BR112019024412A2 - Usos de composição imunogênica e de vacina compreendendo toxóides de clostridium difficile para tratar e/ou prevenir doença causada por clostridium sp, composiçãoimunogênica e vacina compreendendo toxóides de c. difficile e c. perfringens, processo para preparar a dita vacina, bem como kit de vacinação que compreende a dita composição imunogênica - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides c. difficile para uso em um medicamento para animais. a invenção também abrange uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides c. difficile a e um ou mais toxóides c. difficile b e um ou mais toxóides c. perfringens do tipo a. a invenção também abrange vacinas compreendendo as referidas composições imunogênicas, vacinas para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças causadas por c. difficile e c. perfringens, e kits dos mesmos.

Description

“USOS DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E DE VACINA COMPREENDENDO TOXÓIDES DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE PARA TRATAR E/OU PREVENIR DOENÇA CAUSADA POR CLOSTRIDIUM SP, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E VACINA COMPREENDENDO TOXÓIDES DE C. DIFFICILE E C. PERFRINGENS, PROCESSO PARA PREPARAR A DITA VACINA, BEM COMO KIT DE VACINAÇÃO QUE COMPREENDE A DITA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA”.

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Europeu EP17382358.4 depositado em 9 de Junho de 2017.

CAMPO TÉCNICO

[002]A presente invenção refere-se ao campo de composições imunológicas e vacinas. Mais especificamente, esta invenção refere-se a composições imunológicas e vacinas compreendendo toxóides Clostridium, em particular, toxóides Clostridium difficile e misturas de toxóides C. difficile com toxóides C. perfringens do Tipo A; e o uso das referidas composições imunológicas e vacinas para proteger os animais contra doenças clostridiais.

TÉCNICA ANTERIOR

[003]Clostrídios são bactérias anaeróbias formadoras de esporos Gram- positivas. Clostrídios produzem o maior número de toxinas de qualquer tipo de bactéria. Eles são amplamente reconhecidos como patógenos de ambos animais domésticos e selvagens. Das espécies clostridiais atualmente conhecidas, Clostridium difficile (C. difficile) e Clostridium perfringens (C. perfringens) são frequentemente considerados os patógenos bacterianos de maior ocorrência, e são particularmente relevantes como agentes causais de doenças entéricas em animais domésticos. Sua patogenicidade reside na produção de várias exotoxinas.

[004]A infecção por C. difficile foi descrita em seres humanos, porcos, cavalos, primatas não humanos, coelhos, ratos, cães, hamsters e gatos (Arroyo L. G. et al., 2005; Debast S. B. et a/., 2009). A grande maioria dos casos está associada à ruptura da microbiota intestinal, como pode ser comumente observado com o tratamento com antibióticos ou em animais neonatais com microbiota não desenvolvida (Lawley T. D. et al., 2009).

[0O5]As exotoxinas A (TcdA, uma enterotoxina) e B (TcdB, uma citotoxina) são consideradas os principais fatores de virulência associados à doença (Carter G.P. et al., 2010; Voth D.E. et al/., 2005). As toxinas TcdA e TcdB fazem parte da grande família de toxinas glicosiladas de clostrídios com massas moleculares de 308 e 269 kDA, respectivamente. As sequências genéticas que codificam ambas as proteínas toxigênicas A e B foram elucidadas (Barroso et a/., 1990; Dove et al., 1990). C. difficile também produz outras toxinas, tal como a toxina binária (CDT), que está associada ao aumento da gravidade da infecção por C. difficile.

[006]C. difficile também é um patógeno entérico importante em porcos durante a primeira semana de vida. A doença associada ao Clostridium difficite (CDAD) se desenvolve em leitões de 1 a 7 dias de idade, nascidos de porcas jovens ou multíparas. A história inclui lesões de início precoce, raramente com dificuldade respiratória e morte súbita. Geralmente há edema do mesocólon e o cólon pode ter conteúdo amarelado pastoso a aguado. Songer e outros mostraram que em rebanhos de suínos afetados por C. difficile, até dois terços das ninhadas podem estar doentes e, dentro da ninhada, a morbidade pode chegar a 97-100% (Anderson M.A. et al., 2008; Songer J.G. et al., 2004). Lesões macroscópicas e histológicas comuns associadas com infecções por C. diffícile em leitões incluem edema mesocolônico e colite ulcerativa purulenta, respectivamente.

