TW202241509A

TW202241509A - Anti-pd-1抗體及其用途

Info

Publication number: TW202241509A
Application number: TW111104345A
Authority: TW
Inventors: 朴興祿; 裵銅球; 韓成鎬; 朴采圭; 尹明珍; 金慧美; 曺銀枝; 金京珍; 金慈盈
Original assignee: 南韓商基諾富公司
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2022-11-01
Also published as: CA3206253A1; MX2023009112A; AU2022217058A1; KR20230133871A; JP2024508658A; WO2022169274A2; EP4289866A2; KR102661163B1; BR112023015652A2; US20240034796A1; WO2022169274A3; IL304807A

Abstract

本揭露內容是有關於一種結合至程式性細胞死亡-1（PD-1）蛋白質的蛋白質結合劑、抗體、其抗原結合片段。本揭露內容提供額外對本揭露內容的蛋白質結合劑、抗體、其抗原結合片段進行加密的多核苷酸序列、包含其的載體、宿主細胞。另外，本揭露內容提供包含本揭露內容的蛋白質結合劑、抗體、其抗原結合片段的藥學組成物、試劑盒。

Description

ANTI-PD-1抗體及其用途

本揭露內容是有關於一種結合至程式性細胞死亡-1（programmed cell death-1，PD-1）蛋白質的抗體、其抗原結合片段及其用途。

本項目的說明僅提供針對本揭露內容的背景技術資訊，並不在本質上構成先前技術。

程式性細胞死亡-1（Programmed cell death-1）（亦命名為程式性死亡-1（Programmed death-1）、PD-1、CD279）是在如T細胞、B細胞、單核細胞、自然殺手（natural killer，NK）細胞及樹突狀細胞等免疫細胞中頻繁確認的細胞表面蛋白質，藉由下調免疫系統並調節免疫系統的反應，抑制T細胞炎症活性來促進自身耐受性（self-tolerance）。該情形雖亦預防自體免疫疾病，但可能妨礙免疫系統殺死癌細胞（賽恩（Syn）等人，2017柳葉刀腫瘤學（Lancet Oncol）18(12): e731-e741。）。

最近，正活躍地進行以免疫系統為靶，恢復、促進免疫力的免疫抗癌劑的開發。確認了作為免疫檢查點蛋白質之一的PD-1/PD-L1路徑在臨床上可成為癌症免疫療法的標的（帕蘇基斯（Patsoukis）等人，2020科學進展（Sci. Adv.）6：eabd2712）。因此，開發用以阻斷PD-1並使免疫系統活性化來攻擊腫瘤並治療特定類型的癌症的PD-1抑制劑。

另外，PD-1訊號傳遞的上調亦繼而帶來人類的病毒感染及擴大。流行性肝感染病毒B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及C型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）在肝細胞中誘導PD-1配位基的過表達，在效應T細胞中使PD-1訊號傳遞活性化，從而引起對病毒感染的T細胞耗竭及耐受（戈爾登-梅森（Golden-Mason）等人，2008免疫學雜誌（J Immunol）180：3637-3641）。同樣地，艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染利用相似的機制頻繁躲避人類免疫系統。曾報告，可藉由拮抗分子在治療上調節PD-1訊號傳遞以自耐受恢復免疫細胞，且可使其重新活性化來去除癌症及慢性病毒感染（岡崎（Okazaki）等人，2007國際免疫學（Int Immunol）19：813-824）。

另一方面，將抗（ANTI）PD-1促效劑抗體用於如風濕性（rheumatic）關節炎等自身免疫障礙的治療、減少移植細胞/組織的排斥的用途的開發亦在進行中（格雷比諾斯基（Grebinoski）與維格奈利（Vignali），2020免疫學目前視點（Curr Opin Immunol）67:1-9）。

另外，提出了IFNγ依存性全身性免疫反應（systemic immune response）對共有阿茲海默病及神經炎症性要素（neuroinflammatory component）的其他中樞神經系統病理的治療有益，在國際公開專利WO2015/136541中揭露了使用ANTI-PD-1抗體的阿茲海默病治療用途。於國際公開專利WO2017/220990中記載了PD-1/PD-L1抑制性免疫檢查點路徑的阻斷提高由IFNγ生產細胞帶來的IFNγ的分泌，且增加的IFNγ活性允許腦的脈絡叢（choroid plexus）選擇性白血球運送、滲透至T細胞及單核球受損的中樞神經系統、歸巢（homing）至免疫細胞的神經退行性病理及神經炎症部位，對環境的危害小且更好地去除毒性物質、拯救、再生及修復神經細胞。

ANTI-PD-1抗體製劑的開發活躍進行，但具有更多樣的適應症或特性的各種ANTI-PD-1抗體的開發仍然迫切。另外，為了有效地開發ANTI-PD-1抗體製劑或包括其的複合劑的抗體，不僅可結合至人類PD-1，亦可結合至小鼠PD-1，從而可在前臨床階段中在小鼠上確認抗體的效能、藥動力學特性、毒性等的抗體的重要性大，而由於商用化抗體的大部分僅結合至人類PD-1，因此需要開發具有交叉反應性的新的ANTI-PD-1抗體。

[技術課題]

本揭露內容的一目的是提供結合至PD-1的新型PD-1蛋白質結合劑。

本揭露內容的一目的是提供結合至PD-1的新型ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段。

本揭露內容的另一目的是提供結合至人類PD-1及小鼠PD-1二者的具有交叉反應性的（cross-reactive）新型蛋白質結合劑、抗體及其抗原結合片段。

本揭露內容的另一目的是提供生產新型PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段的方法。

本揭露內容的又一目的是提供新型PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段的用途。

但，本揭露內容欲解決的課題並不限定為以上所提及的課題，相關領域技術人員可藉由如下記載明確地理解未提及的又一些課題。

[技術解決方法]

為解決如上所述的課題，本申請案的發明者於進行多次實驗後，開發了新的PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段。

本揭露內容在一方面揭露結合至PD-1蛋白質的ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段，所述抗體及抗原結合片段包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，重鏈可變區包括：重鏈互補性決定區1（heavy chain complementarity determining region，HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；HCDR2，包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由序列號5及68至82組成的群組的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體；輕鏈可變區包括：輕鏈互補性決定區1（light chain complementarity determining region，LCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；LCDR2，包含序列號9的胺基酸序列；以及LCDR3，包含序列號11的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體。

本揭露內容在一方面揭露結合至PD-1蛋白質的ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段，抗體包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，重鏈可變區包括如由序列號13、54、56或58表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體；輕鏈可變區包括如由序列號15、55、57或59表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容在一方面提供與包括人類PD-1蛋白質（序列號62）的P130、L128及I126的PD-1的抗原決定區（epitope）特異性地結合的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段。所述ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段可與包括選自由序列號62的N66、Y68、K78、A129及A132組成的群組的一種以上的額外抗原決定區特異性地結合。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白重鏈可變區多肽包括：重鏈互補性決定區1（HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；HCDR2，包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由序列號5及68至82組成的群組的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包括：輕鏈互補性決定區1（LCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；LCDR2，包含序列號9的胺基酸序列；以及LCDR3，包含序列號11的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體。

本揭露內容在一方面提供結合至PD-1的單離的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白重鏈可變區多肽包括如由序列號13、54、56或58表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容在一方面提供結合至PD-1的單離的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包括如由序列號15、55、57或59表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的單離的免疫球蛋白重鏈可變區多肽：所述胺基酸序列與序列號13、54、56或58的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的單離的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽：所述胺基酸序列與序列號15、55、57或59的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的重鏈可變區多肽：所述胺基酸序列相對於序列號13、54、56或58的胺基酸序列包括1至10個胺基酸的添加、缺失、保守胺基酸取代或該些的組合。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的輕鏈可變區多肽：所述胺基酸序列相對於序列號15、55、57或59的胺基酸序列包括1至10個胺基酸的添加、缺失、保守胺基酸取代或該些的組合。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白重鏈可變區多肽包括：重鏈互補性決定區1（HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；HCDR2，包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由序列號5及68至82組成的群組的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體，且包括架構區（framework region）及恆定區（constant region）。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽，所述免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包括：輕鏈互補性決定區1（LCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；LCDR2，包含序列號9的胺基酸序列；以及LCDR3，包含序列號11的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體，且包括架構區及恆定區。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白重鏈多肽，所述免疫球蛋白重鏈多肽包括如由序列號13、54、56或58表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容在一方面提供單離的免疫球蛋白輕鏈多肽，所述免疫球蛋白輕鏈多肽包括如由序列號15、55、57或59表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的單離的免疫球蛋白重鏈多肽：所述胺基酸序列與序列號13、54、56或58的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的單離的免疫球蛋白輕鏈多肽：所述胺基酸序列與序列號15、55、57或59的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的免疫球蛋白重鏈多肽：所述胺基酸序列相對於序列號13、54、56或58的胺基酸序列包括1至10個胺基酸的添加、缺失、保守胺基酸取代或該些的組合。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的免疫球蛋白輕鏈多肽：所述胺基酸序列相對於序列號15、55、57或59的胺基酸序列包括1至10個胺基酸的添加、缺失、保守胺基酸取代或該些的組合。

本揭露內容在一方面提供一種PD-1蛋白質結合劑（binding agent），所述PD-1蛋白質結合劑包括：根據所述本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、抗體偶聯物、免疫球蛋白重鏈多肽及/或免疫球蛋白輕鏈多肽、免疫球蛋白重鏈可變區多肽及/或免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。

本揭露內容在一方面提供一種PD-1蛋白質結合劑，其中根據所述本揭露內容的PD-1蛋白質結合劑為選自如下的抗體或其抗原結合片段：駱駝化單域抗體、雙抗體、F(ab') ₂、Fab'、Fab、Fv、單鏈可變區片段（single chain variable fragment，scFv）、scFV二聚體、二價單鏈可變區片段（bivalent single-chain Fv，BsFv）、二硫鍵穩定性Fv片段（disulfide-stabilized Fv fragment，dsFv）、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、Fv片段、雙鏈（double strands，ds）雙抗體、奈米抗體、微型抗體、域抗體、二價域抗體、雙抗體（double antibody，dAb）及單鏈結合多肽。

本揭露內容在一方面提供一種單離或純化的多核苷酸（polynucleotide）分子，所述多核苷酸分子包括對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽進行加密的多核苷酸序列。

本揭露內容在另一方面提供單離或純化的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包括將根據本揭露內容的免疫球蛋白重鏈可變區的多肽加密的序列號14的多核苷酸序列。

本揭露內容在一方面提供單離或純化的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包括將根據本揭露內容的免疫球蛋白輕鏈可變區的多肽加密的序列號16的多核苷酸序列。

本揭露內容在一方面提供包括多核苷酸分子的載體，所述多核苷酸分子包括對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽進行加密的多核苷酸序列。

本揭露內容在一方面提供包括含有多核苷酸分子的載體的單離的宿主細胞，所述多核苷酸分子包括對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽進行加密的多核苷酸序列。

本揭露內容在一方面提供基因導入動物，進行操作以表達根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽。

本揭露內容在一方面提供使任意的所述PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽表達的方法，所述方法包括：在對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽加密的單離的多核苷酸表達的條件下，培養包含含有所述多核苷酸的載體的宿主細胞。

本揭露內容在一方面提供包括如下步驟的對PD-1相似物質進行篩選（screening）的方法：使根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽與試驗對象物質進行反應的步驟；以及測定是否結合的步驟。

本揭露內容在一方面藉由包括如下步驟的對PD-1相似物質進行篩選的方法來提供經篩選的PD-1相似物質：使根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽與試驗對象物質進行反應的步驟；以及測定是否結合的步驟。

本揭露內容在一方面提供ANTI-PD-1抗體的生產方法，所述ANTI-PD-1抗體的生產方法包括於利用PD-1抗原使PD-1剔除（knockout）小鼠免疫化後，摘除脾臟並將B淋巴細胞分離之後，於與骨髓瘤細胞進行融合得到的融合瘤（hybridoma）細胞中挑選生產與PD-1抗原進行反應的抗體的融合瘤。

本揭露內容在一方面提供融合瘤，所述融合瘤生產藉由與根據所述本揭露內容的抗體生產方法挑選出的PD-1抗原進行反應的抗體。

本揭露內容在一方面提供多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒，所述多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒包括：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽。

本揭露內容在一方面提供藥學組成物，所述藥學組成物包括選自由如下組成的群組的一種以上及藥學上可允許的賦形劑或載體：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。

所述藥學組成物可為用於預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病的藥學組成物。

本揭露內容在一方面提供在所述藥學組成物中額外包括第二治療劑的藥學組成物。

本揭露內容在一方面提供包括選自由如下組成的群組的一種以上的治療用、診斷用或檢測用試劑盒（kit）：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。

本揭露內容在一方面提供預防或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟：向個體施用選自由根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒組成的群組的一種以上。

本揭露內容亦在一方面提供在個體中調節免疫反應的方法，所述方法包括：對個體施用選自由根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒組成的群組的一種以上。

本揭露內容在一方面提供將根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽或包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒用於預防、改善腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病或製備治療劑的用途。

本揭露內容亦在一方面提供在個體中抑制腫瘤細胞的生長的方法，所述方法包括為抑制腫瘤細胞的生長而以治療學上有效的量對個體施用選自由如下組成的群組的一種以上：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。

其他態樣自本案的詳細說明及相關技術領域的技術常識而明瞭。

[發明的效果]

根據本揭露內容的PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽或包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒可結合至人類PD-1蛋白質而用以調節免疫反應。該等在例如將表達PD-1的T細胞標的化並調節PD-1活性時有用。例如，可用於預防或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病（neurodegenerative disease）或感染性疾病。

另外，根據本揭露內容的所述PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽不僅可結合至人類PD-1，亦可結合至小鼠PD-1，以在前臨床階段中可在小鼠上確認抗體的效能、藥動力學特性、毒性等，從而可對有效地開發抗體製劑或包括其的複合製劑起到重要的作用。

本揭露內容的效果並非僅限定於此種書面上的記載，包括所有普通的技術人員可藉由本揭露內容類推出的情況。

於記載本揭露內容之前，應理解的是由於本揭露內容的特定方法及所記載的實驗條件可為可變的，因此並不限定於此種方法及條件。本案所使用的用語由於本揭露內容的範圍僅由所附的申請範圍限定，因此僅用於記載特定態樣，且並不意圖對申請範圍進行限定。

除非另外定義，否則本案所使用的所有技術及科學用語具有與本揭露內容所屬領域的通常的技術人員通常所理解的相同的含義。與本案所記載的相似或同等的任意方法及物質可用於本揭露內容的實行或試驗。本案所提及的所有文獻的全文作為參考包含於本案。

本揭露內容的用語「程式性細胞死亡-1」、「PD-1」、「PD-1蛋白質」相互交換地使用，包括變異體、同型、人類PD-1的物種同源物、及具有與至少一個PD-1共同的抗原決定區的相似物。PD-1是亦作為CD279公知的T細胞共抑制劑。

本揭露內容的用語「結合分子」或「結合劑」包括抗體、其抗原結合片段、與其等的其他分子的偶聯物。

本揭露內容的用語「抗體」包括整體抗體及任意的抗原結合片段（即「抗原結合部分（portion）」）或其單鏈。「抗體」指包括藉由二硫鍵（disulfide bond）相互連接的至少兩個重鏈及兩個輕鏈的蛋白質或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區及重鏈恆定區形成。重鏈恆定區由三個域、CH1、CH2及CH3形成。各輕鏈由輕鏈可變區及輕鏈恆定區形成。輕鏈恆定區由一個域、CL形成。重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）可額外地細分化為被稱為互補性決定區（CDR）的超變異性（hypervariability）的區，該區配置於更保守的被稱為架構區（framework regions）（FR）的區之間。各VH及VL由三個CDR及四個FR形成，且自胺基封端至羧基封端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區含有與抗原進行相互作用的結合域。

於本揭露內容中，「抗體」指免疫球蛋白或其片段或衍生物，其與無論在試管內生產還是在活體內生產無關，且組合包括抗原結合部位的任意多肽。所述用語包括多選殖性、單選殖性、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合體、合成的、重組、雜交（hybrid）、突變的、及移植（grafted）抗體，但不限定於此。所述用語「抗體」以及抗體片段包括例如Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、scFv、BsFv、dsFv、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、Fd、dAb及保持抗原結合功能、即與PD-1特異性結合的能力的其他抗體片段。典型地，此種片段包括抗原結合片段。

本揭露內容的用語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、及「結合片段」指包括作為抗體與抗原之間特異性結合的原因的胺基酸的抗體分子的一部分。例如，於抗原大的情況下，抗原結合片段可僅結合至抗原的一部分。將成為與抗原分子的抗原結合片段特異性相互作用的原因的部分稱為「抗原決定區」或「抗原決定位（antigenic determinant）」。

雖然抗原結合片段可包括抗體輕鏈可變區（VL）及抗體重鏈可變區（VH），但並非必須包括兩者全部。例如，雖然所謂Fd抗體片段僅由VH域形成，但仍然稍微保持完整的抗體的抗原結合功能。

用語「抗原決定區」定義抗原決定位，且該情形如上述所定義般藉由結合片段進行特異性結合/辨別。結合片段可對於標的結構、例如人類及囓齒類PD-1與固有的結構性抗原決定區或連續性抗原決定區進行特異性結合/相互作用。結構性抗原決定區或非連續性抗原決定區藉由存在兩個以上不連續的胺基酸殘基而表徵為多肽抗原，所述兩個以上不連續的胺基酸殘基雖然在一級序列中分離但多肽折疊成天然蛋白質（native protein）/抗原時合併於分子的表面上。對抗原決定區做出貢獻的兩個以上的不連續的胺基酸殘基存在於一個以上的多肽鏈的單離區域上。此殘基於多肽鏈折疊成三維結構構成抗原決定區時合併於分子的表面上。作為對照，連續的抗原決定區或線型抗原決定區由存在於多肽鏈的單線型區段（segment）內的兩個以上的連續的胺基酸殘基形成。

用語「結合至PD-1的抗原決定區」指抗體對於PD-1的特定的抗原決定區具有特異性結合，且該抗原決定區可由線型胺基酸序列、或PD-1多肽的一部分上的三元、即三維的結構定義。特異性結合意指對PD-1的部分的抗體親和性實質上較對其他相關的多肽的親和性更大。

用語「高親和性」意指與對其他相關的多肽的親和性相比，在對PD-1的部分的親和性中存在可測定的增加。較佳為，所述親和性較對於其他蛋白質而言對於PD-1的特定部分至少為1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、10 ²倍、10 ³倍、10 ⁴倍、10 ⁵倍、10 ⁶倍以上。結合親和性可藉由酶結合免疫吸附測定法（ELISA）、或者藉由螢光活性化細胞分選分析法（fluorescence-activated cell sort，FACS）或表面電漿共振（surface plasmon resonance，SPR）來決定。

