BR112014022067B1

BR112014022067B1 - Composição compreendendo antígeno e lipopolissacarídeo

Info

Publication number: BR112014022067B1
Application number: BR112014022067-0A
Authority: BR
Inventors: Jérôme Thevenon; Miklos Tenk; Ferenc Misak
Original assignee: Ceva Sante Animale
Priority date: 2012-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2022-05-31
Also published as: WO2013131565A1; MX362166B; CA2866199A1; MX2014010789A; UA115053C2; PH12014502015A1; US9687544B2; US20150174240A1; BR112014022067A2; PH12014502015B1

Abstract

COMPOSIÇÃO, COMPOSIÇÃO ÓLEO-EM-ÁGUA, MÉTODO PARA A VACINAÇÃO DE UM ANIMAL NÃO HUMANO CONTRA UM AGENTE PATOGÊNICO, MÉTODO PARA INDUZIR OU ESTIMULAR UMA IMUNIDADE HUMORAL E CELULAR ESPECÍFICA A UM ANTÍGENO EM UM ANIMAL NÃO HUMANO, MÉTODO PARA A VACINAÇÃO DE PORCOS OU LEITÕES CONTRA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE (MH), MÉTODO PARA PROTEÇÃO DE LEITÕES CONTRA DOENÇAS CAUSADAS POR INFECÇÃO POR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE. A presente invenção se refere a novas composições para induzir uma resposta imunológica em mamíferos. A composição, de preferência, compreende um antígeno e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água. A invenção é particularmente adequada para a vacinação de suínos contra infecções por micoplasma.

Description

[001] A presente invenção se refere a novas composições para induzir uma resposta imunológica em mamíferos. A invenção também se refere a métodos para a vacinação de mamíferos contra agentes patogênicos, bem como a métodos para a proteção de mamíferos contra doenças. A invenção se baseia, mais particularmente, em formulações adjuvantes particulares que causam respostas imunológicas fortes e estáveis. A invenção é particularmente adequada para a vacinação de suínos contra infecções por micoplasma.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína. É uma das doenças mais importantes que afetam suínos e, geralmente, provoca a perda mais importante de animais. A doença geralmente resulta em ganho de peso ineficiente em animais doentes. Suínos infectados com Mh também estão sujeitos a infecções secundárias, que eventualmente levam à morte.

[003] Foram relatadas diferentes vacinas para proteção de suínos contra infecções por Mycoplasma hyopneumoniae. Estas incluem, por exemplo, vacinas que compreendem antígenos de superfície do Mh (EP283840), uma vacina compreendendo membranas plasmáticas de Mh, ou vacinas compreendendo bactérias Mh vivas ou inativadas (US 3.917.819, WO2009/61798). As vacinas acima, no entanto, nem sempre fornecem proteção satisfatória aos suínos vacinados. Em particular, estas vacinas não parecem gerar as respostas celular e humoral adequadas para causar uma proteção eficiente dos animais.

[004] As vacinas que compreendem as cepas de Mh inativadas também estão comercialmente disponíveis, tal como Respifend(R). Esta vacina requer várias injeções.

[005] Existe uma necessidade de composições melhoradas que induzam respostas imunogênicas melhores nos animais, para conferir uma maior proteção contra as doenças causadas por agentes patogênicos, tal como Mh.

SUMÁRIO

[006] A presente invenção proporciona composições e métodos que provocam uma resposta imunológica eficaz contra agentes patogênicos em mamíferos, e que podem ser utilizadas para prevenir a ocorrência e/ou reduzir a gravidade de uma doença causada por tais agentes patogênicos, ou para corrigir ou melhorar pelo menos um sintoma associado com a doença.

[007] Um primeiro objeto da invenção reside, mais especificamente, em uma composição que compreende um antígeno e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em- água. Como será demonstrado, o requerente descobriu que a combinação de LPS e uma formulação óleo-em-água permite a estimulação de ambas as imunidades celular e humoral, e induz uma resposta Th1/2 equilibrada que está adaptada para proteger eficientemente mamíferos contra doenças por agentes patogênicos.

[008] Em uma configuração, a composição compreende vários antígenos, e é eficiente para induzir uma resposta imunológica contra agentes patogênicos diferentes.

[009] Em uma configuração preferida, pelo menos um antígeno é um antígeno bacteriano, de preferência uma bactéria inativada.

