Oblasť techniky
Vynález sa týka liečenia alebo prevencie choroby alebo poruchy zvieraťa, ktorá je vyvolaná infekciou Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae), pri ktorom sa zvieratám starým asi tri (3) až desať (10) dní podá účinné množstvo vakcíny M. hyopneumoniae.
Doterajší stav techniky
M. hyopneumoniae je bakteriálny patogén, ktorý vyvoláva enzootickú pneumóniu pri ošípaných. Enzootická pneumónia je chronická choroba, ktorá vedie k špatnej konverzii krmiva, zakrpatenému rastu a predispozícii k druhotným pľúcnym infekciám. M. hyopneumoniae sa ľahko prenáša sekrétmi respiračného traktu a z prasníc na prasiatka, a v chovoch ošípaných má vysokú prevalenciu. V USA je infikovaných približne 99 % chovov ošípaných, čo v odvetví produkcie bravčového vyvoláva ročné náklady asi 300 miliónov dolárov.
Väčšina známych vakcín proti M. hyopneumoniae je založená na prípravkoch obsahujúcich inaktivované celé bunky M. hyopneumoniae a adjuvans. Okrem toho je možné synteticky alebo klonovaním a rekombinantnou expresiou génov M. hyopneumoniae pripraviť vakcíny založené na imunogénnych polypeptidoch alebo proteínoch. Ako vakcínu je možné tiež použiť gény M. hyopneumoniae, ktoré sú schopné exprimovať také polypeptidy alebo proteíny in vivo.
Ako príklady celobunkových inaktivovaných vakcín M. hyopneumoniae je možné uviesť RESPISURE a STELLAMUNE, ktoré sú dostupné na trhu od firmy Pfizer Inc., USA.
Okrem toho bolo opísaných niekoľko rekombinantne získaných imunogénnych polypeptidov a proteínov M. hyopneumoniae, ktoré môžu byť užitočné ako podjednotkové vakcíny. V medzinárodnej patentovej prihláške zverejnenej ako WO 96/28472 je opísaných šesť proteínových antigénov proti M. hyopneumoniae s molekulovými hmotnosťami 46 až 48, 52 až 54, 60 až 64, 72 až 75, 90 až 94 a 110 až 114 kilodaltonov a ďalej čiastočná proteínová sekvencia antigénov s molekulovou hmotnosťou 52 až 54, 60 až 64 a 72 až 75 kilodaltonov a celá nukleotidová a aminokyselinová sekvencia antigénu s molekulovou hmotnosťou 46 až 48 kilodaltonov.
V publikácii Futo et al. (1995; J. Bacteriol 177: 1915 až 1917) bolo tiež opísané klonovanie génu pre proteín M. hyopneumoniae P46, t. j. p46. Rovnaká skupina autorov preukázala, že tento in vitro exprimovaný génový produkt je užitočný pri stanovovaní protilátkových odpovedí na infekcie M. hyopneumoniae bez skríženej reaktivity s inými druhmi Mycoplasma (Futo et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 680 až 683). Sekvencie a diagnostické použitie génu p46 opísané v publikácii Futo et al. je ďalej opísané v európskej patentovej prihláške č. 0 475 185 Al.
V publikácii Wise a Kim (1987, J. Bacteriol., 169: 5546 až 5555) sa uvádza, že v M. hyopneumoniae sa vyskytujú štyri integrálne membránové proteíny označené ako p70, p65 (uvedený P46), p50 a P44, a že tri posledné uvedené proteíny sú modifikované kovalentnými lipidovými väzbami a indukujú silnú humorálnu imunitnú odozvu. Ochranné účinky tejto imunitnej odpovede neboli skúmané. Gén pre proteín P65 bol klonovaný a jeho sekvencie a použitie vo vakcínach a diagnostike sú opísané v US patente č. 5 788 962.
V medzinárodnej patentovej prihláške zverejnenej ako WO 91/15593 je opísaných päť proteínov M. hyopneumoniae so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 105, 90, 85, 70 a 43 kilodaltonov. V tejto publikácii je uvedená úplná sekvencia génu pre 85kDa proteín (proteín C), ako tiež čiastočné nukleotidové sekvencie pre zostávajúce štyri proteíny.
V US patente č. 5 252 328 (Faulds) sú opísané aminoterminálne sekvencie imunoreaktívnych proteínov M. hyopneumoniae, ktorých molekulová hmotnosť je 34, 41, 44, 48, 64, 68, 74, 5, 79, 88, 5, 96 a 121 kDa. V tomto patente sú tiež opísané iné proteíny identifikované na základe elektroforetickej pohyblivosti so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 22,5, 34 a 52 kDa; v ich prípade nie je uvedená proteínová sekvencia. Hoci sa v US patente č. 5 252 328 uvažuje o použití týchto proteínov vo vakcínových formuláciách, nie sú v ňom uvedené žiadne vakcinačné pokusy.
V medzinárodnej patentovej prihláške zverejnenej ako WO 95/09870 sú opísané biochemické spôsoby purifikácie adhezinov M. hyopneumoniae, mykoplazmových integrálnych membránových proteínov, ktoré sú zodpovedné za adhéziu k riasinkám epitelu horných ciest dýchacích hostiteľa. Vo WO 95/09870 sú tiež navrhnuté stanovenia a použitia týchto proteínov napríklad vo vakcínach a diagnostických prípravkoch.
Vo výskumnej správe King et al. (1997; Vaccine 15: 25 až 35) je opísaný Mhpl, 124kDa adhezin, ktorý je kmeňovým variantom P97.