本揭露內容的用語「交叉反應性（cross-reactivity）」指本案所記載的抗原片段作為人類及囓齒類（小鼠或大鼠）中相同的標的分子的結合。因而，「交叉反應性」應理解為對在不同物種中表達的相同分子X（然而並非對X以外的其他分子）的種間反應性（interspecies reactivity）。例如，作為識別人類PD-1的單選殖性抗體的囓齒類（小鼠或大鼠）PD-1的交叉物種特異性可藉由例如FACS分析來確定。

本揭露內容的「個體」、「對象」意指需要治療疾病的對象，更具體而言，意指人類或非人類的靈長類、大鼠、小鼠、狗、貓、馬及牛等哺乳類。

本揭露內容的「治療」意指藉由施用根據本揭露內容的藥學組成物，使疾病的症狀好轉或有益地改變的所有行為。在治療中亦包括預防。需要治療的不僅包括已患有特定醫學障礙的個體，而且包括最終會患上障礙的個體。

本揭露內容的「改善」意指至少減小與治療的病症相關的參數、例如症狀的程度的所有行為。

以上，參照具體實施例的附圖，對用以實施本揭露內容的內容進行詳細說明。作為與先前技術並無不同的部分，對理解本揭露內容的技術思想而言不需要的事項排除於說明之外。

例示性的 ANTI-PD-1 抗體及 PD-1 結合劑等本揭露內容在一方面揭露結合至PD-1蛋白質的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段，且抗體或抗原結合片段包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，重鏈可變區包括：重鏈互補性決定區1（HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；HCDR2，包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由序列號5及68至82組成的群組的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體；輕鏈可變區包括：輕鏈互補性決定區1（lLCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；LCDR2，包含序列號9的胺基酸序列；以及LCDR3，包含序列號11的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體。

於一部分實例中，所述記載的「三個以下的胺基酸突變」意指三個、兩個、一個或零個胺基酸突變。

於一部分實例中，本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段可為對人類PD-1與小鼠PD-1具有同等水平的結合力的抗體或其抗原結合片段。

於一部分實例中，本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段以KD值10 ^-7M以下結合至PD-1；於一部分實例中，以KD值10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M或10 ^-11M以下結合至PD-1。

於一部分實例中，本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段即便於低pH環境下亦以KD值10 ^-9M以下，較佳為KD值10 ^-10M以下、更佳為KD值10 ^-11M以下結合至PD-1。於一部分實例中，本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段於pH 6.0下以9×10 ^-10M以下的KD結合至PD-1。

本揭露內容在一方面揭露結合至PD-1蛋白質的ANTI-PD-1抗體及其抗原結合片段，且抗體包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，重鏈可變區包括如由序列號13、54、56或58表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體；輕鏈可變區包括如由序列號15、55、57或59表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下的胺基酸突變的變異體。

本揭露內容中「單離的」是指自天然環境的成分分離。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的單離的免疫球蛋白重鏈可變區多肽：所述胺基酸序列與序列號13、54、56或58的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的結合至PD-1的單離的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽：所述胺基酸序列與序列號15、55、57或59的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。

針對多肽的序列相似性通常使用序列分析軟體來測定。蛋白質分析軟體使用分配至包括保守胺基酸取代的多種取代、缺失及其他變形的相似性尺度來匹配相似序列。例如，遺傳學電腦組（Genetics Computer Group，GCG）軟體含有可與默認參數（default parameter）一同使用的如GAP及BESTFIT等程式，以確定如來自不同物種的有機體的同族多肽等密切相關的多肽之間的、或野生型蛋白質及其突變蛋白質（mutein）之間的序列同源性或序列同一性。例如，參照GCG 6.1版。亦可使用具有默認或推薦參數的FASTA來比較多肽序列，且GCG 6.1版FASTA（例：FASTA2及FASTA3）的程式提供查詢（query）及檢索序列間的最佳重疊區的排列及百分比序列同一性。於將本揭露內容的序列與含有來自不同有機體的多個序列的資料庫進行比較的情況的又一較佳演算法是使用默認參數的電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。例如，分別參照作為參考包括於本案的文獻（參照：阿特休爾（Altschul）等人（1990）分子生物學期刊（J. Mol. Biol.）215：403-410以及（1997）核酸研究（Nucleic Acids Res.）25:3389-3402）。

不同的殘基位置因例如保守胺基酸取代可不同。

所謂「保守胺基酸取代」是胺基酸殘基被具有具有相似的化學特性（例：電荷或疏水性）的側鏈（R基團）的又一胺基酸殘基取代。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會使蛋白質的功能特性變化。於兩個以上的胺基酸序列因保守取代彼此不同的情況下，可向上調整相似率或相似度以對取代的保守性質進行修正。用於進行此種調整的手段為相關領域技術人員所熟知。例如，參照作為參照包含於本案的文獻（參照：皮爾遜（Pearson）（1994）分子生物學方法（Methods Mol. Biol.）24：307-331）。具有具有相似的化學特性的側鏈的胺基酸基團的例子包括：1）脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2）脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3）含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺；4）芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5）鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6）酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；以及7）含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保守胺酸取代基為纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺。作為代替方案，保守替代是在作為參照包含於本案的文獻（參照：貢內特（Gonnet）等人（1992）科學（Science）256：1443 45）所揭露的可接受點突變（point accepted mutation，PAM）250對數可能性矩陣（log-likelihood matrix）中具有正值的任意變化。「中度（moderately）保守」替代是在PAM250對數可能性矩陣中具有非負的（nonnegative）值的任意變化。

本揭露內容在一方面提供結合至PD-1的單離的免疫球蛋白重鏈多肽，所述免疫球蛋白重鏈多肽包括：重鏈互補性決定區1（HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；HCDR2，包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由序列號5及68至82組成的群組的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體，且包括架構區（framework region）及恆定區（constant region）。

本揭露內容在一方面提供結合至PD-1的單離的免疫球蛋白輕鏈多肽，所述免疫球蛋白輕鏈多肽包括：輕鏈互補性決定區1（LCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；LCDR2，包含序列號9的胺基酸序列；以及LCDR3，包含序列號11的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸取代或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體，且包括架構區及恆定區。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的單離的免疫球蛋白重鏈多肽：所述胺基酸序列與序列號13、54、56或58的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。

本揭露內容在一方面提供具有如下胺基酸序列的單離的免疫球蛋白輕鏈多肽：所述胺基酸序列與序列號15、55、57或59的胺基酸序列的序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。

於一部分實例中，本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段可為重組抗體，較佳為鼠類（murine）抗體、嵌合（chimeric）抗體或人源化（humanized）抗體。

於一部分實例中，本揭露內容的嵌合或人源化ANTI-PD-1抗體的重鏈恆定區源自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的突變體序列，輕鏈恆定區可源自人類k、λ鏈或其突變體序列。

於本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段的一部分實例中，抗體為嵌合抗體，抗體的恆定區（constant region）源自人類抗體的恆定區或其突變體。

於本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段的一部分實例中，抗體為人源化抗體，抗體的輕鏈架構區（framework region，FR）及重鏈架構區分別源自人類生殖腺（germline）輕鏈及重鏈或其突變體序列。

本揭露內容在一方面提供PD-1蛋白質結合劑（binding agent），所述PD-1蛋白質結合劑包括：根據所述本揭露內容的ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、抗體偶聯物、免疫球蛋白重鏈多肽及/或免疫球蛋白輕鏈多肽、免疫球蛋白重鏈可變區多肽及/或免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。

所述PD-1蛋白質結合劑可為例如抗體、抗體偶聯物、或其抗原結合片段，且並非限定為此。

於一部分實例中，為了結合至PD-1，本揭露內容提供單離的PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段，所述PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段與所述記載的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽或免疫球蛋白輕鏈多肽競爭、或者與和PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段相同的PD-1抗原決定區結合。

抗原結合片段本揭露內容中，在一方面，根據本揭露內容的所述PD-1蛋白質結合劑可為選自如下的抗體或其抗原結合片段：駱駝化單域抗體、雙抗體、F(ab') ₂、Fab'、Fab、Fv、scFv、scFV二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、Fv片段、ds雙抗體、奈米抗體、微型抗體、域抗體、二價域抗體、dAb及單鏈結合多肽，且不限定為此。

除非另外具體地指示，否則本案所使用的用語「抗體」不僅包括含有兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈的抗體分子（即「完整抗體分子」），而且包括其抗原結合片段。本案所使用的用語抗體的「抗原結合部位」、抗體的「抗原結合片段」等包括與抗原特異性結合以形成複合體的任意的可天然發生、利用酶獲得的、合成的或進行基因操作的多肽或糖蛋白。本案所使用的用語抗體的「抗原結合片段」或「抗體片段」表示保有與PD-1特異性結合的能力的抗體的一種以上的片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab') ₂片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段、或單離的CDR。於特定態樣中，用語「抗原結合片段」表示多種特異性抗原結合分子的多肽片段。抗體的抗原結合片段可使用如下等任意適合的標準技術自完整抗體分子衍生，例如伴隨對抗體可變及（任意）恆定域進行編碼的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的操作及表達的蛋白質分解消化或重組基因操作技術。此種DNA是公知的且/或可容易自例如商業供給源、DNA庫（包括例如噬菌體抗體庫）可利用或合成。DNA可例如藉由進行序列分析並使用化學或分子生物學技術進行操作，以以合適的立體配置排列一種以上的可變域及/或恆定域，或者導入密碼子，或者生成半胱胺酸殘基，或者改變、添加胺基酸或使胺基酸缺失等。

抗原結合片段的非限定性例子包括最小識別單位（例：單離的互補性決定區（CDR），例如CDR3肽）或束縛的FR3-CDR3-FR4肽，所述最小識別單位由模擬Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、scFv、BsFv、dsFv、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、Fd、dAb及抗體的高度變異（hypervariable）區的胺基酸殘基形成。其他經操作的分子，例如域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙抗體（diabody）、三抗體（triabody）、四抗體（tetrabody）、微型抗體（minibody）、奈米抗體（nanobody）（例：一價奈米抗體、二價奈米抗體等）、小型模組免疫藥劑（small modular immunopharmaceutical，SMIP）、及鯊魚可變（shark variable）IgNAR域亦包含於本案所使用的表達「抗原結合片段」內。

抗體的抗原結合片段通常包括至少一個可變域。可變域可具有任意大小或胺基酸組成，且一般而言包括鄰接於一個以上的架構序列或者位於一個以上的架構序列與架構（frame）內的至少一個CDR。於具有與VL域結合的VH域的抗原結合片段中，VH域及VL域可以相對於彼此任意合適的排列定位。例如，可變區可為二聚物，且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚物。作為代替方案，抗體的抗原結合片段可含有單體VH或VL域。

於特定態樣中，抗體的抗原結合片段可含有與至少一個恆定域共價連接的至少一個可變域。於本揭露內容的抗體的抗原結合片段內，可發現的可變域及恆定域的非限定性、例示性的立體配置包括：（i）VH-CH1；（ii）VH-CH2；（iii）VH-CH3；（iv）VH-CH1-CH2；（v）VH-CH1-CH2-CH3；（vi）VH-CH2-CH3；（vii）VH-CL；（viii）VL-CH1；（ix）VL-CH2；（x）VL-CH3；（xi）VL-CH1-CH2；（xii）VL-CH1-CH2-CH3；（xiii）VL-CH2-CH3；及（xiv）VL-CL。於包括所述列舉的例示性立體配置中的任一者的可變域及恆定域的任意立體配置中，可變域及恆定域可彼此直接連接或者可藉由完整或局部樞紐區或連結區連接。樞紐區可由在單個多肽分子中引起鄰接的可變域及/或恆定域間的可撓性或半可撓性連接的至少兩個（例：5個、10個、15個、20個、40個、60個以上）胺基酸形成。進而，本揭露內容的抗體的抗原結合片段可彼此及/或以與一種以上的單體VH域或VL域非共價連接或共價連接（例如，藉由二硫鍵）包括所述列舉的可變域及恆定域立體配置中的任一者的同二聚體或異二聚體（或其他聚合物）。與完整抗體分子同樣地，抗原結合片段可為單特異性或多特異性（例：雙特異性）。抗體的多特異性抗原結合片段通常包括至少兩個不同的可變域，此處各可變域可特異性地結合至另外的抗原或相同抗原上的不同抗原決定區。包括本案所揭露的例示性的雙特異性抗體格式的任意多特異性抗體格式使用在相應領域中可使用的日常的技術，以可與本揭露內容的抗體的抗原結合片段的脈絡中的使用相匹配。

對例示性的 ANTI-PD-1 抗體及結合劑等進行加密的核酸本揭露內容在一方面提供單離或純化的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包括對如下加密的多核苷酸序列：根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽。

本揭露內容於另一方面提供包括如下的多核苷酸序列的單離或純化的多核苷酸分子，所述多核苷酸序列為對根據本發明內容的免疫球蛋白重鏈可變區的多肽加密的序列號14的多核苷酸序列。

本揭露內容在一方面提供包括如下的多核苷酸序列的單離或純化的多核苷酸分子，所述多核苷酸序列為對根據本發明內容的免疫球蛋白輕鏈可變區的多肽加密的序列號16的多核苷酸序列。

例示性的 ANTI-PD-1 抗體及結合劑等的製備於本揭露內容的一方面提供抗體的生產方法，所述抗體的生產方法包括利用PD-1抗原使PD-1剔除小鼠免疫化後，摘除脾臟並將B淋巴細胞分離之後，於與骨髓瘤細胞進行融合得到的融合瘤細胞中挑選生產與人類PD-1抗原進行反應的抗體的融合瘤。

另外，於本揭露內容的一方面提供藉由所述抗體生產方法製備的融合瘤。

本揭露內容在一方面提供包括含有如下多核苷酸序列的多核苷酸分子的載體：所述多核苷酸序列對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽進行加密。

本揭露內容在一方面提供包括含有如下多核苷酸分子的載體的單離的宿主細胞：所述多核苷酸分子包括對根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽進行加密的多核苷酸序列。

於一實施態樣中，宿主細胞包括：（1）載體，包括將包括根據本揭露內容的抗體的VL的胺基酸序列及包括抗體的VH的胺基酸序列進行加密的多核苷酸；或（2）第一載體以及第二載體，所述第一載體包括將包括根據本揭露內容的抗體的VL的胺基酸序列進行加密的多核苷酸，所述第二載體包括將包括抗體的VH的胺基酸序列進行加密的多核苷酸（例如，藉由該些載體進行形質轉化）。

於一實施態樣中，提供包括如下的ANTI-PD1抗體的製備方法：在適於抗體表達的條件下，培養如上述中提供所示的包括對結合至PD-1的抗體進行加密的多核苷酸的宿主細胞，並選擇性地自宿主細胞（或宿主細胞培養基）回收抗體。

作為適於進行抗體加密載體的選殖或表達的宿主細胞，包括原核細胞或真核細胞。例如，抗體可在細菌中生成，特別是不需要糖基化及Fc作動因子功能的情況。對於細菌中的抗體片段及多肽的表達，可參照例如US 5,648,237號、US 5,789,199號及US 5,840,523號。另外，此可參照記述在大腸桿菌中抗體片段的表達的文獻[查爾頓（Charlton），K.A.，在：分子生物學方法（Methods in Molecular Biology）第248卷，Lo B.K.C.（編輯），胡馬納出版社（Humana Press），托托瓦市（Totowa），新澤西（2003），第245頁至第254頁]。抗體可於表達後，自可溶性分區中的細菌細胞漿單離，且可進一步進行純化。除原核細胞之外，糖基化路徑包括「人源化」而引起具有局部或完全人類糖基化圖案的抗體的生成的真菌及酵母菌株，如絲狀菌或酵母等真核微生物亦為適於抗體加密載體的選殖或表達宿主（參照文獻[格恩格羅斯（Gerngross），T.U.，自然生物技術（Nat. Biotech.）22（2004）1409-1414；以及李，H.等人，自然生物技術24（2006）210-215]）。

適於進行糖基化抗體的表達的宿主細胞亦衍生自多細胞有機體（無脊椎動物及脊椎動物）。作為無脊椎動物細胞的例子，包括植物細胞及昆蟲細胞。特別是為了進行草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）細胞的形質感染，辨別出許多可與昆蟲細胞一同使用的桿狀病毒菌株。植物細胞培養物亦可用作宿主（例如，參照美國專利第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429號（說明了用於在基因移植植物中生成抗體的植物抗體 ^TM（PLANTIBODIES） ^TM技術））。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株可能有用。有用的哺乳動物宿主細胞株的其他例子有：藉由SV40形質轉化的猿猴腎CV1細胞株（COS-7）；人類胎兒腎細胞株（例如，如文獻[格雷厄姆（Graham），F.L.等人，普通病毒學雜誌（J. Gen Virol.）36（1977）59-74]所記述的293或293細胞）；幼倉鼠腎細胞（BHK）；小鼠塞特利（sertoli）細胞（例如，如文獻[馬瑟（Mather），J.P.，生殖生物學（Biol. Reprod.）23（1980）243-252]所記載的TM4細胞）；猿猴腎細胞（CV1）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76）；人宮頸癌細胞（HELA）；狗腎細胞（MDCK）；水牛鼠肝細胞（buffalo rat liver，BRL 3A）；人肺細胞（W138）；人肝細胞（Hep G2）；小鼠乳腺腫瘤細胞（MMT 060562）；例如，如文獻[馬瑟（Mather），J.P.等人，紐約科學院年鑒（Annals N.Y. Acad. Sci.）383（1982）44-68]所記述的TRI細胞；MRC5細胞；以及FS4細胞。作為其他有用的哺乳動物宿主細胞株，包括：包含二氫葉酸還原酶中國倉鼠卵巢（dihydrofolate reductase-Chinese hamster ovary cell，DHFR-CHO）細胞[烏爾勞布（Urlaub），G.等人，美國科學院院報（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）77（1980）4216-4220]的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞；以及骨髓瘤細胞株，例如Y0、NS0及Sp2/0。為了研究適合於抗體生成的特定哺乳動物宿主細胞株，可參照例如文獻[矢崎（Yazaki），P.以及吳，A.M.，分子生物學方法，第248卷，Lo, B.K.C.（編輯），胡馬納出版社，托托瓦市，新澤西（2004），第255頁至第268頁]。

本揭露內容在一方面提供基因導入動物，進行操作以表達：根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽。所述動物可為例如如小鼠、大鼠等囓齒類。

本揭露內容在一方面提供包括如下步驟的對PD-1相似物質進行篩選的方法：使根據所述本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽與試驗對象物質進行反應的步驟；以及測定是否結合的步驟。

多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物本揭露內容在一方面提供包括如下的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白輕鏈多肽。

抗體的多特異性（例如雙特異性）抗原結合分子通常包括至少兩個不同的可變域，此處各可變域可特異性地結合至另外的抗原或相同抗原上的不同抗原決定區。包括雙特異性抗體格式的任意多特異性抗體格式使用在相應領域中可使用的日常的技術，以可與本揭露內容的抗體的抗原結合片段的脈絡中的使用相匹配。

