JP6113306B2 - 抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチン - Google Patents

Description

本開示は、マイコプラズマ属菌種に対するワクチン、とりわけマイコプラズマ属菌種に対するサブユニットワクチンに関する。

マイコプラズマ属菌種は、現在のところ、宿主細胞外で自己複製することができる公知の最も小さい細菌である。ブタ流行性肺炎は、ブタの死亡をもたらすものではないが、ブタを他の病原体に感染しやすくすることに加えて、摂餌効率を低下させ、成長遅延、炎症及び免疫抑制をもたらし、したがって、産業の経済的損害になるものである。
現在までのところ、ブタ流行性肺炎は、薬剤投与、環境の管理及びワクチン接種などの３つの主要な戦略により予防されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する抗生物質の不良な予防効率を考えると、薬剤投与は、治療の目的のためだけに用いることができ、予防の必要を満たすことは困難である。さらに、薬物乱用が薬物耐性細菌によって引き起こされるより大きな感染につながる可能性があることを考慮すると、薬剤投与は、慎重な計画を必要とし、多くの制限が存在する。
環境の管理は、マイコプラズマ属菌種感染の予防の基礎をなす。十分な養豚場の衛生及び管理は、感染の発生を低減するのに有益であろう。他方で、予防は、ワクチン接種によってより包括的なものであり得る。
当該分野における従来のワクチンは、不活性／死細菌をその有効成分として使用している。しかし、マイコプラズマ属菌種は、培養条件の面倒な細菌であり、実験室で培養することが困難であるため、従来のワクチンの価格は、過度に高い。マイコプラズマ属菌種ワクチンの費用を低減するために、科学者は、（１）弱毒化ワクチン、（２）ベクターワクチン、（３）サブユニットワクチン及び（４）ＤＮＡワクチンなどの異なる種類のワクチンを開発することを継続的に試みている。とりわけ、サブユニットワクチンは、製造が容易であり、安全性が高いという利点のため最も高い可能性を示している。
現在までのところ、Ｍ．ヒオニューモニエワクチンに用いることが可能であると思われるいくつかの可能性のある候補タンパク質が存在するが、Ｍ．ヒオニューモニエワクチンに適するタンパク質を確認したさらなる報告は存在しない。

前述のことに照らして、本発明の目的の１つは、予防の費用を低減することができるようにＭ．ヒオニューモニエワクチンに用いるのに適する抗原を提供し、それにより、新規なＭ．ヒオニューモニエワクチンを製造することである。
本発明の他の目的は、Ｍ．ヒオニューモニエワクチンに用いるのに適する抗原の組合せを提供し、それにより、より良い性能を有するサブユニットワクチンを提供することである。したがって、予防の課題に対するより多くの選択肢が存在することとなる。

前述の目的を達成するために、本発明は、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチンを調製するための組換えタンパク質を提供する。
本発明はまた、ＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２、Ｍｈｐ３８９又はそれらの組合せのタンパク質を含む有効成分及び薬学的に許容されるアジュバントを含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチンを提供する。
好ましくは、前記有効成分は、前記ワクチンの総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである。
好ましくは、前記有効成分は、ＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２及びＭｈｐ３８９からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む。

好ましくは、前記有効成分は、ＰｄｈＡ及びＰ７８を含む。
好ましくは、前記有効成分は、ＸｙｌＦ及びＭｈｐ１４５を含む。
好ましくは、前記薬学的に許容されるアジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せである。
好ましくは、前記ワクチンは、薬学的に許容される添加剤をさらに含む。
好ましくは、前記薬学的に許容される添加剤は、溶媒、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤又はそれらの組合せである。
本発明はさらに、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含む有効成分及び薬学的に許容されるアジュバントを含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチンを提供する。

好ましくは、前記有効成分は、前記ワクチンの総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである。
好ましくは、前記有効成分は、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記有効成分は、配列番号０８及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記有効成分は、配列番号０９及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

好ましくは、前記薬学的に許容されるアジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せである。
好ましくは、前記ワクチンは、薬学的に許容される添加剤をさらに含む。
好ましくは、前記薬学的に許容される添加剤は、溶媒、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤又はそれらの組合せである。

本発明はさらに、プラスミドを含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するための発現ベクターを提供し、前記プラスミドは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むヌクレオチド配列並びに調節エレメントを含む。
好ましくは、前記調節エレメントは、プロモーター及びリボソーム結合部位を含む。
好ましくは、前記プラスミドは、ｐＥＴ−ＭＳＹ、ｐＥＴ−ＹｊｇＤ、ｐＥＴ−Ｄ又はｐＥＴ−ＳＵＭＯである。
好ましくは、前記プラスミドは、融合パートナーをコードする遺伝子をさらに含む。
好ましくは、前記融合パートナーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍｓｙＢ、大腸菌のｙｊｇＤ、ラムダバクテリオファージのタンパク質Ｄ又はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳＵＭＯである。
好ましくは、前記発現ベクターは、大腸菌遺伝子発現システムに用いる。
要約すれば、本発明は、Ｍ．ヒオニューモニエサブユニットワクチンの有効成分として用いるのに適する抗原及びそれを用いて調製されるＭ．ヒオニューモニエサブユニットワクチン／組成物に関する。本サブユニットワクチンは、その費用を低減するために予防業務に効果的に用いることができるだけでなく、本発明の開示は、本発明の少なくとも２つの抗原を用いた「カクテル」サブユニットワクチン（すなわち、少なくとも２つの抗原を有効成分として有する）が免疫応答の誘導を改善したことも示している。

