KR20030013480A - 경구 백신화를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물에서 질병에 대한 보호를 제공하고 동물에 의한 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명의 방법은 세균 또는 바이러스 병원체를 수용성 기호성 풍미제와 혼합하고, 항원와 풍미제 혼합물을 동물에게 백신을 경구 투여하기 위한 수용성 비히클과 추가로 혼합하여 혼합된 항원에 의한 감염과 관련되는 질병에 대한 보호를 제공하고 풍미제로 백신의 증가된 섭취를 유도하는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 질병의 예방에 있어 보조제로서의 음용수 또는 시럽을 통해 건강한 동물을 경구 백신화하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 기호성 풍미제와의 혼합은 백신 제제에 백신 제제의 자가 투여를 촉진하고/하거나 동물 사육사가 투여할 경우 당해 제제의 거부를 예방하기 위한 바람직한 풍미를 제공한다.

Description

경구 백신화를 위한 방법 및 조성물{Methods and composition for oral vaccination}
동물 개체군에 악영향을 미칠 수 있으며 약화 및 사망을 유발하는 다수의 전염병이 있다. 감염된 동물에서 질병의 증상을 호전 또는 제거하기 위해 이러한 전염병에 대한 성공적 백신화가 이전부터 수행되어 왔다. 경구 투여되는 백신화는 주사에 대한 필요성을 덜어주기 때문에 바람직한 방법이다.
돼지, 가금, 소, 양, 염소 및 말과 같은 큰 무리의 가축에서, 주사에 의한 백신화는 시간 소모적이며 노동집약적일 수 있다. 또한, 점막내 주사는 육류에 손상을 유발하고 동물에게 스트레스를 줄 수 있다.
개 및 고양이와 같은 가정용 애완동물에서 근육내 주사시의 스트레스는 통상의 감염에 대한 효과적 경구 백신을 사용함으로써 완화될 것이다.
돼지 및 가금 단위의 크기는 전세계적으로 상당히 성장하였다. 현재 다수의양돈 시설은 10,000마리 이상의 이유자돈을 수용할 수 있으며, 다수의 가금 단위는 현재 보다 많은 조류를 수용할 수 있다. 종래의 백신을 사용한 각 돼지 또는 조류의 백신화는 둘다 노동집약적이며 어렵다. 각 동물을 포획하고 1회 이상, 다수의 경우에는 2회 이상 주사해야 하며 백신화 과정 동안 지켜보아야 한다.
이러한 시도로 인해, 동물의 그룹에게 음용수를 통해 투여하여(대량 투여) 돼지 또는 가금을 감염으로부터 보호할 수 있는 효과적 백신은 노동 비용을 절약할뿐만 아니라 바늘에 의해 유발되는 육류에 대한 스트레스와 손상을 예방함으로써 생산자에게 큰 이익을 줄 수 있다.
또한, 일반적으로 축사에서 사육되고 흔히 서로 개별적으로 사육되거나 감금되는 소, 양, 염소 및 말의 생산자는 1회 주사의 비용, 스트레스 및 육류 손상을 경감시키기 위한 음용수를 통해 투여되는 경구 백신으로부터 이익을 얻을 수도 있다.
마지막으로, 개 및 고양이와 같은 가정용 애완동물은 스트레스를 감소시키고 주사를 피하기 위한 경구 백신의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다.
이전에는, 대규모 그룹의 조류에게 음용수를 통해 백신을 대량 투여하는 동안 경험하는 주된 불이익은 물 소비의 변동으로 인한 백신 투여량의 불일치 및 일부 동물은 백신을 전혀 투여받지 않을 수 있다는 가능성이었다. 또한, 백신중의 세균 또는 바이러스 병원체의 생존성 및 안정성은 물속에서 혼합시에 악영향을 받을 수 있다. 물중 안전성은 시간에 걸쳐서 급격하게 감소될 수 있다. 따라서, 면역원제의 불안정화를 예방하기 위해 제한된 시간내에 동물에게 대량 투여되는 백신을 제공하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 또한, 개체군 전반에 걸쳐 백신-함유 음용수의 일관된 자가 투여를 보장하기 위해 동물에게 바람직한 백신을 제공하는 것이 유리할 수 있다.
전염성 인자에 의해 유발되는 질병에 대한 백신의 경구 투여에 대한 또 다른 주요 단점은 이러한 인자가 흔히 불쾌한 냄새 또는 맛을 수반한다는 점이다. 대규모 그룹의 동물에게 대량 투여되는 백신 제제가 동물에게 바람직하며, 그렇지 않으면 이들 동물은 상기 백신 제제를 자가 투여, 즉 음용하지 않을 것이다. 동일한 방식으로, 가축 또는 개별적으로 사육되는 동물에게 투여되는 백신 제제는 동물이 백신 제제를 자가 투여하도록 동물의 기호에 맞는 것이 유리할 수 있다. 마지막으로, 가정용 애완동물에 관해서는, 이들 동물은 일반적으로 수의사 또는 동물 건강관리 요원에 의해 투여되며 흔히 동물이 거부하여 뱉어버리는 경구 백신을 구강내로 투여받는다. 따라서, 경구 투여되는 백신을 동물에게 바람직하고 성공적 투여 및 섭취 가능성을 증가시킬 수 있는 제제로서 제공하는 것이 매우 유리할 수 있다.
WO 98/51279에는 중합체 미립자내로 혼입된 항원성 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 경구 백신의 투여가 기재되어 있다. 풍미 증강제가 상기 미립자내로 혼입될 수 있다. 그러나, 이러한 미립자는 수용성이 아니며 질병을 유발하는 세균 또는 바이러스의 투여를 제공하지 않는다.
문헌[참조문헌: Bell, et al., Australian Veterinary Journal 68(3), 1991, pp. 85-89]에는 닭에게 대량 투여를 통한 뉴캐슬(Newcastle)병 V4 균주 백신의 투여가 기재되어 있다. 상기 백신은 다음의 세가지 방법을 사용하여 투여된다: (1)탈지유와 혼합하여 음용수로서 투여하는 방법, (2) 에어로졸로서 투여하는 방법 및 (3) 조립(粗粒) 스프레이로서 투여하는 방법. 뉴캐슬 바이러스에 대한 항체 생성의 혈청학적 증가는 입증된 반면에, 바이러스 시험감염(challenge) 연구는 수행되지 않았다. 따라서, 상기 조류에서 질병에 대한 백신화의 범위를 결정하는 것이 불가능하다. 보다 중요하게는, 조류의 기호에 맞는 백신 제제를 제조하려는 시도가 이루어지지 않았다.
그리브(Grieve)는 청색 염료를 뉴캐슬병 백신 제제에 첨가함으로써 음용수 또는 스프레이를 통한 닭에게의 백신 대량 투여에 대한 평가를 기술하고 있다. 상기 염료는 조류의 혀를 일시적으로 착색시킴으로써 조류에 의한 백신 소비를 모니터하기 위해 사용된다. 염료는 무리의 약 80%만이 백신을 소비하였음을 입증하였다. 백신 제제를 보다 조류의 기호에 맞는 백신 제제를 제조하려는 시도는 이루어지지 않았다.
따라서, 동물의 기호에 맞는 노동-절약형 경구 투여되는 백신을 제형화하고 투여하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 이러한 백신 제제는 수의사 및 우육류 생산자에게 가축 및 기타 동물 건강을 최적화하는 편리하고 신규한 전략 도구를 제공할 수 있으며, 동물이 거부하지 않는 보다 기호성이 높은 경구 백신은 수의 진료에서 바람직할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은
(a) 수용성 기호성 풍미제를 경구 투여되는 백신의 투여용 수용성 비히클과혼합하는 단계,
(b) 단계(a)의 혼합물을 경구 투여되는 백신의 활성 성분으로서의 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원과 추가로 혼합하는 단계 및
(c) 단계(b)의 경구 투여되는 백신을 동물에게 투여하여 당해 항원에 의한 감염과 관련되는 질병에 대한 보호를 제공하는 단계를 포함하여, 동물에서 질병에 대한 보호를 제공하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은
(a) 수용성 기호성 풍미제를 경구 투여되는 백신 투여용 수용성 비히클과 혼합하는 단계,
(b) 단계(a)의 혼합물을 경구 투여되는 백신의 활성 성분으로서의 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원과 추가로 혼합하는 단계,
(c) 단계(b)의 백신 혼합물을 동물에게 경구 투여하는 단계 및
(d) 풍미제로 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하는 단계를 포함하여, 동물에 의한 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하는 방법을 포함한다.
본 발명은 활성 성분으로서 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원, 수용성 기호성 풍미제 및 경구 투여되는 동물용 백신의 투여용 수용성 비히클을 포함하는, 경구 투여되는 동물용 백신 제제를 추가로 포함한다.
