MX2014010789A - Nueva vacuna veterinaria. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas composiciones para inducir una respuesta inmune en mamíferos. La composición comprende preferentemente un antígeno y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua. La invención es particularmente adecuada para vacunar cerdos contra infecciones por mycoplasma.

Description

NUEVA VACUNA VETERINARIA Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones novedosas para inducir una respuesta inmune en mamíferos. La invención también se refiere a métodos de vacunación de animales contra patógenos, así como a métodos para proteger mamíferos frente a enfermedades. La invención se basa más concretamente en formulaciones particulares de adyuvantes que causan respuestas inmunes fuertes y estables. La invención es particularmente adecuada para vacunar cerdos contra infecciones por mycoplasma. Antecedentes de la Invención Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) es el agente etiológico de la neumonía enzoótica del cerdo. Es una de las enfermedades más importantes que afectan al cerdo y normalmente causa las pérdidas más importantes de animales. La enfermedad generalmente da como resultado una ineficiente ganancia de peso y animales enfermizos. Los cerdos infectados por Mh también son sujetos de infecciones secundarias, que en algunos casos conducen a la muerte.

Se han divulgado diferentes vacunas para proteger a los cerdos contra infecciones por Mycoplasma hyopneumoniae. Estas incluyen, por ejemplo, vacunas que comprenden antígenos de superficie de Mh (Documento EP283840), una vacuna que comprende membranas plasmáticas de Mh, o vacunas que comprenden bacterias de Mh vivas o inactivadas (Documentos US3.917.819, W02009/61798). Las vacunas anteriores, sin embargo, no siempre proporcionan protección satisfactoria en cerdos vacunados. En concreto, estas vacunas no parecen generar respuestas celulares y humorales apropiadas para causar una protección eficiente de los animales.

Las vacunas que comprenden cepas de Mh inactivadas también están disponibles comercialmente, tales como Respifend(R). Esta vacuna requiere varias inyecciones.

Hay una necesidad de composiciones mejoradas que dunzcan mejores respuestas inmunogénicas en animales, para conferir una protección más fuerte contra enfermedades causadas por agentes patógenos tales como Mh.

Sumario de la Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos que susctian una respuesta inmune efectiva contra patógenos en mamíferos, y pueden usarse para prevenir la ocurrencia y/o reducir la severidad de una enfermedad causada por dichos patógenos, o para corregir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad.

Un primero objeto de la invención reside, más específicamente, en una composición que comprende un antígeno y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua. Como se demostrará, el solicitante ha descubierto que la combinación de LPS y una formulación de aceite en agua permite la estimulación de la inmunidad tanto celular como humoral,e induce una respuesta Thl/2 equilibrada que se adapta para proteger a los mamíferos de una manera eficiente contra enfermedades de patógenos.

En una realización particular, la composición comprende varios antígenos, y es eficaz para inducir una respuesta inmune contra distintos patógenos.

En una realización preferente, al menos un antígeno es un antígeno bacteriano, preferentemente una bacteria inactivada.

Un objeto adicional de la invención es una vacuna que comprende un antígeno y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

Un objeto adicional de la invención es una vacuna que comprende un antigeno patogénico y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua, para su uso en la protección de mamíferos no humanos contra enfermedades causadas por el patógeno.

La invención también se refiere a un método para vacunar a un animal no humano contra un patógeno, que comprende administrar al animal una composición o vacuna que comprende un antígeno patogénico y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

La invención proporciona además un método para inducir o estimular una inmunidad humoral y celular antígeno-específica en un animal no humano, que comprende administrar al animal una composición o vacuna que comprende un antígeno bacteriano y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

Otro objetivo de la invención reside en un método para vacunar cerdos o lechones contra Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), que comprende administrar a dichos cerdos o lechones una composición o vacuna que comprende una Mh inactivada y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

La invención también se refiere a un método para proteger a los lechones de enfermedades causadas por infección por Mh, que comprende administrar al animal una composición o vacuna que comprende una Mh inactivada y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

Otro objetivo de la invención se refiere a un método para proteger a un animal contra una enfermedad causada por Mycoplasma hyopneumoniae y/o para reducir el efecto de dicha enfermedad en dicho animal,que comprende administrar al animal una composición o vacuna que comprende una Mh inactivada y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1. Respuesta inmune humoral y celular de lechones vacunados.