[007]Embora a conscientização desta doença tenha aumentado na produção suína na última década, são necessárias mais pesquisas para entender melhor a epidemiologia, a prevenção e o tratamento. Vacinas experimentais contra C. difficile foram testadas em diferentes animais. Por exemplo, o pedido de patente WO2014144567A2 descreve um método de inativação dos toxóides C. difficie Ae B e o uso de composições compreendendo os toxóides resultantes para imunização em hamsters. Atualmente, não existem vacinas comerciais disponíveis para proteger o gado, tal como o suíno, contra C. difficile.

[008]Entre as espécies Clostridium, por outro lado, C. perfringens é o principal produtor de toxina e também o mais difundido, sendo encontrado como parte da microbiota de animais e seres humanos e também no solo. C. perfringens é um bacilo formador de esporos, gram-positivo, anaeróbico, fermentativo, que é classificado em diferentes biótipos, designados de A a E de acordo com a produção de toxinas principais: toxina alfa, toxina beta, toxina epsilon e toxina iota. Outras toxinas tais como toxina beta-2, toxina teta, toxina mu, toxina delta, toxina Kkapa, toxina lambda, enterotoxina Clostridium CPE, toxina do tipo enterite necrótica B (NetB) também são produzidas por cepas C. perfringens. Na medicina veterinária, C. perfringens é responsável por várias doenças, principalmente, entéricas. As infecções C. perfringens do Tipo A são causas comuns de doenças entéricas em porcos, diarreia em leitões neonatais e outros animais. C. perfringens do Tipo A é considerado por alguns pesquisadores como a principal causa de diarreia neonatal em leitões (Songer J. G. et al., 2005; Chan et a/., 2012). Na última década, o diagnóstico de diarreia por leitão neonatal devido a C. perfringens do Tipo A aumentou, e foi associado ao aumento da mortalidade pré-desmame. C. perfringens do Tipo A afeta comumente neonatos na primeira semana de vida. A doença é descrita como uma diarreia mucóide não hemorrágica e é caracterizada por necrose mucosal e atrofia das vilosidades, sem ligação e invasão pelo microrganismo (Songer J. G. et al., 2005). De acordo com alguns estudos, lesões também podem estar ausentes; à luz disso, alguns grupos afirmaram que a diarreia por C. perfringens em leitões neonatais pode ser secretória (Songer J. G. et al., 2005; Cruz-Junior E. C. et al., 2013). O diagnóstico de Clostridium perfringens do Tipo A é muito difícil devido à impossibilidade de diferenciar entre C. perfringens patogênico e comensal do Tipo A (Songer J. G. et a/., 2005). À toxina beta-2 foi postulada como um fator patogênico suíno específico para Clostridium perfringens do Tipo A que afeta os porcos, mas esse fato ainda está em discussão.

[009]A toxina alfa C. perfringgens é uma grande toxina conhecida e sua sequência e estrutura foram elucidadas. A proteína madura tem 370 aminoácidos e um peso molecular de 43 kDa (Justin N. et a/., 2002).

[0010]Os esforços atuais para controlar C. perfringens dependem de medidas sanitárias e uso de antibióticos na alimentação animal. Vacinas para a proteção de porcos contra C. perfringens do Tipo A são raras. Atualmente, existe apenas uma vacina comercialmente disponível (Clostriporc A, IDT Biologika GmbH, Alemanha). Uma das razões para isso pode ser o fato de C. perfringens do Tipo A ser um membro da flora normal. A vacinação contra C. perfringens do Tipo A foi descrita, por exemplo, usando toxóides ou toxinas recombinantes - como detalhado no pedido de patente US20150140033A1 para outras espécies animais, tais como aves domésticas. No entanto, parece que C. perfringens do Tipo A não induz estimulação imunológica suficiente para ser eficiente na prevenção e controle da diarreia em suínos.

[0011]No campo da produção de porcos, é importante observar que as doenças clostridiais ocorrem frequentemente simultaneamente; portanto, é altamente desejável proteger simultaneamente os animais de várias espécies bacterianas. No entanto, a administração de várias vacinas geralmente envolve várias injeções e existem vários problemas associados a essa abordagem - por exemplo, a complexidade do procedimento de administração e maiores volumes de injeção. Tanto para o animal quanto para o praticante, é desejável injetar todos os antígenos necessários em uma vacina de volume normal, tornando assim o procedimento de vacinação menos traumático e doloroso para o animal, e mais eficiente e mais fácil de gerenciar para o praticante.

