KR100490077B1 - 항-전립선 줄기세포 항원 (ｐｓｃａ) 항체 조성물 및 그의사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체내에서 포유동물 세포 상의 PSCA에 결합할 때 내재화하는 단리된 항-전립선 줄기세포 항원 (PSCA) 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 항-PSCA 항체 및 담체를 포함하는 조성물도 포함한다. 이 조성물은 제품 또는 키트에 제공될 수 있다. 본 발명의 또다른 측면은 항-PSCA 항체를 코딩하는 단리된 핵산뿐만 아니라, 상기 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 항-PSCA 항체를 생산하는 세포도 제공한다. 본 발명은 항-PSCA 항체를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 암세포와 항-PSCA 항체를 접촉시키는 것을 포함하는, PSCA-발현 암세포를 사멸시키는 방법, 및 치료 유효량의 항-PSCA 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 PSCA-발현 암을 완화시키거나 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-전립선 줄기세포 항원 (ＰＳＣＡ) 항체 조성물 및 그의 사용 방법 {Anti-Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) Antibody Compositions and Methods of Use}

본 발명은 항-PSCA 항체 조성물, 및 PSCA를 발현하는 암세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

인간에서, 전립선암은 남성에서 가장 흔히 진단되는 악성 종양 중 하나이고 남성에 있어서 암 관련 사망의 두 번째 주원인이다. 미국 암 협회 (American Cancer Society)는 2000년동안 180,400 케이스의 전립선암이 새로 진단되고 이 질환으로 31,900명이 사망할 것이라고 추정하였다. 진행된 단계에서, 전립선암은 뼈로 전이한다. 국소적으로 한정된 부위에 있는 종양의 초기 진단 및 치료가 발전되어 있지만, 전립선암은 일단 전이되면 치료불가능하다. 전이성 전립선암을 앓는 환자를 호르몬요법으로 치료하면 결국 암의 진행 및 사망을 초래할 안드로겐-불응성 (안드로겐 비의존성) 상태로 발전될 것이다. 현재, 전립선-특이적 항원 (PSA)은 전립선암을 스크리닝하고 진단하고 모니터링하는 데 가장 널리 사용되는 종양 마커이다. 그러나, 스크리닝용 수단으로서 PSA를 널리 사용하는 것은 PSA가 양성 전립선 질환과 악성 전립선 질환을 정확히 구별하지 못하기 때문에 논쟁의 여지가 있다.

암의 단계에 따라, 암 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선요법, 화학요법, 전립선암의 경우 안드로겐 제거법 (예컨대, 호르몬요법) 중 하나 또는 이들 요법의 병용 요법을 사용하여 전립선 및 유방암의 치료한다. 수술 또는 방사선요법이 초기 단계의 전립선암 또는 유방암을 앓는 환자의 생존율을 상당히 증가시키지만, 이 치료법의 선택은 진행된 케이스, 특히 호르몬 제거 후 재발된 종양에 대해서는 매우 제한되어 있다. 호르몬요법을 받는 환자의 대다수에서는 안드로겐-비의존성 질환이 발병된다. 현재, 수술 또는 방사선요법 후 전립선암이 재발되는 전립선암 환자 중 20-40%의 환자, 또는 진단시 전립선암이 전이되어 있는 환자에 효과적인 치료법은 없다. 화학요법은 특히 연령이 높은 환자에서 부작용을 나타낸다. 특히, 안드로겐 결핍에 대해 불응성을 나타내는 질환을 위한 새로운 형태의 치료법의 개발은 전립선암의 관리에 있어서 절실히 필요하다.

예컨대, 미국 특허 제5,856,136호 (SCAH2), WO 99/14328 (단백질 PR0232), WO 98/40403 (PSCA), WO 98/51805 (PS116) 및 문헌 (Reiter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1735-1740 (1998))에는 새로운 세포 표면 항원인 전립선 줄기세포 항원 (PSCA)의 확인이 기재되어 있다. PSCA는 처음 전립선암 환자로부터 얻은 LAPC-4 이종이식조직의 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하였다.

PSCA는 전립선 및 방광 종양 세포를 포함하는 다수의 세포 유형의 표면에 발현되는, 123개 아미노산으로 된 GPI-결합 분자이다. PSCA 유전자는 전립선암의 80%에서 증폭되어 있는 영역인 8Q24.2의 myc 좌위에 위치한다. PSCA는 SCA-2와 30% 상동성을 보인다. 이 단백질에는 N-말단의 첫 20개 아미노산에 있는 소수성 신호 서열, 및 C-말단의 아미노산 100-123에 있는 GPI-앵커링 서열이 있다 (문헌 (Reiter et al. (1998))의 1737면의 도 2). 4개의 예상 글리코실화 부위가 있다. 세포 표면 단백질은 배양물 중에서 약 10시간의 t_1/2에서 세포로부터 떨어져 나온다. PSCA는 고등급의 전립선 상피내 종양 (PIN), 안드로겐-의존성 전립선 종양 및 안드로겐-비의존성 전립선 종양을 포함하는 모든 단계의 전립선암에서 광범위하게 과발현되는 것으로 보고되어 있다. 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포에 특이적으로 결합하고 이 세포와 결합시 내재화할 수 있는 항체는 보고된 적이 없다.

항체-기재 요법은 다양한 암의 치료에 매우 효과적인 것으로 증명된 바 있다. 예를 들어, HERCEPTIN (등록상표) 및 RITUXAN (등록상표) (Genentech, S. San Francisco)은 각각 유방암 및 비-호치킨 림프종을 치료하는 데 성공적으로 사용되고 있다. HERCEPTIN (등록상표)은 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 프로토-온코진의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA 유래의 인간화 모노클로날 항체이다. HER2 단백질의 과발현은 원발성 유방암의 25-30%에서 관찰된다. RITUXAN (등록상표)은 정상 B 림프구 및 악성 B 림프구의 표면에서 발견되는 CD20 항원에 대한, 유전공학적으로 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 이들 두 항체는 CHO 세포에서 생산된다.

본 발명은 통상적인 치료 방법의 한계를 극복할 뿐만 아니라, 하기 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 추가 이점을 제공하는, 암 치료의 대안을 제공한다.

<발명의 요약>

본 발명은 생체내에서 포유동물 세포의 PSCA에 결합할 때 내재화되는 단리된 항-PSCA 항체를 제공한다. 이들 항체는 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포에 특이적으로 결합한다. 특정한 실시양태에서, 항-PSCA 항체는 전립선암, 요도암 (예를 들어, 방광암) 및 폐암을 비롯한 암 세포의 PSCA에 결합할 때 내재화된다. 모노클로날 항체인 내재화 항-PSCA 항체가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 상기 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 제PTA-717호, 제PTA-718호, 제PTA-719호, 제PTA-720호, 제PTA-880호, 제PTA-2265호 및 제PTA-2264호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 10E3, 6F8, 8D11, 5F2, 6C3, 6B8 및 10C5이다. 6F8, 8D11, 5F2, 6B8 항체의 V 영역 서열은 도 12 (서열 3-9)에 기재되어 있다. 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 키메라 뮤린-인간 항체 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명은 서열 1-13 중 임의의 한 아미노산 서열을 포함하는 항-PSCA 항체 및 항체 융합 폴리펩티드를 제공한다.

상기 모노클로날 항체 중 임의의 항체에 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 항체도 제공한다. 또다른 실시양태에서, 생체내에서 PSCA-발현 암세포의 생장을 억제하거나 생체내에서 PSCA-발현 세포 및 이러한 세포를 함유하는 종양에 대해 세포독성을 나타내는 단리된 항-PSCA 모노클로날 항체도 제공된다.

또한, 본 발명은 세포독성제 또는 생장 억제제와 결합된 항-PSCA 항체를 제공한다. 이 항체는 내재화 및(또는) 생장 억제 항체이다. 세포독성제는 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 독소는 메이탄시노이드, 보다 바람직하게는 도 22에 기재된 구조를 갖는 메이탄시노이드이다.

상기 실시양태의 항-PSCA 항체에는 완전한 형태의 (전장) 항체뿐만 아니라 항체 단편도 포함된다. 본 발명의 항-PSCA 항체에는 인간 항체 및 키메라 항체뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 항체 V 영역을 포함하는 항체 융합 폴리펩티드도 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 실시양태 중 임의의 실시양태의 항-PSCA 항체는 키메라 또는 인간 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 키메라 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항-PSCA 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁번호 제PTA-717호, 제PTA-718호, 제PTA-719호, 제PTA-720호, 제PTA-880호 및 제PTA-2265호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 임의의 항체의 인간화 형태를 포함하고, 키메라 항체는 도 13에 기재된 서열 1-13의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포에서 생산되는 항체를 포함한다.

본 발명은 상기 실시양태의 항-PSCA 항체 중 임의의 하나 및 담체를 포함하는 조성물도 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물 중의 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁번호 제PTA-717호, 제PTA-718호, 제PTA-719호, 제PTA-720호, 제PTA-880호 및 제PTA-2265호로 기탁된 하이브리도마 중 임의의 하나에 의해 생산되는 인간 항체 또는 인간화 형태의 모노클로날 항체이다. 한 특정 실시양태에서, 상기 조성물 중의 항체는 메이탄시노이드에 결합되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 담체는 제약학적으로 허용되는 담체이다. 이들 조성물은 제품 또는 키트로 제공될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 실시양태의 항-PSCA 항체 중 임의의 하나를 코딩하는 단리된 핵산뿐만 아니라, 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.

본 발명은 상기 항-PSCA 항체을 생산하는 세포도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체를 생산하는 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁번호 제PTA-717호, 제PTA-718호, 제PTA-719호, 제PTA-720호, 제PTA-880호 및 제PTA-2265호의 특정한 하이브리도마 세포를 비롯한 하이브리도마 세포이다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포는 박테리아 세포이다. 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 구체적으로 제공된다.

본 발명은 상기 실시양태의 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 항-PSCA 항체를 회수하는 것을 포함하는, 상기 실시양태의 항-PSCA 항체를 생산하는 방법도 포함한다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 실시양태 중 임의의 실시양태의 항-PSCA 항체와 암세포를 접촉시켜 암세포를 죽이는 것을 포함하는, 항-PSCA 항체를 발현하는 암세포를 죽이는 방법이다. 또다른 측면은 치료 유효량의 본 발명의 항-PSCA 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 PSCA-발현 암을 완화시키거나 치료하는 방법이다. 상기 두 방법의 바람직한 실시양태에서, 암은 전립선암, 방광암 또는 폐암, 보다 바람직하게는 전립선암 및 특히 안드로겐 비의존성 전립선 암세포 또는 전이성 전립선암이다. 이들 방법의 바람직한 실시양태에서, 항-PSCA 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 독소 또는 방사성 동위원소와 같은 세포독성제와 결합되어 있다. 바람직하게는, 상기 독소는 칼리케아미신, 또는 도 22에 기재된 구조를 갖는 "DM1"과 같은 메이탄시노이드이다. PSCA를 발현하는 암을 완화시키는 방법은 화학요법과 함께 항-PSCA 항체를 투여하는 것으로, 이 방법에서 1종 이상의 화학요법제도 포유동물에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 상기 화학요법제는 팩클리탁셀 (TAXOL (등록상표)) 또는 독세탁셀과 같은 탁산, 또는 그의 유도체 및 동족체이다.

다른 측면에서, 본 발명은 용기 및 이 용기에 함유된 조성물을 포함하고 상기 조성물이 PSCA-발현 암 및 특히 전립선암의 완화 또는 치료에 사용될 수 있다는 것을 설명하는 포장 삽입체도 포함하는 제품을 제공하는데, 여기서, 상기 조성물은 상기 실시양태의 항-PSCA 항체를 포함한다.

도 1은 FACS로 분석한, 5F2 Mab와 gD-PSCA 형질감염 CHO 세포의 결합 및 염색을 보여준다 (실시예 1 참조).

도 2는 FACS로 분석한, 10C5 Mab와 gD-PSCA 형질감염 CHO 세포의 결합 및 염색을 보여준다 (실시예 1 참조).

도 3은 다양한 가용성 PSCA 항원에 대한 6B8.1D7.2B3 항-PSCA Mab의 결합 활성을 보여준다 (실시예 1 참조)

도 4는 항체 복수 (ascite) 제2403번 (5F2)에 대한 결합 곡선을 나타낸다 (실시예 1 참조).

도 5는 3개 세포 타입에서 Cy3 형광의 강도로 측정한, 다양한 항-PSCA 모노클로날 항체 (6C3; 6F8; 10A1; 8D11; 5F2; 7A6)의 내재화를 나타내는 그래프이다 (실시예 3 참조).

도 6은 3개 세포 타입에서 Cy3 형광의 강도로 1시간 내에 측정한, 다양한 항-PSCA 모노클로날 항체 (6C3 ; 6F8 ; 10AI ; 8D11 ; 5F2 ; 7A6)에 의한 PSCA의 표면 표지를 나타내는 그래프이다 (실시예 3 참조).

도 7은 Cy3 형광의 강도로 1시간 내에 측정할 때 항-PSCA 모노클로날 항체 각각에 대한 표면 항-PSCA 모노클로날 항체 대 내재화 항-PSCA 모노클로날 항체의 양을 비교한 그래프이다. 표면 및 내재화 항체의 양은 도 5 및 6에 사용된 3가지 다른 세포주로부터 얻은 평균치이다.

도 8A, 8B 및 8C는 PSCA-발현 세포주 HCT 47 gD, MCF7/HER2/PSCA 및 PC3 19 gD PSCA 각각에서 형광 표지된 8D11 항-PSCA 항체의 분포를 콘포칼 (confocal) 현미경으로 관찰하여 나타낸 미세도이다 (실시예 3 참조).

도 9A-D는 금 부가물로 표지된 항-PSCA 항체로 처리된 PSCA 발현 CHO 세포의 전자 미세도를 나타낸다. 도 9A 및 9B는 각각 15분 및 1시간 동안 항체 6C3와 함께 인큐베이션한 세포를 나타낸다. 도 9C 및 9D는 각각 15분 및 1시간 동안 항체 10E3와 함께 인큐베이션한 세포를 나타낸다.

도 10은 ²⁵I-8D11 항체와 HCT116 gDPSCA 세포를 접촉시킨지 15분 후 상기 세포에서 상기 항체의 내재화를 보여주는 미세도이다 (실시예 3 참조)

도 11은 5시간 후 37℃에서, gD-PSCA로 형질감염되었거나 벡터로만 형질감염된 HER2-발현 MCF7 세포에서 3종의 항-PSCA 항체 [복수 #2395 (6F8), #2399 (8D11), #2403 (5F2)]의 내재화 수준을 나타낸다 (실시예 3 참조). HERCEPTIN은 항-HER2 항체이다.

도 12는 하이브리도마 클론 6F8.2F4, 복수 #2395; 8D11.2E9, 복수 #2399; 5F2.4H4.1E3, 복수 #2403; 및 6B8.1D7.2B3, 복수 #2761으로부터 얻은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 도메인 (V_H 및 V_L)의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 13은 신호 펩티드 서열을 포함하는 전장 키메라 2403 IgG의 아미노산 서열 및 키메라 6B8 Fab의 서열을 나타낸다.

도 14는 다양한 종양 조직의 상대적 PSCA 발현도 대 정상 조직의 상대적 PSCA 발현도의 비교를 나타낸다 (실시예 4 참조).

도 15는 시아노몰구스 원숭이 PSCA 타입 I의 DNA 서열 및 단백질 서열 (각각 서열 16 및 서열 17)을 나타낸다 (실시예 6 참조). 아미노산 서열의 말단에 있는 "o"는 Ochre 정지 코돈을 나타낸다.

도 16은 시아노몰구스 원숭이 PSCA 타입 II의 DNA 서열 및 단백질 서열 (각각 서열 18 및 서열 19)을 나타낸다 (실시예 6 참조). 아미노산 서열의 말단에 있는 "o"는 Ochre 정지 코돈을 나타낸다.

도 17은 인간 PSCA의 아미노산 서열 (서열 1)과 시아노몰구스 원숭이 타입 I PSCA의 아미노산 서열 (서열 17)을 비교하여 나타낸다.

도 18은 항-돼지풀 음성 대조구 항체와 비교할 때, 3가지 항-PSCA 항체 (6B8, 8D11 및 5F2)로 처리된 마우스에서 대조구 PC-3 종양 세포 (PSCA-음성)의 생장을 나타낸다 (실시예 5 참조).

도 19는 음성 대조구인 항-돼지풀 항체와 비교할 때, 3가지 항-PSCA 항체 (6B8, 8D11 및 5F2)으로 처리된 마우스에서 PC-3.gDPSCA 종양의 생장을 나타낸다. 상기 항체는 PSCA-형질감염 PC-3 세포로 접종하기 하루 전에 시작되는 복강내 주사로 투여한 후, 세포 접종 다음에 2주마다 주사한다. 화살표 아래의 "RX"는 상기 항체를 마우스 내로 주사하는 시점 (일)을 나타낸다 (실시예 5 참조).

도 20은 도 19에 기재된 바와 같이, 항체 8D11, 5F2, 6B8 및 대조구 돼지풀 항체로 처리된 PC-3.gDPSCA 종양의 생장을 나타낸다 (실시예 5 참조).

도 21은 PC-3.gDPSCA 종양이 마우스에서 생장하는 것을 보여주는데, 여기서, 항-PSCA 항체 6F8, 8D11 또는 5F2을 사용한 치료는 종양이 마우스에서 1주동안 생장하여 마우스의 군 당 대략 200 mm³의 평균 종양 부피에 도달한 후 개시하였다. 항체 투여는 2주마다 수행하였다. 화살표 아래의 "RX"는 상기 항체를 마우스 내로 복강내 주사하는 시점 (일)을 나타낸다 (실시예 5 참조).

도 22는 "DM1"으로 표시되는, 메이탄시노이드의 구조를 나타낸다 (실시예 7 참조).

도 23은 항-PSCA 항체-DM1 컨쥬게이트의 구조를 나타낸다 (실시예 7 참조).

도 24는 비-결합된 DM1에 대한 분석 세포주 (PC3.Neo 세포 및 인간 PSCA 클론 4 세포)의 민감도를 나타낸다 (실시예 8 참조).

도 25는 이소타입 대조구 1429-DM1과 비교할 때, PC3.gD인간 PSCA 클론 4 세포에 대한 항체 컨쥬게이트 2399-DM1의 세포독성을 나타낸다 (실시예 8 참조).

도 26은 이소타입 대조구 1428-DM1과 비교할 때, PC3.gD인간 PSCA 클론 4 세포에 대한 항체 컨쥬게이트 2761-DM1의 세포독성을 나타낸다 (실시예 8 참조).

도 27은 항원-음성 PC3.Neo 세포에서 항체-DM1 컨쥬게이트의 독성이 없음을 나타낸다 (실시예 8 참조).

도 28은 마우스 모델에서 PSCA-발현 세포 (PC3 인간 전립선 종양 세포)가 생장하는 것을 보여주는데, 여기서 마우스는 독소가 결합되어 있지 않은 항체 또는 DM1-결합 항체로 치료하였다. 항-PSCA 항체는 2399 또는 6B8, 및 대조구 항체로 작용하는 항-돼지풀 항체 1428이었다 (실시예 9 참조).

<바람직한 실시양태의 상세한 설명>

본원에 사용된 인간 "PSCA" 또는 "전립선 줄기세포 항원"은 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)이 앵커링된 단백질로서 세포 표면에 발현되는, 123개 아미노산으로 이루어진 단일 서브유닛 당단백질을 말하는데, 이 당단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 예를 들어, 미국 특허 제5,856,136호 (SCAH2; 서열 4); WO 99/14328 (PR0232, 서열 1의 뉴클레오티드 서열, 도 1; 서열 2의 아미노산 서열, 도 2); 문헌 (Reiter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1735-1740 (1998))의 1737면의 도 2 (아미노산 서열); WO 98/51805 (서열 12 및 25); 및 WO 98/40403 (도 1A 및 1B)에 개시되어 있다. 뮤린 PSCA의 아미노산 서열은 문헌 (Reiter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1735-1740 (1998))의 1737면에 있는 도 2에 기재되어 있다. 상기 단백질의 아미노-말단에는 신호 서열이 있고 카르복시-말단에는 GPI-앵커링 서열이 존재한다. 인간 PSCA 서열에서, 아미노산 1-20은 성숙 단백질에서 절단되는 N-말단 신호 서열을 나타내고, 아미노산 위치 100-123은 C-말단 GPI-앵커링 서열 (Reiter et al., 1998, 도 2 참조)을 나타낸다. 따라서, 아미노산 21 내지 약 100은 세포 표면에 있을 것으로 추측된다. 본원에 사용된 PSCA에는 PSCA의 생물학적 활성을 나타내는 대립유전자 변이체 단백질 및 보존 치환 돌연변이체 단백질이 포함된다. 이들 대립유전자 변이체 및 보존 치환 돌연변이체는 GPI-결합 또는 분비 형태의 PSCA 단백질일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체" (Ab)에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (단, 이들은 원하는 생물 활성을 나타내어야 함)가 포함된다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)는 본원에서 "항체"와 상호교환 가능하게 사용된다.

"단리된 항체"는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인, 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 그 예로는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정시 95 중량%를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량%를 넘는 정도까지, (2) 원심분리 컵 시퀘네이터 (sequenator)를 사용시 15개 이상의 잔기로 구성된 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 코마시에 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 수행시 균일한 정도까지 정제한다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 원위치 항체가 포함되는데, 이는 1종 이상의 항체 천연 환경 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 1종 이상의 정제 단계로 제조될 것이다.

기본적인 4-쇄 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 헤테로테트라머 당단백질이다 (IgM 항체는 J 쇄라 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 헤테로테트라머 단위로 구성되어 있으므로, 10개의 항원 결합 부위를 함유하지만, 분비되는 IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 2-5개의 기본적인 4-쇄 단위를 포함하는 다가 집합체를 형성할 수 있음). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 대체적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L쇄는 하나의 공유결합성 이황화 결합에 의해 H쇄에 연결되어 있지만, 두 개의 H쇄는 H쇄 이소타입에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 각 H쇄 및 L쇄에는 일정한 간격을 두고 있는 쇄내 이황화 가교가 존재한다. 각 H쇄의 N-말단에는 가변 도메인 (V_H)가 있고, 이 도메인 다음에는 α및 γ쇄 각각에 대해 3개의 불변 도메인 (C_H), 및 μ및 ε이소타입에 대해 4개의 CH 도메인이 있다. 각 L쇄의 N-말단에는 가변 도메인 (V_L)이 있고, C-말단에는 불변 도메인 (CL)이 있다. V_L은 V_H와 정렬되어 있고, C_L은 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)과 정렬되어 있다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다. V_H와 V_L의 페어링 (pairing)은 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 다양한 클래스의 항체의 구조 및 성질에 대해서는 예컨대, 문헌 (Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6)을 참조한다.

임의의 척추동물 종의 L쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 및 람다로 불리는 명백히 다른 두 가지 타입 중 하나일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄 (C_H)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 다양한 클래스 (class) 또는 이소타입 (isotype)으로 나누어질 수 있다. 5 클래스의 이뮤노글로불린, 즉 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭되는 중쇄가 있는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있다. γ 및 α클래스는 C_H 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 작은 차이점을 기초로 하여 서브클래스로 더 분류되는데, 예를 들어, 인간은 서브클래스 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2를 발현한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 단편이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타내는 사실을 말한다. V 도메인은 특정한 항원과 각 특정 항체의 항원 결합을 매개하고 특정한 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 한정한다. 그러나, 이러한 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신에, V 영역은 길이가 9-12개 아미노산인 "초가변 영역"으로 불리는, 가변성이 극도로 높은 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15-30개 아미노산으로 구성된 골격 영역 (FR)으로 불리는 상대적 불변 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-쉬이트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-쉬이트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는, 상기 β-쉬이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 밀접하게 유지되어 있고, 기타 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 도움이 된다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데에는 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 각종 이펙터 기능을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는, 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 이러한 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 (V_L) 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 (V_H) 내의 잔기 1-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예: V_L 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 V_H 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 항체이다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법으로 항체를 생성하는 것을 필요로 한다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지 부분이 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 목적하는 활성을 나타내는, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체가 포함된다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]. 본원에서 원하는 키메라 항체에는 비-인간 "영장류" (예: Old World Monkey, Ape 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 항체가 포함된다.

"무손상" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (C_L)과 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3 중 적어도 하나를 포함하는 항체이다. 이러한 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예: 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.

"항체 단편"은 바람직하게는 무손상 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함하는, 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아보디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 있다.

항체를 파파인으로 절단하면 "Fab" 단편으로 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. Fab 단편은 H쇄의 가변 영역 도메인 (V_H) 및 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)과 함께 전체 L쇄를 구성한다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 대해 단가이고, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 이가 항원-결합 활성을 나타내는, 2개의 이황화 결합을 갖는 Fab 단편에 대체적으로 상응하며, 가교-결합 항원일 수 있는 큰 단일 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다. 또한, Fab' 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역에 하나 이상의 시스테인이 존재하는 것을 비롯하여 중쇄 C_H1 영역의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 하나 이상의 자유 티올 기가 있는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래, 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖고 있는 한 쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.