본 발명은 질병의 예방에 있어 보조제로서의 음용수 또는 시럽을 통해 건강한 동물을 경구 백신화하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
모든 특허, 특허 출원, 공보 및 본원에서 인용되는 기타 자료는 이의 전문이본원에서 참조로 인용된다. 불일치하는 경우에, 정의를 포함하는 본원의 기술은 조절하기 위함이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대량 투여"는 대규모 시설에서 함께 사육되는 동물 그룹에게 수용성 백신을 대규모로 투여하는 것으로 정의된다. 통상적으로 이러한 시설은 돼지 및 가금을 수용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돼지류(swine)", "돼지(pig)" 및 "돼지들(pigs)"은 동의어로서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가금"은 닭, 칠면조 및 오리를 포함하는 것으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "기호성 풍미제"는 투여되는 동물 또는 동물들이 요망하는 것으로 입증되는 풍미 증강제로서 정의된다. 이러한 요망은 본 발명의 경구 투여되는 백신으로 제형화하기 전에, 기호성 풍미제로 풍미를 가한 음용수 또는 시럽의 자가 투여의 관찰을 통해 결정한다. 이러한 풍미제의 비제한적 예로는 딸기, 체리, 포도, 수박 및 사과 등과 같은 과일 풍미; 생선 풍미; 고기 풍미 및 동물 또는 동물들이 선호하는 임의 기타 풍미제를 포함한다. 과일 풍미제는 돼지, 말, 양, 염소, 고양이 및 개에게 투여하기에 특히 바람직하다. 고기 풍미제는 개 및 고양이용으로 특히 바람직하다. 생선 풍미제는 고양이용으로 특히 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "동물 사육사(animal handler)"는 농장 노동자, 수의사, 동물 건강 전문가 또는 동물의 건강 및 의약, 백신 및/또는 사료를 동물에게 투여하는 것을 책임지고 있는 기타 사람을 포함한다.
본 발명은 동물에서 질병에 대한 보호를 제공하고 동물에 의한 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하는 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명의 방법은 세균 또는 바이러스 항원을 수용성 기호성 풍미제와 혼합하고, 당해 항원과 풍미제 혼합물을 동물에게 백신을 경구 투여하기 위한 수용성 비히클과 추가로 혼합하여 혼합된 항원에 의한 감염과 관련되는 질병에 대한 보호를 제공하고 풍미제로 백신의 증가된 섭취를 유도하는 것에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 질병의 예방에 있어 보조제로서의 음용수 또는 시럽을 통해 건강한 동물을 경구 백신화하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 기호성 풍미제의 혼합은 백신 제제의 자가 투여를 촉진하고/하거나 동물 사육사가 투여하는 경우 당해 제제의 거부를 예방하기 위한 바람직한 풍미를 백신 제제에 제공한다.
본 발명의 백신으로 제형화되는 항원은 세균성 및 바이러스성 질병을 유발하는 병원체이다. 생 세균 및 바이러스가 특히 바람직하다. 생 세균 또는 바이러스를 백신 제제중 항원으로서 투여하는 경우, 생 항원의 생존력이 특히 관건이다. 동물 또는 동물들은 최대의 가능한 항원성을 보장하고 강력한 면역 반응을 수득하기 위해 항원의 생존력이 크게 감소하기 전에 백신을 섭취해야 한다.
"비병원성" 또는 "불활성화" 세균 또는 바이러스 균주는 동물에서 질병을 유발할 수 없는 것으로 이해되며 당해 분야의 숙련가가 동물에게 백신으로서 투여하기에 안전하다고 고려할 수 있는 모든 균주를 포함한다. 예를 들어, 발열, 장액성 비강 분비물 또는 안구 분비물을 포함하는 소수의 임상징후를 유발하는 균주는, 이러한 임상징후가 허용되는 백신 부작용으로 고려되기 때문에 본 발명의 범주내에포함된다.
본 발명에서 사용하기 위한 세균 또는 바이러스 항원을 불활성화시키는 한가지 방법은 질병을 유발하는 항원의 능력을 제거하는, 세균 또는 바이러스 항원의 게놈내에 뉴클레오타이드 치환, 삽입 및/또는 결실과 같은 유전자 돌연변이를 도입하는 것이다. 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 세균 또는 바이러스 항원 게놈내에 결실, 삽입 및 치환을 조작함으로써 약독화된 균주를 제조할 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조문헌: Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 세균 또는 바이러스 항원을 약독화 또는 불활성화시키는 기타 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 생 바이러스" 또는 "변형된 생 세균"은, 통상적으로 조직 배양 세포에서 계대에 의해 변경되어 질병을 유발하는 이의 능력이 감쇠되었으나 동물에게 투여할 경우 질병 또는 감염으로부터 보호하는 능력은 유지하는 세균 또는 바이러스 항원이다.
본 발명의 바이러스 항원의 "감염 단위"는 TCID50또는 조직 배양 세포의 50%를 감염 또는 치사시키는데 필요한 바이러스의 양으로서 정의된다.
소정의 배양물중 세균 항원의 농도는 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 배양액의 현미경 분석, 콜로니 계수 또는 분광광도 분석에 의해 측정할 수있다.
세균 독성 항원의 농도는 적합한 동물 모델, 예를 들어, 마우스에서 치사량(LD) 및 LD50을 측정함으로써 수득할 수 있다.
백신은 당해 분야에 표준인 방법을 사용하여 새로이 수거된 바이러스 배양물로부터 제조할 수 있다. 바이러스의 증식은 표준 기술(세포병변 효과의 관찰, 면역형광법 또는 기타 항체계 검정법)에 의해 모니터링하고 충분히 높은 바이러스 역가가 달성되면 수거한다. 바이러스 스톡은 백신 제제내에 포함시키기 전에 통상의 방법으로 농축 또는 동결건조시킬 수 있다. 문헌[참조문헌: Thomas, et al., Agri-practice, V.7 No. 5, pp.26-30]에 기재되어 있는 방법과 같은 기타 방법을 사용할 수 있다.
세균은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 증식시킨다. 본 발명의 제제에서 사용될 세균 항원은 액체 형태이거나 사용에 앞서 기호성 풍미제 또는 수용성 비히클로 재구성되는 동결건조된 형태일 수 있다.
일반적으로, 단일 동물용 백신의 투여량중의 투여될 세균 항원의 바람직한 양은 약 105내지 약 1011콜로니 형성 단위(Colony Forming Units; "CFU"), 바람직하게는 약 106내지 약 1010CFU 및 가장 바람직하게는 약 107내지 약 109CUF이다. 다른 바람직한 양태에서, 유효량은 용량당 약 105내지 약 108CFU이다.
일반적으로, 단일 동물용 백신의 투여량중의 투여될 바이러스 항원의 바람직한 양은 약 103.0내지 약 106.0TCID50/㎖, 바람직하게는 104내지 105TCID50/㎖이다.
본 발명의 백신으로 제형화될 각 특정 세균 또는 바이러스 항원에 대한 투여량 또는 유효량은 일반적으로 백신화할 동물 또는 동물들의 연령, 건강 및 면역 상태(예: 이전의 노출, 모계의 항체) 뿐만 아니라, 사용될 특정 항원에 따라 좌우될 수 있다. 최소 항원 수준 및 물 또는 시럽 용량을 포함하는 투여될 적합한 유효량 계산은 당해 분야의 숙련가가 의해 통상적으로 측정할 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 모든 약독화 또는 불활성화된 살아있거나 죽은 감염성 세균 또는 바이러스 병원체를 본 발명의 백신으로 제형화할 수 있으며 본 발명의 방법에 따라서 투여할 수 있다. 특히 바람직한 항원의 비제한적 예는 다음 동물을 감염시키는 항원을 포함한다:
돼지 - 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix Rhusiopathiae), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuroneumonia), 미코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 이. 콜라이(E. coli) K88, K99, F41 및 987P, 클로스트리듐 퍼페링젠스(Clostridium perferingens) C형, 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls), 파스튜렐라 무이토시다(Pasterurella muitocida), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 렙토스피라 브라티시아바(Leptospira bratisiava), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그리포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 하르드조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 프로모나(Leptospira promona), 렙토스피라 이크테로(Leptospira ictero), 돼지 인플루엔자(Porcine Influenza) 바이러스, 써코바이러스(Circovirus), PRRS 바이러스, 돈두(Swine pox) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 돼지 호흡기 코로나바이러스(Porcine Respiratory Coronavirus), 파르보 바이러스(Parvo virus), 가성공수병(Pseudorabies) 바이러스, 전염성 위장염 병원체.
말 - 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 말 인플루엔자(Equine Influenza) 바이러스 A1 및 A2 균주, 말 리노뉴모니드(Equine Rhinopneumonid) 1형, 1b형 및 4형, 동부 말 뇌척수막염(Eastern Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 서부 말 뇌척수막염(Western Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염(Venezuelan Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 말 로타바이러스(Equine Rotavirus).
