ES2812552T3 - Vacuna subunitaria contra Mycoplasma spp. - Google Patents

Abstract

Una composición para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende: un principio activo, que comprende una proteína de PdhA; y un adyuvante farmacéuticamente aceptable; en donde dicho PdhA comprende la secuencia de SEQ ID NO: 08.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna subunitaria contra Mycoplasma spp.

Antecedentes

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a una vacuna contra Mycoplasma spp.; especialmente a una vacuna de subunidades contra Mycoplasma spp.

Descripción de la técnica relacionada

Mycoplasma spp. se conoce actualmente como la bacteria más pequeña capaz de autorreplicarse fuera de las células hospedadoras. Aunque la neumonía enzoótica porcina podría no producir la muerte del porcino, reducirá la eficacia de la alimentación y producirá un retraso del crecimiento, inflamación e inmunosupresión, así como convertirá al porcino en más vulnerable a la infección por otros patógenos, lo que por tanto resultará en un daño económico para la industria.

Hasta la fecha, la neumonía enzoótica porcina se evitaba mediante tres estrategias principales, incluyendo: la administración de medicamentos, la gestión del entorno y la vacunación. Al ver la mala eficacia preventiva de los antibióticos contra Mycoplasma hyopneumoniae, la administración de medicamentos se puede usar solo con fines de tratamiento y es difícil cumplir las necesidades de prevención. Asimismo, considerando que la drogodependencia puede conducir a infecciones más importantes producidas por bacterias resistentes a fármacos, la administración de medicamentos necesita planes cautelosos y existen muchas limitaciones.

La gestión del entorno es la base de la prevención de la infección por Mycoplasma spp. Una buena desinfección y gestión de las pocilgas serían útiles para reducir la incidencia de la infección. Por otro lado, la prevención podría ser más comprehensiva a través de la vacunación.

Las vacunas convencionales en el campo utilizan bacterias inactivas/muertas como el principio activo de las mismas. Sin embargo, el precio de las vacunas convencionales es demasiado alto debido a que Mycoplasma spp. es una bacteria exigente y es difícil de cultivar en el laboratorio. A fin de reducir el coste de las vacunas de Mycoplasma spp., los científicos intentan continuamente desarrollar vacunas de diferentes tipos, tales como: (1) vacunas atenuadas, (2) vacunas de vectores, (3) vacunas de subunidades y (4) vacunas de ADN. Entre ellas, las vacunas de subunidades muestran el mayor potencial debido a las ventajas de facilidad en la producción y alta seguridad.

Hasta ahora, existen algunas proteínas candidatas potenciales que podrían utilizarse para las vacunas de M. hyopneumoniae; sin embargo, no existen además informes adicionales que verifiquen las proteínas adecuadas para las vacunas de M hyopneumoniae.

Minion F.C. et al., Database Gene 21 de diciembre de 2012 (2012-12-21) se refiere a la subunidad alfa de la piruvato deshidrogenasa E1 [mycoplasma hyopneumoniae 232].

El documento WO2007/006712 A2 divulga una vacuna de subunidades de micoplasma que comprende L-alfaglicerofosfato oxidasa.

El documento 15 EP 0571 648 A1 se refiere a una vacuna que protege contra la neumonía por micoplasmas siendo una cepa de hiopneumonía plasmática designada PRIT-5.

Sumario

A la vista de lo anterior, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar antígenos adecuados para utilizarse en vacunas contra M hyopneumoniae y producir por tanto novedosas vacunas de M. hyopneumoniae para que se pueda reducir el coste de la prevención.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una combinación de antígenos que sea adecuada para utilizarse en vacunas contra M. hyopneumoniae y proporcionar por tanto vacunas de subunidades con mejor comportamiento; por tanto, habría más opciones para las tareas de prevención.

Para conseguir los objetivos anteriormente mencionados, la presente invención proporciona una composición de acuerdo con la reivindicación 1.

Preferentemente, dicho principio activo tiene una concentración de 50 a 3500 pg/ml basada en el volumen total de dicha composición.

Preferentemente, dicho principio activo comprende PdhA y P78 de acuerdo con la reivindicación 3.

Preferentemente, dicho adyuvante farmacéuticamente aceptable es un adyuvante completo de Freund, un adyuvante incompleto de Freund, un gel de alúmina, un tensioactivo, un adyuvante de polianiones, un péptido, una emulsión de aceite, o una combinación de los mismos.

Preferentemente, dicha composición comprende además un aditivo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicho aditivo farmacéuticamente aceptable es un disolvente, un estabilizante, un diluyente, un conservante, un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente isotónico, un agente de retraso de la absorción o una combinación de los mismos.