96kDa variant P97 bol identifikovaný skupinou Wilton et al. (1998, Microbiology 144: 1931 až 1943). Okrem toho sa ukázalo, že gén p97 je súčasťou operónu, ktorý tiež kóduje druhý proteín označený ako P102 s predpokladanou molekulovou hmotnosťou asi 102 kDa (Hsu et al., 1998, Gene 214: 13 až 23). V medzinárodnej patentovej prihláške zverejnenej ako WO 99/26664 Minion a Hsu navrhujú použitie P102 vo vakcínach, ale neuvádzajú žiadne vakcinačné skúšky.
O žiadnej z opísaných vakcín M. hyopneumoniae sa neuvádza, že by bola účinná pri jednorazovom ošetrení prasiatok starých asi 3 až 10 dní. Taká vakcína by umožňovala vylúčiť potrebu viacnásobnej aplikácie, a preto by výrazne znižovala náklady a prácnosť súvisiacu s masívnou vakcináciou chovov ošípaných na celom svete. Existuje preto potreba vyvinúť účinnú vakcínu M. hyopneumoniae, ktorú by ošípaným bolo možné podávať jednorazovou vakcináciou vo veku asi 3 až asi 10 dní na účely ochrany pred chorobami alebo poruchami vyvolanými M. hyopneumoniae a ich prevencie.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu v základnom uskutočnení i) je použitie bakterinu Mycoplasma hyopneumoniae na výrobu vakcíny na liečenie alebo prevenciu choroby alebo poruchy zvieraťa vyvolanej infekciou Mycoplasma hyopneumoniae, pričom vakcína je vhodná na jednorazové podanie v účinnej dávke zvieraťu starému 3 až 10 dní.
Prednostné uskutočnenia tohto aspektu vynálezu zahŕňajú najmä ii) použitie podľa uskutočnenia i), kde jednorazová dávka vakcíny Mycoplasma hyopneumoniae obsahuje lxlO6 až 5x1010 jednotiek meniacich farbu (CCU) na dávku;
iii) použitie podľa uskutočnenia i), kde množstvo podanej vakcíny je 0,5 až 3,0 ml;
iv) použitie podľa uskutočnenia i), kde bakterin Mycoplasma hyopneumoniae obsahuje kmeň P-5722-3;
v) použitie podľa uskutočnenia i), kde vakcína Mycoplasma hyopneumoniae ďalej obsahuje vírusový alebo bakteriálny antigén odlišný od Mycoplasma hyopneumoniae·, vi) použitie podľa uskutočnenia v), kde vírusové alebo bakteriálne antigény sa volia z vírusu chrípky ošípaných (SIV), vírusu reprodukčnej a respiračnej choroby ošípaných (PRRS alebo záhadné choroby ošípaných), diarey po odstavení (PWD) a proliferačnej enteritídy ošípaných (PPE);
vii) použitie podľa uskutočnenia i), kde vakcína Mycoplasma hyopneumoniae je na intramuskuláme podanie;
viii) použitie podľa uskutočnenia i), kde prasa je chránené až 25 týždňov po vakcinácii; a ix) použitie podľa uskutočnenia i), kde vakcína Mycoplasma hyopneumoniae ďalej obsahuje adjuvans.
Aplikácia vakcíny vyrobenej podľa vynálezu eliminuje nutnosť podávať ďalšie dávky, aby sa vytvorila a/alebo udržala imunita proti M. hyopneumoniae. Takou jednorazovou vakcináciou sa dosiahne ochrana séronegatívnych i séropozitívnych prasiat proti infekcii virulentnou M. hyopneumoniae. Vakcinácia je účinná pri liečení alebo prevencii symptómov vyvolaných infekciou M. hyopneumoniae, ako je napríklad prevencia a zmenšovanie pľúcnych lézií pri ošípaných.
Vakcína M. hyopneumoniae podávaná podľa tohto vynálezu môže obsahovať ďalšie zložky, ako je adjuvans. Je možné použiť rôzne adjuvansy, ako sú adjuvansy opísané v tomto texte a známe v tomto odbore.
Definície a skratky
Pod pojmom „liečenie alebo prevencia“ sa v tomto texte v súvislosti s infekciou Mycoplasma hyopneumoniae rozumie inhibícia replikácie baktérie Mycoplasma hyopneumoniae, inhibícia prenosu Mycoplasma hyopneumoniae, alebo zabránenie Mycoplasma hyopneumoniae v kolonizácii hostiteľa, a zmiernenie symptómov choroby alebo poruchy vyvolanej infekciou Mycoplasma hyopneumoniae. Liečenie je považované za terapeutické, pokiaľ dochádza k zníženiu bakteriálnej nálože, poklesu bakteriálnych infekcií a/alebo vzostupu hmotnosti a/alebo rastu. Spôsob podľa vynálezu je napríklad účinný pri prevencii alebo redukcii pľúcnych lézií.
Pod pojmom „vakcína M. hyopneumoniae“ sa v tomto texte rozumie vakcína, ktorá je užitočná pri prevencii alebo liečení poruchy alebo choroby vyvolanej infekciou M. hyopneumoniae. Do rozsahu tohto pojmu patrí akákoľvek vakcína, ktorá je účinná pri liečení alebo prevencii M. hyopneumoniae pri ošípaných. Ako vakcínu M. hyopneumoniae, ktorú je možné použiť, je možné napríklad uviesť prípravky z celých buniek M. hyopneumoniae alebo ich častí, inaktivované alebo modifikované živé vakcíny, podjednotkové vakcíny obsahujúce jeden alebo viac polypeptidov alebo proteínov pochádzajúcich z M. hyopneumoniae alebo imunogénnych fragmentov takých proteínov alebo polypeptidov alebo jeden, alebo viac génov alebo nukleových kyselín pre jeden alebo viac polypeptidov alebo proteínov pochádzajúcich z M. hyopneumoniae alebo ich imumogénnych fragmentov, pričom tieto gény alebo nukleové kyseliny môžu byť pri ošípaných exprimované in vivo. Polypeptidy a proteíny pochádzajúce z M. hyopneumoniae, imunogénne fragmenty takých polypeptidov a proteínov, alebo gény, alebo nukleové kyseliny M. hyopneumoniae je možné syntetizovať alebo získať metódami génového inžinierstva, ktoré sú známe. Pri spôsobe podľa tohto vynálezu sa ako vakcína M. hyopneumoniae prednostne používa bakterin.