소 - 이. 콜라이 O157:H7, 파스튜렐라 무이토시다, 파스튜렐라 해몰리티카(Pasterurella haemolytica), 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그리포티포사, 레토스피라 하르드죠, 렙토스피라 프로모나, 렙토스피라 이크테로, 클로스트리디움 퍼페링젠스 C형, 클로스트리디움 퍼페링젠스 D형, 클로스트리디움 차우보엘(Clostridium chauvoel), 클로스트리디움 노빌(Clostridium novyl), 클로스트리디움 셉티쿰(Clostridium septicum), 클로스트리디움 테타누스, 클로스트리디움 해몰리티쿰(Clostridium haemolyticum), 클로스트리디움 소델리(Clostridium sodellii), 살모넬라 두블린(Salmonella dublin), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus), 소 코로나바이러스(Bovinecoronavirus), 소 비기관염(Bovine rhinotracheitis) 바이러스, 소 설사 바이러스, 파라인플루엔자(Parainfluenza)-3, 호흡기 합포체 바이러스.
가금 - 살모넬라 티피무리움, 세풀리나 필로시콜리(Sepullina pilosicoli), 마렉병(Marek disease) 바이러스, 전염성 낭병(Infectious bursal disease) 바이러스, 전염성 기관지염(Infectious bronchitis) 바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 레오(Reo) 바이러스, 칠면조 비기관염(Turkey rhinotracheltis) 바이러스, 코우이디오시스(couidiosis).
개 - 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그리포티포사, 렙토스피라 하르드조, 렙토스피라 프로모나, 렙토스피라 이크테로, 개 보렐리아 부르그도르페리(Canine Borrella burgdorferi), 개 에를리히아 카니스(Canine Ehrlichia canis), 개 보르데텔라 브론키셉티카(Canine Bordetella bronchiseptica), 개 람블편모충(Canine Giardia lamblia), 개 디스템퍼(Canine distemper) 바이러스, 개 아데노바이러스(Canine Adenovirus), 개 코로나바이러스(Canine Coronavirus), 개 파라인플루엔자(Canine Parainfluenza), 개 파르보바이러스(Canine Parvovirus), 개 공수병(Canine Rabies) 바이러스.
고양이 - 고양이 클라미디아 시타시(Feline Chlamydia psittaci), 고양이 면역결핍(Feline immunodeficiency) 바이러스, 고양이 감염성 복막염(Feline infectious peritonitis) 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 비기관염(Feline rhinotrachelitis) 바이러스, 고양이 디스템퍼(Canine distemper) 바이러스, 고양이 공수병(Feline rabies) 바이러스. 많은 경우에서 본 발명의 경구 투여되는 백신으로 제형화하기 위한 세균 및 바이러스 항원의 제조 및 생산은 동물들이 선호하지 않는 비기호성 풍미를 갖는 항원을 야기한다. 따라서, 백신을 음용수 또는 시럽으로서 경구 투여하는 경우, 동물은 다량의 백신 제제를 음용하지 않거나, 불쾌한 풍미로 인해 시럽을 거부하거나 뱉어 버린다. 기호성 풍미제의 본 발명의 백신 제제내로의 혼합은 경구 투여되는 백신의 섭취를 촉진 및 증가시킨다. 이러한 기호성 풍미제는 사용되는 풍미제에 의해 지시되는 농도에서 혼합한다. 바람직한 농도는 약 0.01% 이상 내지 1.0% 이상을 포함한다.
액체 풍미제는 점적기구 또는 기타 수단을 사용하여 백신 제제에 첨가할 수 있다. 풍미제가 분말 형태인 경우에는 이를 재수화시켜 백신 제제내로 혼합할 수 있다.
본 발명의 경구 백신을 돼지 또는 가금에게 투여하는 경우, 바람직한 투여방법은 함께 사육되는 대규모 그룹의 동물에게의 대량 투여를 통한 것이다. 백신은 연속적 공급 또는 적하를 통해 동물에게 공급된 다음 동물이 음용수에 접근하여 물속에 함유된 백신을 음용함으로써 백신을 자가투여하는 음용수로 제형화한다. 연속적 공급 또는 적하 기구의 한 예로는 도사트론TM(제조원: Dosatron International Inc., Clearwater, Fla.)으로 지칭되는 자동화 물 비례 장치가 있다. 바람직한 양태에서, 물 비례 장치는 소량의 수용성 백신/풍미제의 연속적 공급을 물 적가 공급기에 공급한 다음, 상기 물 적가 공급기는 예를 들어 니플을 통해 적가에 의한 사육 시설내로의 대량 투여를 통해 동물에게 물을 공급한다.
본 발병의 경구 백신을 소, 말, 양, 염소 또는 외양간, 마굿간 또는 축사에서 영구적으로 사육되거나 별도로 유지되는 기타 농장 동물에게 투여하는 경우, 바람직한 투여 방법은 음용수를 양동이 또는 구유를 통해 투여하는 것이다.
본 발명의 경구 백신을 동물 또는 가정용 애완동물(예: 고양이 또는 개)에게 단독으로 투여하는 경우, 당해 백신은 음용수로서 또는 보다 바람직하게는 시럽으로서 투여할 수 있다. 이러한 시럽은 바람직하게는 주사기와 같은 기구를 통해 구강내로 투여한다. 이러한 투여는 가장 바람직하게는 목구멍의 안쪽에서 이루어진다. 경구 백신은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 시럽으로 제형화할 수 있다. 시럽의 제형화 방법의 비제한적 예는 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다:
제조되는 백신 모액의 양은 각 동물이 백신화 기간 동안 음용할 수 있는 물의 양에 기초한다. 바람직한 백신화 기간은 음용수로서 투여할 경우에는 항원에 따라서 0.5시간 내지 10시간이다. 각 동물이 음용할 수 있는 물의 양은 백신화될 동물의 평균 체중에 따라서 산정한다. 자동화 물 비례 장치를 사용할 경우, 바람한 방법은 다음과 같다: 백신 모액을 물 공급원에 연결되어 있는 연결 호스를 통해 자동화 물 비례 장치에 첨가한다. 상기 물 비례 장치는 백신을 파이프라인으로 흐르는 물을 따라서, 음용수가 적가되는 니플 또는 니플들의 방향으로 펌핑한다.
본 발명의 경구 투여되는 백신을 제형화하기 위해, 동물에게 투여될 물의 양을 (체중에 기초하여) 측정한다. 백신화될 동물(들)의 총 중량은 백신화될 동물의 총 마리수에 동물의 평균 중량을 곱하여 계산함으로써 측정한다. 동물(들)의 중량에 필요한 물의 양을 측정하고 백신 제제를 필요한 물 및 백신 제제가 투여될 기간(time span)에 기초하여 계산한다. 본 발명의 백신을 제형화하고 돼지에게 투여하는데 사용되는 계산법 유형의 한가지 비제한적 예는 실시예 1 및 표 2에서 찾아볼 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명의 동물에게 투여될 평균 물의 양을 측정할 수 있다. (1) 가금에게 투여되는 평균 물의 양의 비제한적 예는 1000마리 조류당 약 2.5 내지 5갤런이다; (2) 방목소는 겨울에 최소한 물 2.5gal.(9.5ℓ)/머릿수/일을 소비하며 여름에는 물 12gal.(45ℓ)/머릿수/일을 소비한다; (3) 1년생 번식용 소 및 2년생 수송아지는 매일 물 약 10gal(38ℓ)을 소비한다; (4) 비육용 송아지는 매일 물 6 내지 8gal.(23 내지 30ℓ)을 음용하며 (5) 개 및 고양이와 같은 소형 동물은 1일당 물 약 250 내지 1500㎖를 요한다.
본 발명의 백신을 음용수로서 투여하기에 앞서, 백신화될 동물로부터 모든 음용수를 제거하여 당해 음용수의 섭취를 촉진하는 것이 바람직하다. 백신을 음용수로서 투여하기 하룻밤 전에 음용수를 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 경구 백신은 면역화될 동물에게 1회 투여량으로서 또는 2회 투여량으로서 투여할 수 있다. 본 발명의 바람직한 투여는 2회 투여량의 백신의 투여이다.
다음 실시예는 본 발명을 비제한적으로 설명하기 위함이다.