[010] Outro objeto da invenção é uma vacina compreendendo um antígeno e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

[011] Outro objeto da invenção é uma vacina compreendendo um antígeno patogênico e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água, para uso para proteger mamíferos não-humanos de doenças causadas pelo agente patogênico.

[012] A invenção também se refere a um método para a vacinação de um animal não humano contra um agente patogênico, compreendendo a administração ao animal de uma composição ou vacina que compreende um antígeno patogênico e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

[013] A invenção proporciona ainda um método para induzir ou estimular uma imunidade humoral e celular específica a antígeno em um animal não humano, compreendendo a administração ao animal de uma composição ou vacina compreendendo um antígeno bacteriano e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

[014] Outro objeto da invenção reside em uma método para a vacinação de porcos ou leitões contra Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), compreendendo a administração a ditos porcos ou leitões de uma composição ou vacina compreendendo um Mh inativado e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

[015] A invenção também se refere a um método para proteção de leitões contra doenças causadas por infecção por Mh, compreendendo a administração ao animal de uma composição ou vacina compreendendo um Mh inativado e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

[016] Outro objeto da invenção se refere a um método para proteger um animal contra uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae e/ou para reduzir o efeito de tal doença no referido animal, compreendendo a administração ao animal de uma composição ou vacina compreendendo um Mh inativado e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em-água.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[017] Figura 1: Resposta imunológica humoral e celular de leitões vacinados

[018] Figura 2: Comparação do peso corporal de porcos no momento do desafio (D175) e do abate (D204)

[019] Figura 3: Médias dos escores de pulmão cumulativos de animais vacinados e de controle

[020] Figura 4: Resposta imunológica humoral dos leitões.

[021] Descrição Detalhada da Invenção

[022] A presente invenção se refere a métodos e composições para a vacinação de mamíferos não-humanos contra agentes patogênicos. Ela é particularmente adequada para proteger os animais de doenças causadas pelos referidos agentes patogênicos, ou para minimizar a gravidade, duração ou sintomas das referidas doenças. Ela é adequada para vacinar quaisquer mamíferos, incluindo porcos, leitões, cães, gatos, cavalos, vacas ou vitela. Ela é particularmente adequada para vacinar porcos ou leitões contra Mycoplasma hyopneumoniae.

[023] Conforme indicado, outro objeto da invenção proporciona uma composição compreendendo um antígeno e um lipopolissacarídeo em uma formulação óleo-em- água. Tais composições, surpreendentemente, estimulam ambas as imunidades humoral e celular nos animais tratados, e induzem uma resposta Th1/2 equilibrada que está adaptada para proteger eficientemente mamíferos contra doenças causadas por agentes patogênicos. Os nossos resultados mostram ainda uma duração de 6 meses da imunidade protetora após a vacinação com uma composição da presente invenção por um teste de desafio experimental pesado, usando 1 injeção da vacina a 3 semanas de idade em porcos imunizados e controles não vacinados. A vacina impediu a perda de peso corporal devido à pneumonia enzoótica (PE) e diminuiu significativamente a gravidade das alterações patológicas causadas pela infecção por Mycoplasma hyopneumoniae.

[024] O(s) antígeno(s) na composição pode(m) ser de diversas naturezas. Em particular, o(s) antígeno(s) pode(m) ser um agente patogênico inteiro (por exemplo, célula, vírus) ou uma porção ou um extrato do mesmo, tal como uma membrana, organela, sobrenadante, proteína ou fragmento desta (por exemplo, um peptídeo), ácido nucleico, lipídeo, ou uma combinação destes. O antígeno algumas vezes é referido como um antígeno "patogênico", visto que deriva de um agente patogênico, mesmo se este não é, por si só, patogênico.

[025] Em uma configuração preferida, o antígeno compreende uma célula completa ou um vírus, na forma viva, inativada ou morta. O antígeno pode ser também um vírus recombinante compreendendo um epítopo imunogênico.