La presente invención proporciona además un vector de expresión para prevenir la invención por Mycoplasma spp., de acuerdo con la reivindicación 7.

Preferentemente, dicho elemento regulador comprende un promotor y un sitio de unión a ribosoma.

Preferentemente, dicho plásmido es pET-MSY, pET-YjgD, pET-D, o pET-SUMO.

Preferentemente, dicho plásmido comprende además un gen que codifica una pareja de fusión. Preferentemente, dicha pareja de fusión es MsyB de E. coli, YjgD de E. coli, la proteína D del bacteriófago Lambda, o SUMO de S. cerevisiae.

Preferentemente, dicho vector de expresión se usa para un sistema de expresión génico de E. coli.

Para resumir, la presente invención se refiere s antígenos que son adecuados para utilizarse como el principio activo de una vacuna de subunidades de M. hyopneumoniae y una vacuna de subunidades/composición de M. hyopneumoniae preparada usando el mismo. La presente vacuna de subunidades no solo puede usarse eficazmente en las tareas de prevención para disminuir el coste de la misma, la divulgación de la presente invención muestra también una vacuna de subunidades de tipo "cóctel" (es decir, que tiene al menos dos antígenos como principios activos) que utiliza al menos dos antígenos de la presente invención y que tiene una inducción mejorada de la respuesta inmunitaria.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el resultado de la electroforesis de proteínas en gel bidimensional llevada a cabo en el 1er ejemplo de la presente invención.

La Figura 2 muestra el resultado de la reacción colorimétrica de la transferencia Western llevada a cabo en el 1er ejemplo de la presente invención.

La Figura 3 muestra el resultado de la electroforesis de los productos de la PCR obtenidos en el 2° ejemplo de la presente invención.

La Figura 4 muestra los registros de los experimentos de estímulo llevados a cebo en el 3er ejemplo de la presente invención.

Descripción detallada

Uno de los conceptos fundamentales de la presente invención es analizar antígenos candidatos potenciales adecuados para las vacunas de subunidades usando la electroforesis de proteínas en gel bidimensional junto con la tecnología de cribado inmunitario y para identificar los antígenos mediante espectrometría de masas. A continuación, se verificaron los comportamientos de las presentes vacunas de subunidades mediante experimentos de modelización animal.

En resumen, el progreso del desarrollo de la presente invención es:

(1) Inducir respuestas inmunitarias en cerdos experimentales inyectando una vacuna de M. hyopneumoniae convencional y obtener suero que contenga anticuerpos dirigidos contra M hyopneumoniae. (2) Obtener proteínas totales de Mhyopneumoniae para electroforesis de proteínas en gel bidimensional. (3) Llevar a cabo la hibridación del resultado de la electroforesis de proteínas en gel bidimensional de la etapa (2) usando el suero de la etapa (1) como 1er anticuerpo, y a continuación recoger las proteínas con resultado positivo (es decir, antígenos candidatos) a partir del gel tras la amplificación con un 2° anticuerpo y el siguiente procedimiento de desarrollo. (4) Identificar los antígenos candidatos obtenidos en la etapa (3). (5) Expresar dichos antígenos candidatos en grandes cantidades usando un sistema de expresión génica de E. coli. (6) Examinar la eficacia de las presentes vacunas de subunidades en la reducción de los rasgos patológicos en el pulmón mediante experimentos de estímulo de los cerdos y verificar así el valor de dichos antígenos candidatos para su uso como principios activos de una vacuna de subunidades.

La presente composición para prevenir la infección por Mycoplasma spp., comprende un principio activo y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una realización de la presente invención, dicho principio activo puede ser PdhA, y P78. En una realización alternativa, siempre que el determinante antigénico de la proteína anteriormente mencionada no esté interferido, dicho principio activo puede ser una proteína de fusión ef de las proteínas anteriormente mencionadas. En otra realización alternativa, dicho principio activo comprende las proteínas anteriormente mencionadas; esto es, la así denominada vacuna "cóctel" de la presente invención.

En otra realización de la presente invención, dicho principio activo puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08, o SEQ ID NO: 12.

En una realización alternativa, siempre que el determinante antigénico formado mediante plegado de un péptido de dicha secuencia de aminoácidos no esté interferido, dicho principio activo puede ser una proteína de fusión con las mencionadas secuencias. En otra realización alternativa, dicho principio activo comprende dos proteínas que comprenden respectivamente una de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas; esto es, la así denominada vacuna "cóctel" de la presente invención.

