TWI609878B - 抗黴漿菌之次單位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明提供合適作為抗黴漿菌之次單位疫苗的活性成分的蛋白質及以其製得之疫苗。前述蛋白質經實驗證實可引發足夠強度的免疫反應而避免豬隻感染黴漿菌。前述疫苗可含有一種前述之蛋白質作為活性成分，或含有兩種以上前述之蛋白質而形成雞尾酒疫苗的形式。本發明之疫苗不僅較習用疫苗更具安全性，同時具有相當、甚至是更優異的免疫效果。

Description

抗黴漿菌之次單位疫苗
本發明關於一種抗豬黴漿菌的疫苗，尤指一種抗豬黴漿菌的次單位疫苗。
黴漿菌(Mycoplasma spp.)是目前所知能在細胞外自行複製的最小細菌，其引發的豬黴漿菌肺炎雖然不會造成豬隻的高死亡率，但會降低飼料換肉率、導致生長發育遲緩、造成發炎性反應及免疫抑制作用、及引起其他諸多細菌性病原的感染，因而使養豬業者蒙受嚴重的經濟損失。
目前對於豬黴漿菌肺炎的防治方式有三，包括：藥物投予、飼養管理及疫苗接種。由於抗生素對於豬肺炎黴漿菌的預防效果不佳，因此藥物投予的策略僅限於治療目的，難以達到預防的效果。此外，考量到藥物濫用可能引發更大規模之抗藥性菌種的感染，採用藥物投予不僅需要更多的規劃，同時面臨諸多極限。
良好的飼養管理是防治豬黴漿菌感染的根本方法。優良的豬舍環境衛生品質及妥善的飼養管理有助於減少感染的發生。從另一方面來說，配合疫苗接種更可使整體的防疫工作更加完善。
領域中現行使用的疫苗是以不活化死菌作為疫苗的活性成分。然而，因為黴漿菌為營養苛求性菌(fastidious bacteria)而不容易以人工培養，造成黴漿菌疫苗的價格居高不下。為了降低黴漿菌疫苗的成本，學者不斷研究以不同的策略來研發疫苗，包括：(1)減毒疫苗、(2)載體疫苗、(3)次單位疫苗、及(4)DNA疫苗；其中，次單位疫苗因具有容易生產及安全性高的優點，而最具應用潛力。
目前已知部分可研製為豬黴漿菌次單位疫苗的可能候選抗原，但截至今日，領域中仍尚未有研究報告完整地提出適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原。
爰是，本發明之一目的為提供適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原，並據以製得次單位疫苗，以降低防疫成本。
本發明之又一目的為組合本發明所習得之適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原，以製得效果更優良的次單位疫苗，提供防疫工作更多樣化的選擇。
為達到上述目的，本發明提供一種用於防治黴漿菌感染的重組蛋白質，其具有SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或其組合所示之胺基酸序列。
本發明又提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其係包含PdhA、XylF、EutD、Mhp145、 P78、P132、Mhp389、或其組合之蛋白質；及一生物可接受之佐劑。
較佳地，前述活性成分的濃度為50至3500μg/mL，其係以前述疫苗的總體積為基礎。
較佳地，前述活性成分係包含下列群組之蛋白質的至少兩種：PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、及Mhp389。
較佳地，前述活性成分為PdhA及P78。
較佳地，前述活性成分為XylF及Mhp145。
較佳地，前述生物可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
較佳地，前述疫苗，其進一步包含一生物可接受之添加劑。
較佳地，前述生物可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
本發明再提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其具有SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或其組合所示之胺基酸序列；及一生物可接受之佐劑。
較佳地，前述活性成分的濃度為50至3500μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
較佳地，前述活性成分係具有下列群組之胺基酸序 列的至少兩種：SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、及SEQ ID NO：14。
較佳地，前述活性成分具有SEQ ID NO：08及SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列。
較佳地，前述活性成分具有SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列。
較佳地，前述生物可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
較佳地，前述組合物進一步包含一生物可接受之添加劑。