Pod pojmom „zviera“ sa rozumie živočích, ako cicavec, nie však človek.
Pod pojmom „ošípané“ sa rozumejú prasiatka (mláďatá ošípanej), brav, prasnice, mladé prasnice, kastrované diviaky, diviaky a príslušníci čeľade Suidae.
Vakcína vyrobená podľa vynálezu sa prednostne aplikuje na živočícha, ktorým je cicavec (ale nie človek), najvýhodnejšie ošípané.
Pod pojmom „bakterin“ sa rozumie prípravok z inaktivovaných buniek M. hyopneumoniae alebo ich častí vhodný na použitie ako vakcína.
Pod pojmom „účinné množstvo“ sa rozumie také množstvo vakcíny M. hyopneumoniae, ktoré je dostatočné na vyvolanie imunitnej odozvy pri subjekte, ktorému je podané. Ako neobmedzujúce príklady imunitnej odozvy je možné uviesť vyvolanie prirodzenej bunkovej a/alebo humorálnej imunity.
Spôsoby výroby obvyklých inaktivovaných vakcín na použitie pri spôsobe podľa tohto vynálezu sú známe.
Bakteriny, ktoré je možné použiť pri spôsobe jednorazovej vakcinácie podľa vynálezu, je možné získať z verejne dostupných zdrojov. Napríklad bakteriny M. hyopneumoniae je možné pripravovať z izolátov M. hyopneumoniae. Odborníkom v tomto odbore je známy rad izolátov M. hyopneumoniae, ktoré sú napríklad dostupné zo zbierky American Type Culture Collection, 1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209, USA. Ako príklady takých izolátov je možné uviesť ATCC č. 25095, 25617, 25934, 27714 a 27715.
Izoláty M. hyopneumoniae je tiež možné známymi spôsobmi získať priamo z prirodzene alebo experimentálne infikovaných pľúc ošípaných.
Izoláty M. hyopneumoniae je možné inaktivovať rôznymi známymi spôsobmi, napríklad tak, že sa na bakteriálny izolát pôsobí binárnym etylénimínom (BEI), ako je opísané v US patente č. 5 565 205, alebo napríklad vodným roztokom formaldehydu, teplom, BPL, žiarením alebo glutaraldehydom.
Bakteriny M. hyopneumoniae vhodné na použitie pri spôsobe podľa tohto vynálezu je tiež možné získať z rôznych zdrojov na trhu. Ako neobmedzujúce príklady takých zdrojov je možné uviesť RESPIFEND (Fort Dodge, American Home Products), HYORESP (Merial Ltd.), M + PAC (Shering Plough), PROSYSTEM M (Intervet), 1NGLEVAC M (Boehringer), RESPISURE (Pfizer Inc.) a STELLAMUNE MYCOPLASMA (Pfizer Inc.).
Ako zdroju bakterinu M. hyopneumoniae pri použití pri spôsobe podľa tohto vynálezu sa venuje prednosť prípravkom RESPISURE a STELLAMUNE MYCOPLASMA.
Osobitne prednostným zdrojom bakterinu M. hyopneumoniae pri použití pri spôsobe podľa vynálezu je RESPISURE-1 (Pfizer Inc.), ktorý obsahuje kmeň P-5722-3 (NL1042), získaný od Purdue University, USA.
V prednostnom uskutočnení sa kmeň P-5722-3 inaktivuje pôsobením BEI a zmieša s adjuvansom dostupným na trhu, prednostne látkou AMPH1GEN (Hydronics, USA). Prednostná dávka je asi 2,0 ml. Ako obvyklú konzervačnú prísadu je možné uviesť mertiolát/EDTA. Je možné pridať nosič, prednostne PBS. Príprava modifikovaných živých vakcín, ako príprava atenuácií virulentných kmeňov pasážovaním v kultúre, je v tomto odbore známa.
V iných realizáciách vakcína, ktorá sa používa pri spôsobe podľa tohto vynálezu, obsahuje bakterin M. hyopneumoniae a aspoň jeden ďalší imunogén (z inaktivovaných buniek alebo ich častí, alebo modifikovaných živých buniek) alebo imunogénny, alebo antigénny proteín, alebo polypeptid, alebo imunogénny fragment takého proteínu alebo polypeptidu, prednostne vírusový, bakteriálny alebo parazitárny polypeptid. Ako neobmedzujúce príklady takých ďalších patogénov a proteínov a polypeptidov a ich fragmentov je možné uviesť vírus chrípky ošípaných (SIV), vírus reprodukčnej a respiračnej choroby ošípaných (PRRS alebo záhadné choroby ošípaných), diareu po odstavení (PWD) a proliferačnú enteritídu ošípaných (PPE). Také kompozície sú užitočné ako kombinované vakcíny.
V ďalšom konkrétnom rozpracovaní imunogénne fragmenty takých proteínov alebo polypeptidov majú sekvenciu, ktorá obsahuje aspoň 10, aspoň 20, aspoň 30, aspoň 40, aspoň 50 alebo aspoň 100 po sebe idúcich aminokyselín imunogénnych proteínov a polypeptidov, ktoré sa používajú pri spôsobe podľa vynálezu, ktorých neobmedzujúcimi príkladmi sú P46, P65, P97, P102, P70, P50 a P44.