실시예 1
풍미를 가한 음용수를 통한 돼지에게 경구 백신의 대량 투여
면역원성은 연구는 총 30마리의 6주령 돼지를 사용하여 수행한다. 30마리의 돼지 중에서, 20마리는 백신처리군이고 10마리는 비백신화된 대조군이다. 모든 20마리의 백신화된 돼지를 자동화 물 비례 장치(제조원: Dosatron)를 사용하여 음용수를 통해 비병원성 생 배양물인 에리시펠로트릭스 루시오파시애 백신으로 대량 백신화시킨다. 2차 백신화는 1차 백신화한 후 2주째에 1차 백신화와 동일한 적용방법을 사용하여 수행한다. 모든 백신화된 돼지를 당해 백신의 안정성을 보장하기 위해 각 백신화 후 8일째에 단독(丹毒)과 관련된 임상징후에 대해 관찰한다. 2차 백신화 후 21째에 모든 20마리의 백신처리군 및 10마리의 비백신화된 대조군을 에리시펠로트릭스 루시오파시애의 병원성 균주로 점막내 시험감염시킨다. 모든 시험감염된 돼지를 9CFR 113.67에 따라서 시험감염 후 7일 동안 체온 및 단독과 관련된 임상징후에 대해 관찰한다. 한마리의 백신화된 돼지도 각 백신화 후에 단독의 모든 임상징후를 나타내지 않았다. 시험감염 후, 100퍼센트(100%)의 비백신화된 대조 돼지는 관찰 기간 동안에 고온, 관절염, 식욕부진, 우울증, 기면증, 전신의 반점형 발적(다이아몬드-피부 병반) 및 돌연사를 포함하는 단독의 중증 임상징후를나타냈다. 70퍼센트(70%)의 대조 돼지는 시험감염 후 4 내지 6일까지 사망하였다. 이. 루시오파시애를 시험감염 후에 또는 부검시에 대조 돼지로부터 수집한 모든 샘플로부터 분리한다. 대조적으로, 100%의 백신화된 돼지는 단독의 모든 임상징후도 나타내지 않았다. 당해 연구의 결과는 9 CFR 113.67에서 에리시펠로트릭스 루시오파시애 백신에 대해 기재되어 있는 요건을 충족시킨다. 당해 연구로부터 수집한 데이터는 음용수를 통해 투여된, 대량 백신화된 비병원성 생 배양물인 에리시펠로트릭스 루시오파시애 백신이 안전하며, 투여량당 약 6.06×107CFU의 최저 수준에서 이. 루시오파시애에 의해 유발되는 질병으로부터 돼지를 보호하는데 있어 효과적임을 입증한다.
시험 동물
종 돼지
마릿수 30마리
연령 6주령
성 둘다
품종 혼합됨
표식 귀 표지
공급원 FDAH SPF 돈군
동물의 사육 및 관리
모든 돼지는 편의상 표준인 21일의 연령에서 이유시킬 때까지 암퇘지에서 유지시킨다. 이유자돈에게 물과 사료를 임의로 공급한다. 돼지는 항생제를 함유하지 않는 Early Start Feed(Supersweet Brand)로 시작하고 현장 관리자가 적절하다고 고려하면 Start Amino로 교환한다. 백신처리군 및 대조군을 백신화 후에 시험감염할 때까지 2개의 별도 룸에서 사육한다. 백신을 투여하기 위해, 20마리의 백신화된 돼지를 축사당 10마리씩 2개의 축사에 넣는다. 각 축사에는 물 호스에 연결된 물 니플을 제공한다. 물은 동일한 자동화 물 비례 장치(도사트론)에 의해 니플 둘다로 주입된다. 시험감염 2일전에 백신화된 돼지 및 비백신화된 대조군을 하나의 룸내로 합하고 모든 돼지를 이. 루시오파시애의 병독성 균주로 시험감염시킨다. 모든 시험감염된 돼지를 관찰 기간이 종결될 때까지 방안에서 유지시킨다.
백신의 조성
당해 연구에서 사용되는 동결건조된 에리시펠로트릭스 루시오파시애 항원은 가장 높은 계대 수준(즉, 주 종균(Master Seed)+5)에서 제조한다. 항원의 주 종균을 5배 배양물이다. 각 계대를 MS+1, MS+2, MS+3, MS+4 및 MS+5로서 일관되게 디자인한다.
실험 디자인
돼지를 마크로소프트 엑셀의 난수 생성기(random number generator)를 사용하여 백신처리군 및 대조군으로 분류한다. 1차 백신화시에는 6주령인 20마리의 백신처리군 및 10마리의 비백신화된 대조군이 있다(부록 2). 모든 백신처리군은 2주의 투여 간격으로 2회 백신화한다. 백신처리군 및 비백신화된 대조군 둘다를 2차 백신화후 21일째에(21DPV2) 시험감염시킨다. 백신화 둘다의 경우, 백신은 자동하 물 비례 장치(도사트론)을 사용하여 음용수를 통해 전달한다. 혈청 샘플을 이후의 가능한 혈청학적 분석을 위해 백신처리군 및 대조군 둘다로부터 백신화 당일과 시험감염 당일에 수집한다. 시험감염한지 7일 후(7DPC) 모든 생존 돼지를 안락사시킨다. 이. 루시오파시애 분리를 위해, 혈액 샘플 및 장기를 시험감염 후 또는 부검시에 대조 돼지로부터 수집한다. 또한, 이. 루시오파시애 분리를 위해, 혈액 샘플을 부검시에 백신처리군으부터 수집한다.
이벤트 로그
과정 돼지의 연령
1차 백신화 6주
2차 백신화 8주
시험감염 11주
안락사 12주
부록 2: 당해 연구에 사용된 돼지의 체중
백신의 제조
제조된 백신 모액의 양은 각 돼지가 6시간의 백신화 기간 동안 음용할 수 있는 물의 양에 기초한다. 각 돼지가 음용할 수 있는 물 및 백신 유기체의 양은 백신화될 20마리의 돼지의 평균 체중에 따라서 산정한다(부록 3). 간략하게, 동결건조된 백신을 풍미(0.5% 지브당 루르(Givaudan Roure), 일련 번호 C-32110)를 가한 희석액 속에 재현탁시킨다. 재수화된 백신을 탈지분유를 함유하는 우유 용액 5ℓ에 첨가하고 고루 혼합한다. 추가로 백신 모액을 물을 사용하여 7ℓ까지 희석한 다음, 용기를 추가 혼합용 교반 플레이트 위에 놓는다. 이어서 상기 모액을 물 공급원에 연결되어 있는 연결 호스를 통해 자동화 물 비례 장치에 연결시킨다.
부록 3: 백신화 기간 동안 소비된 산정된 백신 양의 계산
1차 접종
1. 백신처리군의 평균 체중은 18.3lb이다.
2. 18.3lb/100lb×946㎖=173㎖. 이 계산은 100lb 돼지가 24시간 동안 1갤런(3785.4㎖)의 물을 음용하므로, 6시간의 백신화 기간 동안은 946㎖의 물을 음용한다는 가정에 기초한다.
3. 각 백신 병은 4.12×1010CFU(2.06×109CFU/㎖×20㎖)를 함유한다.
4. 니플로부터의 투여량당 목적한 CFU는 모액 용기로부터 니플로의 손실량을 제외한 1×108CFU이다.
5. 각 돼지에게 173㎖중 1×108CFU를 투여하기 위해, 니플로부터의 백신 유기체의 농도는 5.8×105CFU/㎖(1×108CFU/173㎖)이어야 한다.
6. 니플로부터 5.8×105CFU/㎖를 투여하기 위해, 백신 모액의 농도는 7.42×107CFU/㎖(5.8×105CFU/㎖×128*=7.42×107CFU/㎖)이어야 한다.
7. 백신이 6시간의 백신화 기간 동안 니플 밖으로 일관되게 유동하는 것을 보장하기 위해서는 모액 7ℓ가 필요하다. 모액중 총 CFU는 7.42×107CFU/㎖×7000㎖=5.19×1011CFU이다.
8. 동결건조된 백신의 13개의 병을 희석액으로 재수화시키고, 12.6개(5.19×1011CFU/4.12×1010CFU/병=12.6개의 병)의 병에 상당하는 재수화된 백신의 양을 탈지분유 및 물과 혼합하여 모액을 제조한다.
2차 백신화
1. 백신처리군의 평균 체중은 35.5lb이다.
2. 35.5lb/100lb×946㎖=336㎖. 이 계산은 100lb 돼지가 24시간 동안 1갤런(3785.4㎖)의 물을 음용하므로, 6시간의 백신화 기간 동안은 946㎖의 물을 음용한다는 가정에 기초한다.
3. 각 백신 병은 4.12×1010CFU(2.06×109CFU/㎖×20㎖)를 함유한다.
4. 니플로부터의 투여량당 목적한 CFU는 모액 용기로부터 니플로의 손실량을 제외한 1×108CFU이다.
5. 각 돼지에게 336㎖중 1×108CFU를 투여하기 위해, 니플로부터의 백신 유기체의 농도는 2.98×105CFU/㎖(1×108CFU/336㎖)이어야 한다.
6. 니플로부터 2.98×105CFU/㎖를 투여하기 위해, 백신 모액은 3.81×107CFU/㎖(2.98×105CFU/㎖×128*=3.81×107CFU/㎖)이어야 한다.
7. 백신이 6시간의 백신화 기간 동안 니플 밖으로 일관되게 유동하는 것을 보장하기 위해서는 모액 7ℓ가 필요하다. 모액중 총 CFU는 3.81×107CFU/㎖×7000㎖=2.67×1011CFU이다.