在一方面，本揭露內容包括多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段，此處免疫球蛋白的一個特異性是對PD-1的細胞外域或其片段是特異性的，免疫球蛋白的另一特異性是對PD-1的細胞外域以外的域的結合、或對第二治療標的是特異性的，或者與治療部分進行偶聯。免疫球蛋白的另一特異性可對第二標的抗原是特異性的。所述第二標的抗原可存在於與PD-1相同的細胞或不同的細胞上。在一態樣中，第二標的抗原存在於如B細胞、抗原傳遞細胞、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞等T細胞之外的免疫細胞上。於一部分態樣中，第二標的抗原可存在於腫瘤細胞或自身免疫組織細胞或被病毒感染的細胞上。

於又一方面，本揭露內容提供包括與PD-1結合的第一抗原結合特異性、及與T細胞受體、B細胞受體或Fc受體結合的第二抗原結合特異性的多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段。於相關方面，本揭露內容提供包括與PD-1結合的第一抗原結合特異性、及第二抗原結合特異性的多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段，所述第二抗原結合特異性與如淋巴細胞活化基因3（Lymphocyte activation gene 3，LAG-3）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、B淋巴細胞及T淋巴細胞衰減因子（B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA）、CD-28、2B4、LY108、TIGIT、TIM3、白血球關聯免疫球蛋白樣受體1（leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor1，LAIR1）、可誘導T細胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）及CD160等不同的T細胞共抑制劑結合。

於又一方面，本揭露內容提供包括結合至PD-1的第一抗原結合特異性、及結合至自身免疫組織特異性抗原的第二抗原結合特異性的多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段。於特定態樣中，所述抗體可為活化或作用劑抗體。

本揭露內容的多特異性抗原結合分子中的任一者或其變異體可使用如對相關領域技術人員而言公知的標準分子生物學技術（例：重組DNA及蛋白質表達技術）來進行製劑。

於一部分態樣中，PD-1特異性抗體生成雙特異性格式（「雙特異性」），所述雙特異性格式是結合至PD-1的不同域的可變區連接在一起並在單鍵分子內提供雙域特異性。藉由經適當地設計的雙特異性抗體增加特異性及結合活性（結合親和力（binding avidity））兩者全部，從而可增進全面的PD-1抑制效能。可結合至一個域內不同的區或者具有對各個域（例：N封端域的分段）的特異性的可變區在將各區同時結合至另外的抗原決定區或一個域內不同的區的結構性架構中成對。

作為雙特異性抗體的一例，將來自具有對一個域的特異性的結合劑的VH與來自具有對第二域的特異性的一系列結合劑的輕鏈可變區（VL）進行重組，以不破壞對重鏈可變區（VH）的最初的特異性並識別可與最初的VH成對的非同源（non-cognate）VL配偶體。利用此種方式對單VL分段（例：VL1）與兩個不同的VH域（例：VH1及VH2）進行組合，從而可生產由兩個鍵「臂（arm）」（VH1-VL1及VH2-VL1）形成的雙特異性抗體。由於單VL分段的使用使所述系統的複雜性減少，因此在生成雙特異性抗體時使用的選殖、表達及純化製程中增加效率（例如，參照US13/022759及US2010/0331527）。

作為代替方案，與一個以上的域及第二標的結合的抗體、例如非限定性的第二不同的ANTI-PD-1抗體可使用本案所記載的技術或對相關領域技術人員而言公知的其他技術以製備成雙特異性格式。將結合至不同區的抗體可變區與例如結合至PD-1的細胞外域上的相關部位的可變區連接，以在單鍵分子內提供雙特異性抗原。此種特性的經適當設計的雙特異性抗體起到雙重功能。具有針對細胞外域的特異性的可變區與具有針對細胞外域之外的域的特異性的可變區組合，且在將各可變區結合至另外的抗原的結構性架構中成對。

在本揭露內容的脈絡中可使用的例示性的雙特異性抗體格式伴隨第一免疫球蛋白（immune globulin，Ig）CH3域及第二Ig CH3域的使用，此處所述第一Ig CH3域及第二Ig CH3域彼此因至少一個胺基酸而不同，且至少一個胺基酸的差異與無胺基酸差異的雙特異性抗體相比，減少對蛋白質A的雙特異性抗體的結合。

在一態樣中，所述第一Ig CH3域與蛋白質A結合，所述第二Ig CH3域如H95R變形（根據國際免疫遺傳學資訊系統（international Immunogenetics information system，IMGT）外顯子（exon）編號（numbering）；根據歐盟（European Union，EU）編號的H435R）般含有減少蛋白質A結合或停止蛋白質A結合的突變。所述第二CH3可額外包含Y96F變形（根據IMGT；根據EU編號的Y436F）。在第二CH3內可發現的附加變形於IgG1抗體的情況包括D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I（根據IMGT；根據EU編號的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I）；於IgG2抗體的情況包括N44S、K52N及V82I（IMGT；根據EU編號的N384S、K392N及V422I）；以及於IgG4抗體的情況包括Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I（根據IMGT；根據EU編號的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I）。關於記載的所述雙特異性抗體格式的變形亦考慮在本揭露內容的範圍內。

在本揭露內容的脈絡中可使用的其他例示性的雙特異性格式包括如下而無限制：例如，基於scFv或雙體雙特異性格式、IgG-scFv融合物、雙重可變域（Dual variable domain，DVD）-Ig、雜交瘤（Quadroma）、隆突-入-穴（knobs into-holes）、通常的輕鏈（例：具有隆突-入-穴的通常的輕鏈等）、交叉單選殖抗體（Cross monoclonal antibody，CrossMab）、交叉Fab、（鏈交換改造域（strand-exchange engineered domain，SEED））抗體、白胺酸拉鍊（zipper）、杜歐抗體（Duobody）、IgG1/IgG2、雙重作用Fab (DAF)-IgG及Mab 2雙特異性格式（為了研究所述格式，參照例如克萊因（Klein）等人2012，mAbs 4:6，1-11，及本案所引用的參考文獻）。雙特異性抗體亦可使用肽/核酸偶聯來進行製劑，例如，此處具有正交化學反應性（orthogonal chemical reactivity）的非天然胺基酸生成部位特異性抗體寡核苷酸（oligonucleotide）偶聯物，接著在自行組裝成具有定義的組成、原子價（valency）及幾何學的聚合物複合體時使用（參照：例如，坎紮納（Kazane）等人，美國化學會志（J. Am. Chem. Soc.）[電子出版（Epub）:2012年12月4日]）。

本揭露內容包括與如治療癌症的化學療法劑或細胞毒素等治療部分偶聯的人ANTI-PD-1單選殖（monoclonal）抗體（「免疫偶聯物」）。如本案所使用般，用語「免疫偶聯物」表示在化學或生物學上與如下連接的抗體：細胞毒素、放射性劑、細胞因子（cytokine）、干擾素（interferon）、標的或報告部分（reporter moiety）、酶、毒素、肽或蛋白質或治療劑。所述抗體根據可與其標的結合的一種分子，而無論處於任何位置均可與細胞毒素、放射性劑、細胞因子、干擾素、標的或報告部分、酶、毒素、肽或治療劑連接。免疫偶聯物的例子包括抗體藥物偶聯物及抗體毒素融合蛋白質。

可與ANTI-PD-1抗體偶聯的治療部分的類型會考慮將治療的病情及將達成的目的的治療效果。適於形成免疫偶聯物的物質的例子在相應領域是公知的；例如參照WO 05/103081。

治療性施藥及劑型本揭露內容在一方面提供包括選自由如下組成的群組的一種以上及在藥學上可允許的賦形劑、載體的藥學組成物：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。

所述藥學組成物可為用於預防、改善或治療如下的藥學組成物：腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病。

本揭露內容在一方面提供預防、改善及/或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟：向個體施用選自由根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒組成的群組的一種以上。

根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽、或包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒藉由以下方式而對可治療的任意疾病或障礙、病情的治療、預防及/或改善而言有用：阻斷特別是與PD-1表達、訊號傳遞（signaling）或活性相關或者藉由其等作為媒介或者PD-1與PD1配位基（例：PD-L1或PD-L2）間的相互作用，或者其他抑制PD-1活性及/或訊號傳遞。

根據所述本揭露內容的藥學組成物可用於預防、治療或改善與PD-1相關的病症。

所述與PD-1相關的病症可為腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病，且不限定於此。

所述與PD-1相關的病症可為非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腎癌、肝癌、骨癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫瘤、默克爾（Merkel）細胞癌及經典霍奇金淋巴瘤（classic hodgkin's lymphoma，CHL）、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富的B細胞淋巴瘤、人類皰疹病毒（Epstein-Barr virus，EBV）-陽性及-陰性移植後淋巴增生性疾病（post transplant lymphoproliferative disorder，PTLD）、或EBV-相關的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、漿母細胞淋巴瘤、外源性NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌、或人類皰疹病毒8（human herpes virus 8，HHV8）-相關的原發性滲出性淋巴瘤、包括霍奇金淋巴瘤的其他血癌、包括原發性中樞神經系統（central nervous system，CNS）淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤的中樞神經系統的新生物，且不限定於此。

根據本揭露內容的藥學組成物可用於治療癌症的早期階段或後期階段症狀。在一態樣中，本揭露內容的抗體或其片段可用於治療轉移性癌症。根據本揭露內容的藥學組成物在減少或抑制或收縮固體腫瘤及血癌（blood cancer）兩者全部的腫瘤生長方面有用。在特定態樣中，根據本揭露內容的藥學組成物的處理在受試者中引起減少腫瘤的50%以上、減少60%以上、減少70%以上、減少80%以上、減少90%以上。在特定態樣中，所述藥學組成物可用於預防腫瘤的復發。在特定態樣中，所述藥學組成物在患有癌症的受試者中在延長整體存活方面有用。在一部分態樣中，所述藥學性組成物在患有癌症的患者中在保持長時間存活並減少化學療法或放射線療法帶來的毒性方面有用。

作為所述與PD-1相關的病症的自體免疫疾病，可為例如狼瘡、全身性紅斑狼瘡、乾燥症候群（Sjogren's Syndrome）、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、骨盆腔發炎性疾病、阿茲海默病（Alzheimer's Disease）、炎症性腸病、克羅恩病（Crohn's disease）、潰瘍性大腸炎、佩羅尼病（Peyronie's Disease）、乳糜瀉病（coeliac disease）、膽囊疾病、藏毛病（Pilonidal disease）、腹膜炎、牛皮癬、銀屑病關節炎、血管炎、術後黏連（surgical adhesions）、中風、第1型糖尿病、萊姆病（Lyme disease）、腦膜腦炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、吉蘭-巴雷症候群（Guillain-Barr syndrome）、特應性皮炎、自身免疫性肝炎、纖維化肺泡炎、格雷夫斯病（Grave's disease）、免疫球蛋白（Ig）A腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼埃病（Meniere's disease）、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病（sarcoidosis）、硬皮症、華格納氏肉芽病（Wegener's granulomatosis）、其他自體免疫疾病、胰腺炎、外傷（trauma）（手術）、移植物抗宿主病、移植排斥反應、包括如心肌梗塞及動脈粥樣硬化等的缺血性疾病的心臟病、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎及胃酸過少症、與缺乏母胎耐受相關的不孕症（infertility related to lack of fetal-maternal tolerance）、白癜風、重症肌無力或全身性硬化症，且不限定於此。

提出了IFNγ依存性全身性免疫反應（systemic immune response）對共有阿茲海默病及神經炎症性要素（neuroinflammatory component）的其他中樞神經系統病理的治療有益，揭露了在國際公開專利WO2015/136541中使用ANTI-PD-1抗體的阿茲海默病治療用途。於國際公開專利WO2017/220990中記載了PD-1/PD-L1抑制性免疫檢查點路徑的阻斷提高由IFNγ-生產細胞帶來的IFNγ的分泌，且增加的IFNγ活性允許腦的脈絡叢（choroid plexus）選擇性白血球運送、滲透至T細胞及單核球的受損的中樞神經系統、歸巢（homing）至免疫細胞的神經退行性病理及神經炎症部位，對環境的危害小且更好地去除毒性物質、拯救、再生及修復神經細胞。

公知的是PD-1在中樞神經系統中不僅與認知功能（cognitive function）、學習、記憶相關，而且與腦腫瘤、阿茲海默病、中風（stroke）、脊髓損傷（spinal cord injury）、多發性硬化症（multiple sclerosis）、膠質母細胞瘤（glioblastoma）、黑色素瘤（melanoma）、疼痛（pain）等中樞神經系統障礙相關（早尊禮（Zunli Zao）等，「PD-1在中樞神經系統與腦部疾病中的新興角色（Emerging role of PD-1 in the central nervous system and brain diseases）」，神經科學通報（Neurosci. Bull.）2021年4月20日，在線發表（online published））。另外，曾報告PD-1與視網膜節細胞（retinal ganglion cell）有關，已知所述視網膜節細胞在阿茲海默病、帕金森病、多發性硬化症、肌肉萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等神經退行性疾病中衰退（degeneration）（陳玲（Ling Chen）等，免疫調節劑程序性細胞死亡-1在小鼠視網膜節細胞發育及凋亡期間的作用（Role of the Immune Modulator Programmed Cell Death-1 during Development and Apoptosis of Mouse Retinal Ganglion Cells），眼科研究與視覺科學（Investigative Ophthalmology & Visual Science），2009，第50卷第10號，4941-4948）。公知的是ANTI-PD-1抗體可在阿茲海默病模型小鼠5XFAD及癡呆模型小鼠中改善認知障礙及病理學特徵，並用於神經退行性疾病（米歇爾施瓦茨（Michal Schwartz）等，「阿茲海默病與年齡相關性癡呆的潛在免疫療法（Potential immunotherapy for Alzheimer disease and age-related dementia）」，臨床神經科學對話（Dialogues in clinical neuroscience），21（1），21，2019），且曾報告ANTI-PD-1抗體納武單抗（nivolumab）提高學習及記憶（季如榮（Ru-Rong Ji）等，「Anti-PD-1治療作為增強神經元興奮性、突觸可塑性與記憶力的神經療法（Anti-PD-1 treatment as a neurotherapy to enhance neuronal excitability, synaptic plasticity and memory）」，預印本在線期刊（BioRxiv），2019年12月10日Htps://doi.org/10.1101.870600）。

在本揭露內容的一方面，根據本揭露內容的藥學組成物可用於預防、改善、治療作為與PD-1相關的病症的神經系統疾病及神經退行性疾病，所述神經系統疾病及神經退行性疾病例如，認知障礙、腦腫瘤、阿茲海默病、癡呆、中風（stroke）、脊髓損傷（spinal cord injury）、肌肉萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、帕金森病、亨廷頓病、多發性硬化症（multiple sclerosis）、膠質母細胞（glioblastoma）、黑色素瘤（melanoma）、疼痛（pain）、記憶力減退，且不限定於此。

在本揭露內容的一方面，根據本揭露內容的藥學組成物在治療患有慢性病毒感染的受試者方面有用。在一部分態樣中，於根據本揭露內容的宿主中減少病毒滴定量（viral titer）及/或重新獲得耗竭的T細胞方面有用。

所述與PD-1相關的病症的感染性疾病可為包含如下的慢性病毒感染：B型肝炎、C型肝炎的病毒感染、皰疹病毒、人類皰疹病毒、HIV、巨細胞病毒（cytomegalovirus）、單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒2型、人乳頭瘤病毒、腺病毒（adenovirus）、與皰疹病毒傳染相關的卡波西氏（Kaposi West）肉瘤、細環病毒（Torque teno virus）、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）JC病毒或BK病毒感染。

在一態樣中，本揭露內容的藥學組成物於如獼猴等猿猴受試者中可用於治療猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）引起的感染。

在一態樣中，根據本揭露內容的藥學組成物可被施用以緩和或預防疾病或障礙的一種以上的症狀或病症，或者減少其重症度。在本案中亦考慮在處於如癌症、自體免疫疾病及慢性病毒感染等疾病或障礙的發病危險的患者中預防性使用根據本揭露內容的藥學組成物。

在本揭露內容的又一態樣中，根據本揭露內容的藥學組成物可與在治療癌症、自體免疫疾病或病毒感染中有用的對相關領域技術人員而言公知的任意其他製劑或任意其他療法一同用作輔助療法。

根據本揭露內容的藥學組成物可與包含於劑型內的其他製劑一同施用，以提供適合的載體、賦形劑、及經提高的搬運、傳遞、耐受性等。多個適當的劑型可在對所有製藥化學家（pharmaceutical chemist）而言公知的處方集（參照：雷明頓製藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences），麥克出版公司（Mack Publishing Company），伊斯頓（Easton），賓夕法尼亞州（PA））中進行確認。該些劑型包括：例如，粉末、漿（paste）、軟膏、凝膠、蠟、油、液體、含有囊泡（vesicle）的液體（陽離子或陰離子）（例：轉染試劑（LIPOFECTIN™））、DNA偶聯物、無水吸收漿、水包油及油包水乳液、乳液卡波蠟（多種分子量的聚乙二醇）、半固體凝膠、及含有卡波蠟的半固體混合物（參照：鮑威爾（Powell）等人「腸胃外製劑賦形劑綱要（Compendium of excipients for parenteral formulations）」PDA醫藥科技雜誌（PDA J Pharm Sci Technol）（1998）52:238-311）。

抗體的用量可根據要施用的受試者的年齡及大小、標的疾病、病情、施用途徑等是可變的。於本揭露內容的抗體在成人患者中用於治療疾病或障礙或預防此種疾病的情況，通常以每1 kg體重約0.1 mg至約60 mg，更佳為約5 mg至約60 mg、約10 mg至約50 mg、或約20 mg至約50 mg的單日用量施用本揭露內容的抗體是有利的。根據病情的重症度，可調節治療頻率及治療持續時間。在特定態樣中，本揭露內容的抗體或其抗原結合片段可以至少約0.1 mg至約800 mg、約1 mg至約500mg、約5 mg至約300 mg、或約10 mg至約200 mg、至約100 mg、或至約50 mg為止的初期用量來施用。在特定態樣中，所述初期用量可接著施用與初期用量大致相同或可較其少的量的第二或多個此後用量的抗體或其抗原結合片段，此處所述此後用量按照至少一日至三日；至少一周、至少兩周；至少三周；至少四周；至少五周；至少六周；至少七周；至少八周；至少九周；至少十周；至少十二周；或至少十四周程度降低。

本揭露內容的藥學組成物可利用多種傳遞系統例如脂質體內膠囊化、微粒、微膠囊、可表達突變病毒的重組細胞、受體傳播的內吞作用（endocytosis）來施用（參照：例如，吳等人（1987）生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）262:4429-4432）。導入方法包括皮內、經皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻腔內、硬膜外及口服途徑，但不限定於此。所述組成物可藉由任意通常的途徑、例如藉由注入或單次快速（bolus）注射、通過上皮或黏膜皮膚內層（lining）（例：口腔黏膜、直腸及腸黏膜等）的吸收來施用，且可與其他生物學活性劑一同施用。施用可為全身施用或局部施用。

