CZ390797A3

CZ390797A3 - Prostředek se stálým uvolňováním lidského růstového hormonu

Info

Publication number: CZ390797A3
Application number: CZ973907A
Authority: CZ
Inventors: Olufunmi Lily Johnson; Medha M. Ganmukhi; Howard Bernstein; Henry Auer; Amin M. Khan
Original assignee: Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1998-07-15
Also published as: ATE204468T1; JPH11506740A; PL184531B1; NO316104B1; NO975708D0; CN1102854C; RU2161502C2; SK167197A3; AU708756B2; PT831787E; CZ288147B6; CA2223436A1; EP0831787B1; ES2161366T3; NO975708L; IL122385A0; DE69614685D1; MX9709698A; WO1996040072A3; NZ310644A

Description

(57) Anotace:

Je popsán prostředek pro trvalé uvolňování lidského růstového hormonu, který obsahuje a / bioslučitelný polymer a b/ částice lidského růstového hormonu stabilizovaného kationtem, přičemž kationtem kovu je zinečnatý ion. Tento prostředek se používá pro výrobu léčiva pro léčení.

• * «9» 9 9 ·

9«4«···9 99 · 99 99

Prostředek pro trvalé uvolňování lidského růstového hormonu a jeho použití

Oblast techniky

Předložený vynález se týká prostředku pro trvalé uvolňováni lidského růstového hormonu a použití tohoto prostředku.

Dosavadní stav techniky

Lidský růstový hormon (hGH) je protein, který je sekretován hypofýzou a který může být vyráběn způsobem rekombinantního genetického inženýrství. hGH způsobuje růst všech tělesných tkání, které jsou schopny růst.

hGH se typicky používá pro léčení pacientů, kteří trpí hypopituitárním nanismem. Vodný hGH se pacientům běžně podává jako subkutánní bolus třikrát týdně nebo jednou denně, aby se udržely vhodné hladiny hGH v seru. U pacientů, kteří chronicky dostávají hGH, vedou časté injekce k problémům snášenlivosti.

Aby se vyřešily problémy, které souvisejí s opakovanými injekcemi vodného hGH, byly dělány pokusy připravit zařízení pro regulované uvolňování obsahující vyšší dávky hGH než bolus injekce, které by byly obaleny polymerní matricí, při čemž hGH by se uvolňoval in vivo po dobu kolem jednoho týdne nebo delší.

Tato zařízeni pro regulované uvolňováni však často vykazují vyšší počáteční uvolnění hGH a minimální následující uvolňování hGH. Dále pak díky vysoké koncentraci hGH v zařízeních s tímto regulovaným uvolňováním mají molekuly hGH tendenci po několika dnech agregovat za vzniku agregovaného hGH, který je imunogenní in vivo a pravděpodobně má sníženou biologickou aktivitu .

Existuje tedy potřeba prostředků pro trvalé uvolňování biologicky aktivního hGH in vivo, aniž by toto uvolňování způso« * 9 9 9 9 9 » · · • · · « ·*«··· ·99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 9 9 · « · »9 bilo imunitní systémovou odpověd po dobu uvolňování hGH.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká prostředku a způsobů přípravy a používání tohoto prostředku pro trvalé uvolňování biologicky aktivního, stabilizovaného lidského růstového hormonu (hGH). Prostředek s trvalým uvolňováním podle tohoto vynálezu obsahuje polymerní matrici bioslučitelného polymeru a částice biologicky aktivního, kationtem kovu stabilizovaného hGH, při čemž tyto částice jsou dispergovány v bioslučitelném polymeru.

Způsob přípravy prostředku pro trvalé uvolňování hGH podle vynálezu zahrnuje rozpuštění bioslučitelného polymeru v polymerním rozpouštědle za vzniku polymerního roztoku dispergujícího Částice biologicky aktivního stabilizovaného hGH v polymerním roztoku a potom zpevnění polymeru za vzniku polymerní matrice obsahující disperzi hGH částic.

Způsob používání prostředku s trvalým uvolňováním podle předloženého vynálezu zahrnuje dosažení terapeuticky účinné hladiny biologicky aktivního, neagregovaného lidského růstového hormonu v krvi subjektu pro dobu trvalého uvolňování podáváním dávky prostředku s trvalým uvolňováním tomuto subjektu.

Výhody tohoto prostředku ε trvalým uvolňováním hGH zahrnují delší, konzistentnější hladiny hGH v krvi in vivo, nižší počáteční vzestup hGH a zvýšené terapeutické výhody odstraněním kolísání množství hGH v seru. Tyto výhody zahrnují také zvýšenou snášenlivost pacientem a snížení potřebného počtu injekcí. Mezi tyto výhody dále patří schopnost používat menši množství hGH při srovnání s režimem bolus injekcí, protože hladiny hGH v seru jsou udržovány blíže terapeutického prahu.

Lidský růstový hormon (hGH) používaný podle tohoto vynálezu je biologicky aktivní hGH ve své molekulární (monomerní nebo neagregované) formě. Molekulární hGH je typicky neimunogenní.

• · • · « * « · · tt · · ·

Agregovaný hGH může indukovat imunitní odpověá vedoucí k protilátkám vzniklým proti hGH. To může vést proti účinnosti dlouhotrvající hGH terapie. Agregovaný hGH může také stimulovat auto-imunitní odpověá na endogenní hGH.

Trvalé uvolňování biologicky aktivního neagregovaného lidského růstového hormonu znamená uvolňování, které vede k měřitelným hladinám biologicky aktivního monoroerního hGH v seru po delší období než je období přímého podávání vodného hGH. Je výhodné, aby trvalé uvolňování znamenalo uvolňování hGH po dobu týdne nebo po delší dobu, výhodněji po dobu dvou nebo více týdo nu.

Trvalé uvolňování biologicky aktivního neagregovaného hGH z polymerní matrice může znamenat kontinuální nebo nekontinuální uvolňování s relativně stálou nebo měnící se rychlosti uvolňování. Kontinuita uvolňovaného hGH a hladina uvolňovaného hGH může být dána použitím, mimo jiné, jednoho nebo více typů polymerních prostředků, náplní hGH a/nebo výběrem excipientů, které poskytují žádaný účinek.

Stabilizovaný (hGH) obsahuje biologicky aktivní neagregovaný hGH, který je komplexován s alespoň jedním typem vícemocného kationtu kovu, který má vaznost +2 nebo více, ze složky kationtu kovu. Stabilizovaný hGH v prostředku s trvalým uvolňováním podle předloženého vynálezu je ve formě částeček.

Mezi vhodné vícemocné kationty kovů patří kationty kovů obsažené v biokompatibilních složkách kationtu kovu. Složka kationtu kovu je biokompatibilní, jestliže složka kationtu není toxická pro příjemce v používaných množstvích a jestliže také nepředstavuje významné škodlivé nebo nevhodné účinky pro tělo příjemce, jako je imunologická reakce v místě injekce.

Molární poměr složky kationtu kovu k hGH je pro kation kovu stabilizující hGH typicky mezi 4:1 a 10:1.

