførelsesform er hGH kompleksert med Zn<*2>

Det komplekserte hGH blir deretter tørket, f eks ved lyofilisenng, for å danne partikler av stabilisert hGH Det komplekserte hGH som er suspendert eller i løsning, kan bulk-lyofiliseres eller deles i mindre volumer som så lyofiliseres I en foretrukket utførelsesform forstøves den komplekserte hGH-suspensjonen, for eksempel ved å benytte en ultralyd-dyse, hvorpå den lyofiliseres for å danne stabiliserte hGH-partikler Akseptable måter for å lyofilisere den komplekserte hGH-blandingen er bl a slike som er kjent på området

Fortrinnsvis har partiklene av stabilisert hGH diametere på mellom ca 1 og ca 6 mikrometer hGH-partiklene kan fragmenteres separat, som beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad nr 08/006 682, av 21 januar, 1993, som beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av små partikler av biologisk aktive midler, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende besknvelse Som et alternativ kan hGH-partiklene fragmenteres etter at de er tilsatt til en polymerløsning, f eks ved hjelp av en ultralyd-sonde eller ultralyd-dyse

Ifølge en annen utførelsesform dispergeres også en ytterligere metallkation-komponent som ikke inngår i de stabiliserte hGH-partiklene, i polymerløsningen

Det vil være klart at en ytterligere metallkation-komponent og stabilisert hGH kan dispergeres suksessivt, i omvendt rekkefølge, vekslende, hver for seg eller ved ved samtidige tilsetninger, i en polymerløsning Alternativt kan en polymer, en ytterligere metallkation-komponent og stabilisert hGH blandes suksessivt, i omvendt rekkefølge, vekslende, hver for seg eller ved samtidig tilsetning, i et polymer-løsmngsmiddel

Fremgangsmåten for å danne en blanding for modulering av frigjøringen av biologisk aktivt middel fra en bionedbrytbar polymer, er ytterligere beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad nr 08/237 057

I henhold til denne metode størknes polymer-løsningsmidlet for å danne en polymer matriks som inneholder en dispersjon av stabiliserte hGH-partikler

En passende metode for å danne en blanding med vedvarende hGH-fngjønng fra en polymerløsning, er løsnmgsmiddel-inndampningsmetoden beskrevet i US-patent 3 737 337, utstedt til Schnonng ef al, US-patent 3 523 906, ustedt til Vranchen et al, US-patent 3 691 090, utstedt til Kitajima ef al, eller US-patent 4 389 330, utstedt til Tice ef al Løsningsmiddel-inndampmng benyttes i alminnelighet som fremgangsmåte for å danne mikropartikler med vedvarende hGH-frigjønng

Under løsningsmiddel-fordampningsmetoden vil en polymerløsning som inneholder en stabilisert hGH-partikkeldispersjon, blandes mn eller omrøres, med en kontinuerlig fase som polymer-løsningsmidlet er delvis blandbart med, for å danne en emulsjon Den kontinuerlige fase er i alminnelighet et vandig løsnings-middel Det inkluderes ofte emulgenngsmidler i den kontinuerlige fase for å stabilisere emulsjonen Polymer-løsningsmidlet inndampes deretter i løpet av flere timer, hvorved polymeren størkner for å danne en polymer matriks hvor det i denne inngår en dispersjon av stabiliserte hGH-partikler

En foretrukket fremgangsmåte for dannelse av mikropartikler med vedvarende hGH-frigjønng fra en polymerløsning, er beskrevet i US-patent 5 019 400, utstedt til Bombotz et al, og samtidig verserende US-patentsøknad nr 08/443 726, av 18 mai, 1995, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse Denne fremgangsmåte for dannelse av mikrokuler reduserer den mengde hGH som fordres for å frembnnge en blanding med vedvarende frigjøring med et bestemt hGH-innhold, i forhold til andre metoder

For denne metode behandles polymerløsningen som inneholder den stabiliserte hGH-partikkeldispersjon, for å danne smådråper, hvor minst en vesentlig del av smådråpene inneholder polymerløsning og de stabiliserte hGH-partiklene Disse smådråpene fryses deretter på en måte egnet for å danne mikropartikler Eksempler på måter å behandle polymer-løsnmgsdispersjonen på for å danne smådråper er bl a dirigering av dispersjonen gjennom en ultralyd-dyse, trykkdyse, Rayleigh jet eller annen kjent måte for å danne smådråper ut fra en løsning

