CZ20024222A3

CZ20024222A3 - Vakcína

Info

Publication number: CZ20024222A3
Application number: CZ20024222A
Authority: CZ
Inventors: Hsien-Jue CHU (Steve); Wumin Li
Original assignee: Wyeth
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2003-06-18
Also published as: HUP0301394A2; US20020025325A1; BG107282A; AU2001270135B2; CN1529615A; EP1294399A2; HUP0301394A3; MY128159A; BR0111916A; KR20030013480A; PL360026A1; NZ523329A; CN100457179C; AR030702A1; MXPA02012201A; YU99102A; JP2004501979A; AU7013501A; US20060171960A1; WO2002002139A3

Description

Vakcřna

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředku pro orální vakcinaci zdravých zvířat podávaného pitnou vodou nebo sirupy, který napomáhá při prevenci onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Existuje řada infekčních onemocněni, která mohou postihnout populace zvířat a která způsobují oslabení a smrt. Pro zmírnění nebo odstranění příznaků onemocnění u infikovaných zvířat byla dosud prováděna úspěšná vakcinace proti takovým infekčním onemocněním. Výhodná je orální vakcinace, protože při ní odpadá použití injekcí.

Ve velkých populacích hospodářských zvířat, jako jsou vepři, drůbež, hovězí dobytek, ovce, kozy a koně může být vakcinace náročná na čas i práci. Navíc může intramuskulární injekce poškodit maso a může zvířata stresovat.

U domácích zvířat jako jsou psi a kočky je možno stres spojený s intramuskulární injekcí zmírnit použitím účinné orální vakcíny proti běžným infekcím.

Velikost jednotek pro chov vepřů i drůbeže se celosvětově podstatně zvětšila. V mnoha chovech vepřů může být nyní umístěno více než 10 000 odstavených prasat, a v mnoha chovech drůbeže může být ještě více ptáků. Vakcinace každého vepře nebo ptáka tradičními vakcinami je pracovně náročná a obtížná. Každé zvíře se musí odchytit, musí dostat alespoň jednu injekci, v mnoha případech i dvě, a musí být v průběhu vakcinace hodnoceno.

• ·

- 2 ·· ·

Z důvodů těchto nesnází by byla pro chovatele velmi prospěšná účinná vakcina podávaná skupinám zvířat pitnou vodou (hromadné podávání), která by vepře nebo drůbež chránila před infekcí a která by ušetřila náklady na práci a zabránila stresu a poškození masa způsobenému jehlami.

Navíc chovatelé krav, ovcí, koz a koní, obvykle chovaných ve chlévech, a často umístěných nebo ustájených odděleně, by měli prospěch z orální vakciny podávané pitnou vodou, která by snížila náklady na individuální injekce, stres a poškození masa.

Podávání orálních vakcin by také bylo prospěšné pro domácí zvířata jako jsou psi a kočky, kde by mohlo snížit jejich stres a zabránit potřebě injekcí.

Dosud bylo hlavní nevýhodou při hromadném podávání vakciny prostřednictvím pitné vody velkým skupinám ptáků nerovnoměrné dávkování vakciny způsobené nestejnou spotřebou vody a tím, že některá zvířata nemusela vakcinu přijmout vůbec. Navíc může být smícháním s vodou ovlivněna životaschopnost a stabilita bakteriálního nebo virového účinného prostředku ve vakcině. Stabilita ve vodě může podstatně klesat s časem. Proto by bylo vysoce výhodné poskytnout vakcinu pro hromadné podávání zvířatům v omezeném čase, aby se zabránilo destabilizaci imunogenního prostředku. Bylo by také výhodné poskytnout vakcinu, kterou zvířata ráda přijímají, aby bylo zajištěno spolehlivé samostatné podávání pitné vody s obsahem vakciny populaci zvířat.

Další hlavní nevýhodou orálního podávání vakcin proti infekčním činitelům způsobujícím onemocnění je to, že mnoho takových prostředků je spojeno s nepříjemnou chutí nebo zápachem. Vakciny, které jsou hromadně podávány velkým skupinám zvířat, musí zvířata ráda přijímat, protože jinak si je zvířata sama nevezmou, tj, nevypijí je. Stejným způsobem by bylo výhodné, aby byly chuťově příjemné vakciny podávané zvířatům pěstovaným ve chlévech nebo zvířatům, .··. ···: ···. ......

··· ··>··· · ··· ··· · - · · · ··· Jí.:··· ·

-3- .....·· *..··..· která jsou ustájena jednotlivě, aby si zvířata vakciny sama brala. Konečně co se týče domácích zvířat, těmto zvířatům se obvykle podávají orální vakciny do úst u veterináře nebo ošetřovatele zvířat a tyto vakciny jsou zvířaty často odmítány a vyplivovány. Proto by bylo velmi výhodné poskytnout orálně podávané vakciny v takové formulaci, kterou by zvířata ráda přijímala, čímž by došlo ke zvýšení pravděpodobnosti úspěšného podání a přijmutí vakciny.

WO 98/51279 popisuje podávání orální vakciny s obsahem DNA kódující antigenní peptidy, které jsou inkorporovány do polymerních mikročástic. Do mikročástic mohou být přidány prostředky zlepšující chuť. Tyto částice však nejsou rozpustné ve vodě a neumožňují podávání bakterií nebo virů, které způsobují onemocnění.

Bell, a další (Australian Veterinary Journal 68(3), 1991, str. 85 89) popisují podání vakciny proti Newcastleskému onemocnění kmene V4 hromadným způsobem kuřatům. Vakcina byla podávána následujícími třemi metodami: 1) podávání s odstředěným mlékem a podávání v pitné vodě; 2) podávání ve formě aerosolu; a

3) podávání jako hrubě rozprášeného materiálu. I když byly ukázány sérologické důkazy vytvoření protilátek proti Newcastleskému viru, nebyly prováděny žádné studie se zkušebním podáním viru. Nebylo tedy možné určit u těchto ptáků rozsah vakcinace proti onemocnění. Důležitější je, že nebyly prováděny žádné pokusy převést vakcinační formulaci do formy, která by byla pro ptáky chuťově příjemnější.

Grieve popisuje vyhodnocení vakcin hromadně podávaných kuřatům pitnou vodou nebo sprejem přidáváním modrého barviva do vakcinačního prostředku proti Newcastleskému onemocnění. Barvivo se používá pro monitorování spotřeby vakciny u ptáků tím, že se dočasně zabarví jazyky ptáků. Barvivo ukázalo, že vakcinu konzumovalo přibližně pouze 80 % hejna. Nebyly prováděny žádné pokusy převést vakcinu do formy chuťově příjemnější ptákům.

Bylo by tedy velmi žádoucí sestavit a podávat účinnou orálně podávanou vakcinu chuťově příjemnou pro zvířata a přinášející značné úspory práce. Tyto formulace vakcin by mohly nabízet veterinárním lékařům a výrobcům mléka a masa pohodlný nový strategický nástroj pro optimalizaci chovu a zdraví zvířat obecně, přičemž chuťově příjemnější orální vakcina, která není zvířaty odmítána, by byla výhodná i ve veterinární praxi.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje způsob poskytnutí ochrany proti onemocnění u zvířete, který zahrnuje následující kroky:

(a) smísí se ve vodě rozpustná chuťově příjemná ochucovací látka s ve vodě rozpustným vehikulem pro podání orálně podávané vakciny;

(b) směs z kroku (a) se dále smísí s antigenem zvoleným ze skupiny bakterie a viru jako účinnou složkou orálně podávané vakciny; a (c) vakcina pro orální podávání z kroku (b) se podá zvířeti pro poskytnutí ochrany proti onemocnění souvisejícímu s infekcí antigenem.

Předkládaný vynález také zahrnuje způsob indukce zvýšeného příjmu orální vakciny zvířetem, který zahrnuje:

(b) směs z kroku (a) se dále smísí s antigenem zvoleným ze skupiny bakterie a viru jako účinnou složkou orálně podávané vakciny; a ·· · 4 • · · ·

- 5 4 4 (c) vakcina pro orální podávání z kroku (b) se podá zvířeti pro poskytnutí ochrany proti onemocnění souvisejícímu s infekcí antigenem;

(d) indukuje se zvýšený příjem orální vakciny s ochucovací látkou.

Předkládaný vynález dále zahrnuje orálně podávanou vakcinu pro zvířata, která jako účinnou složku obsahuje antigen zvolený ze skupiny bakterie a viru, ve vodě rozpustnou chuťově příjemnou ochucovací látku a ve vodě rozpustné vehikulum pro podávání orálně podávané vakciny pro zvířata.

Podrobný popis vynálezu

Všechny patenty, patentové přihlášky, publikace a jiné materiály citované v přihlášce se zahrnují ve svém celku odkazem. V případě nejasností je rozhodující popis přihlášky včetně definic.

Jak se zde používá, termín „hromadné podávání“ je definován jako podávání ve vodě rozpustné vakciny ve velkém měřítku skupinám zvířat, která jsou chována společně ve velkých zařízeních. Typicky se v těchto zařízeních chovají vepři a drůbež.

Jak se zde používá, termíny „vepř“ a „prase“ nebo „prasata“ se používají jako synonyma.

Jak se zde používá, termín „drůbež“ je definován tak, že zahrnuje kuřata, krocany a krůty, a kachny.

Jak se zde používá, termín „chuťově příjemná ochucovací látka“ se definuje jako prostředek zlepšující chuť, u kterého se ukázalo, že je přijímajícím zvířetem nebo zvířaty požadován. Toto požadování se zjišťuje před formulací do orální vakciny podle vynálezu pozorováním samovolného podávání pitné vody nebo sirupu, které byly ochuceny chuťově příjemnou ochucovací látkou. Mezi neomezující příklady těchto ochucovacích látek patří ovocné příchuti jako je jahoda, třešeň,

grep, vodní meloun, jablko apod.; rybí příchuti; masové příchuti; a jakékoli jiné příchuti, které zvíře nebo zvířata preferují. Ovocné příchuti jsou zvláště výhodné pro podávání vepřům, koním, ovcím, kozám, kočkám a psům. Masové příchuti jsou zvláště výhodné pro psy a kočky. Rybí příchuti jsou zvláště výhodné pro kočky.

Termín „ošetřovatel zvířat“, jak se zde používá, zahrnuje pracovníka na farmě, veterinárního lékaře, veterinárního zdravotníka nebo jinou osobu odpovědnou za péči o zvíře a podávání léků, vakcin a/nebo potravy zvířeti.

Předkládaný vynález zahrnuje způsoby a prostředky jak pro poskytování ochrany proti onemocnění, tak pro indukci zvýšeného příjmu orální vakciny zvířetem. Způsoby podle vynálezu se zaměřují na míchání bakteriálního nebo virového antigenu s chuťově příjemnou ochucovací látkou rozpustnou ve vodě, dále míchání antigenu a směsi ochucovací látky s vehikulem rozpustným ve vodě pro orální podávání vakciny zvířeti pro poskytnutí ochrany proti onemocnění souvisejícímu s infekcí přimíchaným antigenem a na zvýšený příjem vakciny s obsahem ochucovací látky.