[026] Em uma configuração mais preferida, a composição compreende pelo menos um vírus ou bactéria inativados ou mortos, tal como uma bactéria Mh inativada ou morta. Inativado ou morto indica que o vírus ou bactéria perdeu a capacidade de causar doença em mamíferos, mas conserva uma propriedade imunogênica, especialmente a capacidade de gerar uma resposta imunológica específica. O termo bactéria inativada também inclui bactéria não virulenta. Os métodos para a preparação ou seleção de bactérias ou vírus inativados são bem conhecidos no estado da técnica. Eles incluem métodos de inativação por calor ou métodos de inativação químicos. A inativação pode ser realizada por exposição da bactéria ou vírus a um agente químico, tal como formalina, formaldeído, paraformaldeído, β-propiolactona, etilenoimina, etilenoimina binária (BEI), timerosal, ou derivados destes. Alternativamente, a inativação pode ser realizada por métodos físicos, tal como tratamento por calor ou sonicação. Os métodos de inativação são bem conhecidos por técnicos no assunto. O agente patogênico inativado pode ser concentrado por técnicas de concentração convencionais, em particular, por ultrafiltração e/ou purificados por meios de purificação convencionais, em particular, utilizando técnicas de cromatografia, incluindo, mas não limitado a, filtração em gel, ultracentrifugação em gradiente de sacarose, ou precipitações seletivas, em particular em PEG.

[027] Em uma configuração típica, a bactéria é inativada com etilenoimina usando uma concentração final de 500 microgramas/ml. A inativação é realizada a 37 °C durante 24 horas e interrompida por adição de tiossulfato de sódio.

[028] Em uma configuração preferida, a composição compreende uma quantidade de antígeno suficiente para provocar ou estimular uma resposta imunológica contra o agente patogênico em animais tratados. A quantidade exata necessária para uma dose imunologicamente eficaz pode variar de sujeito para sujeito, dependendo de fatores tais como a idade e condição geral do sujeito, da natureza da formulação e do modo de administração. A "quantidade eficaz" apropriada pode ser determinada por um técnico com conhecimento ordinário do assunto utilizando apenas experimentação de rotina. Por exemplo, são conhecidos métodos no estado da técnica para determinar ou titular as dosagens adequadas de vacina para encontrar as dosagens mínimas eficazes com base no peso do sujeito animal não humano, concentração da vacina e outros fatores típicos. A dosagem da vacina, a concentração dos componentes nesta e o momento de administrar a vacina que provocam uma resposta imunológica adequada, podem ser determinados por métodos tal como titulações de anticorpos em soros, por exemplo, por ELISA e/ou por análise de ensaio de neutralização de soro e/ou por avaliação de desafio de vacinação.

[029] Quando o antígeno é uma bactéria inteira (viva, inativada ou morta), de preferência este é utilizado uma dosagem compreendida entre cerca de 102 e 1011 células/dose, mais de preferência 103 a 1011. As dosagens preferidas estão compreendidas entre 107 a 1010 células/dose.

[030] Além disso, as composições podem compreender vários antígenos diferentes, particularmente 1, 2 ou 3, protegendo assim os animais tratados contra diferentes agentes patogênicos. Em uma configuração particular, a composição compreende pelo menos um antígeno derivado de pelo menos um dos seguintes agentes patogênicos: Actinobacillus pleuropneumoniae; Adenovirus; Alphavirus tal como vírus da encefalomielite equina do Leste; Balantidium coli; Bordetella bronchi septica; Brachyspira spp., de preferência B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, de preferência biovares 1, 2 e 3; vírus da peste suína clássica, vírus da peste suína africana; Chlamydia e Chlamydophila sp. e de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; Coronavirus digestivo e respiratório; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperitrozoon suis atualmente denominado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, de preferência subtipos 1, 7 e 14; vírus da encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis; vírus da encefalite japonesa; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., de preferência Leptospira interrogans ss lato, Leptospira borgpetersenii, Leptospira inadai, Leptospira meyeri, Leptospira noguchii, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira wolbachii, incluindo cepas dos sorogrupos ou sorovares australis, canicola, grippotyphosa, hardjo, Icterohaemorrhagiae, sejroe, Pomona e tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. de preferência, M. avium, M. intracellulare e M. bovis: Mycoplasma hyopneumoniae; Parvovírus; Pasteurella multocida; Cytomegolovirus suíno; Parvovírus suíno, e vírus da síndrome respiratória e reprodutiva de suínos: Vírus da pseudo-raiva; rotavírus; vírus Sagiyama; Salmonella spp. de preferência, S. enterica, S. typhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp. de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência Strep. suis; citomegalovírus suíno; vírus do herpes suíno; vírus da gripe suína; varíola suína; Toxoplasma gondii; vírus da estomatite vesicular e vírus do exantema de suínos; ou outros isolados e subtipos de circovírus suíno.