Fc 단편은 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 두 H쇄의 카르복시-말단 부위를 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되는데, 이 영역은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부위이기도 하다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 이루어진다. 이들 두 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H쇄 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 1개의 가변 도메인 (또는 특정 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)이, 전체 항원 부위보다 낮은 친화성이긴 하지만 항원을 인식하여 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.

"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드쇄로 연결되는 V_H 및 V_L 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H 도메인과 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 고찰은 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조할 수 있다.

용어 "디아보디"는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)가 있는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 제작하여 V 도메인의 쇄내 페어링이 아닌 쇄간 페어링을 형성시킴으로써 이가 단편, 즉 두 개의 항원-결합 부위가 있는 단편을 생성시켜 제조한 작은 항체 단편을 말한다. 이중특이적 디아보디는 두 항체의 V_H 및 V_L 도메인이 다른 폴리펩티드쇄에 존해하는 두 개의 "교차" sFv 단편으로 구성된 이종이량체이다. 디아보디는, 예를 들어 문헌 [EP 404 097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드 (예를 들면, 항체)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물 종으로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, PSCA의 아미노산 서열 변이체와 천연 PSCA의 상동성은 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 90% 이상일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내 특정 위치에 치환, 결실 및(또는) 삽입이 있을 수 있다.

항체의 "기능성 단편 또는 동족체"라는 어구는 정성학적으로 전장 항체와 동일한 생물 활성을 나타내는 화합물이다. 예를 들어, 항-IgE 항체의 기능성 단편 또는 동족체는 IgE 이뮤노글로불린이 고친화성 수용체인 FcεRI에 결합하는 능력을 나타내는 것을 방해하거나 실질적으로 상기 능력을 감소시키는 방식으로 IgE 이뮤노글로불린에 결합할 수 있는 것이다.

"상동성"은 필요에 따라 최대 상동성(%)을 달성하기 위하여, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율 (%)로서 정의된다. 정렬 방법 및 이를 위한 컴퓨터 프로그램은 당분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중의 하나가 "Align 2" [Genentech, Inc.에 의해 제작되어, 1991년 12월 10일자로 United States Copyright Office (Washington, DC 20559)에 사용자 문서분류 시스템으로 출원됨]이다.

비-인간 (예: 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 쥐, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 증진시키도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

본원에 사용된 바와 같이, "내재화"하는 항-PSCA 항체는 포유동물 세포 상의 PSCA (즉, 세포 표면 PSCA)에 결합할 때 세포에 의해 섭취되는 (즉, 세포 내로 들어가는) 항체를 말한다. 물론, 내재화하는 항체에는 항체 단편, 인간 또는 인간화 항체 및 항체 컨쥬게이트가 포함될 것이다. 치료용인 경우, 생체내 내재화도 고려된다. 내재화되는 항체 분자의 수는 PSCA-발현 세포, 특히 PSCA-발현 암세포를 사멸시키기에 충분하거나 적당할 것이다. 항체 또는 항체 컨쥬게이트의 효능에 따라, 몇몇 경우, 단일 항체 분자가 세포 내로 들어가는 것만으로도 항체가 결합하는 표적 세포를 충분히 사멸시킨다. 예를 들어, 일부 독소는 항체와 독소의 한 컨쥬게이트 분자의 내재화가 종양 세포의 사멸에 충분할 만큼 세포 사멸에 있어서 매우 높은 효능을 나타낸다.

항-PSCA 항체가 포유동물 세포 상의 PSCA에 결합할 때 내재화하는 지는 하기 실험예에 기재된 분석법을 비롯한 다양한 분석법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 생체내에서 내재화를 시험하기 위해, 시험 항체를 표지하고 특정 세포의 표면에 발현되는 PSCA를 갖는 것으로 알려진 동물에 도입한다. 예를 들어, 항체는 방사성 동위원소로 표지하거나 형광 또는 금 입자로 표지할 수 있다. 이 분석에 적당한 동물에는 인간 PSCA-발현 종양 이식조직 또는 이종이식조직을 함유하는 NCR 누드 마우스, 인간 PSCA로 형질감염된 세포가 도입된 마우스, 또는 인간 PSCA 트랜스진을 발현하는 형질전환 마우스와 같은 포유동물이 포함된다. 적당한 대조구에는 시험 항체를 받지 못했거나 관련없는 항체를 받은 동물, 및 또다른 항원 (예컨대, 인간 유방 종양 세포주 (실시예 3에서 MCF-7)에 발현된 HER2에 결합하는 HERCEPTIN)과 결합시 내재화되는 것으로 알려진, 원하는 세포 상의 또 다른 항원에 대한 항체를 받은 동물이 포함된다. 항체는 예를 들어, 정맥내 주사에 의해 동물에게 투여할 수 있다. 적당한 시간 간격에서, 공지된 방법 또는 하기 실험예에 기재된 방법을 이용하여 동물의 조직 절편을 얻고 광학 현미경 또는 전자 현미경으로 내재화뿐만 아니라 세포에서 내재화된 항체의 위치를 분석하였다. 시험관내 내재화의 경우, 세포는 배양 배지에 첨가된 관련있는 항체의 존재 또는 부재 하에 조직 배양 디쉬에서 배양하여 원하는 시점에서 현미경 분석에 사용될 수 있다. 내재화 표지 항체가 세포에 존재하는 것은 현미경, 또는 방사성 동위 원소로 표지된 항체가 사용된 경우에는 오토래디오그래피 (autoradiography)를 이용하여 직접 육안으로 관찰할 수 있다. 별법으로, 생화학적 정량 분석에서, PSCA-발현 세포를 포함하는 세포 집단을 시험관내 또는 생체내에서 방사성 동위 원소로 표지된 시험 항체와 접촉시키고, 세포 (생체내에서 접촉시킨 경우, 세포를 적당한 시간 후에 단리함)를 프로테아제로 처리하거나 산으로 수세하여 세포 표면 상에 존재하는 내재화되지 않은 항체를 제거한다. 세포를 분쇄하고, 세포 균질물을 신틸레이션 (scintillation) 카운터에 통과시킴으로써 회분식 세포 배양물 각각의 분 당 방사능 카운트 (cpm)로 표시되는 프로테아제 내성 정도를 측정한다. 방사성 동위 원소로 표지된 항체의 공지된 특이적 활성을 기초로, 세포 당 내재화된 항체 분자 수를 분쇄된 세포의 신틸레이션 카운트로부터 유추할 수 있다. 예를 들어, 세포를 배양 디쉬 또는 플라스크 중의 배양 배지에 첨가하고 상기 항체를 배지와 잘 혼합하여 세포가 항체에 균일하게 노출되도록 함으로써 세포를 시험관내에서 바람직하게는 용액 형태의 항체와 "접촉"시킨다. 배양 배지에 항체를 첨가하는 대신에, 소정의 시간 동안 시험 튜브에 함유된 PBS와 같은 등장 용액 중의 시험 항체와 세포를 접촉시킬 수 있다. 생체내에서, 세포는 하기 투여 방법과 같은, 시험 항체의 투여에 적합한 임의의 방법으로 환자에게 투여되는 항체와 접촉한다.

생체내에서 PSCA 발현 세포와 항체의 결합시 항체의 내재화율이 빠를수록, 표적 PSCA-발현 세포에 대한 예컨대, 세포독성 이뮤노컨쥬게이트의 원하는 사멸 또는 생장 억제 효과를 더 빨리 얻을 수 있다. 바람직하게는, 항-PSCA 항체의 내재화 속도는 상기 항체가 PSCA-발현 표적 세포를 신속히 사멸시킬 수 있는 속도이다. 그러므로, 항-PSCA 항체는 바람직하게는 생체내에서 항체 투여 후 24시간 내, 보다 바람직하게는 약 12시간 내, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 30분 내지 1시간 내, 가장 바람직하게는 약 30분 내만큼 빠른 내재화 속도를 나타내는 것이 바람직하다. 본 발명은 항-PSCA 항체가 생체내에 도입된 후 약 15분만큼 빨리 내재화하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 세포 표면 상의 PSCA와 결합시 수 시간 내에, 바람직하게는 1시간 내에, 보다 바람직하게는 15-30분 내에 세포 내로 내재화할 것이다.

시험 항체가 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체를 비롯한 본 발명의 항-PSCA 항체에 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프와의 결합을 위해 경쟁할 수 있는 지를 알아보기 위해, 크로스-블로킹 분석, 예컨대, 경쟁 ELISA 분석을 수행할 수 있다. 예시적인 경쟁 ELISA 분석에서, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅된 PSCA를 경쟁하는 후보 항체의 존재 또는 부재 하에 미리 인큐베이션한 후, 본 발명의 바이오틴-표지 항-PSCA 항체를 첨가한다. 웰 중의 PSCA 항원에 결합된 표지 항-PSCA 항체의 양은 아비딘-퍼록시다제 컨쥬게이트 및 적당한 기질을 사용하여 측정한다. 항체는 방사성 표지, 형광 표지, 또는 검출가능하고 측정가능한 기타 다른 몇몇 표지로 표지할 수 있다. 항원에 결합된 표지 항-PSCA 항체의 양은 경쟁하는 후보 항체 (시험 항체)가 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 능력과 간접적인 관련성을 가질 것이다. 즉, 동일한 에피토프에 대한 시험 항체의 친화도가 높을수록 항원으로 코팅된 웰에 결합하는 표지된 항체가 적을 것이다. 경쟁하는 후보 항체의 부재 하에 (경쟁하지 않는 공지된 항체는 존재할 수 있음) 병행된 대조구와 비교할 때 상기 후보 항체가 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상만큼 PSCA 항체의 결합을 차단할 수 있는 경우, 상기 후보 항체는 본 발명의 항-PSCA 항체에 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 실질적으로 결합하거나 상기 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 항체로 간주된다. 이 분석의 변법을 수행하여 동일한 정량값에 도달할 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다.

예를 들어, 모노클로날 항체 10E3, 6F8, 8D11 및 5F2 중 어느 하나로 지칭되는 항체의 "생물학적 특징"을 가진 항체는 이를 동일한 항원 (예: PSCA)과 결합하는 기타 항체와 구별시키는 항체의 생물학적 특징을 한 가지 이상 보유하고 있는 항체이다. 예를 들면, 6F8의 생물학적 특징을 나타내는 항체는 생체내에서 PSCA 발현 종양 세포에만 특이적으로 인식할 수 있어 생체내에서 포유동물 세포 상의 PSCA에 결합할 때 내재화할 6F8 (예를 들어, PSCA와 모노클로날 항체 6F8의 결합에 대해 경재하거나 상기 결합을 방해하는 것)에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 것이다.

용어 "길항제" 항체는 광범위한 의미로 사용되고, 본원에 개시된 천연 PSCA 단백질의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 방해, 차단 또는 중화하는 항체를 포함한다. PSCA 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법은 PSCA 폴리펩티드, 또는 세포 표면에 PSCA를 발현하는 세포와 후보 길항제 항체를 접촉시키고 정상적으로 PSCA 폴리펩티드와 관련되어 있는 1종 이상의 생물 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

"PSCA를 발현하는 종양 세포의 생장을 억제하는 항체" 또는 "생장 억제" 항체는 PSCA를 발현 또는 과발현하는 암세포에 결합하여 상기 암세포의 측정가능한 생장 억제를 일으키는 항체이다. 바람직한 생장 억제 항-PSCA 항체는 적당한 대조구와 비교할 때 20%보다 더 높은, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%, 보다 바람직하게는 50%보다 더 높은 (예컨대, 약 50% 내지 약 100%) 정도까지 PSCA-발현 종양 세포의 생장을 억제하는데, 상기 대조구는 전형적으로 시험될 항체로 처리되지 않은 종양 세포이다. 생장 억제는 세포 배양물 중의 약 0.1 내지 30 ㎍/㎖ 또는 약 0. 5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이 때 생장 억제는 종양 세포를 항체에 노출하고 1 내지 10일이 지난 후 측정한다. 생체내 종양 세포의 생장 억제는 하기 실험예 단락에 기재된 바와 같이 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-PSCA 항체의 투여가 항체의 첫 투여로부터 약 5일 내지 약 3개월, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양의 크기 또는 종양 세포의 증식을 감소시키는 경우, 상기 항체는 생체내에서 생장 억제 효과를 나타낸 것이다.

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편형성 (fragmentation), 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편형성, 및(또는) 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성으로 확인된 바와 같이 계획된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 이러한 세포는 통상적으로, PSCA를 과발현하는 것이다. 바람직하게는, 상기 세포는 종양 세포, 예를 들면 전립선암, 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 폐암, 신장암, 결장암, 방광암 세포이다. 각종 방법을 이용하여 아폽토시스와 연관된 세포 이벤트를 조사할 수 있다. 예를 들면, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편형성은 DNA 래더링 (laddering)을 통하여 평가할 수 있고, DNA 단편형성과 함께 일어나는 핵/염색체 수축은 하이포디플로이드 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도하는 항체는 아넥신 결합 분석에 있어서 처리되지 않은 세포와 비교하여 아넥신 결합의 유도를 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배만큼 유도하는 항체이다.

항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말하고, 항체 이소타입마다 다르다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합성; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화가 있다.

"항체-의존적 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs)에 결합된 분비 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원을 발현하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 표적 세포를 세포독소로 사멸시키게 하는 세포독성 형태를 말한다. 항체는 세포독성 세포의 무기이고 이러한 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 원하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 부가적으로, 원하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 말한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체와 얼터네이티브 스플라이싱 (alternative splicing) 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 그의 세포질 도메인에서만 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcR에 대해서는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 앞으로 동정될 것을 포함한 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 상기 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들면 혈액으로부터 단리할 수 있다.

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시키는 능력을 말한다. 고전적인 보체 활성화 경로는 보체의 동종 항원과 결합하는 분자 (예: (적절한 서브클래스의) 항체)에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 결합시킴으로써 개시한다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.

용어 "암" 및 "암적인"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징적으로 하는, 포유동물의 생리학적 증상을 말한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암 (예: 상피 편평 세포암), 소(小)세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종을 포함한 폐암, 복막암, 간암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요도암, 간종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 흑색종 및 B-세포 림프종, 뇌암 뿐만 아니라 두경부암, 및 관련 전이가 포함된다.

"PSCA-발현 세포"는 세포 표면에 내인성 PSCA 또는 형질감염된 PSCA를 발현하는 세포이다. "PSCA-발현 암"은 PSCA 단백질이 세포 표면에 존재하는 세포를 포함하는 암이다. "PSCA-발현 암"은 항-PSCA 항체가 암세포의 표면 상의 PSCA와 결합하여 암에 대한 치료 효과를 나타내도록 그의 세포 표면에 충분한 수준의 PSCA를 발현한다. PSCA를 "과발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비-암적인 세포와 비교할 때, 그의 세포 표면에 상당히 높은 수준의 PSCA를 발현하는 암이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 야기될 수 있거나 전사 또는 번역 증가에 의해 유발될 수 있다. PSCA 과발현은 세포 표면 상에 존재하는 PSCA 단백질의 증가 수준을 (예를 들면, 면역조직화학 분석 (IHC); FACS 분석을 통해) 측정함으로써 진단 또는 예후 분석에서 확인할 수 있다. 또다른 방법으로는, 또는 부가적으로, 예를 들어 형광성 원위치 혼성화 [FISH; WO 98/45479 (1998년 10월에 공개됨) 참조], 서던 블롯팅, 노던 블롯팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들면 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통하여 세포에서 PSCA-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. 또한, 항체-기재의 분석을 이용하여 혈청과 같은 생체액 중의 자유 항원을 측정함으로써 PSCA 과발현을 조사할 수도 있다 [미국 특허 제4,933,294호 (1990. 6. 12자로 허여됨); WO 91/05264 (1991. 4. 18자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995. 3. 28자로 허여됨); 및 문헌 (Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990) 참조]. 상기 분석법들과는 별도로, 숙련인은 각종 생체내 분석법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 환자 신체 내의 세포를 탐지 가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 임의로 표지한 항체에 노출시킬 수 있는데, 이러한 항체가 환자 세포에 결합되어 있는 지의 여부는, 예를 들면 방사능에 대해 외부 스캐닝하거나 항체에 노출시키기 이전에 환자로부터 추출한 생검을 분석함으로써 확인할 수 있다. PSCA-발현 암에는 전립선암, 방광암, 폐암, 요도암 및 유방암이 포함된다.

암을 치료하거나 암의 증상을 완화시키기 위한 "포유동물"는 인간, 가축 및 축산용 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예를 들면 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함한 임의의 포유동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물는 인간이다.

"치료하는", "치료" 또는 "완화"는 치료학적 치료 및 예방학적 처치 둘다를 말하는데, 여기서 치료 또는 예방하고자 하는 병리학적 증상 또는 질환을 예방하거나 경감시키는 것이 목적이다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 질환을 앓는 대상체뿐만 아니라, 질환을 앓기 쉬운 대상체 또는 질환이 예방되어야 하는 대상체가 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 치료 유효량의 항-PSCA 항체가 투여된 후, PSA 수준의 감소; 암세포 수의 감소 또는 암세포의 부재; 종양 크기의 감소; 연조직 또는 뼈로 암이 퍼지는 것을 비롯하여 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 생장의 억제 (어느 정도까지); 특정한 암과 관련된 1종 이상의 증상의 경감 (어느 정도까지); 감소된 사망률 및 실패율, 및 삶의 질의 개선 중 한 가지 이상이 환자에서 관찰가능하고(하거나) 측정가능한 정도로 감소되거나 나타나지 않은 경우, 대상체 또는 포유동물는 PSCA-발현 암에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다". 항-PSCA 항체가 기존 암세포의 생장을 방해하고(하거나) 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도이면, 상기 항체는 세포증식억제성 및(또는) 세포독성을 나타낼 수 있다. 이러한 징후 또는 증상의 감소도 환자가 느낄 수 있다.

성공적인 치료 및 질병의 호전을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 공지된 통상의 방법으로 용이하게 측정할 수 있다. 암 치료의 경우, 치료 효능은 예를 들어, 질환 진행에 소요되는 시간 (TTP) 및(또는) 반응률 (RR)을 측정함으로써 측정할 수 있다. 전립선암의 경우, 치료의 진행은 통상적으로 혈청 PSA (전립선 특이적 항원) 수준을 측정하는 통상적인 방법으로 평가할 수 있는데, 혈액 중의 PSA의 수준이 높을수록 암이 보다 많이 진행된 것이다. PSA의 검출을 위한 시판되는 분석 키트, 예컨대, 하이비테크 탠덤-E (Hybitech Tandem-E) 및 하이비테크 탠덤-R PSA 분석 키트, 양 프로스체크 (Yang ProsCheck) 폴리클로날 분석 키트 (Yang Labs, Bellevue, WA), Abbott Imx (Abbott Labs, Abbott Park, IL) 등을 사용할 수 있다. 전이는 병기분류 시험 및 뼈 스캔과 시험으로 칼슘 수준, 및 뼈로 암이 퍼졌는 지 확인하기 위한 기타 효소를 측정함으로써 확인할 수 있다. CT 스캔을 수행하여 골반 및 림프절에 암이 퍼져있는 지 알아볼 수도 있다. 흉부 X-선, 및 공지된 방법에 의한 간 효소 수준의 측정을 이용하여 폐 및 간 각각에 전이되었는 지를 확인한다. 암을 모니터링하기 위한 다른 통상적인 방법에는 직장횡단 초음파검사법 (TRUS) 및 직장횡단 침생검법 (TRNB)이 포함된다.

보다 국한된 암인 방광암의 경우, 암의 진행을 알아보는 방법에는 방광경검사에 의한 비뇨기 세포 검사, 혈액이 소변에 존재하는 지를 모니터링하는 검사, 음파 홀로그래피 또는 정맥내 신우 촬영에 의한 요로상피관의 관찰, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 자기공명 영상법이 포함된다. 원거리 전이의 존재는 복부 CT, 흉부 X-선, 또는 골격의 방사성핵종 영상화로 조사할 수 있다.

"치료 유효량"이란 용어는 포유동물에서 특정 질병이나 장애를 치료하는 데 효과적인 항체 또는 약물의 양을 말한다. 암의 경우에는, 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소키기며; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제시키고 (즉, 어느 정도는 느리게 하고 바람직하게는 중지시킴); 종양 전이를 억제시키며 (즉, 어느 정도는 느리게 하고 바람직하게는 중지시킴); 종양 생장을 어느 정도를 억제시키고(시키거나) 해당 암과 관련된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. "치료"의 이전 정의를 참조한다. 약물이 기존 암세포의 생장을 억제하고(하거나) 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도이면 약물이 세포증식 억제 활성 및(또는) 세포독성을 나타낸다고 할 수 있다.

"만성" 투여란 초기 치료 효과 (활성)가 연장된 일정 기간 동안 유지되도록 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 약제를 투여하여 하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단하지 않고 연속해서 수행하는 것이라기 보다는 주기적으로 수행하는 치료이다.

1종 이상의 다른 치료제와 "병행된" 투여는 동시 (함께) 투여하거나 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "담체"에는 사용된 투여량 및 농도에서 그에 노출된 세포 또는 포유동물에 독성을 나타내지 않는, 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화가 포함된다. 종종 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예에는 포스페이트, 쉬이트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 슈가 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및(또는) TWEEN (상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS (상표명)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 말한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예: At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이트), 독소루비신, 메팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제 (intercalating agent); 핵산분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 독소, 예를 들면 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체를 포함함); 및 아래에 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다. 다른 세포독성제는 아래에 기재되어 있다. 항종양제는 종양 세포를 파괴한다.

본원에 사용된 "생장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포, 특히 PSCA 발현 암 세포의 생장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 이러한 생장 억제제는 S 주기에서의 PSCA 발현 세포의 비율을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 생장 억제제의 예로는 (S 주기 이외의 주기에서) 세포 사이클 진행을 차단시키는 약제, 예를 들면 G1 정지와 M-주기 정지를 유도하는 약제가 있다. 종래의 M-주기 차단제에는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들면 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1 정지 여파로 S-주기 정지를 가져다 주는 약제는 예를 들면, DNA 알킬화제, 예를 들면 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C이다. 더 자세한 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic dr㎍s" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]에 기재되어 있다. 탁산 (팩클리탁셀 및 독세탁셀)은 둘다 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 독세탁셀 (TAXOTERE (등록상표), Rhone-Poulenc Rorer)은 팩클리탁셀 (TAXOL(등록상표); Bristol-Myers Squibb)의 반합성 동족체이다. 팩클리탁셀 및 독세탁셀은 튜불린 이량체가 마이크로튜불로 어셈블리되는 것을 촉진하고 세포의 유사분열을 억제하는 탈중합 (depolymerization)을 방해함으로써 마이크로튜불을 안정시킨다.

본원에 사용된 "표지"는 항체에 직ㆍ간접적으로 결합하여 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나, 효소 표지의 경우 검출가능한, 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "에피토프 태깅된"은 "태그 폴리펩티드"에 연결된 항-PSCA 항체 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에는 충분하지만, 그에 융합되는 Ig 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 만큼 충분히 짧은 잔기를 갖는다. 또한, 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 매우 독특한 것이다. 적당한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10개 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.

본원에서 "소분자"는 분자량이 약 500 달톤 미만인 분자로 정의한다.

용어 "포장 삽입체"은 통상적으로 시판되는 치료 제품의 포장 내에 포함되며 증상에 대한 정보, 용도, 투여량, 투여, 금기 사항 및( 또는) 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고를 포함하는 설명서를 말하는 데 사용된다.

"단리된 핵산"은 다른 게놈 DNA 서열뿐만 아니라 리보좀 및 폴리머라제와 같은 단백질 또는 결합체로부터 실질적으로 분리되어 있으며 자연적으로 천연 서열을 수반하는 핵산, 예를 들어, RNA, DNA 또는 혼합 중합체이다. 이 용어에는 자연 발생적 환경으로부터 분리되어 있는 핵산 서열이 포함되고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리체 및 화학적으로 합성된 동족체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 동족체가 포함된다. 실질적으로 순수한 분자에는 단리된 형태의 분자가 포함된다.

"벡터"에는 셔틀 벡터 및 발현 벡터가 포함된다. 전형적으로, 플라스미드 제작물은 복제 기점 (예를 들어, ColE1 복제 기점) 및 선별가능한 마커 (예를 들어, 암피실린 또는 테트라시클린 내성)도 포함하므로 상기 플라스미드 제작물은 박테리아 내에서 복제할 수 있고 선별될 수 있다. "발현 벡터"란 박테리아 또는 진핵 세포에서 본 발명의 항체 단편을 비롯한 항체를 발현시키는 데 필요한 조절 서열 또는 조절 요소를 포함하는 벡터를 말한다. 적당한 벡터는 아래에 기재되어 있다.

본 발명의 항-PSCA 항체를 생산하는 세포에는 모하이브리도마 (parent hybridoma), 예컨대, ATCC에 기탁된 하이브리도마뿐만 아니라, 항체를 코딩하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵 숙주 세포도 포함될 것이다.

II. 본 발명의 조성물 및 방법

본 발명은 항-PSCA 항체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 항-PSCA 항체는 포유동물 세포의 세포 표면 PSCA에 결합할 때 내재화한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 항-PSCA 항체는 PSCA를 발현하는 종양 세포를 파괴시키거나 상기 종양 세포의 파괴를 유도한다.