Vakcínové prípravky
Ako vhodné prípravky vakcín podľa vynálezu je možné uviesť prípravky na injekčné podávanie, ako kvapalné roztoky alebo suspenzie; tiež je možné pripravovať pevné formy vhodné na prípravu kvapalného roztoku alebo kvapalné suspenzie pred aplikáciou. Prípravok tiež môže byť emulgovaný. Aktívne imunogénne zložky sa často miešajú s adjuvansmi, ktoré sú farmaceutický vhodné a kompatibilné s aktívnou zložkou.
Vakcínové prípravky, ktoré sa používajú pri spôsobe podľa tohto vynálezu, obsahujú účinné imunizačné množstvo imunogénu M. hyopneumoniae a farmaceutický vhodný nosič. Vakcínové prípravky obsahujú účinné imunizačné množstvo jedného alebo viacerých antigénov a farmaceutický vhodný nosič. Farmaceutický vhodné nosiče sú v tomto odbore dobre známe a ako ich neobmedzujúce príklady je možné uviesť soľný roztok, tlmený soľný roztok, dextrózu, vodu, glycerol, sterilný izotonický vodný tlmivý roztok a ich zmesi. Ako príklad takého vhodného nosiča je možné menovať fyziologicky vyvážené kultivačné médium, ktoré obsahuje jedno alebo viac stabilizačných činidiel, ako sú stabilizované, hydrolyzované, proteíny, laktóza a pod. Nosič je prednostne sterilný. Formulácia by mala byť prispôsobená spôsobu podávania.
Použitie purifikovaných antigénov ako vakcínových prípravkov sa uskutočňuje štandardnými spôsobmi. Purifikovaný proteín (alebo proteíny) by napríklad mal byť upravený na vhodnú koncentráciu, formulovaný s akýmkoľvek adjuvasom vhodným pre vakcíny a balený na použitie. Ako neobmedzujúce príklady vhodných adjuvansov je možné uviesť minerálne gély, napríklad hydroxid hlinitý; povrchovo aktívne látky, ako lyzolecitín; glykosidy, napríklad saponín a deriváty saponínu, ako Quil A alebo GPI-0100; katiónové povrchovo aktívne látky, napríklad DDA (kvartéme hydrokarbyl-amóniumhalonigenidy, polyoly typu Pluronic; polyanióny a viacatómové ióny; polyakrylové kyseliny, neiónové blokové polyméry, napríklad Pluronic F-125 (B.A.S.F., USA); Avridine a Rantidine; peptidy; rekombinantné mutantné labilné toxíny, napríklad leukotoxín (rmLT) alebo cholerový toxín (CT); chemicky viazané alebo „close proximity“ molekulárne prenášače; minerálne oleje, napríklad Montanide ISA-50 (Seppic, Paríž, Francia), karbopol, Amphigen (Hydronics, USA, Omaha, NE, USA), Alhydrogel (Superfos Biosector, Frederikssund, Dánsko), olejové emulzie, napríklad emulzie minerálnych olejov, ako BayolF/Arlacel A, a vody, alebo emulzie rastlinných olejov, vody a emulgátora, ako lecitínu; kamenec, MDP, N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-izoglutamín (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-izoglutamín, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-izogIutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín, cholesterol cytokíny a kombinácie adjuvansov. Viacatómové ióny tiež môžu fungovať ako dispergačné, zahusťovacie a protispekavé činidlá, ktoré umožňujú vakcínu resuspendovať po dlhšom čase usadzovania ako monodisperznú suspenziu. Kombinácie adjuvansov môžu byť vo vodnej, zapuzdrenej (riadené alebo odložené uvoľňovanie) alebo mikrozapuzdrenej forme.
Imunogén tiež môže byť začlenený do lipozómov alebo konjugovaný s polysacharidmi a/alebo inými polymérmi na použitie v očkovacej formulácii. V prípade, že je rekombinantným antigénom haptén, t. j. molekula, ktorej antigenickosť spočíva v tom, že môže selektívne reagovať s rozpoznávanými protilátkami, ale nie je imunogénny, pretože nevyvoláva imunitnú odozvu, haptén môže byť kovalentne viazaný k nosiču alebo imunogénnej molekule; napríklad veľký proteín, ako sérový albumín, hapténu, ktorý je k nemu kopulovaný, dodá imunogenickosť. Hapténové nosiče môžu byť formulované na použitie ako vakcína.
Dávkovanie, spôsoby podávania a liečenia
Podľa tohto vynálezu jednorazová dávka účinného množstva vakcíny M. hyopneumoniae podaná ošípaným starým asi 3 až 10 dní poskytuje efektívnu imunitu proti neskoršej expozícii M. hyopneumoniae. Vakcína M. hyopneumoniae sa prednostne podáva vo veku asi 6 až asi 8 dní, najvýhodnejšie vo veku asi 7 dní.
Množstvo bakterinovej vakcíny M. hyopneumoniae, ktoré je účinné pri jednorazovom podaní, obsahuje asi lxlO6 až asi 5xlO10 jednotiek meniacich farbu (CCU) na dávku. V prednostnom rozpracovaní bakterinová vakcína, ktorá poskytuje efektívnu imunitu pri jednorazovom podaní, obsahuje asi lxlO8 až asi 5xl010 CCU na dávku, výhodnejšie asi 5xl08 až asi 5xlO10 CCU na dávku.
Podľa tohto vynálezu, v prípade, že sa podáva bakterinový produkt RESPISURE-1, je množstvo RESPISURE-1 na jednorazové podanie dávky asi 0,5 až asi 3,0 ml, prednostne asi 1,5 ml až asi 2,5 ml, výhodnejšie asi 2 ml.
Množstvo vakcíny M. hyopneumoniae, ktorá je podjednotkovou vakcínou obsahujúcou jeden alebo viac proteínov alebo polypeptidov, alebo imunogénnych fragmentov takých proteínov alebo polypeptidov, účinné pri spôsobe podľa vynálezu je asi 0,01 pg až asi 200 pg.
