ES2343746T3 - Composiciones de anticuerpo ovr110 y metodos de uso. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar cáncer de cabeza y cuello en un sujeto, comprendiendo el método, (a) combinar una muestra de líquido corporal de un sujeto con un anticuerpo anti-Ovr110 en condiciones adecuadas para la unión específica del anticuerpo anti-Ovr110 con Ovr110 en dicha muestra, (b) determinar el nivel de Ovr110 en dicha muestra, (c) comparar el nivel de Ovr110 determinado en la etapa (b) con el nivel de Ovr110 en un control, en el que un aumento en el nivel de Ovr110 en la muestra del sujeto en comparación con el control es indicativo de la presencia de cáncer de cabeza y cuello en el sujeto.
Description
Composiciones de anticuerpo Ovr110 y métodos de
uso.
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La presente invención se refiere a las
composiciones de anticuerpo anti-Ovr110 y a métodos
de destrucción de células de cáncer de cabeza y cuello que expresan
Ovr110.
El número anual de nuevos casos de cánceres de
cabeza y cuello en los Estados Unidos es de aproximadamente 40.000,
representando aproximadamente el 5% de las neoplasias malignas en
adultos. Específicamente, la Sociedad Americana del Cáncer (ACS;
sitio web es cancer con la extensión .org de la world wide web)
estima que habrá 29.370, 14.520 y 9.880 nuevos casos de cáncer de
la cavidad bucal y faringe, cáncer de esófago y cáncer de laringe
es 2005, respectivamente. Además, la ACS estima que habría 7.320,
13.750 y 3.770 de muertes por cáncer de la cavidad oral y faringe,
cáncer esofágico y cáncer de laringe en 2005, respectivamente.
Además, la ACS estima que habrá 7.320, 13.570 y 3.770 muertes por
cáncer de la cavidad oral y faringe, cáncer esofágico y cáncer de
laringe en 2005, respectivamente. El carcinoma adenoide quístico
(CAQ) representa el 6% de todas las neoplasias de las glándulas
salivales y es la neoplasia maligna más común de las glándulas
salivales menores y submandibulares. No es poco común que se
produzcan recidivas 10-15 años tras el tratamiento
inicial, afectando de manera adversa al pronóstico a largo
plazo.
Existen tres opciones de tratamiento principales
para el cáncer de cabeza y cuello: cirugía, radiación y
quimioterapia. Puede usarse uno de estos tratamientos, o una
combinación de ellos, para tratar el cáncer. Los fármacos para
quimioterapia con actividad de un único agente en este entorno
incluyen metotrexato, 5-fluorouracilo, abreviado a
continuación en el presente documento como 5FU, cisplatino,
paclitaxel y docetaxel. También se usan las combinaciones de
cisplatino y 5FU, carboplatino y 5FU, y cisplatino y paclitaxel.
La cirugía, la radiación y la quimioterapia en
la cabeza y cuello pueden provocar muchos efectos secundarios bien
conocidos en la técnica. Las mejoras en el tratamiento del cáncer de
cabeza y cuello incluirían una mejor eficacia antitumoral, menos
efectos secundarios, y menores costes y tasas de hospitalización,
siendo así más asequibles para los pacientes.
La presente invención es una respuesta a la
necesidad de una terapia alternativa en el tratamiento de los
cánceres de cabeza y cuello. Se notifica que Ovr110, una
glicoproteína de superficie celular, está implicada en la
regulación negativa de la activación de células T. Estudios
recientes han demostrado que Ovr110 también se sobreexpresa en
algunas neoplasias malignas epiteliales comunes, incluyendo cáncer
de mama y de ovario. Sin embargo, no se ha demostrado la expresión
de Ovr110 en el carcinoma adenoide quístico (CAQ). La expresión de
Ovr110 en el cáncer de cabeza y cuello es útil como diana
terapéutica y/o de diagnóstico para el cáncer de cabeza y cuello,
carcinoma adenoide quístico u otros tumores de las glándulas
salivales.
De lo anterior, resulta evidente que los
procedimientos usados para detectar, diagnosticar, monitorizar,
detectar el estadio, pronosticar y prevenir la recidiva de cáncer
de cabeza y cuello son de importancia crítica para el desenlace del
paciente. Además, los procedimientos actuales, aunque útiles en cada
uno de estos análisis, están limitados por su especificidad,
sensibilidad, invasividad y/o su coste. Como tal, serían altamente
deseables procedimientos sensibles y altamente específicos que
operaran por medio de la detección de marcadores novedosos en
células, tejidos o líquidos corporales, con invasividad mínima y a
un coste razonable.
Por consiguiente, existe una gran necesidad de
métodos más sensibles y precisos para predecir si es probable que
una persona desarrolle cáncer de cabeza y cuello, para diagnosticar
cáncer de cabeza y cuello, para monitorizar la progresión de la
enfermedad, para detectar el estadio del cáncer de cabeza y cuello,
para determinar si el cáncer de cabeza y cuello ha metastatizado, y
para obtener imágenes del cáncer de cabeza y cuello. También existe
la necesidad de un mejor tratamiento del cáncer de cabeza y
cuello.
Además, la presente invención da a conocer el
uso de un anticuerpo anti-Ovr110 para la fabricación
de un medicamento para tratar o aliviar el cáncer de cabeza y
cuello.
El crecimiento y la metástasis de los tumores
sólidos también dependen de la angiogénesis. Folkman, J., 1986,
Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J.,
1989, Journal of the National Cancer Institute, 82,
4-6. Se ha demostrado, por ejemplo, que los tumores
que aumentan hasta más de 2 mm deben obtener su propio suministro
de sangre y lo hacen induciendo el crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos capilares. Una vez que estos nuevos vasos sanguíneos se
insertan en el tumor, proporcionan un medio para que las células
tumorales entren en la circulación y metastaticen en sitios
distantes tales como el hígado, pulmón o hueso. Weidner, N., et
al., 1991, The New England Journal of Medicine,
324(1), 1-8.
\global\parskip0.850000\baselineskip
La angiogénesis, definida como el crecimiento o
el brote de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes,
es un proceso complejo que se produce principalmente durante el
desarrollo embrionario. El proceso es distinto de la
vasculogénesis, porque las nuevas células endoteliales que revisten
el vaso surgen de la proliferación de células existentes, en vez de
diferenciarse de células madre. El proceso es invasivo y depende de
la proteólisis de la matriz extracelular (MEC), la migración de
nuevas células endoteliales y la síntesis de nuevos componentes de
la matriz. La angiogénesis se produce durante el desarrollo
embrionario del sistema circulatorio; sin embargo, en seres humanos
adultos, la angiogénesis sólo se produce como respuesta a un estado
patológico (excepto durante el ciclo reproductivo en mujeres).
En estados fisiológicos normales en adultos, la
angiogénesis tiene lugar sólo en situaciones muy restringidas tales
como el crecimiento del cabello y la curación de heridas. Auerbach,
W. y Auerbach, R., 1994, Pharmacol. Ther.
63(3):265-3 11; Ribatti et al., 1991,
Haematologica 76(4):3 11-20; Rissau,
1997, Nature 386 (6626):67 1-4. La
angiogénesis progresa mediante un estímulo que da como resultado la
formación de una columna de migración de células endoteliales. La
actividad proteolítica se centra en la punta de avance de este
"brote vascular", que rompe la MEC lo suficiente para permitir
que la columna de células infiltre y migre. Detrás del frente de
avance, las células endoteliales se diferencian y comienzan
adherirse entre sí, formando así una nueva membrana basal.
Entonces, cesa la proliferación de células y finalmente definen una
luz para la nueva arteriola o capilar.
Se ha reconocido de manera gradual que la
angiogénesis no regulada es responsable de una amplia gama de
trastornos, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer, enfermedad
cardiovascular, artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía
diabética. Folkman, 1995, Nat Med
1(1):27-31; Isner, 1999, Circulation
99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis
Rheum 41(6):951-62; Walsh, 1999,
Rheumatology (Oxford) 38(2):103-12;
Ware y Simons, 1997, Nat Med 3(2):
158-64.
De particular interés es la observación de que
los tumores sólidos requieren la angiogénesis para su crecimiento y
metástasis. Folkman, 1986 citado anteriormente; Folkman 1990, J.
Natl. Cancer Inst., 82(1) 4-6; Folkman,
1992, Semin Cancer Biol 3(2):65-71;
Zetter, 1998, Annu Rev Med 49:407-24.
Usualmente un tumor comienza como una única célula anómala que
puede proliferar sólo hasta un tamaño de unos pocos milímetros
cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares
disponibles, y puede permanecer "latente" sin crecimiento ni
diseminación adicionales durante un largo periodo de tiempo.
Entonces, algunas células tumorales cambian al fenotipo angiogénico
para activar las células endoteliales, que proliferan y maduran para
dar nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos
recién formados no sólo permiten el crecimiento continuo del tumor
primario, sino también la diseminación y recolonización de las
células tumorales metastásicas. No se entienden bien los mecanismos
precisos que controlan el cambio angiogénico, pero se cree que la
neovascularización de las masas tumorales resulta del balance neto
de una multitud de estimuladores y inhibidores de la angiogénesis
Folkman, 1995, citado anteriormente.
Uno de los inhibidores más potentes de la
angiogénesis es una endostatina identificada por O'Reilly y Folkman.
O'Reilly et al., 1997, Cell
88(2):277-85; O'Reilly et al., 1994,
Cell 79(2):3 15-28. Su descubrimiento
se basó en el fenómeno de que determinados tumores primarios pueden
inhibir el crecimiento de metástasis distantes. O'Reilly y Folkman
plantearon la hipótesis de que un tumor primario inicia la
angiogénesis generando estimuladores angiogénicos en mayor cantidad
que inhibidores. Sin embargo, los inhibidores angiogénicos, debido a
su semivida más larga en la circulación, alcanzan el sitio de un
tumor secundario en mayor cantidad que los estimuladores. El
resultado neto es el crecimiento del tumor primario y la inhibición
del tumor secundario. La endostatina es una de una lista creciente
de tales inhibidores de la angiogénesis producidos por tumores
primarios. Es un fragmento proteolítico de una proteína más grande:
la endostatina es un fragmento de 20 kDa de colágeno XVIII
(aminoácido H1132-K1315 en colágeno murino XVIII).
Se ha demostrado que la endostatina inhibe específicamente la
proliferación celular endotelial in vitro y bloquea la
angiogénesis in vivo. De manera más importante, la
administración de endostatina a ratones que tienen un tumor conduce
a la regresión significativa del tumor, y no se ha observado
toxicidad o resistencia al fármaco incluso después de múltiples
ciclos de tratamiento. Boehm et al., 1997, Nature 390
(6658):404-407. El hecho de que la endostatina
seleccione como diana células endoteliales genéticamente estables e
inhiba una variedad de tumores sólidos la convierte en una candidata
muy atractiva para la terapia anticancerígena. Fidler y Ellis,
1994, Cell 79(2): 185-8; Gastl et al.,
1997, Oncology 54(3):177-84; Hinsbergh et
al., 1999, Ann Oncol 10 Supl 4:60-3. Además, se
ha demostrado que los inhibidores de la angiogénesis son más
eficaces cuando se combinan con radiación y agentes quimioterápicos.
Klement, 2000, J. Clin. Invest, 195(8)
R15-24, Browder, 2000, Cancer Res. 6-(7)
1878-86, Arap et al., 1998, Science
279(5349): 377-80; Mauceri et al.,
1998, Nature 394(6690):287-91.
Tal como se discutió anteriormente, cada uno de
los métodos para diagnosticar y detectar el estadio del cáncer de
cabeza y cuello se encuentran limitados por la tecnología empleada.
Por consiguiente, existe la necesidad de marcadores celulares y
moleculares sensibles para la detección del cáncer de cabeza y
cuello. Existe la necesidad de marcadores moleculares para la
detección precisa del estadio, incluyendo la detección del estadio
clínico y patológico, de los cánceres de cabeza y cuello, para
optimizar los métodos de tratamiento. Además, existe la necesidad
de marcadores celulares y moleculares sensibles para monitorizar el
progreso de los tratamientos de cáncer, incluyendo marcadores que
pueden detectar la recidiva de cánceres de cabeza y cuello tras la
remisión.
La presente invención también da a conocer el
uso de un anticuerpo anti-Ovr110 para la fabricación
de un medicamento para tratar o aliviar el cáncer de cabeza y
cuello.
El documento WO2004/000221 da a conocer métodos
y composiciones para modular la señalización negativa mediada por
BTLA e interferir con la interacción de BTLA y B7x con fines
terapéuticos, de diagnóstico y de investigación.
El documento WO2004/101756 da a conocer
anticuerpos anti-antígeno de cáncer de mama, de
pulmón, de páncreas u de ovario (Ovr110) aislados que se
internalizan tras la unión a Ovr110 en una célula de mamífero in
vivo.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para detectar el cáncer de
cabeza y cuello en un sujeto, comprendiendo el método,
- (a)
- combinar una muestra de líquido corporal de un sujeto con un anticuerpo anti-Ovr110 en condiciones adecuadas para la unión específica del anticuerpo anti-Ovr110 a Ovr110 en dicha muestra,
- (b)
- determinar el nivel de Ovr110 en dicha muestra,
- (c)
- comparar el nivel de Ovr110 determinado en la etapa (b) con el nivel de Ovr110 en un control,
en el que un aumento en el nivel de Ovr110 en la
muestra del sujeto en comparación con el control es indicativo de
la presencia de cáncer de cabeza y cuello en el sujeto.
Preferiblemente, el control es una muestra de un
sujeto sin cáncer de cabeza y cuello.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona un método in vitro de destrucción
de una célula de cáncer de cabeza y cuello, comprendiendo el método
poner en contacto la célula cancerosa con un anticuerpo
anti-Ovr110 aislado, destruyendo de ese modo la
célula cancerosa.
Preferiblemente, la célula cancerosa es de
cáncer de cabeza y cuello metastásico.
Preferiblemente, el anticuerpo se conjuga con un
agente citotóxico.
Preferiblemente, el agente citotóxico se
selecciona de toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas
nucleolíticas.
Preferiblemente, el agente citotóxico es una
toxina seleccionada de maitansinoide, ricina, saporina y
caliqueamicina.
Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo
humanizado.
Preferiblemente, el anticuerpo es una forma
humanizada del anticuerpo producido mediante un hibridoma
seleccionado del grupo que consiste en los números de registro de la
ATCC PTA-5180, PTA-5855,
PTA-5856, PTA-5884,
PTA-6266, PTA-7128 y
PTA-7129.
Preferiblemente, el cáncer de cabeza y cuello es
carcinoma adenoide quístico.
Preferiblemente, la localización del carcinoma
adenoide quístico se selecciona de la lengua, la glándula parótida,
la nariz, el paladar, la piel, el cuello, la glándula submandibular,
la glotis, los senos, la epiglotis, el espacio bucal, los nervios,
la laringe, la boca, la faringe y la mejilla.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 aislado en la fabricación de un
medicamento para aliviar el cáncer de cabeza y cuello.
Preferiblemente, el anticuerpo
anti-Ovr110 destruye células cancerosas del cáncer
de cabeza y cuello.
Preferiblemente, las células cancerosas son de
cáncer de cabeza y cuello metastásico.
Preferiblemente, el cáncer de cabeza y cuello es
carcinoma adenoide quístico.
Preferiblemente, el anticuerpo se conjuga con un
agente citotóxico.
Preferiblemente, el agente citotóxico se
selecciona de toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas
nucleolíticas.
Preferiblemente, el agente citotóxico es una
toxina seleccionada de maitansinoide, ricina, saporina y
caliqueamicina.
Preferiblemente, el medicamento se formula para
su administración junto con al menos un agente quimioterápico.
Preferiblemente, el agente quimioterápico es
paclitaxel o derivados del mismo.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 en la fabricación de un medicamento para
tratar el cáncer de cabeza y cuello mediante la modulación de una
respuesta inmunitaria que comprende la unión a Ovr110, reduciendo de
ese modo una función inmunitaria suprimida.
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Preferiblemente, la modulación es un aumento de
la respuesta inmunitaria.
Preferiblemente, la modulación es una reducción
de la supresión de una respuesta inmunitaria.
Preferiblemente, la respuesta inmunitaria se
dirige a una célula.
Preferiblemente, la célula es una célula
cancerosa.
Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es un
aumento de los números de linfocitos que rodean un tumor, aumento de
la infiltración de linfocitos en un tumor o aumento de la activación
de linfocitos.
Preferiblemente, la función inmunitaria es
destruir una célula de cáncer de cabeza y cuello.
Alternativamente, el anticuerpo puede competir
por la unión al mismo epítopo que el epítopo unido mediante el
anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma seleccionado
del grupo de hibridomas depositados con los números de registro de
la Colección Americana de Cultivos Tipo PTA-5180,
PTA-5855, PTA-5856,
PTA-5884, PTA-6266,
PTA-7128 y PTA-7129.
También se describen en el presente documento
los anticuerpos conjugados. Pueden conjugarse con un agente
inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico. El agente
citotóxico puede seleccionarse del grupo que consiste en toxinas,
antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas y
toxinas. Los ejemplos de toxinas incluyen, pero sin limitarse a,
maitansina, maitansinoides, saporina, gelonina, ricina o
caliqueamicina.
El anticuerpo puede producirse en bacterias.
Alternativamente, el anticuerpo puede ser una forma humanizada de un
anticuerpo anti-Ovr110 producido mediante un
hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas que tienen los
números de registro de la ATCC PTA-5180,
PTA-5855, PTA-5856,
PTA-5884, PTA-6266,
PTA-7128 y PTA-7129.
Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal
anti-Ovr110 inhibe el crecimiento de células de
cáncer de cabeza y cuello que expresan Ovr110 in vivo.
También se describe en el presente documento un
método de producción de los anticuerpos que comprende cultivar una
célula apropiada y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
También se describen en el presente documento
composiciones que comprenden los anticuerpos y un vehículo. El
anticuerpo de la composición puede conjugarse con un agente
citotóxico. El agente citotóxico puede ser un isótopo radiactivo u
otro agente quimioterápico.
La invención también se refiere a un método
in vitro de destrucción de una célula de cáncer de cabeza y
cuello que expresa Ovr110, que comprende poner en contacto la célula
cancerosa con los anticuerpos descritos en el presente documento,
destruyendo de ese modo la célula cancerosa. El cáncer de cabeza y
cuello puede ser cáncer metastásico o carcinoma adenoide quístico de
cabeza y cuello.
Se proporciona el uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 para la fabricación de un medicamento
para aliviar un cáncer de cabeza y cuello que expresa Ovr110 en un
mamífero.
También se describe en el presente documento un
artículo de fabricación que comprende un recipiente y una
composición contenida en el mismo, en el que la composición
comprende un anticuerpo tal como se describe en el presente
documento. El artículo de fabricación también puede comprender un
componente adicional, por ejemplo, un prospecto indicando que puede
usarse la composición para tratar cáncer de cabeza y cuello.
Se da a conocer el uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 para la fabricación de un medicamento
para modular la señalización de un receptor Ovr110 de células
inmunitarias con señalización negativa, que comprende la unión a
Ovr110 con el anticuerpo anti-Ovr110 reduciendo de
este modo una función inmunitaria suprimida con el fin de tratar el
cáncer de cabeza y cuello.
Adicionalmente, la invención se refiere al uso
de un anticuerpo anti-Ovr110 para la fabricación de
un medicamento para modular una respuesta inmunitaria que comprende
la unión a Ovr110 con un anticuerpo anti-Ovr110
reduciendo de este modo una función inmunitaria suprimida con el
fin de tratar cáncer de cuello. La modulación puede ser un aumento
de una respuesta inmunitaria o una reducción de la supresión de una
respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede ser contra una
célula cancerosa. La respuesta inmunitaria puede ser un aumento de
los números de linfocitos que rodean un tumor, aumento de la
infiltración de linfocitos en un tumor o aumento de la activación de
linfocitos.
Figura 1: Inmunohistoquímica que demuestra la
expresión de Ovr110 en muestras de carcinoma adenoide quístico (CAQ)
usando Acm Ovr110.A57.1.
Figura 2: Inmunohistoquímica que demuestra la
presencia de células T CD3 positivas en muestras de carcinoma
adenoide quístico (CAQ) usando Ac CD3.
Figura 3: Inmunohistoquímica que demuestra la
presencia de células T CD8 positivas en muestras de carcinoma
adenoide quístico (CAQ) usando Ac CD8.
"Ovr110" humana tal como se usa en el
presente documento, se refiere a una proteína de 282 aminoácidos que
se expresa en la superficie celular como una glicoproteína, cuyas
secuencias de nucleótidos y aminoácidos se dan a conocer por
ejemplo, en el documento WO 00/12758, Ovr110 de gen específico de
cáncer (GSC); el documento WO 99/63088, proteína PRO1291 unida a la
membrana; el documento WO00/36107, antígeno de carcinoma de ovario
humano; el documento WO 02/02624-A2, proteína de
tipo B7 humana (B7-L); el documento WO 2004/101756,
Ovr110. Presumiblemente, los aminoácidos 30-282
están en la superficie celular. Ovr110 tal como se usa en el
presente documento incluye variantes alélicas y mutantes de
sustitución conservativa de la proteína que tienen actividad
biológica Ovr110.
Ovr110 se conoce en la bibliografía como B7x,
B7H4, B7S1, B7-H4 o B7h.5. La base de datos RefSeq
en el NCBI anota el registro NM_024626 como "inhibidor 1 de
activación de células T que contienen el dominio de grupo V
(VTCN1)de Homo sapiens, ARNm". A este nucleótido y
a la proteína codificada NP_078902.1 se les da el siguiente
resumen:
- B7H4 pertenece a la familia B7 (véase CD80; MIM 112203) de proteínas coestimuladoras. Estas proteínas se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno e interaccionan con los ligandos (por ejemplo, CD28; MIM 186760) en los linfocitos T. [proporcionado por OMIM].