較佳地，前述生物可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
本發明更提供一種用於防治黴漿菌感染的表現載體，其包含一質體，前述質體包含：一核苷酸序列，其係選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個：SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、及SEQ ID NO：07；及一調控元件。
較佳地，前述調控元件包含一啟動子及核醣體結合部位。
較佳地，前述質體為pET-MSY、pET-YjgD、pET-D、或pET-SUMO。
較佳地，前述質體進一步包含一融合伴子(fusion partner)基因。
較佳地，前述融合伴子基因為大腸桿菌之msyB基因、yjgD基因、Lambda噬菌體D蛋白質基因、或麵包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)SUMO蛋白質基因。
較佳地，前述表現載體係利用於大腸桿菌表現系統之表現載體。
綜上所述，本發明關於適用於作為豬黴漿菌次單位疫苗之活性成分的抗原，以及以其製得的次單位疫苗。本發明之次單位疫苗不僅可有效運用於防疫工作而降低防疫成本，本發明的揭露內容更教示了組合兩種以上抗原的「雞尾酒」次單位疫苗(即，含有兩種以上的抗原作為活性成分)具有更加強之免疫誘發效果。
1‧‧‧XylF(木糖結合脂蛋白)
2‧‧‧XylF(木糖結合脂蛋白)
3‧‧‧XylF(木糖結合脂蛋白)
4‧‧‧PdhA(丙酮酸去氫酶α次單位)
5‧‧‧Mhp145(周質空間糖結合蛋白質)
6‧‧‧EutD(磷酸乙醯轉移酶)
7‧‧‧EutD(磷酸乙醯轉移酶)
8‧‧‧Mhp389
9‧‧‧P78(脂蛋白)
10‧‧‧P132
第一圖係本發明實施例一之蛋白質二維電泳圖譜。
第二圖係本發明實施例一之西方墨漬法的呈色反應結果。
第三圖係本發明實施例二之PCR產物的電泳結果。
第四圖係顯示本發明實施例三之攻毒試驗的結果紀錄。
本發明的研發概念在於利用蛋白質二維電泳技術結合免疫學技術篩選技術以搜尋出合適作為次單元疫苗的候選抗原，並以質譜儀分析鑑定抗原身分。最後再經動物實驗以確認本發明之次單元疫苗的效果。
本發明的研發過程簡述如下：
(1)以市售的豬黴漿菌疫苗於實驗豬隻體內建立免疫反應，並採集含有抗豬黴漿菌之抗體的血清。(2)取得豬黴漿菌的全蛋白質(total protein)，並進行蛋白質二維電泳。(3)以前述步驟1中所得之血清作為一次抗體與步驟2中的蛋白質二維電泳結果進行雜合，經二次抗體雜合放大及後續顯影程序後，採集有成功顯影之蛋白質(即，候選抗原)。(4)辨識步驟3中所獲得的候選抗原。(5)以大腸桿菌表現系統大量表現前述候選抗原，並據以製得次單位疫苗。(6)以豬隻免疫攻毒實驗測試前述次單位疫苗降低肺部病變之效果，以確認前述候選抗原中何者具有作為次單位疫苗之活性成分的價值。
本發明之防治黴漿菌感染的疫苗包含：一活性成分及一生物可接受之佐劑。
在本發明的一個實施態樣中，前述活性成分可為PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、Mhp389、或其組合之蛋白質。在一個可行實施態樣中，只要不破壞前述蛋白質本身的抗原產生區域，前述活性成分可為任兩個以上之前述蛋白質的融合蛋白質。在另一個可行實施態樣中，前述活性成分為包含任兩個以上之前述蛋白質，此即為本發明所述之雞尾酒疫苗。
在本發明的另一個實施態樣中，前述活性成分可具有SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或其組合所示之胺基酸序列。在一個可行實施態樣中，只要不破壞前述胺基酸序列摺疊 (folding)後應具有的抗原產生區域，前述活性成分可為具有任兩個以上之前述胺基酸序列的融合蛋白質。在另一個可行實施態樣中，前述活性成分為包含任兩個以上的蛋白質，其分別具有一個前述胺基酸序列，此即為本發明所述之雞尾酒疫苗。
前述生物可接受之佐劑係用以增加活性成分的免疫效果、維持活性成分的穩定性、及提升疫苗的安全性。本發明所述之生物可接受之佐劑包括，但不限於：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
本發明之疫苗可含有單一種前述活性成分或含有兩種以上的前述活性成分(即，雞尾酒疫苗)。本發明疫苗中活性成分之總和的濃度為50至3500μg/mL，其係以前述疫苗的總體積為基礎。在本發明的一個較佳實施態樣中，單一種前述活性成分的濃度為50至500μg/mL，其係以前述疫苗的總體積為基礎。在本發明的一個可行實施態樣中，本發明疫苗含有一個以上的前述活性成分，其中活性成分之總和的濃度為：50至1000μg/mL、50至1500μg/mL、50至2000μg/mL、50至2500μg/mL、50至3000μg/mL、或50至3500μg/mL，其係以前述疫苗的總體積為基礎。
本發明的另一個實施態樣為一種用於防治黴漿菌感染的表現載體。更明確地，其係運用於大腸桿菌表現系統之表現載體。然，依據本發明的精神，所屬領域具有通常知識者當可參酌本發明說明書的揭露內容，進行變化以適用於不同的表現系統，而仍屬於本發明的範疇。