[0012]Além disso, a proteção dos recém-nascidos contra infecções é crítica, dada sua maior vulnerabilidade. De fato, a mortalidade pré-desmame de leitões é responsável por uma perda importante para a indústria suína. Embora os leitões sejam frequentemente tratados com antibióticos, existem vários problemas associados a esse método de tratamento: os antibióticos são dispendiosos; existe um alto grau de recorrência da doença após a retirada do tratamento; e há preocupações crescentes relacionadas à promoção da resistência bacteriana. Portanto, são desejáveis novas abordagens para reduzir os tratamentos com antibióticos em animais produtores de alimentos.

[0013]A imunização ativa de clostrídios a leitões através de vacinas não é uma prática atual - a imaturidade de seu sistema imune os torna incapazes de montar uma resposta imune eficaz. Esse fato é particularmente difícil quando a vacina visa ser administrada a leitões de um dia ou desde o seu primeiro dia de vida. No entanto, sabe-se que a vacinação de leitões pode tirar proveito do suprimento materno pós- natal de imunidade passiva que ocorre através do colostro da porca. Portanto, os leitões podem ser imunizados indiretamente contra um determinado patógeno, imunizando ativamente a porca da qual estão amamentando. Este processo é bastante complexo e vários fatores são importantes: as secreções lactacionais da porca devem conter quantidades adequadas da imunoglobulina apropriada (isto é, IgG antes do fechamento do intestino e IgA pós-fechamento); as imunoglobulinas devem ser administradas intactas no local de absorção ou atividade funcional e, finalmente, no caso de IgG, as imunoglobulinas devem ser absorvidas intactas e administradas à circulação do leitão. Consequentemente, é necessário desenvolver novas vacinas que são eficazes para a imunização passiva de leitões através do colostro da porca desde o primeiro dia de vida.

[0014]Atualmente, não existem vacinas específicas no mercado contra C. difficile. Mais importante, nem existem vacinas combinadas contra C. difficile e C.

perfringens do Tipo A para suínos em uma única vacina. Como um resultado, são necessárias vacinas novas e eficazes contra C. difficile e C. perfringens para proteger animais domésticos, tais como os suínos. Em particular, é necessário reduzir a taxa de mortalidade de leitões e reduzir o risco de transmissão zoonótica de Clostrídios para seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015]Os inventores descobriram que a administração de toxóides de diferentes espécies de Clostridium provoca uma resposta imune eficaz em gado, tais como em suínos, que os protege de doenças clostridiais. Inesperadamente, a proteção por essas vacinas compreendendo os toxóides de Clostridium também é eficientemente transferida para a progênie dos animais, que adquire imunidade passiva materna por meio da lactação já no primeiro dia após o nascimento.

[00 16]Assim, em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides Clostridium difficile (C. difficile) para uso como um medicamento em gado.

[0017]EmM um segundo aspecto, a presente invenção também fornece uma vacina para uso como um medicamento em gado, compreendendo: (a) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides C. diffícile, e (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0018]Surpreendentemente, os inventores descobriram que as composições imunogênicas, compreendendo toxóides C. difficile, eram capazes de proteger os suínos de infecções das referidas bactérias. Isso é de particular importância, não apenas para a indústria suína, mas também para a saúde das populações dos seres humanos, porque as fezes de animais são um importante reservatório zoonótico da doença. Para o melhor conhecimento do inventor, esta é a primeira vacina com a capacidade de imunizar efetivamente o gado contra C. difficie. Além disso, a composição da invenção também é adequada para ser transferida para a progênie dos animais tratados, que adquire imunidade passiva efetiva desde o primeiro dia de vida.

[0019]Um terceiro aspecto da invenção refere-se a uma composição imunogênica, compreendendo (a) um ou mais toxóides C. diffícile selecionados a partir do grupo que consiste em um toxóide C. diffícitle A (TcdA), um toxóide C. difficile B (TcdB), e misturas dos mesmos; e (b) um ou mais toxóides C. pefringens do Tipo A.