GPI가 앵커링된 분자의 내재화 경로 및 내재화 속도는 클래쓰린 코딩 수용체-매개 내재화 경로만큼 잘 연구되어 있지는 않다. PSCA가 내재화할 수 있다는 것은 확실하지 않았다. 또한, 내재화하는 항체의 능력은 항체의 친화도, 산염기도 (avidity) 및 이소타입, 및 항체가 결합하는 에피토프를 비롯한 여러 인자에 달려 있다. 본 발명자들은 본원에서 GPI가 결합된 세포 표면 PSCA가 본 발명의 항-PSCA 항체와 결합할 때 내재화할 수 있다는 것을 입증한다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 항-PSCA 항체가 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포에 특이적으로 결합하여 이들 세포를 억제하거나 사멸시킬 수 있는 것을 입증하였다. 항-PSCA 항체가 생체내에서 종양에 특이적으로 결합하여 내재화하고 종양의 생장을 억제하는 성질을 나타내기 때문에, 이들 항체는 치료, 예를 들어, 전립선암, 요도암 및 폐암을 비롯한 다양한 암의 치료에 매우 적합하다. 항-PSCA 항체의 내재화는 예를 들어, 항체 또는 항체 컨쥬게이트에 세포내 작용 부위가 있고 항체에 결합된 세포독성제 (예를 들어, 독소, 칼리케아미신)가 원형질 (plasma)을 용이하게 통과하지 못하는 경우 바람직하다. 내재화는 항체 또는 항체에 결합된 세포독성제에 세포내 작용 부위가 없는 경우, 예를 들어, 항체가 ADCC 또는 기타 다른 메카니즘으로 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 경우에는 불필요하다.

본 발명의 항-PSCA 항체는 다양한 비-치료 분야에 사용할 수도 있다. 전립선암의 스크리닝 또는 진단을 위한 수단으로서 PSA를 사용하는 것이 논쟁의 여지가 있기 때문에, 본 발명의 항-PSCA 항체는 PSCA-발현 암의 진단 및 병기분류 (예를 들어, 방사성영상화)에 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 시험관내에서 PSCA를 검출하고 정량하기 위해 세포로부터 PSCA를 정제하고 면역침전시켜, 다른 세포의 정제에 있어서 혼합된 세포 집단으로부터 PSCA-발현 세포를 한 단계로 사멸시키고 제거하는 데에도 유용하다

본 발명의 내재화 항-PSCA 항체는 본원의 "항체"의 정의에 포함되는 다양한 형태일 수 있다. 따라서, 항체에는 전장 또는 완전한 형태의 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화 항체, 키메라 또는 융합 항체, 이뮤노컨쥬게이트, 및 그의 기능성 단편이 포함된다. 융합 항체에서, 항체 서열은 이종 폴리펩티드 서열에 연결된다. 항체는 원하는 이펙터 기능을 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 하기 단락에서 보다 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 세포 표면에 결합되어 있으며 적당한 Fc 영역을 포함하는 노출 항체는 예를 들어, 항체-의존적 세포독성 (ADCC)을 통해, 또는 보체 의존성 세포독성 기작에 의한 보체의 순환이나 기타 다른 메카니즘을 통해 세포독성을 유도할 수 있다. 별법으로, 이펙터 기능을 제거하거나 감소시켜 부작용 또는 치료 합병증을 최소화시키는 것이 바람직한 경우, 특정한 다른 Fc 영역을 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에 결합하기 위해, 또는 실질적으로 결합하기 위해 경쟁한다. 본 발명의 항-PSCA 항체의 생물학적 특성을 나타내는 항체에는 예를 들어, ATCC 기탁 번호 제PTA-717호, 제PTA-718호, 제PTA-719호, 제PTA-720호, 제PTA-880호, 제PTA-2265호 또는 제PTA-2264호의 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 생물학적 특성, 구체적으로 생체내에서 종양에 특이적으로 결합하는 성질, 내재화하는 성질, 및 세포 증식을 억제하거나 세포에 독성을 나타내는 성질을 비롯한 생물학적 성질을 나타내는 항-PSCA 항체도 포함된다.

구체적으로, 서열 1에 기재된, 인간 PSCA의 아미노산 21-40, 41-60, 61-80 또는 81-100에 존재하는 에피토프에 결합하는 항-PSCA 항체를 제공한다.

상기 항체를 생산하는 방법은 아래에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 항-PSCA 항체는 포유동물의 PSCA-발현 암을 치료하거나 상기 암의 1종 이상의 증상을 완화시키는 데 유용하다. 이러한 암에는 전립선암, 요도암, 폐암, 유방암, 결장암 및 난소암, 보다 구체적으로, 전립선 선암종, 신장 세포암종, 결장직장 선암종, 폐 선암종, 폐 편평세포암종 및 흉막 중피종이 포함된다. 암에는 상기 임의의 전이성 암, 예를 들어, 전립선암 전이도 포함된다. 항체는 포유동물에서 PSCA를 발현하는 암세포의 적어도 일부와 결합할 수 있고 바람직하게는 HAMA 반응을 유도하거나 최소화하지 않는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 세포 상의 PSCA와 결합시 시험관내 또는 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포를 파괴 또는 사멸시키거나, 상기 종양 세포의 생장을 억제하는 데 효과적이다. 이러한 항체에는 노출 항-PSCA 항체 (어떤 물질도 결합되어 있지 않은 항-PSCA 항체)가 포함된다. 생체내에서 종양 생장 억제 성질을 나타내는 노출 항-PSCA 항체에는 하기 실험예에 기재된 항체가 포함된다. 세포독성 또는 세포 생장 억제 성질을 나타내는 노출 항체는 종양 세포를 파괴시키는 항체의 효능을 훨씬 더 강하게 하는 세포독성제와 결합시킬 수도 있다. 예를 들어, 항체를 세포독성제와 결합시켜 하기 이뮤노컨쥬게이트를 형성함으로써 세포독성을 항-PSCA 항체에 부여할 수 있다. 세포독성제 또는 세포 생장 억제제는 바람직하게는 소분자이다. 칼리케아미신 또는 메이탄시노이드와 같은 독소 및 그의 동족체나 유도체가 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 항-PSCA 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 암을 치료하기 위해, 상기 조성물을 암의 치료가 필요한 인간에게 투여할 수 있는데, 여기서, 상기 조성물은 이뮤노컨쥬게이트로서 존재하는 1종 이상의 항-PSCA 항체 또는 노출 항체를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화학요법제를 비롯한, 세포독성제 또는 생장 억제제와 같은 다른 치료제와 함께 이들 항체를 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항-PSCA 항체 및 담체를 포함하는 제제도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 제제이다.

본 발명의 또다른 측면은 내재화 항-PSCA 항체를 코딩하는 단리된 핵산이다. H 또는 L 쇄 둘다와 특히 초가변 영역 잔기를 코딩하는 핵산, 천연 서열 항체를 코딩하는 핵산, 및 이 항체의 변이체, 변형체 및 인간화 항체를 코딩하는 핵산도 포함된다.

본 발명은 치료 유효량의 내재화 항-PSCA 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PSCA-발현 암을 치료하거나 상기 암의 1종 이상의 증상을 완화시키는 데 유용한 방법도 제공한다. 항체 치료 조성물은 의사가 지시한 바와 같이 단기간 (급성) 또는 장기간 투여하거나 간헐적으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명은 PSCA를 발현하는 세포의 생장을 억제하고 상기 세포를 사멸시키는 방법도 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 1종 이상의 내재화 항-PSCA 항체를 포함하는 키트 및 제품도 제공한다. 항-PSCA 항체를 함유하는 키트는 예를 들어, PSCA 세포의 사멸을 분석하는 데, 세포로부터 PSCA를 정제하거나 면역침전시키는 데 사용한다. 예를 들어, PSCA의 단리 및 정제를 위해서는, 상기 키트는 비드 (예컨대, 세파로스 비드)에 커플링된 항-PSCA 항체를 함유할 수 있다. 시험관내에서 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 PSCA를 검출하고 정량하기 위한 항체를 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 검출에 유용한 항체는 형광 표지 또는 방사성 표지와 같은 표지와 함께 제공할 수 있다.

III. 항-PSCA 항체의 생산

본 발명에 유용한 항체의 생산을 위한 예시적 기술은 아래에 기재되어 있다. 이들 기술 중 몇몇은 실시예 1 및 표 2A에 더 기재되어 있다. 항체의 생산에 사용되는 PSCA 항원은 예를 들어, GPI 앵커 서열이 없는 가용성 형태의 PSCA (포스파티딜이노시톨 포스포리파제로 절단하여 얻을 수 있음)을 비롯한 전장 폴리펩티드 또는 그의 일부, 또는 상기 단백질의 선별된 부위의 합성 펩티드일 수 있다. 별법으로, 표면에 PSCA를 발현하는 세포 (예를 들어, PSCA를 과발현하도록 형질전환된 CHO 또는 NIH-3T3 세포; 전립선 종양 세포주 또는 기타 PSCA-발현 종양 세포주), 또는 이러한 세포로부터 얻은 막을 사용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 인간 및 뮤린 PSCA의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 상기한 바와 같이 사용될 수 있다. PSCA는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 박테리아 또는 진핵 세포로에서 재조합 생산하여 상기 세포로부터 단리할 수 있다. PSCA는 태깅된 (예컨대, 에피토프로 태깅된) 단백질 또는 기타 융합 단백질로서 발현되어 다양한 분석에서 단리 및 동정을 용이하게 할 수 있다. 다양한 태그 및 융합 서열에 결합하는 항체 또는 결합 단백질은 아래에 자세히 기재되어 있는 바와 같이 사용될 수 있다. 항체를 생성시키는 데 유용한 PSCA의 다른 형태도 당업자에게 자명할 것이다.

태그

다양한 태그 폴리펩티드 및 그들의 각 항체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 태그 폴리펩티드 및 그들의 항체의 예에는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘 글리신 (poly-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8 : 2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이들에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체; 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6) : 547-553 (1990)]가 포함된다. FLAG-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6 : 1204-1210 (1988)]는 항-FLAG M2 모노클로날 항체 (Eastman Kodak Co., New Haven, CT)에 의해 인식된다. FLAG 펩티드를 함유하는 단백질은 아가로스에 공유결합으로 부착된 항-FLAG M2 모노클로날 항체를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하는 면역친화 크로마토그래피로 정제할 수 있다 (Eastman Kodak Co., New Haven, CT). 다른 태그 폴리펩티드에는 KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255 : 192-194 (1992)]; an α-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266 : 15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 6393-6397 (1990)]가 포함된다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는, 관련된 항원과 면역보강제를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 여러 번 주사함으로써 동물에서 생성시킨다. 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용된 경우)을 결합시키는 것이 유용할 수 잇다. 예를 들어, 이관능성 물질 또는 유도체화제, 예를 들면 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 결합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 결합시킬 수 있다.

상기 단백질 또는 컨쥬게이트 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대한 용량임)을 3 용적의 프로인트 완전 면역보강제와 혼합한 다음 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 상기 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 면역보강제에 포함된 펩티드 또는 컨쥬게이트의 최초 양의 1/5 내지 1/10을 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스팅한다. 7일 내지 14일 후에, 상기 동물을 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 역가가 안정화될 때까지 동물을 부스팅한다. 컨쥬게이트는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 만들 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물 (예: 햄스터)을 상기 언급된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 적합한 융합화제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이로써 생성된 하이브리도마 세포를, 융합되지 않은 모 골수종 세포 (융합 파트너로도 불림)의 생장이나 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 생장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에는, 상기 하이브리도마용 선별 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 생장을 억제하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 융합 파트너인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 지지하는 세포이며, 비융합된 모세포로부터 상기 골수종 세포를 선별하는 선별 배지에 민감하다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들면 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA로부터 입수 가능함], 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 [American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA로부터 입수 가능함]이다. 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주 또한 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되었다.

하이브리도마 세포가 생장하는 배양 배지를 대상으로 하여, 상기 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법으로 측정하거나, 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들면 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들면 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 분석법 (Scatchard analysis)으로 측정할 수 있다.

일단 목적하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정하면, 클론을 제한 희석 방법으로 서브클로닝하고 표준 방법으로 생장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 예를 들어, 하이브리도마 세포를 마우스에 주사하여 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 생장시킬 수 있다.

상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 (예컨대, 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용함), 이온 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 투석에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적합하다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 시퀀싱한다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들면 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 항체 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현하는 것에 관해서는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 검토한다.

추가의 실시양태에서는, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성시킨 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 단리시킬 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 항체와 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재되어 있다. 다음 공개 문헌에는 연쇄 셔플링에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생성 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)] 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 생체내 재조합과 조합 감염 방법이 기재되어 있다 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 존립 가능한 대안이다.

항체를 코딩하는 DNA는 또한, 예를 들면 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인 서열로 대체하거나 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)], 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 연결함으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열로 대체시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 대체시켜, 항원에 대한 특이성을 나타내는 한 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대한 특이성을 나타내는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가 키메라 항체를 생성시킨다.

(iii) 인간화 항체

비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당분야에 보고되었다. 바람직하게는, 인간화 항체에는 비인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기로도 불리는데, 이 잔기는 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화 과정은 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 문헌 [Winter and co-workers, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]의 방법에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 작은 서열을 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환시킨 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호 참조)이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위의 잔기로 치환되는 인간 항체이다.

인간화 항체를 만드는 데 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄와 중쇄 둘다)의 선택은 항체가 인간 치료용인 경우 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 저하시키는 데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 V 도메인 서열과 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고 이 서열 내에 있는 인간 골격 영역 (FR)을 인간화 항체의 생산에 사용하였다 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 아그룹의 모든 인간 항체의 콘센서스 서열로부터 유래된 특정한 골격 영역을 사용한다. 동일한 골격 영역을 수 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수도 있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].

항원에 대한 고친화성 및 기타 바람직한 생물학적 특성들을 유지하도록 항체를 인간화시키는 것 또한 중요하다. 바람직한 방법에 따라서 이러한 목적을 달성하기 위해서는, 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 사용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물을 분석하는 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 이뮤노글로불린 모델은 통상 입수 가능하고 당분야의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이를 검사함으로써, 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 상기 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원과 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자와 임포트 서열로부터 선택하고 조합하여, 목적하는 항체의 특징, 예를 들면 표적 항원(들)에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가, 항원 결합성에 영향을 미치는 데 있어서 직접적이고도 가장 실질적으로 관련되어 있다.

각종 형태의 인간화 항-PSCA 항체도 고려된다. 예를 들면, 인간화 항체는 항체 단편, 예를 들면 Fab일 수 있으며, 이것은 임의로 이뮤노컨쥬게이트를 형성시키기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)과 결합된다. 또다른 한편으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예를 들면 무손상 IgG1 항체일 수 있다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린을 생성시키지 않으면서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물 (예: 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동형 결합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제된다고 보고된 바 있다. 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 배열이 이러한 생식세포 돌연변이 마우스 내로 전달되면, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Br㎍germann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호; 제5,589,369호; 및 제5,545,807호].

별법으로, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 이용하여 비면역화 공여자의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체와 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이져 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편을 디스플레이하였다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 토대로 하여 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별한다. 따라서, 상기 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 유사하게 나타낸다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있고, 이에 대한 상세한 내용은 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터 얻은 V 유전자의 레퍼토리를 작제할 수 있고, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다 [미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조].

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체를 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조].

(v) 항체 단편

특정 환경에서, 전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 빠른 치유 (clearance)를 허용하고 고형 종양에 쉽게 접근할 수 있다.

항체 단편을 생성하기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래 항체를 단백질 분해적 분해함으로써 유도된 것이었다 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 이. 콜라이로부터 분비될 수 있으므로, 이들 항체를 쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수할 수 있고, F(ab')₂ 단편을 형성하도록 화학적으로 커플링시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab'₎₂ 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 또다른 방법에 따라서, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리할 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 기타 기술은 당분야의 숙련인에게는 명백할 것이다. 기타 실시양태에서는, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (svFv)이다 [WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조]. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 완전한 형태의 결합 부위가 있는 유일한 단편이므로, 이들은 생체내에서 사용되는 동안 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합이 일어나도록 제작할 수 있다. 항체 조작에 대해서는 상기 문헌 (Engineering, ed. Borrebaeck)을 참조한다. 이러한 항체 단편은 또한, 예를 들면 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있다.

(vi) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체이다. 예시적 이중특이적 항체는 PSCA 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 PSCA 결합 부위를 다른 단백질에 대한 결합 부위와 연결시킬 수 있다. 별법으로, 항-PSCA 아암 (arm)은 백혈구 상의 유발성 분자, 예를 들면 T-세포 수용체 분자 (예: CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 연결되어, 세포성 방어 메카니즘이 PSCA-발현성 세포에서만 집중적으로 일어나도록 할 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여, 세포독성제를 PSCA를 발현하는 세포에 국한시킬 수도 있다. 이 항체는 PSCA-결합 아암, 및 세포독성제 (예를 들면, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는방사성 동위원소 햅텐)와 결합하는 아암을 갖고 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

WO 96/16673에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 기재되어 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체가 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 기재되어 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생성 방법은 상이한 특이성을 나타내는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 함께 발현시키는 것을 기초로 한다 [Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (quadroma)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중 단지 1개만이 정확한 이중특이적 구조를 지니고 있다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는, 이러한 정확한 분자의 정제 과정이 오히려 번거로운 단계이며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정이 문헌 [WO 93/08829; and Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

상이한 방법에 따라서, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 나타내는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 연결시킨다. 이러한 연결은 바람직하게는, 힌지, C_H2 및 C_H3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 연결이다. 이러한 융합체의 하나 이상에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체을 코딩하고, 경우에 따라 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 이들을 적합한 숙주 세포 내로 함께 형질감염시킨다. 이로써, 해당 작제에 사용된, 동등하지 않은 비율의 3가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율의 원하는 이중특이적 항체를 제공하는 실시양태에서 이들 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데 있어서 유연성이 보다 더 높아진다. 그러나, 동등한 비율의 둘 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 가져다 주는 경우, 또는 이러한 비율이 원하는 쇄의 조합물의 수율에 별로 영향을 주지 않는 경우, 3가지 폴리펩티드 쇄 중의 2개 또는 이들 모두에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다.

이러한 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한 아암에 제1 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄와, 다른 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가, 바람직하지 못한 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물을 용이하게 분리시켜주는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이뮤노글로불린 경쇄가 이러한 이중특이적 분자의 절반에만 존재함으로 인해 용이한 분리 방법이 제공되기 때문이다. 이러한 방법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중특이적 항체 생성에 대한 더 자세한 내용은, 예를 들면 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 방법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면을 유전공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 비율 (%)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면에 있는 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하면 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 "케비티 (cavity)"가 생성된다. 이로써, 기타 바람직하지 못한 최종 생성물 (예: 호모이량체)에 비해 헤테로이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘이 제공된다.

이중특이적 항체는 가교결합 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들면 면역시스템 세포가 원치않는 세포를 특이적으로 인식하게 하고 (미국 특허 제4,676,980호) HIV 감염을 치료하도록 하는 데 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 사용된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 통상의 가교 결합법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 많은 가교결합 기술과 함께 당분야에 널리 공지되어 있으며 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 기술도 당분야의 문헌에 보고되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질 분해효소로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을, 디티올 결합체 형성제인 나트륨 아르세나이트의 존재 하에 환원시켜 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이어서, 이로써 발생된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.

최근의 과학 발달로 인해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 쉽게 회수할 수 있게 되었는데, 이러한 단편을 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성 방법이 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비시키고, 시험관내에서 직집적으로 화학적 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포와 정상적인 인간 T 세포를 결합시킬 수 있었을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 세포분해 활성을 유발시킬 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하는 각종 기술 또한 보고되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생성하였다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터 유래된 상기 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 이러한 항체 호모-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 헤테로이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 호모-이량체를 생성하는 데에도 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 메카니즘을 제공해주었다. 이러한 단편은 너무 짧아 동일한 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성시키지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H와 V_L 도메인은 또다른 단편의 상보적 V_L과 V_H 도메인과 쌍을 형성하게 됨으로써, 2개의 항원 결합성 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 방법도 문헌[Grubber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]에 기재되어 있다.

2가 이상의 항체도 고려된다. 예를 들면, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

(vii) 다가 항체

다가 항체는 이가 항체보다 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 더 빠르게 내재화할 수 있다 (있고/있거나 이화될 수 있다). 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 다른 클래스; 예를 들어, 사가 항체)일 수 있는데, 이러한 다가 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역(으로 구성되어 있거나)을 포함한다. 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 이 영역의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원의 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위(로 구성되어 있거나)를 포함한다. 상기 다가 항체는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 두 개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(Xl)_n-VD2-(X2)_n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 두 개 이상의 (바람직하게는 4개) 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드도 포함한다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 임의로 CL 도메인도 포함한다.

(viii) 기타 아미노산 서열 변형체

본원에 기재된 항-PSCA 항체의 아미노산 서열 변형체(들)도 고려된다. 예를 들면, 상기 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-PSCA 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를 상기 항-PSCA 항체 핵산에 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들면 항-PSCA 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 작제물에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능한데, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 상기 아미노산 변화는 또한, 항-PSCA 항체의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있는데, 예를 들면 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인, 항-PSCA 항체의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다. 여기서는, 표적 잔기 또는 잔기 그룹을 동정하고 (예를 들면, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 PSCA 항원의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치는, 추가 변이체 또는 기타 변이체를 치환 부위에, 또는 치환 부위 대신에 도입함으로써 세밀히 구별한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 목적하는 활성을 나타내는 발현된 항-PSCA 항체 변이체를 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입체에는 길이가 1개의 잔기에서 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 다양한 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합체 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입체도 포함된다. 말단 삽입체의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-PSCA 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항-PSCA 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예: ADEPT용 효소)와 항-PSCA 항체의 N- 또는 C-말단의 융합체가 포함된다.

또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체에는 항-PSCA 항체 분자에 있는 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 바뀐 항체이다. 치환 돌연변이유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변이체도 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환부"란 표제 하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "예시적 치환부"로 명명되거나 아미노산 클래스를 참조하여 아래에 기재된 바와 같은 보다 실재적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝된다.

<표 1>

본래의 잔기	예시적 치환기	바람직한 치환기
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp; lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르류신	leu
Leu (L)	노르류신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	Thr	thr
Thr (T)	Ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	leu

(a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 항체의 백본 (backbone)의 구조, 예를 들면 쉬이트 또는 나선형 입체 구조, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄 벌크의 유지에 대한 변형의 효과가 상당히 다른 치환부를 선택함으로써 생물학적 특성을 실질적으로 변화시킬 수 있다. 자연발생적 잔기는 통상의 측쇄 특성을 기준으로 하기와 같은 군으로 분류된다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환함으로써 이루어질 것이다.

항-PSCA 항체의 적당한 입체 구조를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기를 일반적으로 세린으로 치환하여 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 잘못된 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환한 것이다. 일반적으로, 더 개발시키기 위해 선택한 생성 변이체(들)는 이들을 생성시킨 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 나타낼 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화 성숙화과정 (affinity maturation)을 포함한다. 간략하게 언급하면, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환부가 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 본원에 기재된 바와 같이 파지-디스플레이 변이체의 생물학적 활성 (예: 결합 친화도)을 나타내는 파지-디스플레이 변이체를 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 항원 결합성에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 결합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 인간 PSCA 간의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따라서 치환하기 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 우수한 성질을 나타내는 항체를 선별하여 더 개발할 수 있다.

항체의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체 고유의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다.

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 효소를 사용하여 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 슈가 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신을 사용할 수도 있다.

글리코실화 부위가 항체에 부가되는 것은 아미노산 서열이 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항-PSCA 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 방법 (자연발생적 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-특이적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항-PSCA 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 본 발명의 항체의 항원-의존적 세포에 의해 매개되는 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 향상시키도록, 당해 항체의 이펙터 기능을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 상기 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환부를 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입함으로써, 이러한 영역에서 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 호모-이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및(또는) 증가된 보체-매개 세포 살해 능력과 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 나타낼 수 있다 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]. 향상된 항종양 활성을 나타내는 호모-이량체 항체는, 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로-이관능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수도 있다. 별법으로, Fc 영역이 중복되어 있는 항체는 향상된 보체 분해 능력 및 ADCC 능력을 나타내도록 유전공학적으로 조작할 수 있다 [Stevenson et al., Anti-Cancer Dr㎍ Design 3:219-230 (1989)].

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 상기 항체 (특히 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄ )의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는, IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.

(ix) 목적하는 특성을 나타내는 항체의 스크리닝

항체 생성 기술은 위에 기재되어 있다. 경우에 따라, 특정한 생물학적 특징을 나타내는 항체를 추가로 선별할 수 있다.

