RU2737971C1 - Композиция для профилактики и лечения инфекции mycoplasma hyorhinis и способ получения указанной композиции - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению субъединичных вакцин против Mycoplasma hyorhinis, и может быть использовано в медицине для предотвращения заболевания, вызванного инфекцией Mycoplasma hyorhinis, выбранного из перитонита, плеврита, перикардита и отека суставов. Предложена вакцинная композиция на основе комбинации белков XylF, DnaK и P72 в сочетании с адъювантом. Для рекомбинантного получения активного начала вакцины в прокариотической экспрессирующей системе предложен экспрессирующий вектор, а также способ получения, который позволяет получить активное начало композиции в виде растворимого белка. Изобретение обеспечивает достижение сильного иммунного ответа против Mycoplasma hyorhinis. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл., 3 пр.

Description

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее раскрытие относится к композиции против инфекции Mycoplasma hyorhinis, в частности, к субъединичной вакцине против инфекции Mycoplasma hyorhinis.

ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ

[0002] Mycoplasma hyopneumoniae и Mycoplasma hyorhinis представляют собой основные патогены, вызывающие энзоотическую пневмонию свиней, SEP. Mycoplasma hyorhinis также участвует во вспышках полисерозита или артрита. Инфекция или Mycoplasma hyopneumoniae или Mycoplasma hyorhinis снижает эффективность кормления и вызывает замедление роста свиней и также делает свиней более уязвимыми для вторичной инфекции других вирусных или бактериальных патогенов, что, следовательно, ведет к экономическим потерям в свиноводстве. В мире производителями вакцин для животных разработаны инактивированные (убитые) вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae, которые широко используются в свиноводстве. Однако ни одна вакцина против Mycoplasma hyorhinis не появилась на рынке до сих пор. Введение инактивированных вакцин против Mycoplasma hyopneumoniae может лишь предотвращать инфекцию Mycoplasma hyopneumoniae, но не может защищать свиней от инфекции Mycoplasma hyorhinis.

[0003] Для того чтобы решить проблему недостаточной защиты у существующих вакцин, необходимо разработать вакцину против Mycoplasma hyorhinis. Стандартные вакцины в этой области преимущественно представляют собой инактивированные (убитые) вакцины. Поскольку Mycoplasma spp. не легко поддаются культивированию, среда для их культивирования является дорогостоящей, и концентрация Mycoplasma spp., получаемых из нее, не достаточно высока, стоимость изготовления инактивированной (убитой) вакцин против Mycoplasma hyorhinis остается высокой. Следовательно, субъединичную вакцину, которую легко получать и которая обладает высокой безопасностью, рассматривают в качестве другой возможности для разработки вакцины. До настоящего времени, антигены, пригодные для использования в вакцинах против Mycoplasma hyorhinis, не предложены ни в каком хорошо обоснованном отчете об исследованиях в этой области. Ввиду вышесказанного, основная цель настоящего раскрытия состоит в том, чтобы разработать дешевую и эффективную субъединичную вакцину против Mycoplasma hyorhinis, тем самым усовершенствуя общую работу по предотвращению эпидемий в свиноводстве.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Одна цель настоящего раскрытия состоит в получении субъединичной вакцины против инфекции Mycoplasma hyorhinis с улучшением, тем самым, работу по предотвращению эпидемий в свиноводстве.

[0005] Другая цель настоящего раскрытия состоит в получении экспрессирующего антиген вектора и разработке способа получения субъединичной вакцины, где ген антигена в указанном экспрессирующем векторе экспрессируют в прокариотической экспрессирующей системе, тем самым снижая стоимость производства указанной субъединичной вакцины.

[0006] В отношении достижения указанных целей, настоящее раскрытие относится к композиции для предотвращения заболеваний, обусловленных инфекцией Mycoplasma hyorhinis, которая содержит активный ингредиент, содержащий XylF, DnaK, P72 или их комбинацию, и адъювант; где указанный XylF содержит SEQ ID № 01, указанный DnaK содержит SEQ ID № 02 и указанный P72 содержит SEQ ID № 03; где указанное заболевание представляет собой по меньшей мере одно заболевание, выбранное из перитонита, плеврита, перикардита и отека суставов.

[0007] Предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит по меньшей мере два ингредиента, выбранных из группы, состоящей из XylF, DnaK, P72 или их комбинацию; более предпочтительно, указанный активный ингредиент содержит комбинацию XylF, DnaK и P72.

[0008] Предпочтительно, указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 300 мкг/мл, на основе общего объема указанной композиции.

[0009] Предпочтительно, указанный адъювант включает полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, гель оксида алюминия, поверхностно-активное средство, анионный полимер, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию.

[0010] Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой перитонит, плеврит или их комбинацию, при условии, что указанным активным ингредиентом является XylF.

[0011] Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой перитонит, при условии, что указанным активным ингредиентом является DnaK.

[0012] Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой плеврит, при условии, что указанным активным ингредиентом является P72.

[0013] Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой перитонит, плеврит, перикардит и отек суставов, при условии, что указанным активным ингредиентом является комбинация XylF, DnaK и P72.

[0014] Кроме того, настоящее раскрытие относится к экспрессирующему вектору для получения активного ингредиента указанной композиции в прокариотической экспрессирующей системе, где указанный экспрессирующий вектор содержит:

экспрессионный элемент, который содержит промотор и участок связывания рибосомы;

нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный XylF, указанный DnaK, указанный P72 или их комбинацию; и

последовательность, кодирующую партнера слияния;

где указанная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID № 04, SEQ ID № 05 или SEQ ID № 06 или их комбинацию.

[0015] Предпочтительно, партнер слияния представляет собой DsbC из E. coli, MsyB из E. coli, FklB из E. coli или их комбинацию. Более предпочтительно, для экспрессирующего вектора, указанным партнером слияния является DsbC из E. coli, при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует XylF; указанным партнером слияния является MsyB из E. coli, при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует DnaK; или указанным партнером слияния является FklB из E. coli, при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует P72.

[0016] Предпочтительно, указанный экспрессирующий вектор дополнительно содержит последовательность, кодирующую гистидиновую метку, глутатион-S-трансферазу (метку GST) или их комбинацию.

[0017] Предпочтительно, указанный экспрессирующий вектор содержит SEQ ID № 07, SEQ ID № 08 или SEQ ID № 09.

[0018] Предпочтительно, указанная прокариотическая экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему E. coli.

[0019] Настоящее раскрытие, кроме того, относится к способу получения растворимого белка; где указанный белок представляет собой XylF, DnaK, P72 или их комбинацию; где указанный способ включает

(1) получение прокариотической экспрессирующей системы; и

(2) экспрессию указанной нуклеотидной последовательности экспрессирующего вектора в указанной прокариотической экспрессирующей системе.

[0020] Предпочтительно, указанный способ дополнительно включает стадию пропускания продукта, полученного в вышеуказанной стадии (2), через аффинную колонку с ионами никеля или глутатионовую аффинную колонку для получения указанного растворимого белка.

[0021] В целом, настоящее раскрытие относится к композиции против инфекции Mycoplasma hyorhinis, с помощью которой можно обеспечить предотвращение заболеваний, обусловленных инфекцией Mycoplasma hyorhinis. В настоящем раскрытии также раскрыт экспрессирующий антиген вектор и способ получения указанного активного ингредиента указанной композиции в прокариотической экспрессирующей системе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0022] На фиг. 1 представлен результат электрофореза белков, который проводили в примере 3 для наблюдения растворимости рекомбинантного антигена по настоящему раскрытию (где T представляет общие клеточные лизаты и S представляет растворимую фракцию в общих клеточных лизатах.

[0023] На фиг. 2 представлен результат электрофореза белков, который проводили в примере 3 для наблюдения очистки рекомбинантного антигена по настоящему раскрытию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0024] Ввиду отсутствия композиций против инфекции Mycoplasma hyorhinis, авторы настоящего изобретения выполнили сложное исследование и доказали, что XylF, DnaK и P72, отдельно или в комбинации, можно использовать в качестве активных ингредиентов композиции для предотвращения заболевания, обусловленного инфекцией Mycoplasma hyorhinis. Термин «заболевание, обусловленное инфекцией Mycoplasma hyorhinis», в этом тексте означает по меньшей мере одно заболевание, выбранное из перитонита, плеврита, перикардита и отека суставов. В одном из вариантов осуществления «указанное заболевание, обусловленное инфекцией Mycoplasma hyorhinis», можно оценивать посредством способа, предложенного в Magnusson et al. (Vet. Immunol. Immunopathol., 61:83-96, 1998).

[0025] В одном из примеров результат эксперимента по настоящему раскрытию показывал, что XylF, когда его используют в качестве активного ингредиента композиции согласно настоящему раскрытию, в частности, можно использовать в облегчении перитонита, плеврита или их комбинации. В другом примере согласно настоящему раскрытию результат эксперимента показывал, что DnaK, когда его используют в качестве активного ингредиента композиции согласно настоящему раскрытию, в частности, можно использовать в облегчении перитонита. В дополнительном примере согласно настоящему раскрытию, результат эксперимента показывал, что P72, когда его используют в качестве активного ингредиента композиции согласно настоящему раскрытию, в частности, можно использовать в облегчении плеврита. В другом примере согласно настоящему раскрытию, результат эксперимента показывал, что комбинацию XylF, DnaK и P72, когда ее используют в качестве активных ингредиентов, в частности, можно использовать при условии, что заболевания, подлежащие облегчению, представляют собой перитонит, плеврит, перикардит и отек суставов.

[0026] В одном из аспектов, настоящее раскрытие относится к композиции для предотвращения заболеваний, обусловленных инфекцией Mycoplasma hyorhinis. Указанная композиция содержит активный ингредиент и адъювант. Термин «активный ингредиент» обозначает ингредиент, который позволяет достигать цели использования указанной композиции. Указанный активный ингредиент содержит XylF, DnaK, P72 или их комбинацию; где указанный XylF содержит SEQ ID № 01, указанный DnaK содержит SEQ ID № 02 и указанный P72 содержит SEQ ID № 03.

[0027] В одном из вариантов осуществления указанный активный ингредиент представляет собой ингредиент, выбранный из группы, состоящей из XylF, DnaK и P72. В другом варианте осуществления указанный активный ингредиент содержит два ингредиента, выбранных из группа, состоящей из XylF, DnaK и P72. В предпочтительном варианте осуществления указанный активный ингредиент представляет собой комбинацию XylF, DnaK и P72. Специалисту в данной области будет понятно, что указанный активный ингредиент может представлять собой рекомбинантный белок, который может содержать аминокислотные последовательности по меньшей мере двух белков, выбранных из группы, состоящей из XylF, DnaK и P72, при условии, что структура эпитопа каждого из XylF, DnaK и P72 не изменена. В альтернативном варианте осуществления указанная композиция может содержать смесь указанных активных ингредиентов, получаемую посредством смешивания по меньшей мере двух белков, выбранных из группы, состоящей из XylF, DnaK и P72.

[0028] Специалисту в данной области будет понятно, что если вакцина содержит два или более активных ингредиентов, ее эффект является непредсказуемым, в частности, когда указанные два или более активных ингредиентов направлены против одной и той же патогенной инфекции, поскольку нежелательный результат может возникать из-за взаимного влияния между указанными двумя или больше активными ингредиентами друг с другом. В другом аспекте, даже несмотря на то, что указанные два или более активных ингредиентов не взаимодействуют друг с другом и не возникает какой-либо нежелательный результат, все так же нет мотивации с экономической точки зрения для того, чтобы комбинировать указанные два или более активных ингредиентов в одной единственной вакцине, если объединение указанных двух или более активных ингредиентов не вызывает более хороший эффект (например, индукция более сильного иммунного ответ). Ввиду вышесказанного, объединение двух или более активных ингредиентов в одной единственной вакцине может иметь промышленные эффекты, только когда комбинация указанных двух или более активных ингредиентов может вызывать более хороший эффект. Однако без проведения экспериментов нельзя сказать, какой тип рассматриваемых ингредиентов или композиций может вызывать более хороший эффект.