本発明の第１の例において実施した２次元ゲルタンパク質電気泳動の結果を示す図である。 本発明の第１の例において実施したウエスタンブロットの呈色反応の結果を示す図である。 本発明の第２の例において得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。 本発明の第３の例において実施した誘発実験の記録を示す図である。 本発明の第３の例において実施した誘発実験の記録を示す図である。 本発明の第３の例において実施した誘発実験の記録を示す図である。

本発明の中心概念の１つは、２次元ゲルタンパク質電気泳動並びに免疫学的スクリーニング技術を用いることによりサブユニットワクチンに適する可能性のある候補抗原を調査すること及び質量分析計により抗原を同定することである。次に、本サブユニットワクチンの性能を動物モデル実験により確認した。
手短に述べると、本発明の開発の経過は、以下の通りである。

（１）従来のマイコプラズマ・ヒオニューモニエワクチンを注射することによって実験ブタの免疫応答を誘導し、抗Ｍ．ヒオニューモニエ抗体を含有する血清を得るステップ。（２）２次元ゲルタンパク質電気泳動用のＭ．ヒオニューモニエの全タンパク質を得るステップ。（３）ステップ（１）の血清を一次抗体として用いることによりステップ（２）の２次元ゲルタンパク質電気泳動の結果のハイブリダイゼーションを実施し、次いで、増幅後にゲルから二次抗体及び以下の発色法により陽性を示すタンパク質（すなわち、候補抗原）を収集するステップ。（４）ステップ（３）で得られた候補抗原を同定するステップ。（５）大腸菌遺伝子発現システムを用いることにより前記候補抗原を大量に発現させるステップ。（６）ブタ誘発実験により肺における病的特徴（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔ）の低減における本サブユニットワクチンの有効性を検討し、それにより、サブユニットワクチンの有効成分として用いる際の前記候補抗原の有用性を確認するステップ。

マイコプラズマ属菌種感染を予防するための本ワクチンは、有効成分及び薬学的に許容されるアジュバントを含む。
本発明の実施形態において、前記有効成分は、ＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２又はＭｈｐ３８９であり得る。代替実施形態において、前述のタンパク質のいずれかの抗原決定基が妨害されない限り、前記有効成分は、前述のタンパク質のいずれか２つの融合タンパク質であり得る。他の代替実施形態において、前記有効成分は、前述のタンパク質の少なくとも２つを含む。すなわち、本発明のいわゆる「カクテル」ワクチンである。
本発明の他の実施形態において、前記有効成分は、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。代替実施形態において、前記アミノ酸配列のペプチドの折りたたみにより形成された抗原決定基が妨害されない限り、前記有効成分は、少なくとも２つの前記配列を有する融合タンパク質であり得る。他の代替実施形態において、前記有効成分は、前述のアミノ酸配列の１つをそれぞれ含む２つ以上のタンパク質を含む。すなわち、本発明のいわゆる「カクテル」ワクチンである。
前記薬学的に許容されるアジュバントは、前記有効成分の免疫効果を改善し、前記有効成分を安定化し、且つ／又はワクチンの安全性を高めるために用いられる。本発明の前記薬学的に許容されるアジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

本発明のワクチンは、１つ又は少なくとも２つの前記有効成分（すなわち、カクテルワクチン）を有し得る。本ワクチンの例において、前記有効成分は、前記ワクチンの総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである。本発明の好ましい実施形態において、前記ワクチンが１つの前記有効成分のみを含む場合、前記有効成分は、前記ワクチンの総容積に基づく５０〜５００μｇ／ｍＬの濃度のものである。本発明の代替実施形態において、本ワクチンは、少なくとも１つの前記有効成分を含み、前記ワクチンに含有される前記有効成分の総濃度は、前記ワクチンの総容積に基づく５０〜１０００μｇ／ｍＬ、５０〜１５００μｇ／ｍＬ、５０〜２０００μｇ／ｍＬ、５０〜２５００μｇ／ｍＬ、５０〜３０００μｇ／ｍＬ又は５０〜３５００μｇ／ｍＬである。