本揭露內容的藥學組成物亦可藉由囊泡、特別是脂質體傳遞（參照：例如，蘭格（Langer）（1990）科學249:1527-1533）。亦可考慮使用傳遞本揭露內容的抗體的奈米粒子。抗體偶聯的奈米粒子可用於治療及診斷用途兩者全部。抗體偶聯的奈米粒子及製備方法及用途詳細記載於作為參照包括在本案中的文獻（參照：阿魯埃博（Arruebo, M.）等人2009，在奈米材料雜誌（J.Nanomat）合訂本（Volume）2009中的「用於生物醫學應用的抗體偶聯奈米粒子（Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications）」，論文（Article）ID 439389，第24頁，doi: 10.1155/2009/439389）。開發奈米粒子並與藥學組成物所含有的抗體偶聯，從而可對腫瘤細胞或自身免疫組織細胞或病毒感染的細胞進行標的化。用於藥物傳遞的奈米粒子亦記載於例如各全文包含於本案的US 8257740或US 8246995。

在特定狀況下，本揭露內容的藥學組成物可利用受控制的釋放系統傳遞。在一態樣中，可使用泵。在又一態樣中，可使用聚合物性物質。在又一態樣中，受控制的釋放系統可配置於組成物的標的附近，且僅需要全身用量的一部分。可注射的製劑可包括用於進行靜脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內及肌肉內注射、滴注（drip infusion）等的施用型。該些可注射的製劑可利用正式公知的方法來製備。可注射的製劑可藉由例如使所述記載的抗體或其鹽溶解或懸浮或乳化於滅菌水溶性培養基或通常用於注射的油性培養基中來製備。作為注射用水溶性培養基，具有可與適當的增溶劑等一同使用的例如生理鹽水、含有葡萄糖的等張溶液及其他輔助劑等，所述增溶劑例如醇（例：乙醇）、多元醇（例：丙二醇、聚乙二醇）、非離子性介面活性劑[例：聚山梨醇酯80、氫化蓖麻油的HCO-50（聚氧乙烯（50莫耳）添加物）]。作為油性培養基，可利用可與例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶劑一同使用的例如芝麻油、大豆油等。因此，製備的注射液較佳為裝入適當的安瓿中。

本揭露內容的藥學組成物可藉由標準針（standard needle）及注射器傳遞至皮下或靜脈內。另外，對於皮下，筆傳遞裝置（pen delivery device）容易用於傳遞本揭露內容的藥學組成物。此種筆傳遞裝置可重覆使用或可為一次性的。可重覆使用的筆傳遞裝置一般使用含有藥學組成物的可替換藥筒（cartridge）。若施用藥筒內的所有藥學組成物，使藥筒變空，則空的藥筒容易廢棄並可替換為含有藥學組成物的新的藥筒。筆傳遞裝置之後可重覆使用。於一次性筆傳遞裝置中，沒有可替換的藥筒。相反，一次性筆傳遞裝置中預先填充有收容於所述裝置內的存放處的藥學組成物。若所述存放處中藥學組成物耗竭，則將整個裝置廢棄。多個可重覆使用的筆及自動注射器（autoinjector）傳遞裝置用於本揭露內容的藥學組成物的皮下傳遞。例如，包括自動筆（自動筆（AUTOPEN™），（歐曼福德公司（Owen Mumford, Inc.），伍德斯托克（Woodstock），英國（UK））、迪斯創尼（DISETRONIC™）筆（迪斯創尼醫療系統（Disetronic Medical Systems），博格多夫（Burghdorf），瑞士）、優泌樂（HUMALOG MIX）75/25™筆、優泌樂（HUMALOG™）筆、優泌林（HUMALIN）70/30™筆（禮來公司（Eli Lilly and Co.），印第安納波利斯（Indianapolis），印第安納州（IN））、諾和筆（NOVOPEN™）I、II及III（諾和諾德（Novo Nordisk），哥本哈根（Copenhagen），丹麥（Denmark））、諾和筆初級（NOVOPEN JUNIOR™）（諾和諾德，哥本哈根，丹麥）、BD™筆（貝迪公司（Becton Dickinson），富蘭克林湖（Franklin Lakes），新澤西州）、奧普提筆（OPTIPEN™）、專業奧普提筆（OPTIPEN PRO™）、奧普提筆新星（OPTIPEN STARLET™）、及奧普提可立克（OPTICLIK™，賽諾菲-安萬特（Sanofi-Aventis），法蘭克福（Frankfurt），德國（Germany）），但不必限定於此。用於本揭露內容的藥學組成物的皮下傳遞的一次性筆傳遞裝置包括例如索羅仕（SOLOSTAR™）筆（賽諾菲-安萬特（Sanofi-Aventis））、福萊筆（FLEXPEN™）（諾和諾德（Novo Nordisk））、及奎克筆（KWIKPEN™，禮來（Eli Lilly））、舒萊可立克（SURECLICK™）自動注射器（安進（Amgen），千橡市（Thousand Oaks），加利福尼亞州（CA））、派萊特（PENLET™，哈塞梅爾（Haselmeier），斯圖加特（Stuttgart），德國）、艾佩筆（EPIPEN，戴伊有限合夥（Dey, L.P.））及修美樂（HUMIRA™）筆（雅培實驗室（Abbott Labs），雅培科技園（Abbott Park），伊利諾伊州（IL）），但不必限定於此。

有利地，用於所述記載的口服或非口服使用的藥學組成物被製備成適於匹配活性成分的用量的單位用量的施用型。此種單位用量的施用型包括例如純化、藥片、膠囊、注射液（安瓿）、栓劑等。較佳為含有的抗體的量一般每單位容量、特別是注射形態的施用型為約5 mg至約500 mg，且含有約5 mg至約100 mg的抗體及相對於其他施用型含有約10 mg至約250 mg的抗體。

本揭露內容亦在一方面提供在個體身上調節免疫反應的方法，所述方法包括：對個體施用選自由根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒組成的群組的一種以上。

並用施藥在本揭露內容的一方面，根據本揭露內容的藥學組成物提供額外包括第二治療劑的藥學組成物。

在多個態樣中，作為第二治療劑，可與如下一同使用：針對PD-L1的抗體、針對PD-1的第二抗體（例：納武單抗）、LAG-3抑制劑、CTLA-4抑制劑（例：易普利姆瑪（ipilimumab））、TIM3抑制劑、BTLA抑制劑、TIGIT抑制劑、CD47抑制劑、或其他T細胞共抑制劑或配位基的拮抗劑（例：針對CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗體）、吲哚胺-2,3-二氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）抑制劑、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）拮抗劑[例：「VEGF-Trap」例如，記載於US 7,087,411的阿柏西普（aflibercept）或其他VEGF-抑制融合蛋白質、或ANTI-VEGF抗體或其抗原結合片段（例：貝伐單抗（bevacizumab）或蘭尼單抗（ranibizumab））或VEGF受體的小分子激酶抑制劑（例：舒尼替尼（Sunitinib）、索拉非尼（sorafenib）或帕唑帕尼（pazopanib））]、Ang2抑制劑（例：內斯巴庫抗體（Nesbacumab））、形質轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）抑制劑、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑（例：埃羅替尼（Erlotinib）、西妥昔單抗（cetuximab））、針對共刺激受體的作用劑（例：針對糖皮質激素（glucocorticoids）衍生的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）相關蛋白質的作用劑）、針對腫瘤特異性抗原的抗體（例：CA9、CA125、黑色素瘤相關的抗原3（MAGE3）、癌胚抗原（Carcinoma Embryonic Antigen，CEA）、波形蛋白（vimentin）、腫瘤-M2-PK、前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、黏蛋白（mucin）-1、T細胞識別黑素瘤抗原-1（melanoma antigen recognized by T cells-1，MART-1）及CA19-9）、疫苗（例：卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin）、癌症疫苗）、增加抗原傳遞的佐劑（例：顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子）、雙特異性抗體（例：CD3xCD20雙特異性抗體、PSMAxCD3雙特異性抗體）、細胞毒素、化學療法劑（例：達卡巴嗪、替莫唑胺、環磷醯胺、多西他賽（docetaxel）、阿黴素（doxorubicin）、道諾黴素（daunorubicin）、順鉑（cisplatin）、卡鉑（carboplatin）、吉西他濱（gemcitabine）、甲胺蝶呤（methotrexate）、米托蒽醌（mitoxantrone）、奧沙利鉑（oxaliplatin）、紫杉醇（paclitaxel）及長春新鹼（vincristine））、環磷醯胺、放射療法、IL-6R抑制劑（例：沙利路單抗（Sarilumab））、IL-4R抑制劑（例：度匹魯單抗（dupilumab））、IL-10抑制劑、細胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-21及IL-15、抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate，ADC）（例：ANTI-CD19-DM4 ADC及ANTI-DS6-DM4 ADC）、抗炎症藥物（例：皮質類固醇（corticosteroids）及非類固醇（steroid）抗炎症藥物）、膳食補充劑（例如抗氧化劑或用於治療癌症的任意緩和療護（palliative care））。

在特定態樣中，所述第二治療劑可為包括用於增加抗腫瘤反應的樹突狀細胞疫苗、溶瘤（oncolytic）病毒、腫瘤細胞疫苗等的癌症疫苗。癌症疫苗的例子可包括用於黑色素瘤及膀胱癌的MAGE3疫苗、用於乳腺癌的MUC1疫苗、用於腦癌（包括多形性膠質母細胞瘤）的EGFRv3（例：潤多佩皮穆特（rindopepimut））、或（用於CEA ⁺的）ALVAC-CEA。

用於進行診斷及檢測的方法、試劑盒本揭露內容在一方面提供包括選自由如下組成的群組的一種以上的疾病的治療用、診斷用或檢測用試劑盒：根據本揭露內容的任意PD-1蛋白質結合劑、ANTI-PD-1抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白重鏈可變區多肽、免疫球蛋白輕鏈可變區多肽、免疫球蛋白重鏈多肽、免疫球蛋白輕鏈多肽及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。

本揭露內容的ANTI-PD-1抗體可用於例如為了診斷目的在樣本中對PD-1進行檢測與/或測定。一部分態樣中，於對如癌症、自體免疫疾病或慢性病毒感染等疾病或障礙進行檢測的鑒定中，考慮使用本揭露內容的一種以上的抗體。針對PD-1的例示性的診斷鑒定可包括例如使自患者取得的樣本與本揭露內容的ANTI-PD-1抗體接觸，此處所述ANTI-PD-1抗體用作可檢測出的標記或標記為報告分子、或者選擇性地將PD-1自患者樣本單離的捕獲配位基。

作為代替方案，未標記的ANTI-PD-1抗體可與以自身可檢測的方式標記的二次抗體一同用作診斷用途。可檢測的標記或報告分子可為：放射線同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；如異硫氰酸螢光素或羅丹明（rhodamine）等螢光性或化學發光部分；或如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、山葵過氧化酶（Horseradish Peroxidase）或螢光素酶（luciferase）等酶。

作為可用於在樣本中對PD-1進行檢測或測定的具體例示性化驗，包括酶結合免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）、放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）及螢光活性化細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）。

可用於根據本揭露內容的PD-1診斷化驗的樣本包括可自患者取得的任意組織或流體樣本，此情形含有於正常或患病病症下可檢測的量的PD-1蛋白質或其片段。一般而言，對在自健康患者（例：沒有得癌症或自體免疫疾病的患者）取得的特定樣本中的PD-1水平進行測定，以在初期確立PD-1的基線或標準水平。之後，可將此種PD-1基線水平與在自懷疑具有與癌症相關的病情、或與此種病情相關的症狀的個體取得的樣本中測定的PD-1水平進行比較。

於PD-1中特異性的本揭露內容的多肽、PD-1偶聯物、抗體等可不含有額外的標記或部分，或者可含有N封端或C封端標記或部分。在一態樣中，所述標記或部分為生物素（biotin）。於結合鑒定中，標記（存在的情況）的位置可確定肽對結合肽的表面的配向。例如，於表面塗佈抗生物素蛋白的情況，含有N封端生物素的肽以所述肽的C封端部分在表面中位於遠側的方式配向。

本揭露內容的一方面是有關於作為用於預測患者中癌症或自身免疫障礙預後的標記的揭露的抗體的用途。根據本揭露內容的多肽、PD-1偶聯劑、抗體等可用於用以評估患者中癌症的預後並預測存活的診斷鑒定。

以下，將對根據發明的具體實例的抗體的生產方法更詳細地進行說明。但，此情形作為發明的一個例示而提出，對相關領域技術人員不言而喻的是並非藉此限定發明的權利範圍，且可在發明的權利範圍內對實例進行多種變形。

實施例 實施例 1 . 準備免疫原及確立細胞株 蛋白質抗原

利用聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）自包含人類PD-1的互補DNA（complementary DNA，cDNA）的pCMV3-C-FLAG載體（信諾（Sino））合成細胞外域（extracellular domain），並插入至pEM.CMV-SF-內部核糖體進入位點（Internal Ribosome Entry Site，IRES）-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）載體。使製作的載體在CHOS細胞株中形質感染，以EGFP表達為基準，藉由流式細胞分析技術（flow cytometry）挑選生成人類PD-1蛋白質細胞外域的細胞。於細胞培養液中使用標簽親和層析法（FLAG tag affinity chromatography）來對人類PD-1蛋白質進行純化並定量化。

細胞株抗原使包含人類PD-1的cDNA的pCMV3-C-FLAG載體（信諾）在源自BALB/c小鼠結腸癌的CT26細胞株中形質感染。藉由流式細胞分析技術挑選利用APC-cy7 ANTI-人類PD-1抗體來表達人類PD-1的細胞。於96孔板中進行有限稀釋以確保單選殖。

獲得對照組（可瑞達、歐狄沃）作為對照組抗體的可瑞達（人類IgG4（S228P）同型（isotype），型號（cat.No.）hpd1pe-mab14）購入在因威沃根（InvivoGen）製備的產品、或默沙東（MSD）的臨床用產品來使用。歐狄沃購入百時美施貴寶（BMS）的臨床用產品來使用。

確立細胞株使包含人類PD-1或小鼠PD-1的cDNA的pCMV3-C-FLAG載體（信諾）在CHOS細胞株中形質感染。藉由流式細胞分析技術挑選利用APC-cy7 ANTI-人類PD-1抗體或APC-cy7 ANTI-小鼠PD-1抗體來表達人類PD-1或小鼠PD-1的細胞。於96孔板中進行有限稀釋，以確保單選殖。

實施例 2 . 製作 PD-1 剔除小鼠PD-1剔除小鼠於小鼠（C57BL/6N）中利用規律間隔重複迴文序列簇/CRISPR相關蛋白系統（clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system，CRISPR-CAS）來製作。於小鼠PD-1基因序列製作特異性導引核糖核酸（guide ribonucleic acid，guide RNA），在確認是否可於試管內（in vitro）分解小鼠PD-1 DNA後，將導引RNA與Cas9蛋白質顯微注射（microinjection）至受精卵（zygote）。在注入導引RNA的受精卵中選擇存活的受精卵並移植至代母的輸卵管，移植後自出生兩周左右的小鼠身上剪下尾巴提取基因組DNA，利用PCR方法確認小鼠PD-1基因是否存在缺損。

實施例 3 . 生成抗體融合瘤 小鼠的免疫化對8周齡雌性PD-1剔除小鼠對人類PD-1抗原免疫化，以誘導抗體生成。作為用於免疫化的抗原，使用經純化的人類PD-1蛋白質抗原與來自CT26的人類PD-1細胞株抗原。

蛋白質抗原免疫化是將小鼠每50 μg抗原蛋白質與50 μg太特麥克斯（Titermax）黃金佐劑進行混合，對小鼠左側、右側等部位進行皮下（subcutaneous，s.c.）注射。細胞株抗原免疫化是在免疫化一日前對細胞株抗原實施X射線照射（irradiation）以抑制細胞生長（cell growth），並對每小鼠將1×10 ⁶細胞施用至腹膜內（intraperitoneal，i.p.）。免疫化以三周為間隔實施，於免疫化十日後在各小鼠個體中利用下頜下出血（submandibular bleeding）提取血液。藉由ELISA對利用自血液分離的血清（serum）生成的抗體的滴定量進行測定。

細胞融合及單選殖細胞（融合瘤）的生成自人類PD-1免疫化小鼠摘除脾臟並分離B淋巴細胞後，與培養的骨髓瘤細胞（sp2/0）進行融合。將融合的細胞於添加有次黃嘌呤（hypoxanthin）、胺基蝶呤、胸苷的培養基（HAT 培養基）中進行培養，選擇性地挑選骨髓瘤與B淋巴細胞融合的細胞（融合瘤）來培養。

於得到的融合瘤（hybridoma）細胞中執行基於蛋白質的ELISA分析以確認生產與人類PD-1抗原進行反應的抗體的融合瘤。使用有限稀釋法（limiting dilution method）將與人類PD-1抗原反應的融合瘤反覆進行選殖，從而生產生產對人類PD-1抗原反應的抗體的單選殖細胞（融合瘤）（1G1）。

實施例 4 . 針對融合瘤 1G1 的 PD-1 的結合（ binding ）測試為了確認於實施例3中製備的單選殖細胞（融合瘤）（1G1）與在細胞表面表達的結構性PD-1蛋白質的結合，執行基於細胞的ELISA與流式細胞分析技術分析。ANTI-hPD-1抗體對照組使用可瑞達（因威沃根（invivogen））。

對ELISA分析進行概括，於37℃下對塗佈有膠原蛋白（collagen）的96孔板（賽默飛世爾（ThermoFisher））徹夜塗佈10,000個表達人類PD-1或小鼠PD-1的CHO-S細胞。經塗佈的細胞於常溫下利用8%的聚甲醛（paraformaldehyde）固定15分鐘。於阻斷及洗滌後，添加至塗佈有可瑞達或融合瘤培養上清液的板，於常溫下孵化兩小時。於洗滌後添加二次抗體，於4℃下徹夜進行孵化。作為二次抗體，於可瑞達添加孔中使用小鼠抗人類IgG Fc HRP（金斯瑞（GenScript）），於融合瘤上清液添加孔中使用山羊抗鼠IgG Fc HRP（賽默飛世爾（ThermoFisher））。於洗滌後，添加四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）基質（艾博抗（abcam）），利用終止液（艾博抗）終止顯色反應。使用微盤讀取儀（microplate reader）（賽默飛世爾（ThermoFisher））確認於450/650 nm下的吸光度。

對流式細胞分析（Flow cytometry）進行概括，以1×10 ⁶細胞/孔的密度將表達人類PD-1或小鼠PD-1的CHO-S細胞裝載至96孔V型底板（康寧（Corning）），添加可瑞達或融合瘤培養上清液並於4℃下孵化一小時。於利用1XPBS/2%BSA洗滌後，添加二次抗體，於4℃下與細胞一同孵化一小時。二次抗體於可瑞達添加孔中使用PE抗人類IgG Fc（生物傳奇（Biolegend）），於融合瘤培養上清液添加孔中使用AF647山羊抗鼠IgG(H+L)（賽默飛世爾（ThermoFisher））。之後，於洗滌後，將細胞重懸於1XPBS/2%BSA，並利用流式細胞分析（貝迪（BD））及流動罩（FlowJo）軟體進行分析。