Egnede anordninger for frysing av smådråper for å danne mikropartikler, innbefatter dingenng av smådråpene inn i, eller nær, en kondensert gass, som f eks flytende argon og flytende nitrogen, for å danne frosne mikrodråper som så adskilles fra den flytende gassen De frosne mikrodråpene eksponeres deretter for en ikke-løsende væske, som f eks etanol eller etanol blandet med heksan eller pentan

Løsningsmidlet i de frosne mikrodråpene ekstraheres som et faststoff og/eller en væske inn i det ikke-løsende medium for å danne stabilserte hGH-holdige mikropartikler Blanding av etanol med andre ikke-løsende medier, som f eks heksan eller pentan, kan øke solvent-ekstraksjonshastigheten fra visse polymerer, så som poly(laktid-koglykohd) polymerer i forhold til hva som oppnås med bare etanol

Det kan frembringes et stort utvalg av mikropartikler med vedvarende hGH-frigjønng ved å variere dråpestørrelsen, for eksempel ved å endre diameteren av ultralyd-dysen Ønskes meget store mikropartikler, kan mikropartiklene ekstruderes gjennom en sprøyte direkte inn i den kalde væsken Økning av viskositeten av polymerløsningen kan også øke mikropartikkelstørrelsen Ved denne prosess kan størrelsen av mikropartiklene økes, for eksempel fremstilles mikropartikler hvis diameter varierer fra mer enn ca 1000 til ca 1 mikrometer

En annen fremgangsmåte for å danne en blanding med vedvarende hGH-fngjøring fra en polymerløsning, innbefatter filmstøping, f eks i en form, for å danne en film eller en figur Etter at polymerløsningen som inneholder en dispersjon av stabiliserte hGH-partikler, foreksempel eranbragt i en form, fjernes polymer-løsningsmidlet på kjent måte eller reduseres temperaturen av polymerløsningen inntil det oppnås en film eller figur med en konstant tørrvekt Filmstøpnmg av en polymerløsning, inneholdende et biologisk aktivt middel, er ytterligere beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad nr 08/237 057, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse

Det antas at frigjøringen av hGH kan foregå i henhold til to ulike mekanismer hGH kan frigjøres ved diffusjon gjennom vannfylte kanaler, frembragt i polymer-matnksen, så som gjennom oppløsningen av hGH eller ved hjelp av tomrom som skapes ved fjerning av polymerens løsningsmiddel under syntesen av blandingen med vedvarende frigjøring

Den andre mekanismen er frigjøringen av hGH som følge av nedbrytning av polymeren Nedbrytningshastigheten kan kontrolleres ved å endre

polymeregenskaper som påvirker polymerens hydratiseringshastighet Disse egenskapene innbefatter for eksempel forholdet mellom ulike monomerer, så som laktid og glykohd, som utgjør en polymer, anvendelse av L-isomeren av en monomer i stedet for en racemisk blanding og polymerens molekylvekt Disse egenskapene kan påvirke hydrofilitet og krystallinitet som styrer polymerens

hydratisenngs-hastighet Hydrofile hjelpestoffer, så som salter, karbohydrater og overflateaktive midler kan også inkorporeres for å øke hydratisenngen, hvilket kan endre polymerens erosjonshastighet

Ved å endre polymeregenskapene kan diffusjons- og/eller polymer-nedbrytnings-bidragene til hGH-frigjønng kontrolleres For eksempel kan økning

av glykohd-innholdet i en poly(laktid-koglykohd)-polymer og senkning av polymerens molekylvekt, øke hydrolysen av polymeren og således gi en øket hGH-fngjønng fra polymer-erosjon

Dessuten økes polymerhydrolysehastigheten ved ikke-nøytrale pH-verdier Et surt eller et basisk hjelpestoff kan derfor tilsettes til polymerløsningen, benyttet for å danne mikrokulen, for å endre polymer-erosjonshastigheten

Blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til et menneske eller dyr ved injeksjon, implantering (f eks subkutant, intramuskulært, intrapentonealt, intrakranielt, intravaginalt og intradermalt), ved administrering til slimhinner (f eks intranasalt eller ved hjelp av et suppositorium) eller in situ avgivelse (f eks ved hjelp av klyster eller en aerosolspray) for å gi den ønskede dose av hGH på basis av de kjente parametere for behandling av de ulike medisinske tilstander med hGH

Oppfinnelsen vil i det følgende bli ytterligere og mer spesifikt beskrevet gjennom de etterfølgende eksempler

Eksempel 1

Dannelse av Zn<+2->stabilisert hGH

Humant veksthormon (hGH), hvis DNA-sekvens er beskrevet i US-patent 4 898 830, utstedt til Goeddel et al, ble benyttet i dette eksempel Det humane veksthormon ble stabilisert ved å danne uløselige komplekser med sink

hGH ble løst i prøver av en 4 mM natnumbikarbonat-buffer (pH 7,2) for å danne hGH-løsninger med en konsentrasjon på mellom 0,1 og 0,5 mM hGH Det ble fremstillet en 0,9 mM Zn<+2->løsning av deionisert vann og sinkacetat-dihydrat som deretter ble tilsatt til hGH-løsningene for å danne Zn<+2->hGH-komplekset pH av Zn<+2->hGH-komplekset ble deretter justert til mellom 7,0 og 7,4 ved tilsetning av 1 % eddiksyre Det oppsto et blakket suspendert bunnfall, omfattende Zn<+2->stabilisert hGH

Suspensjonen av Zn<+2->stabilisert hGH ble deretter forstøvet ved å benytte en ultralyd-dyse (type V1A, Somcs and Materials, Danbury, CT) og sprøytet inn i et polypropylenkar (17 cm diameter og 8 cm høyt) inneholdende flytende nitrogen for å danne frosne partikler Polypropylenkaret ble deretter anbragt i et fryseskap ved -80°C inntil det flytende nitrogen var fordampet De frosne partiklene som inneholdt Zn<+2->stabihsert hGH, ble deretter lyofilisert for å danne Zn<+2->stabiliserte hGH-partikler

Eksempel 2

Fremstilling av PLGA-mikrokuler inneholdende

biologisk aktivt, aggregasjons-stabihsert hGH

Mikrokuler inneholdende Zn<+2->stabilisert humant veksthormon (hGH) ble fremstillet fra hydrofil poly(laktid-koglykohd)-polymer RG502H som hadde frie karboksyl-endegrupper (heretter betegnet «ublokkert-PLGA») (50 50 PLGA, 9300 dalton, Boehnnger, Ingelheim Chemicals, Inc ) eller en mer hydrofob PLGA-polymer som hadde blokkerte karboksyl-endegrupper (heretter «blokkert-PLGA»)

(50 50 PLGA, 10 000 dalton, parti nr 115-56-1, Birmingham Polymers, Inc , Birmingham, AL)

Polymeren ble løst i metylenklond ved romtemperatur De lyofiliserte hGH-partiklene ble tilsatt til polymerløsningen i likhet med sinkkarbonat Blandingen ble deretter ultralydbehandlet for å gi en homogen suspensjon Suspensjonen ble forstøvet gjennom en ultralyd-dyse på et lag av frossen etanol, overskiktet med flytende nitrogen Beholderen som inneholdt mikrokulene, ble oppbevart ved -80°C for å ekstrahere metylenklondet og deretter frysetørket for å gi et frittstrømmende pulver

Eksempel 3

Analyse av innkapslet hGH-protem

Integriteten av innkapslet hGH ble bestemt ved å løse uhydratiserte mikrokuler i metylenklond og aceton, oppsamle proteinet, frysetørke og rekonstituere dette i HEPES-buffer inneholdende 10 mM EDTA Det ble tatt med passende kontroller for å sikre at ekstraksjonsprosessen ikke påvirket proteinets integritet

Integnteten av det innkapslede hGH ble analysert ved å måle prosent-andelen hGH-monomer som forekom i hGH etter innkapsling, ved hjelp av SEC