本発明の他の態様は、マイコプラズマ属菌種感染を予防するための発現ベクターを提供することである。具体的には、前記発現ベクターは、大腸菌遺伝子発現システムに用いることができる。それにもかかわらず、本発明の精神から逸脱することなく、当業者は、本発明の開示に基づいて前記ベクターを改良し、前記ベクターを本発明の範囲に属しながら異なる遺伝子発現システムに適するものにすることができる。
前記発現ベクターは、プラスミドを含む。前記プラスミドは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むヌクレオチド配列並びに調節エレメントを含む。
前記ベクターは、大腸菌遺伝子発現システムに用い、また大腸菌により本発明の抗原を製造するために用いる。言い換えれば、前記ヌクレオチド配列を大腸菌遺伝子発現システムにより本発明の抗原のアミノ酸配列に翻訳することができ、次にアミノ酸配列を本発明の抗原に折りたたむことができる。

代替実施形態において、大腸菌遺伝子発現システムの作動が妨げられず、前記ヌクレオチド配列の産生及びその結果として生じるアミノ酸配列の折りたたみが妨害されない限り、前記プラスミドは、２つ以上の前記ヌクレオチド配列を含み得る。
前記調節エレメントは、発現システムにおける転写及び翻訳を開始するために必要なエレメントを意味する。前記調節エレメントは、プロモーター及びリボソーム結合部位を少なくとも含むものとする。好ましくは、前記調節エレメントは、オペレーター、エンハンサー配列、又はそれらの組合せをさらに含み得る。

本発明の好ましい実施形態において、前記プラスミドは、融合パートナーをコードする遺伝子をさらに含む。前記融合パートナーは、大腸菌のｍｓｙＢ、大腸菌のｙｊｇＤ、ラムダバクテリオファージのタンパク質Ｄ又はＳ．セレビシエのＳＵＭＯを含むが、これらに限定されない。前記ＭｓｙＢは、酸性アミノ酸に富み、産生されるタンパク質の溶解度を改善するために有利であると思われる。
以下の実施例では、本発明の特徴及び利点をさらに説明するために本発明の試験及び実験を列挙する。以下の実施例は、例となるものであって、本発明の特許請求の範囲を限定するために用いるものではないことに注意するものとする。

（例１）サブユニットワクチンの有効成分として用いるのに適する候補抗原のスクリーニング
抗ブタマイコプラズマ属菌種抗体を含有する血清の準備
研究者らによれば、ブタから単離することができる次の７種のマイコプラズマ属菌種が存在する：Ｍ．ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ヒオルヒニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオシノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）、マイコプラズマ・フロキュレア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ）、マイコプラズマ・ヒオファリンギス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｈａｒｙｎｇｉｓ）、マイコプラズマ・スアルビ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｕａｌｖｉ）、マイコプラズマ・ボビゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）（Gourlay et al., 1978; Blank et al., 1996; Assuncao et al., 2005）。とりわけ、Ｍ．ヒオニューモニエは、２５〜９３％の感染率を有するブタ流行性肺炎の主要な病原体である。したがって、本発明では、免疫プロテオミクス試験に、また抗原をコードする遺伝子の源としてＭ．ヒオニューモニエ（ＰＲＩＴ−５株）を用いた。Ｆｒｉｉｓ培地（Friis et al., 1975）をＭ．ヒオニューモニエを培養するために用いた。実験計画に従って、適量の抗生物質又は１．５％の寒天を固形培地を調合するために加えた。

４週齢の３匹のＳＰＦブタを農業技術研究所（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手し、実験の前に養豚場において同じ飼料を給餌し、同じ環境及び生育条件で飼育した。
ブタに３２日、４６日及び６０日齢まで給餌した後、ブタに２ｍＬのＢａｙｏｖａｃ（登録商標）ＭＨ−ＰＲＩＴ−５（Ｍ．ヒオニューモニエＰＲＩＴ−５）ワクチンを筋肉内注射により投与した。次いで、ブタに７４日齢まで連続的に給餌し、その頸静脈から血液を採取した。採取した血液を室温に１時間放置し、４℃で保存した。翌日、採取した血液を１，１０７×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去して清浄な管に入れ、−２０℃で保存した。
マイコプラズマ属菌種の全タンパク質の２次元ゲルタンパク質電気泳動
ＲｅａｄｙＰｒｅｐ（商標）タンパク質抽出キット（全タンパク質）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）をマイコプラズマ属菌種の全タンパク質を抽出するために用いた。その後、収集したタンパク質の濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。詳細なプロトコールは、製品説明書を参照することができ、あるいは当分野における周知のプロトコールから修正することができる。

２次元ゲルタンパク質電気泳動は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の２段階で実施した。ＩＥＦは、その等電点を考慮して試料中のタンパク質を分離するためであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、その分子量に基づいてタンパク質を分離するためであった。２次元ゲルタンパク質電気泳動の結果を示す図１を参照のこと。
ハイブリダイゼーション
ステップ（１）で得られた血清は、ステップ（２）における２次元ゲルタンパク質電気泳動の結果とハイブリダイズするための一次抗体として用いた。二次抗体により増幅し、以下の発色法により発色させた後、陽性を示すタンパク質を収集した。それらのタンパク質は、抗マイコプラズマ属菌種抗体により認識され、したがって、サブユニットワクチンの有効成分用の候補抗原として適することとなる。