前述表現載體包含一質體。前述質體包含：一核苷酸序列，其係選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個：SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、及SEQ ID NO：07；及一調控元件。
前述序列係用以於大腸桿菌表現系統中，藉由大腸桿菌來大量生產出本發明的抗原。換言之，前述序列可於大腸桿菌表現系統轉譯為本發明之抗原的胺基酸序列，並據以摺疊(folding)為本發明之抗原。
在一個可行的實施態樣中，於不影響大腸桿菌表現系統的正常運作，也不影響個別前述核苷酸序列於其中的生產及後續胺基酸序列的摺疊的前提下，前述質體可包含兩個以上的前述核苷酸序列。
前述調控元件係指於表現系統中所需之啟動轉錄及轉譯程序所需的元件。前述調控元件至少應包含一啟動子(promoter)及核醣體結合部位。較佳地，前述調控元件可額外包含：操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequences)、或其組合。
在本發明的一個較佳實施態樣中，前述質體進一步包含一融合伴子(fusion partner)基因。前述融合伴子基因包括但不限於：大腸桿菌之msyB基因、yjgD基因、Lambda噬菌體D蛋白質基因、麵包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)SUMO蛋白質基因、或其組合。前述MsyB因富含酸性胺基酸，有助於提升欲生產之蛋白質(抗原)的可溶性。
以下實施例謹記載本發明研發所進行的試驗，以進一步釋明本發明的特徵與優點。惟需理解的是，所列實施例僅是示範性地例示所請發明，不應用於限制本發明的申請專利範圍。
實施例一：挑選適合作為次單元疫苗之活性成分的候選抗原
製備含抗豬黴漿菌之抗體的血清
目前研究顯示，由豬隻中分離出來的黴漿菌共有七種：豬肺炎黴漿菌(Mycoplasm hyopneumoniae)、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis)、豬滑液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)、豬絮狀黴漿菌(Mycoplasma flocculare)、豬喉黴漿菌(Mycoplasma hyopharyngis)、豬腸黴漿菌(Mycoplasma sualvi)及牛生殖道黴漿菌(Mycoplasma bovigenitalium)(Gourlay et al.,1978；Blank et al.,1996；Assuncao et al.,2005)；其中豬肺炎黴漿菌是最主要造成豬黴漿菌肺炎的病原，感染率約在25%至93%之間。本發明因此以豬肺炎黴漿菌(M.hyopneumoniae PRIT-5疫苗株)進行免疫蛋白質體學研究及做為抗原基因之來源。以Friis培養基(Friis et al.,1975)進行豬黴漿菌之培養。依實驗需求，於培養基中加入適當適量之抗生素或加入1.5% agar配製成固體培養基。
由台灣動物科技研究所二代SPF豬舍所購入3頭4週齡SPF豬。將所有豬隻飼養於SPF實驗豬舍待用，並使用相同的飼料、飼養環境及條件。
將實驗豬隻飼養到32、46及60日齡時，三次以肌肉注射的方式注射2mL的疫苗Bayovac® MH-PRIT-5(M.hyopneumoniae PRIT-5)以誘發免疫反應。其後，繼續將實驗豬隻飼養至74日齡時，再進行頸靜脈採血，並將收集的血液置於室溫下1小時。接著，將血液放入4℃中。隔日再以1,107×g的條件離心30分鐘，取上清液(抗血清)置入乾淨的離心管中，並保存於-20℃待用。
以豬黴漿菌之全蛋白質(total protein)進行蛋白質二維電泳
使用ReadyPrepTM protein extraction kit(total protein)(Bio-Rad,CA,USA)進行豬黴漿菌總蛋白質的萃取。然後，利用Bio-Rad RC DC Protein Assay Kit(CA,USA)進行蛋白質濃度之測定。實驗步驟可參酌產品說明，或依據領域中習知的實驗步驟進行調整和修飾，於此不再贅述。
蛋白質二維電泳分為兩個步驟，分別為等電點電泳(isoelectric focusing；IEF)及硫酸十二酯鈉聚丙醯烯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)。等電點電泳是利用蛋白質等電點不同的特性，將蛋白質進行分離；而SDS-PAGE是利用蛋白質分子量不同之特性，將蛋白質進行分離。請參第一圖，圖中所顯示者即為所取得之蛋白質二維電泳圖譜。
雜合反應
以前述步驟1中所得之血清作為一次抗體與步驟2中的蛋白質二維電泳結果進行雜合，經二次抗體雜合放大及後續顯影程序後，採集有成功顯影之蛋白質。這些成功顯影的蛋白質表示會被抗豬黴漿菌之抗體所辨認，因此是適用於作為次單元疫苗之活性成分的候選抗原。
此步驟是採用西方墨漬法來進行。簡單地說，將蛋白質電泳後之膠片轉印至PVDF膜後，依序以一次抗體(含抗豬黴漿菌之抗體的血清)及二次抗體(AP-conjugated anti-pig IgG)與其雜合。然後，再以NBT/BCIP溶液進行呈色反應。