[031] Em uma configuração preferida, a composição compreende pelo menos um antígeno de um dos seguintes agentes patogênicos: Mycoplasma hyopneumoniae, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de suínos (PRRS), parvovírus suíno (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchi septica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, bactéria leptospira, vírus da gripe suína, antígeno de Escherichia coli, coronavirus respiratório de suínos, rotavírus, um agente patogênico causador da doença de Aujeszky, um agente patogênico causador de Gastroenterite Transmissível Suína.

[032] Em uma configuração mais preferida, a composição compreende um Mh inativado ou morto e, opcionalmente, um antígeno PCV2. Infecções por PCV2 ou doenças associadas incluem, entre outras, Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Dermatite Suína e Síndrome da Nefropatia (PDNS), Complexo da Doença Respiratória Suína (PRDC), distúrbios reprodutivos, enterite granulomatosa, epidermite exsudativa, linfadenite necrosante e tremores congênitos. De preferência, um sujeito animal não humano, tal como porco, é protegido em uma extensão em que um a todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos das infecções por PCV2 são significativamente reduzidos, melhorados ou totalmente impedidos.

[033] Em outra configuração preferida, a composição compreende um Mh inativado ou morto e, opcionalmente, um antígeno PRRS.

[034] A composição compreende LPS e óleo para gerar uma formulação óleo-em-água. Conforme mostrado nos exemplos, tal formulação particular gera uma resposta imunológica potente e estável em animais tratados. Em particular, a composição induz uma resposta imunológica celular e humoral, com um balanço Th1/Th2 certo adequado para proteger eficazmente os animais de doenças causadas pelo agente patogênico.

[035] O LPS para uso na presente invenção é de preferência um LPS bacteriano, particularmente derivado de E. coli. O LPS está disponível comercialmente e pode ser obtido de várias fontes. De preferência, este é purificado do sobrenadante de E. coli, mais de preferência no dia 5. O LPS para uso na invenção deve ser farmaceuticamente compatível. Além disso, é preferível usar o LPS em uma quantidade entre 5.102 e 5.104 UE/ml, ainda mais de preferência entre 103 e 104 UE/ml, tipicamente na quantidade de cerca de 5.103 UE/ml. Alternativamente, o LPS é usado em 0,1 a 2,5% v/v da composição, mais de preferência menos de 1% v/v. Em um exemplo específico, o LPS é LPSJ5 de E. coli.

[036] O óleo tipicamente está presente na composição em uma concentração final de cerca de 1-50% (v/v), e mais tipicamente em uma concentração final de cerca de 10-35% (v/v), tipicamente 10%, 15%, 20%, 25%, ou 30% (v/v). E uma configuração preferida, o óleo está presente em uma concentração final entre 10-20% (v/v). Em uma configuração específica, o óleo está presente em uma concentração de cerca de 15% (v/v).

[037] Os resultados obtidos mostram que, em teores de óleo elevados (por exemplo, entre 10-25%), a composição induz uma resposta forte mesmo com baixa dosagem de antígeno.

[038] Uma composição preferida da invenção é uma composição óleo-em-água compreendendo uma bactéria inativada ou morta, LPS, e 10-20% (v/v) de óleo, mais de preferência 12-18% (v/v) de óleo.

[039] Outra composição preferida da presente invenção é uma composição óleo-em-água compreendendo uma bactéria inativada ou morta, pelo menos 5.102 UE/ml de LPS, e 10-20% (v/v) de óleo.

[040] Outra composição preferida da presente invenção é uma composição óleo-em-água que compreende, pelo menos, 103 bactérias inativadas, pelo menos, 5.102 UE/ml de LPS, e 10-20% (v/v) de óleo.

[041] Um exemplo específico de uma composição da presente invenção é uma composição óleo-em-água compreendendo pelo menos 103 bactérias inativadas, cerca de 5.103 UE/ml de LPS, e cerca de 15% (v/v) de óleo.

[042] Na configuração mais preferida, a bactéria é um Mh inativado ou morto ou não virulento.

[043] O óleo na formulação pode ser selecionado de vários óleos farmaceuticamente compatíveis. Estes incluem óleos vegetais, óleos minerais, óleos de origem animal e as suas combinações. Exemplos de óleos vegetais incluem ou podem ser derivados de óleo de amendoim, óleo de cártamo, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo, ou óleo de coco. Exemplos de óleos minerais incluem ou podem ser derivados de óleo de parafina líquida leve, ou óleo de parafina líquida pesado.