본 발명의 항-PSCA 항체의 생장 억제 효과는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 내인성 PSCA를 발현하거나 PSCA 유전자로 형질감염된 세포를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 실시예 2에 기재된 종양 세포주 및 PSCA-형질감염 세포를 다양한 농도의 본 발명의 항-PSCA 모노클로날 항체로 수 일 (예컨대, 2-7일) 동안 처리하고 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나 다른 몇몇 색밀도 측정 분석법으로 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 본 발명의 항-PSCA 항체가 존재하거나 부재하는 조건 하에서 처리된 세포에 의한 ³H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 항체 처리 후, 세포를 모으고 DNA로 혼입된 방사능의 양을 신틸레이션 카운터로 정량한다. 적당한 양성 대조구에는 선택된 세포주의 생장을 억제하는 것으로 알려진 생장 억제 항체로 처리된 세포주가 포함된다. 생체내 종양 세포의 생장 억제는 하기 실험예 단락에 기재된 바와 같은 다양한 방식으로 측정할 수 있다 (실시예 6 참조). 바람직하게는, 종양 세포는 PSCA를 과발현하는 세포이다. 바람직하게는, 항-PSCA 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖의 항체 농도에서 처리되지 않은 종양 세포와 비교할 때 약 25-100%, 보다 바람직하게는 약 30-100%, 훨씬 더 바람직하게는 약 50-100% 또는 70-100%만큼 시험관내 또는 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포의 세포 증식을 억제할 것이다. 생장 억제는 세포 배양물 중에서 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이 때 상기 생장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시키고 1-10일 후 측정한다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-PSCA 항체가 투여될 때 항체의 1차 투여로부터 약 5 일 내지 3 개월 내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소되는 경우, 항체가 생체내에서 생장 억제 효과를 나타낸다고 한다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해서, 예를 들어 프로피디움 요오드 (PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타나는 바와 같이, 막의 통합성이 손상된 정도를 대조구와 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. PSCA-발현 종양 세포는 배지만과 인큐베이션하거나 예컨대, 약 10 ㎍/㎖의 적당한 모노클로날 항체를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션시킨다. 각 처리를 수행한 후, 세포를 수세하고 35㎜ 스트레이너-캡핑 12 x 75 튜브 내로 등분하여 (튜브 당 1 ㎖, 처리 그룹 당 3 튜브) 세포 덩어리를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 g/㎖)를 넣는다. FACSCAN (상표명) 플로우 사이토미터 (flow cytometer)와 FACSCONVERT (상표명) CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정된 바와 같이 통계학적 유의적 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체를 세포 사멸 유도 항체로서 선별할 수 있다.

원하는 항체와 결합된 PSCA 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988))에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 이 분석은 시험 항체가 본 발명의 항-PSCA 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는 지를 알아보는 데 사용할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은 알라닌 스태닝과 같은 방법으로 돌연변이시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이 항체는 먼저 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험하여 적절하게 폴딩되는지 확인한다. 다른 방법에서, PSCA의 다양한 영역에 상응하는 펩티드는 시험 항체와 함께, 또는 특성이 규명된 에피토프 또는 공지된 에피토프가 있는 항체 및 시험 항체와 함께 경쟁 분석에 사용할 수 있다.

(x) 이뮤노컨쥬게이트

본 발명은 세포독성제 또는 생장 억제제와 같은 항암제에 결합되어 있는 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 사용한 치료법에 관한 것이기도 하다.

이러한 이뮤노컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제는 상술되어 있다.

항체와 하나 이상의 소분자 독소 (칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐, CC1065, 및 독소 활성을 나타내는 이들 독소의 유도체)의 컨쥬게이트도 본원에서 고려한다.

A. 메이탄신 및 메이탄시노이드

한 실시양태에서, 본 발명의 항-PSCA 항체 (전장 또는 단편)는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 결합된다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제하는 작용을 하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카산 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 [미국 특허 제3,896,111호]. 그 후, 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생산하는 것으로 밝혀졌다 [미국 특허 제4,151,042호]. 합성 메이탄시놀, 그의 유도체 및 동족체는 예를 들면, 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호 (이들 특허의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함)에 기재되어 있다.

B. 메이탄시노이드-항체 컨쥬게이트

메이탄신 및 메이탄시노이드이들의 치료 지수를 향상시키기 위한 시도로서, 메이탄신 및 메이탄시노이드를, 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 결합시켰다. 메이탄시노이드를 함유하는 이뮤노컨쥬게이트는, 예를 들면 미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있고, 이들 특허의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대한 모노클로날 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 (DM1로 명명됨)를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트가 기재되어 있다. 이러한 컨쥬게이트는 배양된 결장 암 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 디설파이드 링커를 통하여, 인간 결장 암 세포주 상의 항원과 결합하는 뮤린 항체 A7과 결합되어 있거나, 또는 HER-2/neu 종양 유전자와 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1과 결합되어 있는 이뮤노컨쥬게이트가 기재되어 있다. 이러한 TA.1-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은, 세포 당 3 x 10⁵개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 시험하였다. 이러한 컨쥬게이트 약물은 자유 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 나타내었는데, 이 때 세포독성은 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 강화시킬 수 있었다. A7-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.

C. 항-PSCA 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 (이뮤노컨쥬게이트)

항-PSCA 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 상기 항체나 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 그다지 저하시키지 않으면서 항-PSCA 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결함으로써 제조된다. 한 분자의 독소/항체조차도 메이탄시노이드가 결합되어 있지 않은 항체를 사용할 때보다 세포독성을 상승시킬 것으로 예상되었다 하더라도, 항체 당 결합되어 있는 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 상승시키는 효과를 나타내었다. 메이탄시노이드는 당분야에 널리 공지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호, 및 위에서 언급한 다른 특허 및 비특허 공보에 기재되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 방향족 환이 변형되거나 메이탄시놀 분자의 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들면 각종 메이탄시놀 에스테르이다.

항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하는 것으로 당분야에 공지된 많은 연결 기가 있으며, 이 연결기에는, 예를 들면 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 기재된 것이 포함된다. 이러한 연결 기에는 상기 언급된 특허에 기재된 바와 같은, 디설파이드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기 또는 에스테라제 불안정 기가 포함되는데, 디설파이드 및 티오에테르 기가 바람직하다.

상기 항체와 메이탄시노이드의 컨쥬게이트는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 특히 바람직한 커플링제에는 디설파이드 연결을 제공해주는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)] 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.

링커는 연결 유형에 따라서, 각종 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들면, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여, 히드록실기와 반응시켜 형성할 수 있다. 이 반응은 히드록실기가 있는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기가 있는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 이러한 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 동족체의 C-3 위치에서 형성된다.

칼리케아미신

원하는 또다른 이뮤노컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 결합되어 있는 항-PSCA 항체를 포함한다. 항생제의 칼리케아미신 족은 서브-피코몰 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 족의 컨쥬게이트를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드사의 특허임)을 참조한다. 사용될 수 있는, 칼리케아미신의 구조적 동족체에는 γ₁ ¹, α₂ ¹, α₃ ¹, N-아세틸-γ₁ ¹, PSAG 및 θ₁ ¹이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 (Hinman et al. Cancer Research 53 : 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998); 상기 미국 특허는 모두 아메리칸 시아나미드사의 특허임). 항체와 결합시킬 수 있는 또다른 항-종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA 둘다에 세포내 작용 부위가 있고, 이들은 원형질막을 용이하게 통과하지 못한다. 그러므로, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 약물을 세포내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 상승된다.

기타 세포독성제

본 발명의 항-PSCA 항체에 결합시킬 수 있는 다른 항종양제에는 BCNU, 스트렙타조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된, 총체적으로 LL-E33288 결합체로 공지된 약제 군뿐만 아니라 에스퍼라미신 (미국 특허 제5,877,296호)이 포함된다.

사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래함), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 알레우리트 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토락카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다 (1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232 참조).

본 발명은 항체와, 핵산분해 활성을 나타내는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제, 또는 데옥시리보뉴클레아제와 같은 DNA 엔도뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 이뮤노컨쥬게이트도 고려한다.

종양의 선별적 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소를 사용하여 방사성 동위원소와 결합된 항-PSCA 항체를 생성할 수 있다. 방사성 동위원소의 예에는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 컨쥬게이트를 진단에 사용하는 경우, 컨쥬게이트는 신티그램 촬영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명 (NMR) 조영술 (자기 공명 조영술 (MRI)로도 알려져 있음)용 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 이듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가도리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성 표지 또는 기타 표지는 공지된 방법으로 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성하거나, 예컨대 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적당한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성으로 합성할 수 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지는 시스테인 잔기를 통해 펩티드에 부착할 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착할 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 : 49-57)을 이용하여 요오드-123을 도입시킬 수 있다. 다른 방법은 문헌 ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989))에 자세히 기재되어 있다.

항체와 세포독성제의 이뮤노컨쥬게이트는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Scence 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DPTA)은 항체와 방사성 뉴클레오티드의 결합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO 94/11026 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정성 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 (Chari et al. Cancer Research 52:127-131 참조].

별법으로, 항-ErbB 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접해 있거나, 컨쥬게이트의 원하는 성질을 파괴하지 못하는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되어 있는 컨쥬게이트의 두 부위를 코딩하는 각 영역을 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위하여 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 킬레이팅제를 사용하여 순환계로부터 결합되어 있지 않은 결합체를 제거한 후, 세포독성제 (예: 방사성 뉴클레오티드)에 결합되는 "리간드" (예: 아비딘)를 투여한다.

(x) 항체 의존적 효소에 의해 매개되는 전구약물 요법 (ADEPT)

본 발명의 항체는, 전구약물 (예: 펩티딜 화학요법제; WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 항체를 결합시킴으로써, ADEPT에 사용할 수도 있다 [예를 들면, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조].

ADEPT에 유용한 이뮤노컨쥬게이트의 효소 성분에는, 전구약물보다 높은 활성 및 세포독성을 나타내는 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 효소가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는 데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 프로테아제, 예를 들면, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는 데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 탄수화물 절단 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 각각 자유 약물로 전환시키는 데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들면, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또다른 한편, 당분야에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 공지되어 있는, 효소 활성을 나타내는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)]. 항체-아브자임 컨쥬게이트를 본원에 기재된 바와 같이 제조하여 아브자임을 종양 세포 집단에 전달할 수 있다.

본 발명의 효소는 상기 논의된 헤테로-이관능성 가교결합제를 사용하는 것과 같이, 당분야에 널리 공지된 기술로 항-PSCA 항체에 공유 결합시킬 수 있다. 또다른 한편, 본 발명의 효소의 적어도 기능 활성 부위에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은, 당분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제할 수 있다 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)].

(xi) 기타 항체 변형체

본원에서는 항체의 기타 변형체도 고려한다. 예를 들면, 항체를 각종 비단백질 함유 중합체 중 하나, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결할 수 있다. 항체는 또한 예를 들면, 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 반응 (예를 들면, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐)에 의해 제조된 미소캡슐 내에 넣어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼의 형태로 만들 수 있다. 이러한 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 기재되어 있다.

본원에 기재된 항-PSCA 항체는 면역리포좀으로서 제제화될 수도 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 다양한 타입의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 비히클이다. 당해 항체를 함유하는 리포좀은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 WO 97/38731 (1997. 10.23자로 공개됨)]에 기재된 방법으로 제조한다. 순환 시간이 증가된 리포좀이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀을 일정한 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경의 리포좀을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 결합시킬 수 있다. 임의로, 화학요법제도 이러한 리포좀에 함유시킨다 [Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)].

IV. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한 인간화 항-PSCA 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이 핵산을 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체를 생산하기 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용함으로써 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리하고 시퀀싱한다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분에는, 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

(i) 신호 서열 성분

본 발명의 항-PSCA 항체는 직접적으로 재조합 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질이나 성숙 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 생산될 수도 있다. 바람직하게 선택되는 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항-PSCA 항체 신호 서열을 인식하지 못하고 이를 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들면 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정한 장독소 II 리더로 구성된 군으로부터 선택되는, 원핵 숙주의 신호 서열로 치환시킨다. 효모 분비를 위해서는, 천연 신호 서열을, 예를 들면 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더) 또는 산 포스파타제 리더, 씨, 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 시그날로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더, 예를 들면 단순 포진 gD 시그날도 이용가능하다.

이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항-PSCA 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 결찰한다.

(ii) 복제 기점

발현 벡터와 클로닝 벡터 모두는 이 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유하고 있다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는, 상기 서열은, 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있게 해주는 것이고, 상기 서열에는 복제 기점 또는 자율 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균용으로 적합하고, 2 μ플라스미드 기점은 효모용으로 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 대표적으로 사용될 수 있음).

(iii) 선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 또한 선별 마커로 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충해주거나, 또는 (c) 복합 배지로부터는 입수 가능하지 않은 중요한 영양소 (예를 들면, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)를 공급해주는 단백질을 코딩한다.

선별 도식의 한 예는 숙주 세포의 생장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로, 선별 과정을 생존한다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선별 마커의 또다른 예는 항-PSCA 항체 핵산을 받아들일 수 있는 세포의 동정을 가능케 해주는 마커, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.

예를 들면, DHRF 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 상기 형질전환체 모두를 배양함으로써 동정한다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우, 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 항-PSCA 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선별 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH))를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키거나 또는 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들면 가나마이신, 네오마이신 또는 G418와 같은 선별 마커용 선별제를 함유하는 배지에서 세포를 생장시킴으로써 선별할 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호 참조).

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 돌연변이체 효모 균주, 예를 들면 ATCC 제44076호 또는 제PEP4-1호에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12, 1977]. 이때, trp1 유전자가 결실된 효모 숙주 세포 게놈은 트립토판 부재 하의 생장에 의해 형질전환을 검출하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로 보충된다.

또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산을 위한 클루이베로마이세스 발현 시스템가 보고된 바 있다 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 멀티-카피 발현 벡터도 기재되어 있다 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되며 항-PSCA 항체 핵산에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터계, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면 tac 프로모터가 있다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 항-PSCA 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되어 있는 샤인-달가노 (S.D.) 서열도 함유할 것이다.

진핵생물의 프로모터 서열도 공지되어 있다. 실제적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기만큼 하류에 위치한 AT-풍부 영역을 포함하고 있다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기만큼 상류에서 발견되는 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 첨가하기 위한 시그날일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

생장 조건에 의해 조절되는 다른 전사 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스의 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 더 기재되어 있다. 효모 인핸서 또한 효모 프로모터와 함께 사용하는 것이 좋다.

포유동물 숙주 세포 중에서 벡터로부터 항-PSCA 항체를 전사하는 것은, 폴리오마 바이러스, 전염성 상피종 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터; 열-충격 프로모터에 의해 조절될 수 있지만, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템에 적합해야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스의 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소의 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 유래된 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 인간 β-인터페론 cDNA를 마우스 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]을 참조하면 된다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 장말단 반복부 (long termianl repeat)를 프로모터로 사용할 수도 있다.

(v) 인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에서 본 발명의 항-PSCA 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킨다. 현재, 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 당업자는 진핵세포 바이러스로부터 유래된 인핸서를 사용할 것이다. 이러한 인핸서의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조하면 된다. 이러한 인핸서는 항-PSCA 항체 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱되지만, 바람직하게는 상기 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용된 발현 벡터는 전사를 종결하고 mRNA를 안정화시키는 데 필요한 서열도 함유할 것이다. 이러한 서열은 보통 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 종종 3' 비-번역 영역으로부터 얻을 수 있다. 이들 영역은 항-PSCA 항체 코딩 mRNA의 비-번역 부위에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [WO 94/11026 및 본원에 기재된 발현 벡터 참조].

(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 상기 언급된 바와 같은 고등 진핵 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물에는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 유박테리아 (eubacteria), 예를 들면 에스케리치아 (escherichia)와 같은 장내세균 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면 살로넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 또는 세라티아, 예를 들면 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라, 및 바실러스, 예를 들면 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포르미스 (예를 들면, 1989. 4. 12에 공개된 DD 266,710에 기재된 B. licheniformis 41P), 슈도모나스, 예를 들면 슈도모나스 애루기노사 및 스트렙토마이세스가 포함된다. 한가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 기타 균주도 적합하다. 이들 예는 제한하고자 하는 것 아니라 설명하고자 하는 것일 뿐이다.

전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질은 특히, 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예를 들어, 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 결합되어 있고 이뮤노컨쥬게이트 자체가 종양 세포의 파괴에 효과적인 경우 박테리아에서 생산할 수 있다. 순환하는 전장 항체의 반감기는 더 높다. 이. 콜라이에서 생산하는 것은 보다 빠르고 보다 저렴한 효율적인 방법이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 박테리아에서 발현하는 것은 예를 들어, 최적의 번역 및 분비를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 개시하고 있는 미국 특허 제5,648,237호 (Carter et. al.), 미국 특허 제5,789,199호 (Joly et al.)및 제5,840,523호 (Simmons et al.)를 참조한다 (이들 특허의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 발현 후, 항체는 가용성 분획 형태로 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 예를 들어, 이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

원핵생물 이외에도, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항-PSCA 항체 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되고 있는 것은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 흔한 빵효모이다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위커라미 (K. Wickeramii)(ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 월티이 (K. waltii)(ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)(EP 183,070), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 쉬와니오마이세스, 예를 들면 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 및 필라멘트상 진균, 예를 들면 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면 아스퍼질러스 니듈란스 (A. nidulans) 및 아스퍼질러스 니게르 (A. niger)와 같은 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에서 사용된다.

글리코실화 항-PSCA 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera fr㎍iperda) (모충), 아에데스 애기프티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 숙주로부터 유래된 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 각종 바이러스 균주, 예를 들면 오토그라파 칼리포니카 (Autographa califonica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 입수 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 바이러스로서 본원에 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로 사용할 수도 있다.

그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것은 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포, 또는 현탁 배양물에서 생장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 항-PSCA 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 경우에 따라 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다.

(viii) 숙주 세포의 배양

본 발명의 항-PSCA 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 함스 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글즈 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 배지는 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 젠타마이신 (상표명) 약물), 미량 원소 (통상, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 이와 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물도, 당업계에 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 이용되고 있는 조건이며, 이는 당분야의 숙련인에게는 자명할 것이다.

(ix) 항-PSCA 항체의 정제

재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포 내의 주변세포질에서 생산되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 안에서 생산되면, 첫번째 단계로서, 원심분리 또는 한외여과를 수행하여 숙주 세포 또는 숙주의 분해 단편인 미립자 데브리스 (debris)를 제거한다. 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 방법에 대해서는 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]을 참조하면 된다. 간단하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 데브리스는 원심분리하여 제거한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터 얻은 상등액은 먼저, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치와 같은 시판되는 단백질 농축 여과기를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 임의의 상기 단계에서 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있고 또한 항생제을 포함시켜 외래 오염물의 생장을 방지할 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A의 친화 리간드로서 단백질 A가 적합한지는 항체에 존재하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄-기재의 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 [Guss et al., EMBO J 5:1567-1575 (1986)]. 친화 리간드가 부착될 매트릭스로는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 공극이 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스보다 더 빠른 유속 및 더 단축된 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX (상표명) (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라서 이온 교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE (상표명) 상 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술도 이용할 수 있다.

임의의 예비 정제 단계(들) 이후에, 원하는 항체 및 오염물질을 함유하는 혼합물에 대해 약 2.5 내지 4.5의 pH 및 낮은 염농도 (예를 들면, 약 0-0.25 M 염)의 용출 완충액을 사용하는, 낮은 pH의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있다.

V. 제약학적 제제

본 발명에 따라서 사용된 항체의 치료학적 제제는, 목적하는 순도를 나타내는 항체를 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장되도록 제조한다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 아세테이트, 트리스, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 방부제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이팅제; 트레할로스 및 염화나트륨과 같은 강화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨 등의 당; 폴리소르베이트 등의 계면활성제; 나트륨 등의 염 형성 반대이온; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN, PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제가 포함된다. 바람직하게는 상기 제제는 5-200 mg/ml의 농도, 바람직하게는 10-100 mg/ml의 농도의 항체를 포함한다.

본원의 제제는 필요한 경우, 치료받는 특정한 증상을 위한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 나타내는 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 내재화하는 항-PSCA 항체 이외에, 다른 항체, 예를 들어, PSCA 상의 다른 에피토프에 결합하는 제2 항-PSCA 항체, 또는 특정한 암의 생장에 영향을 주는 성장 인자와 같은 몇몇 다른 표적에 대한 항체를 제제에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 생장 억제제, 항호르몬제, 및(또는) 심보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 적합하게는, 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.

활성 성분은 또한 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 반응 (예를 들면, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐)에 의해 제조된 미소캡슐 내에 넣어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼의 형태로 만들 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적당한 예에는 당해 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT (상표명) (락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.

VI. 항-PSCA 항체를 사용한 치료

본 발명에 따라, 세포 표면 상의 PSCA에 결합할 때 내재화되는 항-PSCA 항체를 사용하여 PSCA-발현 암세포, 특히, 방광암 및 전립선암, 예컨대, 안드로겐 비의존성 전립선암 또는 안드로겐 의존성 전립선암, 및 관련된 전이를 치료한다. 환자는 그가 더 이상 항-안드로겐 요법에 반응하지 않는다는 점에서 안드로겐 비의존성 전립선암으로 진단받을 수 있고, 안드로겐 의존성 전립선암을 앓는 것으로 진단된 환자는 항-안드로겐 요법에 반응하는 환자일 수 있다. 암은 일반적으로 PSCA 발현 세포를 포함할 것이므로, 본원에서의 항-PSCA 항체는 이러한 암과 결합할 수 있다. 암이 PSCA 수용체의 과발현을 특징적으로 할 수 있지만, 본 출원은 PSCA 과발현 암인 것으로 간주되지 않는 암의 치료 방법도 제공한다.

암에서의 PSCA 발현을 확인하기 위한 각종 진단/예후 분석법이 이용 가능하다. 한 실시양태에서는, PSCA 과발현은 면역조직화학법 (IHC)으로 분석할 수도 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 포매 조직 절편을 IHC로 분석하고, 다음과 같은 PSCA 단백질 염색 강도 기준을 기록할 수 있다:

스코어 0

어떠한 염색도 관찰되지 않거나 10% 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰된다.

스코어 1+

10% 이상의 종양 세포에서 희미하게 가까스로 인지 가능한 막 염색이 검출된다. 이러한 세포는 이들의 막 일부에서만 염색된다.

스코어 2+

10%를 초과하는 종양 세포에서 약한 수준 내지 중간 수준의 막 염색이 관찰된다.

스코어 3+

10%를 초과하는 종양 세포에서 중간 내지 강한 수준의 막 염색이 관찰된다.

PSCA 발현 평가에 대하여 0 또는 1+의 스코어를 나타내는 종양은 PSCA를 과발현하지 않는 것을 특징적으로 할 수 있는 반면, 2+ 또는 3+의 스코어를 나타내는 종양은 PSCA의 과발현을 특징으로 할 수 있다.

별법으로 또는 부가적으로, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 포매된 종양 조직에 대해 FISH 분석, 예를 들면 INFORM (상표명) (공급원: Ventana, Arizona) 또는 PATHVISION (상표명) (Vysis, Illinois)를 수행하여 상기 종양에서 PSCA가 과발현되는 정도 (있을 경우)를 측정할 수 있다.

PSCA 과발현 또는 증폭은, 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)로 태깅된 분자 (예컨대, 항체)를 투여하고 상기 표지가 집중되어 있는 위치를 찾기 위해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 생체내 진단 분석법을 이용하여 측정할 수 있다.

현재, 암의 단계에 따라, 전립선암은 암 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법, 안드로겐 제거 (예컨대, 호르몬 요법) 및 화학요법 중 하나 또는 상기 요법을 조합한 방법으로 치료한다. 항-PSCA 항체 요법은 방사선 요법의 사용이 제한되어 있는 전이성 질환의 경우 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 초기 환자, 및 안드로겐 제거 치료법에 내성을 나타내는 전립선암종의 관리에 특히 바람직할 수 있다. 종양에 특이적으로 결합하여 내재화하는 본 발명의 항-PSCA 항체는 PSCA-발현 암, 예컨대, 전립선암 및 방광암이 초기 진단될 때, 또는 재발하는 동안 상기 질환을 완화시키는 데 유용하다. 치료에 사용하는 경우, 항-PSCA 항체는 단독으로 사용하거나, 또는 예를 들어, 호르몬, 항혈관신생제 또는 방사성 동위원소로 표지된 화합물과의 병행 투여 요법, 또는 특히, 전립선암 (특히, 떨어져 나온 세포가 도달할 수 없는 경우) 수술, 냉동요법 및 (또는) 방사선요법과의 병행 요법으로 사용할 수 있다. 항-PSCA 항체는 다른 형태의 통상적인 요법과 함께 투여하거나 통상적인 치료 요법 전ㆍ후에 연속 투여할 수 있다. 탁소테르 (독세탁셀), 탁솔 (팩클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론과 같은 화학요법 약물은 전이성 전립선암 및 호르몬 불응성 전립선암, 특히 매우 위험한 환자의 치료에 사용한다. 암, 특히, 안드로겐 비의존성 및(또는) 전이성 전립선암의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 본 발명의 방법에서, 암 환자는 1종 이상의 상기 화학요법제와 함께 항-PSCA 항체를 투여받을 수 있다. 특히, 팩클리탁셀 및 변형된 유도체 (예를 들어, 유럽 특허 제0600517호 참조)를 사용한 병행 요법도 고려된다. 항-PSCA 항체는 치료 유효량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 또다른 실시양태에서, 항-PSCA 항체는 화학요법제, 예를 들어, 팩클리탁셀의 활성 및 효능을 상승시키기 위한 화학요법과 함께 투여한다. 의사용 탁상 편람 (PDR)에는 다양한 암의 치료에 사용되는 이들 화학요법제의 투여량이 개시되어 있다. 치료 효과를 나타내는 상기 화학요법제의 투약법 및 투여량은 치료받을 특정한 암, 암의 심각한 정도, 및 당업계에 숙련된 의사에게 공지된 다른 인자에 따라 다르고 의사가 결정할 수 있다.