請參第二圖，其顯示西方墨漬法的呈色反應結果；其中，共標記出10個與抗豬黴漿菌之抗體有發生免疫雜合反應的蛋白質，即為可能適合作為次單元疫苗之活性成分的候選抗原。
辨識所獲得之候選抗原的身分
依據西方墨漬法的呈色反應結果，於蛋白質電泳膠片上的相對位置，以微量吸管將膠片裁取下來，並進行質譜分析。然後再將所得之胺基酸序列與蛋白質序列資料庫進行搜尋比對以鑑定蛋白質之身分。
請參下表一，經比對，前述10個與抗豬黴漿菌之抗體有發生免疫雜合反應的蛋白質分別為：表一：10個與抗豬黴漿菌之抗體有發生免疫雜合反應的蛋白質及
Figure TWI609878BD00001
實施例二：以大腸桿菌表現系統大量表現前述候選抗原
以Escherichia coli JM109做為基因選殖用之宿主細胞。以Escherichia coli BL21(DE3)作為蛋白質表現用之宿主細胞。以LB(Luria-Bertani)培養基(Difco,Michigan,USA)進行大腸桿菌之培養。依實驗需求，於培養基中加入適當適量之抗生素或加入1.5% agar配製成固體培養基。
候選抗原之基因擴增
確認候選抗原的身分後，依據美國全國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information； NCBI)資料庫中之豬肺炎黴漿菌基因體資料，搜尋候選抗原之基因。針對不同之抗原基因設計特異性引子。以豬肺炎黴漿菌PRIT-5染色體作為模板，利用特異性引子組合進行標的基因之擴增。所用引子組合係列於下表二。
Figure TWI609878BD00002
Figure TWI609878BD00003
以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)搭配前述表二中所列引子組合，以擴增候選抗原的基因序列，供後續大腸桿菌表現系統之用。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應X秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。其中X值為DNA聚合酶延展時間，依照擴增之片段大小設定此值。GDP-HIFI DNA polymerase(GeneDirex,Las Vegas,USA)之延展速率為1 kb/15秒，若欲擴增1 kb大小之DNA片段，則將X值設定為15秒。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。請參第三圖，為PCR產物之電泳結果；其中，Lane 1為eutD基因；Lane 2為pdhA基因；Lane 3為xylF基因；Lane 4為P78基因；Lane 5為P132基因；Lane 6為mhp145基因；Lane 7為mhp389基因。
PCR產物之選殖
利用CloneJET PCR Cloning Kit進行基因之選殖，並將黏合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOSTM 9-5(Yeastern,Taipei,Taiwan)中，轉形的詳細步驟可參酌產品使用說明，或由領域中的標準實驗步驟加以修飾調整，於此不再贅述。
將轉形後之菌體培養於含安比西林(ampicillin,100μg/mL)的LB固態培養基上，使其長成菌落後，以菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃，反應X分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。其中X值為DNA聚合酶延展時間，依照擴增之片段大小設定此值。Taq DNA polymerase(Genomics,Taipei,Taiwan)之延展速率為1 kb/min，若欲擴增1 kb大小之DNA片段，則將X值設定為1分鐘。
經colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有insert DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將含有eutD、pdhA、xylF、P78基因、P132基因、mhp145及mhp389之質體分別命名為pJET-eutD、pJET-pdhA、pJET-xylF、pJET-P78、pJET-P132、pJET-mhp145、pJET-mhp389。
豬肺炎黴漿菌抗原基因之定點突變及選殖
以大腸桿菌表現系統進行候選抗原之增殖表現前，需考慮不同生物體中密碼子使用頻率(Codon Usage)的問題，若所欲表現之基因序列中含有在原生物體與大 腸桿菌中會有不同解讀的密碼子(codon)，則須先以點突變的方式加以修正。