Dicho adyuvante farmacéuticamente aceptable se usa para mejorar el efecto inmunitario de dicho principio activo, estabilizar dicho principio activo, y/o aumentar la seguridad de las vacunas. Dicho adyuvante farmacéuticamente aceptable de la presente invención incluye, aunque no de forma limitativa: un adyuvante completo de Freund, un adyuvante incompleto de Freund, un gel de alúmina, un tensioactivo, un adyuvante de polianiones, un péptido, una emulsión de aceite, o una combinación de los mismos.

La composición de la presente invención puede tener uno o al menos dos de dichos principios activos (es decir, una vacuna de tipo cóctel). En un ejemplo de la presente composición, dicho principio activo tiene una concentración de 50 a 3500 pg/ml basada en el volumen total de dicha composición. En una realización preferida de la presente invención, cuando dicha composición comprende solo uno de dichos principios activos, dicho principio activo tiene una concentración de 50 a 500 pg/ml basada en el volumen total de dicha composición. En una realización alternativa de la presente invención, la presente composición comprende al menos uno de dichos principios activos; en donde la concentración total de dicho(s) principio(s) activo(s) contenidos en dicha composición es de 50 a 1000 pg/ml, 50 a 1500 pg/ml, 50 a 2000 pg/ml, 50 a 2500 pg/ml, 50 a 3000 pg/ml, o 50 a 3500 pg/ml basado en el volumen total de dicha composición.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un vector de expresión para prevenir la infección por Mycoplasma spp. Específicamente, dicho vector de expresión se puede usar para un sistema de expresión génica de E. coli.

Dicho vector de expresión comprende un plásmido. Dicho plásmido comprende: una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 01; y un elemento regulador.

Dicho vector se usa en un sistema de expresión génica de E. coli y para producir los antígenos de la presente invención mediante E. coli. En otras palabras, dicha secuencia de nucleótidos se puede traducir en la secuencia de aminoácidos del presente antígeno mediante un sistema de expresión génica de E. coli y a continuación, la secuencia de aminoácidos puede plegarse al presente antígeno.

En una realización alternativa, siempre que el funcionamiento del sistema de expresión génica de E. coli no esté impedido y la producción de dicha secuencia de nucleótidos y el plegado de la secuencia de aminoácidos consiguiente del mismo no esté interferido, dicho plásmido puede comprender dos o más de dichas secuencias de nucleótidos.

Dicho elemento regulador se refiere a un elemento requerido para iniciar la transcripción y la traducción en el sistema de expresión. Dicho elemento regulador debe al menos comprender un promotor y un sitio de unión a ribosoma. Preferentemente, dicho elemento regulador puede comprender además: un operador, una secuencia potenciadora, o una combinación de los mismos.

En una realización preferida de la presente invención, dicho plásmido comprende además un gen que codifica una pareja de fusión. Dicha pareja de fusión incluye, aunque no de forma limitativa, MsyB de E. coli, YjgD de E. coli, la proteína D del bacteriófago Lambda, o SUMO de S. cerevisiae. Dicho MsyB es rico en aminoácidos ácidos y podría ser favorable para mejorar la solubilidad de las proteínas que se van a producir.

Los siguientes ejemplos enumeran los ensayos y experimentos de la presente invención a fin de explicar adicionalmente las características y ventajas de la presente invención. Debe señalarse que los siguientes ejemplos son ilustrativos y no deben utilizarse para limitar el alcance de las reivindicaciones de la presente invención.

Ejemplo 1: Cribado de antígenos candidatos adecuados para utilizarse como principios activos de una vacuna de subunidades.

Preparación de suero que contiene anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp. de porcino.

De acuerdo con las investigaciones, existen siete Mycoplasma spp. que se pueden aislar de porcinos: Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma flocculare, Mycoplasma hyopharyngis, Mycoplasma sualvi, Mycoplasma bovigenitalium (Gourlay et al., 1978; Blank et al., 1996; Assuncao et al., 2005). Entre ellos, M. hyopneumoniae es el patógeno principal de la neumonía enzoótica de porcino con una tasa de infección del 25 al 93 %. Por tanto, la presente invención utilizó M. hyopneumoniae (cepa PRIT-5) para los estudios inmunoproteómicos y como fuentes de genes que codifican antígenos. Se utilizó medio de Friis (Friis et al., 1975) para cultivar M. hyopneumoniae. De acuerdo con el diseño del experimento, se añadió una cantidad adecuada de antibiótico o agar del 1,5 % para formular un medio sólido.