한 구체적 실시양태에서, 세포독성제와 결합된 항-PSCA 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 환자에게 투여한다. 바람직하게는, PSCA 단백질에 결합되어 있는 이뮤노컨쥬게이트가 세포내로 도입되면, 상기 이뮤노컨쥬게이트에 결합되는 암 세포의 사멸에 대한 이뮤노컨쥬게이트의 치료학적 효능이 높아진다. 바람직한 실시양태에서는, 세포독성제는 암 세포의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 상술되어 있고, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.

항-PSCA 항체 또는 이뮤노컨쥬게이트는 공지된 방법, 예를 들면 거환, 또는 일정 기간에 걸친 연속 관주에 의한 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 포막내, 경구, 국소 투여 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 상기 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

기타 치료 방법을 항-PSCA 항체의 투여와 병행할 수 있다. 병행 투여 방법에는 별개의 제제나 단일 제약학적 제제를 사용하여 함께 투여하는 방법과, 어떠한 순서로든 연속해서 투여하는 방법이 포함되는데, 연속 투여 방법에서는 두 (또는 모든) 활성 성분이 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시기가 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 이러한 병행 투여 요법은 상승작용적인 치료 효과를 발휘한다.

항-PSCA 항체(들)의 투여는 특정한 암과 관련된 또다른 종양 관련 항원에 대한 항체의 투여와 병행하는 것이 바람직할 수도 있다.

한 실시양태에서는, 본 발명의 항체 치료법이 항-PSCA 항체 (또는 항체들)와, 하나 이상의 화학요법제 또는 생장 억제제의 병행 투여를 수반하는데, 이 병행 투여 요법에는 다양한 화학요법제로 구성된 칵테일을 동시 투여하는 방법이 포함된다. 화학요법제에는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스프아미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예컨대, 팩클리탁셀 및 독세탁셀) 및(또는) 안트라시클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따르거나 당분야의 숙련인에 의해 실험적으로 결정된 바에 따라서 이용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.

항체는 항호르몬 화합물, 예를 들면 타목시펜 등의 항-에스트로겐 화합물; 오나프리스톤 등의 항-프로게스테론 (EP 616 812 참조); 또는 플루타미드 등의 항-안드로겐 화합물과 함께 사용될 수 있다 (상기 항-호르몬 화합물은 이들에 대해 공지된 투여량으로 사용됨). 치료하고자 하는 암이 안드로겐 비의존성 암인 경우, 환자는 미리 항-안드로겐 요법으로 치료받을 수 있고, 암이 안드로겐 비의존성이 된 후에는, 항-PSCA 항체 (및 임의로 본원에 기재된 기타 약제)를 상기 환자에게 투여할 수 있다.

종종, 심보호제 (본 치료법과 관련된 심근부전증을 예방하거나 경감시키기 위함) 또는 1종 이상의 사이토킨을 환자에게 함께 투여하는 것이 유익할 수도 있다. 또한, 상기 치료법 이외에, 환자를 수술하여 암세포를 제거하고(하거나) 항체 요법 전에, 항체 요법과 동시에, 또는 항체 요법 후에 방사선 요법으로 치료할 수 있다. 함께 투여되는 상기 임의의 약제에 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 투여량이며 상기 약제와 항-PSCA 항체의 상승작용으로 인해 낮아질 수 있다.

질병을 예방하거나 치료하기 위해서는, 의사는 공지된 기준에 따라 투여량 및 투여 방식을 선택할 것이다. 항체의 적당한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료받고자 하는 질병의 유형, 항체를 예방 목적으로 투여하든 치료 목적으로 투여하든지 간에 해당 질병의 중증도와 경과, 선행 치료 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응도, 및 담당의의 재량에 따라서 결정될 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게는, 항체는 정맥내 관주 또는 피하 주사로 투여한다. 해당 질병의 유형과 중증도에 따라서, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량은 1회 이상의 개별 투여이든 아니면 연속 관주이든 상관없이 체중 1 kg 당 항체 약 1 ㎍ 내지 50 ㎎ (예: 약 0.1 내지 15 ㎎/투여)일 수 있다. 투약법은 항-PSCA 항체 약 4 mg/kg의 초기 로딩 투여량을 투여한 후 항-PSCA 항체 약 2 mg/kg의 유지 투여량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투약법도 이용 가능하다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위내일 것이다. 증상에 따라서 수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복하여 투여하는 경우에는, 질병의 증상이 원하는 만큼 억제될 때까지 치료를 지속적으로 수행한다. 이러한 치료법의 진행 과정은 의사 또는 당업자에게 공지되어 있는 기준을 토대로 한 통상적인 기술과 분석법으로 용이하게 모니터링한다.

항체 단백질을 환자에게 투여하는 것과는 별개로, 본원은 항체를 유전자 치료법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 항체를 코딩하는 핵산 투여는 "치료 유효량의 항체를 투여하는"이란 표현에 포함된다. 예를 들면, 세포내 항체를 생성시키는 유전자 치료법의 사용에 관한 WO 96/07321 (1996. 3. 14에 공개됨)을 참조할 수 있다.

환자의 세포 내로 핵산 (임의로 벡터 내에 함유됨)을 주입하기 위한 두 가지 주요 방법이 있다 (생체내 및 생체외). 생체내 전달의 경우에는, 일반적으로 항체가 요구되는 부위에서 핵산을 환자에게 직접 주사한다. 생체외 치료인 경우에는, 환자의 세포를 꺼낸 다음, 이들 단리된 세포 내로 핵산을 도입하고, 이와 같이 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 또는 예를 들어, 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 투여한다 [미국 특허 제4,892,538호; 및 제5,283,187호]. 핵산을 살아있는 세포에 도입하는 데 이용 가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 시험관내에서 배양된 세포 내로 전달되는지, 아니면 의도된 숙주의 세포 내로 생체내 전달되는지에 따라 다양하다. 핵산을 시험관내에서 포유동물 세포에 전달시키는 데 적합한 기술에는 리포좀의 사용, 전기천공, 미소주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 이러한 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 (예: 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스) 및 지질-기재 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들면, DOTMA, DOPE, 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염이 포함된다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자요법 프로토콜에 대한 자세한 내용은 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992); WO 93/25673 및 이러한 특허에서 인용된 참조문헌]을 참조한다.

VII. 제품 및 키트

본 발명의 또다른 실시양태에서는, 항-PSCA 발현 암, 특히 전립선암 및 방광암의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 용기와, 이러한 용기 상에, 또는 용기에 부착된 표지 또는 포장 삽입체을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이러한 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 암의 증상을 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고 있으며, 멸균성 출구를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 1종 이상의 활성제는 본 발명의 항-PSCA 항체이다. 표지 또는 포장 삽입체에는 조성물이 전립선암, 안드로겐 비의존성 전립선암, 안드로겐 의존성 전립선암 또는 방광암의 치료에 사용된다는 것이 기재되어 있다. 상기 표지 또는 포장 삽입체은 상기 암을 앓는 환자에게 항체 조성물을 투여하기 위한 설명서도 포함할 것이다. 추가로, 제품은 제약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면 세균증식 억제성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질 (기타 완충제, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기를 포함함)을 추가로 포함할 수 있다.

다양한 목적, 예를 들어, PSCA 세포 사멸의 분석, 세포로부터 PSCA를 정제 또는 분리하기 위한 목적에 유용한 키트도 제공한다. PSCA의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-PSCA 항체를 함유할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 PSCA를 검출하고 정량하기 위한 항체를 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 제품의 경우와 마찬가지로, 키트는 용기, 및 이 용기 상에 있거나 용기에 부착되어 있는 표지 또는 포장 삽입체을 포함한다. 상기 용기에는 1종 이상의 본 발명의 항-PSCA 항체를 포함하는 조성물이 있다. 예를 들어, 희석제 및 완충제, 대조구 항체를 함유하는 다른 용기도 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입체은 조성물에 대한 설명 뿐만 아니라 원하는 시험관내 또는 진단에 사용하기 위한 설명을 제공할 수 있다.

VIII. 실험예

지금부터, 본 발명의 상기 특징 및 다른 특징을 수반된 도면을 참조하여 보다 구체적으로 기재할 것이고, 이들 특징은 청구범위에 기재되어 있다. 하기 특정한 실시양태는 설명하기 위해 기재되어 있는 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 진의 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 많은 변형을 가할 수 있다는 것은 당업계의 보통 수준의 기술을 지닌 당업자에게 자명할 것이다.

<실시예 1>

항-PSCA 모노클로날 항체의 제조 및 특징규명을 기재한다.

1. 재료 및 방법

뮤린 및 인간 항-PSCA 모노클로날 항체 (Mab)를 생산하는 하이브리도마를 제조하였다. 융합 파트너는 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J.Immunology 123 : 1548-1550, 1979)이었다.

표 2A에는 면역화 방법이 요약되어 있고 면역화에 사용되는 항원의 성질, 면역보강제, 투여량, 투여 경로, 투여 스케쥴 및 사용된 숙주 동물이 기재되어 있다. 표 2B에는 다양한 분석법에 의해 확인된 항-PSCA Mab의 특징이 요약되어 있다. 본원에 기재된 항체 명칭은 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 첫 3-4개 문자로부터 유래한다 (표 2B 참조). 클론 명칭에서 마침표 앞의 3-4개의 첫 문자는 모클론을 나타내고, 추가 서브클론이 존재하는 경우 추가 서브클론의 이름이 상기 첫 마침표 다음에 온다. 별법으로, 본원의 항-PSCA 항체는 이들 항원을 지칭하는 복수 (ascite) 번호로 부르기도 한다. muPSCA가 기재되어 있는 경우를 제외하고, 인간 (hu) PSCA 그 자체, 또는 gD 태그 (gDPSCA)나 히스티딘 태그 (his-PSCA)에 융합된 인간 PSCA를 사용하였다. 이. 콜라이에서 발현된 인간 또는 뮤린 PSCA는 히스티딘으로 태깅하였다. 달리 명시하지 않는 한, 이. 콜라이에서 발현된 PSCA를 하기에 기재한 바와 같이 리폴딩하여 면역화에 사용하였다. gDPSCA-CHO는 CHO 세포에서 발현되고 상기 세포로부터 정제되는 가용성 PSCA를 말한다. 제노마우스 (Xenomice; Abgenix, Fremont, California)로부터 얻은 항체는 완전한 인간 항체이다.

hu PSCA 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 경우, WO 99/14328 (제넨텍; PR0232 단백질, 도 1의 뉴클레오티드 서열; 도 2의 아미노산 서열); 미국 특허 제5,856,136호 (1999년 1월 5일 발행) (Incyte ; SCAH2 서열 4); 또는 문헌 (Reiter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1735-1740 (1998))의 1737면에 나타낸 도 2)를 참조한다. 편의상, 123개의 아미노산으로 구성된 PSCA 아미노산 서열, 및 PSCA cDNA의 코딩 서열은 각각 서열 1 및 서열 2에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 아미노산 서열은 상기 레이터 등의 문헌 (Reiter et al., 1998)에서와 동일한 서열 1에 기재된 넘버링에 따라 넘버링할 것이다.

세포주 및 형질감염

hu PSCA 또는 gDPSCA를 코딩하는 플라스미드 벡터를 Ras 발현 NIH 3T3 세포 (Ras 3T3); CHO; 및 HCT116 내로 형질감염시켰다. 이. 콜라이에서 발현하는 경우, GPI 앵커 서열이 제거된 (His 태그에 융합된) hu PSCA 아미노산 10-101 코딩 서열을 사용하였다. 3T3 세포에서 발현하는 경우, PSCA의 N-말단 신호 서열 (aa 1-20)을 gD 태그 뒤에 성숙 gD의 25개 아미노산 있는 신호 서열로 대체하였다.

결합 분석

세포 상 PSCA와 항-PSCA 항체의 결합을 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)로 분석하였다. 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 뮤린 항-PSCA 6B8.1D7.2B3 (#2761) 항체 및 완전한 인간 항-PSCA 10C5.6E4.6D1 (#2910) 항체와 세포 표면의 결합을 FACS로 분석하였다. N-말단에 gD 태그가 있는 huPSCA로 형질감염된, (배양 플레이트의) 전면 부착된 안정한 CHO 세포를 PBS로 수세하고 세포 해리 용액 (시그마)를 사용하여 상기 세포를 탈착시켰다. 세포와 다양한 농도 (1-10 ㎍/ml)의 항-PSCA 항체를 인큐베이션하고 PBS로 수세한 후 FITC 컨쥬게이트 2차 항체와 세포를 인큐베이션하였다. 세포를 1% FBS 또는 1% 포름알데히드가 함유된 PBS에 재현탁하여 세포를 고정시켰다. 이어서, 세포 표면과 항체의 결합을 FACScan으로 분석하였다.

용액 중의 PSCA를 포획하는 Mab의 능력을 알아보기 위해, 각 항체가 마이크로타이터 플레이트에 직접 코팅되어 있거나, 이미 마이크로타이터 플레이트 위에 코딩되어 있는, Fc 영역에 특이적인 항-마우스 IgG에 결합되어 있는 분석법을 개발하였다. 이어서, 바이오티닐화 PSCA 항원 (1 ㎍/㎖)를 상기 플레이트에 첨가한 후 스트렙타비딘-HRP와 함께 인큐베이션하였다. OPD를 기질로 사용하고 플레이트를 492 nm에서 판독하였다.

형질감염된 세포의 표면 위에 발현된 PSCA와 Mab #2403의 결합을 입증하기 위해, ¹²⁵I-표지 Mab #2403 (락토퍼록시다제 방법)을 사용하여 냉각 경쟁 결합 분석을 수행하였다. PC3.gD.hu PSCA 세포 (1x10⁵)를 24 웰 디쉬에 플레이팅하고 4℃, 배지 중에서 다양한 농도의 표지되지 않은 Mab 2403 및 일정한 양의 ¹²⁵I-Mab 2403과 함께 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하고 세포를 빙냉 배지로 수세하였다. 8M 우레아/3M 빙초산에서 세포를 용해한 후, 감마 카운터를 이용하여 결합된 방사능의 양을 측정하였다. m3이 IC₅₀을 나타내는 4개 파라미터 피팅 곡선 계산식으로부터 IC₅₀ 값을 계산하였다. 이 분석 결과는 도 4에 작도되어 있다.

직접적인 ELISA를 수행하여 #2761 (6B8) 항체의 결합 활성을 측정하였다. 1 ㎍/㎖의 HuPSCA 및 뮤린 PSCA (mPSCA)를 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 상에 밤새 코팅하였다. 항-PSCA Mab 및 대조구를 항원-코팅 웰에 첨가하고 실온에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 수세하여 제거하고 호스라디쉬 퍼록시다제 (HRP)와 결합된 2차 항체를 상기 웰에 첨가하고 실온에서 상기 항체와 함께 인큐베이션하였다. OPD 기질 용액을 마지막으로 첨가하고 진한 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 상기 플레이트를 492 nm에서 판독하였다.

에피토프 그룹핑 (grouping)을 경쟁 ELISA로 결정하였다. 각 항체를 바이오티닐화하고 과량의 비-표지 항-PSCA Mab 각각이 존재하거나 존재하지 않는 조건 하에서 플레이트 상에 코팅된 PSCA와 각 항체의 결합을 시험하였다. 그 다음으로, 스트렙타비딘-HRP를 상기 플레이트에 첨가한 후 퍼록시다제 기질을 첨가하였다. 바이오티닐화 Mab와 PSCA의 결합이 (50% 이상) 감소하거나 없는 것은 냉각된 항체 및 바이오티닐화 항체 둘다가 PSCA 상의 동일한 (또는 근접한) 에피토프에 결합되어 있음을 나타낸다.

이. 콜라이에서 생산된 His-태깅 단백질의 정제 및 리폴딩

His-태깅 단백질을 발현하는 이. 콜라이의 0.5 내지 1 L 발효물로부터 생산된 단백질의 정제 및 리폴딩에 하기 방법을 이용하였다.

0.5 내지 1 L 발효물로부터 얻은 이. 콜라이 페이스트 (6-10 mg 펠렛)를 10배 부피 (w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 8 완충액에 재현탁하였다. 고상 아황산나트륨 및 소듐 테트라티오네이트를 각각 0.1 M 및 0.02 M의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 이 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 모든 시스테인 잔기가 술피톨라이제이션 (sulfitolization)에 의해 차단된 변성 단백질이 생성된다. 이 용액을 40K rpm, 베크만 한외원심분리에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 3-5배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7. 4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과하여 정화하였다. 원하는 단백질의 발현도에 따라, 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형시킨 퀴아젠 Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 (용적: 5 ml) 상에 30-50 ml의 정화된 추출물을 로딩하였다. 상기 컬럼을 50 mM의 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)이 함유된 다른 완충액 (pH 7.4)으로 수세하였다. 단백질을 250 mM의 이미다졸이 함유된 완충액으로 용출하였다. 원하는 단백질이 함유된 분획을 모아 4℃에 저장하였다. 단백질은 농도는 아미노산 서열을 기초로 하여 계산된 흡광계수를 이용하여 280 nm에서 단백질의 흡광도를 측정함으로써 산출하였다.

단백질은 통상적으로 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된, 즉석에서 제조된 리폴딩 완충액으로 샘플을 서서히 희석하여 리폴딩한다. PSCA의 경우, 3.5 M의 우레아 및 1 mM의 시스테인을 2.5 M의 우레아 및 5 mM의 시스테인 대신에 사용하였다. 리폴딩 부피는 최종 단백질의 농도가 50 내지 100 ㎍/ml가 되도록 선택한다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12-36 시간 동안 천천히 교반한다. 0.4% (대략 pH 3)의 최종 농도까지 트리플루오로아세트산 (TFA)을 리폴딩 반응물에 첨가하여 상기 리폴딩 반응물을 켄칭하였다. 단백질을 더 정제하기 전, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과하고, 아세토니트릴을 2-10%의 최종 농도까지 첨가하였다. 0.1% TFA의 이동상 완충액을 사용하며 10% 내지 80%의 아세토니트릴 구배로 용출하는 Vydac C4 역상 컬럼 크로마토그래피로 리폴딩된 단백질을 정제하였다. A280 흡광도를 나타내는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하고, 균질한 리폴딩 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 일반적으로, 대부분의 단백질 중 적절히 리폴딩된 단백질은 가장 낮은 아세토니트릴 농도에서 용출되었는데, 이는 적절히 리폴딩된 단백질이 역상 수지와의 상호작용으로부터 차단된 소수성 내부가 있는 가장 압축된 단백질이기 때문이다. 침전된 단백질은 대체적으로 보다 높은 아세토니트릴 농도에서 용출되었다. 단백질의 미스폴딩 (misfolding) 형태와 원하는 형태를 구별하는 것 외에, 역상 단계는 샘플로부터 내독소도 제거한다.

원하는 폴딩 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 알맞은 질소 스트림을 용액에 가하여 아세토니트릴을 제거하였다. 단백질은, 통상적으로 투석 또는 제형화 완충액으로 평형시키고 멸균 여과한 G25 수퍼파인 (파마시아) 수지를 사용하는 겔 여과로 20 mM 헤페스 (pH 6.8, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨 함유함)로 제형화하였다. 종종, 등전점이 6-7.5의 pH 범위 내에 있는 단백질은 1 mM HCl, 0. 14 M NaCl의 완충액으로 제형화하여 용해도를 유지한다. 제제화된 단백질을 나누어 -80℃에 동결 저장하였다. 그 후, SDS 겔, 단백질의 정량을 위한 아미노산 분석, 내독소 분석에 의한 내독소 농도의 측정, 단백질을 확인하기 위한 N-말단 단백질 시퀀싱, 단백질의 통합성을 확립하기 위한 질량 분광측정, 및 필요하거나 원하는 경우 기타 분석 방법으로 단백질의 특징을 규명하였다.

이뮤노글로불린 서열 및 제작물

확립된 방법을 이용하여 정제된 항체의 아미노산 서열을 시퀀싱하였다. N-말단 서열을 얻고, 이 서열로부터 프라이머를 디자인하고 RT-PCR로 Ig 가변 영역 (V)을 클로닝하였다. V_L 또는 V_H 영역을 코딩하는 DNA 단편을 벡터에 클로닝하였다. 먼저 벡터에 특이적인 프라이머를 사용하는 확립된 방법을 이용하여 시퀀싱을 수행하였다. 얻어진 항체의 초기 뉴클레오티드 서열로부터, 항체 서열에 특이적인 프라이머를 디자인하여 남은 서열을 얻었다.

서열이 도 13에 기재된 키메라 전장 및 Fab 마우스-인간 항-PSCA 항체는 뮤린 V_L 및 V_H 영역 도메인 서열을 인간 Cκ및 Cγ1 서열에 연결시켜 제작하였다. 쉽게 절단되어 제거되고 다양한 이소타입의 인간 L 및 H 불변 영역이 함유된 예비-제작 벡터에 결찰되는 제한효소 절단 부위 카세트로서 뮤린 항체 V 영역 단편을 벡터에 클로닝하여 PSCA 특이성을 나타내는 키메라 마우스-인간 항체를 발현시켰다. pRK 벡터 (유럽 특허 제307,247호에 기재됨)인 pUC119:Ig 벡터로부터 유래된 베그프킴 (vegfchim)으로 불리는 벡터로부터 Fab 키메라쇄를 발현시켰다.

도 12에는 하이브리도마 클론 6F8.2F4, 복수 #2395 (서열 3 & 4); 5F2.4H4.1E3, 복수 #2403 (서열 5 & 6); 6B8.1D7.2B3, 복수 #2761 (서열 7 & 8)로부터 분비된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 도메인 (V_L 및 V_H) 및 클론 8D11.2E9 (복수 #2399 (서열 9))로부터 분비된 항체의 V_H의 아미노산 서열이 기재되어 있다. 도 13에는 신호 펩티드 서열을 포함하는 전장 키메라 2403 IgG (L쇄는 서열 10이고; H쇄는 서열 11임) 및 키메라 6B8 Fab의 서열 (L쇄는 서열 12이고; H쇄는 서열 13임)의 아미노산 서열이 기재되어 있다. 키메라 항체 2403은 포유동물 세포 발현 벡터 (pRK)에서 Mab 5F2.4H4.1E3 (#2403)의 뮤린 V_L 및 V_H 서열을 인간 이뮤노글로불린 Cκ및 Cγ1 서열 각각과 융합시켜 제조하였다. pRK5 발현 벡터의 제작은 유럽 특허 제307,247호 (1989년 3월 13일 공개)에 개시되어 있다. 키메라 2403 H 및 L 쇄를 코딩하는 pRK 벡터는 DNA pRK-2403H 및 DNA pRK-2403L로서 ATCC에 기탁하였다 (하기 X 참조). 마우스 V_H를 연속하는 잔기 #Pro122 (도 13에 /서열로 표시됨)에서 Cγ1에 연결하였다. 마우스 VL를 연속하는 잔기 #Arg113에서 인간 C_L에 연결하였다. 2403 V_H 인서트는 430 bp의 EcoRI-ApaI 단편 또는 ClaI-ApaI 단편으로서 pRK-2403H로부터 절단하여 얻을 수 있다. 2403 V_L은 400 bp의 EcoRI-CpoI 단편으로서 pRK-2403L 내로 클로닝하였다. 키메라 2761 H 및 L 쇄를 코딩하는 pRK 벡터는 DNA pRK-2761H 및 DNA pRK-2761L로서 ATCC에 기탁하였다 (하기 X 참조). 마찬가지로, 2761 V_L를 400 bp의 EcoRI-CpoI 단편으로서 pRK-2761L 내로 클로닝하였다. 2761 V_H 인서트를 430 bp의 EcoRI-ApaI 단편 또는 ClaI-ApaI 단편으로서 pRK-2761H으로부터 절단하여 얻을 수 있다.

키메라 6B8 Fab L 및 H 쇄는 vegf4chim로 불리는 벡터에서 Mab 6B8.1D7.2B3의 뮤린 V_L 및 V_H 서열을, IgG1 서열의 인간 이뮤노글로불린 Cκ 및 C_H1 도메인 각각과 융합시켜 제조하고, 이. 콜라이에서 발현시켰다. vegf4chim 벡터에는 ampR 선별 마커가 있고 항체의 서열은 알칼리성 포스파타제 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고 상기 프로모터 하에 발현된다.

이들 V 영역 카세트를 절단하고 이 카세트를 다양한 인간 이뮤노글로불린 이소타입의 불변 영역 도메인에 결찰시켜 다양한 Fc 성질을 나타내는 키메라를 제조할 수 있다. ADCC와 같은 이펙터 기능, 보체 결합 활성 또는 Fc 수용체 결합 활성이 없는 항-PSCA 항체를 생산하기 위해서는, 뮤린 V^H 영역을 인간 Cγ2 또는 Cγ4 불변 영역 서열에 연결시킨다.