圖1是使用ELISA，實施針對實施例3中製備的融合瘤抗體1G1的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。圖2是使用流式細胞分析技術，實施針對實施例3中製備的融合瘤抗體的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。1G1抗體以高親和度結合至人類PD-1及小鼠PD-1。

另一方面，用作對照組的可瑞達（Keytruda）僅結合至細胞表面人類PD-1，反之，於實施例3中製備的1G1融合瘤抗體結合至細胞表面人類PD-1及小鼠PD-1二者，從而觀察到交叉反應性。

實施例 5 . 融合瘤 1G1 抗體的配位基阻斷（ blocking ）測試為了確認於實施例3中製備的單選殖細胞（融合瘤）1G1是否阻斷對細胞表面PD-1的PD-L1的結合，執行基於細胞的ELISA與流式細胞分析技術分析。ANTI-hPD-1抗體對照組使用可瑞達（因威沃根（invivogen））。

對ELISA分析進行概括，於37℃下對塗佈有膠原蛋白的96孔板徹夜塗佈10,000個表達人類PD-1或小鼠PD-1的CHO-S細胞。經塗佈的細胞於常溫下利用8%的聚甲醛（paraformaldehyde）固定15分鐘。於阻斷及洗滌後，於人類PD-1 CHO-S細胞塗佈孔中添加人類PD-L1美洲駝（lama）Fc蛋白質，於小鼠PD-1 CHO-S細胞塗佈孔中添加小鼠PD-L1人類Fc蛋白質，於常溫下孵化20分鐘。添加可瑞達或融合瘤培養上清液並於常溫下孵化一小時20分鐘。

於洗滌後添加二次抗體，於4℃下徹夜進行孵化。作為二次抗體，於人類PD-L1美洲駝Fc蛋白質添加孔中使用小鼠抗美洲駝IgG2/IgG3 HRP（抗體在線（antibody onlines）），於小鼠PD-L1人類Fc蛋白質添加孔中使用小鼠抗人類IgG Fc HRP（金斯瑞）。於洗滌後，添加TMB基質（艾博抗），利用終止液（艾博抗）終止顯色反應。使用微盤讀取儀（賽默飛世爾（ThermoFisher））確認於450/650 nm下的吸光度。

對流式細胞分析進行概括，以1×10 ⁶細胞/孔的密度將表達人類PD-1或小鼠PD-1的CHO-S細胞裝載至96孔V型底板（康寧（Corning）），添加PD-L1蛋白質與可瑞達或融合瘤培養上清液的混合液並於4℃下孵化一小時。於人類PD-1 CHO-S細胞裝載孔中添加人類PD-L1美洲駝Fc蛋白質與抗體混合液，於小鼠PD-1 CHO-S細胞裝載孔中添加小鼠PD-L1人類Fc蛋白質與抗體混合液。於利用1XPBS/2%BSA洗滌後，添加二次抗體，並於4℃下孵化一小時。

作為二次抗體，於人類PD-L1美洲駝Fc蛋白質與抗體混合液添加孔中使用螢光異硫氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate，FITC）山羊抗美洲駝IgG（艾博抗（abcam）），於小鼠PD-L1人Fc蛋白質與抗體混合液添加孔中使用PE抗人類IgG Fc（生物傳奇（Biolegend））。於洗滌後，將細胞重懸於1XPBS/2%BSA，並利用流式細胞分析（貝迪（BD））及流動罩（FlowJo）軟體進行分析。

圖3以曲線圖示出對於人類PD-L1或小鼠PD-L1分別對細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合，將使用ELISA實施於實施例3中製備的單選殖細胞（融合瘤）1G1抗體的阻斷測試的結果。

圖4以曲線圖示出對於人類PD-L1或小鼠PD-L1分別對細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合，將使用流式細胞分析技術實施於實施例3中製備的單選殖細胞（融合瘤）1G1抗體的阻斷測試的結果。

作為對照組的可瑞達（Keytruda）僅阻斷細胞表面人類PD-1與PD-L1的結合，反之，1G1融合瘤抗體阻斷人類PD-1/PD-L1及小鼠PD-1/PD-L1結合兩者。

實施例 6 . 針對純化的融合瘤 1G1 抗體的 PD-1 的結合測試（ ELISA ）為了於融合瘤中生產抗體，將融合瘤於包含3%低IgG胎牛血清（Foetal Bovine Serum，FBS）（吉比科（Gibco））的細胞培養基（DMEM）（海克隆（HyClone）、思拓凡（Cytiva））培養基中培養一周，進行離心分離後使用0.22 μm過濾器（密理博（Millipore））進行過濾，之後回收細胞培養液。

於融合瘤細胞培養液中利用親和層析法分離抗體蛋白質。將融合瘤細胞培養液裝載於包含蛋白質G珠（思拓凡）的層析柱（伯樂（Bio Rad）），利用IgG洗脫緩衝液（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））進行洗脫。藉由低pH的IgG洗脫緩衝液（pH2.5-3.0）將蛋白質受到的損傷最小化，於盛有1M三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCL）溶液（pH8.0）的試管中對抗體進行洗脫，使用pH酸鹼指示條來測定中和的蛋白質的pH。

純化的抗體使用米康（Amicon）100K離心過濾器（默克（Merck））進行濃縮，藉由考馬斯藍染色（coomassie blue staining）及BCA化驗（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））執行蛋白質確認及定量（圖5）。

為了確認純化的抗體1G1與於細胞表面表達的正常結構的PD-1蛋白質的結合親和度，執行基於細胞的ELISA。ANTI-hPD-1抗體對照組使用可瑞達（Keytruda，MSD）與歐狄沃（Opdivo，BMS）。

對ELISA分析進行概括，於37℃孵化器中對塗佈有膠原蛋白的96孔板（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））徹夜塗佈10,000個表達人類PD-1或小鼠PD-1的CHO-S細胞。經塗佈的細胞於常溫下利用8%的聚甲醛固定15分鐘。於阻斷及洗滌後，將可瑞達、歐狄沃、純化的融合瘤ANTI-PD-1抗體添加至塗佈的板，並於常溫下孵化兩小時。

於洗滌後添加二次抗體，於4℃下徹夜進行孵化。作為二次抗體，於可瑞達或歐狄沃添加孔中使用小鼠抗人類IgG Fc HRP（金斯瑞（GenScript）），於純化的融合瘤ANTI-PD-1抗體添加孔中使用山羊抗小鼠IgG Fc HRP（賽默飛世爾（ThermoFisher））。於洗滌後，添加TMB基質（艾博抗（abcam）），利用終止液（艾博抗（abcam））終止顯色反應。使用微盤讀取儀（賽默飛世爾（ThermoFisher））確認於450/650 nm下的吸光度。

圖6是使用ELISA，實施針對純化的融合瘤1G1抗體的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。根據該試驗結果，計算針對純化的小鼠1G1抗體及對照組（可瑞達、歐狄沃）的抗原的半效應濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

觀察到純化的融合瘤ANTI-PD-1抗體（1G1）與可瑞達（153.52 pM）及歐狄沃（157.27 pM）相比，提高約5倍對人類PD-1抗原的結合力（28.13 pM）。另外，確認了純化的融合瘤ANTI-PD-1抗體（1G1）對小鼠PD-1抗原亦顯示出與人類PD-1抗原相似的結合力（31.72 pM）。

	可瑞達	歐狄沃	純化融合瘤1G1
EC ₅₀：hPD-1（pM）	153.52	157.27	28.13
EC ₅₀：mPD-1（pM）	ND	ND	31.72

ND：未檢測到（Not Detected）

實施例 7 . 對人類免疫檢查點的交叉反應性為了確認於實施例3中製備的單選殖細胞（融合瘤）1G1是否與存在於人類T細胞表面的PD-1特異性結合，利用基於蛋白質的ELISA分析執行對其他免疫檢查點的交叉反應性試驗。ANTI-hPD-1抗體對照組使用可瑞達（因威沃根（Invivogen））。

於4℃下對96孔板（能肯（Nunc））徹夜塗佈人類PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS或BTLA蛋白質。於阻斷及洗滌後，將可瑞達或融合瘤培養上清液添加至塗佈的板，並於37℃下孵化一小時。於洗滌後添加二次抗體，於37℃下孵化兩小時。二次抗體於可瑞達添加孔中使用小鼠抗人類IgG Fc HRP（金斯瑞（Genscript）），於融合瘤培養上清液添加孔中使用山羊抗小鼠IgG Fc HRP（賽默飛世爾（ThermoFisher））。於洗滌後，添加TMB基質（艾博抗（abcam）），利用終止液（艾博抗（abcam））終止顯色反應。使用微盤讀取儀（賽默飛世爾（ThermoFisher））確認於450/650 nm下的吸光度。

圖7是利用ELISA對人類T細胞表面免疫檢查點是否結合進行試驗的結果。1G1融合瘤抗體與對照組（可瑞達）同樣地僅特異性結合至人類PD-1。

實施例 8 . 抗體融合瘤細胞排序（ sequencing ）於在實施例3中製備的1G1融合瘤細胞中利用特力早（trizol）試劑提取RNA。於RNA中使用逆轉錄酶合成cDNA，於合成的cDNA中如下般放大抗體的VH及VL序列。

用以放大序列的引物（primer）如下。 [表1]

		引物	序列（5'-＞ 3'）
VH	正向	MH1	AATTTGCTAGCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC（序列ID號33）
正向	MH2	AATTTGCTAGCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG（序列ID號34）
反向	IgG1	AATTTGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC（序列ID號35）
VL	正向	MK	AATTGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG（序列ID號36）
反向	CK	AATTTGCGGCCGCGGATACAGTTGGTGCAGCATC （序列ID號37）

PCR反應如下進行。 [表2]

反應系列（50 μl）	反應條件
cDNA	1 μl	95℃	5分鐘	1週期
10×Taq緩衝液	5 μl	95℃	1分鐘	30週期
dNTP（2.5 mM）	4 μl	45℃	1分鐘
正向引物（100 pmol/μl）	1 μl	72℃	1分鐘
反向引物（100 pmol/μl）	1 μl	72℃	5分鐘	1週期
Taq（5 U/μl）	0.25 μl
TDW	37.75 μl

利用pCMV3載體對得到的PCR產物（10 μL）進行結紮，利用使用T7（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）及pCMV3_F（5'-CGAGGAGGATTTGATATTCAC-3'）引物的序列分析確認融合瘤抗體的VH與VL序列。

經確認的VH與VL序列如下，於VH與VL二者中根據卡巴（Kabat）系統確認FR1-4及CDR1-3序列。 [表3]

重型（卡巴系統）
HFR1	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT （序列ID號17）
CDR-H1	GYWMH （序列ID號1）
HFR2	WVKQRPGQGLEWIG （序列ID號19）
CDR-H2	MIHPNSDTTTYNEKFKN （序列ID號3）
HFR3	RATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTG （序列ID號21）
CDR-H3	TDQAAWFAF （序列ID號5）
HFR4	WGQGTLVTVSA （序列ID號23）
卡帕（Kappa）（卡巴系統）
LFR1	DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISC （序列ID號25）
CDR-L1	RSSQNIVHSNGDTYLE （序列ID號7）
LFR2	WYLQKPGQSPKLLIY （序列ID號7）
CDR-L2	KVSKRFS （序列ID號9）
LFR3	GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC （序列ID號29）
CDR-L3	FQGSHVPWT （序列ID號11）
LFR4	FGGGTKLEIK （序列ID號31）

實施例 9 . 嵌合（ chimeric ）抗體的製作、表達及純化製作將於融合瘤中生產的小鼠ANTI-PD-1抗體的恆定區（constant region）替換為人類抗體的恆定區的嵌合抗體。利用重疊PCR連接訊號肽（signal peptide）與抗體的VH或VL序列，並利用表達人類IgG4恆定區（S228P）（序列號38～序列號41）的pTRIOZ-hIgG4載體（因威沃根（invivogen））使其結紮。將包括抗體的VH與VL序列的pTRIOZ-hIgG4載體導入至ExpiCHO ^TM表達系統（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））以表達抗體。於使pTRIOZ-hIgG4載體在ExpiCHO-S細胞轉染（transfection）後，在不包含FBS的ExpiCHO ^TM表達培養基中進行培養，並觀察細胞存活能力，對於轉染後在7-10日之間達到存活能力70%以上的細胞進行離心分離，之後利用0.22 μm過濾器（密理博（Millipore））進行過濾，並回收細胞培養液。將細胞培養液裝載至包含蛋白質A珠（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））的層析柱（伯樂（Bio Rad）），利用IgG洗脫緩衝液（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））進行洗脫。藉由低pH的IgG洗脫緩衝液（pH2.5-3.0）將蛋白質受到的損傷最小化，於盛有1M Tris-HCL溶液（pH8.0）的試管中對抗體進行洗脫，使用pH酸鹼指示條來測定中和的蛋白質的pH。純化的抗體使用米康50K離心過濾器（默克（Merck））進行濃縮，藉由考馬斯藍染色法及BCA化驗（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））執行蛋白質確認及定量。圖5是確認純化的小鼠1G1抗體（1G1親本）及嵌合1G1抗體（1G1嵌合體）的SDS-PAGE結果。

實施例 10 . 針對嵌合 1G1 抗體的 PD-1 的結合測試（ SPR ）藉由使用比亞科（Biacore）8K（思拓凡（Cytiva））的表面電漿共振（Surface Plasma Resonance，SPR）分析來測定實施例9中製備的嵌合1G1抗體對人類PD-1的結合動力學。藉由胺連接（偶聯）將ANTI-人類IgG抗體固定至CM5晶片（思拓凡（Cytiva））。使純化的抗體（可瑞達、歐狄沃、嵌合1G1抗體）流至感測器晶片上以被ANTI-人類IgG抗體捕獲。將人類PD-1及0-100 nM（0 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM）濃度的運行緩衝液（running buffer）以30 μl/分的流速、在締合（association）步驟的120秒期間流至感測器晶片，然後進行900秒的解離（dissociation）。晶片於各實驗後利用pH1.5的甘胺酸（glycine）重新生成。使用思拓凡評估軟體描繪締合及解離曲線，確定動力學及親和度值。

下表示出利用SPR分析針對試驗的嵌合1G1抗體對人類PD-1的結合親和性結果。

	可瑞達	歐狄沃	嵌合1G1
Kon（1/Ms）	4.96e ⁺⁵	2.04e ⁺⁵	2.23e ⁺⁵
Koff（1/s）	3.14e ^-3	2.14e ^-3	7.49e ^-4
KD（M）	6.33e ^-9	1.05e ^-8	3.35e ^-9

確認了與可瑞達（6.33e ^-9）及歐狄沃（1.05e ^-8）相比，嵌合ANTI-PD-1抗體（1G1）相對於人類PD-1具有約2倍至3倍優異的結合力（KD，3.35e ^-9）。該情形是因為雖然1G1嵌合ANTI-PD-1抗體在締合（Kon，2.23e ⁺⁵）方面與可瑞達（4.96e ⁺⁵）、歐狄沃（2.04e ⁺⁵）相似（0.9倍至2.2倍），但是在解離（Koff，7.49e ^-4）方面與可瑞達（3.14e ^-3）及歐狄沃（2.14e ^-3）相比具有2.9倍至4.2倍不解離的提高的結合特性。

實施例 11 . 1G1 抗體的抗原決定區映射（ mapping ）實施1G1嵌合（hIgG4(S228P)）抗體對人類PD-1抗原（序列號62）的抗原決定區映射（丙胺酸掃描），以確認所述抗體識別的人類PD-1抗原抗原決定區。使用PCR突變誘發，利用丙胺酸使PD-1的胺基酸殘基突變。表達突變的蛋白質，利用高通量流式細胞分析技術對與1G1嵌合抗體的結合進行分析。

因此，確定了胺基酸的突變對抗原的結合力與對野生型抗原的結合力相比下降至50%以下的三個抗原決定區（P130、L128及I126）。該些胺基酸為於小鼠PD-1中均亦得到保存的胺基酸，該情形支持了1G1抗體在人類PD-1與小鼠PD-1中具有交叉反應性的現象。

實施例 12 . 1G1 抗體的人源化（ humanization ）為了去除來自小鼠的1G1抗體的免疫原性，確保在人類體內安全的抗體效能，使用回復突變庫（back mutation library）方法來進行1G1抗體的人源化。製作由人類抗體序列取代除抗體的互補性決定區（CDR）序列之外的架構（FR）序列的三種1G1人源化抗體（人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70），並利用蛋白質A親和度層析法進行純化。

藉由使用比亞科（Biacore）8K（思拓凡（Cytiva））的表面電漿共振（Surface Plasma Resonance，SPR）分析實施針對得到的三種1G1人源化抗體（人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70）的人類PD-1抗原的結合親和性。確認了得到的三種人源化1G1抗體表現出與全部1G1嵌合抗體相似水平的抗原結合力。

對得到的三種人源化1G1抗體各自的序列進行分析，並示出於圖8至圖11。具體而言，人源化抗體1G1-h61的重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）分別具有序列號54及55的胺基酸序列。人源化抗體1G1-h68的重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）分別具有序列號56及57的胺基酸序列。人源化抗體1G1-h70的重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）分別具有序列號58及59的胺基酸序列。

實施例 13 . 人源化 1G1 抗體對 PD-1 抗原的結合動力學（ kinetics ）的比較評估藉由使用比亞科（Biacore）8K（思拓凡（Cytiva））的表面電漿共振（SPR）分析測定各抗體對人類PD-1的結合動力學，並比較抗體間對抗原的結合力。

作為ANTI-人類PD-1抗體對照組的可瑞達（Keytruda，MSD（Lot #T020031））與歐狄沃（Opdivo，BMS（Lot #043 FB））作為人體用藥品自信元（Shinwon）藥業購買。使對照組抗體（可瑞達、歐狄沃）與1G1抗體（嵌合抗體1G1嵌合體、人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70）流至蛋白質A晶片（思拓凡（Cytiva））上以捕獲。將七個濃度（0-100M）的人類PD-1以30 μl/分的流速在締合（association）步驟的120秒期間流至感測器晶片，然後進行1800秒的解離（dissociation）。晶片於各實驗後利用pH1.5的甘胺酸重新生成。使用思拓凡評估軟體描繪締合及解離曲線，測定動力學及親和度值。使用格拉夫派得普銳斯（GraphPad Prism）程式的帶有圖基檢驗（Tukey test）的單向方差分析來判斷抗體間動力學及親和度值之間的顯著性（****， P˂0.0001）。