(størrelse-eksklusjonskromatografi)

Resultatene av SEC-analyser av hGH-integnteten av hGH-mikrokuler med vedvarende frigjøring, er angitt nedenfor

Det fremgår av resultatene at mnkapslingsprosessen ikke forårsaket aggregasjon av proteinet Det prosentuelle utbyttet av gjenvunnet protein gjennom ekstraksjonsprosessen (i forhold til mengden målt ut fra nitrogeninnholdet av mikrokulene) vanerte fra ca 40 til 98% Variabiliteten antas å være forbundet med tap av matenale under prosessens overfønngstnnn, og ekstraksjonsprosessen er under modifisenng for å øke proteingjenvinning

Eksempel 4

Bestemmelse av effekten av sinkkarbonat på

in vitro frigjønngskmetikken

Mikrokulene ble dannet som beskrevet i Eksempel 2 og inneholdt 15 vekt% hGH (6 1 Zn hGH-proteinkompleks), 0%, 1%, 6%, 10% eller 20 vekt% sinkkarbonat samt poly(laktid-koglykohd)-polymer

In vitro frigjønngskmetikken av mikrokuleformulennger med vedvarende hGH-fngjønng, inneholdende ulike konsentrasjoner sinkkarbonat, ble bestemt ved å suspendere en alikvot (10 mg) av hver mikrokule-type i forskjellige 1,5 ml_ prøver av HEPES buffer (50 mM HEPES, 10 mM KCI, 0,1% NaN3), pH 7,2, med påfølgende inkubenng ved 37°C Mengden av frigitt protein ble bestemt ved å utta prøver av bufferen 1, 3, 7,10,14, 21, 28 dager etter inkubenng og etterfylling med fersk buffer etter hvert uttak

En kurve over kumulativt frigjort mengde i prosent (i forhold til opprinnelig hGH-innhold i startmassen av mikrokuler) i forhold til tiden, ble plottet inn Frigjorte proteinprøver for hvert tidspunkt ble undersøkt med henblikk på hGH-monomennnhold ved SEC

Sinkkarbonat antas å virke som et reservoar av smkioner slik at dannelsen av Zn-hGH-komplekset begunstiges og dissosiasjonen til løselig hGH disfavonseres Siden sinkkarbonatets løselighet i vann er lav, er fngjønngen av smkioner fra reservoaret langsom, hvorved løseligheten av proteinet moduleres

Ved analysen ble det fastslått at fngjøringshastigheten av det innkapslede hGH var meget stor når sinkkarbonat ikke var tilstede, og alt protein ble frigjort i løpet av et meget kort tidsrom

Eksempel 5

Bestemmelse av hGH etter m vivo nedbrytning

av blokkerte PLGA Zn<+2->stabihserte hGH-mikrokuler

Mikrokuler av blokkert PLGA, inneholdende 15 vekt% Zn<+2->stabilisert hGH og 0%, 6%, 10% eller 20% ZnC03, ble fremstillet etter fremgangsmåten i Eksempel 2 Grupper av forsøksrotter ble subkutant injisert 50 mg prøver av de forskjellige hGH-mikrokulene Rottene ble avlivet etter 60 dager og hudprøver eksidert fra injeksjonsstedene De eksiderte hudprøvene ble anbragt 110% nøytralbuffret formalin i minst 24 timer De ble deretter trimmet med et barberblad for å fjerne overflødig hud og plassert i PBS

Vevsprøvene ble tilberedt av Pathology Associates, Inc (Fredenck, MD) Hudprøvene ble innleiret i glykometakrylat, snittet og undersøkt på nærvær av hGH ved å benytte et HistoScan/LymphoScan Staining Kit (produkt #24-408M, Accurate Chemical & Scientific Corp , Westbury, NY) i henhold til produsentens instruksjoner Vevsprøvene ble gitt poeng for forekomst eller mangel på farving som indikerte forekomst eller mangel på hGH i prøven

Alle hudprøver assosiert med hGH-mikrokule-injeksjoner, ga positiv test for forekomst av hGH og indikerte således at de blokkerte PLGA-mikrokulene fremdeles inneholdt hGH etter 60 dager in vivo

Fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 2 ble benyttet for å danne mikrokuler ved å innkapsle 0 vekt% eller 15 vekt% hGH i form av Zn-hGH-kompleks, og også 0%, 1% eller 6 vekt% ZnC03-salt i blokkert-PLGA og i ublokkert-PLGA

In vivo nedbrytning av ublokkerte PLGA-mikrokuler ble sammenlignet med blokkerte PLGA-mikrokuler, ved å injisere prøver av mikrokuler i rotter og deretter analysere de gjenværende mikrokuler ved injeksjonsstedet til ulike tider etter injeksjon Det ble for hver mikrokuleprøve undersøkt tre rotter for hvert tidspunkt På den dagen mikrokulene ble administrert, ble det tilsatt 750 |iL bærer (3% karboksymetylcellulose (lav viskositet) og 1 % Tween-20 i saltvann) til ampuller inneholdende 50 ±1 mg mikrokuler Ampullene ble umiddelbart ristet kraftig for å danne en suspensjon som så ble sugd over i en 1,0 ml_ injeksjonssprøyte uten nål

Rotter (Sprague-Dawley hanner) ble anestetisert med en halotan- og oksygen-blanding Injeksjonsstedene (det intraskapulære området) ble barbert og markert med en permanent tatovering for nøyaktig eksidenng av hud ved prøvetakningstidspunktene Hver rotte fikk hele ampullen av mikrokuler injisert ved bruk av nåler på 18 til 21 gauge

På fastsatte dager (dagene 15, 30, 59 og 90 etter injeksjon for dyr som fikk blokkerte PLGA-mikrokuler eller dagene 7,14, 21, 28 og 45 etter injeksjon for dyr som fikk ublokkerte PLGA-mikrokuler) ble rottene avlivet ved kvelning med CO2-gass og huden på injeksjonsstedet (inklusivt mikrokuler) eksidert Siden mikrokulene hadde tendens til å klumpe seg sammen på injeksjonsstedene ble nærvær eller fravær av mikrokuler bestemt visuelt

Ved de visuelle inspeksjonene ble det registrert at de ublokkerte PLGA-mikrokulene vesentlig hurtigere ble nedbrutt enn de blokkerte PLGA-mikrokulene, og at tilsetningen av ZnC03 til blokkerte PLGA 1 vesentlig grad forsinket polymer-nedbrytningen I rotter som ble injisert ublokkerte PLGA-mikrokuler inneholdende 0% hGH og 0 eller 1% ZnCC>3, var for eksempel ingen mikrokuler synlige på

dag 21 I rotter injisert blokkerte PLGA-mikrokuler inneholdende 0% hGH og 0% ZnCC>3, var det synlig noen få mikrokuler på dag 60 og ingen på dag 90 I

rotter injisert blokkerte PLGA-mikrokuler inneholdende 0% eller 15% hGH og 6% ZnC03, var mikrokuler dessuten synlige på dag 90

Eksempel 6

Farmakokmetiske in vivo undersøkelser på

rotter av mikrokuler med vedvarende hGH-frigjønng

Det ble foretatt undersøkelser på rotter for screening av forskjellige hGH-mikrokuleformulennger, for å bestemme farmakokmetiske parametere etter intravenøs (i v), subkutan (s c) og s c -osmotisk pumpe (Alzet) administrering av hGH og for å vurdere serumprofiler og in vivo fngjønngshastighet av forskjellige hGH-mikrokuleformulennger

Sprague-Dawley rotter ble delt i grupper på tre, randomisert med hensyn til kroppsvekt og én hGH mikrokuleformulenng administrert til hver gruppe Rottene ble subkutant injisert ca 7,5 mg hGH i 50 mg av en type av ulike mikrokuler, suspendert i 0,75 mL vandig injeksjonsbærer Bærerblandingen var 3% CMC (lav viskositet), 1 % Polysorbate 20, i 0,9% NaCI Den avgitte dose av mikrokuler ble bestemt indirekte ved å veie den gjenværende dose i injeksjonsampullen og foreta en korreksjon for gjenværende injeksjonsbærer hGH-dosen ble deretter beregnet ut fra proteininnholdet i mikrokulene, bestemt ved nitrogenanalyse