Recientemente, una serie de tres publicaciones
independientes han identificado Ovr110 en ratón y ser humano como
nuevo miembro de la familia B-7 de células T de
moléculas coestimuladoras, una clase importante de moléculas que
regulan muy estrechamente la función de activación/inhibición de las
células T. Prasad et al., B7S1, a novel B7 family member
that negatively regulates T cell activation, Immunity
18:863-73 (2003): Sica et al.,
B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively
regulates T cell immunity, Immunity 18:849-61
(2003); y Zang et al., B7x: a widely expressed B7 family
member that inhibits T cell activation, Proc. Natl Acad. Sci USA
100:10388-92 (2003). La secuencia de aminoácidos
predicha del gen de ratón para B7S1 (Prasad 2003) era altamente
homóloga a nuestra molécula de Ovr110 identificada previamente, y la
secuencia predicha de las moléculas de B7-H4/B7x
humanas (Sica 2003; Zang 2003) eran idénticas a Ovr110. El análisis
inmunofluorescente indirecto mediante citometría de flujo confirmó
además la unión de nuestros anticuerpos monoclonales Ovr110 a
poblaciones de linfocitos T activados, tal como describieron estos
autores. A continuación se enumera una lista de referencias que
tratan sobre Ovr110.
Nuestros hallazgos de que Ovr110 se expresa en
cánceres de ovario, de páncreas, de cabeza y cuello, de endometrio
y de mama convierten a este antígeno de superficie celular en una
diana atractiva para inmunoterapia de estos y posiblemente otros
tipos de tumores.
El término "anticuerpo" (Ac) tal como se
usa en el presente documento incluye anticuerpos monoclonales,
anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por
ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo,
siempre que presenten la actividad biológica deseada. En el presente
documento, el término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera
intercambiable con "anticuerpo".
Un "anticuerpo aislado" es el que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno
natural son materiales que interferirían con los usos de
diagnóstico y terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir
enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos.
Preferiblemente, se purificará el anticuerpo (1) hasta más del 95%
en peso del anticuerpo determinado mediante el método de Lowry, y
lo más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de
un secuenciador de cubeta giratoria, o (3) hasta homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no
reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con
plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ
dentro de las células recombinantes dado que al menos un componente
del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo,
de manera habitual, se preparará el anticuerpo aislado con al menos
una etapa de purificación.
La unidad básica del anticuerpo de 4 cadenas es
una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas
ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un
anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas
básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y
por tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los
anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar
ensamblajes polivalentes que comprende 2-5 de las
unidades de 4 cadenas básicas junto con la cadena J). En el caso de
las IgG, generalmente la unidad de 4 cadenas es de aproximadamente
150.000 daltons. Cada cadena L se une a una cadena H mediante un
enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen
entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del
isotipo de la cadena H. También cada cadena H y L tienen puentes
disulfuro espaciados de manera regular entre las cadenas. Cada
cadena H tiene en el extremo N-terminal, un dominio
variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una
de las cadenas \alpha y \gamma, y cuatros dominios CH para los
isotipos L y F. Cada cadena 6L tiene en el extremo
N-terminal, un dominio variable (VL) seguido de un
dominio constante (CL) en su otro extremo.
El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con
el primer dominio constante de la cadena pesada (CHI).
Se cree que residuos de aminoácido particulares
forman una interfase entre los dominios variables de cadena pesada
y de cadena ligera. El emparejamiento de un VH y un VL juntos forma
un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las
propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por
ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edición, Daniel P.
Stites, Abba I. Teff y Tristam G. Parslow (editores), Appleton y
Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie de vertebrado
puede asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados,
denominados kappa y lambda, basándose en la secuencia de aminoácidos
de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de
aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las
inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos.
Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que
tienen cadenas pesadas designadas \alpha, \delta, \varepsilon,
\gamma y \mu, respectivamente. Las clases \gamma y \alpha
se dividen además en subclases basándose en las diferencias
relativamente menores en la función y secuencia de C_{H}, por
ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
El término "variable" hace referencia al
hecho de que determinados segmentos de los dominios variables
difieren de manera extensiva en la secuencia entre los anticuerpos.
El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad
de un anticuerpo particular para su particular antígeno. Sin
embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo
del tramo de 1-10 aminoácidos de los dominios
variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos
relativamente invariables denominados regiones de entramado (FR) de
15-30 aminoácidos separados con regiones más cortas
de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables"
que son cada una de 9-12 aminoácidos de longitud.
Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas
comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan en gran parte una
configuración de hoja P, conectadas por tres regiones
hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos
forman parte de, la estructura de hoja P. Las regiones
hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha
proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la
otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a
antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of
Proteins of Inmunological Interest, 5ª edición, Servicio de Salud
Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)). Los
dominios constantes no están implicados directamente en la unión de
un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones
efectoras, tales como participación del anticuerpo en la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA).
La expresión "región hipervariable" cuando
se usa en el presente documento hace referencia a los residuos de
aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a
antígeno. Generalmente, la región hipervariable comprende residuos
de aminoácido de una "región determinante de la
complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, aproximadamente
alrededor de los residuos 24-34 (LI), 5056 (L2) y
89-97 (L3) en el VL, y aproximadamente alrededor de
1-35 (HI), 50-65 (H2) y
95-102 (113) en el VH; Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5ª edición.
Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda,
MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable"
(por ejemplo, residuos 26-32 (LI),
50-52 (L2) y 91-96 (U) en el VL, y
26-32 (HI) 53-55
(1-12) y 96-101 (H3) en el VH;
Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 1996:901-917
(1987)).
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal
como se usa en el presente documento hace referencia a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden
la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se
producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades
menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos,
dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia
de las preparaciones de anticuerpos monoclonales que incluyen
diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes
(epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo
determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los
anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse
sin contaminarse de otros anticuerpos. El modificador
"monoclonal" no debe interpretarse como que requiere la
producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente
invención pueden prepararse mediante la metodología del hibridoma
descrita en por primera vez por Kohler et al., Nature:
256:495 (1975), o pueden prepararse usando los métodos de ADN
recombinante en células bacterianas, eucariotas, de animales o
vegetales (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º
4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden
aislarse de las bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las
técnicas descritas en Clarkson et al., Nature,
352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales del presente
documento incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una
parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a
las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una
especie particular o que pertenece a una clase o subclase de
anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s)
cadena(s) es idéntico con u homólogo a las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que
pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como
fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad
biológica deseada (véase la patente estadounidense n.º 4.816.567; y
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de
interés en el presente documento incluyen anticuerpos
"primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno
de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo,
mono del viejo mundo, simio, etc.), y las secuencias de la región
constante humana.
Un anticuerpo "intacto" es uno que
comprende un sitio de unión a antígeno así como un CL y al menos los
dominios constantes de cadena pesada, CHI, CH2 y CH3. Los dominios
constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por
ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o una
variante de la secuencia de aminoácidos de los mismos.
Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones
efectoras.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una
parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable
o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de los
fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab', F(ab')2 y
Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente
estadounidense 5.641.870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein
Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de
anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos
formados de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de
anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos,
denominados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc"
residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar
fácilmente. El fragmento Fab consiste en un cadena L completa junto
con el dominio de región variable de la cadena H (VH), y el primer
dominio constante de una cadena pesada (CHI). Cada fragmento Fab es
monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un
único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un
anticuerpo produce un único fragmento F(ab')2 grande que
aproximadamente corresponde a dos fragmentos Fab unidos por
disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y aún
puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los
fragmentos Fab porque tienen pocos residuos adicionales en el
carboxilo terminal del dominio CHI que incluye una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
designación en el presente documento para Fab' en el que el/los
residuo(s) de cisteína de los dominios constantes tienen un
grupo tiol libre. Originariamente, los fragmentos de anticuerpo
F(ab')2 se produjeron como pares de 8 fragmentos Fab' que
tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento Fc comprende las partes de
carboxilo terminal de ambas cadenas H que se mantienen juntas por
disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan
mediante las secuencias en la región Fc, región que también es la
parte que reconocen los receptores Fc (FcR) que se encuentran en
determinados tipos de células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de unión a y reconocimiento de antígeno
completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de
región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en
asociación no covalente, estrecha. Del plegamiento de estos dos
dominios proceden seis bucles hipervariables (3 bucles, cada uno,
de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácido
para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión a
antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio
variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR
específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y
unirse al antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de
unión completo.
"Fv de cadena simple" abreviado también
como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que
comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados a una
única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv
comprende además un ligador de polipéptido entre los dominios VH y
VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión
a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore
eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs.
269-315 (1994); Borrebaeck 1995, citado
posteriormente.
El término "diacuerpos" hace referencia a
pequeños fragmentos de anticuerpo preparados mediante la
construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con
ligadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos)
entre los dominios VH y VL de modo que se logre el apareamiento
entre cadenas pero no dentro de las cadenas de los dominios V,
dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento
que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos
biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "de
entrecruzamiento" en los que los dominios VH y VL de los dos
anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas.
Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el
documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448
(1993).
Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno
que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por
ejemplo, un anticuerpo) derivado de la naturaleza. Tales
polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o
pueden producirse por medios de recombinación o sintéticos. Por
tanto, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia
de aminoácidos de un polipéptido humano, polipéptido murino o
polipéptido de cualquier otra especie de mamífero que se producen
de manera natural.
La expresión "variante de secuencia de
aminoácidos" hace referencia a un polipéptido que tiene
secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto de un
polipéptido de secuencia nativa. Habitualmente, las variantes de
secuencia de aminoácidos de Ovr110 tendrán al menos aproximadamente
el 70% de homología con la secuencia nativa de Ovr110,
preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, incluso más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de homología, y lo
más preferiblemente al menos el 95%. Las variantes de secuencia de
aminoácidos pueden tener sustituciones, deleciones y/o inserciones
en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de
secuencia de aminoácidos nativa.
La frase "fragmento o análogo funcional" de
un anticuerpo es un compuesto que tiene actividad biológica
cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa. Por
ejemplo, un fragmento o análogo funcional de un anticuerpo
anti-IgE es uno que puede unirse a una
inmunoglobulina IgE de modo que se evita o reduce sustancialmente la
capacidad de tal molécula de tener la capacidad de unirse al
receptor de alta afinidad, Fc\varepsilonRI.
"Homología" se define como el porcentaje de
residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son
idénticos tras alinear las secuencias e introducir los huecos, si
es necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. Los
métodos y programas informáticos para el alineamiento son bien
conocidos en la técnica. La similitud de las secuencias puede
medirse mediante cualquier algoritmo de análisis de secuencia, tal
como GAP y BESTFIT u otra variación del alineamiento
Smith-Waterman. Véase, T. F. Smith y M. S. Waterman,
J. Mol. Biol. 147-195:197 (1981) y W.R. Pearson,
Genomics 11:635-650 (1991).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que
contienen secuencias mínimas derivadas del anticuerpo no humano.
Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los
residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por
residuos de una región hipervariable de una especie no humana
(anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no
humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.
En algunos casos, se reemplazan los residuos de la región de
entramado (FR) de la inmunoglobulina humana por los
correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el
anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Se hacen estas
modificaciones para refinar adicionalmente el rendimiento de los
anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios
variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles
hipervariables corresponden a aquéllos de una inmunoglobulina no
humana y todos o sustancialmente todas las FR son las de una
secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo
humanizado comprenderá también al menos una parte de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una
inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et
al., Nature 321:522-525 (1986); Riechman et
al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.
Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Tal como se usa en el presente documento, un
anticuerpo anti-Ovr110 que "se internaliza" es
uno que se capta por (es decir, entra en) la célula tras unirse a
Ovr110 en una célula de mamífero (es decir, Ovr110 de superficie
celular). El anticuerpo que se internaliza incluirá, naturalmente,
fragmentos de anticuerpo, anticuerpo humano o humanizado, y
conjugado de anticuerpo. Para las aplicaciones terapéuticas, se
contempla la internalización in vivo. El número de moléculas
de anticuerpo internalizadas será suficiente o adecuado para
destruir una célula que expresa Ovr110, especialmente una célula
cancerosa que expresa Ovr110. Dependiendo de la potencia del
anticuerpo o del conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la
captación de una sola molécula de anticuerpo dentro de la célula es
suficiente para destruir la célula diana a la que se une el
anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son altamente potentes en
la destrucción de modo que la internalización de una molécula de la
toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para destruir la
célula tumoral.
Mediante diversos ensayos, incluyendo aquellos
descritos en los ejemplos experimentales a continuación, puede
determinarse si un anticuerpo anti-Ovr110 se
internaliza tras la unión a Ovr110 en una célula de mamífero. Por
ejemplo, para someter a prueba la internalización in vivo, se
marca el anticuerpo de prueba y se introduce en un animal que se
sabe que expresa Ovr110 en la superficie de determinadas células. El
anticuerpo puede radiomarcarse o marcarse con partículas
fluorescentes o de oro, por ejemplo. Los animales adecuados para
este ensayo incluyen un mamífero tal como un ratón lampiño NCR que
contiene un xenoinjerto o trasplante de tumor que expresa Ovr110
humano, o un ratón en el que se han introducido células
transfectadas con Ovr110 humano, o un ratón transgénico que expresa
el transgén Ovr110 humano. Los controles apropiados incluyen
animales que no recibieron el anticuerpo de prueba o que recibieron
un anticuerpo no relacionado, y animales que recibieron un
anticuerpo con otro antígeno en las células de interés, anticuerpo
que se sabe que se internaliza tras unirse al antígeno. El
anticuerpo puede administrarse al animal, por ejemplo, mediante
inyección intravenosa. A intervalos de tiempo adecuados, pueden
prepararse secciones de tejido del animal usando métodos conocidos
o tal como se describe en los ejemplos experimentales a
continuación, y se analizan mediante microscopia óptica o
microscopía electrónica, para determinar la internalización así como
la ubicación del anticuerpo internalizado en la célula. Para la
internalización in vitro, pueden incubarse las células en
placas de cultivo tisular en presencia o ausencia de los
anticuerpos relevantes añadidos al medio de cultivo y procesados
para análisis microscópico en puntos de tiempo deseados. Puede
visualizarse directamente la presencia de un anticuerpo marcado e
internalizado en las células mediante microscopía o mediante
autorradiografía si se usa un anticuerpo radiomarcado.
Alternativamente, en un ensayo bioquímico cuantitativo, se ponen en
contacto in vitro o in vivo una población de células
que comprende células que expresan Ovr110 con un anticuerpo de
prueba radiomarcado y las células (si se ponen en contacto in
vivo, entonces las células se aíslan después de una cantidad de
tiempo adecuada) se tratan con una proteasa o se someten a un lavado
ácido para retirar el anticuerpo no internalizado en la superficie
celular. Se trituran las células y se mide la cantidad de recuentos
por minuto (cpm) radiactivos, resistentes a proteasa, asociados con
cada lote de células haciendo pasar el homogeneizado a través de un
contador de centelleo. Basándose en la actividad específica conocida
del anticuerpo radiomarcado, puede deducirse el número de moléculas
de anticuerpo internalizadas por célula a partir de los recuentos de
centelleo de las células trituradas. Las células se "ponen en
contacto" con el anticuerpo in vitro preferiblemente en
forma de disolución tal como añadiendo las células al medio de
cultivo celular en el matraz o placa de cultivo y mezclando el
pocillo del anticuerpo con el medio para garantizar la exposición
uniforme de las células al anticuerpo. En vez de añadirse al medio
de cultivo, las células pueden ponerse en contacto con el anticuerpo
de prueba en una disolución isotónica tal como PBS en un tubo de
ensayo durante el periodo de tiempo deseado. In vivo, las
células se ponen en contacto con el anticuerpo mediante cualquier
método adecuado de administración del anticuerpo de prueba tales
como los métodos de administración descritos a continuación cuando
se administran a un paciente.
Cuanto más rápida sea la velocidad de
internalización del anticuerpo tras la unión a la célula que expresa
Ovr110 in vivo, más rápido podrá conseguirse la destrucción
deseada o el efecto inhibidor del crecimiento en la célula diana
que expresa Ovr110, por ejemplo, mediante un inmunoconjugado
citotóxico. Preferiblemente, la cinética de internalización de los
anticuerpos anti-Ovr110 es tal que favorece la
rápida destrucción de la célula diana que expresa Ovr110. Por
tanto, es deseable que el anticuerpo anti-Ovr110
presente una velocidad rápida de internalización preferiblemente en
el plazo de 24 horas a partir de la administración del anticuerpo
in vivo, más preferiblemente en el plazo de aproximadamente
12 horas, incluso más preferiblemente en el plazo de
aproximadamente 30 minutos a 1 hora, y lo más preferiblemente en el
plazo de aproximadamente 30 minutos. La presente invención
proporciona anticuerpos que se internalizan tan sólo en
aproximadamente 15 minutos a partir del tiempo de introducción del
anticuerpo anti-Ovr110 in vivo.
Preferiblemente, el anticuerpo se internalizará dentro de la célula
en el plazo de unas pocas horas tras unirse a Ovr110 en la
superficie celular, preferiblemente en el plazo de 1 hora, incluso
más preferiblemente en el plazo de 15-30
minutos.
Para determinar si un anticuerpo de prueba puede
competir por la unión al mismo epítopo que el epítopo unido
mediante los anticuerpos anti-Ovr110 de la presente
invención incluyendo los anticuerpos producidos mediante los
hibridomas depositados en la ATCC, puede realizarse un ensayo de
bloqueo cruzado por ejemplo, un ensayo ELISA competitivo. En un
ensayo ELISA competitivo a modo de ejemplo, se preincuban pocillos
recubiertos con Ovr110 de una placa de microtitulación o perlas de
Sepharose recubiertas con Ovr110, con o sin el anticuerpo
competidor candidato y luego se añade un anticuerpo
anti-Ovr110 marcado con biotina de la invención. Se
mide la cantidad de anticuerpo anti-Ovr110 marcado
unido al antígeno Ovr110 en los pocillos o en las perlas, usando
conjugado de peroxidasa-avidina y el sustrato
apropiado.
Alternativamente, puede marcarse el anticuerpo
anti-Ovr110, por ejemplo, con un marcador radiactivo
o fluorescente o algún otro marcador que puede detectarse y
medirse. La cantidad del anticuerpo anti-Ovr110
marcado que se une al antígeno tendrá una correlación inversa con
la capacidad del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de
prueba) para competir por la unión al mismo epítopo en el antígeno,
es decir, a mayor afinidad del anticuerpo de prueba para el mismo
epítopo, menos anticuerpo anti-Ovr110 marcado se
unirá a los pocillos recubiertos con antígeno. Un anticuerpo
competidor candidato se considera un anticuerpo que se une
sustancialmente al mismo epítopo o que compite por la unión a mismo
epítopo como un anticuerpo anti-Ovr110 de la
invención si el anticuerpo competidor candidato puede bloquear la
unión del anticuerpo anti-Ovr110 en al menos el 20%,
preferiblemente en al menos el 20-50%, incluso más
preferiblemente, en al menos el 50% en comparación con un control
realizado en paralelo en ausencia del anticuerpo competidor
candidato (pero puede ser en presencia de un anticuerpo no
competidor conocido). Se entenderá que pueden realizarse variaciones
de este ensayo para llegar al mismo valor cuantitativo.
Un anticuerpo que tiene una "característica
biológica" de un anticuerpo designado, tal como cualquiera de los
anticuerpos monoclonales Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1,
Ovr110.A31.1, Ovrll0.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado
anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1,
Ovr110.A89, Ovr110.A99.1,
Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3,
Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.Cl0.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovrll0.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15,
Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3, es uno que tiene una o más de las características biológicas del anticuerpo que lo distingue de los otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno, Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1,
Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3,
Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15,
Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 se unirán al mismo epítopo al que se unen Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89,
Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1.,
Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2,
Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13,
Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1,
Ovr110.J2 y Ovr110.J3 (por ejemplo que compite por la unión o bloquea la unión del anticuerpo monoclonal
Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1,
Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3,
Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovrll0.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14,
Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.110, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16,
Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 a Ovr110, puede seleccionar como diana una célula tumoral que expresa Ovr110 in vivo y puede internalizarse tras la unión a Ovr110 en una célula de mamífero in vivo. De igual manera, un anticuerpo con la característica biológica del anticuerpo Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (anteriormente identificado como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1,
Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15,
Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17,
Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 tendrán las mismas propiedades de unión a epítopo, de selección como diana, de internalización, de inhibición del crecimiento tumoral y citotóxicas del anticuerpo.
Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3,
Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.Cl0.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovrll0.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15,
Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3, es uno que tiene una o más de las características biológicas del anticuerpo que lo distingue de los otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno, Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1,
Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3,
Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15,
Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 se unirán al mismo epítopo al que se unen Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89,
Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1.,
Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2,
Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13,
Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1,
Ovr110.J2 y Ovr110.J3 (por ejemplo que compite por la unión o bloquea la unión del anticuerpo monoclonal
Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1,
Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3,
Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovrll0.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14,
Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.110, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16,
Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 a Ovr110, puede seleccionar como diana una célula tumoral que expresa Ovr110 in vivo y puede internalizarse tras la unión a Ovr110 en una célula de mamífero in vivo. De igual manera, un anticuerpo con la característica biológica del anticuerpo Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (anteriormente identificado como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1,
Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15,
Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17,
Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3 tendrán las mismas propiedades de unión a epítopo, de selección como diana, de internalización, de inhibición del crecimiento tumoral y citotóxicas del anticuerpo.
El término anticuerpo "antagonista" se usa
en el sentido más amplio, e incluye un anticuerpo que bloquea,
inhibe o neutraliza parcial o totalmente, una actividad biológica de
una proteína Ovr110 nativa dada a conocer en el presente documento.