Množstvo vakcíny M. hyopneumoniae, ktorá je vakcínou obsahujúcou jeden alebo viac génov alebo nukleových kyselín (prednostne DNA) kódujúcich imunogénne proteíny alebo polypeptidy alebo imunogénne fragmenty takých proteínov alebo polypeptidov M. hyopneumoniae, ktoré je účinné pri spôsobe podľa vynálezu, je asi 0,1 pg až asi 200 mg.
Podľa tohto vynálezu je podávanie možné uskutočňovať známymi spôsobmi, ako je podávanie perorálne, intranazálne, mukozálne, topické, transdermálne a parenterálne (napríklad intravenózne, intraperitoneálne, intradermálne, subkutánne alebo intramuskulárne). Podávanie je možné tiež vykonávať pri použití bezihlových aplikačných zariadení. Možné je tiež kombinované podávanie, pri ktorom sa napríklad použije najskôr parenterálny spôsob a potom mukozálny spôsob. Prednosť má podávanie intramuskulárne.
Účinné dávky (imunizačné množstvo) vakcín podľa vynálezu je možné tiež extrapolovať z kriviek závislosti odpovedí od dávok odvodených z modelových skúšobných systémov.
Spôsobmi podľa tohto vynálezu sa dosahuje ochranná imunita pri ošípaných, ktoré sú séropozitívne i pri ošípaných, ktoré sú séronegatívne na M. hyopneumoniae. Prívlastok „séropozitívny“ sa vzťahuje k ošípaným, v ktorých sére sú prítomné protilátky proti M. hyopneumoniae. Prívlastok „séronegatívny“ sa vzťahuje k ošípaným, v ktorých sére nie sú dekovateľné hladiny protilátok proti M. hyopneumoniae.
Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava bakterinu M. hyopneumoniae
Kmeň M. hyopneumoniae NL1042 sa inaktivuje binárnym etylénimínom (BEI).
Na konci kultivačného obdobia sa pH kultúry zvýši na hodnotu 7,8 ±2,0, ktorá sa v tomto rozmedzí udržuje počas aspoň jednej hodiny. Potom sa pridá vodný roztok hydrobromidu 2-brómetylamínu (BEA) sterilizovaný filtráciou (konečná koncentrácia asi 4,0 mM). Pri zvýšenom pH sa BEA chemicky zmení na BEI. Kultúra sa aspoň 24 hodín za konštantného miešania inkubuje pri teplote 37 ±2 °C.
Po inaktivácii, ale pred neutralizáciou tiosíranom sodným, sa odoberú reprezentatívne vzorky, ktoré sa skúšajú na úplnosť inaktivácie. Čerstvé médium obsahujúce 0,0026 % fenolovú červeň sa zaočkuje 5 až 20 % inokulom a aspoň jeden týždeň inkubuje pri teplote 37 ±2 °C. Potom sa hodnotí zmena farby, ktorá je indikátorom neúspešnej inaktivácie. Voľné vzorky sa skúšajú na sterilitu v tioglykolátovej pôde pri teplote 37 ±2 °C a tryptikázovej sójovej pôde pri teplote miestnosti. Inaktivovaná kultúra sa premiestni do sterilných zásobníkov a až do stanovenia uchováva pri 2 až 8 °C.
Sila účinku (potency) sa stanoví in vitro sérologickým stanovením na účely kvantifikácie antigénu v konečnom obale. Sila účinku vakcín použitých pri hodnoteniach účinnosti predurčuje minimálnu silu účinku, ktorá musí byť prítomná vo vakcíne k dátumu exspirácie.
Vzorky voľného produktu alebo produktu v konečnom obale z každej série alebo prvej podsérie sa skúšajú na M. hyopneumoniae pri použití nasledujúceho postupu.
Bakterin sa skladuje v 100 ml fľaštičkách pri 50 °C. Obsah fľaštičiek sa nechá roztopiť a 15 ml subalikvóty sa až do použitia skladujú pri teplote 5 ±2 °C.
Na účely hodnotenia sily účinku zostavenej série sa vzorka série porovná s referenčnou vzorkou a stanoví sa RP jednotky pre sériu. Séria alebo podséria by prednostne mala obsahovať 6,33 RP na počiatku a aspoň 5,06 RP v priebehu starnutia.
RP označuje relatívnu silu účinku. RP je možné stanoviť relatívnou kvantifikáciou antigénu v porovnaní s referenčnou vakcínou. V tomto prípade má referenčná vakcína RP definovanú ako 1. Jednorazový produkt podľa vynálezu má RP prednostne 6,33, čo je 6,33-násobok hodnoty referenčného produktu.
Ako konzervačné činidlo sa pridá mertiolát (konečná hustotná koncentrácia nie je vyššia ako 0,01 % (hmotnosť/objem)).
Ako konzervačné činidlo sa pridá roztok etyléndiamíntetraoctovej kyseliny (EDTA, dvojsodné alebo štvorsodné soli) v konečnej hustotnej koncentrácii asi 0,07 % (hmotnosť/objem).
Príklad 2
Zvieratá
Na vakcináciu sa vyberú prasiatka staré asi jeden týždeň. Sérolotický status z hľadiska M. hyopneumoniae sa stanoví pomocou ELISA. Prasiatka, ktoré majú hodnotu ELISA < 0,50, sú považované za negatívne na M. hyopneumoniae. Prasiatka s hodnotou ELISA vyššou ako 0,50 sú považované na sérologicky pozitívne na M. hyopneumoniae.