ハイブリダイゼーションは、ウエスタンブロッティングにより実施した。手短に述べると、電気泳動の後の２次元ゲルをＰＶＤＦ膜に転移させた。次いで、膜をインキュベートし、一次抗体（抗マイコプラズマ属菌種抗体を含有する血清）及び二次抗体（ＡＰ−コンジュゲート抗ブタＩｇＧ）と連続的にハイブリダイズさせた。その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を用いることにより呈色反応を行わせた。
ウエスタンブロッティングの呈色反応の結果を図２に示す。図において、抗マイコプラズマ属菌種抗体との免疫ハイブリダイゼーションに陽性の１０種のタンパク質が、サブユニットワクチンの有効成分として用いられる候補抗原として表示されていた。

得られた候補抗原の同定
ウエスタンブロッティングの呈色反応に照らして、膜上の陽性位置に対応するゲルをマイクロペプチドにより切断し、質量分析により分析した。次に、質量分析の得られたデータをアミノ酸配列及びタンパク質データベースと照合して、それらのタンパク質を同定した。
抗マイコプラズマ属菌種抗体との免疫ハイブリダイゼーションに陽性の前記１０種のタンパク質を示した以下の表１を参照のこと。

（例２）大腸菌遺伝子発現システムによる大量の前記候補抗原の発現
大腸菌ＪＭ１０９をクローニングのための宿主細胞として用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をタンパク質発現のための宿主細胞として用いた。大腸菌細胞をＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ；Ｄｉｆｃｏ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）中で培養した。実験計画に従って、適量の抗生物質又は１．５％の寒天を固形培地を調合するために加えた。

候補抗原をコードする遺伝子の増幅
候補抗原が同定された後、それらの抗原をコードする遺伝子をＮＣＢＩデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で検索した。抗原遺伝子を標的とする特異的プライマーをそれに応じてデザインした。次いで、特異的プライマー及び鋳型としてのＭ．ヒオニューモニエＰＲＩＴ−５の染色体を用いることにより、抗原遺伝子を増幅した。用いた特異的プライマーを以下の表２に示した。

上の表２に示したプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、候補抗原の遺伝子を増幅した。次いで、増幅された遺伝子を大腸菌遺伝子発現システムに用いた。ＰＣＲ条件は、９８℃に５分（１ラウンド）；９４℃に３０秒、５５℃に３０秒、６８℃にＸ秒（３５ラウンド）；６８℃に５分（１ラウンド）であった。前記Ｘは、ＤＮＡポリメラーゼの伸長時間であり、増幅させる断片のサイズに応じて設定した。ＰＣＲ反応の後、電気泳動を実施して、ＰＣＲ産物が予想されたサイズのＤＮＡ断片を含有していたかどうかを確認した。ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図３を参照のこと。図において、レーン１は、ｅｕｔＤ遺伝子であり、レーン２は、ｐｄｈＡであり、レーン３は、ｘｙｌＦであり、レーン４は、Ｐ７８遺伝子であり、レーン５は、Ｐ１３２遺伝子であり、レーン６は、ｍｈｐ１４５であり、レーン７は、ｍｈｐ３８９であった。

ＰＣＲ産物のクローニング
ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキットを用いてクローニングを実施し、ライゲーション混合物を大腸菌ＥＣＯＳ（商標）９−５（Ｙｅａｓｔｅｒｎ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）に形質転換した。詳細なプロトコールは、製品説明書を参照することができ、あるいは当分野における周知のプロトコールから修正することができる。

形質転換の後、細菌を、そのコロニーが形成されるまでアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する固形ＬＢ培地上で培養した。次いで、形質転換が成功した菌株をスクリーニングするためにコロニーＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、９５℃に５分（１ラウンド）；９５℃に３０秒、５５℃に３０秒、７２℃にＸ秒（２５ラウンド）；７２℃に７分（１ラウンド）であった。前記Ｘは、ＤＮＡポリメラーゼの伸長時間であり、増幅させる断片のサイズに応じて設定した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）の伸長速度は、１ｋｂ／分であり、したがって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するために用いる場合、前記Ｘを１分と設定するものとする。

その組換えプラスミドがｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡを有することが確認された、菌株のプラスミドを次にＤＮＡ配列決定に進めた（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｌｔｄ．のトータルソリューションプロバイダー）。ｅｕｔＤ、ｐｄｈＡ、ｘｙｌＦ、Ｐ７８遺伝子、Ｐ１３２遺伝子、ｍｈｐ１４５及びｍｈｐ３８９を含有するプラスミドをそれぞれｐＪＥＴ−ｅｕｔＤ、ｐＪＥＴ−ｐｄｈＡ、ｐＪＥＴ−ｘｙｌＦ、ｐＪＥＴ−Ｐ７８、ｐＪＥＴ−Ｐ１３２、ｐＪＥＴ−ｍｈｐ１４５、ｐＪＥＴ−ｍｈｐ３８９と命名した。