Předkládaný vynález zahrnuje také způsoby a prostředky pro orální vakcinaci zdravých zvířat prostřednictvím pitné vody nebo sirupů jako pomoc při prevenci onemocnění. Přimíchání chuťově příjemné ochucovací látky poskytuje vakcinu s požadovanou chutí, aby se podpořilo samovolné přijímání vakciny a/nebo aby se zabránilo odmítání prostředku při podávání ošetřovatelem.

Antigeny přidávané do vakcin podle vynálezu jsou činitele způsobující bakteriální a virové onemocnění. Zvláště výhodné jsou živé bakterie a viry. Při podávání živé bakterie nebo viru jako antigenu ve vakcině je zvláště důležitá životaschopnost (viabilita) živého antigenu. Zvíře nebo zvířata musí přijmout vakcinu před tím, než dojde k podstatnému zmenšení viability antigenu, aby byla zajištěna nejvyšší možná antigenicita a aby se získala silná imunitní odpověď.

*· ····

Rozumí se, že „avirulentní“ nebo „inaktivovaný“ bakteriální nebo virový kmen je kmen, který není schopen vyvolat u zvířete onemocnění, a patří sem kterýkoli kmen, který bude odborník v oboru považovat za bezpečný pro podávání zvířeti ve formě vakciny. Do rámce předkládaného vynálezu například spadá kmen způsobující nevýznamné klinické příznaky, které mohou zahrnovat horečku, serózní výtok z nosu nebo výtok z očí, protože tyto klinické příznaky jsou považovány za přijatelné vedlejší účinky vakcin.

Jeden způsob inaktivace bakteriálních nebo virových antigenů pro použití v rámci vynálezu je zavedení genových mutací jako jsou substituce, delece a/nebo inzerce v genomu antigenů, které odstraní schopnost vyvolávat onemocnění. Pro získání oslabených kmenů metodami genetického inženýrství s použitím delecí, inzercí a substitucí v genomu bakteriálního nebo virového antigenů, mohou být použity metody technologie rekombinantní DNA. Tyto metody jsou v oboru dobře známé a popisují se například v Sambrook a další (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Další způsoby oslabování nebo inaktivace bakteriálního nebo virového antigenů pro použití v rámci vynálezu jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Jak se zde používá, „modifikovaný živý virus“ nebo „modifikovaná živá bakterie“ je virový nebo bakteriální antigen, který byl změněn, typicky pasážováním v buňkách tkáňové kultury, pro oslabení schopnosti vyvolávat onemocnění, ale který si zachovává schopnost chránit proti onemocnění nebo infekci, jestliže se podá zvířeti.

Termín „infekční jednotka“ virového antigenů podle vynálezu je definován jako TCID₅₀, neboli množství viru nutné pro infekci nebo usmrcení 50 % buněk tkáňové kultury.

Koncentrace bakteriálního antigenů v dané kultuře může být zjištěna standardními metodami známými v oboru, jako je například • · · ·

*··· mikroskopická analýza, počítání kolonií nebo spektrofotometrická analýza kapalné kultury.

Koncentrace antigenů bakteriálního toxinu se může získat stanovením letální dávky (LD) a LD50 ve vhodném zvířecím modelu, např. myší.

Vakcina se může připravovat z čerstvě sklizených virových kultur způsoby, které jsou v oboru standardní. Růst viru je monitorován standardními technikami (pozorování cytopatického efektu, imunofluorescence nebo jiné testy založené na protilátkách) a sklízení se provádí při dosažení dostatečně vysokého titru viru. Zásoby viru mohou být dále zakoncentrovány nebo lyofilizovány běžnými způsoby před tím, než se přidají do vakciny. Je možno také použít jiných způsobů, např. způsobů popsaných u Thomas, a další, Agri-Practice,

V. 7 No. 5, str. 26 - 30.

Bakterie se pěstují způsoby známými v oboru. Bakteriální antigeny pro použití ve formulacích podle vynálezu mohou být kapalné nebo mohou být také v lyofilizované formě a mohou být rekonstituovány před použitím s chuťově příjemnou ochucovací látkou a ve vodě rozpustným vehikulem.

Výhodné množství bakteriálního antigenu podávaného v dávce vakciny pro jednotlivé zvíře je obecně od přibližně 10 do přibližně 10 bakterií schopných vytvořit kolonie (Colony Forming Units, „CFU“), s výhodou od přibližně 10⁶ do přibližně 1O¹⁰ CFU, a nejvýhodněji od přibližně 10⁷ do přibližně 10⁹ CFU. V dalším výhodném provedení je účinné množství od přibližně 10⁵ do přibližně 10⁸ CFU na dávku.

Výhodné množství virového antigenu podávaného v dávce vakciny pro jednotlivé zvíře by obecně mělo obsahovat množství odpovídající od přibližně 10^3,° do přibližně 1O^6,0 TCIDso/ml, s výhodou 10⁴ až 10⁵ TCID₅₀/ml.

··· ·

Dávka nebo účinné množství u každého konkrétního bakteriálního nebo virového antigenu pro formulaci ve vakcinách podle vynálezu budou obecně záviset na věku, zdravodním stavu a imunitním stavu (např. předchozí expozice, rodičovské protilátky) vakcinovaného zvířete nebo zvířat, stejně jako na konkrétním použitém antigenu. Vhodné účinné množství včetně minimální hladiny antigenu a výpočet dávky vody nebo sirupu pro podání může rutinně určit odborník v oboru.

Jak je uvedeno výše, do vakcin podle vynálezu, které mohou být podávány způsoby podle vynálezu, může být použit jakýkoli infekční, oslabený nebo inaktivovaný, živý nebo usmrcený bakteriální nebo virový prostředek. Neomezující příklady zvláště výhodných antigenů zahrnují antigeny infikující následující zvířata:

Vepři - Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus pleuronumonia, Mycoplasma hyopneumoniae, E. coli K88, K99, F41 a 987P, Clostridium perferingens typ c, Salmonella choleraesuls, Pasterurella muitocida, Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira ictero, virus chřipky vepřů, Circovirus, virus PRRS, neštovice vepřů, rotavirus, respirační koronavirus vepřů, parvovirus, pseudorabies, činitel vyvolávající přenosnou gastroenteritidu.

Koně - Streptococcus equi, Clostridium tetani, virus koňské chřipky kmeny A1 a A2, rhinopneumonitidy koní typu 1,1b a 4, východní encefalomyelitidy koní, západní encefalomyelitidy koní, venezuelské encefalomyelitidy koní, rotavirus koní.

Hovězí dobtek - E. coli O157.H7, Pasterurella muitocida, Pasterurella haemolytica, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira Ictero, Clostridium perferingens typ C, Clostridium perferingens typ D, Clostridium chauvoel, Clostridium novyl, Clostridium septicum, ·· ····

Clostridium tetanus, Clostrídium haemolyticum, Clostridium sodellii, Salmonella dublin a typhimurium, bovinní roíavirus, bovinní koronavirus, bovinní rhinotracheitida, virus bovinního průjmu, parainfluenza-3, virus respiračního syncytia.

Drůbež - Salmonella typhimurium, Sepullina pilosicoli, virus Markovy choroby, infekční onemocněni burzy, infekční bronchitida, virus Newcastleské nemoci, reovirus, rhinotracheitida krocanů, kouidiosa.

Psi - Leptospira canicola, Leptospira gríppotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira ictero, psí Borrella burgdorferi, psí Ehrlichia canis, psí Bordetella bronchiseptica, psí Giardia iamblia, psinka, psí adenovirus, psí koronavirus, psí parainfluenza, psí parvovirus, vzteklina psů.

Kočka - kočičí Chlamydia psittaci, virus kočičí imunodeficience, virus kočičí infekční peritonitidy, virus kočičí leukemie, kočičí rhinotrachelitida, kočičí panleukopenie, vzteklina koček.

V mnoha případech vede příprava a výroby bakteriálních a virových antigenů pro formulaci do orálně podávaných vakcin podle vynálezu k antigenu s nepřijatelnou chutí, který zvířata odmítají. Pří orálním podávání vakciny buď v pitné vodě nebo sirupu tedy zvířata buď nevypijí tolik vakciny, nebo odmítají sirup a vyplivují jej pro jeho nepříjemnou chuť. Přimíchání chuťově příjemné ochucovací látky do vakcin podle vynálezu podporuje a zvyšuje příjem orálně podávaných vakcin. Tyto chuťově příjemné ochucovací látky se přimíchávají v koncentraci podle použité ochucovací látky, výhodné koncentrace jsou alespoň například přibližně 0,01 % až 1,0 % nebo více.

Kapalné ochucovací látky mohou být do vakcin přidávány kapátkem nebo jinými způsoby. Jestliže jsou ochucovací látky ve formě prášku, mohou se rehydratovat a přidávat do vakcin.

·· ·· vynálezu vepřům nebo v hromadném podávání

- 11 Při podávání orálních vakcin podle drůbeži spočívá výhodný způsob podávání větším skupinám zvířat, která jsou ustájena společně. Vakcina se přidává do pitné vody, kterou zvířata dostávají kontinuálním přidáváním nebo přikapáváním, přičemž zvířata se potom dostanou k pitné vodě a sama si podají vakcinu vypitím vakciny obsažené ve vodě. Jeden příklad zařízení pro kontinuální přidávání nebo přikapávání je zařízení pro automatické proporcionální dávkování přísad do vody nazývané Dosatron™ (Dosatron International lne., Clearwater, Fla.) Ve výhodném provedení poskytuje zařízení pro proporcionální dávkování do vody kontinuální přísun ve vodě rozpustné vakciny/ochucovací látky v malých množstvích a potom poskytuje vodu zvířatům hromadným podáváním do chovného zařízení, například kapáním napájecími vývody.

Při podávání orálních vakcin podle vynálezu hovězímu dobytku, koním, ovcím, kozám nebo jiným hospodářským zvířatům, která jsou trvale ustájena nebo odděleně chována ve chlévě, stáji nebo kotci, je výhodný způsob podávání do kbelíku nebo přes pitnou vodu.