[044] Em uma configuração preferida, o óleo compreende óleo de parafina líquida, mais de preferência óleo de parafina líquida leve. Em uma outra configuração preferida, o óleo compreende óleo de parafina líquida em mistura com trioleato de sorbitano e/ou polissorbato 80. A combinação pode ser feita de acordo com as seguintes proporções:

[045] Em uma configuração particular, o óleo é o MixA, com a seguinte composição:

[046] A composição da invenção pode compreender ingredientes adicionais. Em particular, em uma configuração preferida, a composição da invenção é uma vacina, e pode compreender ingredientes adicionais, tal como veículos, excipientes, diluentes, estabilizantes de liofilização, agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH, gelificantes ou aditivos melhoradores de viscosidade e conservantes farmaceuticamente aceitáveis, dependendo da via de administração.

[047] Exemplos de veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água destilada ou desmineralizada; soro fisiológico; silicones voláteis; esqualeno; derivados de celulose tais como metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, sal de sódio de carboximetilcelulose, ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanóis inferiores, por exemplo, etanol ou isopropanol; aralcanóis inferiores; polialquilenoglicóis inferiores ou alquilenoglicóis inferiores, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etilenoglicol, propilenoglicol, 1,3- butileno-glicol ou glicerina; ésteres de ácidos graxos, tal como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinilpirrolidona; ágar; carragena; goma tragacanto ou goma de acácia, e vaselina. Tipicamente, o veículo ou veículos formam de 10% a 99,9% em peso, da composição da vacina e podem ser tamponados por métodos convencionais, utilizando reagentes conhecidos no estado da técnica, tal como hidrogenofosfato de sódio, dihidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato de potássio, dihidrogenofosfato de potássio, uma mistura dos mesmos, e semelhantes.

[048] Exemplos de estabilizadores de liofilização podem ser, por exemplo, carboidratos tal como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tal como albumina ou caseína, e seus derivados.

[049] As composições ou vacinas podem ser formulações líquidas, tal como uma solução aquosa, uma emulsão água-em-óleo ou óleo-em-água, um xarope, um elixir, uma tintura, uma preparação para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tal como suspensões ou emulsões estéreis. Tais formulações são conhecidas na técnica e são tipicamente preparadas por dissolução do antígeno e outros aditivos típicos no veículo ou sistemas de solventes apropriados. As formulações liquidas também podem incluir suspensões e emulsões que contêm agentes de suspensão ou emulsionantes.

[050] A via de administração pode ser percutânea, administração por via mucosal, ou por via parentérica (intradérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa, ou intraperitoneal). As composições de vacinas de acordo com a presente invenção podem ser administradas sozinhas, ou podem ser co-administradas ou administradas sequencialmente com outros tratamentos ou terapias.

[051] A invenção também se refere a um método para a imunização ou indução de uma resposta imunológica em porcos compreendendo a administração de uma vacina conforme descrito acima, bem como a um método de vacinação em porcos, e métodos de tratamento e/ou prevenção de doenças infecciosas.

[052] As vacinas da invenção podem ser convenientemente administradas por via intranasal, por via transdérmica (isto é, aplicado sobre ou na superfície da pele para absorção sistêmica), parenteralmente, ocularmente, etc. A via de administração parentérica inclui, mas não está limitada a, administração intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e semelhantes.

[053] A dosagem da vacina feita de acordo com a presente invenção dependerá da espécie, raça, idade, tamanho, histórico de vacinação, estado de saúde do animal a ser vacinado, bem como da via de administração, ou seja, administração subcutânea, intradérmica, oral, intramuscular ou intravenosa.

[054] As vacinas da invenção podem ser administradas como dose única ou em doses repetidas. As vacinas da invenção podem ser administradas sozinhas, ou podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente com uma ou mais outras composições tal como, por exemplo, outras composições imunogênicas ou vacinas suínas. Onde as composições são administradas em momentos diferentes, as administrações podem ser separadas umas das outras ou sobrepostas no tempo. Tipicamente, a vacina é administrada na forma de dosagens entre 0,5 e 3 ml cada.