Se trajeron tres cerdos SPF de 4 semanas de edad del Agricultural Technology Research Institute y se alimentaron con el mismo pienso y se mantuvieron en el mismo entorno y condición de crecimiento en la pocilga antes de los experimentos. Después, los cerdos se alimentaron hasta el día 32, el día 46, y el día 60 de edad, se administraron a los cerdos 2 ml de vacuna Bayovac® MH-PRIT-5 (M. hyopneumoniae PRIT-5) mediante inyección intramuscular. A continuación, los cerdos se alimentaron de forma continua hasta el día 74 de edad y se extrajo sangre de la vena yugular de los mismos. La sangre recogida se puso a temperatura ambiente durante 1 hora y se almacenó a 4 °C. Al día siguiente, la sangre recogida se centrifugó a 1.107*g durante 30 minutos y se retiró el sobrenadante a un tubo limpio y se almacenó a -20 °C.

Electroforesis de proteínas en gel bidimensional de la proteína total de Mycoplasma spp.

Se usó el kit de extracción de proteínas ReadyPrep™ (proteínas totales) (Bio-Rad, CA, EE.UU.) para extraer la proteína total de Mycoplasma spp. Después, se determinó la concentración de la proteína recogida usando un kit de ensayo de proteínas RC DC de Bio-Rad (CA, EE.UU.). Se puede inferir el protocolo detallado a partir de la descripción del producto o se puede modificar a partir de protocolos bien conocidos en el campo.

La electroforesis de proteínas en gel bidimensional se llevó a cabo en dos etapas: isoelectroenfoque (IEF) y electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). La iEf estaba destinada a separar proteínas en la muestra según el punto isoeléctrico de las mismas; la SDS-PAGE estaba destinada a separar proteínas de acuerdo con el peso molecular de las mismas. Véase la figura 1, que muestra el resultado de la electroforesis de proteínas en gel bidimensional.

Hibridación.

El suero obtenido en la etapa (1) se usó como 1er anticuerpo para hibridarse con el resultado de la electroforesis de proteínas en gel bidimensional en la etapa (2). Tras amplificarse por el 2° anticuerpo y revelarse mediante el siguiente procedimiento de revelado, se recogieron las proteínas que mostraban un resultado positivo. Aquellas proteínas fueron reconocidas por el anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp., y serían por tanto adecuadas como antígenos candidatos para el principio activo de las vacunas de subunidades.

La hibridación se llevó a cabo mediante transferencia Western. En resumen, el gel 2D tras la electroforesis se transfirió a una membrana de PVDF. A continuación, la membrana se incubó y se hibridó secuencialmente con el 1er anticuerpo (el suero que contenía el anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp) y el 2° anticuerpo (anticuerpo dirigido contra IgG de cerdo conjugado con AP). Después, se llevó a cabo una reacción colorimétrica utilizando la solución NBT/BCIP.

En la figura 2 se muestra el resultado de la reacción colorimétrica de la transferencia Western; en donde 10 proteínas positivas para la inmunohibridación con anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp. se marcaron como antígenos candidatos para utilizarse como principios activos de las vacunas de subunidades.

Identificación de los antígenos candidatos obtenidos.

De acuerdo con la reacción colorimétrica de la transferencia Western, el gel correspondiente a la localización positiva en la membrana se cortó en micropéptidos y se analizó mediante espectrometría de masas. Los datos obtenidos de la espectrometría de masas se hicieron corresponder a continuación con la secuencia de aminoácidos y la base de datos para identificar aquellas proteínas.

Véase la tabla 1 siguiente, se relacionaron dichas 10 proteínas positivas para la inmunohibridación con anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp.

Tabla 1: las 10 proteínas positivas para la inmunohibridación con anticuerpo dirigido contra Mycoplasma spp y la secuencia de aminoácidos de las mismas.

continuación

En la siguiente divulgación, las realizaciones con respecto a los candidatos 1 a 3, 5 a 8 y 10 son únicamente para referencia.

Ejemplo 2: Expresión de dichos antígenos candidatos en gran cantidad por el sistema de expresión génica de E. col i.

Se usó Escherichia coli JM109 como células hospedadoras para la clonación y se usó Escherichia coli BL21 (DE3) como células hospedadoras para la expresión de la proteína. Las células de Escherichia coli se cultivaron en medio LB (Luria-Bertani; Difco, Míchigan, EE.UU.). De acuerdo con el diseño del experimento, se añadió una cantidad adecuada de antibiótico o agar del 1,5 % para formular un medio sólido.