Blodprøver ble oppsamlet i forutbestemte intervaller i opptil 30 dager etter injeksjon Blodprøver på 250 uL ble oppsamlet i løpet av de første 24 timene og minst 400 uL til tidspunkter etter 24 timer Blodprøvene ble koagulert og hGH-konsentrasjoner i serum bestemt ved å benytte radioimmunoassay Et radioimmunoassay- (RIA) sett fra ICN ble kontrollert og benyttet for å bestemme hGH-mvåene i rotteserum

For bestemmelsen av farmakokmetiske parametere ble hGH i saltvann administrert til rotter gjennom en subkutan bolusmjeksjon, intravenøst eller gitt via en osmosepumpe (Alzet modell 2ML4) som ble implantert subkutant

Tre rottegrupper fikk subkutane enkeltmjeksjoner av 0,5 eller 7,5 mg/kg hGH 10,9% NaCI i et dosevolum på 1,0 mL/kg, og to grupper fikk en intravenøs bolusmjeksjon av ca 1,0 mg og 5,0 mg hGH per kg rotte 10,9% NaCI-løsnmg i et dosevolum på 1,0 mL/kg For Alzet-pumpe-undersøkelsen ble rottene delt i fire grupper a tre rotter, randomisert med hensyn til kroppsvekt og gitt doser på ca 20 mg/mL og 40 mg/mL hGH i 0,9% saltløsnmg ladet i pumper (Alzet modell 2002, 200 14 dagers frigjøring) og med ca 4 mg/mL og 12 mg/mL hGH i 0,9% saltløsning ladet i pumper (Alzet modell 2ML4, 2 mL, 28 dagers fngjønng) Forventede fngjøringshastigheter fra pumpene tilsvarte henholdsvis ca 2% og 4 til 6% av ProLease hGH-dosen (ca 15 mg/kg) per dag Alzet-pumpene ble implantert subkutant i det interskapulære området etter bløtlegging i sterilt saltvann 11-2 minutter

Formuleringen av mikrokuler med vedvarende hGH-fngjønng, syntetisert som beskrevet i Eksempel 2, inneholdt 15 vekt% hGH kompleksert med Zn i et forhold på 6 1 Zn hGH, 0%, 1%, 3% eller 6 vekt% sinkkarbonat, samt 8K ublokkert PLGA, 10K blokkert PLGA eller 31K ublokkert PLGA

For å evaluere de forskjellige formuleringene med vedvarende hGH-fngjønng, var Cmax, Cd5 og Cmax/Cd5, de in vivo indekser som ble benyttet, hvor Cmax er den maksimalt observerte serumkonsentrasjon og Cd5 er serum-konsentrasjonen på dag 5, hvilket tilnærmet skulle tilsvare likevekts-konsentrasjonen Resultatene var som følger

Resultatene av denne screening viste at de to ublokkerte polymerene (8K og 31K) hadde forskjellig fngjønngskinetikk in vivo sammenlignet med den oppnnnehge formulenng som benyttet blokkerte 10K PLGA og 6 vekt% sinkkarbonat Cmax-verdiene var generelt lavere for ublokkerte polymer-formuleringer enn for lederformuleringen, hvilket tydet på at in vivo «utbrudd» kan være lavere med de ublokkerte polymerformulenngene «Utbrudd» ble definert som den prosentandel hGH som ble fngjort i løpet av de første 24 timer etter injeksjon Disse in vitro «utbrudd»-verdiene var mellom 8-22% Smkkarbonat-innholdet i formuleringene syntes ikke å ha effekt på «utbrudd»- eller in vitro frigjønngsprofilen

Serumkonsentrasjonene mellom dagene 4 og 6 ble holdt på et ganske konstant nivå over basislinjen (eller nivåene før blodprøve-uttak) med de ublokkerte polymerformulenngene, mens serumkonsentrasjonene med de blokkerte formuleringene til de samme tidspunkter, lå meget nær basishnjenivåene Fngjøringsdata m vitro for opptil 7 dager viste at det frigjorte hGH-protein var monomert Etter dag 6 kunne det ikke oppnås nyttige resultater på grunn av dannelsen av anti-hGH antistoff i rottene