[0029] В одном из вариантов осуществления указанный активный ингредиент указанной композиции имеет концентрацию от 50 до 300 мкг/мл, на основе общего объема указанной композиции. В предпочтительном варианте осуществления указанный активный ингредиент указанной композиции представляет собой комбинацию XylF, DnaK и P72, в которой каждый из XylF, DnaK и P72 имеет концентрацию 100 мкг/мл, на основе общего объема указанной композиции. Специалисту будет понятно, что указанную концентрацию можно корректировать в зависимости от цели применения композиции. Например, для того, чтобы сделать транспортировку и хранение композиции более удобными, специалист в данной области может получить указанную композицию с более высокой концентрацией указанного активного ингредиента(ов) и развести указанную композицию непосредственно перед использованием.

[0030] Термин «адъювант» имеет то же значение, которое общеизвестно в области лекарственных средств/вакцин. Например, указанный адъювант используют для усовершенствования иммуногенного эффекта указанных активных ингредиентов и/или стабилизации указанных активных ингредиентов. Указанный адъювант включает, но не ограничиваясь этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, гель оксида алюминия, поверхностно-активное средство, анионный полимер, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления указанный адъювант представляет собой гель оксида алюминия.

[0031] В другом аспекте настоящего раскрытия, настоящее раскрытие относится к экспрессирующему антиген вектору. Цель конструкции указанного экспрессирующего антиген вектора состоит в том, чтобы экспрессировать активный ингредиент (т. е. рекомбинантный антиген) указанной композиции в прокариотической экспрессирующей системе с тем, чтобы обеспечить массовую продукцию указанного рекомбинантного антигена. Несмотря на то, что проведено множество опытов по экспрессии белков в прокариотической экспрессирующей системе, различные условия экспрессии могут быть необходимы для различных белков в силу биоразнообразия. Следовательно, все еще необходимо проводить большое количество экспериментов для того, чтобы тестировать условия экспрессии любого конкретного антигена. Путем исследований согласно настоящему раскрытию, экспрессирующий вектор, который может экспрессировать рекомбинантные антигены в прокариотической экспрессирующей системе, успешно сконструирован, предпочтительно для экспрессирующей системы E. coli. Экспрессирующий вектор согласно настоящему раскрытию, который может экспрессировать рекомбинантные антигены в экспрессирующей системе E. coli, может быть легко модифицирован специалистом, тем самым позволяя экспрессирующему вектору согласно настоящему раскрытию экспрессировать рекомбинантные антигены в других прокариотических экспрессирующих системах.

[0032] В другом аспекте одной из существующих технических проблем при получении указанных активных ингредиентов является очистка указанных активных ингредиентов, экспрессируемых в указанной прокариотической экспрессирующей системе. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в прокариотической экспрессирующей системе, обычно имеют низкую растворимость, что повышает сложность и стоимость стадии выделения/очистки. Ввиду вышесказанного, экспрессирующий антиген вектор согласно настоящему раскрытию разрабатывают для того, чтобы он мог экспрессировать рекомбинантный белок, который имеет хорошую растворимость, тем самым упрощая стадию выделения/очистки рекомбинантного белка и снижая его стоимость.

[0033] Экспрессирующий вектор согласно настоящему раскрытию содержит экспрессионный элемент; нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный XylF, указанный DnaK, указанный P72 или их комбинацию; и последовательность, кодирующую партнер слияния. В одном из вариантов осуществления, в котором указанная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID № 04, SEQ ID № 05 или SEQ ID № 06 или их комбинацию. Специалист может модифицировать указанную нуклеотидную последовательность, в зависимости от кодонных предпочтение выбранной прокариотической экспрессирующей системы, при условии, что указанная нуклеотидная последовательность может кодировать указанный XylF, указанный DnaK, указанный P72 или их комбинацию.

[0034] В предпочтительном варианте осуществления исследование согласно настоящему раскрытию доказывает, что DsbC из E. coli, MsyB из E. coli, FklB из E. coli или их комбинацию предпочтительно использовать в качестве партнера слияния для экспрессии XylF, DnaK, P72 или их комбинации, тем самым придавая рекомбинантным белкам, получаемым в прокариотической экспрессирующей системе, желаемую растворимость. В другом предпочтительном варианте осуществления, для облегчения стадии очистки указанный экспрессирующий вектор дополнительно может содержать последовательность, кодирующую гистидиновую метку, метку GST или их комбинацию, тем самым получаемые рекомбинантные белки можно очищать посредством пропускания через аффинную колонку с ионами никеля или глутатионовую аффинную колонку.

[0035] В одном из вариантов осуществления указанный экспрессионный элемент по меньшей мере содержит промотор и участок связывания рибосомы для осуществления транскрипции и /или трансляции. В другом варианте осуществления, чтобы содействовать операции генетической инженерии, указанный экспрессирующий вектор дополнительно может содержать сайт множественного клонирования, состоящий из сайтов разрезания рестрикционных ферментов, селективный маркер или их комбинацию. Указанный селективный маркер может представлять собой ген устойчивости к антибиотику или ауксотрофный ген.

[0036] В другом аспекте настоящее раскрытие относится к способу получения растворимого белка, в котором указанный растворимый белок представляет собой XylF, DnaK, P72 или их комбинацию. Способ согласно настоящему раскрытию включает (1) получение прокариотической экспрессирующей системы; и (2) экспрессию гена антигена в экспрессирующем векторе в указанной прокариотической экспрессирующей системе. Термин «растворимый» в этом тексте относится к такому свойству, что указанный белок стремится растворяться в водном растворе. Термин «экспрессия» в этом тексте указывает, что экспрессирующий вектор индуцируют к транскрипции и трансляции целевого гена в вышеуказанной прокариотической экспрессирующей системе с помощью любых средств. Средства могут представлять собой, но не ограничиваясь этим, добавление изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) в указанную прокариотическую экспрессирующую систему.

Пример 1. Исследование белков, подходящих в качестве активных ингредиентов композиции согласно настоящему раскрытию

(1) Получение инактивированной вакцины против Mycoplasma hyorhinis

[0037] Mycoplasma hyorhinis (ATIT-7) культивировали в общеизвестной среде Фриза и затем использовали для того, чтобы получать инактивированную вакцину против Mycoplasma hyorhinis в соответствии со способом, как раскрыто в тайваньском патенте на изобретение № 1238721.

(2) Получение антисыворотки, направленной на Mycoplasma hyorhinis

[0038] Трех свиней SPF в возрасте 4 недель приобретали на свиноферме второго поколения SPF в Animal Technology Laboratories of Agricultural Technology Research Institute. Всех свиней кормили в одних и тех же условиях индуцирования в постройке для экспериментальных свиней SPF. Свиней индуцировали к возрасту 32 суток, 46 суток и 60 суток, соответственно, и в каждый из вышеуказанных моментов времени 2 мл инактивированной вакцины против Mycoplasma hyorhinis вводили свиньям посредством внутримышечной инъекции. Когда свиней индуцировали к возрасту 74 суток, у свиней из яремной вены брали образцы крови и держали их при комнатной температуре (приблизительно 25°C) в течение 1 часа. Затем образцы крови оставляли при 4°C. На следующий день образцы крови центрифугировали при 1107×g в течение 30 мин. Супернатант (а именно антисыворотку) переносили в чистую пробирку для центрифуги и хранили при -20°C для использования на последующих стадиях.

(3) Экстрагирование общего белка Mycoplasma hyorhinis

[0039] Общий белок экстрагировали из Mycoplasma hyorhinis с использованием набора для экстрагирования белка (набор для экстрагирования белка Ready Prep™; Bio-Rad, USA). Сначала Mycoplasma hyorhinis, культивированную в среде Фриза, центрифугировали (10,000×g, 20 мин) для того, чтобы собирать бактериальные клетки. Затем бактериальные клетки промывали 3 раза в низкосолевом буферном растворе (100 мМ основания Tris, 250 мМ сахарозы, pH 8,0), суспендировали в 1 мл буфера для образцов (полный 2-D буфер для регидратации/образцов) с добавлением 10 мкл восстанавливающего средства TBF (восстанавливающее средство ReadyPrep™ TBP), подходящего количества амфолита Bio-Lyte 3/10 (конечная концентрация амфолита 0,2%) и подходящего количества протеазного ингибитора. Бактериальные клетки разрушали обработкой ультразвуком. Разрушенные клетки удаляли посредством центрифугирования, и супернатант, который содержал общий белок Mycoplasma hyorhinis, сохраняли и использовали на последующих стадиях.

[0040] Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для анализа белка (RC DC^TM Protein Assay Kit; Bio-Rad, USA). 100 мкл указанного супернатанта, содержащего общий белок, смешивали тщательно с 500 мкл реактива RC I, и смесь помещали в комнатную температуру (приблизительно 25°C) и позволяли реакции протекать в течение 1 мин. Затем добавляли 500 мкл реактива RC II, тщательно смешивали и центрифугировали (15000×g, 5 мин). Осадители собирали и затем тщательно смешивали с 510 мкл реактива A'. Смесь помещали в комнатную температуру (приблизительно 25°C) и позволяли реакции протекать в течение 5 мин или до растворения всех осадителей. После этого 4 мл реактива B добавляли и смесь снова помещали в комнатную температуру (приблизительно 25°C) и позволяли реакции протекать в течение 15 мин. Поглощение раствора при длине волны 750 нм определяли посредством спектрофотометра. Бычий сывороточный альбумин (BSA) использовали в качестве стандартного образца для создания калибровочной кривой зависимости концентрации белка от поглощения. Концентрацию общих белков в указанном супернатанте можно получать посредством интерполяции поглощения образца супернатанта на калибровочной кривой и вычисления концентрации общего белка в нем. Образец с известной концентрацией общего белка можно использовать на последующей стадии электрофореза белков.

(4) Двухмерный электрофорез белков

[0041] Двухмерный электрофорез белков включает две стадии: электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF) и электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), как указано в следующих абзацах.

Электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF)

[0042] Электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF) представляет собой прием для разделения различных белков по различиям в их изоэлектрических точках. Сначала брали 1 мг супернатанта, содержащего общий белок Mycoplasma hyorhinis, и смешивали с подходящим количеством буфера для регидратации таким образом, что общий объем получаемой смеси составлял 400 мкл. Затем смесь добавляли в щели для образцов в планшете для фокусирования (Bio-Rad, USA). Два куска фильтровальной бумаги, которую увлажняли дистиллированной деионизированной водой, помещали, соответственно, на положительный электрод и отрицательный электрод. Указанная фильтровальная бумага может адсорбировать примеси и соли в образце, тем самым избегая влияния указанных примесей и слей на последующий эксперимент и повреждение электродов. Затем IPG гелевую полоску, а именно ReadyStrip™ (pH 5-8/17 см) медленно помещали в планшет для фокусирования. Брали 2,5 мл минерального масла и распределяли его равномерно по IPG гелевой полоске для того, чтобы избегать испарения образца, которое могло влиять на последующий эксперимент. Планшет для фокусирования накрывали крышкой и помещали на прибор с ячейкой для электрофореза с изоэлектрическим фокусированием PROTEAN IEF (Bio-Rad, USA). После того, как задавали программу для ячейки PROTEAN IEF, одномерный электрофорез проводили в 5 этапов. Первый этап представляет собой регидратацию при 50 В в течение 12 часов, чтобы заставлять IPG гелевую полоску абсорбировать образец. Второй этап представляет собой удаление ионов солей и примесей при 250 В в течение 15 мин. Третий этап представляет собой повышение напряжения, в котором напряжение линейно повышают до фокусирующего напряжения 10000 В за 4 часа. Четвертый этап представлял собой стадию изоэлектрического фокусирования, проводимую при 50000 В×ч. Пятый этап представлял собой поддержание напряжения 500 В для того, чтобы избегать избыточной реакции. После завершения одномерного электрофореза, IPG гелевую полоску можно хранить при -80°C, или после уравновешивания быстро использовать на последующей стадии SDS-PAGE.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)

[0043] Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия представляет собой прием для разделения различных белков по различиям в их молекулярной массе. Сначала, после промывания IPG гелевой полоски деионизированной водой, минеральное масло и воду на обратной стороне геля абсорбировали с помощью фильтровальной бумаги. Затем IPG гелевую полоску помещали в одноразовый регидратационный планшет. Туда добавляли 6 мл уравновешивающего буфера I (6 M мочевина, 2% SDS, 0,375 M Tris, 20% глицерин, 130 мМ DTT, pH 8,8) и получаемую смесь встряхивали в течение 20 мин. Затем вынимали IPG гелевую полоску и уравновешивающий буфер I, оставшийся на обратной стороне геля, абсорбировали фильтровальной бумагой. IPG гелевую полоску снова помещали в одноразовый регидратационный планшет. Туда добавляли 6 мл уравновешивающего буфера II (6 M мочевина, 2% SDS, 0,375 M Tris, 20% глицерин, 135 мМ йодацетамид, pH 8,8) и получаемую смесь встряхивали в течение 20 мин. После завершения указанной уравновешивающей обработки проводили SDS-PAGE.

[0044] Сначала получали 12,5% разделяющий гель. IPG гелевую полоску помещали на верхнюю поверхность разделяющего геля. Затем туда добавляли подходящее количество растворенной агарозы (ReadyPrep™ Overlay Agarose, Bio-Rad, USA). Чтобы сделать определение молекулярной массы более удобным, фильтровальную бумагу с точками стандартов молекулярных масс белков на ней помещали рядом IPG гелевой полоской. После коагуляции агарозы, гелевую полоску и фильтровальную бумагу со стандартами молекулярных масс белков фиксировали на разделяющем геле. Кусок электрофоретического геля помещали в электрофоретический сосуд (Bio-Rad, USA) и электрофоретический буфер (25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,3) вводили в сосуд. Электрофорез проводили при электрическом токе 26 мА в течение 15 часов, тем самым разделяя белки с различными молекулярными массами.

(5) Способ вестерн-блоттинга

[0045] После электрофореза белков, вышеуказанный кусок геля погружали в буфер для блоттинга [25 мМ основания Tris, 192 мМ глицина, 10% (об./об.), метанол, pH 8,3]. PVDF пленку обрезали до надлежащего размера и погружали в метанол на несколько секунд, затем промывали 1 раз деионизированной водой и погружали в буфер для блоттинга. После погружения куска геля и PVDF пленки в буфер для блоттинга на 15 мин, кусок фильтровальной бумаги, кусок геля, PVDF пленку и еще один кусок фильтровальной бумаги помещали последовательно в аппарат для переноса блоттингом и проводили перенос при электрическом токе 1300 мА в течение 1,5 часа.

[0046] После завершения переноса, указанную PVDF пленку погружали в блокирующий буфер [20 мМ основание Tris, 150 мМ NaCl, 5% (масс./об.) снятое молоко, pH 7,4] при комнатной температуре в течение 1 часа. Подходящее количество антисыворотки (разведение в 1000 раз) против Mycoplasma hyorhinis, полученной в вышеуказанном эксперименте, добавляли и встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После того, как блокирующий раствор выливали и указанную PVDF пленку промывали подходящим количеством буфера TBST [20 мМ основание Tris, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,4] 3 раза (5 мин/раз), добавляли блокирующий буфер, содержащий конъюгированное с щелочной фосфатазой IgG козы против свиньи (H+L) (разведение 2000 раз). После встряхивания в темноте в течение 1 часа, указанную PVDF пленку промывали буфером TBST 3 раза и затем раствор NBT/BCIP (Thermo Fisher Scientific, USA) добавляли для того, чтобы индуцировать реакцию развития окраски.

(6) Идентификация белков

[0047] Окрашенные точки (всего 17 точек, не показано на фиг.), как показано в результатах реакции развития окраски в указанном способе вестерн-блоттинга, показывали белки Mycoplasma hyorhinis, способные реагировать с антисывороткой против Mycoplasma hyorhinis. Сравнивая вышеуказанный результат реакции развития окраски с куском геля, который подвергали электрофорезу, полосы куска геля, которые находились в положении, соответствующем положению окрашенных точек, брали с помощью микропипетки и использовали в масс-спектрометрическом анализе. Идентификацию белков, полученных выше, проводили посредством сравнения их аминокислотных последовательностей с базой данных о последовательностях белков. Как результат, идентифицировали 3 белка, а именно XylF, DnaK и P72, которые, соответственно, имеют последовательности, как показано в SEQ ID № 01, SEQ ID № 02 и SEQ ID № 03. Настоящее раскрытие продолжает последующее исследование этих 3 белков.

Пример 2. Конструкция экспрессирующего вектора согласно настоящему раскрытию

(1) Точечная мутация и клонирование генов антигенов

[0048] В соответствии с данными из National Center for Biotechnology Information (NCBI) of America, последовательности указанных генов XylF, DnaK и P72, соответственно, имели 4, 1 и 8 кодонов TGA. Кодон TGA считали терминирующим кодоном в экспрессирующей системе E. coli. Для того чтобы избегать неспособности экспрессирующей системы E. coli продуцировать полноразмерные вышеуказанные белки, кодоны TGA в последовательностях генов антигенов мутировали в кодоны TGG посредством полимеразной цепной реакции.

Экстрагирование геномной ДНК Mycoplasma hyorhinis

[0049] Геномную ДНК Mycoplasma hyorhinis экстрагировали с использованием набора для очистки ДНК (Tissue & Cell Genomic DNA Purification Kit; GMbiolab, Taiwan). Сначала 4,5 мл жидкой культуры Mycoplasma hyorhinis брали и помещали в пробирку для центрифуги. После центрифугирования (5870×g, 5 мин), выливали супернатант и собирали осадок. Затем добавляли 20 мкл протеазы K (10 мг/мл) и 200 мкл реактива для экстрагирования и оставляли реагировать при 56°C в течение 3 часов. Добавляли 200 мкл связывающего раствора и оставляли реагировать при 70°C в течение 10 мин. После завершения реакции 200 мкл абсолютного спирта добавляли и переносили в микропробирку для центрифуги и тщательно смешивали, получаемый раствор (включая преципитат) пипетировали в центрифужную колонку, и затем помещали центрифужную колонку в собирающую пробирку. После центрифугирования (17970×g) в течение 2 мин, супернатант выливали и в центрифужную колонку снова добавляли 300 мкл связывающего реактива. После центрифугирования (17970×g) в течение 2 мин, супернатант выливали. 700 мкл промывающего раствора добавляли в центрифужную колонку и смесь центрифугировали (17970×g) в течение 2 мин и затем выливали супернатант. Вышеуказанную стадию промывания повторяли один раз. В конце смесь центрифугировали при 17970×g в течение 5 мин для того, чтобы удалять оставшийся спирт. Центрифужную колонку помещали в стерилизованную микропробирку для центрифуги и добавляли подходящее количество стерильной деионизированной воды, чтобы смывать геномную ДНК.

Точечная мутация гена антигена XylF

[0050] Разрабатывали праймеры XylF/XylR и мутационные праймеры от XylM1 до XylM8 для гена антигена XylF, последовательности этих праймеров перечислены в таблице 1.

Таблица 1

SEQ ID №	Праймер	Последовательность (от 5' к 3')
SEQ ID № 10	XylF	GATATAGGATCCTCATTTGTAGCTTGTGGAACAACAG
SEQ ID № 11	XylR	CAATATGTCGACTTGTGTTACACCATTAGTTGGTACTGTACC
SEQ ID № 12	XylM1	GATCCAGATAATCCAAGATGGATTAATGCACAAAAAGATA
SEQ ID № 13	XylM2	TATCTTTTTGTGCATTAATCCATCTTGGATTATCTGGATC
SEQ ID № 14	XylM3	CAAAATGCACAAAACAACTGGTTAACTCAACAAGCAAACT
SEQ ID № 15	XylM4	AGTTTGCTTGTTGAGTTAACCAGTTGTTTTGTGCATTTTG
SEQ ID № 16	XylM5	GGTTCAACTTCATATGATTGGTATGTTTCTTACGATAATG
SEQ ID № 17	XylM6	CATTATCGTAAGAAACATACCAATCATATGAAGTTGAACC
SEQ ID № 18	XylM7	TTATGTTCCAGGATGGAATTACGGAGACGCTG
SEQ ID № 19	XylM8	CAGCGTCTCCGTAATTCCATCCTGGAACATAA

[0051] Используя геномную ДНК Mycoplasma hyorhinis в качестве матрицы, фрагменты ДНК амплифицировали с использованием пар праймеров XylF/XylM2, XylM1/XylM4, XylM3/XylM6, XylM5/XylM8 и XylM7/XylR и т. д., соответственно. 50 мкл реакционной смеси ПЦР содержали 1× GDP-HiFi ПЦР буфер B, 200 мкМ dNTP (dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 1 мкМ праймеров для амплификации, 200 нг геномной ДНК Mycoplasma hyorhinis и 1 Ед. GDP-HiFi ДНК полимеразы. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 5 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия).

[0052] После завершения ПЦР, электрофорез в агарозном геле проводили для того, чтобы подтверждать, имеют ли место фрагменты ДНК с предсказанными размерами. ПЦР продукты извлекали с помощью набора для системы экстрагирования гелей Gel-M™. Амплификацию гена проводили с использованием 5 извлеченных ПЦР продуктов в качестве матриц и пары праймеров XylF/XylR. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 2 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 45 с (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия). Ген XylF с точечной мутацией получали посредством указанной ПЦР. Продукты ПЦР извлекали с помощью PCR-M^TM Clean Up System Kit. В соответствии с результатом определения последовательности, ген XylF согласно настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID № 4.

Точечная мутация гена антигена DnaK

[0053] Разрабатывали праймеры DnaKF/DnaKR и мутационные праймеры от DnaKM1 до DnaKM2 для гена антигена DnaK, последовательности этих праймеров перечислены в таблице 2.

Таблица 2

SEQ ID №	Праймер	Последовательность (от 5' к 3')
SEQ ID № 20	DnaKF	GATATAGGATCCATGGCAAAAGAAATTATTTTAGGAATAGATTTAG
SEQ ID № 21	DnaKR	CAATATGTCGACTTAATTTTCTTTAACTTCAGCTTCAATTGGTTG
SEQ ID № 22	DnaKM1	GATGACTGTGATCATGTTATTGTTGATTGGTTAGTTGACAAAATTAAAAAAGAATATG
SEQ ID № 23	DnaKM2	CATATTCTTTTTTAATTTTGTCAACTAACCAATCAACAATAACATGATCACAGTCATC

[0054] Используя геномную ДНК Mycoplasma hyorhinis в качестве матриц, фрагменты ДНК амплифицировали посредством соответствующего использования пар праймеров DnaKF/DnaKM2 и DnaKM1/DnaKR. 50 мкл реакционной смеси ПЦР содержали 1× GDP-HiFi ПЦР буфер B, 200 мкМ dNTP (dATP, dTTP, dGTP, и dCTP), 1 мкМ праймеров для амплификации, 200 нг геномной ДНК Mycoplasma hyorhinis и 1 Ед. GDP-HiFi ДНК полимеразы. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 5 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия).