Při podávání orálních vakcin podle vynálezu jednotlivě zvířeti nebo domácímu zvířeti jako je kočka nebo pes, může být vakcina podávána v pitné vodě nebo výhodněji ve formě sirupu. Takový sirup se s výhodou podává do úst zařízením jako stříkačka. Podává se nejvýhodněji na zadní část hrdla. Orální vakciny mohou být formulovány do sirupu způsoby známými v oboru. Neomezující příklady způsobů pro formulaci sirupů je možno nalézt v následujících odkazech:

„Preparation of high conversion syrups by using thermostable amylases from thermoanaerobes“, Saha, B. C.; Zeikus, J. G., Enzyme and Microbial Technology, díl 12, No. 3, str. 229 - 231 (1990);

·· ··

-12- ·· · *..··..· · „Problém of The Mass-Volume Preparation of Medicinal and Table Syrups“, Bondarenko, A. I., Farmatsiya (Moscow), díl 33, No. 6, sír. 70 - 71 (1984);

„Pharmaceutical development of a new syrup formulation versus cough: From test-size batoh až pilot-size batoh“, Renaudeau, P.; Clair, P.; Caire-Maurisier, F., Travaux Scientifiques des Chercheurs du Service de Sante des Armees, díl 0, No. 20 (1999), str. 113 - 114;

„Formulation and evaluation of sustained-release dextromethorphan resinate syrup“, El-Samaligy, M. S.; Mahmoud, H. A.; Omar, I. M., Egyptian Journal of Pharmaceutical Sciences, díl 37, No. 1 6 (1996), str. 509 - 519;

„Pharmacokinetics, efficacy, tolerance of a new formulation of quinine (syrup) in uncomplicated malaria in children“, Rey, E.; ParienteKhayat, A.; D’Athis, P.; Tetanye, E.; Varlan, M.; Olivě, G.; Pons, G., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, díl 18, No. dodatek B (1996), str. 125;

„Therapeutic bioequivalence between drop and syrup formulations of a (dextromethorphan-guaifenesin-menglithate)-based cough suppressanť, Franchi, F., Rivista di Patologia e Clinica, díl 48, No. 3 (1993), str. 149 - 166;

„Continuous preparation of fructose syrups from Jerusalem artichoke tuber using immobilized intracellular inulinase from Kluyveromyces sp. Y-85“, Wei, Wenling; Le Huiying, Wan Wuguang; Wang, Shiyuan, Process Biochem. (Oxford), díl 34, No. 6,7 (1999), str. 643 - 646;

„Syrups for preparation of impact-modified polymers with large particle size“, Doyle, Thomas R., 26. říjen 1999, US patent No. 5,973,079;

’· ·»»· ·· ·»·· „Enzymatic preparation of glucose syrup from starch“, Norman, Barrie Edmund; Hendriksen, Hanne Vang, 16. srpen 1999, WO 99/46399;

„Acrylate syrup composition with good weather resistance“, Makino, Takayuki; Takemoto, Toshio; Yanagase, Akira, 3. srpen 1999, JP No. 99209431 (japonská patentová přihláška No. 199824041-A2);

„Microelement syrup and method of its preparation“, Sviatko, Peter; Bodá, Koloman, 8. červenec 1998, slovenský patent No. 279, 128;

„Monitoring beet sugar evaporator syrup invert and sucrose composition by ion chromatography“, Verceilotti, John R.; Desimon, Frank; Clarke, Margaret A., Proč.Sugar Process. Res. Conf. (1998), str. 442 - 448;

„Preparation of powders from trehalose syrups“, Totsuka, Atsushi; Yamamoto, Takeshi; Umino, Takehiro, 25. květen 1999, JP No. 99140094 (japonská patentová přihláška No. 1997-315993/A2,

31. října 1997);

„Human IGF-I syrup composition and its use“, Shirley, Bret A.; Hora, Maninder S., 20. květen 1999, WO 99/24062;

„The effect of karbohydrate composition of starch syrups on the quality and the stability of foam products“, Nebesny, Ewa; Pierzgalski, Tadeusz; Rosická, Justýna, Zesz. Nauk. - Politech. Lodž, Chem. Spozyw. Biotechnol., díi 58 (1998), str. 69 - 94;

„Preparation of chloral hydráte syrup“, Ishida, Atsuyo; Miyama, Shuho; Mikayama, Hiroki; Teruyama, Shigeo; Takeyasu, Akiko; Ohasi, Atsushi; Okamoto, Kazuaki; Onishi, Toshio; Yasuhara, Akíhíro, Igaku to Yakugaku, díl 40, No. 2 (1998), str. 329 - 333;

„Properties and composition of koncentrates and syrup obtained by microfiltration of saccharified corn starch hydrolyzate“, Singh, ·· ·»·· ·· ··«· ·· ···»

N.; Cheryan, Μ., J. Cereal Sci, díl 27, No. 3 (1998), str. 315 320;

„Process for the preparation of crystallin lactulose from commercial syrups“, Bimbi, Giuseppe, EP No. 622.374-B1;

„Maltitol based sweetening syrup, confections produced using this syrup and the use of a crystalization propagation controlling agent in the preparation of these products“, Ribadeau-Dumas, Guillaume; Fouache, Catherine; Serpelloni, Michel, EP No. 611,527-B1;

„Syrup composition“, Kawasaki, Yoshihiko; Suzuki, Yukio, EP No. 441.307-B1;

„Karbohydrate Syrups and Methods of Preparation“, PATEL, Mansukh, M.; Reed, Michael, A.; Wokas, William, J.; Kures, Vašek, J.; EP No. 241.543-B1;

„Methadone syrup formulation for diabetic heroin drug addict patients“, Gagnaire, L.; Fellous, J.; Dauphin, A.; Bonan, B., Journal de Pharmacie Clinique (Francie), díl 17, No. 4 (1998), str. 264 267;

„Application of solubilizers on the preparation of stable syrups containing Extractum plantaginis fluidum“, Tichy, E., Pharmazie (Německo), díl 52, únor 1997, str. 167 - 168;

„Double-blind, placebo-controlled, pharmacokinetic and dynamic studies with 2 new formulations of piracetam (infusion and syrup) under hypoxia in man“, Saletu, B.; Hitzenberger, G.; Grunberger, J.; Anderer, P.; Rameis, H. a další, International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, díl 33, květen 1995, str. 249 - 262;

„Bioavailability of syrup and tablet formulations of cefetamet pivoxil“, Duchařme, Μ. P.; Edwards, D. J.; McNamara, P. J.; Stoeckel, • ·

K. , Antimicrobial Agents and Chemotherapy, díl 37, prosinec

1993, str. 2706 - 2709;

„Comparison of sprinkle versus syrup formulations of valproate for bioavailability, tolerance, and preference“, Cloyd, J. C.; Kriel, R.

L. ; Jons-Saete, C. M.; Ong, Β. Y.; Remmel, R. P. a další,

Journal of Pediatrics, díl 120, duben 1992, str. 634 - 638;

„Preparation of syrups rich in fructose from tupinambo“, Magro, J.

Regalo Da; Fonseca, Μ. M., Revista Portuguesa de Farmacia (Portugalasko), díl 38, duben-červen 1988, str. 27 - 32;

„The clinical study of cefpodoxime proxetil dry syrup preparation in the pediatrie field“, Kasagi, T.; Tanimoto, K.; Ogihara, Y.; Hayashibara, H.; Okuda, H.; Shiraki, K., Jpn J. Antibiot., díl 47, No. 9, září 1994, str. 1202 - 9; a „Acetaminophen or phenobarbital syrup composition“, Kawasaki, Yoshihiko; Suzuki, Yukio, US patent No. 5,154,926.

Množství připraveného zásobního roztoku vakciny závisí na množství vody, které by každé zvíře vypilo v době vakcinace. Výhodné doby vakcinace jsou od 0,5 do 10 hod pro podávání v pitné vodě v závislosti na antigenu. Množství vody, které každé zvíře vypije, se odhaduje podle průměrné tělesné hmotnosti vakcinovaných zvířat. Při použití zařízení pro automatické proporcionální dávkování do vodyje výhodný způsob následující. Zásobní roztok vakciny se přidá do zařízení pro automatické proporcionální dávkování do vody propojovcí hadicí, která se připojí ze zdroji vody. Zařízení pro proporcionální dávkování do vody čerpá vakcinu spolu s přitékající vodou do potrubí a potom k napájecímu vývodu nebo vývodům (nipple), kterými přitéká pitná voda.

Pro formulaci orálních vakcin podle vynálezu se nejprve zjistí množství vody (na základě tělesné hmotnosti) podávané zvířatům. Celková hmotnost vakcinovaného zvířete nebo zvířat se zjistí

- 16 výpočtem celkového množství vakcinovaných zvířat vynásobeného průměrnou hmotností zvířete. Určí se množství vody potřebné pro hmotnost zvířete nebo zvířat a vypočte se složení vakciny na základě požadovaného množství vody a časového rozpětí, po které se má vakcina podávat. Jeden neomezující příklad typů výpočtů používaných při sestavování a podávání vakcin podle vynálezu vepřům je možno nalézt příkladu 1 a tabulce 2.

Průměrné množství vody podávané zvířatům může určit odborník s běžnou zkušeností v oboru. Neomezující příklady průměrného množství podávané vody je pro: 1) drůbež od přibližně 9,5 do 19 I na 1000 ptáků; 2) pasoucí se krávy minimálně 9,5 I vody/hlavu/den v zimě a až do 45 l/hlavu/den v létě; 3) chovné krávy, jednoleté krávy a dvouletí býčci spotřebují přibližně 38 I vody denně;

4) jatečná telata vypijí 23 až 30 I vody denně; a 5) malá zvířata jako jsou psi a kočky vyžadují přibližně 250 až 1500 ml vody na den.

Před podáváním vakciny podle vynálezu v pitné vodě je výhodné odebrat všechnu pitnou vodu vakcinovaným zvířatům, aby se dosáhlo příjmu pitné vody s vakcinou. Výhodné je odebrat pitnou vodu na noc před podáním vakciny v pitné vodě.

Orální vakciny podle vynálezu mohou být imunizovaným zvířatům podávány v jedné dávce nebo ve dvou dávkách. Výhodný způsob podle vynálezu je podání dvou dávek vakciny.

Následující příklady jsou zamýšleny jako neomezující ilustrace předkládaného vynálezu.