·

Výhodným kationtem kovu používaným pro stabilizování hGH je zinečnatý kation. Ve výhodnějším provedení je molární poměr složky kationtu kovu, obsahujíc! zinečnaté kationty, k hGH 6:1.

Vhodnost kationtu kovu pro stabilizování hGH může stanovit zručný odborník pomocí rozmanitých způsobů indukujících stabilitu, jako je elektroforesa na polyakrylamidovém gelu, isoelektrická fokusace, chromatografie na obrácené fázi, HPLC a testy účinnosti na částicích lyofilizovaného hGH obsahujícího kationty kovu, aby se stanovila aktivita hGH po lyofilizaci a po dobu trvání uvolňování z mikročástic. U stabilizovaného hGH je tendence hGH agregovat v mikročásticích během hydratace in vivo a/nebo ztráta biologické aktivity nebo účinnosti během hydratace nebo díky procesu tvoření prostředku s trvalým uvolňováním nebo diky chemickým vlastnostem prostředku s trvalým uvolňováním snížena vytvořením komplexu alespoň jednoho typu kationtu kovu s hGH před uvedením hGH do kontaktu s roztokem polymeru.

Stabilizovaný hGH je typicky stabilizován proti významné agregaci in vivo po dobu trvalého uvolňování. Významná agregace je definována jako takové množství agregace, které vede k agregaci 15 nebo více % hmotn. z původního množství monomeru hGH uzavřeného v tobolce. Agregace se s výhodou udržuje pod 5 % hmotn. z původní dávky monomeru hGH. Agregace se výhodněji udržuje pod 2 % hmotn. z původní dávky.

hGH v prostředku s trvalým uvolňováním hGH se může smíchat také s jinými excipienty, jako jsou činidla zvětšující objem nebo další stabilizační činidla, jako jsou pufry, aby se hGH během lyofilizace stabilizoval.

činidla zvětšující objem typicky obsahují inertní materiály. Vhodná činidla zvětšující objem jsou známa odborníkům z oblasti techniky.

Polymer nebo polymerní matrice, které jsou vhodné pro pro• · » * • 9 9 · « « ·« ··«·· • · · 9 «

9«·99·9* «· * • · · · • · · · · * · · » · · » středek s trvalým uvolňováním podle předloženého vynálezu, musí být bioslučitelné. Polymer je bioslučitelný, jestliže polymer nebo jakékoliv degradační produkty polymeru nejsou pro příjemce toxické a jestliže také neznamenají významné škodlivé nebo nevhodné účinky pro tělo příjemce, jako je imunologická reakce v místě injekce.

Polymer prostředku s trvalým uvolňováním hGH musí být také biodegradovatelný. Biodegradovatelný, jak je zde definováno, znamená, že prostředek bude degradovat nebo erodovat in vivo za vzniku menších chemických částic. Degradace může být důsledkem například enzymatických, chemických a fyzikálních procesů.

Mezi vhodné bioslučitelné, biodegradovatelné polymery patří například póly(laktidy), poly(glykolidy), poly(laktid-ko-glykolidy), polyfmléčné kyseliny), poly(glykolové kyseliny), polyfmléčná kyselina-ko-glykolová kyselina), polykaprolakton, polyuhličitany, polyesteramidy, polyanhydridy, póly(aminové kyseliny), polyorthoestery, polykyanakryláty, polyfp-dioxanony), póly(alkylen-oxaláty), biodegradovatelné polyurethany, jejich směsi a jejich kopolymery.

Koncové funkční skupiny polymeru mohou být také modifikovány. Například polyestery mohou být blokovány, neblokovány nebo mohou znamenat směs blokovaných a neblokovaných polymerů. Blokovaný polymer je klasicky definován v oblasti techniky, specificky s blokovanými karboxylovými koncovými skupinami. Obecně jsou blokující skupiny odvozeny od iniciátoru polymerace a typicky znamenají alkylovou skupinu. Neblokovaný polymer je klasicky definován v oblasti techniky, specificky jako polymer s volnými karboxylovými koncovými skupinami.

Přijatelné molekulové hmotnosti polymerů používaných podle tohoto vynálezu mohou být stanoveny osobou z oblasti techniky, která vezme v úvahu takové faktory, jako je žádaná rychlost degradace polymeru, fyzikální vlastnosti, jako je mechanická pevnost, a rychlost rozpouštění polymeru v rozpouštědle. Příjatel• « • · a··· ··*» ný rozsah molekulových hmotností je typicky v rozmezí od 2000 do 2 000 000. Ve výhodném provedení polymer znamená biodegradovatelný polymer nebo kopolymer. Ve výhodnějším provedení polymer znamená poly(laktid-ko-glykolid) (zde dále označovaný PLGA”) s poměrem laktid:glykolid 1:1 a molekulovou hmotností 5000 až 70 000. V ještě výhodnějším provedení má PLGA použitý podle předloženého vynálezu molekulovou hmotnost 6000 až 31 000.

Množství hGH, které je obsaženo v dávce mikročástic s trvale uvolňováním nebo v jiném zařízení s trvalým uvolňováním, obsahujícím biologicky aktivní, stabilizované hGH částice, je terapeuticky nebo profylakticky efektivní množství, které může být stanoveno odborníkem z oblasti techniky, při Čemž se berou v úvahu takové faktory, jako je tělesná hmotnost, stav, který má být léčen, typ použitého polymeru a rychlost uvolňování z polymeru.

V jednom provedeni prostředek s trvalým uvolňováním hGH obsahuje od 0,01 do 50 % hmotn. biologicky aktivních částic se stabilizovaným hGH. Množství používaných částic hGH se bude měnit podle žádaného účinku hGH, podle plánovaného uvolňovaného množství, podle doby, po kterou by se hGH měl uvolňovat, a podle času, po který se hGH bude uvolňovat. Výhodné rozmezí náplně částic hGH je mezi 0,1 a 30 % hmotn. částic hGH. Výhodnější rozmezí náplně částic hGH je mezi 0,1 a 20 % hmotn. částic hGH. Nejvýhodnějši náplň biologicky aktivních částic se stabilizovaným hGH je 15 % hmotn.

V jiném provedení prostředek s trvalým uvolňováním hGH obsahuje také druhou složku kationtů kovu, která není obsažena v částicích se stabilizovaným hGH a která je dispergována v polymeru. Druhá složka kationtů kovu s výhodou obsahuje stejné druhy kationtů kovu jako kation ve stabilizovaném hGH. Druhá složka kationtů kovu může také obsahovat jeden nebo více různých druhů kationtů kovu.

• · 0 #

Druhá složka kationtu kovu působí jako modulace uvolněni hGH z polymerní matrice prostředku s trvalým uvolňováním, jako je působení jako zásobník kationtů kovu pro další prodloužení doby, po kterou je hGH stabilizován kationtem kovu, aby se zvýšila stabilita hGH v prostředku.