圖12a及圖12b藉由Kon（ka值）、Koff值（kd）、KD值示出對人類PD-1的結合動力學及親和度。總而言之，確認了人源化ANTI-PD-1抗體（1G1）相對於人類PD-1平均具有與可瑞達（7.06e ^-9）及歐狄沃（7.54e ^-9）相似水平的結合力（KD，7.26e ^-9）。該情形是由於1G1人源化ANTI-PD-1抗體在締合（Kon，5.45e ⁺⁴）方面相較於可瑞達（4.18e ⁺⁵）與歐狄沃（1.41e ⁺⁵）2.6倍至7.7倍緩慢結合，但在解離（Koff，3.87e ^-4）方面相較於可瑞達（2.95e ^-3）及歐狄沃（1.06 ^-3）具有2.7倍至7.6倍不解離的提高的結合特性。當考慮ANTI-PD-1抗體的作用機制時，1G1人源化ANTI-PD-1抗體因不解離的結合特性而表現出提高的抗癌活性。

實施例 14 . 針對 PD-1 抗原的交叉反應性比較評估為了確認抗體對PD-1抗原的交叉反應性，執行基於蛋白質的ELISA。對ELISA分析進行概括，於4℃下對96孔板（賽默飛世爾科技（Thermo scientific））徹夜塗佈10 ng人類、小鼠、兔子、獼猴、大鼠的細胞外域（ECD）PD-1蛋白質。於阻斷及洗滌後，將1 μg/ml對照組抗體（可瑞達、歐狄沃）與1G1抗體（嵌合抗體、人源化抗體）添加至塗佈的板，並於37℃下孵化兩小時。於洗滌後添加二次抗體（ANTI-人類IgG抗體），於37℃下孵化兩小時。於洗滌後，添加TMB基質（艾博抗（abcam）），利用終止液（艾博抗（abcam））終止顯色反應。使用微盤讀取儀（賽默飛世爾（ThermoFisher））確認於450/650 nm下的吸光度。

圖13示出抗體對PD-1抗原的交叉反應性測定結果。可瑞達、歐狄沃、1G1抗體均對人類PD-1及獼猴PD-1抗原具有交叉反應性。確認了1G1抗體額外地對小鼠PD-1表現出交叉反應性。

實施例 15 . 體內 抗癌效能評估如圖14，進行使用小鼠黑色素瘤模型的1G1抗體的抗癌效能評估實驗。培養小鼠黑色素瘤細胞（B16F11/OT.EGFP），將3×10 ⁶個細胞移植至8周齡C57BL/6雌性小鼠右側等皮下。於移植腫瘤細胞6日後測定癌症結節的大小並分成5組，之後自移植第七日以三日為間隔腹腔施用5次1G1親本抗體，以三日為間隔測定腫瘤大小。腫瘤大小利用以下數式來計算。 L×W ²/2 （L：長軸長度，W：短軸長度）存活率記錄至腫瘤的體積超過1000 mm ³或發生腫瘤潰瘍、小鼠死亡的一天。使用格拉夫派得普銳斯（GraphPad Prism）程式的帶有多重測試的雙向方差分析來判斷腫瘤生長抑制率之間的顯著性，使用對數軼（Log-rank）（曼泰爾-考克斯（Mantel-Cox））測試判斷存活率值之間的顯著性（*， P˂0.05；***， P˂0.001，存活率分析終點：700 mm ³）。

圖15示出根據時間的腫瘤生長及根據1G1親本抗體施用濃度的腫瘤生長抑制。1G1 1 mg/kg施藥組表現出與同型對照組相似的腫瘤生長，但在1G1 2.5 mg/kg～10 mg/kg施藥組中，在19日表現出約90%～100%的腫瘤生長抑制率，在22日表現出94%～112%的腫瘤生長抑制率，在25日表現出86%～94%的腫瘤生長抑制率（圖15；22天），且觀察到約20%的存活率增加（圖16）。基於此結果，確認了1G1親本抗體表現出優異的抗癌效果。

實施例 16 . 在大腸癌實驗模型中的體內抗癌效能評估對MC38大腸癌同源模型中1G1抗體的抗癌效能進行評估。對7周齡至8周齡的C57BL/6雌性小鼠的左側肋下皮下注入5×10 ⁵個MC38小鼠大腸癌細胞。於注入後，當平均腫瘤大小達到50 mm ³至150 mm ³時，根據腫瘤體積分成4組（各自n=13），將人類hIgG4、大鼠rIgG2a、1G1-h70抗體及RMP1-14（小鼠PD-1）抗體分別以10 mg/kg施用，間隔3天，共5次。每週三次對各組測定動物的體重與腫瘤的大小並進行評估。最終體重與最終腫瘤的大小測定至研究達到終點的一天。終點由對照組的平均腫瘤大小達到1500 mm ³時確定。腫瘤生長抑制率（%TGI）使用初期（i）及最終（f）腫瘤測定值，針對處理組（T）對對照組（C）使用以下方程式來測定。 %TGI = 1 – (Tf – Ti)/(Cf – Ci)*100 將根據各組的時間的相對腫瘤大小變化與腫瘤生長抑制率示於圖17。1G1-h70抗體與作為小鼠PD-1抗體的RMP1-14抗體相比明顯表現出優異的腫瘤生長抑制。眾所周知，MC38大腸癌同源模型對ANTI-PD-1療法反應不佳。因此，1G1-h70抗體帶來的優異的腫瘤生長抑制效果是意料之外的。另一方面，對由各組的處理帶來的小鼠的體重在統計上不存在有意義的變化（資料未示出）。

實施例 17 . 利用結晶學的 1G1 抗體的抗原決定區映射實施1G1-h70人源化抗體對人類PD-1抗原（序列號62）的抗原決定區映射（X射線結晶學方法）以確認所述抗體識別的人類PD-1抗原的抗原決定區。於20℃下使用結晶化溶液，利用懸滴氣相擴散法（滴體積=蛋白質0.8 μl+容器0.8 μl，容器容積400 μl）將1G1-h70抗體的Fab與PD-1的結合複合體結晶化。對生成的單晶執行X射線衍射實驗以獲得2.30 Å解析度的資料。下述表4整理了針對X射線衍射資料收集及結構精修的資訊。 [表4]

資料收集與精修統計
資料收集
X射線來源	PLS 5C
空間組	P22 ₁2 ₁
細胞尺寸
a、b、c（Å）	70.580,78.490,4.220
解析度（Å）	2.30（2.37-2.30）
R _sym（%）	8.2（65.5）
I/ I	14.8（3.6）
完整性（%）	99.9（99.9）
冗餘	6.7
精修
解析度（Å）	2.30
反射編號	28744
R _work/ R _free（%）	19.4/23.9
原子編號
蛋白質	4069
水	95
平均B因子（Å ²）	58.2
均方根偏差
鍵長（Å）	0.008
鍵角（°）	0.993
拉瑪錢德朗
有利的（%）	98.64
容許的（%）	1.36
異常值（%）	0
*括號中的值用於外部解析度外殼。

於1G1-h70 Fab與PD-1的相互作用中，確認1G1-h70抗體與PD-1蛋白質抗原（序列62）上的N66、Y68、K78、A129、P130及A132殘基形成氫鍵。該等中，Y68、K78、N66側鏈參與氫鍵。另外，觀察到於1G1-h70 Fab與PD-1的相互作用中，1G1-h70抗體與PD-1蛋白質抗原（序列62）上的I126、L128、A129、P130及A132殘基形成疏水鍵。如藉由所述實施例11的丙胺酸掃描實驗亦確認所示般，發現對與1G1抗體的結合起到最重要的作用的三種胺基酸殘基（P130、L128、I126）位於PD-1的FG環區，由其等帶來的疏水性相互作用發揮協同作用以對結合親和度做出大的貢獻。

眾所周知，實際PD-1分子的環區非常靈活，根據結合的配偶體採用適於結合的構造。圖18顯示出於PD-1內對與1G1抗體的結合起到重要作用的FG環、對與可瑞達的結合重要的C'D環、對與歐狄沃的結合重要的N-封端區的結構性差異。此種結構變化的差異將對與PD-1相互作用組的結合狀態帶來差異，且根據各抗體的抗癌免疫狀態可不同。

實施例 18 . 根據 1G1 抗體的 pH 的結合力眾所周知，血液（pH7.4）與腫瘤微環境（tumor microenvironment）（pH5.0～7.0）存在pH差異。因此，根據抗體結合力是否存在pH依賴性對免疫抗癌抗體的治療效能可能帶來影響。通常對由pH差異帶來的結合力最敏感的殘基為組胺酸（histidine），但於作為先前PD-1抗體的可瑞達（Keytruda）與歐狄沃（Opdivo）的情況，在參與結合的殘基中不存在組胺酸。與之相反，由於1G1抗體於CDR區域（卡巴系統）中如重鏈CDR2的H52殘基般具有與PD-1蛋白質抗原參與氫鍵或疏水鍵的組胺酸殘基，因此預計即便於具有低pH的腫瘤微環境中亦對與PD-1的結合做出貢獻。因此，與可瑞達、歐狄沃一同調查1G1-h70抗體的PD-1結合力是否存在pH依賴性。

藉由使用比亞科（Biacore）8K（思拓凡（Cytiva））的表面電漿共振（SPR）分析測定各抗體對人類PD-1的結合動力學，並比較抗體間對抗原的結合力。作為ANTI-PD-1抗體對照組的可瑞達（Keytruda，MSD（Lot #T020031））與歐狄沃（Opdivo，BMS（Lot #043 FB））作為人體用藥品自信元（Shinwon）藥業購買。另外，根據基石藥業（CStone Pharmaceuticals）的自WO 2018/053709的2E5選殖製作2E5抗體。2E5抗體均可結合至人類PD-1及小鼠PD-1，其抗原決定區分析結果揭露為位於PD-1的FG環上。

使對照組抗體（可瑞達、歐狄沃）與2E5抗體及1G1抗體（1G1-h70）流至蛋白質A晶片（思拓凡（Cytiva））上並將其捕獲。將七個濃度（0-100M）的人類PD-1以30 μl/分的流速在締合（association）步驟的120秒期間流至感測器晶片，然後進行1800秒的解離（dissociation）。捕獲、締合（association）、解離（dissociation）於pH6.0的HBS-EP+緩衝液中進行。晶片於各自的實驗後利用pH1.5的甘胺酸重新生成。使用思拓凡評估軟體描繪締合及解離曲線，並測定動力學及親和度值。使用格拉夫派得普銳斯（GraphPad Prism）程式的帶有圖基檢驗的單向方差分析來判斷抗體間動力學及親和度值之間的顯著性（****， P˂0.0001）。

圖19a及圖19b藉由Kon（ka值）、Koff值（kd）、KD值示出對人類PD-1的結合動力學及親和度。於pH7.4（血液）中，1G1-h70抗體（KD=5.4 nM）對於人類PD-1表現出與可瑞達（KD=6.6 nM）、歐狄沃（KD=7.1 nM）及2E5抗體（KD=12.6 nM）匹敵的相似水平的結合力。然而，於pH6.0（腫瘤微環境）中，確認了1G1-h70抗體（KD=0.9 nM）與可瑞達（KD=4.2 nM）、歐狄沃（KD=3.1 nM）及2E5抗體（KD=4.5 nM）相比，對於人類PD-1表現出強得多的結合親和度。該情形是由於1G1-h70抗體即便在pH6.0下亦具有在解離（Koff）方面與可瑞達、歐狄沃及2E5相比不解離的提高的結合特性。在針對包括免疫抗癌抗體的抗癌藥物的腫瘤的抗癌效能在因腫瘤微環境的低pH而受到影響方面，即便於腫瘤微環境的低pH下亦表現出強的人類PD-1結合力的1G1-h70抗體成為活體內腫瘤微環境中表現出顯著優異的抗癌活性的根據。

實施例 19 . 親和度成熟（ Affinity Maturation ）為了增加1G1-h70抗體對人類PD-1的親和度，進行親和度成熟化。使用對大腸桿菌（ Escherichia Coli ， E. coli）的最佳密碼子，利用其他19個胺基酸使1G1-h70抗體的CDR區的各胺基酸殘基突變。於微陣列（microarray）上合成DNA寡核苷酸庫（oligonucleotide library），選擇選殖以在大腸桿菌中表達。

藉由ELISA針對BSA及人類PD-1蛋白質分析培養基所分泌的粗蛋白，並分析表達及結合親和力。選擇具有提高的值的選殖並分析序列。根據SPR的親和度順序確認「有益突變（beneficial mutant）」。於比亞科（Biacore）T200上執行解離速度（解離率（off-rate））篩選。運行緩衝液為HBS-EP（10 mM HEPES、500 mM NaCl、3mM乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）、0.05% 吐溫（Tween）20，pH7.4）。培養基所分泌的所選選殖的Fab-SASA被SASA捕獲生物感測器捕獲。於平衡後，在120秒（締合階段）期間注入抗原，之後在420秒（解離階段）期間注入運行緩衝液。於注入其他選擇的選殖之前重新生成表面，反覆進行該製程直至分析所有的樣本為止。Fab-SASA選殖的解離速度藉由使用比亞科（Biacore）T200評估軟體將實驗資料整合至本地1:1交互模型來獲得。所選擇的突變按照其等的解離常數（off-rates，kd）排序。

若確認「有益突變」，則藉由PCR構成由該些突變的隨機組合形成的組合庫（combinational library）。利用ELISA分析組合選殖並執行DNA序列分析與親和度順序指定作業。最終選定表達不會下降且帶來最高的親和度增加的「有益突變」的上等組合以測定抗體親和度。

於親和度成熟後，得到共13個人源化PD-1抗體（AHF16556、AHF16557、AHF16558、AHF16559、AHF16560、AHF16561、AHF16563、AHF16564、AHF16565、AHF16566、AHF16568、AHF16569及AHF16570）。該些抗體與1G1-h70親本抗體（野生型（wild type，WT））相比，於三個CDR區（VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1）中具有如下述表6般的胺基酸取代。 [表5]

編號	序列ID	VH	VL
59	62	102	105	106	31
WT	T	E	A	F	A	H
1	AHF16556	V	W	E	A	.	R
2	AHF16557	V	W	.	A	G	.
3	AHF16558	.	.	E	H	.	R
4	AHF16559	V	.	.	H	.	.
5	AHF16560	I	.	E	H	G	R
6	AHF16561	I	.	.	A	G	R
7	AHF16563	V	W	E	M	G	.
8	AHF16564	.	.	E	A	G	R
9	AHF16565	V	W	E	H	G	R
10	AHF16566	V	W	.	A	.	.
11	AHF16568	I	W	E	M	G	R
12	AHF16569	I	W	E	A	.	R
13	AHF16570	I	W	.	A	G	R

該些抗體對人類PD-1的結合動力學資料示於下述表6。

[表6]

編號	配位基	Ka（1/Ms）	Kd（1/s）	KD（M）	比率（kd）	比率（kD）
1	AHF16556	1.48E+05	6.31E-05	4.27E-10	6.45	5.27
2	AHF16557	2.04E+05	8.68E-05	4.25E-10	4.69	5.29
3	AHF16558	2.48E+05	7.69E-05	3.10E-10	5.29	7.26
4	AHF16559	2.06E+05	7.62E-05	3.71E-10	5.34	6.06
5	AHF16560	2.04E+05	6.74E-05	3.31E-10	6.04	6.80
6	AHF16561	1.83E+05	5.53E-05	3.02E-10	7.36	7.45
7	AHF16563	2.18E+05	3.60E-05	1.65E-10	11.31	13.64
8	AHF16564	2.30E+05	3.68E-05	1.60E-10	11.06	14.06
9	AHF16565	1.30E+05	1.18E-04	9.13E-10	3.45	2.46
10	AHF16566	2.15E+05	7.53E-05	3.49E-10	5.41	6.45
11	AHF16568	1.46E+05	3.52E-05	2.41E-10	11.56	9.34
12	AHF16569	1.99E+05	6.74E-05	3.39E-10	6.04	6.64
13	AHF16570	1.64E+05	3.29E-05	2.00E-10	12.37	11.25
	U299-WT1	1.74E+05	4.02E-04	2.32E-09
	U299-WT2	1.90E+05	4.12E-04	2.17E-09

序列列表 [表7]