Amplificación de los genes que codifican los antígenos candidatos.

Después de identificar los antígenos candidatos, los genes que codificaban aquellos antígenos se buscaron en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information). Los cebadores específicos que se dirigían a los genes antigénicos se diseñaron en consecuencia. A continuación, los genes antigénicos se amplificaron usando los cebadores específicos y el cromosoma de M. hyopneumoniae PRIT-5 como molde. En la siguiente tabla 2 se relacionaron los cebadores específicos utilizados.

T l 2: n n r .

Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los conjuntos de cebadores relacionados en la tabla 2 anterior para amplificar los genes de los antígenos candidatos. Los genes amplificados se usaron a continuación en el sistema de expresión génica de E. coli. La condición de la PCR era: 5 minutos a 98 °C (un ciclo); 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, X segundos a 68 °C (35 ciclos); 5 minutos a 68 °C (un ciclo). Dicha X era el tiempo de alargamiento para la ADN polimerasa y se ajustó dependiendo del tamaño del fragmento que se iba a amplificar. T ras la reacción de la PCR, se llevó a cabo una electroforesis para verificar si los productos de la PCR contenían los fragmentos de ADN de tamaño esperado. Véase la figura 3, que muestra el resultado de la electroforesis de los productos de la PCR; en donde la banda 1 era el gen eutD; la banda 2 era pdhA; la banda 3 era xylF; la banda 4 era el gen P78; la banda 5 era el gen P132; la banda 6 era mhp145; la banda 7 era mhp389.

Clonación de los productos de la PCR.

La clonación se llevó a cabo usando un Kit de clonación CloneJET PCR, y la mezcla de ligadura se transformó en E. coli ECOS™ 9-5 (Yeastern, Taipei, Taiwan). Se puede inferir el protocolo detallado a partir de la descripción del producto o modificarse a partir del protocolo bien conocido en el campo.

Tras la transformación, se cultivaron las bacterias en un medio LB sólido que contenía ampicilina (100 pg/ml) hasta que se formó una colonia de las mismas. A continuación, se llevó a cabo la PCR de la colonia para cribar con éxito cepas en transformación. La condición de la PCR era: 5 minutos a 95 °C (un ciclo); 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, X segundos a 72 °C (25 ciclos); 7 minutos a 72 °C (un ciclo). Dicha X era el tiempo de alargamiento para la ADN polimerasa y se ajustó dependiendo del tamaño del fragmento que se iba a amplificar. La velocidad de alargamiento de la ADN polimerasa Taq (Genomics, Taipei, Taiwan) es 1 kb/min; por tanto, si se usa la ADN polimerasa Taq para amplificar un fragmento de a Dn de 1 kb, dicha X debe ajustarse a 1 minuto.

Los plásmidos de las cepas, para cuyos plásmidos recombinantes se verificó que contenían el ADN de inserción, se procesaron a continuación para secuenciar el ADN (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Los plásmidos que contenían eutD, pdhA, xylF, el gen P78, el gen P132, mhp145, y mhp389 se nombraron como pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145, pJET-mhp389, respectivamente.

Mutación puntual y clonación de los genes antigénicos de M. hyopneumoniae.

Antes de amplificar los antígenos candidatos en un sistema de expresión génica de E. coli, debe considerarse la utilización del codón en diferentes organismos. Dicho esto, si el gen contiene un codón que esté codificado de forma ambigua entre el organismo original del mismo y E. coli, el gen debe modificarse mediante mutación puntual.

Los genes antigénicos de M. hyopneumoniae, pdhA, xylF, el gen P78, el gen P132, mhp145, y mhp389, contienen el codón TGA (eutD no tiene riesgo en la utilización del codón como otros). El codón TGA se tradujo a triptófano en Mycoplasma spp., pero se tradujo como un codón de detención en E. coli. Para evitar no poder producir la proteína completa en un sistema de expresión génica de E. coli, se diseñaron cebadores que se dirigían al sitio TGA y se llevó a cabo la mutación puntual que sustituía TGA por TGG usando la reacción en cadena de la polimerasa con extensión por solapamiento. Como resultado, los genes que se van a expresar en el sistema de expresión génica de E. coli pueden traducirse completamente al antígeno candidato de la presente invención. Además, los sitios de corte de BamHI del gen P78, el gen P132, y mhp389 experimentaron una mutación silenciosa por comodidad de la clonación.