Složka kationtu kovu používaná při modulaci uvolňování typicky obsahuje alespoň jeden typ vícemocného kationtu kovu. Příklady druhých složek kationtu kovu, které jsou vhodné pro modulaci uvolňování hGH, zahrnují nebo obsahují například Mg(0H)₂, MgCO₃ (jako je 4 MgC0₃.Mg(0H)₂.5 H₂0), ZnC0₃ (jako je 3 Zn(0H)₂.2 ZnC0₃), CaC0₃, Zn₃(C₆H_s0₇)₂, Mg(0Ac)₂, MgSO_a, Zn(0Ac)₂, ΖηΞΟ., ZnCl₂, MqCl₂ a Mg₃(C_AH₅0₇)₂. Vhodný poměr druhé složky kationtu kovu k polymeru je mezi 1:99 a 1:2 hmotn. dílům. Optimální poměr závisí na použitém polymeru a na použité druhé složce kationtu kovu.

Polymerní matrice obsahující dispergovanou složku kationtu kovu pro modulaci uvolnění biologicky aktivního činidla z polymerní matrice je dále popsána v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/237 057, podané 3. května 1994, a v doprovázející PCT patentové přihlášce PCT/US95/05511, jejichž celé popisy jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Prostředek pro trvalé uvolňování hGH podle tohoto vynálezu se může vyrábět v mnoha různých tvarech, jako je film, peleta, váleček, disk nebo mikročástice. Mikročástice, jak je zde definována, obsahuje polymerní složku s průměrem menším než 1 mm, která obsahuje dispergované Částice stabilizovaného hGH. Mikročástice mohou mít kulovitý, nekulovitý nebo nepravidelný tvar. Je výhodné, aby mikročástice znamenaly mikrokuličky. Mikročástice bude mít typicky takový tvar, který je vhodný pro injekční podávání. Výhodným rozmezím velikostí mikročástic je rozmezí průměru částic od 1 do 180 μπι.

Podle způsobu výroby prostředku pro trvalé uvolňování biologicky aktivního, neagregovaného hGH podle tohoto vynálezu se • * φφφφφφI· ·φ V • » » • ΦΦΦ · φ φ • · « « vhodné množství částic biologicky aktivního, stabilizovaného hGH disperguje v polymerním roztoku.

Vhodný polymerní roztok obsahuje mezi 1 a 30 % hmotn. vhodného bioslučitelného polymeru, při čemž biosluČitelný polymer je typicky rozpuštěn ve vhodném polymerním rozpouštědle. Polymerní roztok s výhodou obsahuje 2 až 20 % hmotn. polymeru. Nejvýhodnější je takový polymerní roztok, který obsahuje 5 až 10 % hmotn. polymeru.

Vhodným polymerním rozpouštědlem, jak je zde definováno, je takové rozpouštědlo, v němž je polymer rozpustný, ale v němž jsou částice stabilizovaného hGH v podstatě nerozpustné a nereaktivní. Mezi příklady vhodných polymerních rozpouštědel patří polární organické kapaliny, jako je methylenchlorid, chloroform, ethylacetát a aceton.

Při přípravě biologicky aktivních částic stabilizovaného hGH se hGH smíchá ve vhodném vodném rozpouštědle s alespoň jednou vhodnou složkou kationtů kovu za takových podmínek pH, které jsou vhodné pro vytvoření komplexu kationtů kovu s hGH. Komplexovaný hGH bude typicky ve formě mléčné sraženiny, která je suspendována v rozpouštědle. Komplexovaný hGH však může být také v roztoku. V ještě výhodnějším provedení je hGH komplexován se zinečnatými ionty.

Mezi vhodné podmínky pH pro vytvoření komplexu hGH typicky patří pH hodnoty mezi 7,0 a 7,4. Vhodné podmínky pH se typicky dosáhnou použitím vodného pufru, jako je hydrogenuhličitan sodný, jako rozpouštědla.

Vhodnými rozpouštědly jsou taková rozpouštědla, v nichž hGH a složka kationtů kovu jsou alespoň mírně rozpustné, jako je tomu ve vodném pufru hydrogenuhličitanu sodného, U vodných rozpouštědel je výhodné, aby použitou vodou byla buá deionizovaná voda nebo voda pro injekce (WFI).

♦ · 9 * «·· 9 9 9 9 • 9 9 · 9 * · · 9 · • 9 · · »··«·* ««·« « • 9 · · · 9 « · »·«· ···· ·* · ·· *·

Tomu je třeba rozumět tak, že hGH může být ve formě pevné látky nebo v rozpuštěném stavu před tím, než je uveden do kontaktu se složkou kationtů kovu. Tomu je třeba rozumět také tak, že složka kationtů kovu může být v pevném stavu nebo v rozpuštěném stavu před tím, než je uvedena do kontaktu s hGH. Ve výhodném provedení se pufrovaný vodný roztok hGH smíchá s vodným roztokem složky kationtů kovu,

Komplexovaný hGH bude existovat typicky ve formě mléčné sraženiny, která je suspendována v rozpouštědle. Komplexovaný hGH však může být také v roztoku. V ještě výhodnějším provedení je hGH komplexován se zinečnatými ionty.

Komplexovaný hGH se pak vysuší, jako například lyofilizací, za vzniku stabilizovaného hGH ve formě částeček. Komplexovaný hGH, který je suspendován nebo který je v roztoku, se může lyofilizovat ve velkém měřítku nebo ho lze rozdělit na menší objemy a potom lyofilizovat. Ve výhodném provedení je suspenze komplexovaného hGH mikronizována, jako například použitím ultrazvukové trysky, načež se lyofilizuje za vzniku částic stabilizovaného hGH. Přijatelnými prostředky pro lyofilizaci směsi komplexovaného hGH jsou ty prostředky, které jsou známy z oblasti techniky.

Průměr částic stabilizovaného hGH je s výhodou mezi 1 a 6 pm. Částice hGH se mohou fragmentovat odděleně, jak je popsáno v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/006 682, podané 21. ledna 1993, která popisuje způsob výroby malých částic biologicky aktivních činidel, která je zde celá zahrnuta jako odkaz, částice hGH se mohou také fragmentovat po tom, co jsou přidány k polymernímu roztoku, jako například ultrazvukovou sondou nebo ultrazvukovou tryskou.

V jiném provedení se druhá složka kationtů kovu, která není obsažena v Částicích stabilizovaného hGH, také disperguje v polymerním roztoku.

• · · « · v · » · · · • *

Tomu je třeba rozumět tak, že druhá složka kationtu kovu a stabilizovaný hGH se mohou dispergovat v polymernim roztoku postupně, v obráceném pořadí, střídavě, odděleně nebo současným přidáváním. Polymer, druhá složka kationtu kovu a stabilizovaný hGH se mohou také vmíchat do polymerního rozpouštědla postupně, v obráceném pořadí, střídavě, odděleně nebo současným přidáváním.

Způsob výroby prostředku pro modulaci uvolňování biologicky aktivního činidla z biodegradovatelného polymeru je dále popsán v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/237 057.

Podle tohoto způsobu se polymerní rozpouštědlo nechá ztuhnout za vzniku polymerní matrice obsahující disperzi částic stabilizovaného hGH.

Jiným vhodným způsobem vytvoření prostředku s trvalým uvolňováním hGH 2 polymerního roztoku je způsob odpařování rozpouštědla popsaný v USA patentu č. 3 737 337 Schnoringa a spol., USA patentu č. 3 523 906 Vrancheana a spol., USA patentu č. 3 691 090 Kitajamy a spol. nebo v USA patentu č. 4 389 330 Ticeho a spol. Odpaření rozpouštědla se typicky používá jako způsob výroby mikročástic pro trvalé uvolňování hGH.