Figura 2. Comparación de peso corporal de cerdos en el momento de provocación (D175) y de sacrificio (D204).

Figura 3. Medias de puntuaciones acumulativas de pulmón de animales vacunados y control.

Figura 4. Respuesta inmune humoral de los lechones.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para vacunar mamíferos no humanos contra patógenos. Es particularmente adecuada para proteger a los animales contra enfermedades causadas por dichos patógenos, o para minimizar la severidad, duración o síntomas de dichas enfermedades. Es adecuada para vacunar cualquier mamífero, incluyendo cerdos, lechones, perros, gatos, caballos, vacas o terneras. Es particularmente adecuada para vacunar cerdos o lechones contra Mycoplasma hyopneumoniae.

Como se indica, la invención proporciona composiciones novedosas que comprenden un antígeno y un lipopolisacárido en una forumlación de aceite en agua. Dichas composiciones estimulan sorprendentemente la inmunidad tanto celular como humoral en animales tratados, e inducen una respuesta Thl/2 equilibrada que se adapta para proteger a los mamíferos de una manera eficiente contra enfermedades causadas por patógenos. Nuestros resultados demuestran además una duración de 6 meses de la inmunidad protectora después de la vacunación con una composición de la invención mediante un fuerte ensayo de provocación experimental usando 1 dosis de la vacuna a las 3 semanas de edad en cerdos inmunizados y controles no vacunados. La vacuna previno la pérdida de peso corporal debido a neumonía enzoótica (NE) y disminuyó significativamente la severidad de cambios patológicos causados la infección por Mycoplasma hyopneumoniae .

El(los) antígeno(s) en la composición pueden ser de varias naturalezas. En concreto, el(los) antígeno(s) pueden ser un patógeno completo (por ejemplo, célula, virus) o una porción o extracto de los mismos, tales como una membrana, orgánulo, subrenadante, proteína o fragmento de la misma (por ejemplo, un péptido), ácido nucleico, lípido, o una combinación de los mismos. El antígeno se cita a veces como antígeno "patogénico" ya que se deriva de un patógeno, incluso si no es patogénico por sí mismo.

En una realización preferente, el antígeno comprende una célula o virus completo, en forma viva, inactivada o muerta. El antígeno también puede ser un virus recombinante que comprende un epítopo inmunogénico.

En una realización más preferente, la composición comprende al menos un virus o bacteria inactivada o muerta, tal como una bacteria de Mh inactivada o muerta. Inactivado o muerto indica que el virus o bacteria ha perdido la capacidad de causar enfermedad en mamíferos, pero permanece una propiedad inmunogénica del mismo, en particular la capacidad para generar una respuesta inmune específica. El término bacteria inactivada también incluye bacterias no virulentas. Los métodos para preparar o seleccionar bacterias o virus inactivados se conocen bien en la téenica. Estos incluyen métodos de inactivación por calor, o métodos de inactivación química. La inactivación puede llevarse a cabo exponiendo a la bacteria o virus a un agente químico tal como formalina, formaldehído, paraformaldehído, b-propiolactona, etilenoimina, etilenoimina binaria (BEI), timerosal, o derivados de los mismos. Como alternativa, la inactivación puede llevarse a cabo mediante tratamientos físicos tales como tratamiento por calor o sonicación. Los métodos de inactivación son bien conocidos para los expertos en la téenica. El patógeno inactivado puede concentrarse mediante técnicas de concentración convencionales, en concreto mediante ultrafiltración, y/o purificarse mediante medios de purificación convencionales, en concreto usando técnicas cromatográficas incluyendo pero sin limitación filtración en gel, ultracentrifugación o gradiente de sacarosa, o precipitaciones selectivas, en concreto en PEG.

En una realización típica, la bacteria se inactiva con etilenoimina usando una concentración final de 500 microgramos/ml. La inactivación se lleva a cabo a 37 °C durante 24 horas y se detiene añadiendo tiosulfato de sodio.