Los cebadores usados para la mutación puntual se diseñaron para localizar el sitio de la mutación puntual en la parte central del cebador y para tener un valor Tm mayor de 78 °C. El valor Tm de los cebadores para la mutación puntual se calculó utilizando la fórmula proporcionada por Invitrogene Co.: Tm = 81,5 0,41 (%GC) - 675/N - % de emparejamiento incorrecto; en donde %GC se refiere al porcentaje de GC en vista de los nucleótidos totales contenidos en el cebador correspondiente; N se refiere a la longitud del cebador correspondiente; el % de emparejamiento incorrecto se refiere al porcentaje de la base que va a mutar en vista de los nucleótidos totales contenidos en el cebador correspondiente. Los conjuntos de cebadores usados para los genes anteriormente mencionados se relacionaron en la Tabla 3 a Tabla 8 siguientes.

T l : L n n r r l m i n n l hA.

continuación

T l 4: L n n r r l m i n n l xlF.

T l : L n n r r l m i n n l l n P7.

continuación

T l 7 L n n r r l m i n n l mh 14 .

T l : L n n r r l m i n n l mh .

El método para la mutación puntual se explicó brevemente del siguiente modo. El cromosoma de M. hyopneumoniae PRIT-5 se usó como molde y los fragmentos de ADN se amplificaron usando los conjuntos de cebadores que se muestran en la tabla 3 a la tabla 8 anteriormente.

Los 50 |jl de la mezcla de reacción de la PCR comprendían el tampón de la PCR 1x GDP-HiFi, 200 |jM de la mezcla de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, 1 jM de cebadores, 100 ng del cromosoma de M. hyopneumoniae PRIT-5, y 1 U de ADN polimerasa GDP-HiFi. La condición de la PCR era: 5 minutos a 98 °C (un ciclo); 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, X segundos a 68 °C (35 ciclos); 5 minutos a 68 °C (un ciclo). Dicha X era el tiempo de alargamiento para la ADN polimerasa y se ajustó dependiendo del tamaño del fragmento que se iba a amplificar. La velocidad de alargamiento de la ADN polimerasa GDP-HIFI (GeneDirex, Las Vegas, EE.u U.) es 1 kb/15 segundos; por tanto, si la ADN polimerasa GDP-HIFI se usa para amplificar un fragmente de 1 kb de ADN, dicho X debe ajustarse a 15 segundos. Tras la reacción de la PCR, se llevó a cabo una electroforesis para verificar si los productos de la PCR contenían los fragmentos de ADN de tamaño esperado. A continuación, el producto de la PCR se recirculó usando un kit del sistema de extracción en gel Gel-M™.

Después, el producto de la PCR se usó como un molde y se amplificó usando los conjuntos de cebadores que se muestran en la tabla 2 anterior. La condición de la PCR era: 2 minutos a 98 °C (un ciclo); 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, X segundos a 68 °C (35 ciclos); 5 minutos a 68 °C (un ciclo). Dicha X era el tiempo de alargamiento para la ADN polimerasa y se ajustó dependiendo del tamaño del fragmento que se iba a amplificar. La velocidad de alargamiento de la ADN polimerasa GDP-HIFI (GeneDirex, Las Vegas, EE.u U.) es 1 kb/15 segundos; por tanto, si la ADN polimerasa GDP-HIFI se usa para amplificar un fragmente de 1 kb de ADN, dicho X debe ajustarse a 15 segundos. Tras la etapa de amplificación anteriormente mencionada, se puede obtener una secuencia de longitud completa de los genes antigénicos candidatos con mutaciones puntuales.

A continuación, el producto de la PCR se recirculó usando un kit del sistema PCR-M™ Clean Up (GeneMark, Taichung, Taiwan) y se llevó a cabo la clonación del mismo usando un Kit de Clonación de la PCR CloneJET. Se llevó a cabo la PCR de la colonia para confirmar que las cepas tras la transformación contenían el plásmido con el ADN de inserción y a continuación se aislaron los plásmidos del anterior para la secuenciación del ADN (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Los plásmidos que contenían genes antigénicos candidatos mutados se nombraron pJET-pdhAM, pJET-xylFM, pJET-P78M, pJET-P132M, pJET-mhp145M, pJET-mhp389M, respectivamente.

De acuerdo con los resultados de la secuenciación, las secuencias de ADN de los genes antigénicos candidatos tras la mutación puntual eran como se muestra en la SEQ ID NO:01 (pdhA), SEQ ID NO:02 (xylF), SEQ ID NO:03 (eutD, no estaba mutada puntualmente), SEQ ID NO:04 (mhp145), SEQ ID NO:05 (gen P78), SEQ ID NO:06 (gen P132), SEQ ID NO:07 (mhp389).