[055] As vacinas da invenção são particularmente adequadas para o tratamento de porcos, porcos adultos, mas também porcos jovens, leitões ou fêmeas grávidas, ou de outros tipos de mamíferos não humanos. A vacinação de fêmeas grávidas confere imunidade passiva aos recém-nascidos através da transmissão de anticorpos maternos. Os porcos podem ter menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 semana de idade; 1 a 6 semanas de idade; 2 a 5 semanas de idade; ou 3 a 4 semanas de idade. Por exemplo, animais de "teste" podem ser administrados com a vacina da invenção a fim de avaliar o desempenho da vacina, com vista à eventual utilização ou o desenvolvimento de uma vacina para porcos. Desejavelmente, a vacina é administrada a um sujeito que ainda não foi exposto ao agente patogênico. De preferência, o sujeito é um porco que necessita de vacinação contra micoplasma, Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS) e/ou Dermatite Suína e Síndrome da Nefropatia (PDNS).

[056] A presente invenção fornece um recipiente compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina, conforme descrito acima. A invenção também fornece kits de vacinação compreendendo, opcionalmente, um recipiente estéril compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina, os meios para a administração da vacina a porcos e, eventualmente, um manual de instruções incluindo informação para a administração da quantidade imunologicamente eficaz da composição em porcos para o tratamento e/ou prevenção de doenças infecciosas.

[057] A presente invenção se refere ainda a um método para a geração de um anticorpo que é capaz de se ligar ao agente patogênico ou a uma subunidade do mesmo. O método pode compreender a imunização de um animal, tal como um coelho, cobaia, ou roedor e colheita do anticorpo produzido. Os anticorpos da invenção podem ser preparações de anticorpos policlonais ou monoclonais, antisoros monoespecíficos, anticorpos humanos, ou podem ser anticorpos híbridos ou quiméricos, tal como anticorpos humanizados, fragmentos de anticorpos alterados (Fab')2, fragmentos F(ab), fragmentos Fc, anticorpos de domínio único, fragmentos de anticorpos diméricos ou triméricos ou construtos, ou fragmentos funcionais destes que se ligam ao antígeno em questão. Os anticorpos podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas por especialistas no assunto e descritas em "A Laboratory Manual, Harlow e Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1988)".

[058] O seguinte é fornecido para ilustrar as configurações da invenção e não devem ser vistos como limitantes do escopo da invenção. EXEMPLOS 1. Preparação de formulações de vacina Composição da vacina % v/v • fase aquosa (contendo adjuvante LPS de E. coli J5) 85 • Óleo (MixA) 15 Adjuvantes

Método de Preparação/Emulsificação

[059] O método de emulsificação é um procedimento de mistura em uma etapa.

[060] Todos os ingredientes (surfactantes) são misturados no óleo e, em seguida, a fase oleosa é adicionada à fase aquosa contendo a quantidade necessária de antígeno e do componente adjuvante de LPS de E. coli J5, com agitação. Não é necessária uma etapa de homogeneização específica.

[061] - Começar a mistura do adjuvante oleoso esterilizado e na temperatura ambiente (20 a 25 °C) e misturá-lo por pelo menos 20 minutos. - Iniciar a adição do adjuvante oleoso na fase aquosa através do ponto de entrada estéril, enquanto mantém agitação vigorosa. A agitação vigorosa da fase aquosa é necessária (280 - 320 rpm). A velocidade da adição tem de ser no máximo 4 - 8 kg/minuto.

[062] Após a adição, a emulsão é misturada durante pelo menos 60 minutos na mesma rpm.

[063] Seguindo este método, vacinas adicionais são preparadas com a seguinte formulação: % v/v • fase aquosa (contendo adjuvante de LPS de E. coli J5) 90 • Óleo (MixA) 10 % v/v • fase aquosa (contendo adjuvante de LPS de E. coli J5) 80 • Óleo (MixA) 20 2. Preparação de composições de vacina adicionais

[064] Foram preparadas as seguintes preparações de vacinas. Tabela 1: Composição das vacinas

3. Proteção Imunológica

[065] A proteção imunológica contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) é mediada tanto pelo braço humoral como pelo braço celular do sistema imunológico, com mais ênfase no último. Portanto, é essencial para uma vacina eficaz contra o Mh induzir a resposta imunológica mediada por célula (CMI) em suínos, adicionalmente à resposta de anticorpos. Usando as formulações de vacina do exemplo 2, foi possível gerar uma resposta imunológica Th1/Th2 equilibrada em suínos por vacinação com vacina de Mh inativado.

Materiais e Métodos

[066] Seis grupos de 10 leitões com quatro semanas de idade soronegativos para Mh foram imunizados uma vez com 3 semanas de idade (D21), com formulações óleo-em- água de antígeno de Mh inativado além de um adjuvante não tóxico de LPS derivado de E. coli J5 em diferentes combinações de dose (Tabela 2). Tabela 2: Formulações de vacinas aplicadas a 6 grupos de leitões. A vacina corresponde ao número da vacina na Tabela 1.