[0055] После завершения ПЦР, электрофорез в агарозном геле проводили для того, чтобы подтверждать, имеют ли место фрагменты ДНК с предсказанными размерами. ПЦР продукты извлекали с помощью набора для системы экстрагирования гелей Gel-M™. Амплификацию гена проводили с использованием 2 извлеченных ПЦР продуктов в качестве матриц и пары праймеров DnaKF/DnaK. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 2 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 45 с (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия). Ген DnaK с точечной мутацией получали посредством указанной ПЦР. Наконец, продукты ПЦР извлекали посредством PCR-M™ Clean Up System Kit. В соответствии с результатом определения последовательности, ген DnaK согласно настоящему раскрытию имел нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID № 5.

Точечная мутация гена P72

[0056] Разрабатывали праймеры P72F/P72R и мутационные праймеры от P72M1 до P72M8 для гена антигена P72, последовательности этих праймеров перечислены в таблице 3.

Таблица 3

SEQ ID №	Праймер	Последовательность (от 5' к 3')
SEQ ID № 24	P72F	CAATATGGATCCTCTTGTGGACAACCAACCACAATTAAATTTG
SEQ ID № 25	P72R	GTATAAGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGCTGCAGATTTTTCGGCCATAAAATC
SEQ ID № 26	P72M1	CTTCTCAAGGTTCATATTGGCCAATGATGCTAGGAATG
SEQ ID № 27	P72M2	CATTCCTAGCATCATTGGCCAATATGAACCTTGAGAAG
SEQ ID № 28	P72M3	ACTAAGCAAAGCTCTGATTGGAATCTTATTTTAGGAAACA
SEQ ID № 29	P72M4	TGTTTCCTAAAATAAGATTCCAATCAGAGCTTTGCTTAGT
SEQ ID № 30	P72M5	CTTTCTAAAACTAATAAAACTTTTTGGAGTGAAAAAAGTTTACAAAATAACAA
SEQ ID № 31	P72M6	TTGTTATTTTGTAAACTTTTTTCACTCCAAAAAGTTTTATTAGTTTTAGAAAG
SEQ ID № 32	P72M7	GTTGAAAACCAATATCAAGAATGGGAAAACACTTTAAAACAAACAC
SEQ ID № 33	P72M8	GTGTTTGTTTTAAAGTGTTTTCCCATTCTTGATATTGGTTTTCAAC
SEQ ID № 34	P72M9	CAAGCAAATACTGAAACTACTTCATGGACAAAAAAAGATATTCAAACTAAATC
SEQ ID № 35	P72M10	GATTTAGTTTGAATATCTTTTTTTGTCCATGAAGTAGTTTCAGTATTTGCTTG
SEQ ID № 36	P72M11	CTGAATACTTTAAACCTATAAATCAATGGGGATCTTTTGAAATTAGACAATATTTAAC
SEQ ID № 37	P72M12	GTTAAATATTGTCTAATTTCAAAAGATCCCCATTGATTTATAGGTTTAAAGTATTCAG
SEQ ID № 38	P72M13	CTATTCTGTAGATTCTCCTTGGTCACGTGCATTTTTTAAAAAAG
SEQ ID № 39	P72M14	CTTTTTTAAAAAATGCACGTGACCAAGGAGAATCTACAGAATAG
SEQ ID № 40	P72M15	GAAAACAAAAAGCTTCAGAATGGACAACAAGAGAAGATGTTTATG
SEQ ID № 41	P72M16	CATAAACATCTTCTCTTGTTGTCCATTCTGAAGCTTTTTGTTTTC

[0057] Используя геномную ДНК Mycoplasma hyorhinis в качестве матриц, фрагменты ДНК амплифицировали посредством соответствующего использования пар праймеров P72F/P72M2, P72M1/P72M4, P72M3/P72M6, P72M5/P72M8, P72M7/P72M10, P72M9/P72M12, P72M11/P72M14, P72M13/P72M16 и P72M15/P72R. 50 мкл реакционной смеси ПЦР содержали 1× GDP-HiFi ПЦР буфер B, 200 мкМ dNTP (dATP, dTTP, dGTP, и dCTP), 1 мкМ праймеров для амплификации, 200 нг геномной ДНК Mycoplasma hyorhinis и 1 Ед. GDP-HiFi ДНК полимеразы. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 5 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия).

[0058] После завершения ПЦР, электрофорез в агарозном геле проводили для того, чтобы подтверждать, имеют ли место фрагменты ДНК с предсказанными размерами. ПЦР продукты извлекали с помощью набора для системы экстрагирования гелей Gel-M™. Амплификацию гена проводили с использованием 9 извлеченных ПЦР продуктов в качестве матриц и пары праймеров P72F/P72R. Условия реакции ПЦР представляют собой 96°C в течение 2 мин (одна стадия); 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 68°C в течение 1 мин (35 циклов); и 68°C в течение 5 мин (одна стадия). Ген P72 с точечной мутацией получали посредством указанной ПЦР. Наконец, продукты ПЦР извлекали посредством PCR-M™ Clean Up System Kit. В соответствии с результатом определения последовательности, ген P72 согласно настоящему раскрытию имел нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID № 6.

(2) Конструкция экспрессирующих векторов для антигенов Mycoplasma hyorhinis

[0059] Экспрессирующие векторы для антигенов Mycoplasma hyorhinis конструировали с использованием векторов, содержащих различные гены партнеров слияния, в качестве остова. Гены партнеров слияния, соответственно, представляют собой последовательности ДНК DsbC, MsyB, FklB из E. coli. Схема создания указанных экспрессирующих векторов представляет собой следующее.

[0060] Ген XylF, ген DnaK и ген P72 согласно настоящему раскрытию, полученные в вышеприведенных экспериментах, соответственно, резали с помощью BamHI и SalI и затем, с использованием T4 ДНК лигазы, фрагменты ДНК, полученные выше, соответствующим образом лигировали в слитый с геном DsbC экспрессирующий вектор, слитый с геном MsyB экспрессирующий вектор или слитый с геном FklB экспрессирующий вектор, которые резали с использованием тех же рестрикционных ферментов. После этого лигированные продукты трансформировали в E. coli ECOS 9-5. Трансформированные штаммы отбирали посредством ПЦР колоний. Электрофорез ДНК проводили для того, чтобы подтверждать, если имели место фрагменты ДНК с предсказанными размерами. После подтверждения того, что рекомбинантные векторы из трансформированных штаммов несли вставленную ДНК, векторы экстрагировали из трансформированных штаммов и определяли их последовательности ДНК. Векторы с правильными последовательностями ДНК, соответственно, называли pET-DsbC-XylF (SEQ ID № 07), pET-MysB-DnaK (SEQ ID № 08) и pET-FklB-P72 (SEQ ID № 09).

Пример 3. Получение и применение субъединичной вакцины согласно настоящему раскрытию

(1) Экспрессия рекомбинантных антигенов посредством экспрессирующих векторов согласно настоящему раскрытию

[0061] Вектор для экспрессии антигенов Mycoplasma hyorhinis трансформировали в E. coli BL21 (DE3). Одну колонию штамма, экспрессирующего антигены, выбирали и инокулировали в 12 мл среды LB, содержащей канамицин (конечная концентрация: 30 мкг/мл), затем культивировали при 37°C и в условиях 180 об./мин в течение ночи. После этого, 10 мл жидкой культуры E. coli брали и добавляли в 1 л среды LB, содержащей канамицин (конечная концентрация: 30 мкг/мл), и культивировали при встряхивании (37°C, 180 об./мин) до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигала приблизительно 0,4-0,6. Затем добавляли 0,1 мМ IPTG при 28°C для того, чтобы индуцировать экспрессию белка. После индуцирования в течение 4 часов, культуру центрифугировали (10000×g, 10 мин, 4°C) для того, чтобы собирать бактериальные клетки. После бактериальные клетки ресуспендировали в 10 мл фосфатного буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,4) и разрушали посредством обработки ультразвуком, суспензию центрифугировали (30966×g, 30 мин) для того, чтобы собирать супернатант. Наконец, супернатант фильтровали через фильтровальную мембрану с размером пор 0,22 мкМ и собирали фильтрат. Электрофорез белков проводили для того, чтобы наблюдать статус экспрессии и растворимость рекомбинантных антигенов. Результат показан на фиг. 1. На фиг. 1 можно наблюдать, что E. coli хорошо экспрессировали рекомбинантные антигены согласно настоящему раскрытию. Кроме того, рекомбинантные антигены согласно настоящему раскрытию имели превосходную растворимость, что указывает на то, что партнеры слияния, выбранные в настоящем раскрытии, являются подходящими.

[0062] Затем использовали аффинную хроматографию с иммобилизованными ионами металлов для очистки белка через ковалентное связывание между гистидиновой меткой на рекомбинантных антигенах и ионами никеля или ионами кобальта. Рекомбинантные антигены очищали с помощью ÄKTA Prime Plus (GE Healthcare, Sweden), оборудованного 5 мл колонкой HiTrap™ Ni excel (GE Healthcare, Sweden). Сначала вышеуказанный супернатант вводили в колонку HiTrap™ Ni excel, затем колонку уравновешивали с использованием 25 мл фосфатного буферного раствора. После завершения введения образца, 100 мл буферного раствора для промывания, содержащего 30 мМ имидазола (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазола, pH 7,4), использовали для промывания колонки с тем, чтобы можно было удалять белки, не специфически прилипшие к ней. Наконец, 150 мл элюирующего буферного раствора, содержащего 250 мМ имидазола (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 7,4), использовали для вымывания рекомбинантных антигенов из смолы, где имидазол в высокой концентрации может конкурировать за сайт связывания на смоле с рекомбинантными антигенами и, тем самым, вызывать вымывание рекомбинантных антигенов. Раствор очищенного антигена помещали в пробирку для центрифуги Amicon™ ultra-15 ultracel-30K (Merck Millipore, USA), центрифугировали (2600×g) ниже 4°C, корректировали до подходящего объема и затем хранили при 4°C для использования на последующей стадии. Результат очистки показан на фиг. 2. На фиг. 2 можно видеть, что рекомбинантные антигены согласно настоящему раскрытию, полученные в этом эксперименте, имели высокую чистоту.

(2) Получение субъединичной вакцины согласно настоящему раскрытию и тест на протективный иммунный ответ на нее

[0063] При условиях, как показано в таблицах в следующих абзацах, рекомбинантные антигены согласно настоящему раскрытию, полученные в вышеуказанном эксперименте, соответствующим образом тщательно смешивали с адъювантом (гель оксида алюминия), тем самым получая различные субъединичные вакцины, содержащие один антиген, и вакцинные коктейли, содержащие несколько антигенов. Доза вакцины составляла 2 мл/доза, где содержание каждого рекомбинантного антигена, содержащегося в вакцине, составляло 200 мкг.

Эксперимент 1 по определению протективного иммунного ответа на вакцину из одного антигена

[0064] Этот эксперимент проводили в здании для генетически модифицированных организмов (GMO) в Animal Drugs Inspection Branch of Animal Health Research Institute. 12 свиней в возрасте 3 недель, у которых тесты показали отсутствие антител к Mycoplasma hyorhinis, случайно разделяли на группы с A до D. В каждой группе было по 3 свиньи, где группы с A до C представляли собой экспериментальные группы и группа D представляла собой контрольную группу. Каждую из свиней из групп с A до C иммунизировали вакциной из этого эксперимента через внутримышечную инъекцию (2 мл/доза) один раз, соответственно, в возрасте 3 недель и в возрасте 5 недель. Свиней группы D не иммунизировали. Компоненты вакцин как показаны в таблице 4.