• · · · • · · · · ·

- 17 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Hromadné podávání orální vakcíny vepřům pomocí ochucené pitné vody

Studie imunogenicity byla prováděna s použitím celkem třiceti vepřů stáří 6 týdnů. Z těchto třiceti vepřů bylo dvacet vakcinováno a deset bylo nevakcinovaná kontrola. Všech dvacet vakcinovaných vepřů bylo hromadně vakcinováno vakcinou Erysipelothrix Rhusiopathiae, Avirulent Live Culture, pomocí pitné vody s použitím automatického proporcionálního dávkovače (Dosatron). Druhá vakcinace byla provedena dva týdny po první vakcinaci použitím stejné metody dávkování jako v prvním případě. U všech vakcinovaných vepřů byly sledovány klinické příznaky související s červenkou 8 dnů po každé vakcinaci pro zajištění bezpečnosti vakciny. 21 dnů po druhé vakcinaci byl všem dvaceti vakcinovaným a deseti nevakcinovaným kontrolním zvířatům intramuskulárně podán virulentní kmen Erysipelothrix rhusiopathiae. Všechna sledovaná zvířata byla sledována 7 dnů po podání, přičemž byla měřena teplota a pozorovány klinické příznaky související s červenkou podle 9 CFR 113.7. U žádného z vakcinovaných vepřů se neprojevily klinické příznaky červenky po každé vakcinaci. Po zkušebním podání došlo u 100 % nevakcinovaných kontrolních zvířat k těžkým klinickým příznakům červenky, včetně vysoké teploty, artritidy, ztráty chuti k jídlu, deprese, letargie, celkového zčervenání kůže (poškození kůže kosočtverečného typu) a náhlému úmrtí v průběhu období pozorování. 4 až 6 dnů po testovacím podání uhynulo 70 % kontrolních vepřů. E. rhusiopathiae byl izolován ze všech vzorků odebraných z kontrolních vepřů po testovacím podání nebo při pitvě. Naopak u 100 % vakcinovaných vepřů se neobjevily žádné klinické příznaky červenky. Výsledky z této studie uspokojivě splňují požadavky stanovené v 9 CFR 113.67 na vakcinu proti Erysipelothrix rhusiopathiae. Údaje z této studie ukázaly,

• ♦ · · · ·

- 18 ·· ·· že hromadná vakcinace živou vakcinou Erysipelothrix Rhusiopathiae Vaccine, Avirulent Live Culture, prováděná pomocí pitné vody, je bezpečná a účinná při ochraně vepřů před onemocněním způsobeným E. rhusiopathiae při minimální dávce přibližně 6,06 x 10⁷ CFU na dávku.

Testovací zvířata

Druh:	Vepři
Počet:	30
Stáří:	6 týdnů
Pohlaví:	obojí
Chov:	smíšený
Identifikace:	ušní známka
Zdroj:	chov FDAH SPF

Umístění a péče o zvířata

Všichni vepři byli ponecháni u prasnice až do odstavení ve 21 dnech věku, jak je to pro tento chov standardní. Odstaveným vepřům byla poskytnuta voda a krmivo podle libosti. Nejprve bylo jako krmivo podáváno krmivo bez antibiotik Early Start Feed (Supersweet Brand) a potom bylo krmivo změněno na Start Amino, jak se jevilo místnímu odbornému dohledu vhodné. Vakcinovaná zvířata a kontrolní zvířata byla umístěna po vakcinaci až do testovacího podání ve dvou oddělených místnostech.

Pro podávání vakcíny bylo dvacet vakcinovaných vepřů umístěno do dvou kotců po deseti vepřích na kotec. Každý kotec byl vybaven napájecím vývodem na vodu napojeným na hadici s vodou. Voda k oběma napájecím vývodům procházela stejnými automatickými proporcionálními dávkovači vody (Dosatron). Dva dny před testovacím podáním byli vakcinovaní i nevakcinovaní vepři sloučeni do jedné

0000 • 0 · 0 0 · · > 0 0 0 0 · 0

- 19 místnosti a všem vepřům byl podán virulentní kmen E. rhusiopathiae. Všichni vepři zůstali v této místnosti až do konce období pozorování.

Složení vakcíny

Lyofilizovaný antigen Erysipelothríx rhusiopathiae použitý při této studii byl vyráběn s nejvyšší mírou pasážování (tj. očkovací kultura + 5). Očkovací kultura (Master Seed) antigenu se kultivuje pětkrát. Každá pasáž se postupně označuje jako MS+1, MS+2, MS+3, MS+4 a MS+5.

Uspořádání experimentu

Vepři byli náhodně zařazeni do vakcinované a kontrolní skupiny použitím generátoru náhodných čísel v programu Microsoft Excel. Bylo použito dvacet vakcinovaných zvířat a deset nevakcinovaných kontrolních zvířat ve věku 6 týdnů v čase první vakcinace (příloha 2). Všechna vakcinovaná zvířata dostala dvě vakcinace v odstupu mezi dávkami dvou týdnů. Vakcinovaná zvířata i nevakcinovaná kontrolní zvířata dostala 21 dnů po druhé vakcinaci (21 DPV2) testovací infekční dávku. U obou vakcinaci byla vakcina dodávána v pitné vodě použitím automatického proporcionálního dávkovače (Dosatron). Vzorky séra od vakcinovaných zvířat i kontrolních zvířat byly odebírány v den vakcinace a v den testovacího podání pro účely případné pozdější sérologické analýzy. Sedm dnů po testovacím podání (7DPC) byli všichni živí vepři usmrceni. Z kontrolních vepřů byly po testovacím podání nebo při pitvě odebrány vzorky krve a orgánů pro izolaci E. rhusiopathiae. Vzorky krve na izolaci E. rhusiopathiae byly také odebírány od vakcinovaných zvířat po usmrcení.

• · ·

- 20 • · • · • ·

Záznam experimentu

Postupy	Věk vepřů
První vakcinace	6 týdnů
Druhá vakcinace	8 týdnů
Testovací podání	11 týdnů
Utracení	12 týdnů

Příloha 2

Tělesná hmotnost vepřů použitých při studii

Skupina	ID vepře	Věk při první vakcinaci (dny)	Tělesná hmotnost při první vakcinaci (kg)	Tělesná hmotnost při druhé vakcinaci (kg)
Kontrola	0403	38	7,99	16,39
Kontrola	0404	38	5,90	14,30
Kontrola	0406	38	8,67	16,80
Kontrola	0411	42	9,99	20,16
Kontrola	0417	42	8,17	16,80
Kontrola	0421	42	8,08	16,48
Kontrola	0426	41	8,31	15,39
Kontrola	0429	41	9,31	19,16
Kontrola	0432	41	5,49	13,67
Kontrola	R73	42	7,49	16,48

• * • · · · • · · ·

Vakcinovaný	0401	38	7,81	16,30
Vakcinovaný	0402	38	6,40	14,57
Vakcinovaný	0405	38	6,40	14,16
Vakcinovaný	0407	38	6,40	14,16
Vakcinovaný	0409	42	11,80	20,48
Vakcinovaný	0410	42	8,40	16,57
Vakcinovaný	0412	42	10,49	15,89
Vakcinovaný	0413	42	13,30	21,97
Vakcinovaný	0414	42	4,99	12,67
Vakcinovaný	0416	42	10,31	19,79
Vakcinovaný	0419	42	7,58	14,98
Vakcinovaný	0420	42	10,31	18,98
Vakcinovaný	0422	42	5,68	11,80
Vakcinovaný	0424	41	7,40	13,80
Vakcinovaný	0425	41	9,90	18,48
Vakcinovaný	0427	41	9,17	15,66
Vakcinovaný	0428	41	7,81	16,30
Vakcinovaný	0430	41	8,67	16,57
Vakcinovaný	0431	41	7,81	17,30
Vakcinovaný	R493	38	5,08	12,08
Průměrná hmotnost vakcinovaných vepřů	8,31	16,12

Příprava vakciny

Množství připraveného zásobního roztoku vakciny bylo založeno na množství vody, které by každý vepř vypil v průběhu 6 hodin v období vakcinace. Množství vody a vakcinačního organismu, které by každý vepř vypil, bylo zjištěno podle průměrné tělesné hmotnosti ·· ··· ·

- 22 *··· • · · · ··· · • * · · · · · · dvaceti vakcinovaných vepřů (příloha 3). Ve stručnosti, lyofilizovaná vakcina byla resuspendována v ochuceném (0,5% Givaudan Rouře, Seriál No. C-321110) ředivu. Rehydratovaná vakcina byla přidána do 5 litrů mléčného roztoku obsahujícího odtučněné sušené mléko a dobře zamíchána. Zásobní roztok vakciny byl dále naředěn na 7 litrů vodou a potom byl zásobník uložen na míchací desku pro další míchání. Tento zásobní roztok byl potom napojen na automatický proporcionální dávkovač vody propojovací hadicí a zařízení bylo připojeno na zdroj vody.

Příloha 3

Vypočet odhadnutého množství vakciny spotřebované v období vakcinace

První vakcinace

1. Průměrná tělesná hmotnost vakcinovaných zvířat byla 18,3 lb (8,31 kg).

2. 18,3 lb(8,31 kg)/100 lb (45,4 kg) x 946 ml = 173 ml. Tento výpočet je založen na předpokladu, že vepř o hmotnosti 100 lb (45,4 kg) vypije 1 gallon (3785,4 ml) vody v průběhu 24 hod, tj. vepř o hmotnosti 100 lb (45,4 kg) vypije 946 ml vody během šestihodinového období vakcinace.

3. Každá lahvička vakciny obsahovala 4,12 x 10¹° CFU (2,06 x 10⁹ CFU/ml x 20 ml).

4. Cílová CFU na dávku z napájecích vývodů byla 1 x 10⁸ CFU včetně ztrát od nádoby zásobního roztoku k napájecím vývodům.

5. Aby každý vepř dostal 1 x 10⁸ CFU ve 173 ml, koncentrace vakcinačního organismu z napájecích vývodů musela být 5,8 x 10⁵CFU/ml (1 x 10⁸ CFU/173 ml).

• 4 ····

4 4 4 4 4 · 4 ·

6. Pro získání 5,8 χ 10⁵ CFU/ml z napájecích vývodů musela být koncentrace zásobního roztoku vakciny 7,42 χ 10⁷ CFU/ml (5,8 χ 10⁵CFU/ml x 128* = 7,42 χ 10⁷ CFU/ml).

7. Pro zajištění, aby z napájecích vývodů kontinuálně vytékala vakcina po dobu 6 hodinového období vakcinace bylo zapotřebí 7 litrů zásobního roztoku. Celkový počet CFU v zásobním roztoku byl 7,42 x 10⁷ CFU/ml x 7000 ml = 5,19 χ 10¹¹ CFU.

8. Třináct (13) lahví lyofilizované vakciny bylo rehydratováno ředivem, přičemž množství rehydratované vakciny bylo ekvivalentní

12,6 lahvičkám (5,19 χ 10¹¹ CFU/4,12 χ 10¹° CFU/láhev = 12,6 lahví), a toto množství bylo smíseno s odtučněným mlékem a vodou pro získání zásobního roztoku.

Druhá vakcinace

1. Průměrná tělesná hmotnost vakcinovaných zvířat byla 35,5 Ib (16,12 kg).

2. 35,5 lb(16,12 kg)/100 Ib (45,4 kg) x 946 ml = 336 ml. Tento výpočet je založen na předpokladu, že vepř o hmotnosti 100 Ib (45,4 kg) vypije 1 gallon (3785,4 ml) vody v průběhu 24 hod, tj. vepř o hmotnosti 100 Ib (45,4 kg) vypije 946 ml vody během šestihodinového období vakcinace.