Los métodos para identificar los antagonistas de un polipéptido
Ovr110 pueden comprender poner en contacto un polipéptido Ovr110 o
una célula que expresa Ovr110 en la superficie celular, con un
anticuerpo antagonista candidato y medir un cambio detectable en
una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el
polipéptido Ovr110.
Un "anticuerpo que inhibe el crecimiento de
las células tumorales que expresan Ovr110" o un anticuerpo
"inhibidor del crecimiento" es uno que se une a y da como
resultado una inhibición del crecimiento que puede medirse de las
células cancerosas que expresan o sobreexpresan Ovr110. Los
anticuerpos anti-Ovr110 inhibidores del crecimiento
preferidos inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan
Ovr110, por ejemplo, células de cáncer de ovario, de páncreas, de
pulmón o de mama en más del 20%, preferiblemente desde
aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 50%, e incluso más
preferiblemente, en más del 50% (por ejemplo, desde aproximadamente
el 50% hasta aproximadamente el 100%), en comparación con el control
apropiado, siendo normalmente el control células tumorales no
tratadas con el anticuerpo que está sometiéndose a prueba. La
inhibición del crecimiento puede medirse a una concentración de
anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30 pg/mol o de aproximadamente
0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, en el que la inhibición del
crecimiento se determina 1-10 días tras la
exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición
del crecimiento de las células tumorales in vivo puede
determinarse de diversas maneras tal como se describe en la sección
de ejemplos experimentales a continuación. El anticuerpo es
inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del
anticuerpo anti-Ovr110 a de aproximadamente 1 pg/kg
a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado una
reducción del tamaño del tumor o de la proliferación de las células
tumorales en el plazo de aproximadamente 5 días a 3 meses a partir
de la primera administración del anticuerpo, preferiblemente en el
plazo de aproximadamente 5 a 30 días.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno
que induce la muerte celular programada tal como se determina
mediante la unión de anexina V, fragmentación de ADN, disminución
del tamaño celular, dilatación del retículo endoplasmático,
fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana
(llamadas cuerpos apoptóticos). Usualmente la célula es una que
sobreexpresa Ovr110. Preferiblemente la célula es una célula
tumoral, por ejemplo, una célula de ovario, pancreática, de pulmón
o de mama. Diversos métodos están disponibles para evaluar los
acontecimientos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo,
puede medirse la translocación de fosfatidilserina (FS) mediante la
unión de anexina; puede evaluarse la fragmentación de ADN mediante
desarrollo escalonado de ADN; y puede evaluarse la condensación
nuclear/de la cromatina junto con la fragmentación de ADN mediante
cualquier aumento de las células hipodiploides. Preferiblemente, el
anticuerpo que induce apoptosis es uno que da como resultado de
aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a
50 veces, y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 a 50
veces, la inducción de la unión de anexina en relación con la
células no tratadas en un ensayo de unión de anexina.
Las "funciones efectoras" del anticuerpo se
refieren a aquellas actividades biológicas que pueden atribuirse a
la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o región Fc variante
de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el
isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del
anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del
complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos (CCDA); fagocitosis; regulación por
disminución de los receptores de superficie celular (por ejemplo,
receptor de células B); y activación de células B.
La "citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos" o "CCDA" hace referencia a una
forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida en los
receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por
ejemplo, células citolíticas naturales (NK, Natural Killer),
neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras
citotóxicas se unan de manera específica a una célula diana que
porta el antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con
citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y
se requieren de manera absoluta para tal destrucción. Las células
primarias para mediar en la CCDA, células NK, expresan sólo
Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI,
FC\gammaRII y FC\gammaRIII. La expresión de FcR en las células
hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravecht
y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para
evaluar la actividad de CCDA de una molécula de interés, puede
realizarse un ensayo de CCDA in vitro, tal como el descrito
en las patentes estadounidenses n.^{os} 5.500.362 ó 5.821.337. Las
células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas
naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad de CCDA
de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por
ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes
et al. PNAS (EE.UU) 95:652-656 (1998).
El "receptor Fc" o "FcR" describe un
receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR
preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR
preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma)
e incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y
Fc\gammaRIII, incluyendo las variantes alélicas y
alternativamente las formas sometidas a corte y empalme de estos
receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIIA
(un "receptor activador") y Fc\gammaRIIB (un "receptor
inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que
principalmente difieren en los dominios citoplasmáticos de los
mismos. El receptor activador Fc\gammaRIIA contiene un motivo de
activación a base de tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su
dominio citoplasmático. El receptor inhibidor Fc\gammaRIIB
contiene un motivo de inhibición a base de tirosina de
inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase la
revisión de M., en Daeron, Annu. Rev. Immunol.
15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y
Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel
et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de
Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41
(1995). Otros FcR, incluyendo los que se van a identificar en el
futuro, se abarcan mediante el término "FcR" en el presente
documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn,
que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto
(Guyer et al., J. Immunol. 117:5887 (1976) y Kim et
al., J, Immunol. 24:249 (1994)).
Las "células efectoras humanas" son
leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones
efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos
Fc\gammaRIII y realizan la función efectora de CCDA. Los ejemplos
de leucocitos humanos que median en la CCDA incluyen las células
mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citolíticas
naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos,
prefiriéndose las PBMC y las células NK. Las células efectoras
pueden aislarse a partir de una fuente nativa, por ejemplo de la
sangre.
La "citotoxicidad dependiente del
complemento" o "CDC" hace referencia a la lisis de una
célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta
clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer
componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de
la subclase apropiada) que se unen a su antígeno análogo. Para
evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de
CDC, por ejemplo, tal como se describe en
Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods
202:163 (1996).
Los términos "cáncer" y "canceroso"
hacen referencia a o describen el estado fisiológico en mamíferos
que normalmente se caracteriza por el crecimiento celular no
regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitarse a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o neoplasias
malignas linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres
incluyen cáncer de células escamosa (por ejemplo, cáncer de células
escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de
pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no
pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón,
cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de
estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas,
glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de
hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma,
cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal,
carcinoma del endometrio o uterino, carcinoma de glándulas
salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer
vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal,
carcinoma de pene, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células
B, cáncer de cerebro, así como de cabeza y cuello, y metástasis
asociadas. Los ejemplos de cáncer de cabeza y cuello incluyen, pero
sin limitarse a, carcinomas adenoides quísticos localizados, por
ejemplo en la lengua, glándula parótida, nariz, paladar, piel,
cuello, glándula submandibular, glotis, senos, epiglotis, espacio
bucal, nervios, laringe, boca, faringe o mejilla.
Una "célula que expresa Ovr110" es una
célula que expresa Ovr110 endógena o transfectada en la superficie
celular. Un "cáncer que expresa Ovr110" es un cáncer que
comprende células que tienen la proteína Ovr110 presente en la
superficie celular. Un "cáncer que expresa Ovr110" produce
niveles de Ovr110 suficientes en la superficie de las células del
mismo, de modo que un anticuerpo anti-Ovr110 puede
unirse a ésta y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer.
Un cáncer que "sobreexpresa" Ovr110 es uno que tiene niveles
significativamente superiores de Ovr110 en la superficie celular
del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo
de tejido. Tal sobreexpresión puede provocarse mediante
amplificación génica o mediante un aumento de la trascripción o
traducción. Puede determinarse la sobreexpresión de Ovr110 en un
ensayo de diagnóstico o pronóstico evaluando el aumento de los
niveles de la proteína Ovr110 presente en la superficie de una
célula (por ejemplo, mediante un ensayo inmunohistoquímico;
análisis FACS). Alternativa o adicionalmente, pueden medirse los
niveles de ARNm o ácido nucleico que codifica para Ovr110 en la
célula, por ejemplo, mediante hibridación in situ
fluorescente; (FISH, véase el documento WO98/45479 publicado en
octubre de 1998), transferencia de tipo Southern, transferencia de
tipo Northern, o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real
(RT-PCR). También puede estudiarse la sobreexpresión
de Ovr110 midiendo el antígeno en un líquido biológico tal como
suero, por ejemplo, usando ensayos a base de anticuerpos (véanse
también, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.933.294
expedida el 12 de junio de 1990; el documento WO91/05264 publicado
el 18 de abril de 1991; la patente estadounidense n.º 5.401.638
expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol.
Methods 132: 73-80 (1990)). Además de los ensayos
anteriores, están disponibles diversos ensayos in vivo para
el profesional experto. Por ejemplo, pueden exponerse células dentro
del cuerpo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente se marca
con un marcador que puede detectarse, por ejemplo, un isótopo
radiactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a las células
en el paciente, por ejemplo, mediante exploración externa de la
radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente
expuesto anteriormente al anticuerpo. Un cáncer que expresa Ovr110
incluye cáncer de ovario, de páncreas, de pulmón o de mama. Los
líquidos corporales incluyen todos los líquidos internos,
secretados, expulsados o derivados del cuerpo tales como sangre,
plasma, suero, orina, saliva, esputo, lágrimas, ascitis, líquido de
lavado peritoneal, líquido linfático, bilis, semen, pus, líquido
amniótico, humor acuoso, cerumen, quilo, quimo, líquido
intersticial, menstruo, leche, moco, líquido pleural, sudor,
lubricación vaginal, vómito, líquido cefalorraquídeo y líquido
sinovial.
Un "mamífero" para los fines de tratar un
cáncer o aliviar los síntomas del cáncer, se refiere a cualquier
mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja,
y animales de zoológico, de deporte o mascotas, tales como perros,
gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc.
Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
"Tratar" o "tratamiento" o
"alivio" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a
medidas profilácticas o preventivas, en los que el objetivo es
evitar o ralentizar (reducir) el estado o trastorno patológico
seleccionado como diana. Aquéllos que necesitan el tratamiento
incluyen aquéllos que ya tienen el trastorno así como aquéllos
propensos a tener el trastorno o aquéllos en los que debe prevenirse
el trastorno. Un sujeto o mamífero se "trata"
satisfactoriamente para un cáncer que expresa Ovr110 si, tras
recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo
anti-Ovr110 según los métodos de la presente
invención, el paciente muestra una reducción o ausencia observable
y/o medible de uno o más de los siguientes: reducción en el número
de células cancerosas o ausencia de células cancerosas; reducción
en el tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentización hasta
cierto punto y preferiblemente detención) de la infiltración de
células cancerosas en los órganos periféricos incluyendo la
diseminación del cáncer en los tejidos blandos y hueso; inhibición
(es decir, ralentización hasta cierto punto y preferiblemente
detención) de la metástasis del tumor; inhibición, hasta cierto
punto, del crecimiento del tumor; y/o alivio hasta cierto punto, de
uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico;
morbimortalidad reducida, y mejora en las cuestiones de calidad de
vida. En la medida en la que el anticuerpo
anti-Ovr110 puede prevenir el crecimiento y/o
destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático
y/o citotóxico. El paciente también puede sentir la reducción de
estos signos o síntomas.
Los parámetros anteriores para evaluar un
tratamiento satisfactorio y una mejora en la enfermedad son
fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares
para un médico. Para el tratamiento del cáncer, la eficacia puede
medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la
enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o un fármaco
eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o
mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente
eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas;
reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta
cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células
cancerosas al interior de órganos periféricos; inhibir (es decir,
ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la
metástasis del tumor; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento
del tumor; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas
asociados con el cáncer. Véase la definición anterior de
"tratar". En la medida que el fármaco puede evitar el
crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede
ser citostático y/o citotóxico.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del/de los agente(s) de un modo continuo de
manera opuesta a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad)
terapéutico inicial durante un periodo de tiempo prolongado.
La administración "intermitente" es el
tratamiento que no se da de manera consecutiva sin interrupción,
sino que es más bien de naturaleza cíclica.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
"Vehículos" tal como se usa en el presente
documento incluye vehículos, excipientes o estabilizadores
farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o el
mamífero que se exponen al mismo en las dosificaciones y
concentraciones empleadas.
A menudo el vehículo fisiológicamente aceptable
es una disolución de pH tamponado acuosa. Los ejemplos de vehículos
fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido
ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina
sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agente
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol
(PEG) y PLURONICS^{TM}.
\newpage
El término "agente citotóxico" tal como se
usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o
evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las
células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por
ejemplo At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186},
Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} y los isótopos
radiactivos de Lu), agentes quimioterápicos por ejemplo metotrexato,
adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina,
etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo,
daunorubicina u otros agentes de intercalación, enzimas y fragmentos
de las mismas tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y
toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas
enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o
animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, por
ejemplo, gelonina, ricina, saporina, y los diversos agentes
anticancerígenos o antitumorales dados a conocer a continuación. A
continuación se describen otros agentes citotóxicos. Un agente
tumoricida provoca la destrucción de las células tumorales.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o
composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente
una célula cancerosa que expresa Ovr110, o bien in vitro o
bien in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento
puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de
células que expresan Ovr110 en la fase S. Los ejemplos de agentes
inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la
progresión del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S),
tal como los agentes que inducen la detención en GI y la detención
en la fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las
vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de la
topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina,
daunorubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen GI
también se extienden a la detención en la fase S, por ejemplo, los
agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona,
dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato,
5-fluorouracilo y ara-C. Puede
encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cancer,
Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, titulado "Cell cycle
regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami
et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente p. 13.
Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerígenos
derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®,
Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es
un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®,
Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel
promueven el ensamblaje de los microtúbulos a partir de dímeros de
tubulina y estabilizan los microtúbulos evitando la
despolimerización, que da como resultado la inhibición de la mitosis
en las células.
"Marcador" tal como se usa en el presente
documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se
conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo de modo que se
genere un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser
detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la modificación química de un compuesto o
composición del sustrato que es detectable.
La expresión "epítopo etiquetado" usado en
el presente documento se refiere a un polipéptido quimérico que
comprende un polipéptido de anticuerpo anti-Ovr110
fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta
tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el
que puede producirse un anticuerpo, pero es lo suficientemente
corto para no interferir con la actividad del polipéptido Ig al que
se fusiona. Preferiblemente, el polipéptido etiqueta también es
bastante singular de modo que el anticuerpo no produce
sustancialmente una reacción cruzada con otros epítopos.
Generalmente, los polipéptidos etiqueta tienen al menos seis
residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50
residuos de aminoácido (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y
20 residuos de aminoácido).
Una "molécula pequeña" se define en el
presente documento como que tiene un peso molecular inferior a
aproximadamente 500 daltons.
El término "prospecto" se usa para hacer
referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en los
envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen
información sobre las indicaciones, usos, dosificación,
administración, contraindicaciones y/o advertencias acerca del uso
de tales productos terapéuticos.
Una "molécula de ácido nucleico aislada" es
una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN o un
polímero mixto, que se separa sustancialmente de otras secuencias de
ADN del genoma así como proteínas y complejos tales como ribosomas
y polimerasas, que acompañan de manera natural a una secuencia
nativa. La expresión abarca una molécula de ácido nucleico que se
ha retirado de su entorno en el que se produce de forma natural, e
incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos
sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente
mediante sistemas heterólogos. Una molécula de ácido nucleico
sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula de
ácido nucleico.
"Vector" incluye vectores lanzadera y de
expresión e incluye, por ejemplo, un plásmido, cósmido o fagémido.
Normalmente, un constructo de plásmido también incluirá un origen de
replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColEl) y un
marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a la ampicilina o
tetraciclina), para la replicación y selección, respectivamente, de
los plásmidos en bacterias. Un "vector de expresión" se
refiere a un vector que contiene las secuencias de control o
elementos reguladores necesarios para la expresión de los
anticuerpos incluyendo el fragmento de anticuerpo de la invención,
en procariotas, por ejemplo, células bacterianas o eucariotas. Los
vectores adecuados se dan a conocer a continuación.
La célula que produce un anticuerpo
anti-Ovr110 de la invención incluirá la célula de
hibridoma original por ejemplo, los hibridomas que se depositaron
en la ATCC, así como las células huésped bacterianas y eucariotas
en las que se ha introducido el ácido nucleico que codifica para el
anticuerpo. A continuación se dan a conocer las células huésped
adecuadas.
La interferencia por ARN se refiere al proceso
de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia
en animales mediado por ARN interferentes pequeños (ARNip) (Fire
et al., 1998, Nature, 391, 806). El proceso correspondiente
en plantas se denomina comúnmente silenciamiento génico
postranscripcional o silenciamiento por ARN y también se denomina
extinción en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico
postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado
evolutivamente usado para evitar la expresión de genes foráneos que
comparten comúnmente diversa flora y diversos phyla (Fire et
al., 1999, Trends Genet., 15, 358). Tal protección de la
expresión de genes foráneos puede haber evolucionado en respuesta a
la producción de ARN bicatenarios (ARNbc) derivados de la infección
viral o de la integración aleatoria de los elementos del transposón
en un genoma huésped mediante una respuesta celular que destruye
específicamente el ARN monocatenario homólogo o ARN genómico viral.
La presencia de ARNbc en las células desencadena la respuesta del
iARN a través de un mecanismo que aún debe caracterizarse
completamente. Este mecanismo parece ser diferente de la respuesta
del interferón que resulta de la activación mediada por ARNbc de
proteína quinasa PKR y la 2',5'-oligoadenilato
sintetasa dando como resultado la escisión no específica del ARNm
por la ribonucleasa L.
La presencia de ARNbc largos en las células
estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada
dicer. La dicer está implicada en el procesamiento del ARNbc en
partes pequeñas del ARNbc conocidas como ARN interferentes pequeños
(ARNip) (Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN
interferentes pequeños derivados de la actividad dicer normalmente
son de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud
y comprenden aproximadamente dúplex de 19 pares de bases. La dicer
también se ha implicado en la escisión de ARN temporales pequeños
(ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos a partir del ARN precursor de
estructura conservada que están implicados en el control
traduccional (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). La
respuesta del iARN también presenta un complejo de endonucleasa que
contiene un ARNip, denominado comúnmente complejo de silenciamiento
inducido por ARN (RISC), que media en la escisión del ARN
monocatenario que tiene la secuencia complementaria a la cadena
antisentido del dúplex de ARNip. La escisión del ARN diana tiene
lugar en el centro de la región complementaria a la cadena
antisentido del dúplex de ARNip (Elbashir et al., 2001, Genes
Dev., 15, 188).
Se ha estudiado la iARN mediada por el ARN
interferente pequeño en una variedad de sistemas. Fire et
al., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros en observar la
iARN en C. elegans. Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol.,
2, 70, describen la iARN mediada por ARNbc en embriones de ratón.
Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, describen la iARN en
células de Drosophila transfectadas con ARNbc. Elbashir et
al., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN inducida por la
introducción de dúplex de ARN sintéticos de 21 nucleótidos en
células de mamíferos cultivadas incluyendo células HeLa y de riñón
embrionario humano. Trabajos recientes en lisados embrionarios de
Drosophila (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)
han revelado determinados requisitos para la longitud, estructura,
composición química y secuencia del ARNip que son esenciales para
mediar en la actividad de iARN eficaz. Estos estudios han mostrado
que los dúplex de ARNip de 21 nucleótidos son lo más activos cuando
contienen protuberancias en 3' de dos nucleótidos. Además, la
sustitución completa de una o ambas cadenas de ARNip con
2'-desoxi(2'-H) o
2'-O-metil-nucleótidos
suprime la actividad de iARN, mientras que se mostró que la
sustitución de los nucleótidos protuberantes de ARNip
3'-terminal con desoxinucleótidos
(2'-H) puede tolerarse. También se mostró que las
secuencias de un solo apareamiento erróneo en el centro del dúplex
de ARNip suprimen la actividad de iARN. Además, estos estudios
también indican que la posición del sitio de escisión en el ARN
diana se define mediante el extremo 5' de la secuencia guía del
ARNip en vez del extremo 3' (Elbashir et al., 2001, EMBO J.,
20, 6877). Otros estudios han indicado que se requiere un fosfato
5' en la cadena complementaria diana de un dúplex de ARNip para la
actividad de ARNip y que se utiliza ATP para mantener el resto
5'-fosfato en el ARNip (Nykanen et al., 2001,
Cell, 107, 309).
Estudios han mostrado que reemplazar los
segmentos protuberantes en 3' de un dúplex de ARNip de
21-mero que tiene protuberancias en 3' de 2
nucleótidos por desoxirribonucleótidos no tiene un efecto adverso
sobre la actividad de la iARN. Se ha notificado que reemplazar
hasta 4 nucleótidos en cada extremo del ARNip por
desoxirribonucleótidos se tolera bien mientras que la sustitución
completa con desoxirribonucleótidos da como resultado ninguna
actividad de iARN (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20,
6877). Además, Elbashir et al., citado anteriormente,
también notifica que la sustitución de ARNip con
2'-O-metil-nucleótidos
suprime completamente la actividad de iARN. Li et al.,
publicación internacional PCT n.º WO 00/44914, y Beach et
al., publicación internacional PCT n.º WO 01/68836 sugieren
ambos que el ARNip "puede incluir modificaciones en o bien la
estructura principal de fosfato-azúcar o bien el
nucleósido para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno
o de azufre", sin embargo ninguna solicitud enseña en qué medida
se toleran estas modificaciones en las moléculas de ARNip ni
proporcionan ningún ejemplo de tal ARNip modificado. Kreutzer y
Limmer, solicitud de patente canadiense n.º 2.359.180, también
describe ciertas modificaciones químicas para su uso en los
constructos de ARNbc con el fin de contrarrestar la activación de
proteína quinasa dependiente de ARN bicatenario PKR, específicamente
de 2'-amino o
2'-O-metil-nucleótidos,
y nucleótidos que contienen un puente 2'-O ó
4'-C-metileno. Sin embargo, de
manera similar Kreutzer y Limmer no muestran en qué medida se
toleran estas modificaciones en las moléculas de ARNip ni
proporcionan ningún ejemplo de tal ARNip modificado.
Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6,
1977-1087, sometieron a prueba determinadas
modificaciones químicas que se dirigen al gen
unc-22 en C. elegans usando transcritos de
ARNip largos (>25 nt). Los autores describen la introducción de
residuos de tiofosfato en estos transcritos de ARNip mediante la
incorporación de análogos de nucleótidos de tiofosfato con ARN
polimerasa T7 y T3 y observaron que "los ARN con dos bases
modificadas (fosforotioato) tuvieron también una disminución
sustancial en la eficacia a medida que se desencadena la iARN
(datos no mostrados); la modificación (fosforotioato) de más de dos
residuos desestabilizó en gran medida los ARN in vitro y no
pudieron someterse a ensayo las actividades de interferencia"
Id. en 1081. Los autores también sometieron a prueba
determinadas modificaciones en la posición 2' del azúcar del
nucleótido en los transcritos de ARNip largos y observaron que la
sustitución de los desoxinucleótidos por los ribonucleótidos
"produjo una disminución sustancial en la actividad de
interferencia", especialmente en el caso de las sustituciones de
uridina por timidina y/o citidina por desoxicitidina. Id.
Además, los autores sometieron a prueba determinadas modificaciones
de bases, incluyendo la sustitución por
4-tiouracilo, 5-bromouracilo,
5-yodouracilo, 3-(aminoalil)uracilo para
uracilo, e inosina para guanosina en las cadenas sentido y
antisentido del ARNip, y encontraron que mientras que el
4-tiouracilo y el 5-bromouracilo se
toleraron muy bien, la inosina "produjo una disminución
sustancial en la actividad de interferencia" cuando se incorporó
en cualquiera de las cadenas. La incorporación de
5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en la
cadena antisentido también dio como resultado una disminución
sustancial en la actividad de iARN.
Beach et al., publicación internacional
PCT n.º WO 01/68836, describen métodos específicos para atenuar la
expresión génica usando ARNbc derivado de manera endógena. Tuschl
et al., publicación internacional PCT n.º WO 01/75164,
describen un sistema de iARN in vitro en Drosophila y
el uso de moléculas de ARNip específicas para determinadas
aplicaciones de genómica funcional y determinadas aplicaciones
terapéuticas; aunque Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2,
239-245, duda que pueda usarse la iARN para curar
enfermedades genéticas o una infección viral debido "al peligro
de activación de la respuesta del interferón". Li et al.,
publicación internacional PCT n.º WO 00/44914, describen el uso de
ARNbc específicos para su uso en la atenuación de la expresión de
determinados genes diana. Zernicka-Goetz et
al., publicación internacional PCT n.º WO 01/36646, describen
determinados métodos para inhibir la expresión de genes particulares
en células de mamífero usando determinadas moléculas de ARNbc. Fire
et al., publicación internacional PCT n.º WO 99/32619,
describen métodos particulares para introducir determinadas
moléculas de ARNbc en las células para su uso en la inhibición de
la expresión génica. Plaentinck et al., publicación
internacional PCT n.º WO 00/01846, describen determinados métodos
para identificar genes específicos responsables de conferir un
fenotipo particular en una célula usando moléculas de ARNbc
específicas. Mello et al., publicación internacional PCT n.º
WO 01/29058, describen la identificación de genes específicos
implicados en la iARN mediada por ARNbc. Deschamps Depaillette et
al., publicación internacional PCT n.º WO 99/07409, describen
composiciones específicas que consisten en moléculas de ARNbc
particulares combinadas con determinados agentes antivirales.
Driscoll et al., publicación internacional PCT n.º WO
01/49844, describen constructos de ADN específicos para su uso en la
facilitación del silenciamiento génico en organismos seleccionados
como diana. Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6,
1977-1087, describen constructos de ARNip
modificados químicamente específicos que seleccionan como diana el
gen unc-22 de C. elegans. Tuschl et
al., publicación internacional PCT n.º WO 02/44321, describen
determinados constructos de ARNip sintéticos.
La invención describe anticuerpos
anti-Ovr110. Preferiblemente, los anticuerpos
anti-Ovr110 se internalizan tras la unión a la
Ovr110 de superficie celular en una célula de mamífero. Los
anticuerpos anti-Ovr110 también pueden destruir o
conducir a la destrucción de células tumorales que portan
Ovr110.
No estaba claro que Ovr110 fuera susceptible de
internalización. Además, la capacidad de un anticuerpo para
internalizarse depende de varios factores incluyendo la afinidad,
avidez y el isotipo del anticuerpo, y el epítopo al que se une. Se
ha demostrado en el presente documento que la Ovr110 de superficie
celular es susceptible de internalización tras la unión con los
anticuerpos anti-Ovr110 descritos en el presente
documento. Adicionalmente, se demostró que los anticuerpos
anti-Ovr110 descritos en el presente documento
pueden seleccionar como diana específicamente células tumorales que
expresan Ovr110 in vivo e inhibir o destruir estas células.
Estas propiedades de selección como diana del tumor in vivo,
de internalización e inhibidoras del crecimiento de los anticuerpos
anti-Ovr110 convierten estos anticuerpos en muy
adecuados para usos terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de
diversos cánceres incluyendo cáncer de ovario, de páncreas, de
pulmón o de mama. Se prefiere la internalización del anticuerpo
anti-Ovr110, por ejemplo, si el anticuerpo o
anticuerpo conjugado tiene un sitio intracelular de acción y si el
agente citotóxico conjugado con el anticuerpo no cruza fácilmente
la membrana plasmática (por ejemplo, la toxina caliqueamicina). No
es necesaria la internalización si los anticuerpos o el agente
conjugado con los anticuerpos no tienen sitios intracelulares de
acción, por ejemplo, si el anticuerpo puede destruir la célula
tumoral mediante CCDA o algún otro mecanismo.
Los anticuerpos anti-Ovr110
descritos en el presente documento también tienen diversas
aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos
anti-Ovr110 descritos en el presente documento
pueden ser útiles para el diagnóstico y la determinación del
estadio de los cánceres que expresan Ovr110 (por ejemplo, en la
obtención de imágenes por radionúclidos). Pueden usarse solos o en
combinación con otros marcadores de cáncer de ovario, incluyendo,
pero sin limitarse a, CA125, HE4 y mesotelina. Los anticuerpos
también son útiles para la purificación o inmunoprecipitación de
Ovr110 de células, para la detección y cuantificación de Ovr110
in vitro, por ejemplo en un ELISA o una inmunotransferencia
de tipo Western, para destruir y eliminar células que expresan
Ovr110 de una población de células mixtas como una etapa en la
purificación de otras células. La internalización de los anticuerpos
anti-Ovr110 descritos en el presente documento
puede ser en las diferentes formas abarcadas en la definición de
"anticuerpo" en el presente documento. Por tanto, los
anticuerpos incluyen anticuerpo de longitud completa o intacto,
fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia nativa o variantes
de aminoácidos, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión,
inmunoconjugados, y fragmentos funcionales de los mismos. En los
anticuerpos de fusión, se fusiona una secuencia de anticuerpo a una
secuencia polipeptídica heteróloga. Los anticuerpos pueden
modificarse en la región Fc para proporcionar las funciones
efectoras deseadas. Tal como se trata en más detalle en las
secciones a continuación, con las regiones Fc apropiadas, al
anticuerpo desnudo unido a la superficie celular puede inducir
citotoxicidad, por ejemplo, mediante citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (CCDA) o mediante el reclutamiento del
complemento en una citotoxicidad dependiente del complemento, o
algún otro mecanismo. Alternativamente, cuando se desea eliminar o
reducir la función efectora, para minimizar los efectos secundarios
o las complicaciones terapéuticas, pueden usarse algunas otras
regiones Fc.
El anticuerpo puede competir para unirse, o
unirse sustancialmente, al mismo epítopo unido por los anticuerpos
descritos en el presente documento. También se contemplan los
anticuerpos que tienen las características biológicas de los
presentes anticuerpos anti-Ovr110 descritos en el
presente documento, por ejemplo un anticuerpo
anti-Ovr110 que tiene las características
biológicas de un anticuerpo monoclonal producido mediante los
hibridomas según los números de registro de la ATCC
PTA-5180, PTA-5855,
PTA-5856, PTA-5884,
PTA-6266, PTA-7128 y
PTA-7129, incluyendo específicamente las
características de selección como diana del tumor in vivo, de
internalización y de inhibición de cualquier proliferación celular
o citotóxicas. Específicamente se describen los anticuerpos
anti-Ovr110 que se unen a un epítopo presente en los
aminoácidos 30-40, 40-50,
50-60, 60-70, 70-80,
80-90, 90-100,
100-110, 110-120,
120-130, 130-140,
140-150, 150-160,
160-170, 170-180,
180-190, 190-200,
200-210, 210-220,
220-230, 230-240,
240-250, 250-260,
260-270, 270-282 ó
21-35, 31-45, 41-55,
51-65, 61-75, 71-85,
81-95, 91-105,
101-115, 111-125,
121-135, 131-145,
141-155, 151-165,
161-175, 171-185,
181-195, 191-205,
201-215, 211-225,
221-235, 231-245,
241-255, 251-258 de la Ovr110
humana.
A continuación se describen en detalle los
métodos de producción de los anticuerpos anteriores.
Los presentes anticuerpos
anti-Ovr110 son útiles para la fabricación de un
medicamento para tratar un cáncer de cabeza y cuello que expresa
Ovr110 o para aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero.
Los cánceres abarcan los cánceres metastásicos de cualquiera de los
anteriores, por ejemplo, metástasis de cáncer de cabeza y cuello.
El anticuerpo puede unirse al menos a una parte de las células
cancerosas que expresan Ovr110 en el mamífero y preferiblemente es
uno que no induce o que minimiza la respuesta HAMA. Preferiblemente,
el anticuerpo es eficaz para destruir o eliminar las células
tumorales que expresan Ovr110 o inhibir el crecimiento de tales
células tumorales, in vitro o in vivo, tras la unión a
Ovr110 en la célula. Un anticuerpo de este tipo incluye un
anticuerpo anti-Ovr110 desnudo (no conjugado con
ningún agente). Los anticuerpos anti-Ovr110
desnudos que tienen propiedades de inhibición del crecimiento
tumoral in vivo incluyen los anticuerpos descritos en los
ejemplos experimentales a continuación. Los anticuerpos desnudos que
tienen propiedades citotóxicas o de inhibición del crecimiento
celular pueden conjugarse además con un agente citotóxico para
hacerlos incluso más potentes en la destrucción de las células
tumorales. Pueden conferirse propiedades citotóxicas a un anticuerpo
anti-Ovr110, por ejemplo, conjugando el anticuerpo
con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado tal como
se describe a continuación. El agente citotóxico o un agente
inhibidor del crecimiento preferiblemente es una molécula pequeña.
Son preferibles las toxinas tales como maitansina, maitansinoides,
saporina, gelonina, ricina o caliqueamicina y análogos o derivados
de las mismas.
En el presente documento se describe una
composición que comprende un anticuerpo anti-Ovr110
descrito en el presente documento, y un vehículo. Con los fines de
tratar el cáncer, pueden administrarse composiciones al paciente
que necesite tal tratamiento, en el que la composición puede
comprender uno o más anticuerpos anti-Ovr110
presentes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo.
Además, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos en
combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes
citotóxicos o inhibidores del crecimiento, incluyendo agentes
quimioterápicos. La invención también describe formulaciones que
comprenden un anticuerpo anti-Ovr110 descrito en el
presente documento, y un vehículo. La formulación puede ser una
formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
También se describen en el presente documento
ácidos nucleicos aislados que codifican para la internalización de
los anticuerpos anti-Ovr110. Se abarcan los ácidos
nucleicos que codifican tanto para las cadenas H como L y
especialmente los residuos de la región hipervariable, cadenas que
codifican para el anticuerpo de secuencia nativa así como las
variantes, modificaciones y versiones humanizadas del
anticuerpo.
La invención también proporciona el uso de un
anticuerpo anti-Ovr110 para la fabricación de un
medicamento para tratar un cáncer de cabeza y cuello que expresa
Ovr110 o aliviar uno o más síntomas del cáncer de cabeza y cuello
en un mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo pueden
administrarse a corto plazo (de manera aguda) o de manera crónica,
o de manera intermitente según lo indique el médico. También se
proporcionan métodos de inhibición del crecimiento de, y de
destrucción de una célula que expresa Ovr110 in vitro.
Finalmente, la invención también describe kits y artículos de
fabricación que comprenden al menos un anticuerpo descrito en el
presente documento, preferiblemente al menos uno que internaliza el
anticuerpo anti-Ovr110 descrito en el presente
documento. Los kits que contienen anticuerpos
anti-Ovr110 encuentran su uso en la detección de la
expresión de Ovr110, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico, por
ejemplo, para ensayos de destrucción de células que portan Ovr110 o
para la purificación y/o inmunoprecipitación de Ovr110 de las
células. Por ejemplo, para el aislamiento y purificación de Ovr110,
el kit puede contener un anticuerpo anti-Ovr110
acoplado a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de cultivo
tisular o perlas (por ejemplo, perlas de Sepharose). Pueden
proporcionarse kits que contienen anticuerpos para la detección y
cuantificación de Ovr110 in vitro, por ejemplo, en un ELISA
o una inmunotransferencia de tipo Western. Tal anticuerpo útil para
la detección puede dotarse con un marcador tal como un marcador
fluorescente o radiomarcador.
Lo siguiente describe técnicas a modo de ejemplo
para la producción de los anticuerpos útiles en la presente
invención. Algunas de estas técnicas se describen adicionalmente en
el ejemplo 1. El antígeno Ovr110 que va usarse para la producción
de anticuerpos puede ser, por ejemplo, el polipéptido de longitud
completa o una parte del mismo, incluyendo una forma soluble de
Ovr110 que carece de la secuencia que abarca la membrana, o
péptidos sintéticos para partes seleccionadas de la proteína.
Alternativamente, pueden usarse células que
expresan Ovr110 en su superficie celular (por ejemplo células CHO o
NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar Ovr110;
línea de células tumorales de ovario, pancreáticas, de pulmón, de
mama u otras que expresan Ovr110), o membranas preparadas de tales
células, para generar anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos y
de aminoácidos de Ovr110 humana y murina están disponibles tal como
se proporcionaron anteriormente. Puede producirse Ovr110 de manera
recombinante en y aislarla de, células procariotas, por ejemplo,
células bacterianas, o células eucariotas usando la metodología del
ADN recombinante convencional. Ovr110 puede expresarse como una
proteína de fusión etiquetada (por ejemplo, etiqueta de epítopo) u
otra proteína de fusión para facilitar su aislamiento así como su
identificación en diversos ensayos.
Los anticuerpos o proteínas de unión que se unen
a diversas etiquetas o secuencias de fusión están disponibles tal
como se explica detalladamente a continuación. Otras formas de
Ovr110 útiles para generar anticuerpos resultarán evidentes para los
expertos en la técnica.
Se conocen bien en la técnica, diversos
polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos
incluyen etiquetas de polihistidina (poly-his) o
poli-histidina-glicina
(poly-his-gly); el polipéptido
etiqueta de HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et
al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)); la
etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 para la misma (Evan et al., Molecular and
Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y la
etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su
anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering,
3(6):547-553 (1990)). Se reconoce el péptido
FLAG (Hopp et al., BioTechnology,
6:1204-1210 (1988)) mediante un anticuerpo
monoclonal M2 anti-FLAG (Eastman Kodak Co., New
Havern, CT). Puede realizarse la purificación de una proteína que
contiene el péptido FLAG mediante cromatografía de inmunoafinidad
usando una matriz de afinidad que comprende el anticuerpo monoclonal
M2 anti-FLAG unido covalentemente a agarosa
(Eastman Kodak Co., New Haven, CT). Otros polipéptidos etiqueta
incluyen el péptido de epítopo KT3 [Martin et al., Science,
255:192-194 (1992)]; un péptido de epítopo de
\alpha-tubulina (Skinner et al., J. Biol.
Chenz., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta de
péptido de la proteína del gen de T7
(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)).
Preferiblemente los anticuerpos policlonales se
producen en animales, preferiblemente animales no humanos, mediante
múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del
antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el
antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos
sintéticos) con una proteína que es inmunógena en la especie que va
a inmunizarse. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con
hemocianina de lapa californiana (KLH), suero, tiroglobulina
bovina, o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente
bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de
maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación mediante los residuos
de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante los
residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico,
SOCl_{2}, ó R^{1} N=C=NR, en el que R y R^{1} son grupos
alquilo diferentes. Los conjugados también pueden producirse en
cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas.
Se inmunizan los animales frente al antígeno,
conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo,
5-100 pg de la proteína o conjugado (para conejos o
ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de
Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples
sitios. Un mes más tarde, se suministran dosis de refuerzo a los
animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o
conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se
extrae una muestra de sangre de los animales y el suero se somete a
ensayo para determinar el título del anticuerpo. Se suministran
dosis de refuerzo a los animales hasta que el título alcanza una
meseta. También, se usan de manera adecuada agentes de agregación
tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria.
Pueden producirse anticuerpos monoclonales
usando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler
et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse mediante
métodos de ADN recombinante (patente estadounidense n.º 4.816.567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal
huésped apropiado, tal como un hámster, tal como se describió
anteriormente para provocar que los linfocitos produzcan o puedan
producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína
usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden
inmunizarse in vitro. Tras la inmunización, los linfocitos se
aíslan y entonces se fusionan con un "componente de fusión",
por ejemplo, una línea de células de mieloma usando un agente de
fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula
de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies. Principles and
Practice, pág. 103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se
siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado, medio
que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia del componente de fusión no
fusionado, por ejemplo las células de mieloma originales. Por
ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima
hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPTR), el
medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá normalmente
hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que
impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma del componente de fusión
preferidas son las que se fusionan de manera eficaz, apoyan la
producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células
productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio
selectivo que se selecciona contra las células originales no
fusionadas. Las líneas de células de mieloma preferidas son líneas
de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón
MOPC-21 y MPC-II disponibles del
Centro de distribución de células del Instituto Salk, San Diego,
California, EE.UU., y SP-2 y derivados, por ejemplo,
células X63-Ag8-653 disponibles de
la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, EE.UU.
También se han descrito líneas de célula de mieloma humano y de
heteromieloma de ratón-humano, para la producción de
anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001
(1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel
Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Para determinar la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno, se somete a ensayo el
medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma.
Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producidos por células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante ensayo de unión in
vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard
descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen
anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas,
pueden subclonarse los clones limitando los procedimientos de
dilución y haciéndolos crecer mediante métodos convencionales
(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 103
(Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este
fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o
RPMI-1640. Además, pueden hacerse crecer las células
de hibridoma in vivo como tumores ascíticos en un animal por
ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido
ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de
anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía
de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína
G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis,
etc.
El ADN que codifica para los anticuerpos
monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando
procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de
oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a los genes que
codifican para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos
murinos). Las células del hibridoma sirven como fuente preferida de
tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en los vectores de
expresión, que entonces se transforman o transfectan para dar
células huésped procariotas o eucariotas tales como, por ejemplo,
células de E. coli, células COS de simio, células de ovario
de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no
producen la proteína del anticuerpo, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en la células huésped recombinantes. Los
artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias
de ADN que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra et
al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)
y Phickthun, Immunol. Revs., 130:151-188
(1992).
Además, pueden aislarse los anticuerpos
monoclonales o fragmentos de anticuerpo a partir de bibliotecas de
fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en
McCafferty et al., Nature, 348:552-554
(1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628
(1991) y Marks et al., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991) describen el aislamiento de
anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas
de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de
anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) mediante
intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology,
10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria
y recombinación in vivo como estrategia para la construcción
de bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc.
Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas
técnicas son alternativas viables a las técnicas del hibridoma de
anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de
anticuerpos monoclonales.
El ADN que codifica para el anticuerpo puede
modificarse para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o
de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias de dominio
constante de cadena pesada y cadena ligera (CH y CL) humanas por
las secuencias murinas homólogas (patente estadounidense n.º
4.816.567; y Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851 (1984)), o fusionando la secuencia que codifica para
inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia que codifica para
un polipéptido que no es inmunoglobulina (polipéptido heterólogo).
Las secuencias del polipéptido que no es inmunoglobulina pueden
sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo, o se
sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación del
antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente
quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que
tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de
antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
En la técnica se han descrito métodos para la
humanización de anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido
introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos
residuos de aminoácido no humanos a menudo se denominan como
residuos "de importación", que normalmente se toman de un
dominio variable "de importación". La humanización puede
realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y
colaboradores (Jones et al., Nature,
321:522-525 (1986)); Reichmann et al.,
Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las
secuencias de la región hipervariable por las secuencias
correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente
estadounidense n.º 4.816.567) en los que se ha sustituido
sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto con la
secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica,
normalmente los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en
los que se sustituyen algunos residuos de la región hipervariable y
posiblemente algunos residuos de la FR con los residuos de los
sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de los dominios variables humanos,
tanto de cadena pesada como ligera, que van a usarse en la
fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para
reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo
anti-ratón humano) cuando se pretende que el
anticuerpo sea para uso terapéutico en seres humanos. Según el
método denominado "del mejor ajuste", se selecciona la
secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor frente a
toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano
conocidas. Se identifica la secuencia del dominio V humano que es
más próxima a la del roedor y se acepta la región de entramado (FR)
humana dentro de ella para el anticuerpo humanizado (Sims et
al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J.
Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método usa una región de entramado
particular derivada de la secuencia consenso de todos los
anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o
pesadas. Puede usarse el mismo entramado para varios anticuerpos
humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 89:4285 (1992): Presta et al., J. Immunol.,
151:2623 (1993)).