U způsobu odpařování rozpouštědla se polymerový roztok obsahující disperzi částic stabilizovaného hGH vmíchá do nebo se promíchá s kontinuální fází, v níž je polymerní rozpouštědlo částečně mísitelné, za vzniku emulze. Kontinuální fáze je obvykle ve vodném rozpouštědle. Do kontinuální fáze jsou často zahrnuta emulgační činidla, aby se emulze stabilizovala. Polymerní rozpouštědlo se pak během několika hodin nebo během delší doby odpaří, čímž se polymer ztuží tak, že se vytvoří polymerní matrice, která v sobě obsahuje disperzi částic stabilizovaného hGH.

Výhodný způsob vzniku mikročástic s trvalým uvolňováním hGH z polymerního roztoku je popsán v USA patentu č. 5 019 400 • Φ • φ φ * · · φ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φ φ φφ φφφφφφ φφφ « « φ φ φφφ φφφ

ΦΦΦΦΦΦΦ* φφ φ φφ φφ

Gombotze a spol. a v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/443 726, podané 18. května 1995, jejich popisy jsou zde celé uvedeny jako odkazy. Tento způsob vzniku mikrokuliček, při srovnáni s jinými způsoby, jako je dělení fází, dále snižuje množství hGH, kterého je potřeba pro výrobu prostředku s trvalým uvolňováním se specifickým obsahem hGH.

Podle tohoto způsobu se polymerní roztok, který obsahuje disperzi částic stabilizovaného hGH, zpracuje tak, aby se vytvořily kapičky, při čemž alespoň významná část těchto kapiček obsahuje polymerní roztok a částice stabilizovaného hGH. Tyto kapičky se pak nechají zmrznout prostředky vhodnými pro vznik mikročástic. Příklady prostředků pro zpracování disperze polymerního roztoku za vzniku kapiček zahrnují směrování disperze do ultrazvukové trysky, tlakové trysky, Rayleighovy trysky nebo jiných známých prostředků pro tvořeni kapiček z roztoku.

Prostředky, které jsou vhodné pro zmrazování kapiček, zahrnují směrování kapiček do nebo blízko zkapalněného plynu, jako je kapalný argon a kapalný dusík, při čemž se vytvoří zmrazené mikrokapičky, které se pak oddělí od kapalného plynu. Zmrazené mikrokapičky se pak vystaví působení kapalného ne-rozpouštědla, jako je ethanol nebo směs ethanolu s hexanem nebo pentanem.

Rozpouštědlo ve zmrazených mikrokapičkách se extrahuje jako pevná látka a/nebo kapalina do nerozpouštědla za vzniku mikročástic obsahujících stabilizovaný hGH. Smícháni etnanolu s jinými ne-rozpouštědly, jako je hexan nebo pentan, může zvýšit rychlost extrakce rozpouštědlem nad rychlost dosaženou samotným ethanolem, z některých polymerů, jako jsou poly(laktid-ko-glykolid)ové polymery.

Velký rozsah velikostí mikročástic s trvalým uvolňováním hGH lze vyrobit měněním velikostí kapiček, například měněním průměru ultrazvukové trysky. Jestliže jsou žádoucí velmi velké mikročástice, mikročástice mohou být vytlačovány jehlou přímo • 4 • ·

4 «44« 44·· do chladné kapaliny. Zvýšením viskozity polymerového roztoku se může zvýšit také velikost mikročástic. Tímto způsobem se mohou vyrábét mikročástice o velikosti například v rozmezí v průměru větším než od 1000 do 1 pm.

Ještě jiný způsob vzniku prostředku s trvalým uvolňováním hGH z polymerového roztoku zahrnuje lití filmu_r jako například do forem, za vzniku filmu nebo nějakého tvaru. Například po vliti polymerového roztoku obsahujícího disperzi částic stabilizovaného hGH do formy se polymerový roztok odstraní způsoby známými v oblasti techniky nebo se teplota polymerového roztoku sníží, dokud se nezíská film nebo tvar se stálou suchou hmotností. Odlévání filmu polymerového roztoku, který obsahuje biologicky aktivní činidlo, je dále popsáno v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/237 057, jejíž popis je zde celý zahrnut jako odkaz.

Předpokládá se, že k uvolnění hGH může docházet dvěma různými mechanismy. hGH se může uvolňovat difúzí vodou naplněnými kanálky, které vznikou v polymerní matrici, jak se rozpouští hGH, nebo prázdnými místy vytvořenými odstraněním polymerových rozpouštědel během syntézy prostředku s trvalým uvolňováním.

Druhým mechanismem je uvolňování hGH degradací polymeru. Rychlost degradace může být regulována měněním vlastností polymeru, které ovlivňují rychlost hydratace polymeru. Mezi tyto vlastnosti například patří poměr různých monomerů, jako je laktid a glykolid, obsažených v polymeru, použití L-isomeru monomeru místo racemické směsi a molekulová hmotnost polymeru. Tyto vlatnosti mohou ovlivňovat hydrofilnost a krystalickou schopnost, které regulují rychlost hydratace polymeru. Do prostředku lze zahrnout také hydrofilní excipienty, jako jsou soli, cukry a povrchově aktivní činidla, aby se zvýšila hydratace. Tyto excipienty mohou měnit rychlost eroze polymeru.

Měněním vlastností polymeru l2e regulovat příspěvky difúze a/nebo degradace polymeru na uvolňování hGH. Například zvýšením «4 · • · · » · · « • v « • * * · • · • · · v · »♦ ·· ·» • · t · * · • · « · « * · · · • · · · « ·««···· ·* » obsahu glykolidu v póly(laktid-ko-glykolid)ovém polymeru a snížením molekulové hmotnosti polymeru lze zvýšit hydrolýzu polymeru a tedy dosáhnout zvýšeného uvolňování hGH z polymerové eroze.

Rychlost hydrolýzy polymeru je zvýšena také při ne-neutrálním pH. K polymerovému roztoku se tedy mohou přidávat kyselé nebo bazické excipienty, používané při vzniku mikrokuliček, aby se změnila rychlost eroze polymeru.

Prostředek podle tohoto vynálezu se může podávat člověku nebo jinému živočichovi injekčně, implantaci (např. subkutánně, intramuskulárně, intraperitoneálně, intrakraniálně, intravaginálně a intradermálně), podávánínm do mukózních membrán (např. intranazálně nebo pomocí čípků) nebo podáváním in šitu (např. klystýrem nebo aerosolovým sprejem), aby se dosáhla žádaná dávka hGH na základě známých parametrů pro léčení hGH různých lékařských stavů.