En una realización preferente, la composición comprende una cantidad de antígeno suficiente para causar o estimular una respuesta inmune contra el patógeno en los animales tratados. La cantidad exacta requerida para una dosis inmunológicamente efectiva puede variar de un sujeto a otro dependiendo de factores tales como la edad y estado general del sujeto, la naturaleza de la formulación y el modo de administración. Una "cantidad efectiva" apropiada puede determinarse por un experto en la técnica usando experimentación rutinaria. Por ejemplo, se conocen métodos en la técnica para determinar o titular dosificaciones adecuadas de vacuna para encontrar dosis mínimas efectivas basándose en el peso del sujeto animal no humano, concentración de la vacuna y otros factores típicos. La dosificación de la vacuna, concentración y componentes en ella y el tiempo de administración de la vacuna, la cual suscita una respuesta inmune adecuada, pueden determinarse mediante métodos tales como la titulación de anticuerpos en suero, por ejemplo, mediante análisis ELISA y/o ensayo de seroneutralización y/o evaluación de provocación a la vacunación.

Cuando el antigeno es una bacteria completa (viva, inactivada o muerta), se usa preferentemente una dosificación comprendida entre aproximadamente 102 y 1011 células/dosis, más preferentemente de 103 a 1011. Las dosificaciones preferentes están comprendidas entre 107 a 1010células/dosis.

También, las composiciones pueden comprender varios antigenos distintos, en concreto 1, 2 o 3, protegiendo por lo tanto a los animales tratados contra diferentes patógenos.En una realización particular, la composición comprende al menos un antigeno derivado de al menos uno de los siguientes agentes patogénicos: Actinobacillus pleuropneumoniae; Adenovirus; Alfavirus tales como virus de la encefalomielitis equina del este; Balantidium coli ; Bordetella bronchi séptica ; Brachyspira spp. , preferentemente B. hyodysenteriae, B . pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, preferentemente biovariantes 1, 2 y 3; virus clásico de la fiebre porcina, virus africano de la fiebre porcina; Chlamydia y Chlamydophila sp. y preferentemente C. pecorum y C. abortus; Clostridium spp. , preferentemente Cl . difficile, Cl . perfringens de los tipos A, B y C, Cl . novyi , Cl . septicum, Cl . tetani; coronavirus digestivo y respiratorio; Cryptosporidium parvum ; Eimeria spp; Eperythrozoon suis actualmente llamado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopa thiae; Escherichia coli ; Haemophilus parasuis, preferentemente los subtipos 1, 7 y 14; virus de la encefalomielitis hemaglutinante; Isospora suis, virus de la encefalitis japonesa; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp. , preferentemente Leptospira interrogans la to, Leptospira borgpeter senii , Leptospira inadai, Leptospira meyeri, Leptospira noguchii , Leptospira santarosai , Leptospira weilii, Leptospira wolbachii , incluyendo cepas de los serogrupos o serovariantes australis , canicola , grippotyphosa , hardjo, Icterohaemorrhagiae, se j roe, Pomona y tarassovi ; Mannheimia haemolytica ; Mycobacteríum spp. preferentemente, M. avium, M. intracellulare y M. bovis : Mycoplasma hyopneumoniae; Parvovirus; Pasteurella multocida ; citomegalovirus porcino; parvovirus porcino, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino; virus de la pseudorrabia; Rotavirus; virus de Sagiyama; Salmonella spp. preferentemente, S. enterica , S. thyphimurium y S. choleraesuis; Staphylococcus spp. preferentemente, S. hyicus; Streptococcus spp. , preferentemente Streptococcus suis; citomegalovirus porcino; virus del herpes porcino; virus de la gripe porcina; virus de la viruela porcina; Toxoplasma gondii ; virus de la estomatitis vesicular y virus del exantema del cerdo; u otros aislados y subtipos de circovirus porcino.

En una realización preferente, la composición comprende un antigeno de uno de los siguientes patógenos al menos: Mycoplasma hyopneumoniae , virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), parvovirus porcino (PVP), Haemophilus parasuis, Pasteurella mul tocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchi séptica , Salmonella choleraesuis , Erysipelothrix rhusiopa thíae , Leptospira bacteria , virus de la gripe porcina, antigeno de Escherichia coli, coronavirus respiratorio porcino, rotavirus, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, un patógeno causante de la gastroenteritis transmisible porcina.

En una realización más preferente, la composición comprende al menos una Mh inactivada y, opcionalmente, un antigeno de PCV2. Las infecciones por PCV2 o enfermedades asociadas incluyen entre otras síndrome multisistémico de emaciación posdestete (PMWS), síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS), complejo de enfermedad respiratoria porcina (PRDC), trastornos reproductivos, enteritis granulomatosa, epidermitis exudativa, linfadenitis necrotizante, y tremores congénitos. Preferentemente, un sujeto animal no humano, como un cerdo, se protege hasta un punto en el cual de uno a todos de los síntomas o efectos fisiológicos adversos de infecciones por PVC2 se reducen significativamente, se mejoran o se previenen totalmente.