Además es importante que se humanicen los
anticuerpos con retención de alta afinidad de unión para el antígeno
y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este
objetivo, según un método preferido, se preparan anticuerpos
humanizados mediante un procedimiento de análisis de secuencias
originales y diversos productos humanizados conceptuales usando
modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas.
Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles
comúnmente y son familiares para los expertos en la técnica.
Están disponibles programas informáticos que
ilustran y presentan probables estructuras conformacionales
tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas
seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el
análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de
la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de
los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina
candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, pueden
seleccionarse los residuos de la FR y combinarse a partir de su
receptor y secuencias de importación de modo que se logran las
características del anticuerpo deseadas, tal como aumento de la
afinidad por el/los antígeno(s) diana. En general, los
residuos de la región hipervariable están implicados directamente y
de la manera más sustancial en la influencia en la unión a
antígeno.
Se contemplan diversas formas de anticuerpo
anti-Ovr110 humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo
humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab,
que opcionalmente se conjuga con uno o más agentes citotóxicos con
el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el
anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un
anticuerpo IgG1 intacto.
Como alternativa a la humanización, pueden
generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, actualmente es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden,
tras la inmunización, producir un repertorio completo de
anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas
endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota
del gen de la región de unión de cadena pesada (J_{H}) del
anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da
como resultado la inhibición completa de la producción de
anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de
inmunoglobulinas de línea germinal humana en tales ratones mutantes
de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos
humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo,
Jakobovits et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551
(1993); Jakobovits et al., Nature,
362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year
in Immuno. 7:33 (1993); patentes estadounidenses n.^{os}
5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y
alternativamente, puede usarse la tecnología de presentación en
fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553
(1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de
anticuerpo in vitro, a partir de repertorios del gen del
dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados.
Según esta técnica, se clonan en marco los genes del dominio V del
anticuerpo en un gen de proteína de recubrimiento o bien mayor o
bien menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se
presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la
superficie de la partícula de fago. Dado que la partícula
filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del
fago, las selecciones basándose en las propiedades funcionales del
anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que
codifica para el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por
tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B.
Puede realizarse la presentación en fago en una variedad de
formatos, revisada en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell,
David J., Current Opinion in Structural Biology
3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de
segmentos del gen V para la presentación en fago. Clarkson et
al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una
matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona a
partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V
derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un
repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden
aislarse anticuerpos para una matriz diversa de antígenos
(incluyendo los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas
descritas por Marks et al., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO
J. 12:725-734 (1993). Véanse, también, las patentes
estadounidenses n.^{os} 5.565.332 y 5.573.905. Tal como se
discutió anteriormente, también pueden generarse anticuerpos
humanos mediante células B activadas in vitro (véanse las
patentes estadounidenses 5.567.610 y 5.229.275).
En determinadas circunstancias, existen ventajas
de usar fragmentos de anticuerpo, en vez de los anticuerpos
completos. El menor tamaño de los fragmentos permite un aclaramiento
rápido, y puede conducir a mejorar el acceso a los tumores sólidos.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de
fragmentos de anticuerpo. De manera tradicional, estos fragmentos
se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos
intactos (véanse, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of
Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117
(1992); Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin
embargo, actualmente estos fragmentos también pueden producirse
directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos
de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden todos expresarse en y
secretarse de E. coli, permitiendo así la producción fácil de
grandes cantidades de estos fragmentos. Pueden aislarse fragmentos
de anticuerpo a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos
tratadas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos
Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.
coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos
F(ab)2 (Carter et al., Bio/Technology
10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, pueden
aislarse fragmentos F(ab)2 directamente de cultivo de
células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y
F(ab)2 con aumento de la semivida in vivo que
comprenden un epítopo de unión al receptor de rescate se describen
en la patente estadounidense n.º 5.869.046. Otras técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el
profesional experto. El anticuerpo de elección también puede ser un
fragmento Fv de cadena simple (scFv). Véanse el documento WO
93/16185; la patente estadounidense n.º 5.571.894; y la patente
estadounidense n.º 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con
sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones
constantes; por tanto, son adecuadas para reducir la unión no
específica durante el uso in vivo. Pueden construirse
proteínas de fusión sFv para producir la fusión de una proteína
efectora o bien en el extremo aminoterminal o bien en el
carboxiloterminal de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed.
Borrebaeck, citado anteriormente. El fragmento de anticuerpo también
puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se
describe en la patente estadounidense 5.641.870 por ejemplo. Tales
fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o
biespecíficos.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos
diferentes. Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo pueden
unirse a dos epítopos diferentes de la proteína Ovr110. Otros
anticuerpos de este tipo pueden combinar un sitio de unión a Ovr110
con un sitio de unión para otra proteína. Alternativamente, un
brazo anti-Ovr110 puede combinarse con un brazo que
se une a una molécula de activación en un leucocito tal como una
molécula del receptor de células T (por ejemplo C133), o receptores
Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64),
Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16), de modo que se
centran y localizan los mecanismos de defensa celular en la célula
que expresa Ovr110. También pueden usarse los anticuerpos
biespecíficos para localizar los agentes citotóxicos en las células
que expresan Ovr110. Estos anticuerpos tienen un brazo de unión a
Ovr110 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo,
saporina, anti-interferón-\alpha,
alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de
isótopos radiactivos). Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab)2). El
documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico
anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRIII y la
patente estadounidense n.º 5.837.234 da a conocer un anticuerpo
biespecífico
anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRI. En el
documento WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico
anti-ErbB2/Fc\alpha. La patente estadounidense n.º
5.821.337 enseña un anticuerpo biespecífico
anti-ErbB2/anti-CD3.
En la técnica se conocen los métodos para
fabricar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de
anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la
coexpresión de dos pares de cadena pesada y cadena ligera de
inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades
diferentes (Millstein et al., Nature,
305:537-539 (1983)). Debido a la distribución
aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas
de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura
biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que
usualmente se realiza mediante las etapas de cromatografía de
afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos del producto
son bajos. Procedimientos similares se dan a conocer en el documento
WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991).
Según un enfoque diferente, se fusionan los
dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión
deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno)
a las secuencias del dominio constante de inmunoglobulina.
Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de cadena
pesada de Ig, que comprende al menos parte de las regiones bisagra
C_{H}2 y C_{H}3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CHI) conteniendo el sitio necesario para la unión
de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Se
insertan en vectores de expresión separados, los ADN que codifican
para las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se
desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, y se cotransfectan en
una célula huésped adecuada. Esto proporciona una mayor
flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres
fragmentos de polipéptido en las realizaciones, cuando las razones
desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la
construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo
biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las
secuencias que codifican para dos o las tres cadenas de polipéptidos
en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos
cadenas de polipéptidos en razones iguales da como resultado altos
rendimientos, o cuando las razones no tienen un efecto significativo
sobre el rendimiento de la combinación de cadenas deseada.
Preferiblemente, los anticuerpos biespecíficos
en este enfoque están compuestos de una cadena pesada de
inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en
un brazo, y un par de cadena pesada y cadena ligera de
inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad
de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura
asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado
de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas,
dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en
sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo
fácil de separación. Este enfoque se da a conocer en el documento WO
94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos
biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology, 121:210 (1986).
Según otro enfoque descrito en la patente
estadounidense n.º 5.731.168, puede modificarse mediante ingeniería
la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar
el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de
células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una
parte del dominio CH3. En este método, se reemplazan una o más
cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la
primera molécula del anticuerpo por cadenas laterales más grandes
(por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades"
compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s)
cadena(s) lateral(es) grandes(s) en la
interfase de la segunda molécula del anticuerpo reemplazando las
cadenas laterales de aminoácidos grandes por unas más pequeñas (por
ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para
aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros
productos finales no deseados tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen
anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno
de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con
avidina, el otro a biotina. Se ha propuesto que tales anticuerpos,
por ejemplo, se dirijan células del sistema inmunológico a células
no deseadas (patente estadounidense n.º 4.676.980), y para el
tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO
92/200373 y EP 03089). Pueden fabricarse anticuerpos
heteroconjugados usando cualquier método de reticulación
conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien
en la técnica y se dan a conocer en la patente estadounidense n.º
4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.
También se han descrito en la bibliografía
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse
anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et
al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el
que se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar
fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia
del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para
estabilizar ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuros
intermoleculares. Entonces, se convierten los fragmentos Fab'
generados en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Luego, se
reconvierte uno de los derivados Fab'-TNB en
Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden
usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El reciente progreso ha facilitado la
recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de
E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med.,
175:217-225 (1992) describen la producción de una
molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente
humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó de manera separada de
E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in
vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por tanto, el
anticuerpo biespecífico formado pudo unirse a las células que
sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así
como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos
humanos contra dianas en tumores de mama humano.
También se han descrito diversas técnicas para
fabricar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos
directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por
ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando
cremalleras de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5): 1547-1553 (1992). Se ligaron los
péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun a
las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión
génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región
bisagra para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar los
heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse
para la producción de homodímeros del anticuerpo.
La tecnología de los "diacuerpos" descrita
por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecíficos.
Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un
ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre
los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se obliga a
los dominios VH y VL de un fragmento a aparearse con los dominios
VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos
sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia
para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso
de dímeros Fv de cadena simple (sFv). Véase Gruber et al., J.
Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Un anticuerpo multivalente puede internalizarse
(y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una
célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los
anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser
anticuerpos multivalentes (que son diferentes de la clase de IgM)
con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos
tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante la
expresión recombinante de ácido nucleico que codifica para las
cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente
puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de
unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o
consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este caso, el
anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a
antígeno amino-terminales con respecto a la región
Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento
comprende (o consiste en) de tres a ocho, pero preferiblemente
cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente
comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos
cadenas de polipéptido), comprendiendo la(s) cadena(s)
de polipéptido dos o más dominios variables. Por ejemplo,
la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n)
comprender
VD1(X1n-VD2-(X2)n-Fc,
en la que VDI es un primer dominio variable, VD2 es un segundo
domino variable, Fc es una cadena de polipéptido de una región Fc,
XI y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es 0 ó 1.
Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido
puede(n) comprender: cadena de
VH-CHI-ligador
flexible-VH-CHI-región
FC; o cadena de
VH-CHI-VH-CHI-región
FC. Preferiblemente, el anticuerpo multivalente en el presente
documento comprende además al menos dos (y preferiblemente cuatro)
polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo
multivalente en el presente documento, por ejemplo, puede
comprender desde aproximadamente dos hasta aproximadamente ocho
polipéptidos de dominio de variable de cadena ligera. Los
polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en
el presente documento comprenden un dominio variable de cadena
ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.
Se contempla(n) la(s)
modificación/modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los
anticuerpos anti-Ovr110 descritos en el presente
documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de
unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se preparan
variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo
anti-Ovr110 introduciendo cambios apropiados de
nucleótidos en el ácido nucleico del anticuerpo
anti-Ovr110, o mediante síntesis de péptidos.
Tales modificaciones incluyen, por ejemplo,
deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos
dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo
anti-Ovr110. Se realiza cualquier combinación de
deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo final,
siempre que el constructo final tenga las características deseadas.
Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procedimientos
posttraduccionales del anticuerpo anti-Ovr110,
tales como cambiar el número o la posición de sitios de
glicosilación.
Un método útil para identificar determinados
residuos o regiones del anticuerpo anti-Ovr110 que
son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina
"mutagénesis por exploración de alanina" tal como se describen
Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085
(1989). En este caso, se identifican un residuo o grupo de residuos
diana dentro del anticuerpo anti-Ovr110 (por
ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se
sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más
preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la
interacción de aminoácidos con el antígeno Ovr110.
Entonces, se mejoran las ubicaciones de
aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las
sustituciones introduciendo más u otras variantes en, o para, los
sitios de sustitución. Por tanto, mientras que se predetermina el
sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos, no
necesita predeterminarse la naturaleza de la mutación per
se. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación
en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis aleatoria o por
exploración de alanina en el codón o región diana y se examinan las
variantes de anticuerpos anti-Ovr110 expresadas para
detectar la actividad deseada.
Las inserciones de la secuencia de aminoácidos
incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que oscilan en
longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o
más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o
múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones
terminales incluyen un anticuerpo anti-Ovr110 con
un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo
fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción
de la molécula de anticuerpo anti-Ovr110 incluyen la
fusión en el extremo N- o C-terminal del anticuerpo
anti-Ovr110 a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o
una fusión a un polipéptido que aumenta la semivida en suero del
anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante por
sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un
residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo
anti-Ovr110 sustituido por un residuo diferente. Los
sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución
incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan
alteraciones de FR. En la tabla I se muestran sustituciones
conservativas con el encabezado de "sustituciones preferidas".
Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad
biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales,
denominados "sustituciones a modo de ejemplo" en la tabla 1, o
tal como se describe además a continuación haciendo referencia a
las clases de aminoácidos, y examinarse los productos para
determinar una característica deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se logran modificaciones sustanciales en las
propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones
que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la
estructura de la estructura principal de polipéptido en la zona de
sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o
helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el
sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que
se producen de manera natural se dividen en dos grupos basándose en
sus propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófoba: norleucina, met, ala, leu, ile;
(2) hidrófila neutra: cys, ser, thr; (3) ácida: asp, glu; (4)
básica: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la
orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromática: trp, tyr,
phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el
intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
También puede sustituirse cualquier residuo de cisteína no implicado
en mantener la conformación apropiada del anticuerpo
anti-Ovr110, generalmente por serina, para mejorar
la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación
anómala. A la inversa, puede(n) añadirse enlace(s) de
cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente
cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un
fragmento Fv).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un tipo de variante por sustitución
particularmente preferido implica sustituir uno o más residuos de la
región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un
anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s)
variante(s)
resultante(s) seleccionada(s) para un desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del cual se generan. Un modo conveniente para generar tales variantes por sustitución implica la maduración por afinidad usando la exposición en fago. En resumen, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se muestran de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetadas dentro de cada partícula. Entonces, se examinan las variantes de presentación en fago para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se da a conocer en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidata para la modificación, puede realizarse mutagénesis por exploración de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo humano y Ovr110 humana. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas detalladas en el presente documento. Una vez que se generan tales variantes, se somete a examen el panel de variantes tal como se describe en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo adicional.
resultante(s) seleccionada(s) para un desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del cual se generan. Un modo conveniente para generar tales variantes por sustitución implica la maduración por afinidad usando la exposición en fago. En resumen, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se muestran de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetadas dentro de cada partícula. Entonces, se examinan las variantes de presentación en fago para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se da a conocer en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidata para la modificación, puede realizarse mutagénesis por exploración de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo humano y Ovr110 humana. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas detalladas en el presente documento. Una vez que se generan tales variantes, se somete a examen el panel de variantes tal como se describe en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo adicional.
Otro tipo de variante de aminoácido del
anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del
anticuerpo. Con alteración se hace referencia a la deleción de uno
o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo,
y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están
presentes en el anticuerpo. Normalmente, la glicosilación de
anticuerpos está ligada a N o a O. Ligado a N se refiere a la unión
del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo
de asparagina. Las secuencias de tripéptidos
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en las que X
es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de
carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia
de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido
crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación ligada a O
se refiere a la unión de uno de los azúcares
N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un
hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque
también pueden usarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina. La adición de sitios de
glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente modificando
la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las
secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios
de glicosilación ligada a N). La alteración también puede realizarse
mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de
serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los
sitios de glicosilación ligada a O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
para variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo
anti-Ovr110 se preparan mediante una variedad de
métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se
limitan a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el
caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se producen de
manera natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y
mutagénesis en casete de una molécula de ácido nucleico preparada
anteriormente que codifica para una versión variante o no variante
del anticuerpo anti-Ovr110.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo
descrito en el presente documento con respecto a la función
efectora, por ejemplo, de modo que se mejore la citotoxicidad
mediada por células dependiente de antígenos (CCDA) y/o
citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto
puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos
en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente,
puede(n) introducirse residuo(s)
de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o aumento de la destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada usando agentes de reticulación heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse mediante ingeniería un anticuerpo que tiene dos regiones Fc y de ese modo pueden tener capacidades de CCDA y lisis del complemento mejoradas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o aumento de la destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada usando agentes de reticulación heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse mediante ingeniería un anticuerpo que tiene dos regiones Fc y de ese modo pueden tener capacidades de CCDA y lisis del complemento mejoradas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Para aumentar la semivida en suero del
anticuerpo, puede incorporarse un epítopo de unión al receptor
natural (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se
describe en la patente estadounidense 5.739.277, por ejemplo. Tal
como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo de
unión al receptor natural" se refiere a un epítopo de la región
Fc del anticuerpo.
Anteriormente se han descrito técnicas para
generar anticuerpos. Además, pueden seleccionarse anticuerpos con
determinadas características biológicas, tal como se desee.
Pueden evaluarse los efectos inhibidores del
crecimiento de un anticuerpo anti-Ovr110 descrito en
el presente documento mediante métodos conocidos en la técnica, por
ejemplo, usando células que expresan Ovr110 o bien de manera
endógena o bien tras la transfección con el gen de Ovr110. Por
ejemplo, las líneas de células tumorales y las células
transfectadas con Ovr110 proporcionadas en el ejemplo 1 a
continuación, pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal
anti-Ovr110 descrito en el presente documento en
diversas concentraciones durante algunos días (por ejemplo,
2-7 días) y teñirse con violeta cristal o MTT o
analizarse mediante algún otro ensayo colorimétrico. Otro método de
medir la proliferación sería mediante la comparación de la captación
de ^{3}H-timidina por las células tratadas en
presencia o ausencia de un anticuerpo anti-Ovr110 de
la invención. Tras el tratamiento con anticuerpos, se recogen las
células y se cuantifica la cantidad de radiactividad incorporada en
el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos
apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular
seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento que se sabe
que inhibe el crecimiento de esa línea celular. Puede determinarse
la inhibición del crecimiento de las células tumorales in
vivo de diversas maneras tal como se describen en la sección de
ejemplos experimentales a continuación. Preferiblemente, la célula
tumoral es una que sobreexpresa Ovr110. Preferiblemente, el
anticuerpo anti-Ovr110 inhibirá la proliferación
celular de una célula tumoral que expresa Ovr110 in vitro o
in vivo en aproximadamente el 25-100% en
comparación con la célula tumoral no tratada; más preferiblemente,
en aproximadamente el 30-100%, e incluso más
preferiblemente en aproximadamente el 50-100% o el
70-100%, en una concentración de anticuerpo de
aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml. Puede medirse la inhibición del
crecimiento en una concentración de anticuerpo de aproximadamente
0,5 a 30 \mug/ml o de aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo
celular, en el que se determina la inhibición del crecimiento
1-10 días después de la exposición de las células
tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento
in vivo si la administración del anticuerpo
anti-Ovr110 a de aproximadamente 1 \mug/kg a
aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la
reducción del tamaño del tumor o de la proliferación de células
tumorales en el plazo de aproximadamente 5 días a 3 meses a partir
de la primera administración del anticuerpo, preferiblemente en el
plazo de aproximadamente 5 a 30 días.
Para seleccionar anticuerpos que inducen la
muerte celular, puede evaluarse la pérdida de la integridad de la
membrana tal como se indica mediante, por ejemplo, la captación de
yoduro de propidio (PI), azul de trípano o 7AAD en relación con un
control. Puede realizarse un ensayo de captación de PI en ausencia
del complemento y células efectoras inmunitarias. Las células
tumorales que expresan Ovr110 se incuban con medio solo o con medio
que contiene el anticuerpo monoclonal apropiado en, por ejemplo,
aproximadamente 10 \mug/ml. Las células se incuban durante un
periodo de tiempo de tres días. Tras cada tratamiento, se lavan las
células y se colocan en alícuotas en tubos de 12 x 75 con tapón de
drenaje de 35 nm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento)
para eliminar grupos de células. Entonces, los tubos reciben PI (10
\mug/ml). Pueden analizarse las muestras usando un citómetro de
flujo FACSCAN^{TM} y el software CellQuest FACSCONVERT^{TM}
(Becton Dickinson). Pueden seleccionarse estos anticuerpos que
inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular
tal como se determina mediante la captación de PI, como anticuerpos
que inducen muerte celular.
Para seleccionar los anticuerpos que se unen a
un epítopo en Ovr110 unido mediante un anticuerpo de interés, por
ejemplo, los anticuerpos anti-Ovr110 descritos en el
presente documento, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado
rutinario tal como se describe en Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow y David Lane
(1998). Puede usarse este ensayo para determinar si un anticuerpo de
prueba se une al mismo sitio o epítopo que un anticuerpo
anti-Ovr110 descrito en el presente documento.
Alternativa o adicionalmente, puede realizarse un mapeo del epítopo
mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede
someterse a mutagénesis la secuencia del anticuerpo tal como
mediante exploración de alanina, para identificar residuos de
contacto. Inicialmente, se somete a prueba el anticuerpo mutante
para determinar la unión con el anticuerpo policlonal para
garantizar un plegamiento apropiado. En un método diferente, pueden
usarse péptidos correspondientes a diferentes regiones de Ovr110 en
ensayos de competición con los anticuerpos de prueba o con un
anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o
conocido.