Vynález bude nyní dále a podrobně popsán následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tvorba hGH stabilizovaného zinečnatými ionty

V tomto přikladu byl použit lidský růstový hormon (hGH), jehož DNA sekvence je popsána v USA patentu 4 898 830 Goeddela a spol. Lidský růstový hormon byl stabilizován vytvořením nerozpustných komplexů se zinkem.

hGH byl rozpuštěn ve vzorcích 4mM pufru hydrogenuhličitanu sodného (pH 7,2). Vznikly hGH roztoky s 0,1 a 0,5mM koncentrací hGH. Z deionizované vody a dihydrátu octanu zinečnatého se připraví 0,9mM roztok zinečnatých iontů a ten se pak přidá k hGH • · • « · β ·

9 · ·«« 9 « · ··««*«·* 99 9 9 9 9 9 roztokům za vzniku Zn^2t-hGH komplexu. pH tohoto komplexu se pak přidáním 1% (hmotn.) kyseliny octové upraví na 7,0 aí 7,4. Vytvoří se mléčná suspendovaná sraženina obsahující vytvořený hGH stabilizovaný zinečnatými ionty.

Na suspenzi hGH stabilizovaného zinečnatými ionty se pak ultrazvukovou tryskou (typ VIA, Sonics and Materials, Danbury, Kt.) působí ultrazvukem a pak se tato suspenze nastříká do polypropylenové nádoby (průměr 17 cm, výška 8 cm), která obsahuje kapalný dusík. Vytvoří se zmrzlé částice. Polypropylenová nádoba se pak umístí do mrazáku nastaveného na -80 °C, dokud se kapalný dusík neodpaří. Zmrazené částice, které obsahují hGH stabilizovaný zinečnatými ionty, se pak lyofilizují za vzniku Částic hGH stabilizovaného zinečnatými ionty.

Příklad 2

Příprava PLGA mikročástic obsahujících biologicky aktivní hGH stabilizovaný proti agregaci

Mikrokuličky, které obsahují lidský růstový hornon (hGH) stabilizovaný zinečnatými ionty, se připraví z hydrofilního póly ( laktid-ko-glykolid)ového polymeru RG502H, který má volné karboxylové koncové skupiny (zde dále neblokovaný PLGA·') (50:50 PLGA, molekulová hmotnost 9300, Boehringer Ingelheim Chemicals, lne.) nebo hydrofóbnějšího PLGA polymeru s blokovanýmu karboxylovými koncovými skupinami (zde dále blokovaný PLGA) (50:50 PLGA, molekulová hmotnost 10 000, šarže č. 115-56-1, Birmingham Polymers, lne., Birmingham, Al.).

Polymer se rozpustí v methylenchloridu za teploty místnosti. Částice lyofilizovaného hGH se přidají k polymerovému roztoku a přidá se také uhličitan zinečnatý. Na směs se pak působí ultrazvukem. Získá se homogenní suspenze. Tato suspenze se atomizuje ultrazvukovou tryskou do vsrtvy zmrazeného ethanolu převrstveného kapalným dusíkem. Nádoba, která obsahuje mikrokuličky, se skladuje při -80 °c, aby se extrahoval methy15

9« ·· ·* 9 «9 t* · · 9*9 4999

9999 99 99

9 9 9 9 9999 9 999 9 9 · 999 «99 >99 9 9999 9 9 · 9« 9 9 lenchlorid, a potom se vysuší vymražením. Získá se tak volně sypký prášek.

Příklad 3

Analýza hGH proteinu uzavřeného v tobolkách

Integra i ta hGH uzavřeného v tobolkách se stanovuje rozpuštěním nehydratovaných mikrokuliček v methylenchloridu a acetonu obsahujícím protein, vysušením vymražením a opětovným uvedením do HEPES pufru, který obsahuje lOmM EDTA. Provedou se příslušné kontroly, aby se zajistilo, že proces extrakce neovlivňuje integritu proteinu.

Integrita hGH uzavřeného v tobolkách se analyzuje vytěsftovaci chromatografií (SEC) změřením procent monomeru hGH obsaženého v hGH po uzavření do tobolek.

Výsledky této SEC analýzy integrity hGH mikrokuliček s trvalým uvolňováním hGH jsou uvedeny níže:

prostředek (polymer; procenta uhličitanu zinečnatéhó % monomeru (SEC)

31K neblokovaný; 6 % ZnCO₃ 98,6 31K neblokovaný; 6 % ZnC0₃ 99,2 31K neblokovaný; 3 % ZnC0₃ 97,7 31K neblokovaný; 3 % ZnC0₃ 97,8 31K neblokovaný; 1 % ZnCO₃ 97,6 31K neblokovaný; o % ZnC0₃ 97,8 31K neblokovaný; 0 % ZnC0₃ 97,1 10K blokovaný; 1 % ZnCO₃ 98,2 10K blokovaný; 1 % ZnC0₃ 98,4 8K neblokovaný; o % ZnCO₃ 98,5 10K blokovaný; 1 % ZnC0₃ 98,4 • · ·

• · · • · · · · » · * ί > · ·

Výsledky ukazují, že způsob zahrnutí do tobolek nezpůsobuje agregaci proteinu. Výtěžek (v procentech) proteinu isolovaného postupem extrakce (vzhledem k množství měřeného obsahem dusíku mikrokuliček) je v rozmezí od 40 do 98 % hmotn. Předpokládá se, že proměnlivost souvisí se ztrátami materiálu během stupňů přenosu během postupu. Postup extrakce je modifikován tak, aby se zvýšil výtěžek proteinu.

Příklad 4

Stanovení účinku uhličitanu zinečnatého na kinetiky uvolňování in vitro

Mikrokuličky byly vyrobeny podle toho, jak je to popsáno v příkladu 2, a obsahovaly 15 % hmotn. hGH (komplex Zn:hGH protein 6:1), 0, 1, 6, 10 nebo 20 % hmotn. uhličitanu zinečnatého a póly(laktid-ko-glykolid)ový polymer.

Kinetiky in vitro uvolňování prostředků mikrokuliček s trvalým uvolňovánínm hGH obsahujících různé koncentrace uhličitanu zinečnatého byly stanoveny suspendováním podílu (10 mg) každého typu mikrokuliček v různých l,5ml vzorcích pufru HEPES (50mM HEPES, lOmM KC1, 0,1% (hmotn.) NaN₃) , pH 7,2, a potom byly inkubovány při 37 °C. Množství uvolněného proteinu bylo kvantitativně stanoveno odebráním vzorků pufru 1., 3., 7. , 10. ,

14., 21. a 28. den po inkubaci a nahrazením čerstvým pufrem po každém odebrání.

Byla vynesena křivka souhrnného počtu uvolněných procent (vzhledem k původnímu obsahu hGH v počáteční hmotě mikrokuliček) proti času. Vzorky uvolněného proteinu z každého bodu byly testovány na obsah monomeru hGH vytěsňovací chromatografií.

O uhličitanu zinečnatém se předpokládá, že působí jako nádržka zinečnatých iontů, takže je zvýhodněna tvorba komplexu Zn-hGH a znevýhodněna disociace na rozpustný hGH. Protože rozpustnost uhličitanu zinečnatého ve vodě je nízká, je uvolňování * * ··♦ ··· ·*·«··» ·« φ ,φ φφ zinečnatých iontů ze zásobníku pomalé, což moduluje rozpustnost proteinu.