II. 결과

표 2B에는 본원의 분석법에 의해 확인된 항-PSCA 항체의 특성이 요약되어 있다. 표 2B에서, hu PSCA-이. 콜라이는 이. 콜라이에서 발현되는 his-태깅 PSCA를 말하고; 상기 PSCA는 박테리아로부터 정제한 후 상술한 바와 같이 리폴딩하고; + 포르말린은 포르말린으로 고정시킨 세포를 면역원으로 사용하였음을 나타내고; prk5.hu PSCA는 pRK5 플라스미드에 hu PSCA 유전자를 수반하는 노출 cDNA를 말한다. 제노마우스 (Abgenix, Fremont, California)는 내인성 뮤린 Ig 좌위를 인간 생식세포 이뮤노글로불린 좌위로 바꾸어 인간 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된 마우스이다. PSCA에 대한 인간 항체는 제노마우스를 복강내 (i.p.) 또는 발패드를 통해 이. 콜라이에서 발현된 PSCA로 면역화시켜 제조한다.

시험된 모든 항-PSCA Mab는 FACS로 분석시 PSCA-형질감염 세포의 염색을 상당히 이동시켰다. 도 1 (Mab 5F2) 및 도 2 (Mab 10C5)에는 대표적인 염색 결과가 나타나 있다. FITC와 결합시킨 2차 항체만과 함께 인큐베이션시킨 세포는 음성 대조구로 사용하였고; 이들 세포는 어떠한 항체 결합 활성도 나타내지 않았다. 양성 대조구로 사용된 항-gD Mab 1766 gD는 gD-huPSCA를 발현하는 CHO 세포와의 상당한 결합력을 나타내었다. 완전한 인간 Mab 10C5.6E4.6D1를 함유하는 하이브리도마 상등액도 세포 표면과의 강한 결합력을 나타내었다. 뮤린 항-PSCA Mab 5F2 (#2403)는 이 실험에서 양성 대조구로, 배지는 음성 대조구로 사용하였다.

뮤린 Mab 6B8 (#2761)이 플레이트 상에 고정된 다양한 가용성 형태의 PSCA에 결합하는 능력을 시험하고, 그 결과를 도 3에 기재하였다. 변성된 PSCA 단백질에 대해 생성된 Mab 6B8은 리폴딩되지 않은 huPSCA에 대해서보다 리폴딩된 huPSCA에 대해 더 강한 친화성을 보였다. Mab도 gD-huPSCA CHO 가용성 항원에 결합하였지만, 리폴딩된 huPSCA 및 리폴딩되지 않은 huPSCA과 비교할 때 보다 낮은 친화성을 나타내었다. 그러나, 관련없는 항원 TGF-β및 뮤린 PSCA와 상기 항체의 결합은 없었는데, 이는 상기 항체가 huPSCA에 특이적임을 의미한다.

냉각 경쟁 결합 분석시, Mab 2403에 대한 결합 친화도는 12.9 nM인 것으로 측정되었다 (도 4 및 하기 표 참조).

<표 2A>

<표 2B>

<실시예 2>

이 실시예는 생체내에서 항-PSCA 항체 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2), 2761 (6B8) [복수 번호 다음에 가로 안에 항체 번호가 기재되어 있음; 표 2B 참조]과 PSCA 발현 종양 세포 (MCF-7Her2gdPSCA 및 HCT-gdPSCA)의 결합 및 상기 항체의 국소화를 입증하였다. 형광 염색제 (Cy3)로 항체를 표지하여 항체 결합을 형광 현미경으로 관찰할 수 있다. 이 기술은 Her2를 발현하는 종양을 갖는 마우스에서 Cy3로 표지된 HERCEPTIN (항-Her2 모노클로날 항체)를 사용하여 잘 확립하였다. 항-PSCA 항체의 생체내 결합은 인간 gd와 연결된 PSCA로 형질감염된 종양 세포에 대해 시험하였다. 대조구 항체에는 MCF-7Her2gdPSCA 세포에 대한 양성 대조구로서 Cy3로 표지된 HERCEPTIN이 포함된다. 또한, 결합 활성이 매우 우수한, Cy3로 표지된 항-gd 항체는 PSCA 항체에 대한 양성 대조구로서 사용하였다. 형질감염된 PSCA는 gd에 연결되어 있으므로, gd 단백질의 양은 PSCA 단백질 발현과 직접적으로 관련되어 있다. gdPSCA로 형질감염되지 않은 세포주는 음성 대조구로 사용하였다.

I. 재료 및 방법

세포주

HCT-116 (ATCC CCL-247)은 인간 결장 종양 세포주이고; HCT-47은 형질감염시킬 모클론 HCT-116으로부터 유래된 PSCA 발현 클론이다. MCF-7 (ATCC HTB-22 ; Soule, D. G. et al., J. Natl. Cancer Inst., 51 : 1409-1416, 1973)은 Her2로 미리 형질감염되어 상기 Her2를 발현하는 인간 유방 종양 세포주이다 (Benz et al. Breast Cancer Research and Treatment 24 : 85-95 (1992)). PC3 (ATCC CRL 1435)는 인간 전립선암종 세포주이다 (Kaign et al. Invest. Urol., 17 : 16-23, 1979). 이들 세포는 인간 PSCA (huPSCA) 또는 gD-huPSCA로 형질감염시켰다. gD 또는 gd는 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D 에피토프 태그를 말한다. gD-huPSCA의 제작에 있어서, PSCA의 신호 서열은 gD 에피토프 태그를 코딩하는 서열로 바꾸고; gD-PSCA 서열은 pRK 벡터 내로 클로닝하였다. Her2 항체 (HERCEPTIN(등록상표)가 생체내에서 Her2-발현 종양 세포에만 집중적으로 위치할 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문에 세포 표면 상의 Her2 발현은 대조구로 작용하였다. 이러한 형질감염으로부터 인간 PSCA-발현 종양 세포를 얻었다.

항체 제조

이 실험에 사용된 뮤린 모노클로날 항-PSCA 항체의 리스트는 표 2B를 참조한다. 항체 명칭은 항체를 생산하는 클론의 첫 3-4개 문자로부터 유래한다. 제조자의 지시에 따라 플루오로링크 (FluoroLink) Cy3 단관능성 염색제 (Amersham Pharmacia, PA23001)를 사용하여 모든 항체를 표지하였다. 0.1 M 탄산나트륨 (pH 9.3) 중의 항체 (1 mg/ml의 농도)를 표지 반응에 사용하였다. 1 mg/ml의 항체 원액 (stock) 1 ml를 Cy3 표지 믹스가 함유된 튜브에 첨가하고 철저히 혼합하고 실온의 진탕기에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 주석박에 포장하여 광 노출을 감소시켰다. NAP 10 컬럼 (아미콘)을 PBS로 평형시키고, 컨쥬게이션 반응을 수행할 때, 반응 용액을 상기 컬럼에 첨가하였다. 1.5 ml PBS를 첨가하고 컬럼에서 나오는 흐름을 모았다. A552 및 A280에서 분광광도측정치를 판독하였다. 단백질 농도 및 염색제 대 단백질 비를 하기와 같이 계산하였다:

AB 농도: {[A280-(0.08 X A552)] X 희석율}/1.4 = mg/ml

염색제 대 단백질 비: [1.13 X (A552)]/[A280-(0.08 X A552)]

표지 후, 모든 항체의 결합을 FACS 분석으로 조사하였다 (표 2B 참조).

종양 접종 및 생장

NCR 누드 암컷 마우스에 에스트로겐 펠렛을 이식한 후, 2천만 개의 MCF-7Her2gdPSCA 세포 또는 2천만 개의 비-형질감염 MCF-7 세포주 (음성 대조구)로 피하 접종하였다. 수컷 NCR 누드 마우스를 5백만 개의 HCT-gdPSCA 세포로 피하 접종하였다. 종양이 상기 마우스의 측면에 위치하도록 종양을 피하 주사하였다. 디지탈 판독기가 장착된 캘리퍼를 사용하여 종양 부피가 100 내지 500 mm³가 될 때까지 2주마다 종양을 측정하였다.

Cy3 항체 주사 및 조직 모으기

일단 종양의 부피가 150 mm³ 이상이면, Cy3로 표지된 3종의 항-PSCA 항체 (6F2, 8D11, 5F2) 중 하나, Cy-3 항-gD 항체, 또는 Cy3로 표지된 HERCEPTIN 10 mg/kg을 마우스에게 복강내 주사하였다. 24시간 후, 마우스를 마취시키고 1% 파라포름알데히드를 마우스에게 관류하였다. 종양 조직 및 기타 기관을 모으고 형광 현미경으로 항체의 위치를 파악하기 위해 OCT 동결방지제 중에서 냉동시켰다. 또한, Cy3로 표지된 6B8 항체를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다.

형광 현미경

냉동된 샘플을 5 μm의 절편으로 나누고, DAPI (벡타스테인)를 포함하는 형광 마운팅 배지를 가하였다. DAPI는 핵을 염색시키고 반대염색을 제공한다.

II. 결과

<표 3>

항제 제조 및 FACS 분석

항체	염색제/단백질 (D/P) 비율	표지 후 FACS 분석
2395(6F8)	4	이동
2399 (8D11)	4	이동
2403 (5F2)	3	이동
HERCEPTIN (4D5)	5	이동
항-gD (952)	5	이동

항체의 Cy3 표지가 항원에 결합하는 항체의 능력에 부정적인 영향을 주지 않았음을 확인하기 위해, 세포에 대한 항체의 결합 특이성을 FACS 분석으로 시험하였다. 표 3에서, "이동"이란 형광도를 스크리닝할 때 세포 집단의 이동을 말하고, Cy3로 표지된 항체가 그의 특이적 항원에 결합하는 능력을 유지함을 의미한다.

<표 4>

항체 국소화의 요약

항체	MCF-7Her2gdPSCA종양 염색 양성	MCF-7종양 염색 양성
2395 (6F8)2399 (8D11)2403 (5F2)HERCEPTIN (4D5)항-gd (952)	3 (n=4)2 (n=2)3 (n=4)2 (n=2)2 (n=2)	0 (n=3)0 (n=2)0 (n=3)0 (n=2)0 (n=2)
항체	HCT-gdPSCA
2395 (6F8)2399 (8D11)	2 (n=l)2 (n=2)

표 4에 요약되어 있는 결과는 항-PSCA 항체가 생체내에서 PSCA-발현 종양 세포에 특이적으로 위치하여 상기 종양 세포와 결합할 수 있었음을 입증하였다. 폐 또는 신장에서는 염색이 전혀 검출되지 않았다. 모든 PSCA 항체, 항-gD 및 HERCEPTIN에 대한 Cy3 염색은 항체를 받아 들이는 쿠퍼 (Kupffer) 식세포가 가장 많은 간에서 관찰되었다. 종양과 관련된 비-악성 세포 (대부분 식세포)의 형질감염된 세포주 및 형질감염되지 않은 세포주 둘다도 모든 항체에 대해 Cy3가 양성으로 염색되는 것으로 관찰되었다. 또한, 항체 6B8도 생체내에서 PSCA-발현 PC-3 종양 세포에 국한되어 있지만 대조구-형질감염 PC-3 종양 세포에는 위치하지 않는 것으로 나타났다. 주로 막이 염색되는 패턴을 나타내었다. 양성 염색은 종양의 식세포 또는 종양에 인접한 식세포에서도 관찰되었다.

<실시예 3>

본 실시예에는 PSCA-발현 세포 내에 들어갈 수 있는, 본 발명의 항-PSCA 모노클로날 항체의 능력이 기재되어 있다. 이 연구는 형광 항체, 방사성 동위원소로 표지된 항체, 또는 금 부가물과 결합된 항체를 사용하여 수행하였다. 방사성 동위원소로 표지된 항체를 사용하여, 각 세포주 내로 들어가는 항체 양을 정량하였다.

I. 재료 및 방법

시험관내 연구

gD PSCA를 발현하는 형질감염된 세포 (HCT-47 및 PC3-19 세포), 및 PSCA/HER2를 발현하는 MCF7 세포 (본원에서 MCF7/PSCA/HER2 세포로도 불림)를 커버슬립 위에서 생장시키고, 일련의 모노클로날 항-PSCA 항체 (10 ㎍/mL)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 수세하고, 3% PBS 완충 포름알데히드로 고정시키고, PBS 중의 1% 트리톤 (Triton)으로 상기 세포를 투과성 세포로 만들고, Cy3-형광 표지와 결합된 항-마우스 IgG로 표지하였다. 대조구 실험에서, 형질감염되지 않은 모세포를 사용하였다. 분자 동력학적 콘포칼 현미경으로 면역표지된 세포를 관찰하였다.

전자 현미경의 경우, gD-PSCA를 발현하는 형질감염된 NIH-3T3를 4℃에서 25 ㎍/mL의 항-gD 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 실험 세트에서, PSCA를 발현하는 CHO 세포를 4℃에서 20 ㎍/mL의 10E3 및 6C3 항-PSCA 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체와 인큐베이션한 후, 상기 세포를 염소 항-마우스 IgG의 10 nm 금 부가물로 1시간 동안 처리하였다. 15분 및 1시간 동안 이 세포의 온도를 37℃로 바꾼 후, 카르노브스키 (Karnovsky) 고정제로 세포를 고정시키고 전자 현미경으로 관찰하기 위한 처리를 수행하였다. 박편을 디지탈 GATAN 카메라가 장착된 필립스 CM12로 관찰하였다.

전자 현미경 자가방사기록법의 경우, 10A1 및 8D11 항-PSCA 항체를 요오도-젠 (Iodo-Gen)에 대한 제조자의 지시에 따라 요오드화시켰다. ¹²⁵I-10A1 and ¹²⁵I-8D11 항-PSCA 항체를 HCT116 gD PSCA 세포 (상기 gD 인간 PSCA로 형질감염시킨 인간 결장 종양 세포주)와 함께 15, 1시간 및 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 세포를 수세하고 2% 포름알데히드, 0.1 M 카코딜레이트 완충액 (pH 7.2) 중의 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고 1% 오스뮴 테트록사이드로 후고정시켰다. 탈수, 및 EPONATE 12 에폭시 수지 내로의 포매 후, 이 박편을 절단하고 일포드 (Ilford) L4 에멀젼으로 코팅하였다. 노출 후, 상기 박편을 마이크로돌 (Microdol) X로 현상하고, 우라닐 아세테이트 및 납 쉬이트레이트로 염색하고, 필립스 CM12 전자 현미경으로 관찰하였다.

6B8 항-PSCA 항체의 내재화는 gD.huPSCA를 발현하는 PC3 세포를 사용하여 전자 현미경으로 연구하였다. 6B8 항체는 요오도-젠에 대한 제조자의 지시에 따라 요오드화시켰다. ¹²⁵I-6B8 항체를 PC3.gD.huPSCA 클론 4 세포와 함께 15분 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 세포를 수세하고 2% 포름알데히드, 0.1 M 카코딜레이트 완충액 (pH 7.2) 중의 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고 1% 오스뮴 테트록사이드로 후고정시켰다. 탈수, 및 EPONATE 12 에폭시 수지 내로의 포매 후, 이 박편을 절단하고 일포드 (Ilford) L4 에멀젼으로 코팅하였다. 노출 후, 상기 박편을 마이크로돌 (Microdol) X로 현상하고, 우라닐 아세테이트 및 납 쉬이트레이트로 염색하고, 필립스 CM12 전자 현미경으로 관찰하였다.

정상상태 내재화 연구는 다음과 같이 수행하였다: MCF7/Her2 세포 (도 11, 우측 패널)를 퓨로마이신 선별 마커 (PurR)가 있는 벡터로만 형질감염시키고; 이 세포주를 PSCA 항체의 내재화에 대한 음성 대조구로 사용하였다. MCF7/Her2/gD.PSCA 세포주는 실시예 2에 기재되어 있다. MCF7/Her2 세포 및 MCF7/Her2/gD.PSCA 세포를 37℃에서 22nM의 ¹²⁵I로 표지된 항-PSCA 모노클로날 항체 2395, 2399, 2403, 및 0.8 nM의 ¹²⁵I로 표지된 항-Her2 항체 (Herceptin) 중 하나와 함께 5시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하고 세포를 냉각된 배지로 수세하였다. 세포에 결합된 방사능의 양은 상기 세포를 산 워시 (Acid Wash; 2M 우레아, 0.5 M NaCl, 50 mM 글리신, pH 2.4) 중에서 10분 동안 인큐베이션한 후 세포를 제거하고 상기 산 워시를 카운팅함으로써 측정하였다. 이어서, 상기 세포를 용해 완충액 (8M 우레아, 3M 빙초산)으로 용해시키고, 생성된 세포용해물을 카운팅하여 내재화된 방사능의 양을 측정하였다. 각 분석 샘플에서 방사성 동위원소로 표지된 항체의 특이적 활성 및 세포수를 사용하여 cpm을 분자/세포로 전환하였다.

생체내 연구

Cy3로 표지된 6F8, 5F2 또는 8D11 PSCA 항체를 MCF7/HER2/PSCA 이종이식 종양을 갖는 마우스에게 복강내 투여하였다. 24시간 후, 상기 종양을 제거하고 5, 10, 20 and 50 ㎛로 동결절편하고 콘포칼 현미경으로 관찰하였다.

항-PSCA 항체를 상기 시험관내 실험에서 기재한 바와 같이 ¹²⁵I으로 표지하였다. MCF7/Her2/gdPSCA 세포를 준비하고 NCR 누드 마우스 내로 접종하고 ¹²⁵I으로 표지된 항-PSCA 항체, ¹²⁵I-항-gD 항체, 또는 ¹²⁵I으로 표지된 HERCEPTIN (등록상표)을 상기 실시예 2에 기재한 바와 같이 마우스에게 주사하였다. 종양 세포를 분석에 사용하기 위해 절편으로 만들었다.

II. 결과

시험관내 연구에서, 면역표지된 HCT 47 gD PSCA, PC3-19 gD PSCA 및 MCF7/HER2/PSCA 세포의 콘포칼 현미경은 이들 세포가 다양한 정도로 항-PSCA 모노클로날 항체 8D11, 10A1, 6C3, 6F8, 5F2, 7A6 및 10E3에 결합하여 내재화한다는 것을 보였다 (도 5-8 참조). 내재화 염색 패턴은 골기체 (Golgi apparatus)의 근처에 있는 엔도좀에 상응하는 세포질 비히클 및 핵주위 소기관 (organelle)의 존재를 특징으로 한다.

생체내 연구에서, 표지는 대부분의 동결절편된 세포의 세포 표면에서 볼 수 있고 적은 비율의 세포에서 세포 표면 근처에 있는 작은 비히클 내로 들어갈 수 있다.

10 nm 금 입자로 가시화되는 항-gD 항체와 함께 인큐베이션한 상기 3T3 세포를 사용한 EM 내재화 연구는 gD-PSCA가 내재화되어 엔도좀 구획으로 이동한다는 것을 보였다. 금 입자는 소포 및 다소포체에서 관찰되었다. 또한, PSCA-형질감염된 CHO 세포를 사용한 EM 내재화 연구는 10E3 항체의 내재화와 6C3 항체의 내재화에 동일한 경로가 관련됨을 보였다 (도 9A-9D). PSCA 내재화의 속도는 빠른 듯하였다 (원형질막에서 엔도좀까지 15분 소요).

¹²⁵I-10A1 및 ¹²⁵I-8D11 항-PSCA 항체를 사용하여 세포막, 특히 미소융모와 결합되어 있는 자가방사성 실버 결정체를 관찰하였다. 자가방사성 결정체는 ¹²⁵I로 표지된 10A1 및 8D11 항체를 첨가한 지 15분 후 만큼 빨리 세포 내로 들어갔다. 도 10의 미세도면에 나타낸 내재화는 이 실험의 결과를 대표한다. PSCA가 아니라 neo 마커로 형질감염시킨 대조구 HCT116 세포는 내재화하지 않았다.

6B8 항체를 사용하여 얻은 결과는 ¹²⁵I-10A1 항-PSCA 항체를 사용하여 얻은 결과와 유사하였다. 항체 6B8의 내재화는 24시간 내내 연속하여 15분 간격으로 관찰하였다. 자가방사성 결정체는 먼저 세포막의 소포와 결합되어 있고 나중에 엔도좀으로 들어가는 것으로 관찰되었다.

도 11은 gD-PSCA로 형질감염시킨 Her2-발현 MCF7 세포에서 3종의 항-PSCA 항체 [복수 #2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2)]의 내재화가 5시간이 지난 후에 정상상태 수준에 도달하였음을 나타낸다. HERCEPTIN은 대조구 항체로 작용하였다. 세포용해물 중에서 세포 당 결합된 항-PSCA 항체의 분자수 대 세포 당 결합되지 않은 자유 항-PSCA 항체의 분자수를 정량하였다.

III. 결론

PSCA에 대한 항체 (6C3, 10E3, 10A1, 6F8, 5F2, 8D11, 6B8)는 세포내이입 (endocytosis)에 의해 효율적으로 세포 내로 들어갔고 시험관내 및 생체내 둘다에서 내재화하였다. 초음파구조 분석은 6C3, 10E3 및 6B8의 내재화가 소포를 통해 일어날 것이라는 것을 보여주었다. 상기 항체는 골기체에 매우 인접해 있는 다소포체에 축적된다. 따라서, 본 발명의 항-PSCA 항체가 세포 표면에 있는 PSCA에 결합할 때 내재화된다는 것은 다양한 방법으로 입증되었다.

<실시예 4>

다양한 조직 및 기관에서 발현되는 유전자를 포함하는 cDNA 라이브러리에 존재하는 PSCA 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 cDNA 라이브러리의 데이타베이스로부터 측정하여 다양한 정상 조직 및 종양 조직에 PSCA가 풍부함을 확인하였다 (도 14 참조). 도 18 (x-축)에 기재된 각 기관에 대해 수십개의 cDNA 라이브러리의 취합물 (pool)을 얻었다. "모든"은 도면에 기재된 다양한 기관의 cDNA 라이브러리뿐만 아니라, 뼈, 자궁, 소장, 흉선, 위, 결합 조직 및 분류되지 않은 조직 형태를 비롯한 다양한 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 혼합물을 의미한다. 취합된 라이브러리에 존재하는 PSCA 서열의 카피 수를 상기 취합된 라이브러리에 존재하는 서열의 총수로 나누어 정상 기관 및 종양 기관에 존재하는 PSCA의 상대적인 양을 산출하고 도 14에 #히트/100,000 무작위 서열로서 나타내었다. PSCA의 절대적인 양 (Absabu)으로부터, 전립선 종양 및 방광 종양의 PSCA 발현이 매우 상승조절되어 있음을 명백히 알 수 있다.

<실시예 5>

항-PSCA 항체의 항-종양 활성을 생체내에서 측정하였다.

I. 재료 및 방법

인간 전립선암 세포주, PC3를 ATCC (ATCC CRL-1435)로부터 얻었다. 세포주 PC3.gDhuPSCA 서브클론은 퓨젠 방법 (Roche Molecular Biochemical)을 이용하여 모세포주인 PC3 세포를 pRK.gDPSCA.tkneo으로 형질감염시키고 400 ㎍/ml의 G418 (Life Technologies)이 함유된 배지에 플레이팅하여 얻었다. 2주 동안 생장시킨 후, G418 내성 서브클론을 선별하고 증폭시켜 gDPSCA 발현하는 클론을 찾았다. 세포주 PC3.Neo는 모세포주 PC3 세포를 벡터 pRK.tkneo로 형질감염시키고 400 ㎍/ml의 G418 (Life Technologies)이 함유된 배지에서 선별하여 제조하였다. 안정한 콜로니를 모아 증폭시켰다.

gDPSCA로 형질감염된 PC-3 세포 또는 neo로 형질감염된 PC-3 세포 (5 X 10⁶)를 NCR 누드 마우스 (Taconic, Germantown, New York, USA)에게 피하 주사하였다. 세포 접종 하루 전에 10 mg/kg 투여량의 항-PSCA 모노클로날 항체 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2) 및 2761 (6B8)를 복강내 주사 투여하였다. 음성 대조구로서, 항-돼지풀 모노클로날 항체 MARG2 (Genentech)를 동일한 투약법으로 투여하였다. 세포 접종 후, 10 mg/kg의 항체를 2주마다 동물에게 투여하였다. 2주마다 종양을 측정하였다. 이러한 실험 결과는 도 18-20에 나타나 있다.

(치료 후) 별개의 실험에서, 종양이 특정한 크기까지 성장하게 한 후, 전립선암 환자의 조건 및 치료와 유사하게 마우스를 항-PSCA 항체로 치료하였다. 가장 적절하게는, 항체 치료 전의 종양의 크기는 대략 75-lOO mm³이어야 한다. 이 실험에서, gDPSCA로 형질감염된 PC-3 세포 5 X 10⁶를 NCR 누드 마우스 (Taconic, Germantown, New York, USA)에게 피하 주사하고 종양을 1주 동안 생장시켰다. 그 후, 마우스를 9마리 마우스로 구성된 4개 군으로 나누었는데, 각 군의 평균 종양 부피는 대략 200 mm³이었다. 그 다음, 마우스를 10 mg/kg의 항-PSCA 모노클로날 항체 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2761 (6B8) 및 2403 (5F2), 또는 항-돼지풀 항체 MARG2 (Genentech)로 2주마다 치료하였다. 2주마다 종양을 측정하였다. 이 실험 결과는 도 21에 나타나 있다.