豬肺炎黴漿菌抗原基因pdhA、xylF、P78基因、P132基因、mhp145及mhp389中帶有TGA codon(eutD於此沒有codon usage的問題)。TGA codon在黴漿菌中被轉譯為色胺酸(tryptophan)，但在大腸桿菌中則被視為停止碼(stop codon)。為了避免無法利用大腸桿菌表現系統生產全長蛋白質，首要針對TGA處設計突變引子並利用重疊延展聚合酶連鎖反應針對基因中之TGA進行定點突變，使其突變為TGG。如此一來，便可使欲表現之基因序列於大腸桿菌表現系統中也忠實地轉譯為本發明之候選抗原。另外，為方便基因選殖，將P78基因、P132基因及mhp389中之BamHI切位進行靜默突變(silent mutation)。
突變引子之設計原則包括突變點位於引子中央及引子之Tm值溫度需高於78℃。突變引子之Tm值以Invitrogene公司提供之公式Tm=81.5+0.41(%GC)-675/N-%mismatch計算，公式中之%GC為GC在引子核苷酸中所佔的百分比；N為引子長度；%mismatch為突變base在引子核苷酸中所佔的百分比。各基因進行點突變所需之引子組合係如下表三~表八所列。
Figure TWI609878BD00004
Figure TWI609878BD00005
表四：對xylF進行點突變所需之引子
Figure TWI609878BD00006
Figure TWI609878BD00007
Figure TWI609878BD00008
Figure TWI609878BD00009
Figure TWI609878BD00010
Figure TWI609878BD00011
Figure TWI609878BD00012
Figure TWI609878BD00013
進行點突變的步驟概述如下：以豬肺炎黴漿菌PRIT-5染色體作為模版，分別以前述表三~表八所列引子組分別進行DNA片段擴增。
在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR 緩衝液A，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng豬肺炎黴漿菌PRIT-5染色體及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應X秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。其中X值為DNA聚合酶延展時間，依照擴增之片段大小設定此值。GDP-HIFI DNA polymerase(GeneDirex,Las Vegas,USA)之延展速率為1 kb/15秒，若欲擴增1 kb大小之DNA片段，則將X值設定為15秒。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收。
之後，以回收之PCR產物作為模版，分別利用表二中所列之擴增引子組合進行基因擴增。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應X秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。其中X值為DNA聚合酶延展時間，依照擴增之片段大小設定此值。GDP-HIFI DNA polymerase(GeneDirex,Las Vegas,USA)之延展速率為1 kb/15秒，若欲擴增1 kb大小之DNA片段，則將X值設定為15秒。經此步驟後，即可獲得全長定點突變之候選抗原的基因序列。
接著，利用PCR-MTM Clean Up system kit(GeneMark,Taichung,Taiwan)進行PCR產物之回收。利用CloneJET PCR Cloning Kit進行突變基因之選殖。以colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有insert DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將含有突變候選抗原基因序列的質體分 別命名為pJET-pdhAM、pJET-xylFM、pJET-P78M、pJET-P132M、pJET-mhp145M、pJET-mhp389M。
根據定序結果，完成點突變後，各候選抗原的DNA序列分別如SEQ ID NO：01(pdhA)、SEQ ID NO：02(xylF)、SEQ ID NO：03(eutD，無進行點突變)、SEQ ID NO：04(mhp145)、SEQ ID NO：05(P78基因)、SEQ ID NO：06(P132基因)、SEQ ID NO：07(mhp389)所示。
豬肺炎黴漿菌抗原表現載體之建構
本實驗以pET-MSY質體為骨架進行豬肺炎黴漿菌抗原表現載體之建構。pET-MSY係自pET29a衍生而來；質體中帶有大腸桿菌msyB基因，可使表現之重組抗原帶有融合伴子(fusion partner)MsyB。MsyB富含酸性胺基酸，可增加蛋白質的可溶性。
將pJET-eutD、pJET-pdhAM、pJET-xylFM、pJET-P78M、pJET-P132M、pJET-mhp145M及pJET-mhp389M分別以BamHI及SalI剪切後，利用T4 DNA ligase將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-Msy中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有insert DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-MSYEutD、pET-MSYPdhA、pET-MSYXylF、pET-MSYP78、pET-MSYP132、pET-MSYMhp145、pET-MSYMhp389； 此即本發明所請之用於減少豬黴漿菌肺炎病變發生的表現載體。