Analýza zjistila, že v nepřítomnosti uhličitanu zinečnatého byla rychlost uvolňování hGH uzavřeného v tobolce velmi rychlá a všechen protein byl uvolněn ve velmi krátké době.

Přiklad 5

Test hGH po in vivo degradaci mikrokuliček blokovaných PLGA s hGH stabilizovaným zinečnatými ionty

Mikrokuličky blokovaného PLGA, obsahující 15 % hmotn. hGH stabilizovaného zinečnatými ionty a 0, 6, 10 nebo 20 % hmotn. uhličitanu zinečnatého, byly vyrobeny podle způsobu z příkladu

2. Skupinám testovaných krys byly injekčně subkutánně podány 50mg vzorky různých mikrokuliček hGH. Krysy byly po 60 dnech usmrceny a z míst injekce byly odebrány vzorky kůže. Vzorky odebrané kůže byly umístěny do 10% (hmotn.) neutrálního pufrovaného formalinu na alespoň 24 h. Potom byly ořezány Žiletkou, aby se odstranila nadbytečná kůže a byly umístěny do PBS.

Vzorky tkáně byly zpracovány v Pathology Associates, lne. (Frederick, Md.). Vzorky kůže byly uloženy do glykomethakrylátu, byly z nich připraveny řezy a ty byly analyzovány na přítomnost hGH použitím sestavy HistoScan/LymphoScan Staining Kit (výrobek č. 24-408M, Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y.) podle pokynů výrobce. Vzorky tkání byly vyhodnoceny na přítomnost nebo nepřítomnost obarveni, které indikovalo přítomnost nebo nepřítomnost hGH ve vzorku.

Všechny vzorky kůže, které souvisely s injekcemi mikrokuliček hGH, byly testovány positivně na přítomnost hGH, což tedy ukazuje, že mikrokuličky blokovaného PLGA obsahovaly hGH ještě po 60 dnech in vivo.

Způsob popsaný v příkladu 2 byl použit pro přípravu mikro* · • · • * • · · * • · 9 · * · « * · · · · * * * · · «····« • « · · » ···»♦·» ·· « kuliček zahrnutím do tobolek 0 nebo 15 % hmotn. hGH ve formě komplexu Zn:hGH a také 0, 1 nebo 6 % hmotn. soli uhličitanu zinečnatého v blokovaném PLGA a v neblokovaném PLGA.

In vivo degradace mikrokuliček neblokovaného PLGA byly srovnávány s mikrokuličkami blokovaného PLGA podáním injekcí vzorků mikrokuliček krysám a následným analyzováním mikrokuliček zbývajících v místě injekce v různých dobách po injekci. V každém Čase byly testovány tři krysy na každý vzorek mikrokuliček. V den podání mikrokuliček bylo do ampulek obsahujících 50 ± 1 mg mikrokuliček přidáno 750 μΐ ředidla (3 % (hmotn.) karboxymethylcelulosy (o nizké viskozitě) a 1 % hmotn. Tweenu 20 v solném roztoku). Ampulky se pak hned intenzivně třepou. Vytvoří se supenze, která se pak přenese do Iml injekční stříkačky bez jehly.

Krysy (samci Sprague-Dawley) byly anestetizovány směsí halothanu a kyslíku. Místa vpichu injekce (intraskapulární oblast) byla oholena a označena stálou tetovací barvou, aby se získalo přesné místo kůže, kam byl vzorek podán. Každé kryse byla injekčně podána celá ampulka mikrokuliček jehlou o velikosti 18 až 21 gauge.

V předem určený den (15., 30., 59. a 90. po injekci, kterou zvíře obdrželo mikrokuličky blokovaného PLGA, nebo 7. , 14.,

21., 28. a 45. den po podání injekce zvířeti, kterou obdrželo mikrokuličky neblokovaného PLGA) byly krysy usmrceny udušením oxidem uhličitým a kůže v místě vpichu (včetně mikrokuliček) byla odebrána. Jelikož mikrokuličky mají tendenci tvořit v místě vpichu shluky, přítomnost nebo nepřítomnost mikrokuliček byla stanována vizuálně.

Vizuální inspekce zjistila, že mikrokuličky neblokovaného PLGA degradovaly podstatně rychleji než mikrokuličky blokovaného PLGA a že přidáni uhličitanu zinečnatého k blokovanému PLGA podstatně zpomalilo polymerní degradaci. Například u krys, kterým byly injekčně podány mikrokuličky neblokovaného PLGA, které • · • · ·· * · · # 4 • ! * · · · · · · · . • * ···» ··· * · *· ··*··· ··»· *

.....:

obsahují 0 % hmotn. hGH a 0 nebo 1 % hmotn. uhličitanu zinečnatého, nebyly vidět žádné kuličky 21. den. Navíc u krys, kterým byly injekčně podány mikrokuličky blokovaného PLGA obsahující 0 % hmotn. hGH a 0 % hmotn. uhličitanu zinečnatého, bylo několik mikrokuliček vidět 60. den, žádná nebyla vidět 90. den. Navíc u krys, kterým byly injekčně podány mikrokuličky blokovaného PLGA, které obsahují 0 nebo 15 % hmotn. hGH a 6 % hmotn. uhličitanu zinečnatého, byly mikrokuličky vidět 90. den.

Přiklad 6

Farmakokinetické studie in vivo mikrokuliček s trvalým uvolňováním hGH u krys

U krys byly provedeny studie, které testovaly různé prostředky mikrokuliček s hGH. Byly stanoveny farmakokinetické parametry po intravenózním (i.v.) podání, subkutánním (s.k.) podání a podání SC osmotickou pumpou (Alzet) hGH. Byly vyhodnoceny profily v seru a in vivo rychlosti uvolňování různých prostředků mikrokuliček hGH.

Krysy Sprague-Dawley byly rozděleny do skupin po třech zvířatech, náhodně podle tělesné hmotnosti, a každé skupině byl podán jeden prostředek mikrokuliček hGH. Krysám bylo injekčně subkutánně podáno přibližně 7,5 mg hGH v 50 mg jednoho typu různých mikrokuliček, suspendovaných v 0,75 ml vodného ředidla pro injekce. Prostředek ředidla obsahoval 3 % hmotn. CMC (s nízkou viskozitou) a 1 % hmotn. Polysorbátu 20 v 0,9 % (hmotn.)

NaCl. Podaná dávka mikrokuliček byla stanovena nepřímo odvážením zbylé dávky v injekční ampulce a opravou na zbylé injekční ředidlo. Dávka hGH byla vypočtena pro každou náplň proteinu mikrokuliček stanovením analýzy dusíku.

Vzorky krve byly odebírány v předem stanovených intervalech až do 30 dnů po injekci. Vzorky krve po 250 μΐ byly odebírány během prvních 24 h a alespoň po 400 μΐ v každém časovém bodu po 24 h. Vzorky krve byly sraženy a koncentrace hGH v seru • 4 Β «

4 · • 4 · ·· · • · 4 • 4 4 4

4 4 byly stanoveny radioimunotestem. Radioimunotestovací (RIA) sestava od ICN byla otestována a použita pro stanovení hladin hGH v krysím seru.