3. Každá lahvička vakciny obsahovala 4,12 x 10^w CFU (2,06 x 10⁹ CFU/ml x 20 ml).

4. Cílová CFU na dávku z napájecích vývodů byla 1 χ 10⁸ CFU včetně ztrát od nádoby zásobního roztoku k napájecím vývodům.

5. Aby každý vepř dostal 1 χ 10⁸ CFU ve 336 ml, koncentrace vakcinačního organismu z napájecích vývodů musela být 2,98 χ 10⁵CFU/ml (1 χ 10⁸ CFU/336 ml).

·♦ ·»»· *· ··»· ·» ···· • · ··· ··· · • · · · · · ··· • · · ···· ···· • · · · · · · · · · ·

- 24 6. Pro získání 2,98 x 10⁵ CFU/ml z napájecích vývodů musela být koncentrace zásobního roztoku vakciny 3,81 x 10⁷ CFU/ml (2,98 x 10⁵ CFU/ml x 128* = 3,81 x 10⁷ CFU/ml).

7. Pro zajištění, aby z napájecích vývodů kontinuálně vytékala vakcina po dobu 6 hodinového období vakcinace bylo zapotřebí 7 litrů zásobního roztoku. Celkový počet CFU v zásobním roztoku byl 3,81 x 10⁷ CFU/ml x 7000 ml = 2,67 x 10¹¹ CFU.

8. Sedm (7) lahví lyofilizované vakciny bylo rehydratováno ředivem, přičemž množství rehydratované vakciny bylo ekvivalentní 6,47 lahvičkám (2,67 x 10¹¹ CFU/4,12 x 10¹° CFU/láhev = 6,47 lahví), a toto množství bylo smíseno s odtučněným mlékem a vodou pro získání zásobního roztoku.

*Dodávací poměr proporcionálního dávkovače byl nastaven na 1 : 128.

Příprava vodního systému, orálně podávaná vakcina a postup vakcinace

Postup

Pro výpočet množství zásobní vakciny použité v průběhu období vakcinace byla zjištěna u každého vakcinovaného vepře den před vakcinací tělesná hmotnost (příloha 2). Přes noc (alespoň 8 až 10 hod) před vakcinací nebyla zvířatům k dispozici voda, která byla znovu přivedena vepřům po zahájení vakcinace. Vakcinace trvala 6 hod pro zajištění, aby vepři spotřebovali odhadnuté množství vakciny. V době první vakcinace bylo připraveno 7 litrů zásobní vakciny, jak bylo popsáno výše, aby bylo zajištěno, že bude z napájecích vývodů kontinuálně vytékat v průběhu 6 hod dostatečné množství vakciny. Zařízení Dosatron bylo napojeno na nádobu se zásobním roztokem a proporcionální dávkovač vody byl nastaven na poměr 28 g (1 unce) na 3,786 I (1 gallon) vody přiváděné k vakcinovaným vepřům. Automatické poměrové dávkovači zařízení napájelo paralelně dva ·· ··«· ·· ··«« • · ··· · • * ··· · · · · • · · ··· · · · • · · ·♦» 9 9 9 9 9 _ _ * - * 9 9 9 9 9 9 9 9

- 25 - ·· · ........

napájecí vývody (jeden vývod na kotec) a dodávalo vakcinu ke dvěma napájecím vývodům současně. Zásobní množství vakciny bylo umístěno na míchací desce pro zajištění míchání po celou dobu vakcinace. Vzorky z těchto dvou napájecích vývodů byly odebírány každou hodinu po zahájení přivádění. Počet životaschopných bakterií byl testován na agarových plotnách TSA II s 5 % ovčí krve. Pro každý vzorek bylo použito pěti ploten.

V případě druhé vakcinace byl postup rehydratace vakciny, nastavení proporcionálního dávkovače vody a odebírání vzorků stejný jako u první vakcinace.

Vypočet vakcinační dávky

Koncentrace vakciny a zjištění dávky v pitné vodě jsou ukázány v příloze 4. Průměrný počet životaschopných buněk ze dvou napájecích vývodů při první vakcinaci byl 3,50 χ 10⁵ CFU/ml a odhadované množství vody spotřebované každým vepřem bylo přibližně 173 ml, přičemž množství bylo určeno na základě tělesné hmotnosti ve skupině a publikované spotřebě vody. Počet CFU na dávku skutečně podaný každému vepři byl stanoven na 3,50 χ 10⁵CFU/ml x 173 ml = 6,06 χ 10⁷ CFU.

Podobně byl zjištěn průměrný počet životaschopných buněk u dvou napájecích vývodů u druhé vakcinace 1,42 χ 10⁵ CFU/ml a množství vody, které by spotřeboval každý vepř, bylo přibližně 336 ml. Proto byl počet CFU na dávku skutečně podanou každému vepři při druhé vakcinaci vypočten jako 1,42 χ 10⁵ CFU/ml x 336 ml = 4,77 x 10⁷CFU.

• Φ ·««· φφ φφ<φ φφ Φ··Φ

- 26 φφ φ φ · φ · • φ · • φ · · · • · · φ φ • φ φ φ

Příloha 4

Potvrzení životaschopnosti vakciny a zjištění dávky v pitné vodě

Vakcinace	Vzorek odebraný po počáteční vakcinaci v čase (hod)	Napájecí vývod 1 (CFU/ml)	Napájecí vývod 2 (CFU/ml)
První	0	2,81 E + 05	2,68 E + 05
První	1	3,86 E + 05	2,86 E + 05
První	2	2,91 E + 05	3,48 E + 05
První	3	3,57 E + 05	3,71 E + 05
První	4	4,45 E + 05	4,24 E + 05
První	5	4,73 E + 05	4,34 E + 05
První	6	2,74 E + 05	2,54 E + 05
První	Průměr	3,58 E + 05	3,41 E + 05
	Průměr ze dvou vývodů	3,50 x 10^Λ5 CFU/ml

Odhadované množství vody (ml) spotřebované každým vepřem

18,3 lb/100 lb. x 946 ml* = 173 ml (1 lb = 0,454 kg)

CFU/vepř ve skutečně podané dávce

3,50 x 10^Λ5 CFU/ml x 173 ml/dávka na vepře = 6,06 x 10^Λ7 CFU/dávka na vepře

- 27 ·♦ ··«<* ·» *··· ** ·««· • 4 • · 4 ·* ·«

Vakcinace	Vzorek odebraný po počáteční vakcinaci v čase (hod)	Napájecí vývod 1 (CFU/ml)	Napájecí vývod 2 (CFU/ml)
Druhá	0	1,63 E + 05	1,26 E + 05
Druhá	1	1,02 E + 05	1,08 E + 05
Druhá	2	1,31 E + 05	1,35 E + 05
Druhá	3	1,59 E + 05	1,59 E + 05
Druhá	4	1,88 E + 05	1,80 E + 05
Druhá	5	1,54 E + 05	1,51 E + 05
Druhá	6	1,43 E + 05	8,50 E + 04
Druhá	Průměr	1,49 E + 05	1,35 E + 05
	Průměr ze dvou napájecích vývodů	1,42 x 10^Λ5 CFU/ml

Odhadované množství vody (ml) spotřebované každým vepřem

35,5 lb/100 Ib. x 946 ml* = 336 ml (1 Ib = 0,454 kg)

CFU/vepř ve skutečně podané dávce

1,42 x 10^Λ5 CFU/ml x 336 ml/dávka na vepře = 4,77 x 10^Λ7 CFU/dávka na vepře

*946 ml je založeno na výpočtu, že vepř o hmotnosti 100 Ib (45,4 kg) by vypil 1 gallon (3785,4 ml) vody v průběhu 24 hod, tedy vepř o hmotnosti 100 Ib (45,4 kg) by vypil 946 ml vody v průběhu 6 hod v období vakcinace.

·» «··· t« ···· ·· ···· • · · · · · » * · • · · ··· ·*· • · · 9 · · · · · · ··· ···· · ·9 ·

- 2o - ·· ♦ ·· ·· ·· ··

Srovnání počtu životaschopných buněk vakcinačního organismu mezi vzorky zásobního roztoku a napájecího vývodu

Byl porovnáván počet životaschopných buněk vakcinačního organismu mezi zásobním roztokem a vzorky napájecích vývodů. Výsledky při první a druhé vakcinaci jsou ukázány v tabulce 1, popř. v tabulce 2. Při první vakcinaci byl průměrný počet životaschopných buněk v zásobním roztoku 1,36 x 10⁸ CFU/ml. Průměrný počet CFU/ml ze dvou napájecích vývodů byl 3,49 x 10⁵ CFU/ml a průměrná teoretická hodnota CFU/ml (průměr CFU/ml zásobního roztoku/128) byl 1,06 x 10⁶ CFU/ml. Rozdíl mezi průměrem z napájecích vývodů a teoretickou koncentrací měl hodnotu 0,48 log. Podobně při druhé vakcinaci byl průměrný počet životaschopných buněk v zásobním roztoku 3,51 x 10⁷ CFU/ml. Průměr CFU/ml ze dvou napájecích vývodů byi 1,42 x 10⁵ CFU/ml a průměrná teoretická hodnota CFU/ml (průměr CFU/ml zásobního roztoku/128) byl 2,74 x 10⁵ CFU/ml. Rozdíl mezi průměrnou hodnotou z napájecích vývodů a teoretickou koncentrací měl hodnotu 0,29 log. Údaje poskytnuté touto studií ukazují, že průměrná koncentrace při dodávání mezi vzorky z napájecích vývodů a zásobním roztokem nebyla příliš vzdálená od očekávané hodnoty (tj. méně než 0,5 log) a spadá do normálního rozmezí očekávaného pro stanovení CFU.

·· · ···

CN

Tabulka 1 £

φ

O

4-1

N

O £

'c n

o w

-Π3

N

Ň

Φ £

£

C/3 ’c σ

L_ o

o .c 'c >o c

Ό .χ.

>

><D

C

3!