II. 결과

대조구 돼지풀 항체와 비교할 때 시험된 4종의 항-PSCA 항체, 즉 2395 (6F8), 2399 (8D11), 2403 (5F2) 및 2761 (6B8)는 노출 (결합된 물질이 없는) 항체로서 생체내에서 PSCA-발현 전립선암 세포를 사멸시키는 세포독성 활성을 나타내었다 (도 19-21). 도 19의 2395 및 2399, 도 20의 2399, 2403 및 2761, 및 도 21의 2395의 p 값은 대조군과 p < 0.05 만큼 큰 차이를 보였다. 항-종양 활성은 PSCA 발현 종양 세포에 특이적이고 (도 19-21), 대조구인 PSCA-음성 PC3 종양 세포에는 존재하지 않았다 (도 18). 일단 마우스에 주사된 PC3 종양 세포의 생장률을 예측하거나 조절하여 항체 치료를 시기적절하게 개시하는 것은 어려웠다. 따라서, 이들 치료 후 초기 실험에서, 종양은 항-PSCA 항체를 투여할 때 최적 크기 (75-1OO mm³)보다 더 커져 있었다 (150-200 mm³). 항-PSCA 항체를 사용한 치료를 종양의 크기가 보다 더 작고 보다 더 전형적인 크기일 때 개시하는 경우, 및 항체 투여량이 10 mg/kg을 넘는 정도까지 증가되는 경우, 종양의 세포독성 효능이 더 높아질 것이라고 예측할 수 있다.

<실시예 6>

시아노몰구스 원숭이 PSCA

본 실시예에는 시아노몰구스 원숭이 PSCA의 클로닝이 기재되어 있고 본 발명의 항-인간 PSCA 항체가 상동성이 높은 시아노몰구스 PSCA 및 인간 PSCA와 유사한 친화도로 결합한다는 것이 나타나 있다. 높은 상동성 이외에, 본 발명자들은 시아노몰구스의 요로상피가 인간의 요로상피에서 관찰된 방식과 동일한 방식으로 PSCA를 발현하므로, 시아노몰구스 원숭이가 항-PSCA 항체의 독성 연구에 적합하고 좋은 동물 모델이라는 것을 발견하였다. 이 모델에서 노출 항-PSCA 항체 및 독소-결합 항-PSCA 항체를 시험할 것이다.

I. 방법 및 재료

시아노몰구스 PSCA의 클로닝

시아노몰구스 원숭이 방광으로부터 RNA를 정제하였다. PSCA를 클로닝하기 위해, 프라이머 psca.2F (AAGGCTGTGCTGCTTGCCCT - 서열: 14) 및 psca.lR (GAGTGGCACAAAGGCCTGGG - 서열: 15)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 2회의 독립적인 PCR 반응으로부터 생성된 PCR 생성물을 PCR 서브클로닝 벡터 pCR2.1-TOPO (Invitrogen)에 서브클로닝한 후 시퀀싱하였다.

세포 표면 PSCA에 대한 친화도 측정

인간 PSCA 및 시아노몰구스 PSCA의 전체 코딩 서열을 발현 벡터 pRK에 클로닝하였다. 락토퍼록시다제 방법을 이용하여 항-PSCA 모노클로날 항체 5F2 (복수 #2403)를 ¹²⁵I로 표지하였다. 퓨젠 시약 (Roche)을 사용하여 PC3 세포 또는 CHO 세포를 pRK.gD.인간 psca 또는 pRK.gD.시아노몰구스 psca로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 24웰 디쉬에 다시 플레이팅하고 다양한 농도의 비표지된 Mab 2403 및 일정한 양의 ¹²⁵I-Mab 2403과 함께 4℃, 배지에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 결합하지 않은 항체를 제거하고 세포를 빙냉 배지로 수세하였다. 세포를 8M 우레아/3M 빙초산에 용해시켜 결합된 방사능의 양을 측정하였다. NewI 프로그램을 이용한 표준 분석으로 Kd 값을 계산하였다.

FACS 분석:

COS 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포)를 pRK.인간.psca 또는 pRK.시아노몰구스.psca로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 5 mM의 EDTA를 사용하여 세포를 배양물 디쉬로부터 떨어뜨리고 1X PBS로 수세하였다. 세포를 여러 개의 튜브에 나누고 l0 ㎍/ml의 항체 8D11 (복수 #2399) 또는 6B8로 1시간 동안 염색하였다. 2X PBS로 수세한 후, 세포를 FITC 항-마우스 (ICN) 항체로 염색한 다음, 플로우 사이토메트리 (flow cytometry)를 사용하여 분석하였다. 반응 당 100 ㎕의 하이브리도마 상등액에 함유된 제노마우스 항체 (1OC5 서브클론으로부터 얻은 1D8, 3B8 및 6D1)를 사용하고 FITC 항-인간 카파쇄 항체로 염색하고, 다시 플로우 사이토메트리로 분석하였다. FACS 분석의 결과는 아래 표 5에 기재되어 있다.

II. 결과

원숭이 PSCA의 7개 서브클론을 시퀀싱하여 두 타입의 서열, 즉 타입 I (4개의 서브클론) 및 타입 II (3개의 서브클론)을 얻었다. 타입 I의 DNA 서열 및 변역된 아미노산 서열 (서열 16 및 17)은 도 15에 기재되어 있고, 타입 II의 서열 및 번역된 아미노산 서열 (서열 18 및 19)은 도 16에 기재되어 있다. RNA는 각 원숭이의 방광으로부터 정제되었고, 원숭이는 야생형 원숭이 (동계교잡 (inbred) 종이 아님)로부터 유래하였기 때문에, 상기 두 타입은 동일한 유전자의 상이한 대립유전자를 나타낼 가능성이 가장 높다. 타입 I 및 타입 II 시아노몰구스 PSCA는 DNA 수준에서 98.64%의 동일성을, 단백질 수분에서 99.18%의 동일성을 보이는데, 아미노산 119 (Ser 대 Gly)에서만 달랐다. PSCA는 GPI-앵커링 표면 단백질이다. 인간 PSCA에서, GPI가 부착되는 절단 부위는 아미노산 100이다. 절단 및 GPI-결합이 시아노몰구스 PSCA의 유사한 위치에서 일어난다고 가정하면, 성숙 타입 I 원숭이 PSCA와 성숙 타입 II 원숭이 PSCA의 아미노산 서열은 100% 동일할 것이다. 상기 두 타입은 전체 코딩 서열에 걸쳐 인간 PSCA와 대략 94%의 동일성을 나타내었다. 도 17은 인간 타입 I PSCA의 아미노산 서열 (서열 1)과 시아노몰구스 타입 I PSCA의 아미노산 서열 (서열 17)을 비교한 것이다.

COS 세포에서 발현된 인간 또는 시아노몰구스 PSCA에 대한 항-PSCA 항체의 평균 FACS 이동 (FITC의 단위로 나타냄)은 표 5 (뮤린 항체의 경우) 및 표 6 (제노마우스 항체의 경우)에 기재되어 있다. 다른 연구로부터 5F2, 8D11 및 6F8 항체가 인간 PSCA에 대해 매우 유사한 결합 친화도를 나타낸다는 것이 공지되었다. 따라서, 이들 항체 중 5F2를 냉각 경쟁 분석에서 대표적으로 사용하였다. 표 7은 인간 및 시아노몰구스의 세포 표면 PSCA에 대한 항체 5F2의 친화도와 6F8의 친화도를 냉각 경쟁 분석으로 측정하여 비교한 것이다. PC3 형질감염 세포로부터 얻은 결과와 CHO 형질감염 세포로부터 얻은 결과는 유사하였다. FACS 분석 및 냉각 경쟁 분석으로부터 얻은 결과는 뮤린 항체 및 제노마우스 인간 항체가 세포 표면 상에서 그의 천연 형태로 발현된 인간 및 시아노몰구스 PSCA에 (오차 한계 내에서) 동일한 친화도로 결합된다는 것을 보여주었다.

<표 5>

평균 FACS 이동

	항체 없음	8D11	6F8
인간	4.2	22.6	11
시아노몰구스	3.9	21.9	10

<표 6>

평균 FACS 이동

	항체 없음	1D8	3B8	6D1
인간	3.6	10	9.6	14.3
시아노몰구스	3.8	10.9	12.3	14.4

<표 7>

세포 표면 PSCA에 대한 항체 친화도

항-psca	PSCA
Mab	종	세포주	Kd
5F2	인간	PC3.oD.hu.ps.oa	13.2
		클론 4
5F2	시아노몰구스	PC3.cyn.ps.oa	7
		클론 8
6B8	인간	PC3.gD.hu.ps.oa	21
		클론 4
6B8	시아노몰구스	PC3.cyn.ps.oa	3.3
		클론 8

<실시예 7>

항-PSCA 항체-DM1 컨쥬게이션

본 실시예에는 메이탄시노이드 DM1에 대한 항-PSCA 항체의 컨쥬게이션이 기재되어 있다. DM1은 세포에서 활성화되는 전구약물이고, 마이크로튜불 형성의 강력한 억제제이고 유사분열을 방해한다. DM1의 구조는 도 22에 기재되어 있다. 항-PSCA 항체-DM1 컨쥬게이트의 구조는 도 23에 나타나있다. 하기 컨쥬게이션의 경우, 도 22에 기재된 R 기는 SH 또는 그의 보호 유도체이고; 특히 이황화 유도체가 바람직하다. 이 프로토콜은 예를 들어, 개개의 항체에 대한 시약의 pH 또는 농도가 최적화되도록 변형시킬 수 있고, 이러한 변형은 성질상 관례적인 것이고 당업계의 단백질 화학자에게 공지되어 있을 것이다.

SPP를 사용한 항-PSCA 항체의 변형

정제된 항-PSCA 항체 (예를 들어, 표 2B에 나열된 항-PSCA 항체 중 하나)를 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)로 변형하여 디티오피리딜기를 도입하였다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)을 함유하는 인산칼륨 완충액 (PPB; 예컨대, pH6.5의 50 mM PPB) 중의 항체 (예를 들어, 약 6-10 mg/mL)를 SPP (예를 들어, 2.3 mL 에탄올 중의 5.3 몰 당량)로 처리하였다. 아르곤 하에 주위 온도에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 표준 방법, 예를 들어, 35 mM 소듐 쉬이트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA로 평형시킨 세파덱스 G25를 통한 겔 여과로 여과하였다. 항체를 함유하는 분획을 모아 분석하였다. 항체의 변형도는 위에 기재된 바와 같이 측정하였다.

항-PSCA 항체-SPP-Py와 DM1의 컨쥬게이션

변형된 항체 (예를 들어, 9.5 μmol의 방출가능한 2-티오피리딘기가 있는 항체)를 상기 35 mM 소듐 쉬이트레이트 완충제 (pH 6.5)로 희석하여 최종 농도가 예를 들어, 2.5 mg/mL이 되도록 하였다. 이어서, 3.0 mM의 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중의 3% v/v) 중의 DM1 (예를 들어, 1.7 당량, 16.1 μmol)을 상기 항체 용액에 첨가하였다. 반응은 아르곤 하에 주위 온도에서 20시간 동안 진행시켰다.

반응물을 35 mM 소듐 쉬이트레이트, 154 mM NaCl (pH 6.5)로 평형시킨 겔 여과 컬럼, 예를 들어, 세파크릴 S300 겔 여과 컬럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L)에 로딩하였다. 유속은 예를 들어, 5.0 mL/분이고, 65개의 분획 (각각 20.0 mL)을 모았다. 주피크는 항-PSCA 항체-DM1 단량체를 포함한다. 주피크 근처의 분획을 모아 분석하였다. 항체 분자 당 결합된 DM1 약물 분자의 수는 예를 들어, 252 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였고, 그 결과, 항체 분자 당 약 3-5개의 약물 분자가 결합되어 있는 것으로 밝혀졌다.

<실시예 8>

배양된 세포에 대한 항-PSCA-DM1 컨쥬게이트의 세포독성

항-PSCA 항체 #2761 (6B8) 및 #2399 (8D11)를 상술한 바와 같이 DM1에 결합시켰다. 내재화 연구로부터, PSCA를 발현하는 세포가 DM1 항체 컨쥬게이트를 효율적으로 받아들일 것으로 기대되었다. 두 가지 항-돼지풀 항체를 항원 특이성 및 이뮤노글로불린 이소타입에 대한 대조구로 사용하였다. 첫번째 4개의 DM1 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성에 대한 결과를 얻었다. PC3.Neo 세포 및 PC3.gD 인간 PSCA 클론 4 세포에 대한 세포독성은 클론원성 분석에서 측정하였다. 이들 두 세포주는 항체에 결합되지 않은 DM1에 대해 동일한 민감도를 나타내는 것으로 밝혀졌는데 (도 24), 이는 PC3.Neo 세포주가 PC3.gD인간 PSCA 클론 4 세포에 대한 우수한 항원-음성 대조구임을 의미한다.

I. 방법

세포를 6-웰 조직 배양 등급 플레이트의 생장 배지 (시험될 항체 컨쥬게이트를 함유하거나 함유하지 않음)에 플레이팅하였다. 대조구 배양물을 500 세포/플레이트에 플레이팅하였다. 상기 컨쥬게이트에 노출된 배양물을 500 내지 5000 세포/웰의 다양한 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 5 내지 7일 동안 인큐베이션하여 콜로니를 형성시켰다. 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛 염색제로 염색하고, 콜로니의 수를 세었다. 콜로니의 수 / 플레이팅된 세포의 수로서 플레이팅 효율 (PE)을 계산하였다. 세포가 생존하는 분획을 처리된 세포의 PE / 처리되지 않은 세포의 PE로서 계산하였다. 대조구 배양물의 플레이팅 효율은 대조구 및 PSCA-발현 세포주 둘다에 대해 40-60%였다.

II. 결과: (농도는 각 항체에 대한 농도로 주어짐)

컨쥬게이트 관리# 이소타입 DM1/Ab IC ₁₀ ,M

항-PSCA 항체 #2761-DM1 1461-44 IgG_2a 3.39 ~1 x 10^-9

항-PSCA 항체 #2399-DM1 1461-165 IgG_2b 2.94 ~3 x 10^-10

항-돼지풀 항체 #1428-DM1 1461-154 IgG_2a 2.68 무독성

항-돼지풀 항체 #1429-DMl 1461-175 IgG_2b 1.85 무독성

항체 컨쥬게이트 2399-DM1은 연속 노출시 PC3.gD인간 PSCA 클론 4 세포에 대해 IC_1O ∼ 3 x 10^-10 M의 세포독성을 나타내었다 (도 25). 이소타입-매치 대조구 1429-DM1은 시험된 가장 높은 농도 (3 x 10^-9 M)까지 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다. 두 번째 컨쥬게이트 2761-DM1은 연속 노출시 PC3.gD인간 PSCA 클론 4 세포에 대해 IC_1O ∼ 1 x 10^-9 M의 세포독성을 나타내었다 (도 26). 이소타입-매치 대조구 1428-DM1은 시험된 가장 높은 농도 (3 x 10^-9 M)까지 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다. 4종의 항체-DM1 컨쥬게이트 중 어떤 컨쥬게이트도 시험된 가장 높은 농도 (3 x 10^-9 M)까지 PC3.Neo 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다 (도 27).

결론

항체 컨쥬게이트 2399-DM1 및 2761-DM1은 PSCA 항원-양성 세포에 대해 특이적으로 세포독성을 나타내었다.

<실시예 9>

생체내에서 종양 생장에 대한 항체-DM1 컨쥬게이트의 효과

I. 재료 및 방법

1일째, 0.2 ml의 5 X 10⁶ PC-3gdPSCA 세포를 6-8주 된 암컷 NCR 누드 마우스 (Taconic, Inc.)에게 피하 주사하였다. 종양을 5일 동안 생장시킨 후, 칼리퍼를 사용하여 2차원으로 종양의 크기를 측정하였다. 종양 부피는 식 V = 0. 5a X b²를 이용하여 mm³으로 표현하였는데, 여기서, a 및 b는 각각 종양의 장직경 및 단직경이다. 평균 종양 부피가 160 mm³인, 7마리의 마우스로 구성된 6개 군으로 마우스를 나누었다. 6일째, 항체 처리를 시작하였다. 노출 (DM1이 결합되지 않은) 항-PSCA 항체 2399 (8D11), 2761 (6B8) 및 항-돼지풀 음성 대조구 항체 1428을 10 mg/kg의 투여량으로 주당 2회씩 복강내 (IP) 주사하였다. 이 치료법은 실험 내내 계속하였다. 메이탄시노이드 세포독소 DM1에 결합되어 있는 동일한 항체를 75 ㎍/kg의 DM1 농도로 정맥내 (IV) 주사하였다. DM1 항체를 주 당 2회 투여하여 총 8회 투여하였다. 종양은 실험 내내 주 당 2회 측정하였다. 아래 표 8에는 투약법이 기재되어 있다.

<표 8>

군	항체	DM1 투여량	AB 투여량	스케쥴
1	2399-노출 항체IP	N/A	10 mg/kg	2X 주전기간 동안 지속
2	2761-노출 항체IP	N/A	10 mg/kg	2X 주전기간 동안 지속
3	항-돼지풀 노출 항체 (1428)IP	N/A	10 mg/kg	2X 주전기간 동안 지속
4	2399-DM1IV	75 ㎍/kg	5.5 mg/kg	2X 주총 8회 투여
5	2761-DM1IV	75 ㎍/kg	5 mg/kg	2X 주총 8회 투여
6	항-돼지풀-DM1 (1428)IV	75 ㎍/kg	6.1 mg/kg	2X 주총 8회 투여

결과

도 28에 나타낸 바와 같이, 치료 26일째, DM1이 결합되지 않은 항-PSCA 항체 및 DM1-항-돼지풀 대조구 항체와 비교할 때 DM1이 결합된 항-PSCA 항체 (2399 및 2761)로 치료받은 동물에서 인간 전립선 종양 (PSCA-발현 세포)이 사실상 제거되었다. DM1-2399 또는 DM1-2761으로 치료받은 7마리의 동물로 구성된 각 군에서 4마리의 동물이 검출가능한 종양을 갖고 있지 않았다. 종양이 남아있는 3마리 동물의 경우, 평균 종양 크기는 겨우 6 mm³이었지만, 이에 비해 DM1-돼지풀 대조구 항체 군의 종양 부피는 약 550 mm³이었다. 29일째에 끝나는 1회 이상의 투약 동안 DM1 치료는 계속하였다. 33일째, 모든 군의 마우스를 희생시키고 종양 조직을 모아 조직 분석을 수행하였다. 간, 신장 및 방광을 비롯한 다른 조직을 모아 항체 치료와 관련된 세포독성의 증거에 대해 조사하였다.

<실시예 10>

조직 마이크로어레이를 사용한 PSCA 발현 분석

정상 조직 및 악성 종양에서 인간 PSCA의 발현은 다중-조직 어레이 상에서 동위원소 원위치 혼성화 (ISH)를 수행하여 조사하였다. 조직 마이크로어레이 (TMA)는 전형적으로 백개 내지 천개 이상의 각 조직 샘플을 함유하는 파라핀 블록이다. TMA는 파라핀 블록에 포매된 "공여" 조직으로부터 작은 생검 샘플을 채취하고 생검을 단일 "수용" 블록에 다시 포매하여 어레이를 형성함으로써 제작하였다.

I. 방법

768 b의 인간 PSCA 단편이 증폭되도록 PCR 프라이머 (상류-5' ACC CAC GCG TCC GGC TGC TT 3' [서열 24] 및 하류-5' CGG GGG ACA CCA CGG ACC AGA 3' [서열 25])를 디자인하였다. 프라이머에는 27개의 뉴클레오티드로 구성된 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 개시 부위를 코딩하는 익스텐션 (extension)이 포함되어 있어 증폭된 생성물로부터 각각 센스 프로브 또는 안티센스 프로브의 시험관내 전사가 가능하다. 종양 마이크로어레이 슬라이드로부터 파라핀을 제거하고, 37℃에서 20 ㎍/ml의 프로테이나제 K로 15분 동안 단백질을 제거하고, 원위치 혼성화를 위한 추가 처리를 수행하였다. ³³P-UTP로 표지된 센스 및 안티센스 프로브를 55℃에서 밤새 동안 상기 절편과 혼성화시켰다. 결합되지 않은 프로브는 37℃에서 20 mg/ml의 RNase A와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 55℃에서 0.1 X SSC로 2시간 동안 고엄격 수세를 수행하고 농도가 점차 변하는 에탄올을 통해 탈수시킴으로써 제거하였다. 상기 슬라이드를 NBT2 핵 트랙 에멀젼 (Eastman Kodak)에 담구고, 4℃에서 건조제를 함유하는 밀봉된 플라스틱 슬라이드 박스에 4주 동안 노출시키고, 현상하고 헤마톡실린 및 에오신으로 대비염색하였다.

II. 결과

정상 전립선 및 전립선 종양의 ISH 분석 결과는 표 9에 요약되어 있다.

<표 9>

	원위치 혼성화 (ISH)
조직	음성	약한 양성	강한 양성
정상 전립선 (n=29)	55%	28%	17%
정상 요로상피 (n=4)	0%	25%	75%
원발성 전립선암 (n=97)	48%	27%	25%
전이성 전립선암 (n=28)	22%	39%	39%

원발성 전립선암 군에는 7가지 경우의 전립선 상피내 종양 (PIN; PSCA에 대해 한 경우는 음성이고, 한 경우는 약한 양성이고, 5가지 경우는 강한 양성임)이 포함된다. 전이성 전립선암 군은 25가지 경우의 림프절 전이, 2가지 경우의 간 전이 (두 경우 모두 PSCA에 대해 강한 양성을 나타냄) 및 한 경우의 뇌 전이 (PSCA에 대해 약한 양성을 나타냄)로 구성된다. 추가적인 전립선 다중-조직 어레이 (정상 전립선, 원발성 및 전이성 전립선암)에 대한 예비 결과는 이들 수를 확인시켜준다. 다른 종양 타입 (폐 및 결장)에 대한 결과는 예비적인 것이고 대략 10%의 폐 종양 및 5%의 결장 종양이 약한 정도 또는 중간 정도로 PSCA를 발현함을 나타낸다.

<실시예 11>

종양 및 정상 조직의 PSCA 분포

실시예 11에는 본원의 항-PSCA mAb를 사용한 면역조직화학 분석 (IHC)으로 조사한 종양 및 정상 조직에서의 PSCA 분포가 기재되어 있다. 일련의 원발성 기관-국한 전립선암의 PSCA 발현을 조사하였다. 또한, 유방, 폐, 결장 및 신장 종양의 동결 절편, 및 결장암종 세포주에서 PSCA의 발현을 분석하였다. 따로, 이 IHC 연구에 사용되는 경우와 동일한 경우 중 일부 경우에 대해 PSCA에 대한 Taqman (상표명) 분석을 수행하였다. TaqMan (상표명)은 실시간으로 유전자 증폭을 모니터링하기 위해 Taq DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는, 형광 PCR을 기초로 한 기술이다.

동결된 절편에 대한 PSCA의 염색 방법

레이카 동결절편기 (Leica cryostat)를 사용하여 즉석에서 동결된 종양 조직으로부터 5 마이크론 두께의 동결 절편을 잘라내어 나중에 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.

절편을 완벽히 건조하고 아세톤/에탄올로 5분 동안 고정시켰다. 이어서, 상기 절편을 포스페이트-완충 생리수 (PBS)로 각각 5분 동안 2회 린싱하였다. 글루코스 옥시다제 / 글루코스 방법을 이용하여 37℃에서 60분간 내인성 퍼록시다제 활성을 켄칭하였다. 그 후, PBS로 각각 5분 동안 2회 린싱하였다. 내인성 바이오틴은 벡터 아비딘 / 바이오틴 블로킹 키트를 사용하여 블로킹하였다. 내인성 이뮤노글로불린 결합 부위는 10% 정상 말 혈청으로 30분 동안 블로킹하였다. 블로킹 혈청은 씻어내지 않았다.

상기 절편은 블로킹 혈청으로 희석된 항-PSCA 뮤린 항체 10 ㎍/ml와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 마우스 이소타입 대조구 항체 (Zymed)는 음성 대조구로 사용하였다. 상기 절편은 PBS로 각각 5분 동안 2회 린싱하였다. 특이적으로 결합된 1차 항체는 바이오티닐화 말 항-마우스 IgG로 검출하였다. 상기 절편은 블로킹 혈청으로 1:200까지 희석된 바이오티닐화 말 항-마우스 IgG와 함께 30분간 인큐베이션하였다. 절편을 PBS로 각각 5분 동안 2회 린싱하고, 희석된 ABC 시약과 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 다시 PBS로 각각 5분 동안 2회 린싱하였다. 절편을 피어스 메탈 인핸스 DAB (Pierce Metal Enhanced DAB)과 함께 5분 동안 인큐베이션한 후, 수도물로 5분 동안 린싱하고, 헤마톡실린 (Mayer)으로 1분 동안 대비염색한 다음, 물로 린싱하고, 70%, 95% 및 100% 에탄올에 이어서 크실렌 내로 옮기고, 커버슬라이드로 덮었다. 그 후, 절편을 탈수시키고, 깨끗하게 하고 합성 마운팅 배지에 마운팅하였다.