Pro stanovení farmakokinetických parametrů byl hGH v solném roztoku podáván krysám subkutánní bolus injekcí, intravenózně nebo byl dodáván osmotickou pumpou (Alzet model 2ML4), která byla subkutánně implantována.

Tři skupiny krys dostaly jedinou subkutánní injekci hGH v 0,9% (hmotn.) NaCl v dávce 0,5 nebo 7,5 mg/kg při objemu dávky 1,0 mg/kg. Dvě skupiny dostaly jedinou intravenózní bolus injekci hGH v 0,9% (hmotn.) NaCl v dávce 1,0 a 5,0 mg hGH na kg krysy při objemu dávky 1,0 mg/kg. U studia s Alzetovou pumpou byly krysy rozděleny do Čtyř skupin po třech krysách, náhodně podle tělesné hmotnosti, a dostaly dávku 20 mg/ml a 40 mg/ /ml hGH v 0,9% (hmotn.) NaCl naplněnou v pumpách (Alzet model 2002, 200 μΐ, uvolňování 14 dnů) a dávku 4 mg/ml a 12 mg/ml hGH v 0,9% (hmotn.) solném roztoku naplněném v pumpách (Alzet model 2ML4, 2 ml, uvolňování 28 dnů). Očekávaná rychlost uvolňování z pump odpovídala 2 a 4 až 6 % hmotn. dávky ProLease hGH (kolem 15 mg/kg) za den. Alzetovy pumpy byly implantovány subkutánně v interskapulární oblasti po namočení ve sterilním solném roztoku po dobu 1 až 2 minut.

Prostředky mikrokuliček s trvalým uvolňování nm hGH, syntetizované jak popsáno v příkladu 2, obsahovaly 15 % hmotn. hGH komplexovaného se Zn v poměru 6:1 (Zn:hGH), 0, 1, 3 nebo 6 % hmotn. uhličitanu zinečnatého a 8K neblokovaný PLGA, 10K blokovaný PLGA nebo 31K neblokovaný PLGA.

Pro vyhodnocení různých prostředků s trvalým uvolňováním hGH byly použity in vivo indexy Cmax, Cd5 a Cmax/Cd5, kde Cmax znamená maximální pozorovanou koncentraci v seru a Cd5 znamená koncentraci v seru 5. den, což by měla přibližně být koncentrace ve stabilním stavu. Výsledky byly následující:

v *

I · « · • · · # 1 • · • φ · · prostředek zvýšení” in vitro (% hmotn.) % hmotnmonomeru

7. den

Cmax Cd5 Cmax/Css (ng/ml) (ng/ml)

8K PLGA	22,0±	99,3‘	323,3+	20,4±	19,5 +
neblokovaný 0 % ZnCO₃	0,9		98,6	14,2	10,6
8K PLGA	16,4±	97,3*	309,0±	20,4±	39,5±
neblokovaný 1 % ZnCO₃	1,6		67,1	14,2	17,7
8K PLGA	15,9±	98,7	670,5±	9,0±	44,8±
neblokovaný 3 % ZnCO₃	6,9		244,4	4,2	22,6
8K PLGA	17,6±	99,3	358,0+	18,8±	42,4 +
neblokovaný 6 % ZnCO₃	2,7		58,9	14,7	6,8
31K PLGA	12,3+	98,2	592,0+	4,5±	132,5±
neblokovaný 0 % ZnC0₃	1,1		318,2	1,5	47,9
31K PLGA	11,4+	98,8	432,7±	5,1 +	84,1±
neblokovaný 1 % ZnC0₃	1,3		91,6	0,3	14,9
31K PLGA	7,9±	99,4	643,6±	8,0±	93,3±
neblokovaný 3 % ZnCO₃	1,9		203,9	2,6	62,0
31K PLGA	15,8±	99,8	1691,8±	6,6±	262,2+
neblokovaný 6 % ZnC0₃	0,5		340,0	0,8	83,5
10K PLGA	12,7+	99,3	615,9+	4,5±	155,6±
blokovaný 1 % ZnCO₃	0,1		384,3	1,0	126,8
10K PLGA	18,1±	99,6	1053,2±	3,6±	291,7±
blokovaný	3,2		293,3	0,8	71,1

% ZnCO₃ • * • ··»· ·<·· • ·· ······ ».«· .

* · · * · · ·

	22
10K PLGA	9,9+	99,0	1743,5±	4,9±	516,1±
blokovaný	1,4		428,4	2,7	361,6

% ZnCO₃

Hodnoty získané z dvojité dávky stejného prostředku.

Výsledky testování ukázaly, že dva neblokované polymery (8K a 31K) měly odlišné in vivo kinetiky uvolňování při srovnání s původním prostředkem, který používá blokovaný 10K PLGA a 6 % hmotn, uhličitanu zinečnatého. Cmax hodnoty byly obecně nižší u prostředků s neblokovaným polymerem než u vedoucího prostředku, což předpokládá, Že počáteční zvýšení může být nižší u prostředků s neblokovaným polymerem. Zvýšení bylo definováno jako procento uvolnění hGH v prvních 24 h po injekci. Hodnoty zvýšení in vitro byly mezi 8 a 22 % hmotn. Obsah uhličitanu zinečnatého v prostředcích neměl vliv na zvýšení nebo na in vitro profil uvolňování.

Koncentrace v seru mezi 4. a 6. dnem byly udržovány na dost konstantní hladině nad základní hladinou {nebo hladinami před vykrvácením) u prostředků s neblokovaným polymerem, zatímco koncentrace v seru u blokovaných polymerů byly ve stejné době blízko základních hladin. Data uvolňování in vitro až do dnů ukázala, že uvolňovaný hGH protein byl monomerní. Užitečná data nelze 2ískat po 6. dnu kvůli tvorbě prostředku anti-hGH protilátky u krys.

Přiklad 7

Farmakokinetické studie u opice Rhesus

Předmětm této studie na primátech bylo vyhodnotit farmakokinetické profily různých prostředků trvale uvolňujících hGH při srovnání s tradičnějšími způsoby podávání hGH (např. bolus s.k. injekcí, denní s.k. injekcí a s.k. injekcí kombinovanou s použitím osmotické pumpy) a stanovit, jestli prostředek s trvalým uvolňováním hGH poskytuje optimální koncentrační profil hGH v krvi.

v * r t · • · · ' · « » « •··· ·♦·(

Prostředky mikrokuliček s trvalým uvolňováním hGH, které byly testovány, představovaly 1) 15 % hmotn. hGH (komplexovaný se Zn v poměru hGH:Zn 1:6), 6 % hmotn. uhličitanu zinečnatého a 10K blokovaný PLGA, 2) 15 % hmotn. hGH (komplexovaný se Zn v poměru hGH:Zn 1:6), 1 % hmotn. uhličitanu zinečnatého a 8K neblokovaný PLGA (RG502H PLGA polymer) a 3) 15 % hmotn. hGH (komplexovaný se Zn v poměru hGH:Zn 1:6), 1 % hmotn. uhličitanu zinečnatého a 31K neblokovaný PLGA (RG503H PLGA polymer).