序列 ID 編號		序列
1	HCDR1胺基酸	GYWMH
2	HCDR1核苷酸	GGCTACTGGATGCAC
3	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTTYNEKFKN
4	HCDR2核苷酸	ATGATTCATCCTAACAGTGATACTACTACCTACAATGAGAAGTTCAAAAAC
5	HCDR3胺基酸	TDQAAWFAF
6	HCDR3核苷酸	ACAGATCAGGCCGCCTGGTTTGCTTTC
7	LCDR1胺基酸	RSSQNIVHSNGDTYLE
8	LCDR1核苷酸	agatctagtcagaacattgtacatagtaatggagacacctatttagaa
9	LCDR2胺基酸	KVSKRFS
10	LCDR2核苷酸	aaagtttccaagcgattttct
11	LCDR3胺基酸	FQGSHVPWT
12	LCDR3核苷酸	tttcaaggttcacatgttccgtggacg
13	HCVR胺基酸	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMH WVKQRPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTGTDQAAWFAFWGQGTLVTVSA
14	HCVR核苷酸	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTTAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACCGGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAATGATTCATCCTAACAGTGATACTACTACCTACAATGAGAAGTTCAAAAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCGGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAGGGACAGATCAGGCCGCCTGGTTTGCTTTC TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
15	LCVR胺基酸	DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
16	LCVR核苷酸	GATATTGTGCTGACACAAACTCCActctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaacattgtacatagtaatggagacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaagcgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
17	HFR1胺基酸	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
18	HFR1核苷酸	GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTTAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACC
19	HFR2胺基酸	WVKQRPGQGLEWIG
20	HFR2核苷酸	TGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGA
21	HFR3胺基酸	RATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTG
22	HFR3核苷酸	AGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCGGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAGGG
23	HFR4胺基酸	WGQGTLVTVSA
24	HFR4核苷酸	TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
25	LFR1胺基酸	DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISC
26	LFR1核苷酸	GATATTGTGCTGACACAAACTCCActctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgc
27	LFR2胺基酸	WYLQKPGQSPKLLIY
28	LFR2核苷酸	tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac
29	LFR3胺基酸	GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
30	LFR3核苷酸	ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgc
31	LFR4胺基酸	FGGGTKLEIK
32	LFR4核苷酸	ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
33	MH1引物	AATTTGCTAGCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC
34	MH2引物	AATTTGCTAGCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
35	IgG1引物	AATTTGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC
36	MK引物	AATTGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG
37	CK引物	AATTTGCGGCCGCGGATACAGTTGGTGCAGCATC
38	人類IgG4(S228P)恆定區，重鏈核苷酸	GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
39	人類IgG4(S228P)恆定區，重鏈胺基酸	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
40	人類IgG4(S228P)恆定區，k鏈核苷酸	CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
41	人類IgG4(S228P)恆定區，k鏈胺基酸	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
42	人源化抗體，1G1-h61重鏈核苷酸	CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACAGGCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCATGATCCACCCCAACAGCGACACCACAACCTACAACGAGAAGTTCAAGAATAGAGTGACCATGACAAGAGATACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGCGGTCCGATGACACAGCTGTGTACTATTGTGCCGGCACCGACCAGGCCGCTTGGTTCGCCTTCTGGGGGCAGGGCACCACAGTCACCGTGAGCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACATATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCAAGCAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTAGCTGTCCTGCTCCAGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCTCTAGAACACCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTTAACTCTACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCTATCGAGAAGACAATCTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCAAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAAAGTCTGTCACTGTCACTGGGAAAGTGATAA
43	人源化抗體，1G1-h61重鏈胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWMGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
44	人源化抗體，1G1-h68重鏈核苷酸	CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACAGGCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCATGATCCACCCCAACAGCGACACCACAACCTACAACGAGAAGTTCAAGAATAGAGTGACCATGACAAGAGATACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGCGGTCCGATGACACAGCTGTGTACTATTGTACCGGCACCGACCAGGCCGCTTGGTTCGCCTTCTGGGGGCAGGGCACCACAGTCACCGTGAGCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACATATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCAAGCAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTAGCTGTCCTGCTCCAGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCTCTAGAACACCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTTAACTCTACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCTATCGAGAAGACAATCTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCAAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAAAGTCTGTCACTGTCACTGGGAAAGTGATAA
45	人源化抗體，1G1-h68重鏈胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
46	人源化抗體，1G1-h70重鏈核苷酸	CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACAGGCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCATGATCCACCCCAACAGCGACACCACAACCTACAACGAGAAGTTCAAGAATAGAGTGACCATGACAAGAGATACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGCGGTCCGATGACACAGCTGTGTACTATTGTGCCGGCACCGACCAGGCCGCTTGGTTCGCCTTCTGGGGGCAGGGCACCACAGTCACCGTGAGCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACATATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCAAGCAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTAGCTGTCCTGCTCCAGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCTCTAGAACACCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTTAACTCTACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCTATCGAGAAGACAATCTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCAAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAAAGTCTGTCACTGTCACTGGGAAAGTGATAA
47	人源化抗體，1G1-h70重鏈胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
48	人源化抗體，1G1-h61輕鏈核苷酸	GATATCGTTATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGACCCCAGGCCAACCTGCCTCTATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAACATCGTGCACAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAACCTGGACAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAAGCGGTTTTCCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTGCCCTGGACATTCGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGATAA
49	人源化抗體，1G1-h61輕鏈胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
50	人源化抗體，1G1-h68輕鏈核苷酸	GATATCGTTATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGACCCCAGGCCAACCTGCCTCTATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAACATCGTGCACAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAACCTGGACAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAAGCGGTTTTCCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTGCCCTGGACATTCGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGATAA
51	人源化抗體，1G1-h68輕鏈胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
52	人源化抗體，1G1-h70輕鏈核苷酸	GATATCGTTATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGACCCCAGGCCAACCTGCCTCTATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAACATCGTGCACAGCCAGGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAACCTGGACAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAAGCGGTTTTCCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTGCCCTGGACATTCGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGATAA
53	人源化抗體，1G1-h70輕鏈胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
54	人源化抗體，1G1-h61 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWMGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
55	人源化抗體，1G1-h61 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
56	人源化抗體，1G1-h68 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
57	人源化抗體，1G1-h68 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
58	人源化抗體，1G1-h70 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
59	人源化抗體，1G1-h70 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
60	LCDR1胺基酸	RSSQNIVHSQGDTYLE
61	LCDR1核苷酸	agaagcagccagaacatcgtgcacagccagggcgacacctacctggaa
62	人類PD-1蛋白質, 全胺基酸	MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGW FLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL 斜體部分表示訊號序列。字下線部分表示ECD（細胞外域）部分。
63	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTVYNEKFKN
64	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTIYNEKFKN
65	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTTYNWKFKN
66	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTVYNWKFKN
67	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTIYNWKFKN
68	HCDR3胺基酸	TDQEAWFAF
69	HCDR3胺基酸	TDQAAWAAF
70	HCDR3胺基酸	TDQAAWMAF
71	HCDR3胺基酸	TDQAAWHAF
72	HCDR3胺基酸	TDQAAWFGF
73	HCDR3胺基酸	TDQEAWAAF
74	HCDR3胺基酸	TDQEAWMAF
75	HCDR3胺基酸	TDQEAWHAF
76	HCDR3胺基酸	TDQEAWFGF
77	HCDR3胺基酸	TDQAAWAGF
78	HCDR3胺基酸	TDQAAWMGF
79	HCDR3胺基酸	TDQAAWHGF
80	HCDR3胺基酸	TDQEAWAGF
81	HCDR3胺基酸	TDQEAWMGF
82	HCDR3胺基酸	TDQEAWHGF
83	LCDR1胺基酸	RSSQNIVRSNGDTYLE
84	LCDR1胺基酸	RSSQNIVRSQGDTYLE

以上，對本揭露內容進行了說明，但是本揭露內容不藉由所揭露的實施例及附圖進行限定，且可在不脫離本揭露內容的技術思想的範圍內由通常的技術人員進行各種變形。另外，於本揭露內容的實施例中說明的技術思想可分別單獨實施，亦可兩個以上彼此組合實施。

無

圖1是使用酶結合免疫吸附測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），實施對根據本揭露內容的融合瘤1G1抗體的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。圖2是使用流式細胞分析技術（flow cytometry）實施對根據本揭露內容的融合瘤1G1抗體的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。圖3以曲線圖示出對於人類PD-L1或小鼠PD-L1分別對細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合，使用ELISA實施本揭露內容的融合瘤1G1抗體的阻斷（blocking）測試的結果。圖4以曲線圖示出對於人類PD-L1或小鼠PD-L1分別對細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合，使用流式細胞分析技術實施本揭露內容的融合瘤1G1抗體的阻斷測試的結果。圖5是確認純化的融合瘤1G1抗體及嵌合1G1抗體（1G1嵌合體（1G1 chimeric））的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結果。圖6是使用ELISA實施對純化的融合瘤1G1抗體的細胞表面人類PD-1或小鼠PD-1的結合測試的結果的曲線圖。圖7是利用ELISA對本揭露內容的單選殖細胞（融合瘤）1G1抗體是否與人類T細胞表面免疫檢查點選擇性結合進行試驗的結果。圖8示出三種人源化1G1抗體（人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70）各自的重鏈胺基酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL的形態表示。圖9示出三種人源化1G1抗體（人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70）各自的輕鏈胺基酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL的形態表示。圖10a示出人源化抗體1G1-h61的重鏈核酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL- 終止密碼子（斜體）的形態表示。圖10b示出人源化抗體1G1-h68的重鏈核酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL- 終止密碼子（斜體）的形態表示。圖10c示出人源化抗體1G1-h70的重鏈核酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL- 終止密碼子（斜體）的形態表示。圖11示出三種人源化1G1抗體（人源化抗體1G1-h61、1G1-h68、1G1-h70）各自的輕鏈核酸序列。所述序列由前導序列（leader sequence）- VH/VL （粗體及字下線表示） -hIgG4CH/hIgkappaCL- 終止密碼子（斜體）的形態表示。圖12a示出根據本揭露內容的人源化1G1抗體對人類PD-1的結合動力學。圖12b藉由ka（結合常數）值（結合速率常數（Kon））、kd（解離常數）值（解離速率常數（Koff））、平衡解離常數（KD）值示出根據本揭露內容的人源化1G1抗體對人類PD-1的親和度。圖13是使用ELISA對根據本揭露內容的1G1抗體（嵌合1G1抗體、人源化1G1抗體）是否與人類、小鼠、兔子、獼猴（cynomolgus）及大鼠各自的細胞外域PD-1抗原選擇性結合（交叉反應（cross-reactivity））進行試驗的結果的曲線圖。圖14示出用於確認1G1抗體的抗癌效果的動物實驗日程。圖15是示出在小鼠黑色素瘤模型中由施用1G1抗體帶來的根據時間的腫瘤大小變化的曲線圖。圖16是示出在小鼠黑色素瘤模型中由施用1G1抗體帶來的根據時間的存活率的曲線圖。圖17示出在MC38大腸癌同源的小鼠模型中由施用1G1抗體帶來的根據時間的腫瘤相對大小變化與腫瘤生長抑制率。圖18示出人源化1G1抗體、可瑞達（Keytruda）及歐狄沃（Opdivo）對人類PD-1的結合區。圖19a示出根據本揭露內容的人源化1G1抗體在pH 6.0下對人類PD-1的結合動力學。圖19b藉由ka值（Kon）、kd值（Koff）、KD值示出根據本揭露內容的人源化1G1抗體在pH 6.0下對人類PD-1的親和度。