8. 동결건조된 백신의 7개의 병을 희석액으로 재수화시키고, 6.47개의 병에 상당하는 재수화된 백신의 양(2.67×1011CFU/4.12×1010CFU/병=6.47개의 병)을 탈지분유 및 물과 혼합하여 모액을 제조한다.
* 비례 장치를 1:128 전달비로 조정한다.
물 시스템의 제조, 경구 투여되는 백신 및 백신화 과정
백신화된 각 돼지의 체중을 백신화 하루전에 측정하고(부록 2) 백신화 기간 동안 사용되는 백신 스톡의 양을 계산하는데 사용한다. 백신화하기 하룻밤(8시간 내지 10시간 이상) 전에 음용수를 돼지로부터 회수하고 백신화가 시작된 후에 돼지에게 재전달한다. 백신화 기간은 돼지가 산정된 양의 백신을 소비하하는 것을 보장하기 위해 6시간 동안 지속한다. 1차 백신화시, 6시간 동안 충분한 백신이 니플 밖으로 일관되게 유동하는 것을 보장하도록 스톡 백신 7ℓ를 상기 기술한 바와 같이 제조한다. 도사트론을 모액 용기에 연결하고, 물 비례 장치를 1갤런당 1온스의 물이 백신화된 돼지에게 전달되록 조정한다. 자동화 물 분배 장치는 평행하게 2개의 물 니플(축사당 1개의 니플)으로 이동하여 백신을 2개의 니플로 동시에 전달한다. 백신 스톡을 교반 플레이트 위에 놓아서 백신화 기간 동안 혼합한다. 샘플을 전달이 시작된 후에 각 시간마다 2개의 니플로부터 수집한다. 생존 세균 계수를 5% 양 혈액을 함유하는 TSA II 한천 플레이트에서 수행한다. 5개의 플레이트를 각 샘플용으로 사용한다. 2차 백신화시, 백신 재수화 과정, 물 비례 장치 조절 및 샘플 수집은 1차 백신에서와 동일하다.
백신화량의 계산
음용수중의 백신의 농도 및 투여량 측정은 부록 4에 제시한다. 1차 백신화에서 2개의 니플의 평균 생존 계수는 3.50×105CFU/㎖이고, 각 돼지가 소비한 산정된 물의 양은 그룹의 체중 및 공개된 물 소비율에 기초하여 약 173㎖이다. 따라서, 각 돼지에게 실질적으로 투여된 투여량당 CFU는 3.50×105CFU/㎖×173㎖=6.06×107CFU인 것으로 계산된다.
마찬가지로, 2차 백신화시에 2개의 니플의 평균 생존 계수는 1.42×105CFU이고, 각 돼지가 소비한 물의 양은 약 336㎖이다. 따라서, 2차 백신화 동안 각 돼지에게 실질적으로 투여된 투여량당 CFU는 1.42×105CFU/㎖×336㎖=4.77×107CFU인 것으로 계산된다.
부록 4: 음용수중 백신 생존성의 확인 및 투여량 측정
모액과 니플 샘플 간의 백신 유기체의 생존 계수의 비교
모액과 니플 샘플 간의 백신 유기체의 생존 계수를 비교한다. 1차 및 2차 백신화의 결과는 각각 표 1 및 표 2에 제시한다. 1차 백신화시에, 모액의 평균 생존 계수는 1.36×108CFU/㎖이다. 2개의 니플의 평균 CFU/㎖는 3.49×108CFU/㎖이고, 평균 이론상 CFU/㎖(모액/128의 평균 CFU/㎖)는 1.06×106CFU/㎖이다. 니플 및 이론상 농도의 평균 간의 차이는 0.48 대수값이다. 유사하게, 2차 접종시에 모액의 평균 생존 계수는 3.51×107CFU/㎖이다. 2개의 니플의 평균 CFU/㎖은 1.42×105CFU/㎖이고 평균 이론상 CFU/㎖(모액/128의 평균 CFU/㎖)은 2.74×105CFU/㎖이다. 니플 및 이론상 농도의 평균간의 차이는 0.29 대수값이다. 당해 연구로부터 수집된 데이터는 니플 샘플과 모액 간의 평균 전달 농도가 예상치와 크게 다르지 않으며(즉, 0.5 대수 미만) CFU 측정에 대해 예상한 표준 범위내에 포함된다는 것을 나타낸다.
1차 백신화: 모액과 니플 샘플 간의 백신 유기체의 생존 계수의 비교
표본 시간(시간) 모액(CFU/㎖) 니플 1(CFU/㎖) 니플 2(CFU/㎖) 2개 니플의 평균(CFU/㎖) 이론상*CFU/㎖ 니플 CFU/㎖과 이론상 CFU/㎖의 평균간의 차이(대수값)
0 2.70E+08 2.81E+05 2.68E+05 2.75E+05 2.11E+06 -0.886
1 1.11E+08 3.86E+05 2.86E+05 3.36E+05 8.67E+05 -0.412
2 9.12E+07 2.91E+05 3.48E+05 3.20E+05 7.13E+05 -0.348
3 9.48E+07 3.57E+05 3.71E+05 3.64E+05 7.41E+05 -0.308
4 2.02E+07 4.45E+05 4.24E+05 4.35E+05 1.58E+06 -0.560
5 9.48E+07 4.73E+05 4.34E+05 4.54E+05 7.41E+05 -0.213
6 9.04E+07 2.74E+05 2.54E+05 2.64E+05 7.06E+05 -0.427
평균 1.36E+08 3.58E+05 3.41E+05 3.49E+05 1.06E+06 -0.484
비례 장치는 1:128 전달비로 조절한다.* 이론상 CFU/㎖은 모액/128에 기초하여 계산한다.
2차 백신화: 모액과 니플 샘플 간의 백신 유기체의 생존 계수의 비교
표본시간(시간) 모액(CFU/㎖) 니플 1(CFU/㎖) 니플 2(CFU/㎖) 2개 니플의 평균(CFU/㎖) 이론상*CFU/㎖ 니플 CFU/㎖과 이론상 CFU/㎖의 평균 간의차이(대수값)
0 3.21E+07 1.63E+05 1.26E+05 1.45E+05 2.51E+05 -0.239
1 3.53E+07 1.02E+05 1.08E+05 1.05E+05 2.76E+05 -0.419
2 3.44E+07 1.31E+05 1.35E+05 1.33E+05 2.69E+05 -0.305
3 3.65E+07 1.59E+05 1.59E+05 1.59E+05 2.85E+05 -0.254
4 3.66E+07 1.88E+05 1.80E+05 1.84E+05 2.86E+05 -0.191
5 3.63E+07 1.54E+05 1.51E+05 1.53E+05 2.84E+05 -0.269
6 3.42E+07 1.43E+05 8.50E+04 1.14E+05 2.67E+05 -0.370
평균 3.51E+07 1.49E+05 1.35E+05 1.42E+05 2.74E+05 -0.286
비례 장치는 1:128 전달비로 조절한다.* 이론상 CFU/㎖은 모액/128에 기초하여 계산한다.
각 백신화 후의 관찰
백신화된 돼지는 당해 백신의 안정성을 보장하기 위해 각 백신화 후에 8일 동안 단독(丹毒)과 관련된 임상징후에 대해 관찰한다. 또한, 1일 직장 온도를 관찰 기간 동안 측정한다.
관찰 및 시험감염 과정
2차 백신화 후 3주째에, 백신처리군 및 대조 그룹 둘다로부터의 모든 돼지를 이. 루시오파시애의 병원성 균주로 시험감염시킨다. 시험감염 균주(E1-6P, IRP ERC 일련 번호 4, USDA, APHIS CVB-L, 9-97 시험감염)를 SOP # a11-015-02(이. 루시오파시애 혈청형 1, SPF 돼지에 대한 시험감염)에 기재되어 있는 바와 같이 제조한다. 간략하게, 배양물을 CVB-L(아이오와주 에임스 소재)로부터 입수하여 변형된 파이스트(Feist) 배지에서 증식시킨다. CFU/㎖를 측정한 다음, 배양물을 저장을 위해 동결시킨다. 시험감염을 위해, 동결된 스톡을 급속해동시키고 각 돼지에게 시험감염 배양물 1㎖를 목 부위에서 근육내 투여한다. 시험감염량(5.7×104CFU/㎖)을 시험감염 전과 후에 TSA II 혈액 한천 플레이트에서 시험감염 재료의 CFU 계수에 의해 확인한다. 모든 돼지를 단독과 관련된 임상징후에 대해 관찰하고, 직장 온도를 9 CFR 113.67에 따라서 시험감염하기 전 2일 동안과 시험감염한 후 7일 동안 측정한다.