Ｍ．ヒオニューモニエの抗原遺伝子の点突然変異及びクローニング
大腸菌遺伝子発現システムにおける候補抗原を増幅する前に、異なる生物におけるコドン利用を考慮するものとする。とは言うものの、遺伝子がそこからの最初の生物と大腸菌との間であいまいにコードされるようなコドンを含有する場合、遺伝子は、点突然変異により修飾されることとなる。

Ｍ．ヒオニューモニエ抗原遺伝子、ｐｄｈＡ、ｘｙｌＦ、Ｐ７８遺伝子、Ｐ１３２遺伝子、ｍｈｐ１４５及びｍｈｐ３８９は、ＴＧＡコドンを含有する（ｅｕｔＤは、他のもののようにコドン利用の問題を有さない）。ＴＧＡコドンは、マイコプラズマ属菌種においてはトリプトファンに翻訳されるが、大腸菌においては停止コドンとして翻訳される。大腸菌遺伝子発現システムにおいて全タンパク質を産生することができないことを防ぐために、ＴＧＡ部位を標的とするプライマーをデザインし、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによりＴＧＡをＴＧＧで置換する点突然変異を行わせた。結果として、大腸菌遺伝子発現システムにおいて発現させる遺伝子は、本発明の候補抗原に真に翻訳することができる。さらに、Ｐ７８遺伝子、Ｐ１３２遺伝子及びｍｈｐ３８９のＢａｍＨＩの切断部位は、クローニングの便宜のためにサイレント突然変異を受けさせた。

点突然変異のために用いたプライマーは、点突然変異の部位をプライマーの中央部に配置し、７８℃より高いＴｍ値を有するようにデザインした。点突然変異のためのプライマーのＴｍ値は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ Ｃｏ．により提示された式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（ＧＣ％）−６７５／Ｎ−ミスマッチ％を用いて計算した。式中、ＧＣ％は、関係しているプライマーに含有される全ヌクレオチドを考慮したＧＣの百分率を指し、Ｎは、関係しているプライマーの長さを指し、ミスマッチ％は、関係しているプライマーに含有される全ヌクレオチドを考慮した突然変異を受ける塩基の百分率を指す。前記の遺伝子に用いたプライマーセットを以下の表３〜表８に示した。

点突然変異に関する方法は、以下のように簡単に説明した。Ｍ．ヒオニューモニエＰＲＩＴ−５の染色体を鋳型として用い、上の表３〜表８に示したプライマーセットを用いることによりＤＮＡ断片を増幅した。
５０μＬのＰＣＲ反応混合物は、１×ＧＤＰ−ＨｉＦｉ ＰＣＲ緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの２００μＭの混合物、１μＭのプライマー、Ｍ．ヒオニューモニエＰＲＩＴ−５の１００ｎｇの染色体並びに１ＵのＧＤＰ−ＨＩＦＩ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲ条件は、９８℃に５分（１ラウンド）；９４℃に３０秒、５５℃に３０秒、６８℃にＸ秒（３５ラウンド）；６８℃に５分（１ラウンド）であった。前記Ｘは、ＤＮＡポリメラーゼの伸長時間であり、増幅させる断片のサイズに応じて設定した。ＧＤＰ−ＨＩＦＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＤｉｒｅｘ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ、ＵＳＡ）の伸長速度は、１ｋｂ／１５秒であり、したがって、ＧＤＰ−ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼを１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するために用いる場合、前記Ｘは、１５秒と設定するものとする。ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ産物が予想されたサイズのＤＮＡ断片を含有していたかどうかを確認するために電気泳動を実施した。次いで、Ｇｅｌ−Ｍ（商標）ゲル抽出システムキットを用いることによりＰＣＲ産物をリサイクルした。

その後、ＰＣＲ産物を鋳型として用い、上の表２に示したプライマーセットを用いることにより増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃に２分（１ラウンド）；９４℃に３０秒、５５℃に３０秒、６８℃にＸ秒（３５ラウンド）；６８℃に５分（１ラウンド）であった。前記Ｘは、ＤＮＡポリメラーゼの伸長時間であり、増幅させる断片のサイズに応じて設定した。ＧＤＰ−ＨＩＦＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＤｉｒｅｘ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ、ＵＳＡ）の伸長速度は、１ｋｂ／１５秒であり、したがって、ＧＤＰ−ＨＩＦＩ ＤＮＡポリメラーゼを１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するために用いる場合、前記Ｘは、１５秒と設定するものとする。前記増幅ステップの後、点突然変異を有する候補抗原遺伝子の全長配列を得ることができる。