Таблица 4

Группа	Вакцина	Компонент/доза
		XylF (мкг)	DnaK (мкг)	P72 (мкг)
Группа A	V-001	200	-	-
Группа B	V-002	-	200	-
Группа C	V-003	-	-	200
Группа D	-	-	-	-

[0065] Когда свиньи были в возрасте 7 недель (то есть, через 2 недели после иммунизации), тест абдоминальной стимуляции проводили с использованием среды для культивирования, содержащей выделенный дикий штамм ATIT-2 Mycoplasma hyorhinis. Когда свиньи были в возрасте 10 недель (то есть, через 3 недели после теста стимуляции), проводили патологоанатомическое исследование. Вычисляли процентные доли патологических изменений, таких как перитонит, плеврит, перикардит и отек суставов и т. д. Видимые патологические изменения оценивали в соответствии со способом из Magnusson et al. (Vet. Immunol. Immunopathol., 61:83-96, 1998).

[0066] Результат эксперимента показан в таблице 5. Субъединичная вакцина, полученная из XylF, может снижать заболеваемость перитонитом и плевритом свиней, кроме того, усредненные оценки патологических изменений у иммунизированных свиней были ниже таковых у не иммунизированных свиней (контрольная группа), что указывает на то, что XylF может индуцировать значимый протективный иммунный ответ. Субъединичные вакцины, полученные из DnaK и P72, соответственно, могут снижать заболеваемость перитонитом и плевритом.

[0067] Следует отметить, что данные в таблице 5 не следует интерпретировать как то, что субъединичная вакцина, полученная из XylF, благоприятна только в облегчении перитонита и плеврита, они лишь указывают на то, что субъединичная вакцина, полученная из XylF, имела менее заметный эффект в облегчении других состоянии в течение эксперимента. По той же причине данные в таблице 5 не следует интерпретировать как то, что субъединичные вакцины, полученные из DnaK и из P72, благоприятны, соответственно, в облегчении только перитонита и плеврита, они лишь указывают на то, что субъединичная вакцина, полученная из DnaK или из P72, оказывает менее заметный эффект в облегчении других состояний в течение эксперимента.

Таблица 5

Группа	Оценка патологических изменений
	Перитонит	Плеврит	Перикардит	Отек суставов	Общая оценка	Усредненная оценка
A	1	0	2	4	7	2,3
B	1	4	3	7	15	5
C	3	0	0	8	11	3,6
D	3	3	0	4	10	3,3

Эксперимент 2 по определению протективного иммунного ответа вакцинного коктейля

[0068] Этот эксперимент проводили в здании для генетически модифицированных организмов (GMO) в Animal Drugs Inspection Branch of Animal Health Research Institute. 24 свиньи в возрасте 4 недель, у которых тесты показывали отсутствие антител к Mycoplasma hyorhinis, отбирали и случайно разделяли на 2 группы, а именно группу иммунизации (группа E) и контрольную группу (группа F). В каждой группе было 12 свиней. Каждую из свиней группы иммунизации иммунизировали вакциной из этого эксперимента через внутримышечную инъекцию (2 мл/доза) один раз, соответственно, в возрасте 4 недель и в возрасте 6 недель. Свиней из контрольной группы не иммунизировали. Компоненты вакцины показаны в таблице 6.

Таблица 6

Группа	Вакцина	Компонент/доза
		XylF (мкг)	DnaK (мкг)	P72 (мкг)
Группа E	V-004	200	200	200
Группа F	-	-	-	-

[0069] Результат эксперимента показан в таблице 7. Вакцинный коктейль согласно настоящему раскрытию (содержащий смесь 3 рекомбинантных антигенов согласно настоящему раскрытию в этом эксперименте) может значительно облегчать клинические симптомы перитонита, плеврита, перикардита и отека суставов и т. д., которые обусловлены инфекцией Mycoplasma hyorhinis, и он демонстрировал более хороший эффект по сравнению с эффектом субъединичной вакцины, содержащей один антиген (как показано в таблице 5).

Таблица 7

Группа	Оценка патологических изменений
	Перитонит	Плеврит	Перикардит	Отек суставов	Общая оценка	Усредненная оценка
E	8	10	8	9	35	2,9
F	18	16	12	23	69	5,8

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Agricultural Technology Research Institute

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ MYCOPLASMA HYORHINIS И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОЙ КОМПОЗИЦИИ

<140> PCT/CN2016/094104

<141> 2016-08-09

<160> 41

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> Белок

<213> Mycoplasma hyorhinis

<400> 1

Met Lys Lys Leu Ile Thr Lys Lys Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Ile Ser

1 5 10 15

Thr Ala Ser Phe Ile Ala Phe Ala Ser Phe Val Ala Cys Gly Thr Thr

20 25 30

Ala Thr Gly Leu Ser Gln Thr Lys Asp His Ala Val Thr Asn Glu Ser

35 40 45

Ile Arg Val Ala Leu Thr Asp Pro Asp Asn Pro Arg Trp Ile Asn Ala

50 55 60

Gln Lys Asp Ile Leu Asn Tyr Ile Asp Lys Thr Glu Gly Ala Ile Ser

65 70 75 80

Thr Ile Thr Lys Asp Gln Asn Ala Gln Asn Asn Trp Leu Thr Gln Gln

85 90 95

Ala Asn Leu Asn Pro Ala Pro Lys Gly Phe Ile Ile Ala Pro Glu Asn

100 105 110

Gly Gly Gly Val Gly Thr Ala Val Asn Ser Ile Ala Glu Lys Asn Ile

115 120 125

Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg Leu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Asp

130 135 140

Trp Tyr Val Ser Tyr Asp Asn Glu Lys Val Gly Glu Leu Gln Gly Leu

145 150 155 160

Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Gly Lys Thr Asp Gly Ala Phe Lys Asp

165 170 175

Glu Thr Glu Met Leu Asn Tyr Leu Lys Asp His Met Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Val Ser Phe Tyr Ala Val Ala Gly Ser Gln Asp Asp Asn Asn Ser Gln

195 200 205

Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Leu Met Glu Asn

210 215 220

Ser Asn Gly Lys Val Val Asp Leu Ser Pro Arg Gly Asn Ala Val Tyr

225 230 235 240

Val Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Asp Ala Gly Gln Arg Ile Gln Gln Phe

245 250 255

Phe Thr Gln Tyr Arg Asp Ser Ser Val Pro Asn Gly Val Leu Pro Val

260 265 270

Thr Tyr Asp Asn Val Thr Ile Pro Lys Ser Val Leu Lys Gly Phe Leu

275 280 285

Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala Val Asp Lys Leu Lys Ala

290 295 300

Thr Asn Tyr Asp Val Gln Lys Val Phe Ile Thr Gly Gln Asp Tyr Asn

305 310 315 320

Asp Thr Ala Lys Lys Leu Ile Lys Asn Gly Glu Gln Asn Met Thr Ile

325 330 335

Tyr Lys Pro Asp Val Ile Leu Gly Lys Val Ala Val Glu Val Leu Lys

340 345 350

Thr Leu Ile Asn Lys Lys Lys Ala Asn Ala Thr Ala Thr Lys Glu Asp

355 360 365

Val Glu Asn Ala Leu Lys Asn Asn Glu Asn Thr Lys Asp Ile His Phe

370 375 380

Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Tyr Lys Ala Gly Ser Val Gly Ala Tyr Lys

385 390 395 400

Asn Ile Lys Ala Ile Leu Val Asn Pro Val Val Val Thr Lys Gln Asn

405 410 415

Val Asp Asn Pro Leu Ala Asn Ala Gln Gln Ser Thr Ser Ala Asn Val

420 425 430

Ser Val Ser Ala Ser Gly Thr Val Pro Thr Asn Gly Val Thr Gln

435 440 445

<210> 2

<211> 597

<212> Белок

<213> Mycoplasma hyorhinis

<400> 2

Met Ala Lys Glu Ile Ile Leu Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Val Val Ser Ile Ile Glu Asn Gly Lys Pro Val Val Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Asn Gly Lys Asn Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Lys Asn Gly Glu

35 40 45

Glu Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Leu Glu Thr Asn Pro Asp

50 55 60

Ala Ile Ala Ser Ile Lys Arg Leu Met Gly Thr Asp Lys Thr Val Lys

65 70 75 80

Ala Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Pro Glu Glu Ile Ser Ala Lys Ile Leu

85 90 95

Ser Tyr Leu Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Lys Ile Gly Asn Lys Val Ser

100 105 110

Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asn Ala Gln Arg Glu

115 120 125

Ala Thr Lys Asn Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile

130 135 140

Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Phe Gly Leu Glu Lys Thr

145 150 155 160

Glu Lys Glu Met Lys Val Leu Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe

165 170 175

Asp Val Ser Val Leu Glu Leu Ser Gly Gly Thr Phe Glu Val Leu Ser

180 185 190

Thr Ser Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Cys Asp His Val Ile

195 200 205

Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Ile Lys Lys Glu Tyr Glu Phe Asp Pro

210 215 220

Ser Lys Asp Lys Met Ala Leu Ser Arg Leu Lys Glu Glu Ala Glu Lys

225 230 235 240

Thr Lys Ile Ser Leu Ser Asn Gln Ser Val Ala Thr Ile Ser Leu Pro

245 250 255

Phe Leu Gly Ile Gly Pro Lys Gly Pro Ile Asn Val Glu Leu Glu Leu

260 265 270

Lys Arg Ser Glu Phe Glu Lys Met Thr Ala His Leu Val Asp Lys Thr

275 280 285

Arg Lys Pro Ile Met Asp Ala Leu Lys Glu Ala Lys Leu Glu Ala Lys

290 295 300

Asp Leu Asp Glu Val Leu Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala

305 310 315 320

Val Gln Thr Met Ile Glu His Thr Leu Gly Lys Lys Pro Asn Arg Ser

325 330 335

Ile Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly

340 345 350

Val Leu Ala Gly Glu Ile Asn Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro

355 360 365

Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Leu Gly Gly Ile Ala Thr Pro Leu Ile

370 375 380

Pro Arg Asn Thr Thr Ile Pro Val Thr Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr

385 390 395 400

Ala Glu Asn Asn Gln Thr Glu Val Thr Ile Ser Val Val Gln Gly Glu

405 410 415

Arg Gln Leu Ala Ala Asp Asn Lys Leu Leu Gly Arg Phe Asn Leu Ser

420 425 430

Gly Ile Glu Gln Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Ser Phe

435 440 445

Ser Ile Asp Val Asn Gly Ile Thr Thr Val Ser Ala Lys Asp Lys Lys

450 455 460

Thr Asn Lys Glu Gln Thr Ile Thr Ile Lys Asn Thr Thr Ser Leu Ser

465 470 475 480

Glu Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Lys Glu Ala Glu Glu Asn Arg Glu

485 490 495

Ala Asp Ala Lys Lys Lys Glu Lys Ile Glu Val Thr Val Arg Ala Glu

500 505 510

Ala Leu Ile Asn Gln Leu Glu Lys Ser Leu Glu Asp Gln Gly Asp Lys

515 520 525

Val Asp Ala Lys Gln Lys Glu Thr Leu Glu Lys Gln Ile Gln Glu Leu

530 535 540

Lys Asp Leu Val Lys Glu Glu Lys Ile Glu Glu Leu Lys Thr Lys Leu

545 550 555 560

Asp Gln Ile Glu Gln Ala Ala Gln Ala Phe Ala Gln Ala Ala Ala Gln

565 570 575

Gln Ala Asn Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asp Asp Gln Pro Ile Glu Ala