Eksempel 7

Farmakokmetiske undersøkelser på rhesus-aper

Formålet med studiet av denne primat var å vurdere den farmakokmetiske profil av ulike formuleringer med vedvarende hGH-frigjønng, sammenlignet med mer tradisjonelle metoder for hGH-administrenng (f eks bolus s c -injeksjoner, daglige s c -injeksjoner og s c -injeksjoner kombinert med bruk av en osmosepumpe) og bestemme hvilken formulering med vedvarende hGH-frigjønng som ga optimal hGH-konsentrasjon i blodet

De mikrokuleformulennger for vedvarende hGH-frigjønng som ble undersøkt var 1) 15% hGH (kompleksert med Zn i Zn hGH-forholdet 6 1), 6 vekt% sinkkarbonat og 10K blokkert PLGA, 2) 15% hGH (kompleksert med Zn i Zn hGH-forholdet 6 1), 1 vekt% sinkkarbonat og 8K ublokkert PLGA («RG502H» PLGA-polymer), og 3) 15% hGH (kompleksert med sink i Zn hGH-forholdet 6 1), 1 vekt% sinkkarbonat og 31K ublokkert PLGA («RG503H» PLGA-polymer)

Det ble benyttet fire aper i hver gruppe og hvert dyr fikk en enkelt subkutan injeksjon i den dorsale cervikalregion på dag 1 En dose på 160 mg mikrokuler med vedvarende hGH-frigjønng (24 mg hGH) ble gitt hver ape 11,2 mL injeksjonsbærer gjennom en 20 gauge nål Injeksjonsbæreren var en vandig bærer inneholdende 3% vekt/vol karboksymetylcellulose (natnumsalt), 1 vol% Tween 20 (Polysorbate 20) og 0,9% natnumklorid

Dosen av hGH var ment å gi målbare hGH-serumkonsentrasjonerfor farmakokinetisk analyse For å oppnå farmakokmetiske parametere ble det tatt inn ytterligere undersøkelsesgrupper på fire aper i hver, som fikk 1) en enkelt subkutan injeksjon (24 mg hGH), 2) daglige subkutane injeksjoner (24 mg/28 dager=0,86 mg hGH/dag), 3) en subkutan injeksjon (3,6 mg hGH) kombinert med en Alzet osmosepumpe (20,4 mg hGH) (total dose på 24 mg hGH), og 4) en subkutan injeksjon av injeksjonsbæreren som kontroll (det ble bare benyttet tre aper i bærerkontrollgruppen)

Det ble tatt blodprøver til følgende tidspunkter for analyse av hGH, IGF1, IGFBP3 og anti-hGH antistoff -7, -5, -3, før dosering og 0,5,1, 2, 3, 5, 8,10,12, 24, 28, 32 og 48 timer, og 5, 4T 6, 8, 11, 14,17, 20, 23, 26, 29, 32, 25, 28,41,44, 47, 50, 53, 56 dager etter dosering

Deretter ble konsentrasjonene av IGF-1 og hGH i serumet målt Et IRMA-sett fra RADIM (forhandlet av Wein Laboratories, P O Box 227, Succasunna, NJ) ble benyttet for å kvantifisere hGH i apeserum IRMA-bestemmelsen hadde en kvantifisenngsgrense i PBS-buffer på 0,1 ng/mL og på 1,5 ng/mL i sammenslått juvenilt rhesusape-serum, med et basalt GH-nivå på ca 4 ng/mL

Gyldigheten av IRMA-bestemmelsen ble bekreftet over konsentrasjons-området 1,5-75 ng/mL for sammenslåtte juvemle rhesusape-sera Presisjon og nøyaktighet av målingen ligger innenfor området ±10%

Resultatene viser at mikrokuler med vedvarende hGH-fngjønng, frigjorde vesentlige, vedvarende nivåer av hGH over et tidsrom på 1 måned, mens subkutane injeksjoner ikke var i stand til å opprettholde de samme serumnivåer