En otra realización preferente, la composición comprende al menos una Mh inactivada y, opcionalmente, un antigeno de PRRS.

La composición comprende LPS y aceite para generar una formulación de aceite en agua. Como se muestra en los ejemplos, dicha formulación particular genera una respuesta inmune potente y estable en los animales tratados. En concreto, la composición induce una respuesta inmune celular y humoral, con un buen equilibrio Thl/Th2 adecuado para proteger eficazmente a los animales de las enfermedades causadas por el patógeno.

El LPS para su uso en la presente invención es preferentemente LPS bacteriano, en concreto derivado de E. coli . El LPS está disponible comercialmente y puede obtenerse de varias fuentes. Preferentemente, se purifica a partir de un sobrenadante de E. coli, más preferentemente en el día 5. El LPS para su uso en la invención debe ser farmacéuticamente compatible. También, se prefiere usar al LPS en una cantidad entre 5.102y 5.104EU/ml, aún más preferentemente entre 103 y 104 EU/ml, normalmente en la cantidad de aproximadamente 5.103EU/ml.Como alternativa, el LPS se usa al 0,1-2,5 % v/v en la composición, más preferentemente por debajo del 1 % v/v. En un ejemplo especifico, el LPS es LPSJ5 de E coli .

El aceite está presente normalmente en la composición a una concentración final de aproximadamente 1-50 % (v/v) y más normalmente a una concentración final de aproximadamente 10-35 % (v/v), normalmente del 10 %.15 % 20 % 25 % o 30% (v/v). En una realización preferente, el aceite está presente a una concentración final de entre 10-20 % (v/v). En una realización especifica, el aceite está presente a una concentración final de aproximadamente un 15 % (v/v).

Los resultados obtenidos muestran que, a un contenido alto de aceite (por ejemplo, entre un 10-25 %), la composición induce una fuerte respuesta incluso a un nivel de dosificación de antigeno bajo.

Una composición preferente de la invención es una composición de aceite en agua que comprende una bacteria inactivada o muerta, LPS, y un 10-20 % (v/v) de aceite, más preferentemente un 12-18 % (v/v) de aceite.

Una composición adicional preferente de esta invención es una composición de aceite en agua que comprende una bacteria inactivada o muerta, al menos 5.102 EU/ml de LPS, y un 10-20 % (v/v) de aceite.

Una composición adicional preferente de esta invención es una composición de aceite en agua que comprende al menos 103 bacterias inactivadas, al menos 5.102 EU/ml de LPS, y un 10-20 % (v/v) de aceite.

Un ejemplo especifico de una composición de la invención es una composición de aceite en agua que comprende al menos 103 bacterias inactivadas, aproximadamente 5.103 EU/ml de LPS, y aproximadamente un 15 % (v/v) de aceite.

En la realización más preferente, la bacteria es una Mh inactivada o muerta o no virulenta.

El aceite en la formulación puede seleccionarse de varios aceites farmacéuticamente compatibles. Estos incluyen aceites vegetales, aceites minerales, aceites animales y combinaciones de losmismos.Los ejemplos de aceitesvegetales incluyen o pueden derivarse de aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo o aceite de coco. Los ejemplos de aceites minerales incluyen o pueden derivarse de aceite de parafina liquida ligera, o aceite de parafina liquida pesada.

En una realización preferente, el aceite comprende aceite de parafina liquida, más preferentemente aceite de parafina liquida ligera. En una realización preferente adicional, el aceite comprende aceite de parafina liquida en mezcla con trioleato de sorbitán y/o polisorbato 80. La combinación puede hacerse de acuerdo con las siguientes proporciones: En una realización particular, el aceite es MixA, con la siguiente composición: polisorbato 80 La composición de la invención puede comprender ingredientes adicionales. En concreto, en una realización preferente, la composición de la invención es una vacuna y puede comprender ingredientes adicionales tales como vehículos, excipientes, diluyentes, estabilizantes de liofilización, agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, y conservantes farmacéuticamente aceptables, dependiendo de la ruta de administración.