580 585 590

Glu Val Lys Glu Asn

595

<210> 3

<211> 511

<212> Белок

<213> Mycoplasma hyorhinis

<400> 3

Met Asn Lys Lys His Ile Lys Thr Leu Ile Ser Ser Val Ser Ile Leu

1 5 10 15

Thr Pro Val Ala Ile Leu Ala Ser Cys Gly Gln Pro Thr Thr Ile Lys

20 25 30

Phe Ala Thr Ser Gln Gly Ser Tyr Trp Pro Met Met Leu Gly Met Lys

35 40 45

Glu Ile Ile Lys Ile Tyr Asn Glu Gln His Lys Asn Asp Ala Asp Phe

50 55 60

Ile Pro Val Glu Leu Leu Thr Ser Asp Val Thr His Lys Asn Ser Glu

65 70 75 80

Gly Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp Ser Asp Leu Ser Thr Lys Gln Ser

85 90 95

Ser Asp Trp Asn Leu Ile Leu Gly Asn Lys Ala Thr Ala Tyr Val Ala

100 105 110

Asn Ser Tyr Asp Lys Leu Leu Asp Val Gly Thr Ser Thr Val Asn Pro

115 120 125

Asn Ser Phe Pro Thr Lys Ile Ile Asn Asn Tyr Asn Lys Leu Leu Gly

130 135 140

Val Glu Gly Gln Thr Thr Leu Lys Ser Leu Pro Tyr Asn Ile Asn Asp

145 150 155 160

Thr Asp Gly Ile Val Phe Asn Leu Asp Ile Met Lys Val Leu Phe Asp

165 170 175

Ile Ile Lys Gln Gly Gly Gly Thr Ile Asp Glu Asn Ser Ile Ile Ala

180 185 190

Lys Lys Val Lys Glu Ala Glu Gly Lys Gly Asn His Ile Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Met Phe Ser Ala Ile Lys Ile Lys Glu Ser Ser Lys Asn Thr Gly

210 215 220

Phe Ser Gly Tyr Thr Val Asn Asp Ser Thr Phe Ser Asp Ile Lys Lys

225 230 235 240

Ala Phe Glu Phe Ala Gln Lys Ile Tyr Asp Asn Thr Glu Ile Asp Thr

245 250 255

Thr Lys Leu Ser Lys Asp Val Lys Asp Ser Glu Ile Phe Ala Ile Asp

260 265 270

Tyr Ala Ser Asp Val Phe Arg Lys Glu Ile Leu Ser Lys Thr Asn Lys

275 280 285

Thr Phe Trp Ser Glu Lys Ser Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Leu Asp

290 295 300

Val Asn Leu Asn Thr Asn Gln Ala Leu Lys Thr Glu Val Glu Asn Gln

305 310 315 320

Tyr Gln Glu Trp Glu Asn Thr Leu Lys Gln Thr Gln Phe Ile Pro Thr

325 330 335

Thr Thr Thr Gln Ala Asn Thr Glu Thr Thr Ser Trp Thr Lys Lys Asp

340 345 350

Ile Gln Thr Lys Ser Ala Thr Asp Asp Ser Gln Gln Ser Ile Asn Ser

355 360 365

Lys Thr Phe Tyr Ser Val Lys Phe Thr Glu Tyr Phe Lys Pro Ile Asn

370 375 380

Gln Trp Gly Ser Phe Glu Ile Arg Gln Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ala Pro Leu Val Gly Thr Asn Tyr Ser Val Asp Ser Pro Trp Ser Arg

405 410 415

Ala Phe Phe Lys Lys Asp Leu Glu Glu Gly Lys Gln Lys Ala Ser Glu

420 425 430

Trp Thr Thr Arg Glu Asp Val Tyr Ala Thr Asn Gln Ala Met Lys Ala

435 440 445

Asp Asp Asn Ala Gln Tyr Leu Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Phe Ser Leu

450 455 460

Ile Ala Ile Lys Ser Asn Ser Asp Ile Ile Asn Lys Asn Ile Ile Lys

465 470 475 480

Phe Val Asp Phe Leu Tyr Asn Gly Thr Gly Leu Thr Asp Leu Thr Gly

485 490 495

Ala Lys Ile Ser Ala Ala Asp Phe Met Ala Glu Lys Ser Ala Ala

500 505 510

<210> 4

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антиген

<400> 4

atgaaaaagt taattactaa aaaattttta tatttatcaa caatttcaac agcttcattt 60

atagcttttg cttcatttgt agcttgtgga acaacagcaa caggtttatc acaaacaaaa 120

gatcatgctg ttactaatga atccattaga gttgcattaa cagatccaga taatccaaga 180

tggattaatg cacaaaaaga tatattaaat tatatagaca aaacagaagg tgcaatttct 240

actattacta aagaccaaaa tgcacaaaac aactggttaa ctcaacaagc aaacttaaat 300

ccagcaccta aaggatttat tattgctcct gaaaatggag gaggagttgg aaccgctgtt 360

aattcaatag ctgaaaaaaa tattcctatc gttgcttatg atagattaat tactggttca 420

acttcatatg attggtatgt ttcttacgat aatgaaaaag tgggtgaact acaaggtctt 480

tcattagcag ctggattatt aggaaaaact gatggtgcat ttaaagatga aactgaaatg 540

ttaaactatc taaaagatca catgccacaa gaaactgttt cattttatgc agtagctgga 600

tcacaagatg acaacaattc tcaatacttt tacaacggag caatgaaaat tttaaaaaaa 660

ttaatggaaa actccaatgg taaagtagta gatttgtctc caagaggtaa tgcagtttat 720

gttccaggat ggaattacgg agacgctgga caaagaattc aacaattctt cacacaatat 780

cgtgattcat cagtgccaaa tggagtatta ccagttacat atgataatgt aactatccct 840

aaatctgttt taaaaggatt tttagcacca aatgatggaa tggcagaaca agcagtagac 900

aaactaaaag ctactaatta tgatgtacaa aaagttttca ttactggtca agactacaat 960

gatacagcaa aaaaacttat taaaaatggt gaacaaaata tgaccatcta caaaccagat 1020

gtaattttag gtaaagtagc tgtagaagta ttaaaaacat taataaacaa aaagaaagca 1080

aatgcaacag caactaaaga agatgttgaa aatgctttaa aaaacaacga aaatacaaaa 1140

gatattcact ttagatatga tgatacaaca tataaagctg gttcagtagg tgcttacaaa 1200

aacattaaag caattttagt taatccagtt gtagtaacta aacaaaatgt agataaccca 1260

ttagctaatg cacaacaatc tacaagtgca aatgtttctg tttctgcatc aggtacagta 1320

ccaactaatg gtgtaacaca ataa 1344

<210> 5

<211> 1794

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антиген

<400> 5

atggcaaaag aaattatttt aggaatagat ttaggaacaa caaattctgt tgtttctata 60

atagaaaatg gtaagccagt tgtattagaa aatccaaatg gaaaaaatac aacaccttct 120

gttgttgctt ttaaaaacgg agaagaaatc gtaggagatg ctgctaaaag acaattagaa 180

acaaatcctg acgcaattgc ttcaattaaa agattaatgg gaacagataa aacagtaaaa 240

gcaaatggaa aagactataa accagaagaa atttctgcaa aaattctttc ttatttaaaa 300

caatatgcag agaaaaaaat tggtaacaaa gtttcaaaag cagttattac tgttccagct 360

tacttcaata atgcacaaag agaagcaaca aaaaatgcag gaaaaattgc tggcttagaa 420

gtagaaagaa ttattaatga accaactgca gctgctttag cttttggact agaaaaaact 480

gaaaaagaaa tgaaagtatt agtttacgac ttaggtggag gaacatttga cgtttctgta 540

ttagaacttt caggtggaac tttcgaagtt ttatcaacta gtggagataa caaattagga 600

ggagatgact gtgatcatgt tattgttgat tggttagttg acaaaattaa aaaagaatat 660

gaatttgatc cttctaaaga caaaatggct ttatctcgtt taaaagaaga agcagaaaaa 720

acaaaaattt ctttatccaa ccaatcagtt gctacaattt cattaccatt tttgggtatt 780

ggaccaaaag gacctattaa tgttgagtta gaactaaaaa gatcagaatt tgaaaaaatg 840

acagctcatt tagtagataa aacaagaaaa ccaattatgg atgctttaaa agaagcaaaa 900

ttagaagcaa aagatttaga tgaagtttta ttagttggtg gatcaacaag aattcctgct 960

gttcaaacaa tgattgagca cacattaggt aaaaaaccaa atagatccat taatccagat 1020

gaagttgttg ctattggagc tgcaattcaa ggtggtgttt tagctggaga aattaatgat 1080

gttttattac ttgacgttac acctttaact ttaggtattg aaacattagg tggaattgct 1140

actccattaa ttccaagaaa cacaacaatt cctgttacta aatcacaaat tttctcaact 1200

gctgaaaata accaaacaga agttacaatt tcagttgttc aaggagaaag acaattagct 1260

gctgataata aattattagg tagatttaat ctctcaggaa ttgaacaagc acctagagga 1320

gttcctcaaa ttgaagttag tttctcaatt gatgttaacg gaataacaac tgtatcagca 1380

aaagataaaa aaacaaacaa agaacaaact attactatta aaaatacaac cagcttatct 1440

gaagaagaaa ttgaaagaat ggtaaaagaa gctgaagaaa atcgtgaagc agatgctaag 1500

aaaaaagaaa aaattgaagt aacagttaga gctgaagctt taattaatca attagaaaaa 1560

tctctagaag accaaggtga taaagtagat gctaaacaaa aagaaacttt agaaaaacaa 1620

attcaagaat taaaagactt ggtaaaagaa gaaaaaattg aagaattaaa aacaaaatta 1680

gaccaaattg aacaagctgc acaagctttt gctcaagctg cagcacaaca agcaaatact 1740

tctgatactt cttcagatga tcaaccaatt gaagctgaag ttaaagaaaa ttaa 1794

<210> 6

<211> 1536

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антиген

<400> 6

atgaataaaa aacatataaa aacacttatt tcaagtgtaa gtattttaac tcctgttgcc 60

attttagctt cttgtggaca accaaccaca attaaatttg ctacttctca aggttcatat 120

tggccaatga tgctaggaat gaaagaaatt attaagattt ataatgaaca acacaaaaac 180

gatgctgatt tcattcctgt tgaactttta acatcagatg taactcataa aaatagtgaa 240

ggtcaacttt taagtagttt agatagtgat ttatctacta agcaaagctc tgattggaat 300

cttattttag gaaacaaagc tactgcttat gttgcaaatt cttatgataa attattagac 360

gttggtactt ctacagtaaa tcccaattca ttccctacaa aaataattaa taattacaat 420

aaattattag gtgttgaagg acaaacaaca ttaaaaagtt taccttacaa catcaacgat 480

acagatggta ttgtttttaa tttagacatc atgaaagttc tttttgatat cataaaacaa 540

ggtggcggaa ctattgatga aaactcaata attgctaaaa aagtaaaaga agcagaagga 600

aaaggtaatc atattccatc aagttcaatg ttttctgcaa ttaaaattaa agagtcttca 660

aaaaacactg gattttctgg atatacagta aatgattcta cttttagtga tattaaaaaa 720

gcttttgagt ttgctcaaaa aatttatgat aacacagaaa ttgatacgac caaattatca 780

aaagatgtaa aagattcaga gatttttgca atagattatg cttcagatgt ttttagaaaa 840

gaaattcttt ctaaaactaa taaaactttt tggagtgaaa aaagtttaca aaataacaaa 900

attacattag atgtaaatct caatacaaat caagctctaa aaacagaagt tgaaaaccaa 960

tatcaagaat gggaaaacac tttaaaacaa acacaattta taccaactac aacaactcaa 1020

gcaaatactg aaactacttc atggacaaaa aaagatattc aaactaaatc agcaactgat 1080

gatagtcaac aatccattaa ttctaaaaca ttttattctg ttaaatttac tgaatacttt 1140

aaacctataa atcaatgggg atcttttgaa attagacaat atttaactgc atttacttat 1200

gctcctctag taggaacaaa ctattctgta gattctcctt ggtcacgtgc attttttaaa 1260

aaagatttag aagaaggaaa acaaaaagct tcagaatgga caacaagaga agatgtttat 1320

gctacaaatc aagcaatgaa agcagatgat aatgcacaat atttagcata taacgctggt 1380

ggtttttctt taattgctat caaatccaac agtgatataa taaataaaaa tatcattaaa 1440

tttgtagact ttttatacaa tggaacagga ctaacagatt taactggtgc taaaatttca 1500

gctgctgatt ttatggccga aaaatctgca gcttaa 1536

<210> 7

<211> 7245

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор

<400> 7

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacttgtgt tacaccatta gttggtactg tacctgatgc agaaacagaa acatttgcac 240