시험감염 시험을 수행하기 위한 상세한 프로토콜은 하기에 기재한다:
A. 재료
1. 보호 장비(글러브, 코트 및 안전 안경)
2. 1개의 바이알, 이. 루시오파시애 균주 E1-6P IRP ERC 일련 번호 4-9/97, NVSL 시험감염 배양물로부터의 제1 계대)
3. 멸균 트립신 대두 브로쓰
4. SPF 돈군으로부터의 감수성 돼지
5. 주사기
6. 바늘
7. 직장용 온도계
8. 멸균 피펫
9. 멸균 희석 시험관
10. 혈액 한천 플레이트
11. 멸균 접종 루프
12. 200㎕들이 피펫터
13. 멸균 피펫 팁
B. 방법
1. 관리인을 잠재적 위험으로부터 보호하기 위한 보호용 의류 및 부속품(글로브, 코트 및 안전 안경)을 착용한다. 에리시펠로트릭스 루시오파시애는 패혈증, 피부 병반, 관절염 및/또는 사망을 야기할 수 있는 공지된 사람 병원균이다. 이는 체액 및 개방된 상처를 통해 감염된다. 모든 예상되는 노출은 즉시 보고한다.
2. 시험감염 전 -2일째, -1일째 및 0일째에 직장 온도(이는 각 돼지에 대한 기선 온도로서 제공된다)를 측정한다. 온도를 기록한다.
3. 무균상태에서 시험감염 재료(이. 루시오파시애 E1-6P IRP ERC 일련 번호 4-9/97)를 투여하기 직전에 제조한다. 시험감염물의 바이알을 손으로 문질러 급속 해동시킨다. 종균이 해동되는 시간을 부착물 II에 기록한다. 종균 바이얼을 가볍게 진탕하고, 다음 방법을 사용하여 6.5×104CFU/㎖의 최종 농도까지 트립티카제 대두 브로쓰(TSB) 속에 희석시킨다(종균 농도는 약 2.15×107CFU/㎖이다). 무균상태에서, 시험감염 종균 재료 0.5㎖를 멸균 TSB 4.5㎖에 첨가한다(시험관 1- 2.15×106CFU/㎖). 시험관 1을 실온에서 15분 동안 유지한 다음, 시험관 1을 철저하게 혼합하고, 무균상태에서 시험관 1의 3.0㎖를 멸균 TSB 7.0㎖에 첨가한다(시험관 2- 6.5×105CFU/㎖). 시험관 2를 철저하게 혼합하고, 무균상태에서 TSB 중 시험관 2의 1:10 희석액을 제조한다(시험관 3- 6.5×104CFU/㎖) 상기 희석액을 적정수의 돼지를 시험감염하기에 충분하도록 제조한다(즉, 25마리의 돼지를 1.0㎖ 투여량의 6.5×104CFU/㎖ 시험감염 재료로 시험감염시킬 필요가 있는 경우, 30㎖ 이상의 6.5×104CFU/㎖ 시험감염 재료를 제조한다). 이를 위해, 무균상태에서 시험관 2의 3.0㎖를 멸균 TSB 27.0㎖에 첨가한다. 모든 시험감염 재료 및 희석액 시험관을 시험감염시까지 빙상에서 보관한다.
4. 시험감염 재료의 농도를 측정한다. 시험관 3을 철저하게 혼합하고 무균상태에서 시험관 3의 0.5㎖를 멸균 TSB 4.5㎖에 첨가한다(시험관 4- 6.5×103CFU/㎖). 시험관 4를 철저하게 혼합하고 시험관 4의 0.5㎖를 멸균 TSB 7.0㎖에 첨가한다(시험관 5- 4.3×102CFU/㎖).
5. 3개의 양 혈액 한천(SBA) 플레이트에 "시험관 5-시험감염 전의 이. 루시오파시애", 날짜 및 머리글자를 표지한다. 시험관 5를 철저하게 혼합하고, 무균상태에서 3개의 개별적 0.1㎖ 분취액을 시험관 5로부터 제거하고 이를 3개의 SBA 플레이트 위에 놓는다. 멸균 접종 루프를 사용하여 샘플을 가장자리에 가깝게 닿지않게 SBA 플레이트의 표면에 도말한다. 플레이트를 37℃에서 20 내지 48시간 동안 항온처리한다. 시험감염 전의 CFU가 플레이팅되는 시간을 기록한다. 모든 희석 시험관을 빙상에 놓아둔다.
6. 모든 돼지를 단계 IV.B.3에서 제조한 시험관 3으로부터의 시험감염 재료 1.0㎖(6.5×104CFU/㎖)으로 목 근육을 통해 근육내 시험감염시킨다. 돼지가 시험감염된 목의 부위를 기록한다. 모든 시험감염 재료를 시험감염 기간 동안 빙상에서 보관한다.
7. 돼지를 시험감염시킨 후, 시험관 5의 내용물을 철저하게 혼합한다. 3개의 SBA 플레이트에 "시험관 5-시험감염 후 이. 루시오파시애 및 날짜를 표지한다. 무균상태에서 3개의 개별적 0.1㎖ 분취액을 시험관 5로부터 제거하고 이를 3개의 SBA 플레이트 위에 놓는다. 멸균 접종 루프를 사용하여 샘플을 가장자리에 가깝게 닿지 않게 SBA 플레이트의 표면에 도말한다. 플레이트를 37℃에서 20 내지 48시간 동안 항온처리한다. 시험감염 후의 CFU가 플레이팅되는 시간을 기록하고, 시험감염 재료가 해동된 시간부터 시험감염 후의 CFU가 종결될 때가지 소요된 시간을 계산한다.
8. 7일 동안 연속적으로 각 돼지의 온도를 측정하고 기록한다. 각 돼지를 단독의 임상징후(식욕부진을 동반한 우울증, 강직 및/또는 관절 병발, 전이성 피부 병반을 동반하거나 동반하지 않은 빈사)에 대해 조사하고 모든 관찰결과를 기록한다. 또한, 모든 주사 부위 반응, 전신의 반점형 피부 발적, 불현성(不顯性) 또는청색증을 조사하고 기록한다.
9. 수의사는 부검을 수행하고 연구 기간동안 사망하였으나 단독의 임상징후를 보이지 않은 각 돼지의 사망 원인을 결정한다.
10. 남아있는 모든 시험감염 재료를 소각 또는 오토클래이브에 의해 제거한다.
11. 이중 플레이트 상의 콜로니를 계수하여 평균을 산정하고 기록한다.
C. 계산/해석
1. 대조 돼지는 2일(예비시험감염 일수는 제외) 동안 임상징후 및/또는 105.6°F의 온도를 나타내는 경우 단독에 대해 양성인 것으로 고려한다[참조: 9 CFR §113.67]. 양성으로 고려되는 기준을 만족시키는 돼지는 현장 감독자 또는 담당 수의사의 재량으로 페니실린으로 처리하여 통증 및 우을증을 경감시킬 수 있다.
2. 유효한 시험감염을 위해, 관찰 기간동안 80% 이상의 대조 돼지가 단독의 양성 징후를 나타내야 한다[참조: 9 CFR §113.67].
3. 계수된 콜로니의 평균수와 최종 희석액이 플레이팅된 시간을 곱한다. 시험감염 전과 후의 CFU 결과의 농도의 평균을 산정한다. 유효한 시험감염을 위해 시험감염 재료의 평균 농도는 5×104내지 9×104이어야 한다.
1차 백신화 후 임상 징후 및 온도
모든 백신화된 돼지를 1차 백신화 후 8일째까지 관찰한 결과, 한마리의 돼지도 단독과 관련된 모든 임상징후를 나타내지 않았다. 대부분의 돼지는 각각 4DPV1 및 5DPV1에서 104.6°F의 1일 체온을 나타내는 2마리의 돼지를 제외하고는 백신화 후의 관찰 기간 동안 정상 체온을 나타냈다. 상기 2마리의 돼지에서 임상징후는 관찰되지 않았다. 백신화된 돼지의 일부는 관찰 기간 동안 기선 온도보다 1°F 이상의 온도를 나타냈으며, 이는 취급하는 동안 돼지를 흥분시켜 야기된 것일 수 있다. 마찬가지로, 비백신화된 대조 돼지도 임의 임상징후 없이 1일 또는 2일 고온을 나타냈다.
2차 백신화 후의 임상징후 및 온도
한마리의 백신화된 돼지도 2차 백신화 후 8일 동안 단독과 관련된 모든 임상징후를 나타내지 않았다. 모든 돼지는, 각각 6DPV2에서 1일 체온이 104.2°인 한마리의 돼지 및 5DPV2 및 6DPV2에서 체온이 104.1°인 또 다른 돼지를 제외하고는 관찰 기간 동안 정상 체온을 나타냈다. 이들 돼지는 둘다 관찰 기간동안 어떠한 임상징후도 나타내지 않았다. 유사하게, 한마리의 대조 돼지는 어떠한 임상징후 없이 7DPV2에서 104.3°의 1일 체온을 나타냈다. 이러한 1일 고온은 취급 동안 돼지를 흥분시켜 야기된 것일 수 있다. 각 백신화 후의 임상 관찰 및 온도 둘다로부터 수집한 데이터는 당해 백신 균주가 돼지에게 안전하며 백신화 후에 단독과 관련된 임상징후를 유발하지 않을 수 있음을 입증한다.