Vakcíny
Prasiatka sa vakcínujú bakterinom M. hyopneumoniae RESPISURE-1 (Pfizer Inc.). Pred použitím sa stanoví sila účinku vakcíny relatívnou kvantifikáciou antigénu v porovnaní s referenčným bakterinom M. hyopneumoniae. Referenčná vakcína (RP = 1,0) obsahuje asi 8 000 jednotiek antigénu (asi 1 až 2 x 108 CCU viditeľných buniek zberaných pred inaktiváciou) na dávku, podľa imunostanovenia v pevnej fáze, ktorým sa mieri množstvo antigénu proti M. hyopneumoniae vo vakcíne.
Rovnaký kvapalný adjuvans (AMPHIGEN), ktorý sa používa pri formulácii prípravku RESPISURE-1, slúži ako placebo (t. j. bez bakteriálnych buniek).
Expozičné inokulum
Expozičné vehikulum sa pripraví ako 10 ml alikvóty pľúcneho homogenátu, zmrazí a označí ako derivát kmeňa M. hyopneumoniae 11 (LI 36). Inokulum sa nechá roztopiť a zriedi pôdou Friis Mycoplasma tak, aby sa dosiahlo zriedenie 1 : 25 a až do podania sa uchováva na ľade. Každému prasiatku sa v dňoch konkrétne uvedených v nasledujúcich príkladoch podá 5 ml intranazálna dávka (2,5 ml na nozdru) suspenzie 1 : 25. Každý deň expozície sa uskutoční kultivácia alikvotu pľúcneho inokula, aby sa potvrdila neprítomnosť bakteriálnej kontaminácie. Druhý alikvot sa spätne titruje každé tri dni; výsledky ukazujú, že inokulum obsahuje asi 106 až 107 jednotiek meniacich farbu (CCU) M. hyopneumoniae/m\.
Skúšobný postup
Prasiatka sa označia ušnými známkami ešte pri prasnici [deň (-1)]. Prasiatka sa na základe generalizovanej blokovej randomizačnej schémy pridelia do ohrád a ošetrovaných skupín. Bloky sa tvoria na základe vrhu a odšťavovacej ohrady.
V deň 0 sa prasiatka vakcínujú 2 ml intramuskulámou dávkou bakterinu M. hyopneumoniae RESPISURE-1 (Pfizer Inc.) alebo 2 ml intramuskulámou dávkou placeba. Každému prasiatku sa v dňoch uvedených v nasledujúcich príkladoch podá 5 ml intranazálna dávka suspenzie 1 : 25 expozičného inokula. Všetky prasiatka sa sledujú a denne sa kontrolujú príznaky klinického ochorenia.
Po uplynutí príslušného času od prvého dňa expozície sa prasiatka ohľaduplne usmrtia a podrobia pitve. Pľúca sa vyberú a hodnotia. Skúmanie post-mortem zahŕňa odhad rozsahu patologických zmien, ku ktorým došlo v súvislosti s mykoplazmovou respiračnou chorobou. Skúma sa každý pľúcny lalok a lézie sa zaznamenajú, aby bolo možné odhadnúť percentuálne postihnutie každého laloku. Zaznamená sa stupeň makroskopických lézií.
Analýza údajov
Účinnosť sa hodnotí na základe percenta pľúcnych lézií, ktoré je typické pre infekciu M. hyopneumoniae. Stanoví sa, že prasiatka v ošetrovaných skupinách (vakcinované) majú percentuálny podiel celých pľúc s léziami, ktorý je významne (P < 0,05) menší ako pri prasiatkach zo skupiny ošetrenej placebom.
Percentuálny podiel celých pľúc s léziami
Percentný podiel makroskopického postihnutia sa váži pri použití nasledujúcich podielov jednotlivých pľúcnych lalokov na celkovej hmotnosti pľúc: ľavý kraniálny - 10 %, ľavý stredný - 10 %, ľavý kaudálny - 25 %, pravý kraniálny - 10 %, pravý stredný - 10 %, pravý kaudálny - 25 % a prídavný 10 %. Vážené hodnoty pľúcnych lalokov sa sčítajú za celé pľúca, čím sa získa percentuálny podiel celých pľúc s léziami (Pointon et al., 1992).
Príklad 3
Ochrana proti infekcii virulentnou M. hyopneumoniae sa hodnotí pri prasiatkach sérologicky pozitívnych na M. hyopneumoniae pri použití jednorazovej dávky bakterinu M. hyopneumoniae RESPISURE-1 (Pfizer Inc.) podanej prasiatkam starým 3 až 8 dní.
V čase vakcinácie alebo v čase jemu blízkom sa vykoná päť opakovaných hodnotení RESPISURE-1. Relatívna sila účinku (RP) sa stanoví relatívnou kvantifikáciou antigénu v porovnaní s referenčnou vakcínou. Referenčná vakcína s RP = 1/0 obsahuje asi 8 000 jednotiek antigénu M. hyopneumoniae. Hodnoty RP z týchto stanovení boli 5,42, 3,96, 4,71, 5,49 a 4,36.
V deň 0 sa prasiatka v ošetrovanej skupine T02 (pozri tabuľku 1) vakcínujú 2 ml intramuskulámou dávkou bakterinu M. hyopneumoniae RESPISURE'l (Pfizer Inc.). Prasiatka v skupine T01 sa vakcínujú intramuskulárne 2 ml placeba. Každému prasiatku sa v dňoch 178, 179 a 180 podá 5 ml intranazálna dávka suspenzie 1 : 25 expozičného inokula. Každé tri dni sa v čase inokulácie kultivuje alikvot expozičného materiálu, aby sa potvrdila neprítomnosť bakteriálnej kontaminácie. Druhý alikvot sa spätne titruje každé tri dni, aby sa potvrdilo, že inokulum obsahuje asi 107 CCU M. hyopneumoniae/ml. Všetky prasiatka sa sledujú a denne kontrolujú z hľadiska príznakov klinického ochorenia.