Construcción de los vectores de expresión para expresar antígenos de M. hyopneumoniae

En esta parte de los experimentos, el plásmido pET-MSY se usó como estructura principal para construir un vector de expresión para expresar el antígeno de M. hyopneumoniae. pET-MSY es un derivado de pET29a y tiene un msyB de E. coli. Por tanto, el antígeno recombinante expresado podría tener por tanto una pareja de fusión de MsyB. MsyB es rico en aminoácidos ácidos y puede aumentar la solubilidad de la proteína expresada.

Tras digerirse pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145 y pJET-mhp389 con BamHI y SalI, El fragmento de ADN obtenido se insertó en pET-Msy digerido previamente con las mismas enzimas de restricción por la ligasa. A continuación, el pET-Msy con el fragmento de ADN se transformó en E. coli ECOS 9-5. Se llevó a cabo la PCR de la colonia para confirmar que las cepas tras la transformación contenían el plásmido con el ADN de inserción y a continuación se aislaron los plásmidos del anterior para la secuenciación del ADN (Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.). Los plásmidos verificados con la secuencia de ADN correcta se nombraron pET-MSYEutD, pET-MSYPdhA, pET-MSYXylF, pET-MSYP78, pET-MSYP132, pET-MSYMhp145, y pET-MSYMhp389, respectivamente. Aquellos plásmidos obtenidos fueron ejemplos de los vectores de expresión para prevenir la infección por Mycoplasma spp. de la presente invención.

Expresión y aislamiento de los antígenos de M. hyopneumoniae

Los vectores para la expresión antigénica se transformaron en E. coli BL21(DE3). Una única colonia de cepas correspondientes tras la transformación se inoculó en medio líquido LB que contenía kanamicina (concentración de trabajo: 30 pg/ml). tras el cultivo durante la noche a 37 °C, 180 rpm, la suspensión de bacterias se diluyó a una relación de 1:100 y se inoculó de nuevo en otro medio líquido LB que contenía kanamicina (concentración de trabajo: 30 pg/ml). las bacterias se cultivaron a 37 °C, 180 rpm hasta la DO⁶⁰⁰ alcanzando por tanto aproximadamente de 0,6 a 0,8. A continuación, se añadió IPTG 0,1 mM para inducir la expresión. Tras la inducción durante 4 horas, se recogió el aglomerado mediante centrifugación (10000*g, 10 minutos, 4 °C) y se examinó la expresión mediante electroforesis de proteínas.

Después, se usó la cromatografía por afinidad de metales inmovilizados (IMAC) para el aislamiento de proteínas mediante el enlace covalente entre la etiqueta His del extremo N de la proteína recombinante e iones de níquel o iones de cobalto. El protocolo de aislamiento de proteínas concordaba con la descripción de producto del QIAexpressionist™ (cuarta edición, Qiagen). El aglomerado se suspendió en un tampón de lisis (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) y se alteró mediante un procesador ultrasónico. Tras la centrifugación (8.000*g, 15 minutos), se recogió el sobrenadante para introducir en una columna de 1 ml de resina Ni-NTA. Los antígenos recombinantes se adherirían sobre dicha resina. A continuación, 15 ml de tampón de lavado (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) se introdujeron en la columna para lavar la resina para que las proteínas no específicas adheridas a la misma se pudieran eliminar. Por último, se añadieron 20 ml de tampón de elución (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0) para eliminar mediante lavado los antígenos recombinantes de la resina; en donde el imidazol de alta concentración puede competir por el sitio de unión en la resina con las proteínas recombinantes y por tanto conseguir que las proteínas recombinantes se eliminen mediante lavado. A continuación se examinó el resultado del aislamiento mediante electroforesis de proteínas.

Los antígenos candidatos de la presente invención recogidos mediante aislamiento se pueden usar a continuación en los siguientes ensayos inmunitarios para confirmar su capacidad de utilizarse como principio activo de las vacunas de subunidades dirigidas contra Mycoplasma spp.

Ejemplo 3: Experimentos de estímulo inmunitario en cerdos de los antígenos candidatos de la presente invención.

En este ejemplo, los antígenos candidatos de la presente invención se utilizaron como principio activo para preparar vacunas de subunidades y se probaron para determinar los efectos inmunitarios de los mismos en cerdos vivos.

Preparación de la vacuna

Un antígeno recombinante aislado o varios antígenos recombinantes aislados se mezclaron con gel de alúmina como un adyuvante para preparar una vacuna de subunidades o una vacuna de subunidades de tipo cóctel. Cada dosis de la vacuna preparada era de 2 ml de volumen y cada tipo de antígeno contenido en la misma era de 100 pg.