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            1               5                  10                  15 
          Asn
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          agatctagtc agaacattgt acatagtaat ggagacacct atttagaa                      48
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          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Thr Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Leu Val Thr Val Ser Ala
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          gaggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggttaagc ctggggcttc agtgaagctg         60
          tcctgcaagg cttctggcta cactttcacc ggctactgga tgcactgggt gaagcagagg        120
          cctggacaag gccttgagtg gattggaatg attcatccta acagtgatac tactacctac        180
          aatgagaagt tcaaaaacag ggccacactg actgtagaca aatcctccgg cacagcctac        240
          atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac agggacagat        300
          caggccgcct ggtttgcttt ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca              354
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                       20                  25                  30 
          Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
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               50                  55                  60 
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          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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          tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caagcgattt        180
          tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc        240
          agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg        300
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          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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          gaggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggttaagc ctggggcttc agtgaagctg         60
          tcctgcaagg cttctggcta cactttcacc                                          90
          <![CDATA[<210>    19]]>
          <![CDATA[<211>    14]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    19]]>
          Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
            1               5                  10                
          <![CDATA[<210>    20]]>
          <![CDATA[<211>    42]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR2核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    20]]>
          tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gagtggattg ga                            42
          <![CDATA[<210>    21]]>
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          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    21]]>
          Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr Met Gln
            1               5                  10                  15 
          Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly
                       20                  25                  30 
          <![CDATA[<210>    22]]>
          <![CDATA[<211>    96]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR3核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    22]]>
          agggccacac tgactgtaga caaatcctcc ggcacagcct acatgcaact cagcagcctg         60
          acatctgagg actctgcggt ctattactgt acaggg                                   96
          <![CDATA[<210>    23]]>
          <![CDATA[<211>    11]]>
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          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR4 aa]]>
          <![CDATA[<400>    23]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
            1               5                  10    
          <![CDATA[<210>    24]]>
          <![CDATA[<211>    33]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HFR4核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    24]]>
          tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca                                      33
          <![CDATA[<210>    25]]>
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          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR1 aa]]>
          <![CDATA[<400>    25]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
            1               5                  10                  15 
          Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
                       20            
          <![CDATA[<210>    26]]>
          <![CDATA[<211>    69]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR1核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    26]]>
          gatattgtgc tgacacaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc         60
          atctcttgc                                                                 69
          <![CDATA[<210>    27]]>
          <![CDATA[<211>    15]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    27]]>
          Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
            1               5                  10                  15
          <![CDATA[<210>    28]]>
          <![CDATA[<211>    45]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR2核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    28]]>
          tggtacctgc agaaaccagg ccagtctcca aagctcctga tctac                         45
          <![CDATA[<210>    29]]>
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          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    29]]>
          Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
            1               5                  10                  15 
          Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
                       20                  25                  30 
          <![CDATA[<210>    30]]>
          <![CDATA[<211>    96]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR3核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    30]]>
          ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc         60
          agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgc                                   96
          <![CDATA[<210>    31]]>
          <![CDATA[<211>    10]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR4 aa]]>
          <![CDATA[<400>    31]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            1               5                  10
          <![CDATA[<210>    32]]>
          <![CDATA[<211>    30]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LFR4核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    32]]>
          ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa                                          30
          <![CDATA[<210>    33]]>
          <![CDATA[<211>    31]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    MH1引子]]>
          <![CDATA[<400>    33]]>
          aatttgctag csargtnmag ctgsagsagt c                                        31
          <![CDATA[<210>    34]]>
          <![CDATA[<211>    34]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    MH2引子]]>
          <![CDATA[<400>    34]]>
          aatttgctag csargtnmag ctgsagsagt cwgg                                     34
          <![CDATA[<210>    35]]>
          <![CDATA[<211>    38]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IgG1引子]]>
          <![CDATA[<400>    35]]>
          aatttggatc catagacaga tgggggtgtc gttttggc                                 38
          <![CDATA[<210>    36]]>
          <![CDATA[<211>    34]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    MK引子]]>
          <![CDATA[<400>    36]]>
          aattggatcc aggggccagt ggatagactg atgg                                     34
          <![CDATA[<210>    37]]>
          <![CDATA[<211>    34]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    CK引子]]>
          <![CDATA[<400>    37]]>
          aatttgcggc cgcggataca gttggtgcag catc                                     34
          <![CDATA[<210>    38]]>
          <![CDATA[<211>    981]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人類IgG4 CH]]>
          <![CDATA[<400>    38]]>
          gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag         60
          agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gacggtgtcg        120
          tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca        180
          ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc        240
          tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc        300
          aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc        360
          ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg        420
          tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat        480
          ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac        540
          cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag        600
          tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa        660
          gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag        720
          aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag        780
          tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc        840
          gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg        900
          aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc        960
          ctctccctgt ctccgggtaa a                                                  981
          <![CDATA[<210>    39]]>
          <![CDATA[<211>    327]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人類IgG4 CH]]>
          <![CDATA[<400>    39]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
            1               5                  10                  15 
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                       20                  25                  30 
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
                   35                  40                  45 
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
               50                  55                  60 
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
           65                  70                  75                  80 
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                           85                  90                  95 
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                      100                 105                 110 
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                  115                 120                 125 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
              130                 135                 140 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                          165                 170                 175 
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                      180                 185                 190 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
                  195                 200                 205 
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
              210                 215                 220 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                          245                 250                 255 
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                      260                 265                 270 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                  275                 280                 285 
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
              290                 295                 300 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                          325        
          <![CDATA[<210>    40]]>
          <![CDATA[<211>    321]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人類IgG4 Ckappa]]>
          <![CDATA[<400>    40]]>
          cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct         60
          ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag        120
          tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac        180
          agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag        240
          aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag        300
          agcttcaaca ggggagagtg t                                                  321
          <![CDATA[<210>    41]]>
          <![CDATA[<211>    107]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人類IgG4 Ckappa]]>
          <![CDATA[<400>    41]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
            1               5                  10                  15 
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
                       20                  25                  30 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
                   35                  40                  45 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
               50                  55                  60 
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
           65                  70                  75                  80 
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                           85                  90                  95 
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                      100                 105        
          <![CDATA[<210>    42]]>
          <![CDATA[<211>    1341]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h61重鏈核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    42]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggagccag cgtgaaagtg         60
          tcctgcaagg cctctggcta cacctttaca ggctactgga tgcactgggt gcggcaggcc        120
          cctggacagg gcctggaatg gatgggcatg atccacccca acagcgacac cacaacctac        180
          aacgagaagt tcaagaatag agtgaccatg acaagagata ccagcatcag caccgcctac        240
          atggaactga gcagactgcg gtccgatgac acagctgtgt actattgtgc cggcaccgac        300
          caggccgctt ggttcgcctt ctgggggcag ggcaccacag tcaccgtgag ctctgccagc        360
          accaagggcc cttccgtgtt tcccctggcc ccttgctccc ggtccacatc tgagagcacc        420
          gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc ccgtgaccgt gagctggaac        480
          agcggcgccc tgacaagcgg cgtgcacaca tttcccgccg tgctgcagag ctccggcctg        540
          tactccctgt ctagcgtggt gacagtgcct tcctctagcc tgggcaccaa gacatatacc        600
          tgtaacgtgg accacaagcc aagcaatacc aaggtggata agcgggtgga gtctaagtac        660
          ggccctcctt gccctagctg tcctgctcca gagtttctgg gcggcccttc cgtgttcctg        720
          tttccaccca aaccaaagga cacactgatg atctctagaa caccagaggt gacctgcgtg        780
          gtggtggacg tgagccagga ggatcccgag gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg        840
          gaggtgcaca atgccaagac caagccaaga gaggagcagt ttaactctac atacagggtg        900
          gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctcaacg gcaaggagta taagtgcaag        960
          gtgtccaata agggcctgcc ctcctctatc gagaagacaa tctctaaggc taagggccag       1020
          ccaagagagc ctcaggtgta caccctgcct ccaagccagg aggagatgac aaagaaccag       1080
          gtgtccctga catgtctggt gaagggcttc tatccctccg acatcgccgt ggagtgggag       1140
          tctaatggcc agcctgagaa caattacaag accacacccc ctgtgctgga ctctgatggc       1200
          agcttctttc tgtattccag gctgaccgtg gataagtctc ggtggcagga gggcaacgtg       1260
          ttcagctgct ctgtgatgca cgaagccctg cataatcact atactcagaa aagtctgtca       1320
          ctgtcactgg gaaagtgata a                                                 1341
          <![CDATA[<210>    43]]>
          <![CDATA[<211>    445]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h61重鏈胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    43]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
                  115                 120                 125 
          Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
              130                 135                 140 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                          165                 170                 175 
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                      180                 185                 190 
          Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                  195                 200                 205 
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
              210                 215                 220 
          Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                          245                 250                 255 
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
                      260                 265                 270 
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
                  275                 280                 285 
          Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
              290                 295                 300 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
          305                 310                 315                 320 
          Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                          325                 330                 335 
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                      340                 345                 350 
          Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                  355                 360                 365 
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
              370                 375                 380 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
          385                 390                 395                 400 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                          405                 410                 415 
          Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
                      420                 425                 430 
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                  435                 440                 445
          <![CDATA[<210>    44]]>
          <![CDATA[<211>    1341]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h68重鏈核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    44]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggagccag cgtgaaagtg         60
          tcctgcaagg cctctggcta cacctttaca ggctactgga tgcactgggt gcggcaggcc        120
          cctggacagg gcctggaatg gatcggcatg atccacccca acagcgacac cacaacctac        180
          aacgagaagt tcaagaatag agtgaccatg acaagagata ccagcatcag caccgcctac        240
          atggaactga gcagactgcg gtccgatgac acagctgtgt actattgtac cggcaccgac        300
          caggccgctt ggttcgcctt ctgggggcag ggcaccacag tcaccgtgag ctctgccagc        360
          accaagggcc cttccgtgtt tcccctggcc ccttgctccc ggtccacatc tgagagcacc        420
          gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc ccgtgaccgt gagctggaac        480
          agcggcgccc tgacaagcgg cgtgcacaca tttcccgccg tgctgcagag ctccggcctg        540
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          tgtaacgtgg accacaagcc aagcaatacc aaggtggata agcgggtgga gtctaagtac        660
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Thr Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
                  115                 120                 125 
          Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
              130                 135                 140 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                          165                 170                 175 
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                      180                 185                 190 
          Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                  195                 200                 205 
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
              210                 215                 220 
          Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                          245                 250                 255 
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
                      260                 265                 270 
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
                  275                 280                 285 
          Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
              290                 295                 300 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
          305                 310                 315                 320 
          Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                          325                 330                 335 
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                      340                 345                 350 
          Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                  355                 360                 365 
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
              370                 375                 380 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
          385                 390                 395                 400 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                          405                 410                 415 
          Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
                      420                 425                 430 
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                  435                 440                 445
          <![CDATA[<210>    46]]>
          <![CDATA[<211>    1341]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h70重鏈核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    46]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggagccag cgtgaaagtg         60
          tcctgcaagg cctctggcta cacctttaca ggctactgga tgcactgggt gcggcaggcc        120
          cctggacagg gcctggaatg gatcggcatg atccacccca acagcgacac cacaacctac        180
          aacgagaagt tcaagaatag agtgaccatg acaagagata ccagcatcag caccgcctac        240
          atggaactga gcagactgcg gtccgatgac acagctgtgt actattgtgc cggcaccgac        300
          caggccgctt ggttcgcctt ctgggggcag ggcaccacag tcaccgtgag ctctgccagc        360
          accaagggcc cttccgtgtt tcccctggcc ccttgctccc ggtccacatc tgagagcacc        420
          gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc ccgtgaccgt gagctggaac        480
          agcggcgccc tgacaagcgg cgtgcacaca tttcccgccg tgctgcagag ctccggcctg        540
          tactccctgt ctagcgtggt gacagtgcct tcctctagcc tgggcaccaa gacatatacc        600
          tgtaacgtgg accacaagcc aagcaatacc aaggtggata agcgggtgga gtctaagtac        660
          ggccctcctt gccctagctg tcctgctcca gagtttctgg gcggcccttc cgtgttcctg        720
          tttccaccca aaccaaagga cacactgatg atctctagaa caccagaggt gacctgcgtg        780
          gtggtggacg tgagccagga ggatcccgag gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg        840
          gaggtgcaca atgccaagac caagccaaga gaggagcagt ttaactctac atacagggtg        900
          gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctcaacg gcaaggagta taagtgcaag        960
          gtgtccaata agggcctgcc ctcctctatc gagaagacaa tctctaaggc taagggccag       1020
          ccaagagagc ctcaggtgta caccctgcct ccaagccagg aggagatgac aaagaaccag       1080
          gtgtccctga catgtctggt gaagggcttc tatccctccg acatcgccgt ggagtgggag       1140
          tctaatggcc agcctgagaa caattacaag accacacccc ctgtgctgga ctctgatggc       1200
          agcttctttc tgtattccag gctgaccgtg gataagtctc ggtggcagga gggcaacgtg       1260
          ttcagctgct ctgtgatgca cgaagccctg cataatcact atactcagaa aagtctgtca       1320
          ctgtcactgg gaaagtgata a                                                 1341
          <![CDATA[<210>    47]]>
          <![CDATA[<211>    445]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h70重鏈胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    47]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
                  115                 120                 125 
          Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
              130                 135                 140 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                          165                 170                 175 
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                      180                 185                 190 
          Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                  195                 200                 205 
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
              210                 215                 220 
          Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                          245                 250                 255 
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
                      260                 265                 270 
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
                  275                 280                 285 
          Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
              290                 295                 300 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
          305                 310                 315                 320 
          Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                          325                 330                 335 
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                      340                 345                 350 
          Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                  355                 360                 365 
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
              370                 375                 380 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
          385                 390                 395                 400 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                          405                 410                 415 
          Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
                      420                 425                 430 
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                  435                 440                 445
          <![CDATA[<210>    48]]>
          <![CDATA[<211>    663]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h61輕鏈核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    48]]>
          gatatcgtta tgacccagac ccctctgagc ctgtccgtga ccccaggcca acctgcctct         60
          atcagctgta gaagcagcca gaacatcgtg cacagcaacg gcgacaccta cctggaatgg        120
          tatctgcaga aacctggaca gagccccaag ctgctgatct acaaggtgtc caagcggttt        180
          tccggcgtgc ctgatagatt cagcggatct ggcagcggca cagacttcac cctgaagatt        240
          tctagagtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccagggcag ccacgtgccc        300
          tggacattcg gcggcggaac aaaggtggaa atcaagagga cagtggccgc cccaagcgtg        360
          ttcatctttc ccccttccga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg        420
          ctgaacaact tctaccctcg ggaggccaag gtccagtgga aggtggataa cgccctgcag        480
          tctggcaata gccaggagtc cgtgaccgag caggactcta aggatagcac atattccctg        540
          tctagcaccc tgacactgag caaggccgat tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgaa        600
          gtcacccatc aggggctgtc atcacccgtc actaagtcat tcaatcgcgg agaatgctga        660
          taa                                                                      663
          <![CDATA[<210>    49]]>
          <![CDATA[<211>    219]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h61輕鏈胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    49]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
                  115                 120                 125 
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
              130                 135                 140 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                          165                 170                 175 
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
                      180                 185                 190 
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                  195                 200                 205 
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
              210                 215                
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          <![CDATA[<400>    50]]>
          gatatcgtta tgacccagac ccctctgagc ctgtccgtga ccccaggcca acctgcctct         60
          atcagctgta gaagcagcca gaacatcgtg cacagcaacg gcgacaccta cctggaatgg        120
          tatctgcaga aacctggaca gagcccccag ctgctgatct acaaggtgtc caagcggttt        180
          tccggcgtgc ctgatagatt cagcggatct ggcagcggca cagacttcac cctgaagatt        240
          tctagagtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccagggcag ccacgtgccc        300
          tggacattcg gcggcggaac aaaggtggaa atcaagagga cagtggccgc cccaagcgtg        360
          ttcatctttc ccccttccga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg        420
          ctgaacaact tctaccctcg ggaggccaag gtccagtgga aggtggataa cgccctgcag        480
          tctggcaata gccaggagtc cgtgaccgag caggactcta aggatagcac atattccctg        540
          tctagcaccc tgacactgag caaggccgat tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgaa        600
          gtcacccatc aggggctgtc atcacccgtc actaagtcat tcaatcgcgg agaatgctga        660
          taa                                                                      663
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h68輕鏈胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    51]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
                  115                 120                 125 
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
              130                 135                 140 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                          165                 170                 175 
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
                      180                 185                 190 
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                  195                 200                 205 
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
              210                 215                
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          <![CDATA[<211>    663]]>
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          gatatcgtta tgacccagac ccctctgagc ctgtccgtga ccccaggcca acctgcctct         60
          atcagctgta gaagcagcca gaacatcgtg cacagccagg gcgacaccta cctggaatgg        120
          tatctgcaga aacctggaca gagcccccag ctgctgatct acaaggtgtc caagcggttt        180
          tccggcgtgc ctgatagatt cagcggatct ggcagcggca cagacttcac cctgaagatt        240
          tctagagtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccagggcag ccacgtgccc        300
          tggacattcg gcggcggaac aaaggtggaa atcaagagga cagtggccgc cccaagcgtg        360
          ttcatctttc ccccttccga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg        420
          ctgaacaact tctaccctcg ggaggccaag gtccagtgga aggtggataa cgccctgcag        480
          tctggcaata gccaggagtc cgtgaccgag caggactcta aggatagcac atattccctg        540
          tctagcaccc tgacactgag caaggccgat tacgagaagc acaaggtgta tgcctgtgaa        600
          gtcacccatc aggggctgtc atcacccgtc actaagtcat tcaatcgcgg agaatgctga        660
          taa                                                                      663
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          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>    53]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Gln Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
                  115                 120                 125 
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
              130                 135                 140 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                          165                 170                 175 
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
                      180                 185                 190 
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                  195                 200                 205 
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
              210                 215                
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            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser
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          <![CDATA[<400>    55]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
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          <![CDATA[<400>    56]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Thr Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser
                  115            
          <![CDATA[<210>    57]]>
          <![CDATA[<211>    112]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>    57]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>    58]]>
          <![CDATA[<211>    118]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人源化抗體, 1G1-h70 VH胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    58]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
                       20                  25                  30 
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                   35                  40                  45 
          Gly Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
               50                  55                  60 
          Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Gly Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
                      100                 105                 110 
          Thr Val Thr Val Ser Ser
                  115            
          <![CDATA[<210>    59]]>
          <![CDATA[<211>    112]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>    59]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
            1               5                  10                  15 
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
                       20                  25                  30 
          Gln Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
                   35                  40                  45 
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
               50                  55                  60 
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
           65                  70                  75                  80 
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                           85                  90                  95 
          Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>    60]]>
          <![CDATA[<211>    16]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LCDR1胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    60]]>
          Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Gln Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
            1               5                  10                  15 
          <![CDATA[<210>    61]]>
          <![CDATA[<211>    48]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    LCDR1核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>    61]]>
          agaagcagcc agaacatcgt gcacagccag ggcgacacct acctggaa                      48
          <![CDATA[<210>    62]]>
          <![CDATA[<211>    288]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人類PD-1蛋白質, 全胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>    62]]>
          Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
            1               5                  10                  15 
          Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
                       20                  25                  30 
          Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
                   35                  40                  45 
          Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
               50                  55                  60 
          Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
           65                  70                  75                  80 
          Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
                           85                  90                  95 
          Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
                      100                 105                 110 
          Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
                  115                 120                 125 
          Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
              130                 135                 140 
          Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
          145                 150                 155                 160 
          Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
                          165                 170                 175 
          Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
                      180                 185                 190 
          Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
                  195                 200                 205 
          Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
              210                 215                 220 
          Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
          225                 230                 235                 240 
          Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
                          245                 250                 255 
          Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
                      260                 265                 270 
          Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
                  275                 280                 285 
          <![CDATA[<210>    63]]>
          <![CDATA[<211>    17]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    63]]>
          Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
            1               5                  10                  15 
          Asn
          <![CDATA[<210>    64]]>
          <![CDATA[<211>    17]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    64]]>
          Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
            1               5                  10                  15 
          Asn
          <![CDATA[<210>    65]]>
          <![CDATA[<211>    17]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    65]]>
          Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Thr Tyr Asn Trp Lys Phe Lys
            1               5                  10                  15 
          Asn
          <![CDATA[<210>    66]]>
          <![CDATA[<211>    17]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    66]]>
          Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Val Tyr Asn Trp Lys Phe Lys
            1               5                  10                  15 
          Asn
          <![CDATA[<210>    67]]>
          <![CDATA[<211>    17]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR2 aa]]>
          <![CDATA[<400>    67]]>
          Met Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Ile Tyr Asn Trp Lys Phe Lys
            1               5                  10                  15 
          Asn
          <![CDATA[<210>    68]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    68]]>
          Thr Asp Gln Glu Ala Trp Phe Ala Phe
            1               5                
          <![CDATA[<210>    69]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    69]]>
          Thr Asp Gln Ala Ala Trp Ala Ala Phe
            1               5                
          <![CDATA[<210>    70]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    70]]>
          Thr Asp Gln Ala Ala Trp Met Ala Phe
            1               5                
          <![CDATA[<210>    71]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    71]]>
          Thr Asp Gln Ala Ala Trp His Ala Phe
            1               5                
          <![CDATA[<210>    72]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    72]]>
          Thr Asp Gln Ala Ala Trp Phe Gly Phe
            1               5                
          <![CDATA[<210>    73]]>
          <![CDATA[<211>    9]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    HCDR3 aa]]>
          <![CDATA[<400>    73]]>
          Thr Asp Gln Glu Ala Trp Ala Ala Phe
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          Thr Asp Gln Glu Ala Trp Ala Gly Phe
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          Thr Asp Gln Glu Ala Trp Met Gly Phe
            1               5                
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          <![CDATA[<400>    82]]>
          Thr Asp Gln Glu Ala Trp His Gly Phe
            1               5                
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          <![CDATA[<400>    83]]>
          Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Arg Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
            1               5                  10                  15 
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          <![CDATA[<211>    16]]>
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          <![CDATA[<400>    84]]>
          Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Arg Ser Gln Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
            1               5                  10                  15

Claims

一種抗體或其抗原結合片段，其與包含序列號62的P130、L128及I126胺基酸的程式性細胞死亡-1（PD-1）蛋白質的抗原決定區（epitope）結合。
如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與包括選自由序列號62的N66、Y68、K78、A129及A132組成的群組的一種以上的額外抗原決定區結合。
如請求項1或2所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段對人類PD-1及小鼠PD-1具有同等水平的結合力。
如請求項1或2所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段於pH6.0下以9E-10 M以下的平衡解離常數結合至人類PD-1。
一種抗體或其抗原結合片段，其結合至PD-1蛋白質，所述抗體或抗原結合片段包括：重鏈互補性決定區1（HCDR1），包含序列號1的胺基酸序列；重鏈互補性決定區2（HCDR2），包含序列號3、63、64、65、66或67的胺基酸序列；重鏈互補性決定區3（HCDR3），包含選自由序列號5及序列號68至序列號82組成的群組的胺基酸序列；輕鏈互補性決定區1（LCDR1），包含序列號7、60、83或84的胺基酸序列；輕鏈互補性決定區2（LCDR2），包含序列號9的胺基酸序列；以及輕鏈互補性決定區3（LCDR3），包含序列號11的胺基酸序列。
如請求項5所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體為鼠類（murine）抗體、嵌合（chimeric）抗體或人源化（humanized）抗體。
一種抗體或其抗原結合片段，其結合至PD-1蛋白質，所述抗體或抗原結合片段包括：重鏈可變區，包含序列號13、54、56或58的胺基酸序列；以及輕鏈可變區，包含序列號15、55、57或59的胺基酸序列。
一種抗體或其抗原結合片段，其結合至PD-1蛋白質，所述抗體或抗原結合片段包括：重鏈可變區，包含序列號13、54、56或58的胺基酸序列與序列同一性至少為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%以上的胺基酸序列；以及輕鏈可變區，包含序列號15、55、57或59的胺基酸序列與序列同一性至少為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%以上的胺基酸序列。
一種核酸分子，對如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段進行加密。
一種選殖或表達載體，包含如請求項9所述的核酸分子。
一種宿主細胞，包含如請求項10所述的選殖或表達載體。
一種抗體或其抗原結合片段的生產方法，所述抗體或其抗原結合片段包含如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，包括培養宿主細胞的步驟，所述宿主細胞包括包含對如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段進行加密的核酸分子的選殖或表達載體。
如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段自如下進行選擇：駱駝化單域抗體、雙抗體、F(ab') ₂、Fab'、Fab、Fv、單鏈可變區片段、單鏈可變區片段二聚體、二價單鏈可變區片段、二硫鍵穩定性Fv片段（dsFv）、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、Fv片段、雙鏈雙抗體、奈米抗體、微型抗體、域抗體、二價域抗體、雙抗體及單鏈結合多肽。
一種基因導入動物，進行操作以表達如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
如請求項14所述的基因導入動物，其中動物為囓齒類。
一種多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒，包含如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種藥學組成物，包括如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒，用以預防或治療與PD-1相關的病症。
如請求項17所述的藥學組成物，其中與PD-1相關的病症為腫瘤、癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病。
如請求項18所述的藥學組成物，其中作為與PD-1相關的病症的腫瘤或癌症選自：非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腎癌、肝癌、骨癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫瘤、默克爾細胞癌及經典霍奇金淋巴瘤（CHL）、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富的B細胞淋巴瘤、人類皰疹病毒（EBV）-陽性及-陰性移植後淋巴增生性疾病（PLTD）、及人類皰疹病毒相關的彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、漿母細胞淋巴瘤、外源性NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌、及人類皰疹病毒8（HHV8）相關的原發性滲出性淋巴瘤、包括霍奇金淋巴瘤的其他血癌、包括原發性中樞神經系統（CNS）淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤的中樞神經系統的新生物。
如請求項18所述的藥學組成物，其中作為與PD-1相關的病症的自體免疫疾病選自：狼瘡、全身性紅斑狼瘡、乾燥症候群（Sjogren's Syndrome）、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、骨盆腔發炎性疾病、阿茲海默病（Alzheimer's Disease）、炎症性腸病、克羅恩病（Crohn's disease）、潰瘍性大腸炎、佩羅尼病（Peyronie's Disease）、乳糜瀉（coeliac disease）、膽囊疾病、藏毛病（Pilonidal disease）、腹膜炎、牛皮癬、銀屑病關節炎、血管炎、術後黏連（surgical adhesions）、中風、第1型糖尿病、萊姆病（Lyme disease）、腦膜腦炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、吉蘭-巴雷症候群（Guillain-Barr syndrome）、特應性皮炎、自身免疫性肝炎、纖維化肺泡炎、格雷夫斯病（Grave's disease）、免疫球蛋白A腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼埃病（Meniere's disease）、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮症、華格納氏肉芽病（Wegener's granulomatosis）、其他自體免疫疾病、胰腺炎、外傷（手術）、移植物抗宿主病、移植排斥反應、包括如心肌梗塞及動脈粥樣硬化等缺血性疾病的心臟病、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎及胃酸過少症、與缺乏母胎耐受相關的不孕症（infertility related to lack of fetal-maternal tolerance）、白癜風、重症肌無力及全身性硬化症。
如請求項18所述的藥學組成物，其中作為與PD-1相關的病症的神經系統疾病或神經退行性疾病選自：認知障礙、腦腫瘤、阿茲海默病、癡呆、中風（stroke）、脊髓損傷（spinal cord injury）、肌肉萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、帕金森病、亨廷頓病、多發性硬化症（multiple sclerosis）、膠質母細胞瘤（glioblastoma）、黑色素瘤（melanoma）、疼痛（pain）及記憶力減退。
如請求項18所述的藥學組成物，其中作為與PD-1相關的病症的感染性疾病選自包括如下的慢性病毒感染：B型肝炎、C型肝炎的病毒感染、皰疹病毒、人類皰疹病毒、艾滋病病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人乳頭瘤病毒、腺病毒、與皰疹病毒傳染相關的卡波西氏肉瘤、細環病毒（Torque teno virus）、JC病毒或BK病毒感染。
一種腫瘤、癌症、自體免疫疾病、神經系統疾病、神經退行性疾病或感染性疾病的預防或治療方法，包括向個體施用選自由如下組成的群組的一種以上的步驟：如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段及包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體及腫瘤殺滅病毒。
一種藥學組成物，用以在患有癌症的對象中增加免疫反應，包含如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或包括其的多特異性抗原結合分子、免疫偶聯物、嵌合抗原受體、製作的T細胞受體或腫瘤殺滅病毒。
一種抗體或抗原結合片段的生產方法，所述抗體或抗原結合片段包括如請求項1、請求項2及請求項5至請求項8中任一項所述的抗體或抗原結合片段，包括於利用PD-1抗原使PD-1剔除小鼠免疫化後，摘除脾臟並將B淋巴細胞分離之後，於與骨髓瘤細胞融合而得到的融合瘤細胞中挑選生產與人類PD-1抗原進行反應的抗體的融合瘤。
一種融合瘤，藉由如請求項25所述的抗體或抗原結合片段的生產方法來製備。