시험감염 후의 임상 관찰
2차 백신화 후 21일째에, 20마리의 백신처리군 및 10마리의 대조군을 이. 루시오파시애의 병독성 균주로 시험감염시킨다. 모든 돼지는 단독과 관련된 임상징후에 대해 관찰하고 시험감염 전 2일 동안 및 시험감염 후 7일 동안 직장 체온을 측정한다.
시험감염 후, 대조 돼지의 임상징후
모든 비백신화된 대조군(100%)은 관절염, 전신의 반점형 발적(다이아몬드-피부 병반), 기면증, 식욕부진, 우울증 및 돌연사를 포함하는 단독의 중증 임상징후를 나타냈다. 시험감염 후 4일째에 네마리의 대조 돼지 O404, O417, O421 및 O422는 사망하였다. 돼지 O406 및 R73은 5DPC에서 사망하였고 돼지 O403은 6DPC에서 사망하였다. 시험감염 후 7일째에, 10마리의 대조 돼지중 7마리(70%)가 사망하였다. 돼지 O403은 사망 전 5DPC에서 체온이 105.7°F이었다. 돼지 O404 및 O406의 체온은 사망 전에 각각 103.1°F 및 102.4°F이었다. 돼지 O417, O421, O432 및 R73은 사망전에 체온이 각각 105.2°F, 104.9°F, 99.5°F 및 105.6°F이었다. 3마리의 대조 돼지 O411, O426 및 O429는 중증 임상징후를 나타내며 시험감염에서 생존하였다.
시험감염 후, 백신화된 돼지의 임상징후
100%(20마리중 20마리)의 백신처리군은 관찰 기간 동안 단독과 관련된 통상적 임상징후를 나타내지 않았다. 돼지 O409는 2DPC에서 주사 부위 발적을 나타냈다. 한마리의 백신화된 돼지도 시험감염 후 관찰 기간 동안 104.0°F 이상의 체온을 나타내지 않았다. 백신화된 돼지로부터 수집된 데이터는 100%의 백신처리군이이. 루시오파시애 시험감염으로부터 보호되었다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 돼지를 이. 루시오파시애 감염으로부터 보호하는데 적격인 효과적인 백신의 9 CFR 요건을 충족시킨다.
시험감염 후 돼지로부터 이. 루시오파시애의 분리
대조 돼지로부터 수집한 혈액, 비장, 간 및 장간막 림프절로부터 이. 루시오파시애의 분리는 시험감염 후 또는 부검시에 수행한다. 관찰된 바와 같이, 이. 루시오파시애는 4DPC에서 사망한 것으로 확인된 대조 돼지 O403, O406, O411, O426, O429 및 R73으로부터 수집된 샘플로부터 분리한다. 돼지 O404, O417, O421 및 O432는 4DPC에서 사망한 것으로 확인되었으며 이때 샘플은 수집하지 않는다. 또한, 혈액 샘플을 7DPC에서 백신화된 돼지로부터 수집하고 이. 루시오파시애는 백신화 돼지로부터 분리하지 않는다. 대조 돼지로부터 이. 루시오파시애를 분리한 결과는 유효한 이. 루시오파시애 시험감염에 대한 9 CFR 요건을 충족시킨다.
결론
당해 연구의 데이터는, 당해 경우에 본 발명의 방법에 따라서 자동화 물 비례 장치를 사용하여 음용수를 통해 약 6.06×107CFU/투여량의 속도로 대량 투여하는, 비독성 생 배양물인 에리시펠로트릭스 루시오파시애 백신을 포함하는 본 발명의 풍미를 가한 백신 제제가 안전하며 이. 루시오파시애 감염에 의해 유발되는 질병으로부터 돼지를 보호하는데 효과적임을 입증한다. 당해 연구의 결과는 9 CFR 113.67에 기재된 요건을 충족시키며, 비독성 생 배양물인 에리시펠로트릭스 루시오파시애 백신이 승인받기에 적합하도록 한다.
실시예 2
풍미를 가하지 않은 백신과 비교한 경구 투여되는 풍미를 가한 백신
본 발명의 풍미를 가한 경구 투여되는 백신이 풍미를 가하지 않은 백신과 비교하여 감염에 대한 보다 큰 보호를 제공한다는 것을 입증하기 위해, 동결건조된 에리시펠로트릭스 루시오파시애를 항원으로서 함유하는 딸기 풍미를 가한 백신 제제, 동결건조된 에리시펠로트릭스 루시오파시애를 항원으로서 함유하는 풍미를 가하지 않은 백신 제제 및 풍미제 또는 항원을 첨가하지 않은 대조 제제를 사용하여, 실시예 1에서 기술한 프로토콜과 유사한 백신화 프로토콜을 수행한다. 모든 백신 및 대조 제제는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한다. 시험감염 실험은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 수행한다.
당해 실험 및 데이터는 하기 표에 기재한다.
풍미를 가한 백신 제제의 투여-연구 I
그룹 돼지당 투여량 돼지의 수 시험감염시의 보호율(%)
1 1회 투여량 5×107 5 100%
2 1회 투여량 5×108 5 100%
3 1회 투여량 5×107 5 100%
4 1회 투여량 5×108 5 100%
대조군 NA 8 NA-100% 질병
풍미를 가한 백신 제제의 투여-연구 II
그룹 돼지당 투여량 돼지의 수 시험감염시의 보호율(%)
백신처리군 1회 투여량 1×107 20 50%
대조군 NA 10 NA-100% 질병
백신처리군 2회 투여량 1×107/투여량 20 75%
대조군 NA 10 NA-100% 질병
풍미를 가하지 않는 백신 제제의 투여
그룹 돼지당 투여량 돼지의 수 시험감염시의 보호율(%)
1 1회 투여량 1×107 21 10%
2 1회 투여량 2×107 18 22%
대조군 NA 10 NA-100% 질병
실시예 3
항원이 풍미를 갖지 않은 백신 제제 중에서 활성임을 입증하기 위해, 돼지에게 풍미를 갖지 않는 제형화한 백신의 1회 투여량을 주사기로 투여한다. 당해 데이터는 하기 표 7에 기재되어 있으며 항원이 활성이라는 것을 입증하고, 풍미제가음용수중의 풍미를 가한 경구 투여되는 백신의 돼지에 의한 보다 큰 섭취량을 제공한다는 증거를 제공한다.
풍미를 가하지 않은 백신의 주사기 전달
그룹 돼지당 투여량 돼지의 수 시험감염시의 보호율(%)
백신처리군 1회 투여량 1×107 3 100%
대조군 NA 3 NA-100% 질병
참조문헌
M.L. Augenstein, L.J. Johnston, G.C. Shurson, J. D. Hawton and J.E. Pettigrew. Formulating Farm-Specific Swine Diets; University of Minnesota Extension Service. 1994.