Por ejemplo, un método para seleccionar
anticuerpos que se unen a un epítopo que está unido mediante un
anticuerpo puede comprender combinar una muestra que contiene
Ovr110 con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo descrito en el
presente documento para formar una mezcla, entonces se determina el
nivel de anticuerpo anti-Ovr110 unido a Ovr110 en
la mezcla y se compara con el nivel de anticuerpo
anti-Ovr110 unido en la mezcla con respecto a una
mezcla control, en la que el nivel unión de anticuerpo
anti-Ovr110 a Ovr110 en la mezcla en comparación
con el control es indicativo de la unión del anticuerpo de prueba a
un epítopo que está unido mediante el anticuerpo
anti-Ovr110 descrito en el presente documento. El
nivel de anticuerpo anti-Ovr110 unido a Ovr110 se
determina mediante ELISA. El control puede ser un control positivo o
negativo, o ambos. Por ejemplo, el control puede ser una mezcla de
Ovr110, anticuerpo anti-Ovr110 tal como se describe
en el presente documento y un anticuerpo que se sabe que se une al
epítopo unido mediante el anticuerpo anti-Ovr110
descrito en el presente documento. El anticuerpo
anti-Ovr110 marcado con un marcador tal como los
dados a conocer en el presente documento. El Ovr110 puede estar
unido a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de cultivo tisular
o a perlas; por ejemplo, perlas de Sepharose.
La invención también está relacionada con el uso
de un anticuerpo anti-Ovr para el tratamiento del
cáncer de cabeza y cuello con inmunoconjugados que comprenden un
anticuerpo conjugado con un agente anticancerígeno tales como un
agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento.
Anteriormente se han descrito agentes
quimioterápicos útiles en la generación de tales inmunoconjugados.
También se contemplan en el presente documento conjugados de un
anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como
caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno, y CC1065, y los
derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, un anticuerpo
anti-Ovr110 (de longitud completa o fragmentos) tal
como se describen en el presente documento se conjugan con una o
más moléculas de maitansinoide.
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que
actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se
aisló por primera vez del arbusto del este de África Maytenus
serrata (patente estadounidense n.º 3.896.111). Posteriormente,
se descubrió que determinados microbios también producen
maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres
C-3 de maitansinol (patente estadounidense n.º
4.151.042). Se dan a conocer maitansinol sintético y derivados y
análogos del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses
n.^{os} 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814;
4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946;
4.315.929; 4.317.821; 4.322.348;
4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
En un intento de mejorar su índice terapéutico,
se han conjugado maitansina y maitansinoides con anticuerpos que
específicamente se unen a antígenos de células tumorales. Se dan a
conocer inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso
terapéutico, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.^{os}
5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1. Liu
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:8618-8623 (1993) describieron inmunoconjugados
que comprendían un maitansinoide designado DMI ligado a un
anticuerpo monoclonal C242 dirigido frente a cáncer colorrectal
humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico para
las células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad
antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.
Chari et al., Cancer Research 52:127-131
(1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugó un
maitansinoide, mediante un ligador de disulfuro, al anticuerpo
murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de
colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une
al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del
conjugado TA.1-maitansinoide se sometió a prueba
in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano
SK-BR-3, que expresa 3 x 10^{5}
antígenos de superficie de HER-2 por célula. El
conjugado del fármaco consiguió un grado de citotoxicidad similar
al del fármaco de maitansinoide libre, que pudo aumentarse
aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de
anticuerpo. El conjugado de maitansinoide A7 mostró baja
citotoxicidad sistémica en ratones.
Se prepararon conjugados de anticuerpo
anti-Ovr110-maitansinoide ligando
químicamente un anticuerpo anti-Ovr110 a una
molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la
actividad biológica o bien del anticuerpo o bien de la molécula
maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de
maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha demostrado
eficacia en mejorar la citotoxicidad de las células diana sin
afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo,
aunque incluso se esperaría que una molécula de toxina/anticuerpo
mejorara la citotoxicidad a través del uso del anticuerpo desnudo.
Los maitansinoides se conocen bien en la técnica y pueden
sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse a partir de
fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados, por
ejemplo, en la patente estadounidense n.º 5.208.020 y en otras
patentes y publicaciones que no son patentes a las que se hizo
referencia anteriormente en el presente documento. Los
maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos del maitansinol
modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la
molécula de maitansinol, tales como diversos ésteres de
maitansinol.
Existen muchos grupos de enlace conocidos en la
técnica para preparar conjugados de
anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo,
los dados a conocer en la patente estadounidense n.º 5.208.020 o la
patente europea 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer
Research 52: 127-131 (1992). Los grupos de enlace
incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil,
grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábil, o grupos de esterasa
lábil, tal como se dan a conocer en las patentes anteriormente
identificadas, prefiriéndose los grupos disulfuro y tioéter. Pueden
prepararse los conjugados del anticuerpo y maitansinoide usando una
variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales
tales como
(2-piridilditio)-propionato de
N-succinimidilo (SPDP),
(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tales como adipimato de dimetilo HCl), ésteres activos
(tales como suberato de disucciminidilo), aldehídos (tales como
glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como
bis-(p-azidobenozil)hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de
tolueno), y compuestos de fluoro bis-activos (tales
como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen
(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al.,
Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y
(2-piridiltio)pentanoato de
N-succinimidilo (SPP) para proporcionar un enlace
disulfuro.
Puede unirse el ligador a la molécula de
maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de
enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster mediante
reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento
convencionales. La reacción puede producirse en la posición
C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición
C-14 modificada con hidroximetilo, la posición
C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la
posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo.
Preferiblemente, el enlace se forma en la posición
C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Otro inmunoconjugado de interés comprende un
anticuerpo anti-Ovr110 conjugado con una o más
moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de
caliqueamicina puede producir rupturas del ADN bicatenario en
concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados
de la familia de la caliqueamicina, véanse las patentes
estadounidenses 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285,
5.770.701, 5.773.001, 5.877.296 (todas de la American Cyanamid
Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden
usarse incluyen, pero no se limitan a, \gamma_{1}^{I},
\alpha_{2}^{I}, \alpha_{3}^{I},
N-acetil-\gamma_{1}^{I}, PSAG
y \theta_{1}^{I}, (Hinman et al., Cancer Research
53:3336 (1993), Lode et al., Cancer Research 5
8:2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses
anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco
antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es
un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios de
acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana plasmática.
Por tanto, la captación celular de estos agentes a través de la
internalización mediada por anticuerpos mejora en gran medida sus
efectos citotóxicos
Otros agentes antitumorales que pueden
conjugarse con los anticuerpos anti-Ovr110 descritos
en el presente documento incluyen BCNU, estreptozoicina,
vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes
conocidos de manera colectiva complejo de LL-E33288
descritos en las patentes estadounidenses 5.053.394, 5.770.710, así
como las esperamicinas (patente estadounidense 5.877.296). Toxinas
enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden
usarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos 1 5 que
no se unen de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de
Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de
abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina,
proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina,
proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y
PAP-S), inhibidor de Momordica charantia,
curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis,
gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los
tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado
el 28 de octubre de 1993. La presente invención describe además un
inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con
actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una
endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa, ADNsa).
Para la destrucción selectiva del tumor, el
anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están
disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción
de anticuerpos anti-Ovr110 radioconjugados. Los
ejemplos incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, In^{111},
Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32},
e isótopos radiactivos de Lu. Cuando se usa el conjugado para el
diagnóstico, éste puede comprender un átomo radiactivo para
estudios por gammagrafía, por ejemplo Tc^{99M} o I^{123}, o un
marcador de espín para la obtención de imágenes por resonancia
magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de
imágenes por resonancia magnética, mri), tales como
yodo-123, yodo-131,
indio-111, flúor-19,
carbono-13, nitrógeno-15,
oxígeno-17, gadolinio, manganeso e hierro.
Pueden incorporarse en el conjugado
radiomarcadores u otros marcadores de maneras conocidas. Por
ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse
mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de
aminoácidos adecuados implicando, por ejemplo,
flúor-19 en lugar de hidrógeno. Pueden unirse
marcadores tales como Tc^{99M}, I^{123}, In^{111},
Re^{186}, Re^{188}, mediante un residuo de cisteína en el
péptido. Puede unirse itrio-90 mediante un residuo
de lisina. Puede usarse el método IODOGEN (Fraker et
al.(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun.
80:49-57) para incorporar yodo, "Monoclonal
Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)
describe otros métodos en detalle.
Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y el
agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de
proteínas bifuncionales tales como
(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP),
(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres
activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales
como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales
como
bis-(p-azidobenzoil)-hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de
tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales
como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como
se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). El
ácido
1-isotiocianatobencil-metildietilen-triaminapentaacético
marcado con carbono (MX-DTPA) es un agente quelante
a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al
anticuerpo. Véase el documento 94/11026. El ligador puede ser un
"ligador que puede escindirse" que facilita la liberación del
fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, pueden usarse un
ligador de ácido lábil, ligador sensible a peptidasas, ligador
fotolábil, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro
(Chari et al., Cancer Research 52: 127-131
(1992); patente estadounidense n.º 5.208.020).
Alternativamente, puede usarse una proteína de
fusión que comprende el anticuerpo anti-Ovr110 y el
agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o
síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones
respectivas que codifican para las dos partes del conjugado o bien
adyacentes entre sí o bien separadas por una región que codifica
para un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas
del conjugado.
Además, puede conjugarse el anticuerpo con un
"receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la
preselección como diana del tumor en el que se administra el
conjugado anticuerpo-receptor al paciente, seguido
de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un
agente de eliminación y luego la administración de un "ligando"
(por ejemplo, avidina) que se conjuga con el agente citotóxico (por
ejemplo, un radionucleótido).
Los anticuerpos descritos en el presente
documento también pueden usarse en el TPEDA conjugando el anticuerpo
con una enzima de activación de profármaco que convierte un
profármaco (por ejemplo, un agente quimioterápico de peptidilo,
véase el documento WO81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo.
Véase por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente
estadounidense n.º 4.975.278.
El componente de enzima del inmunoconjugado útil
para el TPEDA incluye cualquier enzima que puede actuar sobre un
profármaco de tal manera que lo convierte en su forma citotóxica más
activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención
incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para
convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres;
arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato
en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir
fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticancerígeno,
5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasas de
Serratia, termolisina, subtilisina carboxipeptidasas y
catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para
convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres;
D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir
profármacos que contienen sustituyentes de
D-aminoácidos; enzimas que escinden hidratos de
carbono tales como O-galactosidasa y neuramidasa
útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres;
P-lactamasa útiles para convertir fármacos
derivatizados con P-lactamas en fármacos libres; y
penicilinamidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G
amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus
nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo,
respectivamente, en fármacos libres.
Alternativamente, los anticuerpos con actividad
enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas",
pueden usarse para convertir los profármacos descritos en el
presente documento en fármacos activos libres (véase, por ejemplo,
Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Pueden
prepararse conjugados de anticuerpo-abzima tal como
se describe en el presente documento para suministrar la abzima a
una población de células tumorales. Las enzimas descritas en el
presente documento pueden unirse covalentemente a los anticuerpos
anti-Ovr110 mediante técnicas bien conocidas en la
técnica tales como el uso de reactivos de reticulación
heterobifuncionales tratados anteriormente. Alternativamente,
pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos una
región de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en el presente
documento, ligada a al menos una parte funcionalmente activa de una
enzima descrita en el presente documento usando técnicas de ADN
recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo,
Neuberger et al., Nature, 312: 604-608
(1994)).
En el presente documento se contemplan otras
modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede
unirse a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por
ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o
copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. También puede
atraparse el anticuerpo en microcápsulas preparadas, por ejemplo,
mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización
interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximeticelulosa o
gelatina y microcápsulas de poli(metacilato de metilo),
respectivamente), en sistemas de administración de fármacos
coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina,
microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en
macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16^{a} edición, Oslo, A. Ed., (1980).
También pueden formularse los anticuerpos
anti-Ovr110 descritos en el presente documento como
inmunoliposomas. Un "liposomas" es una vesícula pequeña
compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o
tensioactivos que es útil para administrar un fármaco a un
mamífero. Comúnmente, los componentes del liposoma se disponen en
una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las
membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se
preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se
describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,
77:4030 (1980); las patentes estadounidenses n.^{os} 4.485.045 y
4.544.545; y el documento WO97/38731 publicado el 23 de octubre de
1997. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación mejorado
en la patente estadounidense n.º 5.013.556. Pueden generarse
liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación
en fase inversa con una composición de lípidos que comprende
fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada
con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través
de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con
el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo descrito en
el presente documento pueden conjugarse con los liposomas tal como
se describe en Martin et al., J. Biol. Chem.
257:286-288 (1982) mediante una reacción de
intercambio de disulfuro. Opcionalmente, un agente quimioterápico
está contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J.
National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).
La invención también describe una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo
anti-Ovr110 humanizado, los vectores y las células
huésped que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas
recombinantes para la producción del anticuerpo. Para la producción
recombinante del anticuerpo, se aísla la molécula de ácido nucleico
que lo codifica y se inserta en un vector replicable para clonación
adicional (amplificación del ADN) o se inserta en un vector en
unión operativa con un promotor de la expresión. El ADN que codifica
para el anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente
usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de
oligonucleótido que pueden unirse específicamente a las moléculas de
ácido nucleico que codifican para las cadenas pesadas y ligeras del
anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Generalmente, los
componentes del vector incluyen, pero sin limitarse a, uno o más de
los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno
o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una
secuencia de terminación de la transcripción.
El anticuerpo anti-Ovr110 de
esta invención puede producirse de manera recombinante no sólo
directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un
polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal
u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el
extremo N-terminal del polipéptido o la proteína
madura. La secuencia señal heteróloga seleccionada es
preferiblemente una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde
mediante una peptidasa señal) mediante la célula huésped. Para las
células huésped procariotas que no reconocen ni procesan la
secuencia señal del anticuerpo anti-Ovr110 nativo,
se sustituye la secuencia señal por una secuencia señal procariota
seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina,
penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina II termoestable. Para
la secreción en levaduras, puede sustituirse la secuencia señal
nativa, por ejemplo, por el líder de invertasa de levadura, líder de
factor oc (incluyendo líderes de factor cc de Saccharomyces
y Kluyveromyces), o líder de fosfatasa ácida, líder de
glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en el
documento WO 90/13646. En la expresión en células de mamíferos,
están disponibles secuencias señal de mamífero así como líderes
secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El
ADN de tal región precursora se liga en marco de lectura al ADN que
codifica para el anticuerpo anti-OVR110.
Tanto los vectores de expresión como de
clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que
el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas.
Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una
que permite que el vector se replique independientemente del ADN
cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o
secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias se conocen bien
para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de
replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de
bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido
2\mu es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales
(SV40, polioma, adenovirus, VSV o VPB) son útiles para vectores de
clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente de
origen de replicación no es necesario para vectores de expresión en
mamíferos (normalmente el origen de SV40 puede usarse sólo porque
contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden
contener un gen de selección, también denominado un marcador
seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para
proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o
tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios
complejos, por ejemplo, el gen que codifica para
D-alanina racemasa para bacilos. Un ejemplo de un
esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento
de una célula huésped. Las células que se transforman
satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que
confiere resistencia al fármaco y por tanto sobreviven al régimen
de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos
neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son los que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
del anticuerpo anti-Ovr110, tal como DHFR, timidina
cinasa, metalotioneína-I y II, preferiblemente
genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina
descarboxilasa, etc. Por ejemplo, se identifican por primera vez
células transformadas con el gen de selección DHFR cultivando todos
los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato
(Mtx), un agonista competitivo de DHFR. Una célula huésped
apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea de
células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad
DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, pueden seleccionarse células
huésped (particularmente huéspedes de tipo natural que contienen
DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con
secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo
anti-Ovr110, la proteína DHFR de tipo natural y
otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido
3'-fosfotransferasa (APH) mediante crecimiento
celular en medio que contienen un agente de selección para el
marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico,
por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la patente
estadounidense n.º 4.965.199.
Un gen de selección adecuado para su uso en
levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura
(Stinchcomb et al., 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona
un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que
carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC
n.º 44076 o PEP4 Jones, Genetics, 85:12(1977). Entonces, la
presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula huésped de
levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la
tranformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De
manera similar, se complementan las cepas de levaduras deficientes
de Leu2 (ATCC 20.522 ó 38.626) con plásmidos conocidos que llevan
el gen Leu2.
Además, pueden usarse vectores derivados del
plásmido circular de 1,6 pm pKDI para la transformación de levaduras
de Kluyveromyces. Alternativamente, se notificó para K.
lactis un sistema de expresión para la producción a gran escala
de quimosina de ternero recombinante. Van den Berg, Bio/Technology,
8:135 (1990). También se han dado a conocer vectores de expresión
de múltiples copias estables para la secreción de albúmina sérica
humana recombinante madura mediante cepas industriales de
Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991).
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Habitualmente los vectores de expresión y
clonación contienen un promotor que es reconocido por el organismo
huésped y está operativamente unido al ácido nucleico del anticuerpo
anti-Ovr110. Los promotores adecuados para su uso
con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA,
P-lactmasa y sistemas de promotor de lactosa,
promotor de fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano
(trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin
embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los
promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán
una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.)
operativamente unida al ADN que codifica para el anticuerpo
anti-Ovr110.
Se conocen secuencias promotoras para
eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una
región rica en AT ubicada aproximadamente a de 25 a 39 bases en el
sentido de 5' del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra
secuencia encontrada de 70 a 80 bases en el sentido de 5' del inicio
de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N
puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de
los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal
para la adición de la cola de poliA al extremo 3' de la secuencia
codificante. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada
en los vectores de expresión eucariotas. Los ejemplos de secuencias
promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen
los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras
enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído fosfato
deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructocinasa, glucosa fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción
controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa
ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del
nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído fosfato deshidrogenasa y
enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Se
describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para su uso
en la expresión en levaduras en el documento EP 73.657. También se
usan de manera ventajosa potenciadores de levadura con los
promotores de levadura.
Se controla la transcripción del anticuerpo
anti-Ovr110 a partir de los vectores en células
huésped de mamífero, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de
los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela
aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma
bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus,
virus de la hepatitis B y más preferiblemente virus de simio 40
(SV40), de los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el
promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de los
promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean
compatibles con los sistemas de células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus
SV40 se obtienen de manera conveniente como un fragmento de
restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación
viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus
humano se obtiene de manera conveniente como un fragmento de
restricción E de HindI11. En la patente estadounidense n.º
4.419.446 se da a conocer un sistema para expresar ADN en huéspedes
mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector. Una
modificación de este sistema se describe en la patente
estadounidense n.º 4.601.978. Véase también Reyes et al.,
Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc
de P-interferón humano en células de ratón bajo el
control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes
simple. Alternativamente, puede usarse la repetición terminal larga
del virus del sarcoma de Rous como promotor.
La transcripción de un ADN que codifica para el
anticuerpo Ovr110 descrito en el presente documento por eucariotas
superiores a menudo se aumenta insertando una secuencia potenciadora
en el vector. En la actualidad se conocen muchas secuencias
potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo,
normalmente se usará un potenciador de un virus de célula eucariota.
Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del
origen de replicación (pb 100-270), el potenciador
del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma
en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de
adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18
(1982) sobre elementos potenciadores para activar los promotores
eucariotas. El promotor puede cortarse y empalmarse en el vector en
la posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia que codifica para
el anticuerpo anti-Ovr110, pero preferiblemente se
ubica en un sitio en 5' con respecto al promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huésped eucariotas (células de levadura, hongos, insecto, vegetales,
animales o nucleadas de otros organismos multicelulares) también
contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la
transcripción y para estabilizar el ARNn. Comúnmente, tales
secuencias están disponibles a partir de las regiones no traducidas
en 5' y ocasionalmente en 3' de los ADNc o ADN eucariotas o virales.
Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como
fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que
codifica para el anticuerpo anti-Ovr110. Un
componente de terminación de la transcripción útil es la región de
poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase el
documento WO 94/11026 y el vector de expresión dado a conocer en el
mismo.
Las células adecuadas para clonar o expresar el
ADN en los vectores en el presente documento son las células
procariotas, de levaduras o eucariotas superiores descritas
anteriormente. Los procariotas adecuados para este fin incluyen
eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, enterobacterias tales
como Escherichia, por ejemplo, E. coli,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia
marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como
B. subtilis y B. lincheniformis (por ejemplo, se da a
conocer B.lincheniformis 41P en el documento DD 266.710
publicado el 12 de abril de 1989), pseudomonas tales como P.
aureoginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de
E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque
son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E.
coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W31 10 (ATCC 27.325).
Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitativos.
Pueden producirse en bacterias anticuerpos de
longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión
de anticuerpos, en particular cuando no se necesitan ni
glicosilación ni función efectora de Fc, tal como cuando se conjuga
el anticuerpo terapéutico con un agente citotóxico (por ejemplo, una
toxina) y el inmunoconjugado muestra por sí mismo eficacia en la
destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud
completa tienen mayor semivida en circulación. La producción en
E. coli es más rápida y más económica. Para la expresión de
fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por
ejemplo, el documento U.S. 5.684.237 (Carter et al.), el
documento U.S. 5.789.199 (Joly et al.) y el documento U.S.
5.840.523 (Simmons et al.) que describe la región de inicio
de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la
expresión y secreción. Tras la expresión, se aísla el anticuerpo de
la masa de células de E. coli en una fracción soluble y
puede purificarse, por ejemplo, a través de una columna de proteína
A o G dependiendo del isotipo. Puede llevarse a cabo la
purificación final de manera similar al procedimiento para purificar
anticuerpos expresados, por ejemplo, en células CHO.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes
de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican
el anticuerpo anti-Ovr110. Saccharomyces
cerevisae, o levadura de panadería común, es la más comúnmente
utilizada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores.