ttgtagattg ttgtgcatta gctaatgggt tatctacatt ttgtttagtt actacaactg 300

gattaactaa aattgcttta atgtttttgt aagcacctac tgaaccagct ttatatgttg 360

tatcatcata tctaaagtga atatcttttg tattttcgtt gttttttaaa gcattttcaa 420

catcttcttt agttgctgtt gcatttgctt tctttttgtt tattaatgtt tttaatactt 480

ctacagctac tttacctaaa attacatctg gtttgtagat ggtcatattt tgttcaccat 540

ttttaataag tttttttgct gtatcattgt agtcttgacc agtaatgaaa actttttgta 600

catcataatt agtagctttt agtttgtcta ctgcttgttc tgccattcca tcatttggtg 660

ctaaaaatcc ttttaaaaca gatttaggga tagttacatt atcatatgta actggtaata 720

ctccatttgg cactgatgaa tcacgatatt gtgtgaagaa ttgttgaatt ctttgtccag 780

cgtctccgta attccatcct ggaacataaa ctgcattacc tcttggagac aaatctacta 840

ctttaccatt ggagttttcc attaattttt ttaaaatttt cattgctccg ttgtaaaagt 900

attgagaatt gttgtcatct tgtgatccag ctactgcata aaatgaaaca gtttcttgtg 960

gcatgtgatc ttttagatag tttaacattt cagtttcatc tttaaatgca ccatcagttt 1020

ttcctaataa tccagctgct aatgaaagac cttgtagttc acccactttt tcattatcgt 1080

aagaaacata ccaatcatat gaagttgaac cagtaattaa tctatcataa gcaacgatag 1140

gaatattttt ttcagctatt gaattaacag cggttccaac tcctcctcca ttttcaggag 1200

caataataaa tcctttaggt gctggattta agtttgcttg ttgagttaac cagttgtttt 1260

gtgcattttg gtctttagta atagtagaaa ttgcaccttc tgttttgtct atataattta 1320

atatatcttt ttgtgcatta atccatcttg gattatctgg atctgttaat gcaactctaa 1380

tggattcatt agtaacagca tgatcttttg tttgtgataa acctgttgct gttgttccac 1440

aagctacaaa tgaggatcct ttaccgctgg tcattttttg gtgttcgtcg aggaattctt 1500

tcatctcttt cggcggctgg taacccggaa caagtgtgcc attgctcagc acaactgccg 1560

gagtaccgct aacgccaagc tggacgccaa gtgcgtaatg gtcggcaata tccacgtcgc 1620

aactggctgg tgcgacgctt ttacctgcca tcacatcatc aaacgctttg tttttatctt 1680

tcgcacacca gatagctttc atttctttct ctgcatcgct gtccagcccc tggcgcggga 1740

aagcaagata acgcacggtg atccccagcg cgttgtagtc tgccatttgc tcatgcagtt 1800

tgtggcagta accacaggta atatcagtaa acacggtgat gacgtgtttt tcctgcggcg 1860

ctttataaac gatcatctct ttttcaagcg cattcaactg ctttaacagc atcttattgg 1920

tgacattgac cggagccgtg ccactaacgt catacattgg cccctgaatg atatgtttac 1980

catcatcggt gatgtacaac acgccgctgt tagtcagaac tgtcttcatg ccagctacag 2040

gcgcgggctg aatatcgctg cttttgatgc ccattttggc taacgtttgt tgaattgccg 2100

cgtcatcggt acccagatct gggctgtcca tgtgctggcg ttcgaattta gcagcagcgg 2160

tttctttcat atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt 2220

gttatccgct cacaattccc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgggat cgagatcgat 2280

ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc 2340

tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat 2400

gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc 2460

catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact 2520

gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagatcccg gacaccatcg 2580

aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg 2640

tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc 2700

agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag 2760

tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg 2820

gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc 2880

aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga 2940

tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac 3000

gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag 3060

ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca 3120

gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg 3180

gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc 3240

tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag 3300

gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg 3360

ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta 3420

ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggaca tctcggtagt gggatacgac gataccgaag 3480

acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc 3540

aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc 3600

tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct 3660

ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 3720

gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc accgggatct 3780

cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg 3840

actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg 3900

gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc 3960

ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc 4020

gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cccacgggtg 4080

cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt 4140

tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct 4200

gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg 4260

cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta 4320

ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt 4380

ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg 4440

gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt 4500

acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc 4560

gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac 4620

gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag 4680

ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 4740

ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 4800

ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat 4860

agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 4920

atatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 4980

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 5040

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 5100

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 5160

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 5220

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 5280

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 5340

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 5400

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 5460

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 5520

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 5580

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 5640

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 5700

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 5760

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 5820

catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 5880

ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 5940

atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 6000

atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 6060

atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 6120

tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 6180

aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 6240

tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 6300

atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 6360

gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 6420

aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 6480

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 6540

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 6600

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 6660

atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taattcatga gcggatacat atttgaatgt 6720

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa 6780

attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 6840

tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 6900

gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 6960

gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 7020

tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 7080

cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 7140

aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 7200

cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcccatt cgcca 7245

<210> 8

<211> 7500

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор

<400> 8

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacttaatt ttctttaact tcagcttcaa ttggttgatc atctgaagaa gtatcagaag 240

tatttgcttg ttgtgctgca gcttgagcaa aagcttgtgc agcttgttca atttggtcta 300

attttgtttt taattcttca attttttctt cttttaccaa gtcttttaat tcttgaattt 360

gtttttctaa agtttctttt tgtttagcat ctactttatc accttggtct tctagagatt 420

tttctaattg attaattaaa gcttcagctc taactgttac ttcaattttt tcttttttct 480

tagcatctgc ttcacgattt tcttcagctt cttttaccat tctttcaatt tcttcttcag 540

ataagctggt tgtattttta atagtaatag tttgttcttt gtttgttttt ttatcttttg 600

ctgatacagt tgttattccg ttaacatcaa ttgagaaact aacttcaatt tgaggaactc 660

ctctaggtgc ttgttcaatt cctgagagat taaatctacc taataattta ttatcagcag 720

ctaattgtct ttctccttga acaactgaaa ttgtaacttc tgtttggtta ttttcagcag 780

ttgagaaaat ttgtgattta gtaacaggaa ttgttgtgtt tcttggaatt aatggagtag 840

caattccacc taatgtttca atacctaaag ttaaaggtgt aacgtcaagt aataaaacat 900

cattaatttc tccagctaaa acaccacctt gaattgcagc tccaatagca acaacttcat 960

ctggattaat ggatctattt ggttttttac ctaatgtgtg ctcaatcatt gtttgaacag 1020

caggaattct tgttgatcca ccaactaata aaacttcatc taaatctttt gcttctaatt 1080

ttgcttcttt taaagcatcc ataattggtt ttcttgtttt atctactaaa tgagctgtca 1140

ttttttcaaa ttctgatctt tttagttcta actcaacatt aataggtcct tttggtccaa 1200

tacccaaaaa tggtaatgaa attgtagcaa ctgattggtt ggataaagaa atttttgttt 1260

tttctgcttc ttcttttaaa cgagataaag ccattttgtc tttagaagga tcaaattcat 1320

attctttttt aattttgtca actaaccaat caacaataac atgatcacag tcatctcctc 1380

ctaatttgtt atctccacta gttgataaaa cttcgaaagt tccacctgaa agttctaata 1440

cagaaacgtc aaatgttcct ccacctaagt cgtaaactaa tactttcatt tctttttcag 1500

ttttttctag tccaaaagct aaagcagctg cagttggttc attaataatt ctttctactt 1560

ctaagccagc aatttttcct gcattttttg ttgcttctct ttgtgcatta ttgaagtaag 1620

ctggaacagt aataactgct tttgaaactt tgttaccaat ttttttctct gcatattgtt 1680

ttaaataaga aagaattttt gcagaaattt cttctggttt atagtctttt ccatttgctt 1740

ttactgtttt atctgttccc attaatcttt taattgaagc aattgcgtca ggatttgttt 1800

ctaattgtct tttagcagca tctcctacga tttcttctcc gtttttaaaa gcaacaacag 1860

aaggtgttgt attttttcca tttggatttt ctaatacaac tggcttacca ttttctatta 1920

tagaaacaac agaatttgtt gttcctaaat ctattcctaa aataatttct tttgccatgg 1980

atccggtgcc gccaccagaa cgttcatccc actcatcagc tgctgcgcgt ccttcctcgg 2040

tatccagcgg tggctcaagc tgaaattccc cctcgtccca ttcatgtaat gtattctctt 2100

cctgccactc ctggcgtatc tctatctcat catagtcgcc atcaaaaaca ctttgcgcgg 2160

cttcaccgct aagcataggt aaacattcac cttcttcccc ttcgtcggca aaaaactcaa 2220

cttgccacat gatgtcgccg tcctgcaaaa cgtatttttg ggcattgaac tgttgcacat 2280

tcgcatcttc ggcgtcgatg ccggggttgt ctgcaagaaa ttcttcgcgt gcagcgtcaa 2340

tggcttcttc aagcgttgcg tacatggtca tggtaccacc accgctgtga tggtgatggt 2400

gatgcgatac gaattttttt ttcatatgta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat 2460

ttctagaggg gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc 2520

gggatcgaga tcgatctcga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 2580

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 2640

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 2700

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 2760

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgaga 2820

tcccggacac catcgaatgg cgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag 2880

agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg 2940

ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga 3000

aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg 3060

cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc 3120

tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca 3180

gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca 3240

atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg 3300

ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc 3360

agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc 3420

atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct 3480

cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga 3540

tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc 3600

tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg 3660

caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggacatctcg gtagtgggat 3720

acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt 3780

ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg 3840

tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca 3900

atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 3960

tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtaagtta gctcactcat 4020

taggcaccgg gatctcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg 4080

tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc 4140

gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc 4200

gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc 4260

ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg 4320

gcggccccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 4380

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc 4440

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg 4500

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 4560

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga 4620

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 4680

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt 4740

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 4800

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 4860

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 4920

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 4980

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 5040

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 5100

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 5160

tactgagagt gcaccatata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 5220

ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5280

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5340

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5400

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5460

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5520

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 5580

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 5640

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 5700

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 5760

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 5820

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 5880

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 5940

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 6000

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 6060

ttaagggatt ttggtcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg 6120

gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt cttgctctag gccgcgatta aattccaaca 6180

tggatgctga tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga 6240

caatctatcg attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag 6300

gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta 6360

tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca 6420

ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa 6480

atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt 6540

gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg 6600

gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct 6660

ggaaagaaat gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt 6720

tctcacttga taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac 6780

gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt 6840

tttctccttc attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga 6900

ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta agaattaatt catgagcgga 6960