次いで、ＰＣＲ−Ｍ（商標）Ｃｌｅａｎ Ｕｐシステムキット（ＧｅｎｅＭａｒｋ、Ｔａｉｃｈｕｎｇ、Ｔａｉｗａｎ）を用いることによりＰＣＲ産物をリサイクルし、ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキットを用いることによりそのクローニングを実施した。コロニーＰＣＲを実施して、形質転換後の菌株がｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡを有するプラスミドを含有することを確認し、次いで、その中のプラスミドをＤＮＡ配列決定（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｌｔｄ．のトータルソリューションプロバイダー）のために単離した。突然変異候補抗原遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｐＪＥＴ−ｐｄｈＡＭ、ｐＪＥＴ−ｘｙｌＦＭ、ｐＪＥＴ−Ｐ７８Ｍ、ｐＪＥＴ−Ｐ１３２Ｍ、ｐＪＥＴ−ｍｈｐ１４５Ｍ、ｐＪＥＴ−ｍｈｐ３８９Ｍと命名した。
配列決定の結果によれば、点突然変異後の候補抗原遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号０１（ｐｄｈＡ）、配列番号０２（ｘｙｌＦ）、配列番号０３（ｅｕｔＤ、点突然変異させなかった）、配列番号０４（ｍｈｐ１４５）、配列番号０５（Ｐ７８遺伝子）、配列番号０６（Ｐ１３２遺伝子）、配列番号０７（ｍｈｐ３８９）に示す通りであった。

Ｍ．ヒオニューモニエ抗原を発現させるための発現ベクターの構築
実験のこの部分においては、Ｍ．ヒオニューモニエ抗原を発現させるための発現ベクターを構築するための骨格として、プラスミドｐＥＴ−ＭＳＹを用いた。ｐＥＴ−ＭＳＹは、ｐＥＴ２９ａの誘導体であり、大腸菌ｍｓｙＢを有する。したがって、それにより発現する組換え抗原は、融合パートナーＭｓｙＢを有することとなる。ＭｓｙＢは、酸性アミノ酸に富み、発現するタンパク質の溶解度を増加させることができる。

ｐＪＥＴ−ｅｕｔＤ、ｐＪＥＴ−ｐｄｈＡ、ｐＪＥＴ−ｘｙｌＦ、ｐＪＥＴ−Ｐ７８、ｐＪＥＴ−Ｐ１３２、ｐＪＥＴ−ｍｈｐ１４５及びｐＪＥＴ−ｍｈｐ３８９をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより消化した後、得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素によりあらかじめ消化したｐＥＴ−Ｍｓｙにリガーゼにより挿入した。次いで、ＤＮＡ断片を含むｐＥＴ−Ｍｓｙを大腸菌ＥＣＯＳ９−５に形質転換した。コロニーＰＣＲを実施して、形質転換後の菌株がｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡを有するプラスミドを含有することを確認し、次いで、その中のプラスミドをＤＮＡ配列決定（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｌｔｄ．のトータルソリューションプロバイダー）のために単離した。適正なＤＮＡ配列を有すると確認されたプラスミドをそれぞれｐＥＴ−ＭＳＹＥｕｔＤ、ｐＥＴ−ＭＳＹＰｄｈＡ、ｐＥＴ−ＭＳＹＸｙｌＦ、ｐＥＴ−ＭＳＹＰ７８、ｐＥＴ−ＭＳＹＰ１３２、ｐＥＴ−ＭＳＹＭｈｐ１４５及びｐＥＴ−ＭＳＹＭｈｐ３８９と命名した。得られたそれらのプラスミドは、本発明のマイコプラズマ属菌種感染を予防するための発現ベクターの例であった。

Ｍ．ヒオニューモニエ抗原の発現及び単離
抗原発現のためのベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換後に結果として生じた菌株の単一コロニーをカナマイシン（作業濃度：３０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地に接種した。３７℃、１８０ｒｐｍで一夜培養した後、細菌の懸濁液を１：１００の比率で希釈し、カナマイシン（作業濃度：３０μｇ／ｍＬ）を含有する別のＬＢ液体培地に再び接種した。ＯＤ₆₀₀、したがって、約０．６〜０．８を達成するまで細菌を３７℃、１８０ｒｐｍで培養した。次いで、０．１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、発現を誘導した。４時間にわたる誘導の後、遠心分離（１００００×ｇ、１０分、４℃）によりペレットを収集し、タンパク質電気泳動により発現を検査した。

その後、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、組換えタンパク質のＮ末端のＨｉｓタグとニッケルイオン又はコバルトイオンとの間の共有結合によるタンパク質の単離に用いた。タンパク質の単離のプロトコールは、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（商標）の製品説明書（第４版、Ｑｉａｇｅｎ）に準拠したものであった。ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波プロセッサーによりかき混ぜた。遠心分離（８，０００×ｇ、１５分）の後、上清を収集して、１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂のカラムに導入した。組換え抗原は、前記樹脂上に付着した。次いで、それに付着した非特異的タンパク質を除去することができるように１５ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）をカラムに導入して、樹脂を洗浄した。最後に、２０ｍＬの溶出緩衝液を加えて（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）、樹脂上の組換え抗原を洗い落とした。この場合、高濃度のイミダゾールは、樹脂上の結合部位を組換えタンパク質と競合し、それにより、組換えタンパク質が洗い落とされることをもたらすことができる。次いで、単離の結果をタンパク質電気泳動により検査した。
単離により収集された本発明の候補抗原は、その後、抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチンの有効成分として使用されるそれらの能力を確認するための以下の免疫試験に用いることができる。