Los ejemplos de vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, a agua desmineralizada o destilada, solución salina, siliconas volátiles, escualeno, derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, sal de sodio de carboximetilcelulosa, o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilengficol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; ésteres de ácidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; carragenina; goma de tragacanto o goma arábiga, y vaselina. Normalmente, el vehículo o vehículos formarán del 10 % al 99,9 % en peso de la composición de vacuna y pueden tamponarse mediante métodos convencionales usando reactivos conocidos en la téenica, tales como hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, una mezcla de los mismos, y similares.

Los ejemplos de estabilizante de liofilización pueden ser, por ejemplo, hidratos de carbono tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, y derivados de los mismos.

Las composiciones o vacunas pueden ser formulaciones líquidas tales como una solución acuosa, emulsión de agua en aceite o de aceite en agua, jarabe, un elixir, una tintura, una preparación para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable),tales como suspensiones o emulsiones estériles. Dichas formulaciones se conocen en la técica y se preparan normalmente mediante disolución del antígeno y otros aditivos típicos en los sistemas de vehículo o solvente adecuados. Las formulaciones líquidas también pueden incluir suspensiones y emulsiones que contienen agentes de suspensión o emulsionantes.

La ruta de administración puede ser percutánea, a través de administración mucosal, o a través de una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, o intraperitoneal).

Las composiciones de vacunas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse solas, o pueden coadministrarse o administrase secuencialmente con otros tratamientos o terapias.

La invención también se refiere a un método para inmunizar o inducir una respuesta inmune en cerdos que comprende administrar una vacuna como se describe anteriormente, así como a un método de vacunación en cerdos, y métodos de tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas.

Las vacunas de la invención pueden administrarse convenientemente intranasalmente, transdermalmente (es decir, aplicada sobre o en la superficie de la piel para absorción sistémica), parenteralmente, ocularmente, etc. La ruta de administración parenteral incluye, pero sin limitación, rutas intramusculares, intravenosas, intraperitoneales y similares.

La dosificación de la vacuna fabricada de acuerdo con la presente invención dependerá de la especie, raza, edad, tamaño, historial de vacunación, estado de salud del animal a vacunar, asi como de la ruta de administración, es decir, administración subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa.

Las vacunas de la invención pueden administrarse como una única dosis o en dosis repetidas. Las vacunas de la invención pueden administrarse solas, o pueden administrarse simultáneamente o administrarse secuencialmente con una o más composiciones adicionales, tales como por ejemplo otras composiciones inmunogénicas o de vacuna porcinas. En los casos donde las composiciones se administran a distintos tiempos, las administraciones pueden separarse unas de otras o solaparse en el tiempo. Normalmente, la vacuna se administra en forma de dosificaciones entre 0,5 y 3 mi cada una.

Las vacunas de la invención son particularmente adecuadas para tratar cerdos, cerdos adultos, pero también cerdos jóvenes, lechones y hembras gestantes, u otros tipos de mamíferos no humanos. La vacunación de hembras gestantes confiere inmunidad pasiva a los neonatos a través de la transmisión de anticuerpos maternos. Los cerdos pueden ser de menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 semana de edad; de 1 a 6 semanas de edad; de 2 a 5 semanas de edad; o de 3 a 4 semanas de edad.Por ejemplo, se puede administrar la vacuna de la invención a los animales "de prueba" para evaluar el rendimiento de la vacuna con vistas al uso o desarrollo eventual de una vacuna para cerdos. De manera deseable, la vacuna se administra a un sujeto que no se ha expuesto todavía al patógeno. Preferentemente, el sujeto es un cerdo en necesidad de vacunación contra mycoplasma, síndrome multisistémico de emaciación posdestete (PMWS) y/o síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS).

La presente invención proporciona un contenedor que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de vacuna como se ha descrito anteriormente. La invención también proporciona kits de vacunación que comprenden un contenedor opcionalmente estéril que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna, medios para administrar la vacuna a cerdos, y eventualmente un manual de instrucciones que incluye información para la administración de la cantidad inmunológicamente efectiva de la composición en cerdos para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas.