Tridsať dní po prvom dni expozície sa všetky prasiatka ohľaduplne usmrtia a podrobia pitve. Pľúca sa vyberú a hodnotia. Skúmanie post-mortem zahŕňa odhad rozsahu patologických zmien, ku ktorým došlo v súvislosti s mykoplazmovou respiračnou chorobou. Skúma sa každý pľúcny lalok a lézie sa zaznamenajú, aby bolo možné odhadnúť percentuálne postihnutie každého laloku. Zaznamená sa stupeň makroskopických lézií.
Tabuľka 1
Ošetrovaná skupina |
T01 |
T02 |
Vakcinácia |
Placebo |
vakcína |
Počet |
26 |
26 |
Vakcinované
Deň 0 |
26 |
26 |
Expozícia
Deň 1781 |
26 |
2422 |
Expozícia
Deň 1791 |
26 |
223 |
Expozícia
Deň 180' |
26 |
223 |
Virulentné inokulum M. hyo
Prasiatka 71 a 73 boli zo štúdie vyradené pred expozíciou, pretože obidve stratili všetky ušné známky, a nebolo možné ich identifikovať.
3 Prasiatko 36 bolo v deň 178 nájdené mŕtve kvôli anestetickým komplikáciám. Prasiatko 31 bolo v deň 179 nájdené mŕtve kvôli anestetickým komplikáciám.
Výsledky hodnotení pľúcnych lézií sú súhrnne uvedené v tabuľke 2. Výsledky ukazujú, že vakcínované prasiatka (T02) majú významne (P = 0,0385) nižší stredný percentný podiel, stanovené metódou najmenších štvorcov, pneumonických pľúcnych lézií ako prasiatka, ktorým bolo podané placebo (T01) (2,0 proti 4,5 %).
Tabuľka 2
Ošetrovaná
skupina |
Ošetrenie |
Počet
prasiatok |
Stredná hodnota LS |
Rozmedzie |
T01 |
placebo |
26 |
4,5a |
0 až 36,75 |
T02 |
vakcína |
22 |
2^ |
0 až 13,75 |
LS stanovená pomocou najmenších štvorcov a,b Hodnoty označené rôznymi indexmi sa štatisticky líšia (P = 0,0385).
Výsledky tejto štúdie ukazujú, že jednorazová vakcinácia prasiatok starých asi 1 týždeň bakterinom M. hyopneumoniae RESPISURE - 1 vyvoláva ochranu pri následnej expozícii virulentnou M. hyopneumoniae.
Príklad 4
Ochrana proti infekcii virulentnou M. hyopneumoniae sa hodnotí pri prasiatkach sérologicky negatívnych na M. hyopneumoniae pri použití jednorazovej dávky bakterinu M. hyopneumoniae RESP1SURE-1 (Pfizer Inc.) podanej prasiatkam starým 3 až 8 dní.
V čase vakcinácie alebo v čase jemu blízkom sa uskutoční päť opakovaných hodnotení RESPISURE-1. Relatívna sila účinku (RP) sa stanoví relatívnou kvantifikáciou antigénu v porovnaní s referenčnou vakcínou. Referenčná vakcína s RP = 1,0 obsahuje asi 8 000 jednotiek antigénu M. hyopneumoniae. Hodnoty RP z týchto stanovení boli 5,42, 3,96,4,71, 5,49 a 4,36.
V deň 0 sa prasiatka v ošetrovanej skupine T02 vakcínujú 2 ml intramuskulárnou dávkou bakterinu M. hyopneumoniae RESPISURE-1. Prasiatka v skupine T01 sa vakcinujú intramuskuláme 2 ml placeba. Každému prasiatku sa v dňoch 173, 174 a 175 podá 5 ml intranazálna dávka suspenzie 1 : 25 expozičného inokula. Každé tri dni sa v čase inokulácie kultivuje alikvot expozičného materiálu, aby sa potvrdila neprítomnosť bakteriálnej kontaminácie. Druhý alikvot sa spätne titruje každé tri dni, aby sa potvrdilo, že inokulum obsahuje asi 108 CCU M. hyopneumoniae/m\. Všetky prasiatka sa sledujú a denne kontrolujú z hľadiska príznakov klinického ochorenia.
Dvadsať deväť dní po prvom dni expozície sa všetky prasiatka ohľaduplne usmrtia a podrobia pitve. Pľúca sa vyberú a hodnotia. Skúmanie post-mortem zahŕňa odhad rozsahu patologických zmien, ku ktorým došlo v súvislosti s mykoplazmovou respiračnou chorobou. Skúma sa každý pľúcny lalok a lézie sa zaznamenajú, aby bolo možné odhadnúť percentuálne postihnutie každého laloku. Zaznamená sa stupeň makroskopických lézií.
Schému skúšky súhrnne vyjadruje tabuľka 3.
Tabuľka 3
Ošetrovaná skupina |
T01 |
T02 |
Vakcinácia |
placebo |
vakcína |
Počet |
26 |
26 |
Vakcínované
Deň 0 |
26 |
26 |
Expozícia
Deň 173' |
252 |
233 |
Expozícia
Deň 1741 |
244 |
205 |
Expozícia
Deň 175* |
24 |
20 |
' Virulentný M. hyo 2 Prasiatko 123 bolo v deň 19 ohľaduplne usmrtené vzhľadom na chronickú septickú polyartritídu.
3 Prasiatko 222 bolo v deň 40 nájdené mŕtve. Pri pitve bolo zistené veľké množstvo perikardiálnej kvapaliny a hemoragia na epikardiu. Prasiatko 102 bolo ohľaduplne usmrtené v deň 95 kvôli prolapsu rekta. Prasiatko 204 bolo v deň 145 nájdené mŕtve. Pitva nebola vykonaná s ohľadom na pokročilý rozklad zdochliny.