（例３）本発明の候補抗原のブタ免疫誘発実験
この例では、本発明の候補抗原をサブユニットワクチンを調製するための有効成分として用い、生存ブタにおけるその免疫効果について試験した。
ワクチンの調製
１つの単離組換え抗原又はいくつかの単離組換え抗原をアジュバントとしてのアルミナゲルと混合して、サブユニットワクチン又はカクテルサブユニットワクチンを調製した。調製されたワクチンのすべての用量は、容積が２ｍＬであり、それに含有されていた各種の抗原は、１００μｇであった。

以下の表９に免疫誘発実験のためにこの例で調製した試料を示す。
ブタ免疫誘発実験は、Ｂａｙｏｖａｃ（登録商標）ＭＨ−ＰＲＩＴ−５（陽性対照群として、Ｍ．ヒオニューモニエＰＲＩＴ−５を用いて作成）、サブユニットワクチン（本発明の試料１〜７）及びカクテルワクチン（本発明の試料８及び９）を用いて実施するものとした。
４週齢の３３匹のＳＰＦブタを農業技術研究所から入手し、実験の前に養豚場において同じ飼料、環境及び生育条件で給餌した。
ブタに３５日及び４９日齢まで給餌した後、ブタに２ｍＬの上記のワクチンを筋肉内注射により投与した。

誘発実験
免疫応答を誘導した前記のブタを１０９日齢においてマイコプラズマ属菌種により誘発して、前記のワクチンの免疫効果を確認した。
まず第一に、マイコプラズマ属菌種により感染させたブタから採取した肺を２０ｍＬのＦｒｉｉｓ培地中で磨砕し、１４８．８×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去して清浄な管に入れ、再び７，８７０×ｇで４０分間遠心分離した。次いで、上清を捨て、沈殿を６ｍＬのＦｒｉｉｓ培地に懸濁して、懸濁液を得た。その後、懸濁液を５μｍ及び０．４５μｍの膜により連続的にろ過して、誘発実験に必要な細菌溶液を得た。

細菌溶液（５ｍＬ）をその気管を介して麻酔ブタに投与した。投与してから２８日後に、ブタを屠殺し、解剖してその肺を採取した。免疫効果は、肺を観察し、以下の基準に従って記録することにより検討した。病的特徴が認められた肺のいずれかの側のメドロ上葉（ｍｅｄｄｌｅ ｕｐｐｅｒ ｌｏｂｅ）及び上葉のいずれかを１０点としてスコア化し、病的特徴が認められた肺のいずれかの側のメドロ上葉及び横隔葉のいずれかを５点としてスコア化した。全スコアは、５５点であった。観察記録を図４に示した。
非注射ブタの結果と比較して、本発明の７つの候補抗原は、従来のワクチン（Ｂａｙｏｖａｃ（登録商標）ＭＨ−ＰＲＩＴ−５）と同等の免疫効果をもたらすことができた。サブユニットワクチンのより高い安全性を考慮に入れるならば、本発明の候補抗原を含有するワクチンは、より価値の高いものとされよう。

他方で、２つ以上の抗原は２倍の免疫効果をもたらさない可能性があるため、１つのワクチンに免疫効果をもたらす２つ以上の抗原を使用することは一般的でなかった。実際、２つ以上の抗原が互いに妨害又は対抗し、その結果として、ワクチンの免疫効果を低下させるという可能性がより高い。この例の結果によれば、本発明の試料８及び試料９（すなわち、カクテルワクチン）は、思いがけなく免疫効果の有意な増大をもたらす。とは言うものの、本発明の候補抗原を組み合わせて用いる場合、本発明のサブユニットワクチンは、高い安全性を有するだけでなく、より十分な免疫効果ももたらす。