Claims (26)

  1. (a) 수용성 기호성 풍미제를 경구 투여되는 백신 투여용 수용성 비히클과 혼합하는 단계,
    (b) 단계(a)의 혼합물을 경구 투여되는 백신의 활성 성분으로서의 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원과 추가로 혼합하는 단계 및
    (c) 단계(b)의 경구 투여되는 백신을 동물에게 투여하여 당해 항원에 의한 감염과 관련되는 질병에 대한 보호를 제공하는 단계를 포함하여, 동물에서 질병에 대한 보호를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원이 돼지, 가금, 소, 양, 염소, 말, 고양이 및 개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동물에서 질병을 유발할 수 있는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항원이, 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix Rhusiopathiae), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuroneumonia), 미코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 이. 콜라이(E. coli) K88, K99, F41 및 987P, 클로스트리듐 퍼페링젠스(Clostridium perferingens) C형, 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls), 파스튜렐라 무이토시다(Pasterurella muitocida), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 렙토스피라 브라티시아바(Leptospira bratisiava), 렙토스피라카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그리포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 하르드조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 프로모나(Leptospira promona), 렙토스피라 이크테로(Leptospira ictero), 돼지 인플루엔자(Porcine Influenza) 바이러스, 써코바이러스(Circovirus), PRRS 바이러스, 돈두(Swine pox) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 돼지 호흡기 코로나바이러스(Porcine Respiratory Coronavirus), 파르보 바이러스(Parvo virus), 가성공수병(Pseudorabies) 바이러스, 전염성 위장염 병원체, 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 클로스트리디움 테타누스(Clostridium tetanus), 말 인플루엔자(Equine Influenza) 바이러스 A1 및 A2 균주, 말 리노뉴모니드(Equine Rhinopneumonid) 1형, 1b형 및 4형, 동부 말 뇌척수막염(Eastern Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 서부 말 뇌척수막염(Western Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염(Venezuelan Equine Encephalomyelitis) 바이러스, 말 로타바이러스(Equine Rotavirus), 이. 콜라이 O157:H7, 파스튜렐라 무이토시다, 파스튜렐라 해몰리티카(Pasterurella haemolytica), 클로스트리디움 퍼페링젠스 D형, 클로스트리디움 차우보엘(Clostridium chauvoel), 클로스트리디움 노빌(Clostridium novyl), 클로스트리디움 셉티쿰(Clostridium septicum), 클로스트리디움 해몰리티쿰(Clostridium haemolyticum), 클로스트리디움 소델리(Clostridium sodellii), 살모넬라 두블린(Salmonella dublin), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus), 소 코로나바이러스(Bovinecoronavirus), 소 비기관염(Bovine rhinotracheitis) 바이러스, 소 설사 바이러스, 파라인플루엔자(Parainfluenza)-3, 호흡기 합포체 바이러스, 세풀리나 필로시콜리(Sepullina pilosicoli), 마렉병(Marek disease) 바이러스, 전염성 낭병(Infectious bursal disease) 바이러스, 전염성 기관지염(Infectious bronchitis) 바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 레오(Reo) 바이러스, 칠면조 비기관염(Turkey rhinotracheltis) 바이러스, 코우이디오시스(couidiosis), 개 보렐리아 부르그도르페리(Canine Borrella burgdorferi), 개 에를리히아 카니스(Canine Ehrlichia canis), 개 보르데텔라 브론키셉티카(Canine Bordetella bronchiseptica), 개 람블편모충(Canine Giardia lamblia), 개 디스템퍼(Canine distemper) 바이러스, 개 아데노바이러스(Canine Adenovirus), 개 코로나바이러스(Canine Coronavirus), 개 파라인플루엔자(Canine Parainfluenza), 개 파르보바이러스(Canine Parvovirus), 개 공수병(Canine Rabies) 바이러스, 고양이 클라미디아 시타시(Feline Chlamydia psittaci), 고양이 면역결핍(Feline immunodeficiency) 바이러스, 고양이 감염성 복막염(Feline infectious peritonitis) 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 비기관염(Feline rhinotrachelitis) 바이러스, 고양이 범백혈구감소증(Feline Panleukopenia) 바이러스 및 고양이 공수병(Feline rabies) 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 백신이 음용수를 통해 투여되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 동물이 돼지, 가금, 소, 양, 염소, 말, 고양이 및 개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 동물이 돼지 및 가금으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 경구 투여되는 백신의 투여가 음용수를 통한 대량 투여인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 동물이 돼지이고 항원이 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae)인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 동물이 개 및 고양이로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 경구 투여되는 백신이 주사기를 통해 구강내로 투여되는 방법.
  11. (a) 수용성 기호성 풍미제를 경구 투여되는 백신 투여용 수용성 비히클과 혼합하는 단계,
    (b) 단계(a)의 혼합물을 경구 투여되는 백신의 활성 성분으로서의 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원과 추가로 혼합하는 단계,
    (c) 단계(b)의 백신 혼합물을 동물에게 경구 투여하는 단계 및
    (d) 당해 풍미제로 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하는 단계를 포함하여, 동물에 의한 경구 투여되는 백신의 증가된 섭취를 유도하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항원이 돼지, 가금, 소, 양, 염소, 말, 고양이 및 개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동물에서 질병을 유발할 수 있는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 항원이, 에리시펠로트릭스 루시오파시애, 악티노바실러스 플레우로뉴모니아, 미코플라스마 하이오뉴모니애, 이. 콜라이 K88, K99, F41 및 987P, 클로스트리듐 퍼페링젠스 C형, 살모넬라 콜레라에슐스, 파스튜렐라 무이토시다, 보르데텔라 브론키셉티카, 렙토스피라 브라티시아바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그리포티포사, 렙토스피라 하르드조, 렙토스피라 프로모나, 렙토스피라 이크테로, 돼지 인플루엔자 바이러스, 써코바이러스, PRRS 바이러스, 돈두, 로타바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 파르보 바이러스, 가성 공수병 바이러스, 전염성 위장염 병원체, 스트렙토코커스 에퀴, 클로스트리디움 테타누스, 말 인플루엔자 바이러스 A1 및 A2 균주, 말 리노뉴모니드 1형, 1b형 및 4형, 동부 말 뇌척수막염 바이러스, 서부 말 뇌척수막염 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염 바이러스,말 로타바이러스, 이. 콜라이 O157:H7, 파스튜렐라 무이토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 클로스트리디움 퍼페링젠스 D형, 클로스트리디움 차우보엘, 클로스트리디움 노빌, 클로스트리디움 셉티쿰, 클로스트리디움 해몰리티쿰, 클로스트리디움 소델리, 살모넬라 두블린, 살모넬라 티피무리움, 소 로타바이러스, 소 코로나바이러스, 소 비기관염 바이러스, 소 설사 바이러스, 파라인플루엔자-3, 호흡기 합포체 바이러스, 세풀리나 필로시콜리, 마렉병 바이러스, 전염성 낭병 바이러스, 전염성 기관지염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 레오 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 코우이디오시스, 개 보렐리아 부르그도르페리, 개 에를리히아 카니스, 개 보르데텔라 브론키셉티카, 개 람블편모충, 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노바이러스, 개 코로나바이러스, 개 파라인플루엔자, 개 파르보바이러스, 개 공수병 바이러스, 고양이 클라미디아 시타시, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 비기관염 바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스 및 고양이 공수병 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 백신이 음용수를 통해 투여되는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 동물이 돼지, 가금, 소, 양, 염소, 말, 고양이 및 개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 동물이 돼지 및 가금으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는방법.
  17. 제16항에 있어서, 경구 투여되는 백신의 투여가 음용수를 통한 대량 투여인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 동물이 돼지이고 항원이 에리시펠로트릭스 루시오파시애인 방법.
  19. 제11항에 있어서, 동물이 개 및 고양이로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 경구 투여되는 백신이 주사기를 통해 구강의 안쪽으로 투여되는 방법.
  21. 활성 성분으로서 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원, 수용성 기호성 풍미제 및 경구 투여되는 동물용 백신의 투여용 수용성 비히클을 포함하는, 경구 투여되는 동물용 백신 제제.
  22. 제21항에 있어서, 항원이 돼지, 가금, 소, 양, 염소, 말, 고양이 및 개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동물에서 질병을 유발할 수 있는 백신 제제.
  23. 제22항에 있어서, 항원이, 에리시펠로트릭스 루시오파시애, 악티노바실러스 플레우로뉴모니아, 미코플라스마 하이오뉴모니애, 이. 콜라이 K88, K99, F41 및 987P, 클로스트리듐 퍼페링젠스 C형, 살모넬라 콜레라에슐스, 파스튜렐라 무이토시다, 보르데텔라 브론키셉티카, 렙토스피라 브라티시아바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그리포티포사, 렙토스피라 하르드조, 렙토스피라 프로모나, 렙토스피라 이크테로, 돼지 인플루엔자 바이러스, 써코바이러스, PRRS 바이러스, 돈두, 로타바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 파르보 바이러스, 가성 공수병 바이러스, 전염성 위장염 병원체, 스트렙토코커스 에퀴, 클로스트리디움 테타누스, 말 인플루엔자 바이러스 A1 및 A2 균주, 말 리노뉴모니드 1형, 1b형 및 4형, 동부 말 뇌척수막염 바이러스, 서부 말 뇌척수막염 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염 바이러스, 말 로타바이러스, 이. 콜라이 O157:H7, 파스튜렐라 무이토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 클로스트리디움 퍼페링젠스 D형, 클로스트리디움 차우보엘, 클로스트리디움 노빌, 클로스트리디움 셉티쿰, 클로스트리디움 해몰리티쿰, 클로스트리디움 소델리, 살모넬라 두블린, 살모넬라 티피무리움, 소 로타바이러스, 소 코로나바이러스, 소 비기관염 바이러스, 소 설사 바이러스, 파라인플루엔자-3, 호흡기 합포체 바이러스, 세풀리나 필로시콜리, 마렉병 바이러스, 전염성 낭병 바이러스, 전염성 기관지염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 레오 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 코우이디오시스, 개 보렐리아 부르그도르페리, 개 에를리히아 카니스, 개 보르데텔라 브론키셉티카, 개 람블편모충, 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노바이러스, 개 코로나바이러스, 개 파라인플루엔자, 개 파르보바이러스, 개 공수병 바이러스, 고양이 클라미디아 시타시, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 비기관염 바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스 및 고양이 공수병 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신 제제.
  24. 제21항에 있어서, 투여용 비히클이 음용수인 백신 제제.
  25. 제21항에 있어서, 동물이 돼지이고 항원이 에리시펠로트릭스 루시오파시애인 백신 제제.
  26. 제21항에 있어서, 동물이 개 및 고양이로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 투여용 비히클이 시럽인 백신 제제.
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