La presente invención además se refiere a un método para generar un anticuerpo que es capaz de unirse al patógeno o a una subunidad del mismo. El método puede comprender inmunizar a un animal, tal como un conejo, cobaya, o roedor y recoger el anticuerpo producido en él. Los anticuerpos de la invención pueden ser preparaciones de anticuerpos policlonales o monoclonales, antisueros monoespecífíeos, anticuerpos humanos, o pueden ser anticuerpos híbridos o quiméricos, tales como anticuerpos humanizados, fragmentos (Fab')2 de anticuerpos alterados, fragmentos F(ab), fragmentos Fe, anticuerpos de dominio simple, fragmentos o construcciones de anticuerpos diméricos o triméricos, o fragmentos funcionales de los mismos que se unen al anticuerpo en cuestión. Los anticuerpos pueden producirse usando téenicas bien conocidas para los expertos en la técnica y se divulgan en "A Laboratory Manual,Harlow and Lañe, eds., Coid Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)".

Lo siguiente se proporciona para ilustrar realizaciones de la invención y no debe verse como limitante del alcance de la invención.

Ejemplos 1 . Preparación de formulaciones de vacuna Composición de la vacuna v/v % • Fase acuosa (contiene adyuvante J5 LPS de E. coli) 85 • Aceite (MixA) 15 Adyuvantes Método de preparación/emulsionado El método de emulsionado es un procedimiento de mezcla de un paso.

Todos los ingredientes (tensioactivos) se mezclan en el aceite. A continuación la fase oleosa se añade a la fase acuosa que contiene la cantidad necesaria del antigeno y componente adyuvante J5 LPS de E. coli en agitación.No esnecesaria una etapa de homogeneización especifica.

Empezar mezclando adyuvante de aceite estéril a temperatura ambiente (20-25°C) y mezclarlo durante al menos 20 minutos.

Empezar a añadir el adyuvante de aceite en la fase acuosa a través del puerto de entrada estéril mientras se mezcla vigorosamente. Es necesaria la mezcla vigorosa de la fase acuosa (280 - 320 rpm).La velocidad de la adición tiene que ser un máximo de 4-8 kg/minuto.

Después de la adición, la emulsión se mezcla durante almenos 60 minutos a las mismas rpm.

Después de este método, se preparan vacunas adicionales con la siguiente formulación: v/v % Fase acuosa (contiene adyuvante J5 LPS de E. coli) 90 Aceite (MixA) 10 v/v % • Fase acuosa (contiene adyuvante J5 LPS de E. coli) 80 • Aceite (MixA) 20 2 . Preparación de formulaciones de vacuna adicionales Las siguientes preparaciones de vacuna se prepararon Tabla 1. Composición de las vacunas 3 . Protección inmune La protección inmune contra la infección por Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), está mediada por los brazos tanto humorales como celulares del sistema inmune, con más énfasis en el último. Por lo tanto, es crucial para una vacuna de Mh eficiente inducir una respuesta inmune mediada por células (CMI) en el cerdo además de respuesta de anticuerpos. Usando las formulaciones de vacuna del ejemplo 2, fuimos capaces de generar una respuesta inmune equilibrada Thl/Th2 en cerdo tras la vacunación con vacuna de Mh inactivada.

Materiales y métodos Se inmunizaron una vez seis grupos de 10 lechones seronegativos a Mh de cuatro semanas de edad a las tres semanas de edad (D21), con formulaciones de aceite en agua de antigeno inactivado de Mh más adyuvante LPS no tóxico derivado de E. coli J5 en diferentes combinaciones de dosis (Tabla 2).

Tabla 2. Formulaciones de vacuna aplicadas a los 6 grupos de lechones. La vacuna correspone al n° de vacuna en la Tabla 1 Se efectuó un ensayo de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) a la mitad de cada grupo en el D40 usando inyección intradérmica de antigeno Mh purificado.Se usó fitohemaglutinina (PHA) a una concentración de 20 mg/ml en 0,1 mi como control positivo. El espesor de la piel se midió con un calibre digital sensible a la presión (Mitutoyo, Japón). Se tomaron muestras de sangre de la segunda mitad de cada grupo para ELISPOT de interferón-g (IFNy) y anticuerpos de ELISA en el D40. Se usaron un kit porciono IFNy ELISPOT (R&D, EE.UU.) y un lector ELISPOT (CTL, USA) para la cuantificación de la secreción de citocina específica de antígeno mediante PBMC estimulada in vitro.