결과

악성 상피세포의 PSCA 발현이 관찰되었다. 발현도는 약한 수준부터 매우 강한 수준까지 있었고, 악성 세포 양성의 비율은 10% 미만 내지 95를 넘는 범위이었다. PSCA mRNA는 이미 원위치 혼성화를 통해 결장직장 선암종의 경우 입증된 바 있다.

<실시예 12>

동물 모델은 병리 메카니즘의 이해 및 신규 치료법의 개발에 유용하다. 본 연구는 원위치 혼성화에 의해 관찰된 태아 및 성인 조직의 뮤린 PSCA의 발현 패턴뿐만 아니라, 인간 전립선 선암종에 대한 뮤린 모델을 보고한다.

구조적으로, PSCA는 Thy-1/Ly-6 단백질 족에 속하는 단백질과 상동성을 나타내는 GPI-결합 막 당단백질이다. PSCA는 미성숙 림프구에 대한 세포 표면 마커인 Sca2에 가장 밀접하게 관련되어 있다 (Noda S. et al. Journal of Experimental Medicine 1996 ; 183 : 2355-60). 정상 조직에서 인간 PSCA RNA의 발현은 본래 조직 특이적인 것으로 기재되어 있을뿐만 아니라, 본질적으로 전립선 기저 세포에 제한된다. 본 발명자들은 이와 같은 발현 패턴의 관찰 및 Sca2와의 구조적 상동성으로부터 PSCA가 "줄기 (stem)" 세포 항원일 수 있다고 추측하였다.

뮤린 상동체는 뉴클레오티드 및 아미노산 수준에서 인간 PSCA와 70% 동일성을 나타내는 것으로 밝혀진 바 있다 (Reiter RE et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1735-40). 인간 전립선암에 대해 잘 확립된 한 동물 모델은 마우스 전립선의 형질전환 선암종 (TRAMP(상표명))이다 (Greenberg NM, 1995, PNAS 92 : 3439-43). 인간의 전립선과 비교할 때 마우스 전립선은 인간의 전립선과는 해부학적으로 상당한 차이점이 있지만, 분비 기능 및 호르몬 조절을 비롯한 고유의 공통된 특성이 있다. TRAMP (상표명) 모델에서, 래트의 프로바신 (probasin) 유전자의 최소 프로모터는 SV40 라지 T-항원 (large T-antigen)을 전립선 상피에서만 특이적으로 발현시킨다. 모든 수컷 TRAMP (상표명) 마우스는 대개 8-12주쯤에 전립선암으로 진행된다 (Gingrich JR et al., 1997, Cancer Research 57 : 4687-91). 자가유래성 TRAMP 모델은 암이 전립선 상피에서만 특이적 발생되고 이러한 암의 발생이 초기에 안드로겐에 의해 조절된다는 점에서 특히 인간 전립선암종과 관련되어 있다. 또한, 결국 원거리 부위로의 전이가 일어난다 (Gingrich JR et al., 1996, Cancer Research 56 : 4096-102 ; Gingrich JR et al., 1999, Prostate Cancer & Prostatic Diseases 2 : 70-75).

I. 재료 및 방법

마우스 및 조직 모으기

10-24주 된 수컷 및 암컷 성숙 CD-1 마우스를 찰스 리버 래보레이토리 (Charles River laboratory)로부터 얻었다. 배아를 모으기 위해 임신한 마우스를 정렬하였다. 교미 플러그를 단리한 날을 배아 발달의 1일로 간주하였다. ISH로 조사한 태아 조직에는 E10, E13, E14, E15, E17 및 E18이 포함된다. 조사된 성숙 조직에는 수컷의 요생식기 시스템 조직, 암컷의 요도 방광 및 신장 조직, 연모 유선 조직, 임신 14일 된 유선 조직, 수유 유선 조직, 간 조직, 심장 조직, 피부 및 장 조직이 포함된다. 모든 조직을 4% 포르말린을 고정시키고 파라핀에 포매하였다. TRAMP (상표명) 형질전환 마우스의 종축 (번식하는) 쌍을 노만 그린버그 박사 (Dr. Norman Greenberg; BaylorCollege of Medicine, Houston, TX))로부터 얻었다. 12 및 24주 된 야생형 리터 메이트 (한 배 새끼) C57BL/6로부터 얻은 요생식기 조직을 채취하여 같은 나이의 TRAMP (상표명) 형질전환 마우스와 비교하였다. 12주 된 TRAMP (상표명) 마우스는 전형적으로 PIN 및(또는) 잘 분화된 종양으로 진행되어 있었다. 12 내지 39주 된 9마리의 TRAMP (상표명) 수컷 마우스를 희생시키고, 통상적인 조직학적 연구 및 ISH 연구를 위해 조직을 모았다. 전립선암의 조직학적 등급은 TRAMP (상표명) 모델에 대한 이전에 공개된 연구에 따라 결정하였다 (Gingrich JR et al., 1999, Prostate Cancer & Prostatic Diseases 2 : 70-75).

뮤린 PSCA 오르토로그 (Orthologue)의 클로닝

뮤린 PSCA에 대한 전장 cDNA는 17일 된 마우스 배아 마라톤-레디 (Marathon-Ready) cDNA (Clontech)로부터 증폭하였다. 진뱅크에 존재하는 EST 서열을 토대로 하여 프라이머를 디자인하였다. 센스 프라이머 (5' ACT ATG AAG CTT TGC AGC TCA TCC CTT CAC AAT CG 3' (서열 20)), 및 3' 비번역 영역에 존재하는 안티센스 프라이머 (5' GAA TTC GGA TCC ACC ATG AAG ACC GTC TTC TTT CTC CTG CTG 3' (서열 21))를 사용하여 420 bp의 단편을 얻고, 이 단편을 PCR 서브클로닝 벡터 PCR2.1TOPO (Invitrogen)에 클로닝하였다. 클론을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

제자리 혼성화 (In Situ Hybridization)

뮤린 PSCA의 388bp 단편을 증폭하도록 PCR 프라이머 (상류 - 5' CCT GCT GGC CAC CTA CT 3' 및 하류 - 5' CCT TCA CAA TCG GGC TAT 3' - 각각 서열 22 & 23)를 디자인하였다. 프라이머는 27개의 뉴클레오티드로 구성된 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 개시 부위를 코딩하는 부분을 포함하므로 증폭된 생성물로부터 각각 센스 또는 안티센스 프로브를 시험관내 전사할 수 있다 (Lu et al. Cell Vision 1994, 1 : 169-176). 5 ㎛ 두께의 절편으로부터 파라핀을 제거하고 37℃에서 4 ㎍/㎖의 프로테이나제 K로 30분 동안 상기 절편의 단백질을 분해하고, 제자리 혼성화를 위한 추가 처리를 수행하였다. ³³P-UTP로 표지된 센스 및 안티센스 프로브를 55℃에서 상기 절편과 밤새 혼성화시켰다. 37℃에서 20 mg/ml의 RNase A와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 55℃에서 0.1 X SSC로 2시간 동안 고엄격 수세을 수행하고 농도가 점차 달라지는 에탄올을 통해 탈수시킴으로써 결합되지 않은 프로브를 제거하였다. 슬라이드를 NBT2 핵 트랙 에멀젼 (Eastman Kodak)에 담구고, 4℃에서 건조제를 함유하는 밀봉된 플라스틱 박스에 4주 동안 노출시키고, 현상하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 대비염색하였다: 제자리 혼성화는 센스 및 안티센스 프로브를 사용하여 중복된 절편 상에서 관례적으로 수행하였다. 센스 프로브와 혼성화된 절편에서는 별다른 혼성화 신호가 관찰되지 않았다.

결과

결과를 요약하면, 뮤린 PSCA는 태아의 발생 동안 요생식동, 피부 및 위장관에서 발현된다. 이들 조직에서의 발현은 대부분 표면 세포층에 제한된다. 성숙 마우스에서, 발현은 요로의 점막 내층에서 가장 높다. 정상적인 성숙 전립선에서, PSCA의 발현은 분비 상피에서만 검출된다. TRAMP (상표명) 모델에서 뮤린 전립선의 암발생 과정 동안 PSCA을 조사한 결과, PSCA의 발현이 종양 영역에서 현저히 증가되어 있었다.

이 연구는 뮤린 PSCA의 발현이 전립선 특이적이지 않고 PSCA이 줄기세포 마커일 것이라는 가설과 일치하지 않음을 입증한다. 연구 결과로부터, 상피 표면에서의 PSCA의 발현이 인간 PSCA 유전자에 대해 보고된 바와 같이 기저 세포가 아니라 표피 세포층에 제한된다는 것을 명백히 알 수 있다. 표피 세포층의 세포는 전형적으로 고도의 분화를 나타내지만, 줄기세포와는 달리 낮은 증식능 또는 낮은 자가-재생능을 나타낸다. 그러므로, "줄기세포 항원"이라는 이 분자의 명칭은 문제의 소지가 있다. 이러한 결과는 정상 조직 및 뮤린 전립선 선암종의 조직에서의 뮤린 PSCA의 발현 패턴이 인간 전립선 선암종에 대한 공개된 데이타와는 다르다는 것을 제시한다. 특히, TRAMP(상표명) 종양과 인간 전립선 선암종 사이의 PSCA 발현의 차이는 PSCA 발현의 종-특이적 조절을 나타내거나 진행되고 있는 암발생의 유형과 관련되어 있다.

PSCA의 가장 높은 발현은 발생중인 요로상피 및 성숙 요로에서 검출된다. 성숙 유기체에서, PSCA의 발현은 신우부터 요도까지 연속되는 것으로 보인다. 전립선의 발현은 고르지 못하지만, 대전립선관과 요도가 만나는 부위에서 현저히 증가한다. 이러한 발견이 이들 구조 내로의 소변의 역류와 관련되어 있는 지를 조사하여 PSCA 단백질의 기능에 대한 잠재적인 단서를 제공하고자 한다. PSCA 발현을 나타내는 상피 표면의 공통적인 특징은 상기 표면이 체액, 점액 또는 분비물가 연속 접촉하는 구조를 형성하는 경계를 이룬다는 사실이다. 이러한 사실은 요로상피의 경우 분명한 사실이지만, 상당한 PSCA 발현이 양막, 항문관, 구강인두, 식도 및 발생중인 태아의 피부에 존재한다는 관찰에 대해서도 사실이다. 어떠한 가설 또는 메카니즘에 구애되지 않고, 추가적인 공통 요소가 작용할 가능성이 있는데, 이는 태아의 기관기관지수와 같은 다른 체액-노출 상피 조직이 PSCA를 발현하지 않기 때문이다. 태아 피부에서의 PSCA의 발현이 일시적으로 조절되는지는 측정된 배아의 수가 작은 시점에서는 결정하기 어렵다. 그러나, 피부에서의 PSCA의 발현은 태아난 후 자궁외의 생존에 더 이상 불필요한 것 같다. 다중층 상피 표면 내의 발현 패턴은 PSCA가 외부 자극에 대한 장벽 또는 완충제로 작용할 수 있음을 암시한다. 또한, PSCA 넉아웃 마우스의 발생과 같은 연구는 정상 조직에서의 PSCA의 주요 기능을 밝히는 데 도움이 될 것이다.

PSCA가 태아 및 성인 조직에서 다소 선택적으로 발현되기 때문에, 상기 마우스는 PSCA 단백질의 생리적 기능을 밝히는 데 적합한 모델이 된다. PSCA가 진행된 종양 단계에서 없어진다고 하더라도, TRAMP (상표명) 모델은 여전히 전립선암의 표적으로서 PSCA를 연구하는 데 잠재적으로 유용한 수단일 수 있다.

결론

상기 실시예는 본 발명의 항-PSCA 항체가 생체내에서 PSCA-발현 암세포에만 효과적으로 인식하여 결합하고 GPI-결합 PSCA 분자, 및 이 분자에 결합된 항체가 PSCA-발현 암세포와 상기 항체의 결합시 신속히 내재화됨을 입증하였다. 항-PSCA 항체는 생체내에서, 종양 세포의 사멸 및 종양 생장의 저해에 있어서 특이성 및 효능을 보였다. 종양 세포의 세포독성은 독소, 특히 세포내에서 작용하는 독소인 메이탄시노이드 DM1과 결합된 항체를 사용할 때 매우 상승되었다. DM1과 결합된 항-PSCA 항체를 사용하여 치료하였을 때 생체내에서 PSCA-발현 인간 전립선 종양 세포가 완전히 제거되었다 (실시예 9 참조)

IX. 참고문헌

본원에서 언급된 참고문헌 (특허, 공개된 출원 및 다른 공개물을 포함함)은 그 내용이 본원에 포함되는 것으로 한다.

본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한 당업계의 기술 수준 내에 있는 통상적인 분자생물학 기술 등을 사용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995); PCR : A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2^nd Ed. (R. Freshney et aL eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocvtochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T. K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988); Antibody Engineering, second edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology]에 상세히 설명되어 있다.

X. 세포주 및 DNA의 기탁

하기 하이브리도마 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U. S. A.)에 기탁하였고, 다음과 같은 기탁번호를 부여받았다.

하이브리도마 ATCC 기탁번호 기탁일

PSCA.10E3 PTA-717 1999년 9월 16일

PSCA.6F8 PTA-718 1999년 9월 16일

PSCA.8D11 PTA-719 1999년 9월 16일

PSCA.5F2 PTA-720 1999년 9월 16일

PSCA.6C3 PTA-880 1999년 10월 26일

PSCA.6B8 PTA-2265 2000년 7월 25일

PSCA.1OC5 PTA-2264 2000년 7월 25일

다음 벡터 DNA (실시예 1 참조)도 ATCC에 기탁하였다.

pRK-2403L PTA-2623 2000년 10월 24일

pRK-2761L PTA-2620 2000년 10월 24일

pRK-2403H PTA-2622 2000년 10월 24일

pRK-2761H PTA-2621 2000년 10월 24일

상기 기탁된 하이브리도마 세포주의 명칭은 언급 편의상 단축하여 기재하였는데, 이들 하이브리도마는 (그들의 완전한 명칭과 함께) 표 2B에 나열된 클론에 상응한다.

기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸시키거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 이러한 기탁은 이 기탁물이 본 발명을 실시하는 데 반드시 필하다는 것을 시인하는 것은 아니다.

Sequence Listing <110> Genentech, Inc. Devaux, Brigitte Keller, Gilbert-Andre. Koeppen, Hartmut Lasky, Laurence A. <120> Anti-Tumor Antibody Compositions and Methods of Use <130> P1777R1PCT <140> PCT/US00/29603 <141> 2000-10-27 <150> US 60/162,558 <151> 1999-10-29 <150> US 60/182,872 <151> 2000-02-16 <160> 25 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val 20 25 30 Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly 35 40 45 Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln 65 70 75 Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala 95 100 105 Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro 110 115 120 Gly Gln Leu <210> 2 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atg aag gct gtg ctg ctt gcc ctg ttg atg gca ggc 36 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly 1 5 10 ttg gcc ctg cag cca ggc act gcc ctg ctg tgc tac tcc 75 Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser 15 20 25 tgc aaa gcc cag gtg agc aac gag gac tgc ctg cag gtg 114 Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val 30 35 gag aac tgc acc cag ctg ggg gag cag tgc tgg acc gcg 153 Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys Trp Thr Ala 40 45 50 cgc atc cgc gca gtt ggc ctc ctg acc gtc atc agc aaa 192 Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 55 60 ggc tgc agc ttg aac tgc gtg gat gac tca cag gac tac 231 Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr 65 70 75 tac gtg ggc aag aag aac atc acg tgc tgt gac acc gac 270 Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 ttg tgc aac gcc agc ggg gcc cat gcc ctg cag ccg gct 309 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala 95 100 gcc gcc atc ctt gcg ctg ctc cct gca ctc ggc ctg ctg 348 Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu 105 110 115 ctc tgg gga ccc ggc cag cta tag 372 Leu Trp Gly Pro 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Tyr 305 310 315 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 320 325 330 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 335 340 345 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 350 355 360 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 365 370 375 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 380 385 390 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 395 400 405 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 410 415 420 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 425 430 435 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 440 445 450 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 455 460 465 Lys <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is chimeric mouse/human <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile 1 5 10 15 Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly 95 100 105 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 110 115 120 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 125 130 135 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 140 145 150 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 155 160 165 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 175 180 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195 Val Tyr Ala Cys Glu Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 13 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is chimeric mouse/human <400> 13 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Glu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Pro Ser Gly Asn Ser Phe Thr 20 25 30 Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Arg Val Asp Pro Asn Asn Gly Phe Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Gly Asn Phe Phe Asp Ser Trp Gly 95 100 105 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Gly Pro 110 115 120 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 125 130 135 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 140 145 150 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 155 160 165 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 185 190 195 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 200 205 210 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 215 220 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a primer <400> 14 aaggctgtgc tgcttgccct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a primer <400> 15 gagtggcaca aaggcctggg 20 <210> 16 <211> 372 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 16 atg aag gct gtg ctg ctt gcc ctg ttg atg gca ggc 36 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly 1 5 10 ttg gcc ctg cag cca ggc act gcc ctg ctg tgc tac tcc 75 Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser 15 20 25 tgc aag gcc cag gtg agc aac gag gac tgc ctg aat gtg 114 Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Asn Val 30 35 gag aac tgc acg cag ccg gag gag cag tgc tgg acc gag 153 Glu Asn Cys Thr Gln Pro Glu Glu Gln Cys Trp Thr Glu 40 45 50 cgc atc cgc gcc gtg ggc ctc ctg acc gtc atc agc aaa 192 Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 55 60 ggc tgc agc tca aac tgc gtg gat gac tca cag gac tac 231 Gly Cys Ser Ser Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr 65 70 75 tac gtg ggc aag aag aac atc acc tgc tgt gac acc gac 270 Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 ttg tgc aac gcc agc ggg gcc cat gca ctg cag ccg gct 309 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala 95 100 gct gcc atc ctg gca ctg ctc cct gca ctc agt ctg ctg 348 Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ser Leu Leu 105 110 115 ctt tgg agc ccc aga cag ctg t ag 372 Leu Trp Ser Pro Arg Gln Leu 120 123 <210> 17 <211> 123 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 17 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val 20 25 30 Ser Asn Glu Asp Cys Leu Asn Val Glu Asn Cys Thr Gln Pro Glu 35 40 45 Glu Gln Cys Trp Thr Glu Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Ser Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln 65 70 75 Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala 95 100 105 Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ser Leu Leu Leu Trp Ser Pro 110 115 120 Arg Gln Leu <210> 18 <211> 372 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 18 atg aag gct gtg ctg ctt gcc ctg ttg atg gca ggc 36 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly 1 5 10 ttg gcc ctg cag cca ggc act gcc ctg ttg tgc tac tcc 75 Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser 15 20 25 tgc aag gcc cag gtg agc aac gag gac tgc ctg aat gtg 114 Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Asn Val 30 35 gag aac tgc acg cag ccg gag gag cag tgc tgg acc gag 153 Glu Asn Cys Thr Gln Pro Glu Glu Gln Cys Trp Thr Glu 40 45 50 cgc atc cgc gcc gtg ggc ctc ctg acc gtc atc agc aaa 192 Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 55 60 ggc tgc agc tca aac tgc gtg gat gac tca cag gac tac 231 Gly Cys Ser Ser Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr 65 70 75 tac gtg ggc aag aag aac atc acc tgc tgt gac acc gac 270 Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 ttg tgc aac gcc agc ggg gcc cat gcc ctg cag cca gct 309 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala 95 100 gct gcc atc ctg gca ctg ctc cct gca ctc agc ctg ctg 348 Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ser Leu Leu 105 110 115 ctt tgg ggc ccc aga cag ctg t ag 372 Leu Trp Gly Pro Arg Gln Leu 120 123 <210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 19 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val 20 25 30 Ser Asn Glu Asp Cys Leu Asn Val Glu Asn Cys Thr Gln Pro Glu 35 40 45 Glu Gln Cys Trp Thr Glu Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Ser Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln 65 70 75 Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90 Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala 95 100 105 Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ser Leu Leu Leu Trp Gly Pro 110 115 120 Arg Gln Leu <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a primer <400> 20 actatgaagc tttgcagctc atcccttcac aatcg 35 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a primer <400> 21 gaattcggat ccaccatgaa gaccgtcttc tttctcctgc tg 42 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a PCR primer <400> 22 cctgctggcc acctact 17 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a primer <400> 23 ccttcacaat cgggctat 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a PCR primer <400> 24 acccacgcgt ccggctgctt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is a PCR primer <400> 25 cgggggacac cacggaccag a 21

Claims (59)

1. 삭제
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5. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁된, 기탁번호 제PTA-717호의 하이브리도마, 제PTA-718호의 하이브리도마, 제PTA-719호의 하이브리도마, 제PTA-720호의 하이브리도마, 제PTA-880호의 하이브리도마 및 제PTA-2265호의 하이브리도마로 구성된 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되거나, 서열 10 및 서열 11, 또는 서열 12 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는, 생체내에서 포유동물 세포 상의 전립선 줄기세포 항원 (PSCA)에 결합할 때 내재화하는 단리된 항-전립선 줄기세포 항원 (PSCA) 항체.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서, 생장 억제제와 결합되어 있는 항체.
8. 제5항에 있어서, 세포독성제와 결합되어 있는 항체.
9. 제8항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
10. 제9항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소인 항체.
11. 제10항에 있어서, 상기 독소가 메이탄시노이드 (maytansinoid) 및 칼리케아미신 (calicheamicin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
12. 제11항에 있어서, 상기 독소가 메이탄시노이드인 항체.
13. 제12항에 있어서, 상기 메이탄시노이드가 도 22에 기재된 구조를 갖는 것인 항체.
14. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 암세포인 항체.
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20. 제14항에 있어서, 상기 암세포가 전립선암, 방광암, 폐암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암으로부터 유래한 것인 항체.
21. 제20항에 있어서, 상기 암이 전립선암인 항체.
22. 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
23. 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 제22항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
24. 제5항의 항체를 생산하는 세포.
25. 제24항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, 기탁번호 제PTA-717호의 하이브리도마, 제PTA-718호의 하이브리도마, 제PTA-719호의 하이브리도마, 제PTA-720호의 하이브리도마, 제PTA-880호의 하이브리도마 및 제PTA-2265호의 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포.
26. 제23항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
27. 제26항에 있어서, 박테리아 세포인 숙주 세포.
28. 제24항의 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 제5항의 항체의 생산 방법.
29. 제5항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, PSCA-발현 암의 완화를 위한 조성물.
30. 제29항에 있어서, 상기 항체가 세포독성제와 결합되어 있는 것인 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드인 조성물.
32. 삭제
33. 삭제
34. 제5항의 항체, 및 암세포의 사멸 수준을 측정하기 위한 수단을 포함하는, PSCA-발현 암의 진단을 위한 키트.
35. 제34항에 있어서, 상기 암세포가 전립선암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포 및 췌장암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키트.
36. 제35항에 있어서, 상기 암세포가 전립선암 세포인 키트.
37. 제36항에 있어서, 상기 전립선암이 안드로겐 비의존성 전립선암인 키트.
38. 제36항에 있어서, 상기 암세포가 전이성 전립선암 세포인 키트.
39. 제34항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 키트.
40. 삭제
41. 제34항에 있어서, 상기 항체가 세포독성제와 결합되어 있는 것인 키트.
42. 제41항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 구성된 군으로부터 선택되는 독소인 키트.
43. 제42항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드인 키트.
44. 삭제
45. 제41항에 있어서, 상기 세포독성제가 방사성 동위원소인 키트.
46. 삭제
47. 삭제
48. 제29항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 방광암, 폐암 또는 췌장암인 조성물.
49. 제48항에 있어서, 상기 암이 전립선암인 조성물.
50. 제49항에 있어서, 상기 전립선암이 안드로겐 비의존성 또는 전이성 전립선암인 조성물.
51. 삭제
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53. 삭제
54. 제31항에 있어서, 상기 메이탄시노이드가 도 22에 기재된 구조를 갖는 것인 조성물.
55. 제29항에 있어서, 상기 항체가 1종 이상의 화학요법제와 함께 투여되는 것인 조성물.
56. 제55항에 있어서, 상기 화학요법제가 탁산 (taxane)인 조성물.
57. 제55항에 있어서, 상기 화학요법제가 팩클리탁셀 (paclitaxel) 또는 그의 유도체인 조성물.
58. 제5항의 항체를 포함하는 조성물, 이 조성물이 함유되어 있는 용기, 및 상기 조성물이 전립선암의 치료에 사용할 수 있다는 것을 설명하는 포장 삽입물을 포함하는 제품.
59. 제5항의 항체를 포함하는 조성물, 이 조성물이 함유되어 있는 용기, 및 상기 조성물이 방광암의 치료에 사용할 수 있다는 것을 설명하는 포장 삽입물을 포함하는 제품.