Sin embargo, comúnmente están disponibles varios otros géneros,
especies y cepas y son útiles en el presente documento, tales como
Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces
tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC
12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii
(ATCC 24.178), K. waltti (ATCC 56.500). K.
drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K.
marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia
pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma
reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa;
Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y
hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huéspedes de
Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y
Aspergillus tales como A. nidulans y A.
niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión
de anticuerpo anti-Ovr110 glicosilado se derivan de
organimos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados
incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado
numerosas cepas de baculovirus y variantes y células huésped de
insectos permisivas correspondientes de huéspedes tales como
Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una
variedad de cepas virales para la transfección está públicamente
disponible, por ejemplo, la variante L-1 de
Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de
Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como los virus
descritos en el presente documento, particularmente para la
transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También pueden utilizarse como huéspedes
cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja,
petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Los vectores de
clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en
cultivo de células vegetales los conocen los expertos en la técnica.
Véanse por ejemplo, Hiatt et al., Nature
(1989)342:76-78, Owen et al. (1992)
Bio/Technology 10:790-794. Artsaenko et al.
(1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker et
al., (1996) Plant. Mol. Biol. 32:979-986.
Sin embargo, el mayor interés ha sido en células
de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en
cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento de
rutina. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles
son la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario
humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en
suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977));
células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de
ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77:4216 (1980)); células de Sertoli de
ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251
(1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de
riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC
CRL1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC
CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de
hígado de rata búfalo (BRL, ATCC CRL 1442); células de pulmón
humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, 1413
8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI
(Mather et al., Annals. N. Y Acad. Sci.
383:44-84 (1982)); células MRC 5; células FS4; y un
línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los
vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la
producción de anticuerpos anti-Ovr110 y se cultivan
en medios de nutrientes convencionales modificados según sea
apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes que codifican para las secuencias
deseadas.
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Las células huésped usadas para producir el
anticuerpo anti-Ovr110 descrito en el presente
documento pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios
comercialmente disponibles tales como FIO de Ham (Sigma), medio
esencial mínimo (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma),
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) son adecuados
para cultivar las células huésped. Además, puede usarse cualquiera
de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44
(1979), Barner et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980),
patentes estadounidenses n.^{os} 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762;
4.560.655; ó 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO
87/00195; o la patente estadounidense Re. 30.985 como medios de
cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede
complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores
de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de
crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio,
magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos
(tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el
fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones
finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de
energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro
complemento necesario a concentraciones apropiadas que las conocerán
los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como
temperatura, pH y similares, son las usadas anteriormente con la
célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes
para el experto habitual.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el
anticuerpo puede producirse de manera intracelular, en el espacio
periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el
anticuerpo se produce de manera intracelular, como primera etapa,
se eliminan los residuos de material particulado, o bien células
huésped o bien fragmentos lisados, por ejemplo mediante
centrifugación o ultrafiltración. Carter et al.,
Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un
procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio
periplásmico de E. coli. En resumen, se descongela la masa de
células en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a lo largo de aproximadamente 30
minutos. Los residuos celulares pueden eliminarse mediante
centrifugación. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, los
sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se
concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de
proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amico o Millipore Pellicon. Puede incluirse un
inhibidor de proteasas tal como PMSF en cualquiera de las etapas
anteriores para inhibir la proteólisis, y pueden incluirse
antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes
adventicios.
Puede purificarse la composición de anticuerpos
preparada a partir de las células usando, por ejemplo, cromatografía
de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía
de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de
purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando
de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio
Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Puede
usarse proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas
pesadas \gamma1, \gamma2 ó \gamma4 humanas (Lindmark et
al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Se
recomienda proteína G para todos los isotipos de ratón y para
\gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La
matriz a la que el ligando de afinidad está unido es lo más a menudo
agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices
mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o
poli(estirendivinil)benceno permiten velocidades de
flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que
pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un
dominio CH3, es útil para la purificación la resina Bakerbond
ABX^{TM} (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Dependiendo del
anticuerpo que va a recuperarse también están disponibles otras
técnicas para purificar proteínas tales como fraccionamiento en una
columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de
fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina
SEPHAROSE^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio
aniónico o catiónico (tal como columna de ácido aspártico),
cromatoenfoque, SIDS-PAGE y precipitación con
sulfato de amonio.
Tras cualquier etapa(s) de purificación
preliminar(es), la mezcla que comprende el anticuerpo de
interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de
interacción hidrófoba a pH bajo usando un tampón de elución a un pH
entre aproximadamente 2,5 - 4,5, preferiblemente realizada a bajas
concentraciones de sales (por ejemplo, desde aproximadamente 0 -
0,25 M de sal).
Las formulaciones farmacéuticas de los
anticuerpos usados según la presente invención se preparan para el
almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado de pureza
deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes
farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical
Sciences 16^{a} edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de
formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos,
excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los
receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e
incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y
otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y
metionina; conservantes (tales como cloruro de
octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de
hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol,
alcohol bencílico o butílico; alquilparabenos tales como metil o
propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol;
3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos,
disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa
o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificantes tales
como trealosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sacarosa,
manitol, trealosa o sorbitol; tensioactivos tales como polisorbato;
contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos
metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína); y/o
tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM}
o polietilenglicol (PEG). Preferiblemente, el anticuerpo comprende
el anticuerpo a una concentración de entre 5-200
mg/ml, preferiblemente 10-100 mg/ml.
La formulación en el presente documento también
puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para
la indicación particular que está tratándose, preferiblemente
aquellos con actividades complementarias que no se afectan entre sí
de manera adversa. Por ejemplo, además del anticuerpo
anti-Ovr110 que se internaliza, sería deseable
incluir en una formulación un anticuerpo adicional, por ejemplo, un
segundo anticuerpo anti-Ovr110 que se une a un
epítopo diferente en Ovr110, o un anticuerpo frente a alguna otra
diana tal como un factor de crecimiento que afecta al crecimiento
del cáncer particular. Alternativa o adicionalmente, la composición
puede comprender además un agente quimioterápico, agente citotóxico,
citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal y/o
cardioprotector. Tales moléculas se presentan de manera adecuada en
combinación en cantidades que son eficaces para el fin
previsto.
También pueden atraparse los principios activos
en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnica de
coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de
poli-(metacilato de metilo), respectivamente, en sistemas de
administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer
en Remington's Pharmaceutical Science 16^{a} edición, Osol, A.
Ed. (1980).
Pueden prepararse preparaciones de liberación
sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos
sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de
artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los
ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres,
hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de
2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)),
polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919), copolímeros de
ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno-acetato de vinilo no degradables,
copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como
el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas por
copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de
leuprolida), y ácido poli-D-(-)hidroxibutírico.
Las formulaciones que van a usarse para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Según la presente invención, el anticuerpo
anti-Ovr110 que se internaliza tras unirse a Ovr110
en una superficie celular se usa para la preparación de un
medicamento para tratar un sujeto que lo necesita que tiene un
cáncer de cabeza y cuello, más particularmente, carcinoma adenoide
quístico de cabeza y cuello y metástasis asociadas.
Generalmente, el cáncer comprenderá células que
expresan Ovr110, de modo que el anticuerpo
anti-Ovr110 puede unirse a las mismas. Mientras que
el cáncer puede caracterizarse mediante la sobreexpresión de la
molécula Ovr110, la presente aplicación proporciona además el uso
de un anticuerpo anti-Ovr110 para la fabricación de
un medicamento para tratar un cáncer que no se considera que sea un
cáncer de cabeza y cuello que sobreexpresa Ovr110.
La invención también hace referencia a métodos
para detectar células de cáncer de cabeza y cuello que sobreexpresan
Ovr110. Los métodos pueden comprender combinar una muestra de
prueba que contiene células con un anticuerpo descrito en el
presente documento, someter a ensayo la muestra de prueba para
detectar la unión del anticuerpo a células en la muestra de prueba
y comparar el nivel de unión del anticuerpo en la muestra de prueba
con el nivel de unión del anticuerpo en una muestra control de
células. Un control adecuado es, por ejemplo, una muestra de
células normales del mismo tipo que la muestra de prueba o una
muestra de células que se sabe que está libre de células que
sobreexpresan Ovr110. Un nivel de unión a Ovr110 superior al de una
muestra control de este tipo sería indicativo de que la muestra de
prueba contiene células que sobreexpresan Ovr110. Alternativamente,
el control puede ser una muestra de células que se sabe que contiene
células que sobreexpresan Ovr110. En tal caso, un nivel de unión de
anticuerpo a Ovr110 en la muestra de prueba que es similar a, o que
supera a, el de la muestra control sería indicativo de que la
muestra de prueba contiene células que sobreexpresan Ovr110.
Puede detectarse la sobreexpresión de Ovr110 con
diversos ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, puede someterse a
ensayo la sobreexpresión de Ovr110 mediante inmunohistoquímica
(IHC). Pueden someterse secciones de tejido de una biopsia de tumor
incluidas en parafina al ensayo de IHC y otorgarse un criterio de
intensidad de tinción de la proteína Ovr110 tal como sigue.
Puntuación 0, no se observa tinción o se observa
tinción de la membrana en menos del 10% de las células
tumorales.
Puntuación 1+, se detecta una tinción de la
membrana tenue/apenas perceptible en más del 10% de las células
tumorales. Las células se tiñen sólo en parte de su membrana.
Puntuación 2+, se observa una tinción de la
membrana completa de débil a moderada en más del 10% de las células
tumorales.
Puntuación 3+, se observa una tinción de la
membrana completa de moderada a intensa en más del 10% de las
células tumorales.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los tumores con puntuaciones de 0 ó 1+ para la
expresión de Ovr110 pueden caracterizarse como que no sobreexpresan
Ovr110, mientras los tumores con puntuaciones de 2+ ó de 3+ pueden
caracterizarse como que sobreexpresan Ovr110.
Alternativa o adicionalmente, pueden llevarse a
cabo ensayos FISH tales como INFORM^{TM} (vendido por Ventana,
Arizona) o PATHVISION^{TM} (VySiS, Illinois) en tejido tumoral
incluido en parafina, fijado con formalina para determinar el grado
(si existe alguno) de sobreexpresión de Ovr110 en el tumor. Puede
evaluarse la sobreexpresión o amplificación de Ovr110 usando un
ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, administrando una
molécula (tal como un anticuerpo descrito en el presente documento)
que se une a Ovr110 y que está marcado con un marcador detectable
(por ejemplo, un isótopo radiactivo o un marcador fluorescente) y
explorando externamente al paciente para localizar el marcador.
Se combina una muestra que se sospecha que
contiene células que expresan o sobreexpresan Ovr110 con los
anticuerpos descritos en el presente documento en condiciones
adecuadas para la unión específica de los anticuerpos a Ovr110. La
unión y/o internalización de los anticuerpos
anti-Ovr110 descritos en el presente documento es
indicativa de que las células expresan Ovr110. El nivel de unión
puede determinarse y compararse con un control adecuado, en el que
un nivel elevado de Ovr110 unido en comparación con el control es
indicativo de la sobreexpresión de Ovr110. La muestra que se
sospecha que contiene células que sobreexpresan Ovr110 puede ser una
muestra de células cancerosas, particularmente una muestra de
cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo, carcinoma adenoide
quístico. También puede someterse a ensayo una muestra de suero de
un sujeto para determinar los niveles de Ovr110 combinando una
muestra de suero de un sujeto con un anticuerpo
anti-Ovr110 descrito en el presente documento,
determinando el nivel de Ovr110 unido al anticuerpo y comparando el
nivel con un control, en el que un nivel elevado de Ovr110 en el
suero del paciente en comparación con un control es indicativo de
sobreexpresión de Ovr110 por las células del paciente. El sujeto
puede tener un cáncer tal como cáncer de cabeza y cuello, por
ejemplo, carcinoma adenoide quístico.
En la actualidad, dependiendo del estadio del
cáncer, el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello implica una o
una combinación de las siguientes terapias: cirugía para extirpar el
tejido canceroso, radioterapia, deprivación de andrógenos (por
ejemplo, terapia hormonal) y quimioterapia. La terapia con
anticuerpos anti-Ovr110 puede ser especialmente
deseable en pacientes ancianos que no toleran bien la toxicidad y
los efectos secundarios de la quimioterapia, en enfermedad
metastásica en la que la radioterapia tiene utilidad limitada y para
el manejo del carcinoma prostático que es resistente al tratamiento
de deprivación de andrógenos. La selección como diana del tumor y
la internalización de los anticuerpos anti-Ovr110
descritos en el presente documento son útiles para aliviar cánceres
que expresan Ovr110, por ejemplo, cánceres de cabeza y cuello tras
el diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recidiva. Para
aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-Ovr110
puede usarse solo, o en terapia de combinación con, por ejemplo,
hormonas, agentes antiangiógenicos o compuestos radiomarcados, o
con cirugía, crioterapia y/o radioterapia, notablemente para
cánceres de cabeza y cuello, también particularmente cuando no
pueden alcanzarse células diseminadas. El tratamiento con
anticuerpos anti-Ovr110 puede administrarse junto
con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente
con, antes o después de la terapia convencional. En el presente
método de la descripción para tratar o aliviar el cáncer de cabeza
y cuello, puede administrarse al paciente con cáncer anticuerpo
anti-Ovr110 junto con tratamiento con
Taxotere®(docetaxel), Taxol®(paclitaxel), estramustina y
mitoxantrona. En particular, se contempla la terapia de combinación
con paclitaxel y derivados modificados (véase, por ejemplo, el
documento EP0600517). El anticuerpo anti-Ovr110 se
administrará con una dosis terapéuticamente eficaz del agente
quimioterápico. También puede administrarse el anticuerpo
anti-Ovr110 junto con quimioterapia para mejorar la
actividad y eficacia del agente quimioterápico, por ejemplo,
paclitaxel. El vademécum de especialidades farmacéuticas
estadounidense (PDR, "Physicians' Desk Reference") da a
conocer dosificaciones de estos agentes que se han usado en el
tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosificación y las
dosificaciones de estos fármacos quimioterápicos anteriormente
mencionados que son terapéuticamente eficaces dependerán del cáncer
particular que está tratándose, el grado de la enfermedad y otros
factores familiares para el médico experto en la técnica y que el
médico puede determinar.
Particularmente, puede administrarse al paciente
un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo
anti-Ovr110 conjugado con un agente citotóxico.
Preferiblemente, el inmunoconjugado unido a la proteína Ovr110 se
internaliza por la célula, dando como resultado un aumento de la
eficacia terapéutica del inmunoconjugado en la destrucción de
células cancerosa a la que se une. Preferiblemente, el agente
citotóxico selecciona como diana o interfiere con el ácido nucleico
en la célula cancerosa. Anteriormente se describieron ejemplos de
tales agentes citotóxicos e incluyen maitansina, maitansinoides,
saporina, gelonina, ricina, caliqueamicina, ribonucleasas y
endonucleasas de ADN.
Los anticuerpos anti-Ovr110 o
inmunoconjugados se administran a un paciente humano, según métodos
conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como
un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de
tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal,
subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica
o de inhalación. Los anticuerpos o inmunoconjugados pueden
inyectarse directamente en la masa tumoral. Se prefiere la
administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo. Pueden
combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración del
anticuerpo anti-Ovr110.
La administración combinada incluye la
coadministración, usando formulaciones separadas o una única
formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en
cualquier orden, en la que preferiblemente hay un periodo de tiempo
mientras el cual ambos (o todos) principios activos ejercen de
manera simultánea sus actividades biológicas. Preferiblemente, tal
terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico
sinérgico.
También puede ser deseable combinar la
administración del anticuerpo o de los anticuerpos
anti-Ovr110 con la administración de un anticuerpo
dirigido contra otro antígeno tumoral asociado con el cáncer
particular. Como tal, la descripción también se refiere a un
"cóctel" de anticuerpos que comprende uno o más anticuerpos
descritos en el presente documento y al menos otro anticuerpo que se
une a otro antígeno tumoral asociado con las células tumorales que
expresan Ovr110. El cóctel también puede comprender anticuerpos que
se dirigen a otros epítopos de Ovr110. Preferiblemente, los otros
anticuerpos que no interfieren con la unión y/o internalización de
los anticuerpos descritos en el presente documento.
El método de tratamiento terapéutico con
anticuerpos de la descripción puede implicar la administración
combinada de un anticuerpo (o anticuerpos)
anti-Ovr110 y uno o más agentes quimioterápicos o
agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministración
de cócteles de diferentes agentes quimioterápicos. Los agentes
quimioterápicos incluyen, por ejemplo, fosfato de estramustina,
prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo,
melfalán, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales
como paclitaxel o docetaxel) y/o antibióticos antraciclinas. Los
programas de dosificación y preparación para tales agentes
quimioterápicos pueden usarse según las instrucciones del
fabricante o tal como determine empíricamente el experto. Los
programas de dosificación y preparación para tal quimioterapia se
describen también en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams
y Wilkins, Baltimore, MD (1992).
El anticuerpo puede combinarse con un compuesto
antihormonal; por ejemplo, un compuesto antiestrógeno tal como
tamoxifeno; una antiprogesterona tal como onapristona (véase, el
documento EP 616 812); o un antiandrógeno tal como flutamida, en
las dosificaciones conocidas para tales moléculas. Cuando el cáncer
que va a tratarse es cáncer
andrógeno-independiente, el paciente puede haberse
sometido anteriormente a una terapia anti-andrógenos
y, después de que el cáncer se vuelva
andrógeno-independiente, puede administrarse al
paciente el anticuerpo anti-Ovr110 (y opcionalmente
otros agentes tal como se describe en el presente documento).
Algunas veces puede ser beneficioso
coadministrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la
disfunción del miocardio asociada con la terapia) o una o más
citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos
anteriores, el paciente puede someterse a eliminación quirúrgica de
las células cancerosas y/o radioterapia, antes, simultáneamente con
o después de la terapia con anticuerpos. Dosificaciones adecuadas
para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son las
usadas en la actualidad y pueden disminuirse debido a la acción
combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo
anti-Ovr110.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, el médico elegirá la dosificación y el modo de
administración según criterios conocidos. La dosificación apropiada
del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse,
tal como se definió anteriormente, la gravedad y el curso de la
enfermedad, ya se administre el anticuerpo para fines de prevención
o terapéuticos, las terapias anteriores, la historia clínica del
paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico
encargado. El anticuerpo se administra al paciente de manera
adecuada de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Preferiblemente, el anticuerpo se administra mediante infusión
intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo
y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a
aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo,
aproximadamente 0,1 - 15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una
dosificación candidata inicial para la administración al paciente,
ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas,
o mediante infusión continua. Un régimen de dosificación puede
comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente
4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de
aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-Ovr110.
Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una
dosificación diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1
pg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados
anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días
o más largas, dependiendo del estado, el tratamiento es sostenido
hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la
enfermedad. El progreso de esta terapia puede monitorizarse
fácilmente mediante métodos y ensayos convencionales y basados en
criterios conocidos por el médico u otras personas expertas en la
técnica.
Además de la administración de la proteína de
anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la
administración del anticuerpo mediante terapia génica. Tal
administración de una molécula de ácido nucleico que codifica para
el anticuerpo está abarcada por la expresión "administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo". Véase, por
ejemplo, el documento WO 96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996
acerca del uso de la terapia génica para generar anticuerpos
intracelulares.
Existen dos enfoques principales para introducir
la molécula de ácido nucleico (opcionalmente contenida en un
vector) en las células del paciente; in vivo y ex
vivo. Para la administración in vivo, se inyecta la
molécula de ácido nucleico directamente en el paciente,
habitualmente en el sitio en el que se requiere el anticuerpo. Para
el tratamiento ex vivo, se extraen células del paciente, se
introduce la molécula de ácido nucleico en estas células aisladas y
se administran las células modificadas al paciente o bien
directamente o bien, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas
porosas que se implantan en el paciente (véanse, por ejemplo, las
patentes estadounidenses n.^{os} 4.892.538 y 5.282.187). Existe
una variedad de técnicas disponibles para introducir las moléculas
de ácido nucleico en células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si se transfiere el ácido nucleico en células
cultivadas in vitro, o in vivo en las células del
huésped previsto. Las técnicas adecuadas para la transferencia del
ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el
uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular,
DEAE-dextrano, el método de precipitación con
fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente usado para la
administración ex vivo del gen es un vector retroviral.
Las técnicas para transferir moléculas de ácido
nucleico in vivo preferidas en la actualidad incluyen la
transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del
herpes simple I o virus adeno-asociados) y sistemas
a base de lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por
lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por
ejemplo). Para una revisión de los protocolos de marcaje de genes y
terapia génica conocidos en la actualidad véase Anderson et
al., Science 256:808-813 (1992). También véase
el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo.
La invención también describe un artículo de
fabricación que contiene materiales útiles para la detección de
células que sobreexpresan Ovr110 y/o el tratamiento de cáncer que
expresa Ovr110, concretamente cáncer de cabeza y cuello. El
artículo de fabricación comprende un recipiente y una composición
contenida en el mismo que comprende un anticuerpo descrito en el
presente documento. La composición puede comprender además un
vehículo. El artículo de fabricación puede comprender también una
etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los
recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales,
jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una
variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente
contiene una composición que es eficaz para detectar células que
expresan Ovr110 y/o tratar un estado de cáncer y puede tener un
orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una
bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón que
puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos
un principio activo en la composición es un anticuerpo
anti-Ovr110 descrito en el presente documento. La
etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para detectar
células que expresan Ovr110 y/o para tratar el cáncer de cabeza y
cuello, o más específicamente carcinoma adenoide quístico de cabeza
y cuello en un paciente que lo necesita. La etiqueta o prospecto
pueden comprender además instrucciones para administrar la
composición del anticuerpo a un paciente con cáncer.
Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además
un segundo recipiente que comprende una sustancia que detecta el
anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, un
segundo anticuerpo que se une a los anticuerpos descritos en el
presente documento. La sustancia puede marcarse con un marcador
detectable tal como se da a conocer en el presente documento. El
segundo recipiente puede contener, por ejemplo, un tampón
farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacterioestática para
inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución
de Ringer y disolución de dextrosa. El artículo de fabricación
puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de
vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones,
diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
También se describen kits que son útiles para
diversos fines, por ejemplo, para ensayos de destrucción de células
con Ovr110, para la purificación o inmunoprecipitación de Ovr110 a
partir de células o para detectar la presencia de Ovr110 en una
muestra de suero o detectar la presencia de células que expresan
Ovr110 en una muestra de células. Para el aislamiento y la
purificación de Ovr110, el kit puede contener un anticuerpo
anti-Ovr110 acoplado a un soporte sólido, por
ejemplo, una placa de cultivo de tejidos o perlas (por ejemplo,
perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen los
anticuerpos para la detección y cuantificación de Ovr110 in
vitro, por ejemplo, en un ELISA o una inmunotransferencia de
tipo Western. Al igual que con el artículo de fabricación, el kit
comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo que
comprende un anticuerpo descrito en el presente documento. El kit
puede comprender además una etiqueta o un prospecto en o asociado
con el recipiente. Los kits pueden comprender componentes
adicionales, por ejemplo, diluyentes y tampones, sustancias que se
unen a los anticuerpos descritos en el presente documento, por
ejemplo, un segundo anticuerpo que puede comprender un marcador tal
como los dados a conocer en el presente documento, por ejemplo, un
radiomarcador, un marcador fluorescente o una enzima, o el kit puede
comprender también anticuerpos de control. Los componentes
adicionales pueden estar dentro de recipientes separados dentro del
kit. La etiqueta o prospecto puede proporcionar una descripción de
la composición así como instrucciones para el uso previsto in
vitro o de diagnóstico.
A continuación se describen los siguientes
AcM/hibridomas de la presente descripción:
Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1,
Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (identificado anteriormente
como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89,
Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1,
Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3,
Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6; Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16,
Ovr110. I17, Ovr110. I18, Ovr110. I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3. Si se ha clonado el AcM, obtendrá la nomenclatura "X.1," por ejemplo, el primer clon de A7 se denominará A7.1, el segundo clon de A7 se denominará A7.2, etc. Para los fines de esta descripción, una referencia a A7 incluirá todos los clones, por ejemplo, A7.1, A7.2, etc.
Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3,
Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6; Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16,
Ovr110. I17, Ovr110. I18, Ovr110. I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2 y Ovr110.J3. Si se ha clonado el AcM, obtendrá la nomenclatura "X.1," por ejemplo, el primer clon de A7 se denominará A7.1, el segundo clon de A7 se denominará A7.2, etc. Para los fines de esta descripción, una referencia a A7 incluirá todos los clones, por ejemplo, A7.1, A7.2, etc.
Anteriormente se han descrito estos anticuerpos
monoclonales (incluyendo propiedades físicas, funcionales y
bioquímicas) y los hibridomas que producen estos anticuerpos en los
documentos PCT/US2004/014490 y PCT/US2005/
040707.
040707.
Se evaluaron muestras de carcinoma adenoide
quístico (CAQ) de cabeza y cuello de diversas ubicaciones tumorales
para determinar la expresión de Ovr110 por inmunohistoquímica
(IHC).
Se recuperaron bloques de tejido incluido en
parafina, fijado con formalina de tejidos normales o cancerosos de
las colecciones de patología quirúrgica del Centro de Ciencias de la
Salud de la Universidad de Colorado (UCHSC). Se hicieron secciones
de los tejidos a 5 \mum, se montaron sobre portaobjetos de vidrio
cargado (Superfrost Plus; Fischer Scientific, Pittusburgh, PA) y se
secaron en estufa a 60ºC durante la noche. A la desparafinización
con xileno y la rehidratación a través de una serie de alcoholes
graduados le siguió el bloqueo de la actividad peroxidasa endógena
con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos. Se realizó la
recuperación de antígenos en un dispositivo Decloaking Chamber
(Biocare Medical, Walnut Creek, CA) calentando los portaobjetos en
tampón citrato (10-10 mmol/l, pH 6,0) a 120ºC
durante 10 minutos. Se realizó la tinción inmunohistoquímica para
Ovr110 usando anticuerpo monoclonal de ratón Ovr110.A57.1 (número de
depósito de ATCC PTA-5180) a una concentración de
trabajo final de 0,4 \mug/ml.
Se realizaron controles negativos para los
anticuerpos de ratón en todas las secciones usando una concentración
equivalente de una IgG1 K de subclase emparejada (Becton Dickson
PharMingen), que se generó contra antígenos no relacionados. Se
visualizó la expresión de antígenos mediante revelado con
3,3'-diaminobencidina (DakoCytomation) y se
contratiñeron las secciones con hematoxilina, se deshidrataron en
alcoholes graduados y finalmente se cubrieron con cubreobjetos.
Todos los portaobjetos fueron revisados por la
Junta de Patólogos Anatómicos y Clínicos Certificados en el UCHSC.
Se graduó la intensidad de la tinción de Ovr1110 de las células
tumorales en una escala de 1 a 4+ en la que la tinción 1+ reflejó
resultados apenas perceptibles y la tinción 4+ correspondió a
niveles equivalentes a los observados en una sección control
positivo fuerte caracterizada anteriormente (carcinoma seroso de
ovario). Se evaluó el porcentaje de células tumorales que se tiñeron
para Ovr110 revisando la sección histológica completa de cada caso
(>0-100%).
Se evaluaron para Ovr110 veintitrés bloques de
tejido incluido en parafina, fijado con formalina de archivo de
carcinoma adenoide quístico (CAQ) de cabeza y cuello tal como se
describió anteriormente. Se observó expresión de Ovr110 detectable
en 23/23 (100%) muestras de carcinomas adenoides quísticos invasivos
y se detectó tinción de Ovr110 en la superficie celular y
citoplásmica intensa (de 3+ a 4+) en >90% de las células
tumorales en 20/23 muestras. Véase la tabla 1 a continuación. La
tinción de Ovr110 claramente delineó la extensión del tumor,
incluyendo focos de invasión perineural. Véanse las figuras 1B y 1C.
Las secciones control negativo no mostraron pruebas de tinción no
específica y la preincubación del anticuerpo Ovr110.A57.1 con la
proteína Ovr110 recombinante de longitud completa bloqueó
completamente la tinción en secciones histológicas (figura 1A).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que Ovr110 se
expresa altamente en carcinoma adenoide quístico (CAQ).
Anteriormente se ha mostrado que Ovr110 se expresa en bajos niveles
en tejidos normales y no cancerosos. Véanse los documentos
PCT/US2004/014490 y PCT/US2005/040707. Por tanto, el bloqueo o la
inhibición de la sobreexpresión de Ovr110 ó de la actividad de
Ovr110 (incluyendo la unión a un receptor) es útil para destruir
células cancerosas, evitar el crecimiento de células cancerosas,
evitar el crecimiento/metástasis de tumores y reducir los tumores.
Los compuestos anti-Ovr110 tales como los
anticuerpos descritos anteriormente se unen a células cancerosas
que sobreexpresan Ovr110 e inhiben la función de Ovr110 dando como
resultado beneficios terapéuticos frente a células y tumores
cancerosos.
Se evaluaron muestras tumorales de diversos
tejidos mediante inmunohistoquímica (IHC) para determinar la
expresión de Ovr110 y la infiltración de linfocitos de células T
asociados a tumores. Se evaluó la infiltración de linfocitos de
células T tiñendo para CD3, CD8 y/o CD69. La tinción de CD3 positiva
indica la presencia de linfocitos de células T periféricos y la
tinción de CD8 positiva indica la presencia de linfocitos de células
T supresores/citotóxicos que promueven la respuesta inmunitaria
frente a tumores. El antígeno CD69 no se expresa en linfocitos de
sangre periférica en reposo pero está entre los antígenos más
tempranos en aparecer tras la activación de los linfocitos. La
tinción de CD69 positiva indica la presencia de linfocitos de
células T supresores/citotóxicos activados.
Se recuperaron bloques de tejido incluido en
parafina, fijado con formalina de tejidos normales y cancerosos de
las colecciones de patología quirúrgica del Centro de Ciencias de la
Salud de la Universidad de Colorado (UCHSC) para la evaluación
inmunohistoquímica. Se hicieron secciones de los tejidos a 5 \mum,
se montaron sobre portaobjetos de vidrio cargado (Superfrost Plus;
Fischer Scientific, Pittsburg, PA) y se secaron en estufa durante
la noche a 60ºC. A la desparafinización con xileno y la
rehidratación a través de una serie de alcoholes graduados le
siguió el bloqueo de la actividad peroxidasa endógena con peróxido
de hidrógeno al 3,0% durante 15 minutos. Se realizó la recuperación
de antígenos en un dispositivo Decloaking Chamber (Biocare Medical,
Walnut Creek, CA) calentando los portaobjetos en tampón citrato
(10-20 mmol/, pH 6,0) a 120ºC durante 10 minutos.
Se realizó la tinción inmunohistoquímica para Ovr110 usando
anticuerpo monoclonal de ratón Ovr110.A57.1 (número de depósito de
ATCC PTA-5180) a una concentración de trabajo final
de 0,4 \mug/ml. Se realizó la tinción inmunohistoquímica para CD3
y CD8 usando anticuerpos DakoCytomation, CD3 (policlonal de conejo,
n.º de ref. A0452) y CD8 (monoclonal de ratón, n.º de ref. M7103) a
concentraciones de trabajo finales respectivas de 2 \mug/ml y
0,25 \mug/ml. Se realizó la tinción inmunohistoquímica para CD69
usando anticuerpo monoclonal de ratón CD69 Ab-1
(n.º de cat. MS-1478) de Lab Vision Corporation
(Fremont, CA) a una dilución de 1:20 a partir de las disoluciones
madre de fabricación. Se realizó la tinción inmunohistoquímica para
la caspasa 3 escindida usando anticuerpo policlonal de conejo
Asp175 (Cell Signaling Inc., Danvers, MA) a una concentración de
trabajo final de 0,6 \mug/ml. Se realizó la tinción de tejido para
Ovr110, CD3 y caspasa 3 escindida en un dispositivo Autostainer
(DakoCytomation, Carpentaria, CA) mediante un método de
inmunperoxidasa indirecto a base de avidina-biotina
(Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se realizó la tinción de CD8
en el dispositivo Autostainer usando el sistema de detección de
inmunoperoxidasa Envision (DakoCytomation)
Se realizaron en todas las secciones controles
negativos para los anticuerpos de ratón usando una concentración
equivalente de una IgG1 K de subclase emparejada (Becton Dickson
PharMingen), que se generó contra antígenos no relacionados. Se
realizaron controles negativos para los anticuerpos de conejo usando
una concentración equivalente de inmunoglobulina policlonal de
conejo (DakoCytomation). Se visualizó la expresión de antígenos
mediante revelado con 3,3'-diaminobencidina
(DakoCytomation) y se contratiñeron las secciones con hematoxilina,
se deshidrataron en alcoholes graduados y finalmente se cubrieron
con cubreobjetos.
Todos los portaobjetos fueron revisados por la
Junta de Patólogos Anatómicos y Clínicos Certificados en el UCHSC.
Se graduó la intensidad de la tinción de Ovr110 de las células
tumorales en una escala de 1+ a 4+ en la que la tinción 1+ reflejó
resultados positivos apenas perceptibles y la tinción 4+
correspondió a niveles equivalentes a los observados en una sección
control positivo fuerte caracterizada anteriormente (carcinoma
seroso de ovario). Se evaluó el porcentaje de células tumorales que
se tiñeron para Ovr110 revisando la sección histológica completa de
cada caso (>0-100%).
Se evaluaron las puntuaciones de CD3, CD8 y CD69
basándose en la tinción de linfocitos infiltrantes y peritumorales
como negativas, 1+, 2+ ó 3+, correspondiendo respectivamente con la
detección de <1, 1-20, 20-100 y
más de 100 linfocitos teñidos por campo microscópico de 200x, tal
como se promedió a lo largo de toda la sección ocupada con tumor.
Se correlacionaron las puntuaciones de CD3, CD8 y CD69 con los
resultados de la localización inmunohistoquímica de Ovr110, el
número de células positivas para Ovr110 y/o la intensidad de tinción
de Ovr110 mediante la comparación de los resultados de secciones en
serie emparajedas de cada caso.
Se calculó el índice de apoptosis (I.A.) a
partir de los resultados de la tinción de caspasa-3
escindida. El I.A. es la proporción de células positivas de
caspasa-3 escindida dentro de las células
tumorales.
Se evaluaron veintitrés bloques de tejido
incluido en parafina, fijado con formalina de archivo de carcinoma
adenoide quístico (CAQ) de cabeza y cuello para determinar la
expresión de Ovr110, CD3 y CD8 tal como se describió
anteriormente.
Tal como se notificó anteriormente, se observó
expresión de Ovr110 en 23/23 (100%) de las muestras de carcinomas
adenoides quísticos invasivos y se detectó tinción de Ovr110 en la
superficie celular y citoplásmica intensa (de 3+ a 4+) en >90% de
la células tumorales en 20/23 muestras.
Las tinciones inmunohistoquímicas para CD3 y CD8
detectaron tanto linfocitos peritumorales como infiltrantes de
tumor. Las puntuaciones de linfocitos positivos para CD3 oscilaron
desde 0 hasta 3+ (intervalo de 0 a 3+, media 0,95, desviación
estándar 1,17), que corresponden a de cero a más de 100
linfocitos/campo microscópico de 200x. Véase la figura 2B. En
general, los tumores mostraron puntuaciones de CD8 inferiores
(intervalo de 0 a 3+, media 0,39, desviación estándar 0,72). Véase
la figura 3B. A continuación la tabla 2 resume los resultados de la
tinción IHC.
La comparación de las tinciones histoquímicas en
secciones en serie emparejadas reveló una correlación inversa entre
la intensidad y el porcentaje positivo de células tumorales que
expresan Ovr110 y células T asociadas a tumor. Los tumores con
niveles superiores de expresión de Ovr110 (16/20) demostraron menos
(de 0 a 1+) linfocitos CD3. De manera similar, 19/20 casos de CAQ
con puntuaciones de Ovr110 superiores tuvieron menos células T CD8
positivas. Por el contrario, 2/3 muestras de CAQ con porcentajes
inferiores de células positivas para Ovr110 tenían puntuaciones de
linfocitos CD3 y CD8 aumentadas.
Se ha demostrado que Ovr110 se expresa altamente
en tumores y que la expresión de Ovr110 está inversamente
relacionada con la prevalencia de los linfocitos positivos para CD3,
CD8 y CD69 asociados a tumor. Esto indica que Ovr110 protege a las
células tumorales de la vigilancia inmunitaria mediada por células
T, limita la infiltración al tumor por células T y evita la
apoptosis en células tumorales. La capacidad para evadir la
vigilancia inmunitaria es un factor de virulencia clave para los
tumores que ayuda en el crecimiento, la infiltración y la
metástasis. Adicionalmente, la falta de células apoptóticas, el
aumento de la proliferación y las propiedades invasivas de las
células examinadas mediante IHC demuestra que la sobreexpresión de
Ovr110 por las células aumenta la carcinogenicidad de las células
epiteliales.
Por tanto, el bloqueo o la inhibición de la
sobreexpresión de Ovr110 o la actividad de Ovr110 (incluyendo la
unión a un receptor) es útil para destruir células cancerosas,
evitar el crecimiento de células cancerosas, evitar el
crecimiento/metástasis de tumores y reducir los tumores. Los
compuestos anti-Ovr110 tales como los anticuerpos
descritos anteriormente se unen a las células cancerosas que
sobreexpresan Ovr110, inhiben la función de Ovr110 y/o evitan la
inhibición de la activación e infiltración de células T en los
tumores, dando como resultado una respuesta inmunitaria contra las
células tumorales.
Se depositaron las siguientes líneas celulares
de hibridoma con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC),
ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EE. UU., y se otorgaron números de
registro. Los nombres de las líneas celulares de hibridomas
depositadas pueden acortarse por comodidad de referencia. Por
ejemplo, A57.1 corresponde a Ovr110.A57.1. Estos hibridomas
corresponden a los clones (con sus nombres completos) enumerados en
la tabla 3.
Se hicieron estos depósitos bajo las
disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
procedimiento en materia de patentes y las regulaciones en el mismo
(Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos
viables durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los
organismos se pondrán a disposición por la ATCC bajo los términos
del Tratado de Budapest, y sujetos a un acuerdo entre diaDexus,
Inc. y la ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin
restricciones de la progenie de los cultivos al público tras la
concesión de la patente estadounidense pertinente o tras poner a
disposición del público cualquier solicitud de patente
estadounidense o extranjera, la que venga primero, y garantiza la
disponibilidad de la progenie a quien el comisario de patentes y
marcas comerciales de los EE.UU. determine que tiene derecho según
la ley 35 USC \NAK 122 y las reglas del comisario en virtud de la
misma (incluyendo 3 7 CFR \NAK1.14 haciendo referencia particular
a 886 OG 638).
El cesionario de la presente aplicación ha
acordado que si los cultivos en depósito mueren o se pierden o se
destruyen cuando se cultivan en condiciones adecuadas, serán
inmediatamente reemplazados al notificarlo por un espécimen viable
del mismo cultivo. La disponibilidad de las cepas depositadas no
debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la
invención en contravención de los derechos otorgados bajo la
autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes. La
realización de estos depósitos no es en absoluto una admisión de
que se requieren los depósitos para facilitar la invención.
Claims (29)
1. Método para detectar cáncer de cabeza y
cuello en un sujeto, comprendiendo el método,
- (a)
- combinar una muestra de líquido corporal de un sujeto con un anticuerpo anti-Ovr110 en condiciones adecuadas para la unión específica del anticuerpo anti-Ovr110 con Ovr110 en dicha muestra,
- (b)
- determinar el nivel de Ovr110 en dicha muestra,
- (c)
- comparar el nivel de Ovr110 determinado en la etapa (b) con el nivel de Ovr110 en un control,
en el que un aumento en el nivel de Ovr110 en la
muestra del sujeto en comparación con el control es indicativo de
la presencia de cáncer de cabeza y cuello en el sujeto.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el control es una muestra de un sujeto sin cáncer de cabeza y
cuello.
3. Método in vitro de destrucción de una
célula de cáncer de cabeza y cuello, comprendiendo el método poner
en contacto la célula cancerosa con un anticuerpo
anti-Ovr110 aislado, destruyendo de ese modo la
célula cancerosa.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
la célula cancerosa es de cáncer de cabeza y cuello metastásico.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 o 4, en el que el anticuerpo se conjuga con un
agente citotóxico.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
el agente citotóxico se selecciona de toxinas, antibióticos,
isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el agente citotóxico es una toxina seleccionada de maitansinoide,
ricina, saporina y caliqueamicina.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo
humanizado.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
el anticuerpo es una forma humanizada del anticuerpo producido
mediante un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en los
números de registro de la ATCC PTA-5180,
PTA-5855, PTA-5856,
PTA-5884, PTA-6266,
PTA-7128 y PTA-7129.
10. Método según la reivindicación 10, en el que
el cáncer de cabeza y cuello es carcinoma adenoide quístico.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
la localización del carcinoma adenoide quístico se selecciona de la
lengua, la glándula parótida, la nariz, el paladar, la piel, el
cuello, la glándula submandibular, la glotis, los senos, la
epiglotis, el espacio bucal, los nervios, la laringe, la boca, la
faringe y la mejilla.
12. Anticuerpo anti-Ovr110 para
su uso para aliviar el cáncer de cabeza y cuello.
13. Uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 aislado en la fabricación de un
medicamento para aliviar el cáncer de cabeza y cuello.
14. Uso según la reivindicación 12 ó 13, en el
que el anticuerpo anti-Ovr110 destruye las células
cancerosas del cáncer de cabeza y cuello.
15. Uso según la reivindicación 13, en el que
las células cancerosas son de cáncer de cabeza y cuello
metastásico.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 15, en el que el cáncer de cabeza y cuello es carcinoma
adenoide quístico.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 16, en el que el anticuerpo se conjuga con un agente
citotóxico.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que el
agente citotóxico se selecciona de toxinas, antibióticos, isótopos
radiactivos y enzimas nucleolíticas.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que el
agente citotóxico es una toxina seleccionada de maitansinoide,
ricina, saporina y caliqueamicina.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 19, en el que el medicamento se formula para su administración
junto con al menos un agente quimioterápico.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que el
agente quimioterápico es paclitaxel o derivados del mismo.
22. Anticuerpo anti-Ovr110 para
su uso para tratar cáncer de cabeza y cuello mediante la modulación
de una respuesta inmunitaria que comprende la unión a Ovr110,
reduciendo de ese modo una función inmunitaria suprimida.
23. Uso de un anticuerpo
anti-Ovr110 en la fabricación de un medicamento para
tratar cáncer de cabeza y cuello mediante la modulación de una
respuesta inmunitaria que comprende la unión a Ovr110, reduciendo de
ese modo una función inmunitaria suprimida.
24. Uso según la reivindicación 22 o 23, en el
que la modulación es un aumento de la respuesta inmunitaria.
25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
22 a 24, en el que la modulación es una reducción de la supresión de
una respuesta inmunitaria.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
22 a 25, en el que la respuesta inmunitaria se dirige a una
célula.
27. Uso según la reivindicación 26, en el que la
célula es una célula cancerosa.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
22 a 27, en el que la respuesta inmunitaria es un aumento de los
números de linfocitos que rodean un tumor, aumento de la
infiltración de linfocitos en un tumor o aumento de la activación de
linfocitos.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
22 a 28, en el que la función inmunitaria es destruir una célula de
cáncer de cabeza y cuello.
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