当業者は、本発明の精神から逸脱することのない本発明の開示に基づく任意の可能な修正を容易に理解することができる。したがって、上記の実施例は、本発明を限定するために用いるのではなく、下文に示す特許請求の範囲に準じた本発明の精神及び範囲のもとでの任意の可能な修正を包含することを意図する。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１． 配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチンを調製するためのタンパク質。
２． ＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２、Ｍｈｐ３８９又はそれらの組合せのタンパク質を含む有効成分と、
薬学的に許容されるアジュバントと
を含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチン。
３． 前記有効成分が前記ワクチンの総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである、上記２に記載のワクチン。
４． 前記有効成分がＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２及びＭｈｐ３８９からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む、上記２に記載のワクチン。
５． 前記有効成分がＰｄｈＡ及びＰ７８を含む、上記４に記載のワクチン。
６． 前記有効成分がＸｙｌＦ及びＭｈｐ１４５を含む、上記４に記載のワクチン。
７． 前記薬学的に許容されるアジュバントが完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せである、上記２に記載のワクチン。
８． 薬学的に許容される添加剤をさらに含む、上記２に記載のワクチン。
９． 前記薬学的に許容される添加剤が溶媒、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤又はそれらの組合せである、上記８に記載のワクチン。
１０． 配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含む有効成分と、
薬学的に許容されるアジュバントと
を含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチン。
１１． 前記有効成分が前記ワクチンの総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである、上記１０に記載のワクチン。
１２． 前記有効成分が配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸配列を含む、上記１０に記載のワクチン。
１３． 前記有効成分が配列番号０８及び配列番号１２の２つのアミノ酸配列を含む、上記１２に記載のワクチン。
１４． 前記有効成分が配列番号０９及び配列番号１１の２つのアミノ酸配列を含む、上記１２に記載のワクチン。
１５． 前記薬学的に許容されるアジュバントが完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せである、上記１０に記載のワクチン。
１６． 薬学的に許容される添加剤をさらに含む、上記１０に記載のワクチン。
１７． 前記薬学的に許容される添加剤が溶媒、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤又はそれらの組合せである、上記１６に記載のワクチン。
１８． プラスミドを含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのワクチンを調製するための発現ベクターであって、前記プラスミドが
配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むヌクレオチド配列と、
調節エレメントと
を含む、発現ベクター。
１９． 前記調節エレメントがプロモーター及びリボソーム結合部位を含む、上記１８に記載の発現ベクター。
２０． 前記プラスミドがｐＥＴ−ＭＳＹ、ｐＥＴ−ＹｊｇＤ、ｐＥＴ−Ｄ又はｐＥＴ−ＳＵＭＯである、上記１８に記載の発現ベクター。
２１． 融合パートナーをコードする遺伝子をさらに含む、上記１８に記載の発現ベクター。
２２． 前記融合パートナーが大腸菌のｍｓｙＢ、大腸菌のｙｊｇＤ、ラムダバクテリオファージのタンパク質Ｄ又はＳ．セレビシエのＳＵＭＯである、上記２１に記載の発現ベクター。
２３． 大腸菌遺伝子発現システムに用いる、上記１８に記載の発現ベクター。

１ ＸｙｌＦ（キシロース結合リポタンパク質）
２ ＸｙｌＦ（キシロース結合リポタンパク質）
３ ＸｙｌＦ（キシロース結合リポタンパク質）
４ ＰｄｈＡ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１−アルファサブユニット）
５ Ｍｈｐ１４５（周辺質糖結合タンパク質）
６ ＥｕｔＤ（ホスホトランスアセチラーゼ）
７ ＥｕｔＤ（ホスホトランスアセチラーゼ）
８ Ｍｈｐ３８９
９ Ｐ７８（リポタンパク質）
１０ Ｐ１３２

Claims (12)

1. ＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２、Ｍｈｐ３８９又はそれらの組合せのタンパク質を含む有効成分を含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するための組成物であって、前記ＰｄｈＡが配列番号０８のアミノ酸配列によって表され、前記ＸｙｌＦが配列番号０９のアミノ酸配列によって表され、前記ＥｕｔＤが配列番号１０のアミノ酸配列によって表され、前記Ｍｈｐ１４５が配列番号１１のアミノ酸配列によって表され、前記Ｐ７８が配列番号１２のアミノ酸配列によって表され、前記Ｐ１３２が配列番号１３のアミノ酸配列によって表され、前記Ｍｈｐ３８９が配列番号１４のアミノ酸配列によって表される、組成物。
2. 前記有効成分がＰｄｈＡ、ＸｙｌＦ、ＥｕｔＤ、Ｍｈｐ１４５、Ｐ７８、Ｐ１３２及びＭｈｐ３８９からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記有効成分がＰｄｈＡ及びＰ７８を含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記有効成分がＸｙｌＦ及びＭｈｐ１４５を含む、請求項２に記載の組成物。
5. 前記有効成分が前記組成物の総容積に基づく５０〜３５００μｇ／ｍＬの濃度のものである、請求項１に記載の組成物。
6. 完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組合せである薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 薬学的に許容される添加剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
8. 前記薬学的に許容される添加剤が溶媒、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤又はそれらの組合せである、請求項７に記載の組成物。
9. プラスミドを含む、マイコプラズマ属菌種感染を予防するための発現ベクターであって、前記プラスミドが
   配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むヌクレオチド配列と、
   調節エレメントと
   を含み、前記プラスミドが融合パートナーをコードする遺伝子をさらに含み、前記融合パートナーが大腸菌のｍｓｙＢである、発現ベクター。
10. 前記調節エレメントがプロモーター及びリボソーム結合部位を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
11. 前記プラスミドがｐＥＴ−ＭＳＹである、請求項９に記載の発現ベクター。
12. 大腸菌遺伝子発現システムに用いる、請求項９に記載の発現ベクター。