.Ω _£3

O

->

c

Q

O _c o

w

4—>

O >

>N

4>O

O

Q '£

C >

O o

Ct

Φ

O £3 'ϋ

J«í >

C >

L_

CL »33

T3

O >

->

>

X3

O 'o

Φ

Q

C

N >

ΙΟ

N >

Rozdíl mezi průměrem	z napájecích vývodů	a teoretickou hodnotou	CFU/ml (hodnota log)	-0,886	CN v* Ν’ θ' t	-0,348	CO O CO O* 1	-0,560	-0,213	-0,427	N“ 00 N; o
'(ϋ				CD	LD	LD	LD	co	LD	LD	CD
Jsi O M—>	<0 o	E		o +	0 +	0 +	0 +	+	0 +	0 +	0 +
<D	c	30		LU	X	X	X	X	X	X	X
	□	LL			h-	CO	X—	V	CD	CD
03	o ,r~	O		T-_	co	y.	N_	CO LD	N;	C3	o
H				CN	co			v-	>-	Γ*'-
	oj
Z3	T3
O >	O >			LD	LD	LD	ID	ID	LD	LD	LD
TJ		L—'		O	O	O	O		O	O	O
(D N	JZ o	E 5		+ LLJ	+ X	+ X	+ LU	35E +	+ LU	+ X	+ LU
><ΰ	ϋ	LL		LD	co	o	xf	N“	N	CT)
ε	0)	O		h-	co	CN	co_	LD	CO	Ν'
O	-ra'			CN	co	CO~	co~		N	CN	CO
	Q_
0-	CD
	C
Ό								05
O > '>»		o		05	05	05	05	05	05	05
>		£		+	+	+	+	+	+	+	+
O	CN	33)		IX	X	X	X	X	X	X	X
Φ		LL		CO	CD	CO	T—	Ν’	N“	T“
'CD Q_ CD		O		2,6	2,8	3,4	3,7	CN Ν'	4,3	2,5	3,4
2
TJ								05
o > '>1				05	05	05	05	05	05	05
>		^E		+	+	+	+	+	+	+	+
o	τ-	30		X	X	X	X	4,45E	X	X	X
o		LL		T“	co	T“	μ-	CO	Ν’	CO
‘CD Q_ CD		O		co CN	oo co	CD CN	3,5	r- N*	r- CN	3,5
2
J£								00
O				co	co	r^·	μ-	b-	b-	00
N				o	o	o	O		O	o	o
O u.	£			+	+	+	+	+	+	+	+
c	O			X	X	X	X	02E	X	X	X
_Q	LL			o	V“	IN	co	co	N*	co
o	O			r-	τ—	τ^-	Ν'	Ν’	O	co
<0 “CD				CN	τ—	CD	CT)	CN	ctT	CT)	T“~
N

Jsi	03										>03
0) u. O N	ω CD >o	“O o -C		O	-	CN	CO	Ν'	LD	co	E o u_
>	>										X

CN >φ £

o

S3L 'o >

T3

O

Ό

c.

c

Φ >

4—» ω

c >X3 >C3 >

O rZ >

ΊΞ

C

O o

ΙΟ

Q.

O

1—

CL

Teoretická hodnota CFU/ml byla vypočtena na základě zásobního roztoku/128.

IO • · • · « ·* · ··

I

O

CO

CN

CU

Z5 n

cu

H

E

CD

O

N

O

E 'c _Q

O ω

'CU

N

Ň

CD

E

Σ3

E ω

c cu σ

L_

O o

Ξ 'c >o cu c

Ό cu >

><D c

Z3

X2 x:

o '>

c

Q

O x:

o ω

(U o

>

>N

Z3 *4—>

>o o

Q

Έ 'CU c

>

o o

Q

CD

O

CU c

Ό

CU >

'CU

JC.

Z3

Q <0

T3

O >

'>

>

jC

O '0

CD 'CU

Q

CU c

N >

JZ

L.

O

N >

CU

Rozdíl mezi průměrem	z napájecích vývodů	a teoretickou hodnotou	CFU/ml (hodnota log)	-0,239	-0,419	-0,305	-0,254	-0,191	-0,269	-0,370	-0,286
'CO				lO	tO	to	to	to	to	to	to
O	* <0 N—· O	E		+ 0	0 +	0 +	0 +	0 +	+ 0	0 +	0 +
Φ	c	Z)		X	X	X	X	X	X	X	X
	Ό	IX		V-	CD	σ>	to	co		r-	Ν’
Φ	O C	0		tO	Γ-_	co	co	00	CO	<0	l·-
H				CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN
	O
□	TJ
0	O
>	>			10	tO	10	to	to	IO	to	to
Ό		^E“		0	O	0	O	O	O	0	O
Φ fcj	-C	E		+	+	+	+	+	+	+	+
	0	Z)		X	X	X	X	X	X	X	X
>Φ	0	X		10	to	co	05	Ν'	co	Yf	CN
E	Φ	0		*4·	0	co	IO	CO	to	Y“	N^-

<0	'(0			V	γ-	y~	Y”	Y“	Y“
	CL
0.	CO
	c
O
0 >				to	LO	to	UO	10	to		to
'>		íEE'		0	O	0	O	0	0	0	0
>		E		+	+	+	+	+	+	+	+
0	CN	=)		X	X	X	X	X	X	X	X
Φ		LL		<0	co	to	05	0	Y“	0	to
-co		0		CN	0	co	IO	00	to	to	co
Q. CD				T—	Y”	v-'	T-·	τ—	Y“	co’	-r-'
z
Ό
O >				UE)	to	to	to	to	10	to	to
		L_'		O	0	0	0	0	0	0	0
>		E		+	+	+	+	+	+	+	+
O	t—	Z		X	X	X	X	X	X	X	X
Φ		X		co	CN	r—	σ	co	Ν'	co	σ>
'CO		O		co	0	CO	to	00	to
CL CD				Y“	v-	v-	Y“	Y-	v-	Y—	Y“
ž

0				X	N-	b-	r^-	h-	h-		r-
N	CE?			0	O	0	0	0	O	0	0
O u-	E			+	+	+	+	+	+	+	+
c	=5			X	X	X	X	X	X	X	X
_Q	IX.			T—	co		UO	co	co	CN	Y-
O	O			CN	LO	N-_	CO	co_	CD	'•šT	10
w				CO	co’	CO	co	co’	co’	co’	co
Ň

	0)										>φ
Φ L. O N	w co >0	X5 O jC		O	Y“	CN	co		co	co	E <0
>	>										X

ca

CN ><D

E o

Q.

'5

CU >

'CU

O

T3

CU c

c

CD >

CU

-4—I « cu c

-Q >O

CU >

O

Jťí >

'CU

T3 c

'CU c

o o

ιΟ

Q.

O

u.

Q_

• · · · • ·· · • 9

- 31 Pozorování po každé vakcinaci

Vakcinovaní vepři byli pozorováni na klinické příznaky související s červenkou po dobu 8 dnů po každé vakcinaci, aby se zjistila bezpečnost vakciny. V průběhu období pozorování byly také denně měřeny rektální teploty.

Pozorování a postupy testovacího podávání

Tři týdny po druhé vakcinaci byl všem vepřům vakcinované i kontrolní skupiny podán virulentní kmen E. rhusiopathiae. Testovací io kmen (E1-6P, IRP ERC Seriál 4, USDA, APHIS, CVB-L, 9-97 challenge) byl připraven jak je popsáno v SOP # a11-015-02 (£. rhusiopathiae sérotyp 1, testovací podání pro SPF vepřů). Ve stručnosti, kultura byla získána od CVB-L, Ames, lowa, a pěstována v modifikovaném Feistově médiu. Byl určen počet CFU/ml a potom byla kultura zamrazena pro skladování. Pro testovací podání byl zamrazený zásobní roztok rychle roztaven a každý vepř dostal 1 ml testovací kultury intramuskulárně do oblasti krku. Podaná dávka (5,7 x 10⁴ CFU/ml) byla potvrzena počítáním CFU testovacího materiálu na plotnách krevního agaru TSA II před a po testovacím podání. Všichni vepři byli pozorováni na výskyt klinických příznaků červenky a 2 dny před a 7 dnů po testovacím podání byly měřeny rektální teploty podle 9 CFR 113.67.

Podrobný protokol provádění experimentu s testovacím podáním je uveden níže.

A. Materiály

1. Ochranné pomůcky (rukavice, plášť a bezpečnostní brýle).

2. Jedna lahvička, E. rhu. kmen E1-6P IRP ERC Seriál 4-9/97, první pasáž z testovací kultury NVSL.

···· • · • · · · • · · ·

- 32 3. Sterilní půda Tryptic soy broth.

4. Vepři citliví na onemocnění z chovu SPF.

5. Stříkačky.

6. Jehly.

7. Rektální teploměr.

8. Sterilní pipety.

9. Sterilní ředicí zkumavky.

10. Plotny krevního agaru.

11. Sterilní očkovací smyčky. io 12. Automatická pipeta 200 pl.

13. Sterilní pipetovací špičky.

B. Metody

1. Ochranné oblečení a pomůcky Don (rukavice, plášť a brýle) pro ochranu ošetřovatele před možnými riziky. Erysipelothríx rhusiopathiae je známý lidský patogen, který může způsobit septikémii, poškození kůže, artritidu a/nebo smrt. Přenáší se tělesnými tekutinami a otevřenými poraněními. Jakákoli možná expozice by měla být okamžitě oznámena.

2. Ve dnech -2, -1 a 0 před testovacím podáním se změří rektální teplota (hodnoty slouží jako výchozí teplota každého vepře). Teploty se zaznamenají.

3. Za aseptických podmínek se připraví testovací materiál (E. rhu. kmen E1-6P IRP ERC Seriál 4-9/97) bezprostředně před podáním. Lahvička kultury se rychle rozmrazí třením v rukou.

Zaznamená se čas roztavení inokula do přílohy II. Inokulum v lahvičce se mírně protřepe a zředí půdou Trypticase Soy Broth (TSB) na konečnou koncentraci 6,5 x 10⁴ CFU/ml následujícím způsobem: koncentrace inokula je přibližně 2,15 x 10⁷ CFU/ml).

Asepticky se přidá 0,5 ml testovacího očkovacího materiálu do

4,5 ml sterilní TSB (zkumavka 1 - 2,15 x 10⁶ CFU/ml). Zkumavka se udržuje při teplotě laboratoře 15 min, potom se zkumavka 1 důkladně promíchá a 3,0 ml ze zkumavky 1 se přidá 7,0 ml sterilní půdy TSB (zkumavka 2 - 6,5 x 10⁵ CFU/ml). Zkumavka 2 se důkladně promíchá a za aseptických podmínek se připraví ředění 1 : 10 ze zkumavky 2 v půdě TSB (zkumavka 3 - 6,5 x 10⁴ CFU/ml). Připraví se dostatečné množství tohoto ředění pro podání příslušnému počtu vepřů (jestliže je tedy potřeba podat 25 vepřům dávku 1,0 ml testovacího materiálu 6,5 x 10⁴ CFU/ml, připraví se alespoň 30 ml testovacího materiálu 6,5 x 10⁴CFU/ml. K tomuto účelu se přidá asepticky 3,0 ml materiálu ze zkumavky 2 k 27,0 ml sterilní půdy TSB.) Veškerý testovací materiál a zkumavky použité pro ředění se uchovávají na ledu až do použití.

Určí se koncentrace testovacího materiálu. Důkladně se zamíchá zkumavka 3 a asepticky se přidá 0,5 ml materiálu ze zkumavky 3 ke 4,5 ml sterilního TSB (zkumavka 4 - 6,5 x 10³CFU/ml). Zkumavka 4 se důkladně zamíchá a asepticky se přidá 0,5 ml ze zkumavky 4 k 7,0 ml sterilního TSB (zkumavka 5 - 4,3 x 10² CFU/ml).