La siguiente tabla 9 relaciona las muestras preparadas en este ejemplo para los experimentos de estímulos inmunitarios.

T l : M r v n r r n l E m l

Los experimentos de estímulo inmunitario en cerdos se realizarían usando Bayovac® MH-PRIT-5 (preparado usando PRIT-5 de M. hyopneumoniae, como grupo control positivo), vacunas de subunidades (muestra 1 de la presente invención), y vacuna de tipo cóctel (muestra 8 de la presente invención).

33 cerdos SPF de 4 semanas de edad se trajeron del Agricultural Technology Research Institute y se alimentaron con el mismo pienso, entorno, y condiciones de crecimiento en la pocilga antes de los experimentos.

Después, los cerdos se alimentaron hasta el día 35 y el día 49 de edad, se administraron a los cerdos 2 ml de la vacuna anterior mediante inyección intramuscular.

Experimentos de estímulo

Los cerdos anteriormente mencionados que indujeron respuestas inmunitarias se estimularon con Mycoplasma spp. en el día 109 de edad para confirmar el efecto inmunitario de las vacunas anteriormente mencionadas.

En primer lugar, un pulmón recogido de los cerdos infectados por Mycoplasma spp. se molturó en 20 ml de medio de Friis y se centrifugó a 148,8*g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante a un tubo limpio y se centrifugó de nuevo a 7.870*g durante 40 minutos. A continuación, se descartó el sobrenadante y se suspendió la precipitación en 6 ml de medio de Friis para obtener una suspensión. Después, se filtró la suspensión mediante una membrana de 5 pm y 0,45 pm secuencialmente para obtener las soluciones de bacterias requeridas para los experimentos de estímulo.

La solución de bacterias (5 ml) se administró a cerdos anestesiados a través de la tráquea de los mismos. Después de 28 días de la administración, se sacrificaron los cerdos y se diseccionaron para recoger el pulmón de los mismos. Se examinó el efecto inmunitario observando el pulmón y se registró de acuerdo con los siguientes criterios: cualquiera de los lóbulos superiores medios y los lóbulos superiores de cualquier lado del pulmón observado con rasgos patológicos se puntuó como 10 puntos; cualquiera de los lóbulos superiores medios y los lóbulos diafragmáticos de cualquier lado del pulmón observado con rasgos patológicos se puntuó como 5 puntos. La puntuación completa fue de 55 puntos. En la figura 4 se mostraron los registros de la observación.

En comparación con los resultados de los cerdos no inyectados, los siete antígenos candidatos de la presente invención pudieron proporcionar efectos inmunitarios equivalentes a los de una vacuna convencional (Bayovac® MH-PRIT-5). Si se toma en consideración la mayor seguridad de las vacunas de subunidades, las vacunas que contienen los antígenos candidatos de la presente invención deben ser más valiosas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende:

un principio activo, que comprende una proteína de PdhA; y

un adyuvante farmacéuticamente aceptable;

en donde dicho PdhA comprende la secuencia de SEQ ID NO: 08.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho principio activo tiene una concentración de 50 a 3500 pg/ml basado en el volumen total de dicha composición.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho principio activo comprende PdhA y P78; en donde dicho P78 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho adyuvante farmacéuticamente aceptable es un adyuvante completo de Freund, un adyuvante incompleto de Freund, un gel de alúmina, un tensioactivo, un adyuvante de polianiones, un péptido, una emulsión de aceite o una combinación de los mismos.

5. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un aditivo farmacéuticamente aceptable.

6. La composición de la reivindicación 5, en donde dicho aditivo farmacéuticamente aceptable es un disolvente, un estabilizante, un diluyente, un conservante, un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente isotónico, un agente de retraso de la absorción o una combinación de los mismos.

7. Un vector de expresión para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende: un plásmido; en donde dicho plásmido comprende:

una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 01; y

un elemento regulador;

en donde dicho plásmido comprende además un gen que codifica una pareja de fusión, y dicha pareja de fusión es MsyB de E. coli, YjgD de E. coli, la proteína D del bacteriófago Lambda o SUMO de S. cerevisiae.

8. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde dicho elemento regulador comprende un promotor y un sitio de unión a ribosoma.

9. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde dicho plásmido es pET-MSY, pET-YjgD, pET-D o pET-SUMO.

10. El vector de expresión de la reivindicación 7, para su uso en un sistema de expresión génica de E. coli.