En resumen, se emplacaron PBMC separadas en placas de 96 pocilios de fondo de PVDF en duplicado a 5x 105célulaspor pocilio y se estimularon con antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae purificado concentrado.Las células no estimuladas se usaron como controles negativos. Las células estimuladas con PHA y el IFN-y porcino recombinante sirvieron como controles positivos, respectivamente. Después de 72-96 horas de incubación a temperatura ambiente (TA) se lavaron las células y se midión el anticuerpo anti-pIFN-g biotinilado en los pocilios para una incubación a 4 °C durante la noche. Se visualizó la formación de puntos mediante incubación de 2 horas con conjugado estreptavidina-AP a TA seguido de 1 hora de uncubación con sustrato BCIP/NBT a TA. Los números de puntos por pocilio se analizaron con un analizador CTL ELISPOT (S5 Versa).

El título de anticuerpo en suero específico de Mh se determinó con un ensayo ELISA indirecto.

Resultados La Figura 1 muestra el efecto de diferentes formulaciones en la respuesta inmune celular y humoral. De manera interesante, una dosismás alta de antigeno no aumentó por simisma la respuesta humoral mientras que aumentó ligeramente ambas respuestas CMI (Grupo 5 frente a 3). El efecto de adyuvante Thl/Th2 más equilibrado se logró mediante la combinación de alto LPS + alto aceite a baja concentración de antigeno (Grupo 1 frente a 3). En este efecto, el LPS jugó el papel principal (Grupo 1 frente a 2). El efecto de adyuvante de aceite fue más pronunciado a elevadas dosis de antigeno (Grupo 4 frente a 5) que a bajas dosis de antigeno (Grupo 2 frente a 3).

Conclusiones y discusión Aqui, describimos el efecto adyuvante de diferentes formulaciones de vacuna en respuesta inmune celular y titulo de anticuerpo en suero medido mediante DTH, ELISPOT de IFNy y ELISA cuantitativo de anticuerpo, respectivamente. La formulación de aceite en agua combinada con el adyuvante no tóxico LPS dio como resultado una respuesta inmune Thl/Th2 equilibrada en animales seronegativos. Esta formulación proporciona memoria inmune CMI y humoral de larga duración. 4. Duración de la inmunidad despues de una dosis de vacuna de Mycoplasma hyopnevaaoniae en cerdos Mycoplasma hyopneumoniae es el agente etiológico de la neumonía enzoótica en el cerdo.La enfermedad se caracteriza por una elevada morbilidad en animales de edad mediana a edad de matanza, sin embargo, la circulación del patógeno comienza generalmente ya en el criadero después de mezclar a los cerdos destetados. La severidad de los signos clínicos depende elevadamente de la virulencia y dosis infecciosa de cepa de M. hyopneumoniae (M.h.). El objetivo de este estudio fue confirmar los seis meses de protección conferidos por vacunas de la invención contra una provocación fuerte.

Material y métodos: Diseño del estudio: se dividieron un total de 25 lechones seronegativos a Mh de 3 semanas de edad en 2 grupos separados. Doce lechones del grupo 1 (Gl) recibieron una dosis de vacunación con la vacuna N° 2 de la Tabla 1, en el día 0 (DO). Se incluyeron en el estudio trece lechones de control de la misma edad no vacunados en el grupo 2 (G2). La provocación se efectuó a la edad de engorde, en dos dias consecutivos, en D175 y D176, Se provocó intranasalmente a los animales con una elevada dosis de Mh. (91ogl0 unidades de cambio de color/animal). Se les observó para signos clínicos respiratorios durante 28 dias y después se eutanasiaron para la necropsia y marcas pulmonares en el D204, aproximadamente a los 6,5 meses de edad. Se usaron parámetros clínicos y post-moterm para ambos estudios: se usaron 1) síntomas respiratorios, 2) temperatura rectal, 3) peso corporal, 4) puntuación pulmonar de acuerdo con la Farmacopea Europea. El área afectada de los lóbulos se expresó en porcentaje en relación con la masa del lóbulo completo. El cálculo de los valores de puntuación pulmonar total (o acumulativa) se completó mediante un factor de multiplicación dependiente del lóbulo pulmonar (1).