[067] Foi realizado um teste de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) em metade de cada grupo, em D40, usando injeção intradérmica do antígeno de Mh purificado. Fito-hemaglutinina (PHA) a 20 μg/ml de concentração em 0,1 ml foi usada como controle positivo. A espessura da pele foi medida com um paquímetro digital sensível à pressão (Mitutoyo, Japão). As amostras de sangue foram tomadas da segunda metade de cada grupo para testes ELISPOT de interferon-Y (IFNy) e ELISA de anticorpos em D40. Um kit de ELISPOT IFNY para suínos (R&D, EUA) e um leitor ELISPOT (CTL, EUA) foram usados para a quantificação da secreção de citocinas específicas para antígeno por PBMC estimulado in vitro.

[068] Resumidamente, PBMC separadas foram plaqueadas em placas de fundo de PVDF com 96 poços em duplicata, a 5 x 105 células por poço e estimuladas com antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae concentrado purificado. As células não estimuladas foram usadas como controles negativos. As células estimuladas por PHA e IFN-Y recombinante de suíno serviram como controles positivos, respectivamente. Após 72-96 horas de incubação à temperatura ambiente (TA) as células foram lavadas e o anticorpo anti-pIFN-Y biotinilado foi dosado nos poços para uma incubação durante a noite a 4 °C. A formação de manchas foi visualizada por 2 horas de incubação com conjugado de Estreptavidina-AP à temperatura ambiente, seguido por 1 hora de incubação com substrato BCIP/NBT, à TA. Os números de manchas por poço foram analisados por um analisador CTL ELISPOT (S5 Versa).

[069] O título de anticorpo sérico Mh- específico foi determinado com um ensaio ELISA indireto. Resultados

[070] A Figura 1 mostra o efeito de diferentes formulações sobre a resposta imunológica celular e humoral. Curiosamente, a dose mais elevada do antígeno propriamente dita não aumentou a resposta humoral, tendo aumentado ligeiramente ambas as respostas de CMI (Grupo 5 versus 3). O efeito do adjuvante de Th1/Th2 mais equilibrado foi alcançado pela combinação de LPS elevado + óleo elevado com dose de antígeno baixa (Grupo 1 versus 3). Neste efeito o LPS teve o papel principal (Grupo 1 vs 2). O efeito do adjuvante oleoso foi mais pronunciado com dose de antígeno elevada (Grupo 4 versus 5) do que com dose de antígeno baixa (Grupo 2 versus 3). Conclusões e Discussão

[071] Aqui, nós descrevemos o efeito adjuvante de diferentes formulações de vacina na resposta imunológica celular e no título de anticorpos séricos medido por DTH, ELISPOT IFNY e ELSIA quantitativo para anticorpos, respectivamente. A formulação óleo-em-água combinada com o adjuvante de LPS não tóxico resultou em uma resposta imunológica Th1/Th2 equilibrada em animais soronegativos. Esta formulação fornece uma memória imunológica humoral e CMI de longa duração.

[072] 4. Duração da imunidade após uma injeção de vacina contra Mycoplasma hyopneumoniae em porcos

[073] O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica (PE) em suínos. A doença é caracterizada por altas taxas de morbidez em animais com na fase de crescimento até a idade de abate, no entanto, a circulação do agente patogênico se inicia normalmente já no berçário após a mistura de leitões desmamados. A gravidade dos sinais clínicos é altamente dependente da dose infeciosa e virulência da cepa de M. hyopneumoniae (Mh). O objetivo deste estudo foi o de confirmar os seis meses de proteção conferida pelas vacinas da invenção contra um desafio pesado.

[074] Materiais e Métodos:

[075] Desenho do estudo; um total de 25 leitões soronegativos para Mh com 3 semanas de idade, foram divididos em dois grupos separados. Doze leitões do grupo 1 (G1) receberam uma injeção de vacinação com a vacina n° 2 da Tabela 1, no dia 0 (D0). Treze leitões não vacinados de controle, com a mesma idade estavam envolvidos no estudo, no grupo 2 (G2). O desafio foi realizado na idade de engorda, em dois dias consecutivos em D175 e D176. Todos os animais foram desafiados por via intranasal com uma alta dose de Mh (91ogl0 unidades de mudança de cor/animal). Eles foram observados para sinais clínicos respiratórios durante 28 dias e, em seguida, submetidos à eutanásia para necropsia e escore do pulmão em D204, a cerca de 6,5 meses de idade. Os parâmetros clínicos e post-mortem foram utilizados para ambos os estudos: foram utilizados 1) sintomas respiratórios, 2) temperatura retal, 3) peso corporal, 4) escore do pulmão de acordo com a Farmacopeia Europeia. A área afetada dos lobos foi expressa em porcentagem relacionada com a massa de todo o lobo. O cálculo dos valores finais (ou cumulativos) de escore de pulmão foi completado por um fator de multiplicação dependente do lobo pulmonar (1).