重組豬肺炎黴漿菌抗原之表現與純化
將抗原表現載體轉形入E.coli BL21(DE3)中。挑取單一菌落接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)的LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，振盪培養(37℃,180rpm)至OD600約為0.6~0.8左右，以0.1mM IPTG進行蛋白質之誘導表現，誘導4小時後，離心(10000×g,10分鐘，4℃)收集菌體部分並以蛋白質電泳觀察重組抗原之表現情形。
接著，利用重組蛋白質N端之His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和層析法(immobilized-metal affinity chromatography,IMAC)進行蛋白質純化。蛋白質純化之方式依照The QIAexpressionistTM(fourth edition,Qiagen)所述之方法進行。將菌體懸浮於Lysis buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM imidazole,pH 8.0)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後。離心(8,000×g,15分鐘)收集上清液部分。將上清液注入含有1mL Ni-NTA樹脂之管柱中，此階段重組抗原會結合至樹脂上。之後加入15mL之Wash buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8.0)洗滌樹脂，此步驟之目的在於洗除非 特異性結合之蛋白質。最後加入20mL Elution buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM imidazole,pH 8.0)沖提樹脂上之重組抗原，此步驟乃是利用高濃度之imidazole與重組蛋白質競爭樹脂結合部位致使重組抗原自樹脂上被沖提下來。利用蛋白質電泳觀察重組抗原之純化情形。
經純化收集所得之本發明的候選抗原便可使用於後續的免疫試驗，以確定其是否適合作為抗豬黴漿菌之次單元疫苗的活性成分之用。
實施例三：本發明之候選抗原的豬隻免疫攻毒試驗
本實施例以本發明之前述候選抗原作為活性成分，製備次單元疫苗，並於活體豬隻中測試其效果。
疫苗製備
將一種純化之重組抗原或多種重組抗原與鋁膠佐劑均勻混合後，可製成次單位疫苗或雞尾酒疫苗。疫苗每劑之劑量為2mL，每劑每種蛋白質之含量為100μg。
本實施例共製備下表九所列樣本進行後續免疫試驗。
Figure TWI609878BD00014
Figure TWI609878BD00015
以M.hyopneumoniae PRIT-5所製成之疫苗Bayovac® MH-PRIT-5(控制組)、次單位疫苗(本發明樣本1-7)及雞尾酒疫苗(本發明樣本8、樣本9)進行豬隻免疫試驗。
由台灣動物科技研究所二代SPF豬舍所購入33頭4週齡SPF豬(每組3頭)。將所有豬隻飼養於SPF實驗豬舍待用，並使用相同的飼料、飼養環境及條件。
將實驗豬隻培養到35、及49日齡時，兩次以肌肉注射的方式注射2mL的疫苗以誘發免疫反應。
攻毒試驗
將前述經疫苗免疫之豬隻在109日齡時進行黴漿菌攻毒，以確認經疫苗建立之免疫效果。
首先，擷取一塊經黴漿菌感染之豬隻的肺臟(約3×3cm2)，於20mL的Friis培養基中將肺臟組織磨碎，再以148.8×g的轉速離心10分鐘。收集上清液到另一乾淨的離心管中，再以7,870×g的轉速離心40分鐘。接著，去除上清液，以6mL的Friis培養基將離心管中的沉澱物製為懸浮液。然後，依序以5μm、及0.45μm過濾膜 過濾前述懸浮液，即製得本實驗所需之攻毒菌液。
採用氣管攻毒的方式，將備得之攻毒菌液(5mL)打入經麻醉之實驗豬隻的氣管。攻毒28天後，將豬隻犧牲並進行解剖。取出實驗豬隻的肺部，進行免疫效果評估。病變點數的評估方式是，左右心葉及左右尖葉若有病變，則分別記為10分；心尖葉及左右膈葉若有病變，則分別記為5分。總分為55分。實驗結果及病變點數的評估結果請參第四圖。
參照第四圖，以未注射免疫疫苗的攻毒實驗豬隻的實驗結果為基礎，可知本發明的7個候選抗原皆具有與習用疫苗(Bayovac® MH-PRIT-5)相當的免疫效果。若進一步考量次單元疫苗較高的安全性，含本發明之候選抗原的次單位疫苗顯然更具價值。