4 Prasiatko 244 bolo v deň 174, po prvom dni po expozícii, nájdené mŕtve kvôli anestetickým komplikáciám.
5 NEEA počítané na 3 prasiatka
Výsledky hodnotenia pľúcnych lézií sú súhrnne uvedené v tabuľke 4. Celková analýza ukazuje, že vakcínované prasiatka (T02) majú významne (P = 0,0001) nižší stredný percentný podiel, stanovené metódou najmenších štvorcov, pneumonických pľúcnych lézií ako prasiatka, ktorým bolo podané placebo (T01) (0,3 proti 5,9 %).
Tabuľka 4
Ošetrovaná
skupina |
Ošetrenie |
Počet
prasiatok |
Stredná hodnota LS |
Rozmedzie |
T01 |
Placebo |
24 |
5,9“ |
0 až 36 |
T02 |
Vakcína |
20 |
ôj5 |
0 až 6 |
LS stanovená pomocou najmenších štvorcov a'b Hodnoty označené rôznymi indexmi sa štatisticky líšia (P = 0,0001).
Výsledky tejto štúdie ukazujú, že jednorazová vakcinácia prasiatok bakterinom M. hyopneumoniae RESIPURE ONE vyvoláva ochranu proti následnej experimentálnej expozícii virulentnou M. hyopneumoniae.
Príklad 5
Ochrana proti infekcii virulentnou M. hyopneumoniae sa hodnotí pri prasiatkach sérologicky negatívnych na M. hyopneumoniae pri použití jednorazovej dávky bakterinu M. hyopneumoniae RESPISURE-1 podanej prasiatkam starým 3 až 8 dní.
V čase vakcinácie alebo v čase jemu blízkom sa uskutoční päť opakovaných hodnotení RESPISURE-1. Relatívna sila účinku (RP) sa stanoví relatívnou kvantifikáciou antigénu v porovnaní s referenčnou vakcínou. Referenčná vakcína s RP = 1,0 obsahuje asi 8 000 jednotiek antigénu M. hyopneumoniae. Hodnoty RP z týchto stanovení boli 5,42, 3,96,4,71, 5,49 a 4,36.
V deň 0 sa prasiatka v ošetrovanej skupine T02 vakcinujú 2 ml intramuskulárnou dávkou bakterinu M. hyopneumoniae. Prasiatka v skupine T01 sa vakcinujú intramuskulárne 2 ml placeba. Každému prasiatku sa v dňoch 76, 77 a 78 podá 5 ml (2,5 ml na nozdru) intranazálna dávka suspenzie 1 : 25 expozičného inokula. Každé tri dni sa v čase inokulácie kultivuje alikvot expozičného materiálu, aby sa potvrdila neprítomnosť bakteriálnej kontaminácie. Druhý alikvot sa spätne titruje každé tri dni, aby sa potvrdilo, že inokulum obsahuje asi 106 CCU M. hyopneumoniae/m\. Všetky prasiatka sa sledujú a denne kontrolujú z hľadiska príznakov klinického ochorenia.
Dvadsaťdeväť dní po prvom dni expozície sa všetky prasiatka ohľaduplne usmrtia a podrobia pitve. Pľúca sa vyberú a hodnotia. Skúmanie post-mortem zahŕňa odhad rozsahu patologických zmien, ku ktorým došlo v súvislosti s respiračnou chorobou vyvolanou M. hyopneumoniae. Skúma sa každý pľúcny lalok a lézie sa zaznamenajú, aby bolo možné odhadnúť percentuálne postihnutie každého laloku. Zaznamená sa stupeň konsolidácie.
Schému skúšky súhrnne vyjadruje tabuľka 5.
Tabuľka 5
Ošetrovaná skupina |
T01 |
T02 |
Vakcinácia |
Placebo |
vakcína |
Počet |
26 |
26 |
Vakcinované
Deň 0 |
26 |
26 |
Expozícia
Deň 1761 |
232 |
213 |
Expozícia
Deň 177' |
23 |
21 |
Expozícia
Deň 1781 |
23 |
21 |
1 Virulentné inokulum M. hyo 2 Prasiatka 237 a 239 boli v deň -1 určené ako pozitívne na pneumóniu vyvolanú M. hyopneumoniae. Tieto prasiatka boli zo štúdie vyradené v deň 14 a ohľaduplne usmrtené. Prasiatko 220 bolo v deň 3 nájdené mŕtve, zaľahnuté prasnicou.
3 Prasiatka 238, 240 a 277 boli v deň -1 stanovené ako pozitívne na pneumóniu vyvolanú M. hyopneumoniae. Tieto prasiatka boli v deň 14 vyradené zo štúdie a ohľaduplne usmrtené. Prasiatko 280 bolo v deň 7 ohľadu9 plne usmrtené, pretože bolo anorektické a neduživé. Prasiatko 177 bolo v deň 40 ohľaduplne usmrtené kvôli chronickému syndrómu chradnutia.
Výsledky hodnotenia pľúcnych lézií sú súhrnne uvedené v tabuľke 6. Celková analýza ukazuje, že vakcínované prasiatka (T02) majú významne (P = 0,0001) nižší stredný percentný podiel, stanovené metódou najmenších štvorcov, pneumonických pľúcnych lézií ako prasiatka, ktorým bolo podané placebo (T01) (0,5 proti 9,9 %).
Tabuľka 6
Súhrnný prehľad percenta celkových pľúcnych lézií
Ošetrovaná
skupina |
Ošetrenie |
Počet
prasiatok |
Stredná hodnota LS |
Rozmedzie |
T01 |
Placebo |
23 |
9,9“ |
0 až 40,5 |
T02 |
Vakcína |
21 |
ôy |
0 až 5 |
LS stanovená pomocou najmenších štvorcov a,b Hodnoty označené rôznymi indexmi sa štatisticky líšia (P = 0,0001).