Resultados: 1) No sucedió ninguna muerte específica por EP en el periodo de observación post-provocación.Ni los animales vacunados ni los controles mostraron signos clínicos respiratorios.2) Después de la provocación no hubo fiebre ni en animales control (G2) o animales vacunados (Gl). 3) El peso corporal medio de los vacunados 3,8 kg mayor que el de los controles (G2) (véase Figura 2). 4) Las marcas pulmonares totales de los animales control fueron 7,75 veces mayores que aquellas de los cerdos vacunados en G1. La diferencia fue significativa en favor del grupo vacunado. (P=0,0015) (Véase Figura 3).

Discusión: Se comprobó una duración de 6 meses de inmunidad protectora después de la vacunación con una composición de la invención mediante un fuerte ensayo de provocación experimental usando 1 dosis de la vacuna a las 3 semanas de edad en cerdos inmunizados y controles no vacunados. La vacuna previno la pérdida de peso corporal debido a EP y disminuyó significativamente la severidad de cambios patológicos causados la infección por Mycoplasma hyopneumoniae. 5. Estado inmunológlco de animales vacunados 5.1. Respuesta inmune humoral La tabla 3 a continuación reporta la media del titulo de anticuerpos (EU/ml) antes y después de la vacunación y después de la provocación.

En el D63 después de la vacunación se detectó respuesta inmune humoral medible contra M. hyopneumoniae en los lechones vacunados. Cuatro semanas despés de la provocación se detectaron elevados niveles de anticuerpos contra M. hyopneumoniae en los animales vacunados. Se dessarrollaron niveles de anticuerpo contra M. hyopneumoniae 173 veces mayores en los animales vacunados que en los animales control al final del estudio (D202) (véase Figura 4). 5.2. Respuesta inmune celular La Tabla 4 a continuación reporta la media del número de glóbulos blancos específicos de antígeno / 61ogl0 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Los resultados muestran que, 13 días después de la vacunación (D13) la respuesta inmune celular ya era 42,41 veces mayor en los animales vacunados comparados con los controles. Se encontraron 5,19 veces más glóbulos blancos específicos de antígeno en los animales vacunados que en los controles después de la infección de provocación (D175).

Después del análisis estadístico, hubo diferencias significativas entre las medias de los recuentos de glóbulos blancos específicos de antígeno del grupo vacunado y control en el D13 y D90 (PDi3 =· 0,027, PD9o = 0,016).

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un antigeno y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

2. La composición de la reivindicación 1, donde el antigeno es un antigeno bacteriano, preferentemente una bacteria inactivada o muerta.

3. La composición de la reivindicación 2, donde el antigeno es un mycoplasma inactivado o muerto,preferentemente un Mycoplasma hyopneumoniae inactivado o muerto.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende varios antigenos distintos.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende un Mycoplasma hyopneumoniae inactivado o muerto y al menos un antigeno de PCV2 o PRRS.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el lipopolisacárido es un LPS bacteriano, preferentemente obtenible de E. colí .

7. La composición de la reivindicación 4, donde el lipopolisacárido es LPS J5.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la formulación de aceite en agua comprende del 1 al 30 % (v/v) de aceite, preferentemente del 5 al 30 %, aún más preferentemente del 10-30 %, 10-25 % o 10-20 %.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el aceite comprende aceite de parafina liquida.

10. La composición de la reivindicación 9, donde el aceite comprende aceite de parafina liquida en mezcla con trioleato de sorbitán y/o polisorbato 80.

11. Una composición de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una bacteria inactivada o muerta, al menos 5.102 EU/ml de LPS, y un 10-20 % (v/v) de aceite, y preferentemente al menos 103 EU/ml de LPS.

12. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una vacuna.

13. Un método para vacunar a un animal no humano contra un patógeno, que comprende administrar al animal una composición o una vacuna que comprenden un antigeno patogénico y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

14. Un método para inducir o estimular una inmunidad humoral y celular antigeno-especifica en un animal no humano,que comprende administrar al animal una composición o una vacuna que comprenden un antigeno bacteriano y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

15. Un método para vacunar cerdos o lechones contra Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), que comprende administrar a dichos cerdos o lechones una composición o una vacuna que comprenden un Mycoplasma hyopneumon iae inactivado y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.

16. Un método para proteger a los lechones de enfermedades causadas por infección por Mycoplasma hyopneumoniae, que comprende administrar al animal una composición o una vacuna que comprenden un Mycoplasma hyopneumoniae inactivado y un lipopolisacárido en una formulación de aceite en agua.