IGF-1-serumprofilen viste at serum IGF-1-konsentrasjonene var høyere enn basislmjeverdiene mellom dagene 2 og 29 etter administrering av mikropartiklene Dette viser at tilstrekkelig hGH ble fngjort fra mikrokulene med vedvarende hGH-frigjønng til å bevirke en farmakodynamisk effekt Dette tyder også på at det frigitte hGH var biologisk aktivt, hvilket viser at innkapshngsprosessen ikke hadde hatt noen ugunstig påvirkning på den biologiske styrke av hGH

Claims (18)

1 Blanding for vedvarende frigjøring av humant veksthormon karakterisert ved at den omfatter a) en bioforlikelig polymer, og b) partikler av metallkation-kompleksert humant veksthormon, hvor molforholdet mellom metallkation og protein er større enn 4 1 og mindre enn eller hk 10 1, og hvor blandingen ikke er en poly(laktid-koglykohd)mikrokule inneholdende partikler på 1 til 16 vekt% Zn<+2->stabilisert humant veksthormon med en molar ratio av Zn<+2> til humant veksthormon på 6 1

2 Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at molforholdet er minst ca 10 1

3 Blanding ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at metallkationet er Zn(ll)

4 Blanding ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at metallkationet er tilsatt til humant veksthormon som et vannløselig salt

5 Blanding ifølge krav 4, karakterisert ved at metallkationet er tilsatt til humant veksthormon i form av sinkacetat

6 Blanding ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de nevnte partikler av metallkation-kompleksert humant veksthormon er dispergert i den nevnte bioforlikelige polymer

7 Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at polymeren er valgt fra gruppen bestående av poly(laktid), poly(glykolid), poly(laktid-koglykolid), poly(melkesyre), poly(glykolsyre), polykaprolakton, polykarbonat, polyesteramid, polyanhydnd, poly(aminosyre), polyortoester, polycyanoakrylat, poly(dioksanon), poly(alkylenoksalat), polyuretan, blandinger og kopolymerer derav

8 Blanding ifølge krav 7, karakterisert ved at polymeren er valgt fra gruppen bestående av poly(laktid), poly(glykohd) og poly(laktid-koglykohd)

9 Blanding ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at partiklene av metallkation-kompleksert humant veksthormon forekommer i polymeren i en konsentrasjon på mellom ca 0,1 vekt% og ca 30 vekt%, fortnnnsvis mellom ca 0,1 vekt% og ca 20 vekt%

10 Blanding ifølge krav 9, karakterisert ved at partiklene av metallkation-kompleksert humant veksthormon forekommer i polymeren i en konsentrasjon på ca 15 vekt%

11 Blanding ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den bioforlikelige polymer omfatter ytterligere en metallkation-komponent

12 Blanding ifølge krav 11, karakterisert ved at metallkationet av metallkation-komponenten er Zn(ll)

13 Blanding ifølge krav 12, karakterisert ved at metallkation-komponenten er valgt fra gruppen bestående av ZnC03, ZnafCeHsOvfe. Zn(OAc)2, ZnSC-4 og ZnCI2

14 Blanding ifølge krav 11, karakterisert ved at metallkationet av metallkation-komponenten er Mg(ll)

15 Blanding ifølge krav 12, karakterisert ved at metallkation-komponenten er valgt fra gruppen bestående av Mg(OH)2, MgC03, Mg3(C6H507)2, Mg(OAc)2, MgS04 og MgCI2

16 Blanding ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15, karakterisert ved at forholdet mellom metallkation-komponenten og polymeren er mellom ca 1 99 til ca 1 2 vektdeler, fortrinnsvis ca 1 vekt%

17 Blanding ifølge krav 1, for vedvarende fngjønng av humant veksthormon karakterisert ved at den omfatter a) et bioforlikelig poly(laktid-koglykohd), hvor det i dette er dispergert Zn(ll), hvor Zn(ll) er tilsatt som ZnC03, og b) partikler av Zn(ll)-kompleksert humant veksthormon (hGH), hvor Zn(ll) er tilsatt til det humane veksthormon i form av sinkacetat i et molforhold på ca 10 1 Zn hGH, og partiklene av Zn(ll)-kompleksert humant veksthormon forekommer i polymeren i en konsentrasjon på ca 15vekt%

18 Blanding ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, for anvendelse til fremstilling av et terapeutisk medikament