[076] Resultados: Não houve morte específica por PE no período de observação pós-desafio. Nem os animais vacinados, nem os animais do grupo de controle apresentaram sinais clínicos respiratórios. 2) Após o desafio, não houve qualquer febre no grupo de controle (G2) ou nos animais vacinados (G1). 3) O peso corporal médio dos animais vacinados foi 3,8 kg maior do que o dos animais de controle (G2) (ver Figura 2). 4) Os escores totais do pulmão dos animais de controle foram 7,75 vezes maiores do que os dos porcos vacinados em G1. A diferença foi significativa a favor do grupo vacinado. P = 0,0015) (ver Figura 3).

Discussão:

[077] Foram comprovados 6 meses de duração da imunidade protetora após a vacinação com uma composição da invenção por um teste de desafio experimental pesado, usando 1 injeção da vacina com 3 semanas de idade em porcos imunizados e controles não vacinados. A vacina impediu a perda de peso corporal devido à pneumonia enzoótica (PE) e diminuiu significativamente a gravidade das alterações patológicas causadas por infecção por Mycoplasma hyopneumoniae. 5. Estado imunológico de animais vacinados 5.1. Resposta imunológica humoral

[078] A Tabela 3 abaixo lista a média do título de anticorpos (UE/ml) antes e depois da vacinação e após o desafio.

[079] No D63 após a vacinação, foi detectada uma resposta imunológica humoral mensurável contra M. hyopneumoniae nos leitões vacinados. Quatro semanas após o desafio, foram detectados níveis elevados de anticorpos contra M. hyopneumoniae nos animais vacinados. Níveis 173 vezes mais elevados de anticorpos contra M. hyopneumoniae se desenvolveram nos animais vacinados em comparação com os animais de controle no final do estudo (D202) (ver Figura 4). 5.2. Resposta imunológica celular A Tabela 4 abaixo indica a média do número de glóbulos brancos antígeno-específicos/ 6log10 de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

[080] Os resultados mostram que, 13 dias após a vacinação (D13) a resposta imunológica celular já era 42,41 vezes superior nos animais vacinados em comparação com os controles. Foram encontrados 5,19 vezes mais glóbulos brancos antígeno específicos nos animais vacinados do que nos controles antes da infecção por desafio (D175).

[081] Após a análise estatística, haviam diferenças significativas entre a média da contagem de glóbulos brancos antígeno específicos do grupo vacinado e do grupo de controle em D13 e D90 (PD13 = 0,027, PD90 = 0,016).

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um antígeno e um lipopolissacarídeo (PLS) em uma formulação óleo- em-água, em que o lipopolissacarídeo compreende LPS J5 obtido de Escherichia coli, e a formulação óleo-em-água compreende óleo de parafina líquida em mistura com trioleato de sorbitano e/ou polissorbato 80.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno ser um antígeno bacteriano.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo referido antígeno ser uma bactéria inativada ou morta.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo antígeno bacteriano ser um micoplasma inativado ou morto.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo referido micoplasma inativado ou morto ser um Mycoplasma hyopneumoniae inativado ou morto.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender vários antígenos diferentes.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender um Mycoplasma hyopneumoniae inativado ou morto e pelo menos um antígeno PCV2 ou PRRS.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela formulação óleo-em-água compreender de 1 a 30% (v/v) de óleo, de 5 a 30% (v/v) de óleo, de entre 10 a 30% (v/v) de óleo, 10 a 25% (v/v) de óleo ou 10 a 20% (v/v) de óleo.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo óleo compreender óleo de parafina líquida em mistura com trioleato de sorbitano e polissorbato 80.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma bactéria inativada ou morta, pelo menos, 5-102 UE/ml de LPS, e 10 a 20% (v/v) de óleo.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender pelo menos 103 UE/ml de LPS.