V každé skupině byly čtyři opice a každé zvíře dostalo jednu subkutánní injekci do dorsálnl cervikální oblasti 1. den. Dávka 160 mg mikrokuliček s trvalým uvolňováním hGH (24 mg hGH) byla podávána každé opici v 1,2 ml injekčního ředidla jehlou o velikosti 20 gauge. Injekčním ředidlem bylo vodné ředidlo obsahující 3 % hmotn. karboxymethyleelulosy (sodná sůl), 1 % hmotn. Tweenu 20 (polysorbát 20) a 0,9 % hmotn. chloridu sodného.

Dávka hGH byla taková, aby poskytla měřitelné koncentrace hGH v seru pro farmakokinetické studie. Pro získání farmakokinetických parametrů byly zahrnuty do studie další skupiny po čtyřech zvířatech, specificky 1) jedna subkutánní injekce (24 mg hGH), 2) denně subkutánní injekce (24 mg/28 dnů = 0,86 mg hGH/den), 3) subkutánní injekce (3,6 mg hGH) kombinovaná s Alzetovou osmotickou pumpou (20,4 mg hGH) (celková dávka 24 mg hGH) a 4) subkutánní injekce injekčního ředidla jako kontrola (pro kontrolní skupinu s ředidlem byly použity pouze tři opice) .

Pro analýzy hGH, IGF1, IGFBP3 a anti-hGH protilátky byly vzorky krve shromažáovány v následujících časech: -7., -5-, -3. den před dávkou, půl hodiny po dávce, 1., 2., 3., 5., 8., 10.,

12., 24-, 28., 32. a 48. hodinu a 5., 4., 6., 8-, 11., 14., 17-, 20., 23., 26., 29., 32., 25., 28., 41., 44., 47., 50., 53. a 56. den po dávce.

Byly měřeny koncentrace IGF-1 a hGH v seru. Pro kvantitaff ff · « • · * tivní vyhodnocení hGH v seru opic byla použita sestava IRMA kit od RADIM (dodávána Wein Laboratories, P.O,Box 227, Succasunna,

N.J.). Test IRMA měl limit kvantitativního hodnocení v PBS pufru 0,1 ng/ml a v sebraném seru juvenilní opice Rhesus 1,5 ng/ml se základní hladinou GH kolem 4 ng/ml.

* · ff • ♦ · ff · · « • · ff ffff 4 • · ff • ff

Test IRMA byl vyhodnocován při koncentracích 1,5 až 75 ng/ /ml u sebraného sera juvenilní opice Rhesus. Přesnost měření je v mezích ± 10 %.

Výsledky ukázaly, Že mikrokuličky s trvalým uvolňováním hGH uvolňovaly významné trvalé hladiny hGH déle než jeden měsíc, zatímco subkutánní injekce nebyly schopny udržovat v seru stejné hladiny.

Sérový profil IGF-1 ukazoval, že koncentrace IGF-1 v seru byly vyhodnocovány nad základními hodnotami mezi 2. a 29. dnem po podání mikročástic. To ukazuje, že se z mikrokuliček s trvalým uvolňováním hGH uvolňuje dostatek hGH, aby způsobil farmakodynamický efekt. To také ukazuje, Že uvolňovaný hGH byl biologicky aktivní, což předpokládá, že proces zahrnutí do tobolek neovlivňuje nepříznivě biologickou aktivitu hGH.

Zručný odborník z oblasti techniky rozpozná nebo je schopen použitím ne více než rutinního experimentování rozpoznat mnoho ekvivalentů ke specifickým provedením vynálezu, která jsou zde specificky popsána. Tyto ekvivalenty jsou zamýšleny jako ekvivalenty, které jsou zahrnuty v rozsahu následujících nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek pro trvalé uvolňování lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje:

a) bioslučitelný polymer a

b) částice lidského růstového hormonu komplexovaného kationtem kovu, při čemž molární poměr kationtů kovu k proteinu je vyšší než 4:1 a nižší než 10:1.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že molární poměr je alespoň 6:1.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že kationtera kovu je zinečnatý ion.
4. Prostředek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků l až 3, vyznačující se tím, že kationt kovu se k lidskému růstovému hormonu přidává jako ve vodě rozpustná sůl.
5. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že kationt kovu se k lidskému růstovému hormonu přidává jako octan zinečnatý.
6. Prostředek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků l až 5, vyznačující se tím, Se částice lidského růstového hormonu komplexovaného kationtem kovu jsou dispergovány v bioslučitelném polymeru.
7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že polymer je vybrán ze skupiny sestávající poly(laktidu), póly(glykolidu), póly(laktid-ko-glykolidu), polyfmléčné kyseliny), poly(glykolové kyseliny), polykaprolaktonu, polyuhličitanu, polyesteramidu, polyanhydridu, póly (aminové kysel iny), polyorthoesteru, polykyanakrylátu, póly(dioxanonu), póly(alkylen-oxalátu), polyurethanu, jejich směsí a jejich kopolymerů.

fe fe · · «

4ί • · *< ··· KU l|(l >· I | a ₍ ,
8. Prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že polymer je vybrán ze skupiny sestávající poly(laktidu), póly(glykolidu) a póly(laktid-ko-glykolidu).
9. Prostředek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků l až 8, vyznačující se tím, že částice lidského růstového hormonu komplexovaného kationtem kovu jsou v polymeru přítomny v množství mezi 0,1 a 30, s výhodou 0,1 a 20 % hmotn.
10. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se t í m, že částice lidského růstového hormonu komplexovaného kationtem kovu jsou v polymeru přítomny v množství 15 % hmotn.
11. Prostředek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že bioslučitelný polymer dále obsahuje složku kationtů kovu.
12. Prostředek podle nároku ll, vyznačující se tím, že kation kovu složky kationtů kovu znamená zinečnatý ion.
13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že složka kationtů kovu je vybrána ze skupiny sestávající z ZnC0₃, Zn₃(C₆H₅0₇)₂, Zn(0Ac)₂, ZnSO₄ a ZnCl₂.
14. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že kation kovu složky kationtů kovu znamená hořečnatý ion.
15. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že složka kationtů kovu je vybrána ze skupiny sestávající z Mg(0H)₂, MgC0₃, Mg₃(C₆H₅0₇) ₂, Mg(0Ac)₂, MgSO< a MgCl₂.
16. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15, vy«· · • · a
17.

17.
18.

18.

značující se tím, že poměr složky kationtů kovu k polymeru je mezi 1:99 a 1:2 hmotnostními díly, s výhodou 1 % hmotn.

Prostředek podle nároku 1 pro trvalé uvolňování lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje:

a) bioslučitelný póly(laktid-ko-glykolid), v němž je dispergován zinečnatý ion, při čemž zinečnatý ion se přidává jako uhličitan zinečnatý, a

b) částice lidského růstového hormonu (hGH) komplexovaného zinečnatým iontem, při čemž zinečnatý ion se k lidskému růstovému hormonu přidává ve formě octanu zinečnatého v molárním poměru Zn:hGH 6:1 a částice lidského růstového hormonu komplexovaného zinečnatým iontem jsou v polymeru přítomny v koncentraci 15 % hmotn.

Prostředek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že se používá pro výrobu léčiva pro léčení.