另一方面，在同一疫苗中使用兩種得以引發免疫反應的抗原並非領域中常見的策略。原因是在同一疫苗中同時使用兩種抗原並不一定可使免疫效果加倍，反而可能會因為相互的排斥而造成免疫效果降低。從本實施例的實驗結果可知，本發明的樣本8和樣本9(雞尾酒疫苗)的免疫效果超乎預期的大幅度提升，顯見本發明之次單元疫苗不僅安全性高，當採用本發明之候選抗原的組合時，更可顯著地提升免疫效果。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範 疇中所做的修改。
<110> 財團法人台灣動物科技研究所
<120> 抗黴漿菌之次單位疫苗
<130>
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1125
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
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Figure TWI609878BD00131
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Figure TWI609878BD00133
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Figure TWI609878BD00134
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Figure TWI609878BD00135
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Claims (13)

  1. 一種蛋白質用於製備防治黴漿菌感染的組合物的用途，其中前述蛋白質具有SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或其組合所示之胺基酸序列。
  2. 一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其係包含PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、Mhp389、或其組合之蛋白質；及一生物可接受之佐劑；其中該PdhA具SEQ ID NO：08之胺基酸序列、XylF具SEQ ID NO：09之胺基酸序列、EutD具SEQ ID NO：10之胺基酸序列、Mhp145具SEQ ID NO：11之胺基酸序列、P78具SEQ ID NO：12之胺基酸序列、P132具SEQ ID NO：13之胺基酸序列、Mhp389具SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中前述活性成分係包含下列群組之蛋白質的至少兩種：PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、及Mhp389。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中前述活性成分為PdhA及p78。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中前述活性成分為XylF及Mhp145。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中前述活性成分的濃度為50至3500μg/mL，其係以前述組合物的總 體積為基礎。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中前述生物可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其進一步包含一生物可接受之添加劑。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之組合物，其中前述生物可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
  10. 一種用於防治黴漿菌感染的表現載體，其包含一質體，前述質體包含：一核苷酸序列，其係選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個：SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、及SEQ ID NO：07；一調控元件；及一融合伴子基因，其中前述融合伴子基因為大腸桿菌之msyB基因、yjgD基因、Lambda噬菌體D蛋白質基因、或麵包酵母菌SUMO蛋白質基因。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之表現載體，其中前述調控元件包含一啟動子及核醣體結合部位。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之表現載體，其中前述質體為pET-MSY、pET-YjgD、pET-D、或pET-SUMO。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之表現載體，其係利用於大腸桿菌表現系統之表現載體。
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