Označí se tři plotny ovčího krevního agaru (SBA) nápisem „zkumavka 5 - před podáním E. rhusiopathiae“, datem a iniciálami. Důkladně se zamíchá zkumavka 5 a asepticky se odeberou tři oddělené alikvoty 0,1 ml ze zkumavky 5 a napipetují se na tři plotny SBA. Použitím sterilní očkovací kličky se vzorky rozetřou na povrchu ploten SBA, aniž by došlo k přílišnému přiblížení k okraji. Plotny se inkubují 20 až 48 hod při 37 °C. Zaznamená se čas vysetí předběžného testování CFU. Všechny ředicí zkumavky se umístí na led.

Všem vepřům se do krčního svalu podá 1,0 ml i.m. testovacího materiálu ze zkumavky 3 (6,5 x 10⁴ CFU/ml) připraveného v kroku IV. B. 3. Zaznamená se, do které strany krku byl materiál vstříknut. Veškerý testovací materiál se v průběhu podávání udržuje na ledu.

7. Po podání vepřům se důkladně smíchá obsah zkumavky 5. Označí se tři plotny SBA nápisem „zkumavka 5 - po podání E.

rhusiopathiae“ a datem. Asepticky se odeberou 0,1 ml alikvoty ze zkumavky 5 a napipetují se na tři plotny ovčího krevního agaru. Pro rozetření vzorků na povrchu ploten SBA se používá sterilní očkovací klička, aniž by došlo k přílišnému přiblížení k okraji plotny. Plotny se inkubují 20 až 48 hod při 37 °C. io Zaznamená se čas vysetí pro zjištění CFU po podání a vypočte se čas od doby rozmražení testovacího materiálu až do provedení testu na CFU po podání.

8. Měří se a zaznamenává teplota každého vepře po sedm za sebou následujících dnů. Každý vepř se testuje na klinické příznaky červenky (deprese s anorexií, ztuhlost a/nebo postižení kloubů, úmrtnost s nebo bez metastatických kožních poškození) a všechna pozorování se zaznamenávají. Provádí se také kontrola a záznam veškerých reakcí v místě injekce, generalizované zčervenání kůže, nechutenství nebo cyanóza.

9. Veterinární lékař by měl provést pitvu a určit příčinu smrti každého vepře, který uhyne v průběhu studie, ale u kterého se nevyvinou klinické příznaky červenky.

10. Veškerý zbylý materiál použitý pro testování se likviduje spálením nebo autoklávováním.

11. Počítá se průměrný počet kolonií na plotnách v duplikátech a výsledky se zaznamenají.

C, Vypočty/interpretace

1. Kontrolní vepř je považován za pozitivní na červenku, jestliže se u něj vyskytují klinické příznaky a/nebo teplota vyšší než 40,9 °C • · •

• · · · • · · ·

• · · · · · · ·♦ · ·· ··

-35 po dva za sebou následující dny (kromě dnů před testovacím podáním) (viz 9 CFR § 113.67). Zvířata splňující kritéria na pozitivitu mohou být léčena penicilinem pro zmírnění bolesti a zbavení stresu podle úsudku vedoucích pracovníků nebo ošetřujícího veterinárního lékaře.

2. Aby mohlo být testovací podání považováno za platné, musí se u alespoň 80 % kontrolních zvířat projevit pozitivní příznaky červenky v době pozorování (viz 9 CFR § 113.67).

3. Průměrný počet kolonií se vynásobí konečným ředěním, které io bylo vyseto. Vypočte se průměr koncentrací v CFU před a po testovacím podání. Průměrná koncentrace testovacího materiálu by měla být mezi 5 χ 10⁴ a 9 χ 10⁴ CFU/ml.

Klinické příznaky a teplota po první vakcinaci

Všichni vakcinovaní vepři byli pozorování po dobu 8 dnů po vakcinaci, přičemž u žádného z nich se neobjevily žádné klinické příznaky spojené s červenkou. U většiny vepřů byla naměřena v období pozorování po vakcinaci normální teplota kromě dvou, kteří měli jeden den teplotu 40,33 °C čtvrtý den, popřípadě pátý den po

2o první vakcinaci. U těchto dvou vepřů nebyly pozorovány žádné klinické příznaky. Někteří z vakcinovaných vepřů měli po dobu pozorování teplotu o 0,56 °C (1 °F) vyšší než základní teplotu, která mohla být důsledkem podráždění vepřů v průběhu manipulace. Podobně u některých nevakcinovaných kontrolních zvířat se vyskytly jednodenní nebo dvoudenní vyšší teploty bez jakýchkoli klinických příznaků.

Klinické příznaky a teplota po druhé vakcinaci

V období 8 dnů po druhé vakcinaci se neprojevily u žádného z vakcinovaných vepřů klinické příznaky související s červenkou.

3o Všichni vepři měli normální teplotu po dobu období pozorování, kromě • · ♦ · · · • · · ·

- 36 jednoho vepře, který měl šestý den po vakcinaci teplotu 40,11 °C a dalšího vepře, který měl teplotu pátý a šestý den po druhé vakcinaci 40,06 °C. U obou z těchto vepřů se neobjevily v období pozorování žádné klinické příznaky. Podobně u jednoho kontrolního zvířete se vyskytl jednodenní vzestup teploty na 40,17 °C sedm dnů po druhé vakcinaci, bez jakýchkoli klinických příznaků.

Klinická pozorování po testovacím podání dnů po druhé vakcinaci byl dvaceti vakcinovaným zvířatům a io deseti kontrolním podán virulentní kmen E. rhusiopathiae. Všichni vepři byli pozorování na výskyt klinických příznaků souvisejících s červenkou a dva dny před testovacím podáním sedm dnů po něm byly měřeny rektální teploty.

is Klinické příznaky u kontrolních vepřů po testovacím podání

U všech nevakcinovaných kontrolních zvířat (100 %) se vytvořily těžké klinické příznaky související s červenkou, včetně generalizovaného zčervenání kůže (poškození kůže kosočtverečného typu), letargie, anorexie, deprese a náhlého uhynutí. Čtyři dny po testovacím podání uhynula čtyři kontrolní zvířata, a to 0404, 0417, 0421 a 0432. Vepři 0406 a R73 byli nalezeni mrtví pátý den po testovacím podání a vepř 0403 uhynul šestý den po testovacím podání. Sedm dnů po testovacím podání bylo uhynulých sedm z deseti (70 %) kontrolních vepřů. Vepř 0403 měl teplotu pátý den po testovacím podání před smrtí 40,94 °C, vepři 0404 a 0406 měli před smrtí teploty 38,50, popř. 39,11 °C. Vepři 0417, 0421, 0432 a R73 měli před smrtí teploty 40,67, 40,50, 37,50, popř. 40,89 °C. S vážnými klinickými příznaky přežili tři kontrolní vepři, 0411, 0426 a 0429.

* ·· · • · · · · φ

- 37 Klinické příznaky vakcinovaných vepřů po testovacím podání

U 100 % (20 z 20) vakcinovaných zvířat se neprojevily po dobu pozorování žádné typické klinické příznaky související s červenkou. U vepře 0409 se ukázalo zčervenání v místě injekce druhý den po testovacím podání. U žádného z testovacích vepřů nebyla teplota po dobu pozorování po testovacím podání vyšší než 40,00 °C. Údaje získané u vakcinovaných vepřů ukázaly, že 100 % vakcinovaných zvířat bylo chráněno před účinky testovacího podání E. rhusiopathiae. Tyto výsledky uspokojivě splňují požadavky 9 CFR pro zařazení io vakciny jako úspěšné pro ochranu vepřů před infekcí E. rhusiopathiae.

Izolace E. rhusiopathiae z vepřů po testovacím podání

Izolace E. rhusiopathiae byla prováděna z krve, sleziny, jater a mezenterických lymfatických uzlin získaných od kontrolních vepřů po testovacím podání, nebo při pitvě, jak bylo pozorováno, E. rhusiopathiae byl izolován ze vzorků získaných z kontrolních vepřů 0403, 0406, 0411, 0426, 0429 a R73. Vepři 0404, 0417, 0421 a 0432 byli nalezeni mrtví v den 4 po testovacím podání a v tu dobu nebyly odebrány žádné vzorky. Vzorky krve byly také odebrány od vakcinovaných vepřů 7 dnů po testovacím podání, přičemž od vakcinovaných vepřů nebyl izolován žádný E. rhusiopathiae. Výsledky izolace E. rhusiopathiae od kontrolních vepřů splňují požadavky 9 CFR na platné testovací podání kmene E. rhusiopathiae.

Závěry

Údaje z této studie ukazují, že ochucená vakcina podle vynálezu, v tomto případě obsahující živou vakcinu Erysipelothrix Rhusiopathiae Vaccine, Avirulent Live Culture, podávaná hromadně způsobem podle vynálezu, v množství přibližně 6,06 x 10⁷ CFU/dávku

3o prostřednictvím pitné vody, a s použitím automatického • · · · ♦ · • · proporcionálního dávkovače, je účinné a bezpečné pro ochranu vepřů před onemocněním způsobeným E. rhusiopathiae. Výsledky z této studie uspokojivě splňují požadavky uvedené v 9 CFR 113.67 a kvalifikují vakcinu Erysipelothrix Rhusiopathiae Vaccine, Avirulent Live

Culture, pro udělení licence.

Příklad 2

Srovnání orálně podávané ochucené vakcíny s neochucenou vakcinou

Aby bylo možno prokázat, že ochucená orálně podávaná io vakcina podle vynálezu poskytla vyšší ochranu proti infekci než neochucená, byl použit podobný protokol vakcinace jako bylo popsáno v příkladu 1, s použitím vakcíny ochucené jahodovou příchutí s lyofilizovaným Erysipelothrix rhusiopathiae jako antigenem, neochucené vakcíny s lyofilizovaným Erysipelothrix rhusiopathiae jako antigenem a kontrolní formulací bez přidané příchuti nebo antigenu. Všechny vakcíny a kontrolní preparátu byly připraveny podle popisu v příkladu 1. Všechny experimenty s testovacím podáním byly provedeny podle popisu v příkladu 1.