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 7020

aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 7080

taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 7140

gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 7200

aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 7260

gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 7320

cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 7380

gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 7440

cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca 7500

<210> 9

<211> 7431

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор

<400> 9

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacttagtg atggtgatgg tgatgagctg cagatttttc ggccataaaa tcagcagctg 240

aaattttagc accagttaaa tctgttagtc ctgttccatt gtataaaaag tctacaaatt 300

taatgatatt tttatttatt atatcactgt tggatttgat agcaattaaa gaaaaaccac 360

cagcgttata tgctaaatat tgtgcattat catctgcttt cattgcttga tttgtagcat 420

aaacatcttc tcttgttgtc cattctgaag ctttttgttt tccttcttct aaatcttttt 480

taaaaaatgc acgtgaccaa ggagaatcta cagaatagtt tgttcctact agaggagcat 540

aagtaaatgc agttaaatat tgtctaattt caaaagatcc ccattgattt ataggtttaa 600

agtattcagt aaatttaaca gaataaaatg ttttagaatt aatggattgt tgactatcat 660

cagttgctga tttagtttga atatcttttt ttgtccatga agtagtttca gtatttgctt 720

gagttgttgt agttggtata aattgtgttt gttttaaagt gttttcccat tcttgatatt 780

ggttttcaac ttctgttttt agagcttgat ttgtattgag atttacatct aatgtaattt 840

tgttattttg taaacttttt tcactccaaa aagttttatt agttttagaa agaatttctt 900

ttctaaaaac atctgaagca taatctattg caaaaatctc tgaatctttt acatcttttg 960

ataatttggt cgtatcaatt tctgtgttat cataaatttt ttgagcaaac tcaaaagctt 1020

ttttaatatc actaaaagta gaatcattta ctgtatatcc agaaaatcca gtgttttttg 1080

aagactcttt aattttaatt gcagaaaaca ttgaacttga tggaatatga ttaccttttc 1140

cttctgcttc ttttactttt ttagcaatta ttgagttttc atcaatagtt ccgccacctt 1200

gttttatgat atcaaaaaga actttcatga tgtctaaatt aaaaacaata ccatctgtat 1260

cgttgatgtt gtaaggtaaa ctttttaatg ttgtttgtcc ttcaacacct aataatttat 1320

tgtaattatt aattattttt gtagggaatg aattgggatt tactgtagaa gtaccaacgt 1380

ctaataattt atcataagaa tttgcaacat aagcagtagc tttgtttcct aaaataagat 1440

tccaatcaga gctttgctta gtagataaat cactatctaa actacttaaa agttgacctt 1500

cactattttt atgagttaca tctgatgtta aaagttcaac aggaatgaaa tcagcatcgt 1560

ttttgtgttg ttcattataa atcttaataa tttctttcat tcctagcatc attggccaat 1620

atgaaccttg agaagtagca aatttaattg tggttggttg tccacaagag gatccgagga 1680

tttccagcag ttcgacttca aacaccaggg tgctgaacgg agggatggat gcgcctgcgc 1740

cgcgctcgcc atatgccagt tcctgcggga tagtcagttc ccatttagaa cctaccggca 1800

tcagagtcag tgcttcaatc cagccaggga tcacgccatt aaccgggaat tcagcgggtt 1860

caccacgagc aacggagctg tcaaacacgg tgccgtcgat cagtttaccg gtgtaatgaa 1920

cacgaacgcg gtcggtacgt gccggaattg cgccttcacc ctggttgatc acgcggaatt 1980

gcaggccaga ttcggtgcta ttcacacctt cttttttggc gttttcttcc aggtatttca 2040

caccttcagc agccatcgcc tggaaacgct gacgacgaac ggcatcggcg cgctcgtgga 2100

tttcacgcag cgcgcgatgc accacatcaa ccggaacagc cggatgtttg ccttccagcg 2160

catcggcaat acctgcaacc agtgcttctg gcagcagccc ttccaggcca gattcactca 2220

gttgttgccc tacctgcaaa ccaatgccgt agcttgcttg cgcttcgatg gtgtcaaaag 2280

ttggggtggt catggtaccc agatctgggc tgtccatgtg ctggcgttcg aatttagcag 2340

cagcggtttc tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg 2400

ggaattgtta tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag 2460

atcgatctcg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc 2520

ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg 2580

gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt 2640

gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct 2700

actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgag atcccggaca 2760

ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 2820

tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct 2880

cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 2940

aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 3000

tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 3060

cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 3120

tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 3180

cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 3240

tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 3300

tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 3360

cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 3420

tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 3480

gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 3540

gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 3600

ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggacatctc ggtagtggga tacgacgata 3660

ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 3720

tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 3780

atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 3840

ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 3900

tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg 3960

ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 4020

ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 4080

gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg 4140

atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact 4200

ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggcccca 4260

cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt 4320

actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa 4380

acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg 4440

gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc 4500

tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg 4560

atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt 4620

aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt 4680

atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa 4740

aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa 4800

ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 4860

gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 4920

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 4980

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 5040

agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 5100

tgcaccatat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 5160

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 5220

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 5280

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5340

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5400

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5460

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5520

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5580

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5640

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5700

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5760

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5820

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5880

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 5940

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6000

tttggtcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 6060

gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 6120

atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 6180

gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 6240

ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 6300

cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 6360

ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 6420

atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 6480

acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 6540

atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 6600

tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 6660

ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 6720

tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 6780

cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 6840

agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt 6900

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 6960

cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 7020

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 7080

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 7140

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 7200

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 7260

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 7320

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 7380

accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc a 7431

<210> 10

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 10

gatataggat cctcatttgt agcttgtgga acaacag 37

<210> 11

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 11

caatatgtcg acttgtgtta caccattagt tggtactgta cc 42

<210> 12

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 12

gatccagata atccaagatg gattaatgca caaaaagata 40

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 13

tatctttttg tgcattaatc catcttggat tatctggatc 40

<210> 14

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 14

caaaatgcac aaaacaactg gttaactcaa caagcaaact 40

<210> 15

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 15

agtttgcttg ttgagttaac cagttgtttt gtgcattttg 40

<210> 16

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 16

ggttcaactt catatgattg gtatgtttct tacgataatg 40

<210> 17

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 17

cattatcgta agaaacatac caatcatatg aagttgaacc 40

<210> 18

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 18

ttatgttcca ggatggaatt acggagacgc tg 32

<210> 19

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 19

cagcgtctcc gtaattccat cctggaacat aa 32

<210> 20

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 20

gatataggat ccatggcaaa agaaattatt ttaggaatag atttag 46

<210> 21

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 21

caatatgtcg acttaatttt ctttaacttc agcttcaatt ggttg 45

<210> 22

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 22

gatgactgtg atcatgttat tgttgattgg ttagttgaca aaattaaaaa agaatatg 58

<210> 23

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 23

catattcttt tttaattttg tcaactaacc aatcaacaat aacatgatca cagtcatc 58

<210> 24

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 24

caatatggat cctcttgtgg acaaccaacc acaattaaat ttg 43

<210> 25

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 25

gtataagtcg acttagtgat ggtgatggtg atgagctgca gatttttcgg ccataaaatc 60

<210> 26

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 26

cttctcaagg ttcatattgg ccaatgatgc taggaatg 38

<210> 27

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 27

cattcctagc atcattggcc aatatgaacc ttgagaag 38

<210> 28

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 28

actaagcaaa gctctgattg gaatcttatt ttaggaaaca 40

<210> 29

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 29

tgtttcctaa aataagattc caatcagagc tttgcttagt 40

<210> 30

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 30

ctttctaaaa ctaataaaac tttttggagt gaaaaaagtt tacaaaataa caa 53

<210> 31

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 31

ttgttatttt gtaaactttt ttcactccaa aaagttttat tagttttaga aag 53

<210> 32

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 32

gttgaaaacc aatatcaaga atgggaaaac actttaaaac aaacac 46

<210> 33

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 33

gtgtttgttt taaagtgttt tcccattctt gatattggtt ttcaac 46

<210> 34

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 34

caagcaaata ctgaaactac ttcatggaca aaaaaagata ttcaaactaa atc 53

<210> 35

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 35

gatttagttt gaatatcttt ttttgtccat gaagtagttt cagtatttgc ttg 53

<210> 36

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 36

ctgaatactt taaacctata aatcaatggg gatcttttga aattagacaa tatttaac 58

<210> 37

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 37

gttaaatatt gtctaatttc aaaagatccc cattgattta taggtttaaa gtattcag 58

<210> 38

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 38

ctattctgta gattctcctt ggtcacgtgc attttttaaa aaag 44

<210> 39

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 39

cttttttaaa aaatgcacgt gaccaaggag aatctacaga atag 44

<210> 40

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 40

gaaaacaaaa agcttcagaa tggacaacaa gagaagatgt ttatg 45

<210> 41

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 41

cataaacatc ttctcttgtt gtccattctg aagctttttg ttttc 45

<---

Claims (24)

1. Композиция для предотвращения заболевания, вызванного инфекцией Mycoplasma hyorhinis, содержащая

эффективное количество активного ингредиента, представляющего собой комбинацию XylF, DnaK и P72; а также

адъювант;

где указанный XylF представляет собой SEQ ID NO: 01, указанный DnaK представляет собой SEQ ID NO: 02 и указанный P72 представляет собой SEQ ID NO: 03.

2. Композиция по п.1, в которой указанный активный ингредиент имеет концентрацию от 50 до 300 мкг/мл в расчете на общий объем указанной композиции.

3. Композиция по любому из пп.1 и 2, в которой указанный адъювант включает полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, гель оксида алюминия, поверхностно-активное вещество, анионный полимер, пептид, масляную эмульсию или их комбинацию.

4. Композиция по п.1, в которой указанное заболевание представляет собой перитонит, плеврит, перикардит и отек суставов.

5. Экспрессирующий вектор для получения комбинации XylF, DnaK и P72 в прокариотической экспрессирующей системе, включающий:

экспрессионный элемент, включающий промотор и участок связывания рибосомы;

нуклеотидную последовательность, кодирующую указанные XylF, DnaK и P72; и

последовательность, кодирующую партнер слияния, выбранный из группы, состоящей из DsbC из E. coli, MsyB из E. coli, FklB из E. coli или их комбинации;

где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 и SEQ ID NO: 06.

6. Экспрессирующий вектор по п.5, в котором

указанный партнер слияния представляет собой DsbC из E.coli при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует XylF;

указанный партнер слияния представляет собой MsyB из E.coli при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует DnaK; или

указанный партнер слияния представляет собой FklB из E.coli при условии, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует P72.

7. Экспрессирующий вектор по п.5, дополнительно содержащий последовательность, кодирующую гистидиновую метку, метку глутатион-S-трансферазы или их комбинацию.

8. Экспрессирующий вектор по п.5, в котором указанная прокариотическая экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему E. coli.

9. Способ получения растворимого белка, где указанный растворимый белок представляет собой комбинацию XylF, DnaK и P72; причем указанный способ включает:

получение прокариотической экспрессирующей системы;

экспрессию указанной нуклеотидной последовательности экспрессирующего вектора по любому из пп.5-8 в указанной прокариотической экспрессирующей системе и

пропускание продукта, полученного на вышеуказанной стадии экспрессии, через аффинную колонку с ионами никеля или глутатионовую аффинную колонку, для получения указанного растворимого белка.

10. Применение композиции по любому из пп.1-4 для получения вакцины для предотвращения заболевания, вызванного инфекцией Mycoplasma hyorhinis,

где указанное заболевание представляет собой по меньшей мере одно заболевание, выбранное из перитонита, плеврита, перикардита и отека суставов.

Images