Experimenty a získané údaje jsou popsány v následujících tabulkách:

Tabulka 4

Podávání ochucené vakcíny - studie I

Skupina	Dávka na 1 vepře	Počet vepřů	% ochrany po testovacím podání
1	jedna dávka 5 x 10⁷	5	100 %
2	jedna dávka 5 x 10⁸	5	100 %
3	jedna dávka 5 x 10⁷	5	100 %
4	jedna dávka 5 x 10⁸	5	100 %

• · · · · · • ·· ·

- 39 • ·

Kontrola

NA

8

NA-100 % onemocnění

Tabulka 5

Podávání ochucené vakciny - studie II

Skupina	Dávka na 1 vepře	Počet vepřů	% ochrany po testovacím podání
Vakcinovaná zvířata	jedna dávka 1 x 10⁷	20	50 %
Kontrola	NA	10	NA-100 % onemocnění

Vakcinovaná zvířata	dvě dávky 1 x 10⁷/dávku	20	75 %
Kontrola	NA	10	NA-100 % onemocnění

Tabulka 6

Podávání neochucené vakciny

Skupina	Dávka na 1 vepře	Počet vepřů	% ochrany po testovacím podání
1	jedna dávka 1 x 10⁷	21	10 %
2	jedna dávka 2 x 10⁷	18	22 %
Kontrola	NA	10	NA-100 % onemocnění

Příklad 3

Aby bylo možno ukázat, že antigen je ve vakcinách bez io ochucení účinný, vepřům byla podána jedna dávka vakciny formulované bez příchuti stříkačkou. Tyto údaje jsou uvedeny v tabulce 7 níže a ukazují, že antigen je aktivní a poskytují důkaz, že příchuť zvyšuje příjem ochucené orálně podávané vakciny v pitné vodě u vepřů.

• · · · · · ·· ····

Tabulka 7

Dodávání neochucené vakciny stříkačkou

Skupina	Dávka na 1 vepře	Počet vepřů	% ochrany po testovacím podání
Vakcínovaná zvířata	jedna dávka 1 χ 10⁷	3	100 %
Kontrola	NA	3	NA-100 % onemocnění

Odkaz

M. L. Augenstein, L. J. Johnston, G. C. Shurson, J. D. Hawton a

J. E. Pettigrew. Formulating Farm-Specific Swine Diets; University of Minnesota Extension Service. 1994.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob poskytnutí ochrany proti onemocnění u zvířete,

5 vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) smísí se ve vodě rozpustná chuťově příjemná ochucovací látka s ve vodě rozpustným vehikulem pro podání orálně podávané vakcíny;

10 (b) směs z kroku (a) se dále smísí s antigenem zvoleným ze skupiny bakterie a viru jako účinnou složkou orálně podávané vakcíny; a (c) vakcina pro orální podávání z kroku (b) se podá zvířeti pro poskytnutí ochrany proti onemocnění souvisejícímu s infekcí

15 antigenem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e antigen je schopen způsobit onemocnění u zvířete zvoleného ze skupiny vepřů, drůbeže, hovězího dobytka, ovcí,

2o koz, koní, koček a psů.
3. Způsob podle nároku 2, kde antigen je zvolený ze skupiny Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus pleuroneumonia, Mycoplasma hyopneumoniae, E. coli K88, F41 a 087P,

25 Clostridium perferingens typ c, Salmonella choleraesuls,

Pasterurella muitocida, Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira ictero, virus chřipky vepřů, cirkovirus, virus PRRS, virus neštovic vepřů, ·· 444·
4 4 4 4

-4210 rotavirus, respirační koronavirus vepřů, parvovirus, pseudorabies, agens vyvolávající přenosnou gastroenteritidu, Streptococcus equi, Clostridium tetanus, kmeny viru chřipky koní A1 a A2, koňská rhinopneumonitida typ 1, 1b a 4, východní koňská encefalomyelitida, západní koňská encefalomyelitida, venezuelská koňská encefalomyelitida, rotavirus koní, E. coli O157:H7, Pasterurella multocida, Pasterurella haemolytica, Clostridium perferingens typ D, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium sodellii, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, hovězí rotavirus, hovězí koronavirus, hovězí rhinotracheitida, virus průjmu hovězího dobytka, parainfluenza-3, virus respiračního syncytia, Sepullina pilosicoli, virus Marekovy choroby, infekční onemocnění burzy, infekční bronchitida, virus Newcastleského onemocnění, rheovirus, rhinotracheitida krůt, couidióza, psí Borrella burgdorferi, psí Ehrlichia canis, psí Bordetella bronchiseptica, psí Giardia lamblia, psinka, psí adenovirus, psí koronavirus, psí parainfluenza, psí parvovirus, psí vzteklina, kočičí Chlamydia psittaci, virus kočičí imunodeficience, virus kočičí infekční peritonitidy, virus kočičí leukemie, kočičí rhinotracheitida, kočičí panleukopenie, kočičí vzteklina.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,

25 že vakcina se podává prostřednictvím pitné vody.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny vepřů, drůbeže, hovězího dobytka, ovcí, koz, koní, koček a psů.

99 9999

99 9999
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny vepřů a drůbeže.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím,

5 že podávání orálně podávané vakciny se provádí prostřednictvím pitné vody.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, ž e zvíře je vepř a antigen je Erysipelothrix rhusiopathiae.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny psů a koček.
10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, is že podávání orálně podávané vakciny se provádí do úst pomocí stříkačky.
11. Způsob indukce zvýšeného příjmu orálně podávané vakciny zvířetem, vyznačující se tím, že zahrnuje

20 následující kroky:

(a) smísí se ve vodě rozpustná chuťově příjemná ochucovací látka s ve vodě rozpustným vehikulem pro podání orálně podávané vakciny;

(b) směs z kroku (a) se dále smísí s antigenem zvoleným ze

25 skupiny bakterie a viru jako účinnou složkou orálně podávané vakciny; a • 44 • · ·44 4 ·♦ Φ·4·

- 44 (c) vakcina pro orální podávání z kroku (b) se podá zvířeti pro poskytnutí ochrany proti onemocnění souvisejícímu s infekcí antigenem;

(d) indukuje se zvýšený příjem orální vakciny s ochucovací látkou.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e antigen je schopen způsobit onemocnění u zvířete zvoleného ze skupiny vepřů, drůbeže, hovězího dobytka, ovcí, io koz, koní, koček a psů.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e antigen je zvolený ze skupiny Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus pleuroneumoniae, Mycoplasma

15 hyopneumoniae, E. coli K88, F41 a 087P, Clostridium perferingens typ c, Salmonella choleraesuls, Pasterurella muitocida, Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira ictero, virus chřipky

20 vepřů, cirkovirus, virus PRRS, virus neštovic vepřů, rotavirus, respirační koronavirus vepřů, parvovirus, pseudorabies, agens vyvolávající přenosnou gastroenteritidu, Streptococcus equi, Clostridium tetanus, kmeny viru chřipky koní A1 a A2, koňská rhinopneumonitida typ 1, 1b a 4, východní koňská

25 encefalomyelitida, západní koňská encefalomyelitida, venezuelská koňská encefalomyelitida, rotavirus koní, E. coli O157:H7, Pasterurella muitocida, Pasterurella haemolytica, Clostridium perferingens typ D, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium septicum, Clostridium

30 haemolyticum, Clostridium sodellii, Salmonella dublin,

Salmonella typhimurium, hovězí rotavirus, hovězí koronavirus, ·· ···· ·· ··»·

-45 hovězí rhinotracheitida, virus průjmu hovězího dobytka, parainfluenza-3, virus respiračního syncytia, Sepullina pilosicoli, virus Markovy choroby, infekční onemocnění burzy, infekční bronchitida, virus Newcastleského onemocnění,

5 rheovirus, rhinotracheitida krůt, couidióza, psí Borrella burgdorferi, psí Ehrlichia canis, psí Bordetella bronchiseptica, psí Giardia lamblia, psinka, psí adenovirus, psí koronavirus, psí parainfluenza, psí parvovirus, psí vzteklina, kočičí Chlamydia psittaci, virus kočičí imunodeficience, virus kočičí infekční

10 peritonitidy, virus kočičí leukemie, kočičí rhinotracheitida, kočičí panleukopenie, kočičí vzteklina.
14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e vakcina se podává prostřednictvím pitné vody.
15. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny vepřů, drůbeže, hovězího dobytka, ovcí, koz, koní, koček a psů.

20
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny vepřů a drůbeže.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, ž e podávání orálně podávané vakcíny se provádí prostřednictvím pitné vody.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím ž e zvíře je vepř a antigen je Erysipelothríx rhusiopathiae.

·· ·♦·· ·* 9··» ·· ··>··

-46
19. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny psů a koček.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, ž e podávání orálně podávané vakciny se provádí do zadní části úst pomocí stříkačky.
21. Vakcina pro orální podávání zvířatům, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku antigen io zvolený ze skupiny bakterie a viru, ve vodě rozpustný chuťově příjemný ochucovací prostředek a ve vodě rozpustné vehikulum, pro podávání orálně podávané vakciny zvířeti.
22. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se tím, is že antigen je schopen způsobit onemocnění u zvířete zvoleného ze skupiny vepřů, drůbeže, hovězího dobytka, ovcí, koz, koní, koček a psů.
23. Vakcina podle nároku 22, vyznačující se tím,

20 že antigen je zvolený ze skupiny Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus pleuroneumonia, Mycoplasma hyopneumoniae, E. coli K88, F41 a 087P, Clostridium perferingens typ c, Salmonella choleraesuls, Pasterurella muitocida, Bordetella bronchiseptica, Leptospira bratistava,

25 Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira promona, Leptospira ictero, virus chřipky vepřů, cirkovirus, virus PRRS, virus neštovic vepřů, rotavirus, respirační koronavirus vepřů, parvovirus, pseudorabies, agens vyvolávající přenosnou gastroenteritidu, Streptococcus equi,

30 Clostridium tetanus, kmeny viru chřipky koní A1 a A2, koňská

44 4444

99 <·**

49 9499 rhinopneumonitida typ 1, 1b a 4, východní koňská encefalomyelitida, západní koňská encefalomyelitida, venezuelská koňská encefalomyelitida, rotavirus koní, E. coli O157:H7, Pasteurella muitocida, Pasteurella haemolytica,

5 Clostridium perferingens typ D, Clostridium chauvoei,

Clostridium novyi, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium sodellii, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, hovězí rotavirus, hovězí koronavirus, hovězí rhinotracheitida, virus průjmu hovězího dobytka, io parainfluenza-3, virus respiračního syncytia, Sepullina pilosicoli, virus Markovy choroby, infekční onemocnění burzy, infekční bronchitida, virus Newcastleského onemocnění, rheovirus, rhinotracheitida krůt, couidióza, psí Borrelia burgdorferi, psí Ehrlichia canis, psí Bordetella bronchiseptica,

15 psí Giardia lamblia, psinka, psí adenovirus, psí koronavirus, psí parainfluenza, psí parvovirus, psí vzteklina, kočičí Chlamydia psittaci, virus kočičí ímunodeficience, virus kočičí infekční peritonitidy, virus kočičí leukemie, kočičí rhinotracheitida, kočičí panleukopenie, kočičí vzteklina.
24. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e vehikulum pro podávání je pitná voda.
25. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se tím,

25 že zvíře je vepř a antigen je Erysipelothrix rhusiopathiae.
26. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e zvíře je zvoleno ze skupiny psů a koček a vehikulum pro podávání je sirup.