[0020]UmM quarto aspecto da invenção referese a uma vacina compreendendo a referida composição imunogênica conforme definida no terceiro aspecto da invenção e um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0021]Esses terceiro e quarto aspectos resultam da constatação de que uma combinação de toxóides C. difficile e toxóides C. perfringens pode provocar uma resposta imunológica eficiente em gado, principalmente em suínos, contornando a interferência antigênica. De fato, anticorpos ativos contra as toxinas C. diffícile e C. perfringens estão presentes no soro das amostras vacinadas e, no caso particular de fêmeas de gado em gestação, esses anticorpos maternos passam para a progênie em uma forma ativa através da lactação. Portanto, as vacinas da invenção supõem um impacto real no campo da criação de gado, em particular, a criação de suínos: para minimizar os índices de mortos na progênie, mesmo no primeiro dia de vida e, assim, aumentar a produção de gado, em particular, a produção de suíno; porque supõe uma imunização eficiente em todas as amostras (fêmeas vacinadas e imunização da progênie durante a lactação); e para reduzir o risco de infecções zoonóticas.

[0022]Desta maneira, um quinto aspecto da invenção refere-se à composição imunogênica conforme definida no terceiro aspecto da invenção, ou à vacina conforme definida no quarto aspecto da invenção para uso como um medicamento, que é para uso em um método de fornecer imunidade passiva materna à progênie de um gado fêmea, particularmente por meio de lactação, o método que compreende administrar a composição imunogênica ou a vacina ao animal gado fêmea em gestação antes do nascimento da progênie.

[0023]Um sexto aspecto da invenção refere-se a um processo para fazer a vacina da invenção, que compreende a etapa de misturar a composição imunogênica descrita acima com um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0024]Um sétimo aspecto da invenção refere-se a um kit de vacinação que compreende: (a) uma composição imunogênica como definida acima; (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável; (c) opcionalmente, um adjuvante; e (d) opcionalmente, instruções para o seu uso.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025]A Fig. 1, relacionada com o Exemplo 2, mostra a resposta sorológica dos porcos contra o toxóide C. difficite A TdcA (A) e o toxóide B TcdB (B), grupos A a C. O grupo A corresponde aos porcos vacinados com toxóides C. difficile A e B (a 9,4 CPE); o grupo B corresponde a porcos vacinados com toxóides C. difficite A e B (a 8,4 CPE); e o grupo C corresponde a porcos vacinados com uma vacina de placebo. À O.D. (densidade óptica ELISA, média do grupo) é representada no eixo y como um indicador da resposta do anticorpo IgG.

[0026]A Fig. 2, relacionada com o Exemplo 3, é um diagrama de barras mostrando a resposta sorológica de porcos imunizados com vacinas combinadas diferentes no dia 44 após a primeira injeção, grupos A a D. Os grupos A e B correspondem aos porcos vacinados com C. difficile, C. perfringens do Tipo A, C. perfringens do Tipo C, C. novyi do Tipo B e E. coli; o grupo C corresponde aos porcos vacinados com C. difficile e C. perfringens do Tipo A; e o grupo D corresponde aos porcos vacinados com uma vacina de placebo. O ELISA IRPC (índice relativo x 100) é representado no eixo y como um indicador da resposta de anticorpo IgG contra E.

coli F4ab adesina fimbrial (A), F5 adesina fimbrial (B), F4ac adesina fimbrial (C), LT enterotoxina (D) e F6 adesina fimbrial (E); toxóide C. perfringens do Tipo C (F); e toxóide C. novyi B (G).

[0027]A Fig. 3, relacionada com o Exemplo 3, mostra a resposta sorológica aos toxóides C. perfringens do Tipo A CpA (A) e C. difficile TcdA (B) e TcdB (C). Grupos A a D, conforme definidos na Fig. 2. O ELISA IRPC (índice relativo x 100) é representado no eixo y como um indicador da resposta de anticorpos IgG.

[0028]A Fig. 4, relacionada com o Exemplo 3, mostra os títulos de anticorpos contra os antígenos de C. perfringens do Tipo A CpA (A), e toxóides C. difficile TcdA (B) e TcdB (C) no colostro de porcos vacinados. Grupos A a D, conforme definidos na Fig. 2 (Grupo A na primeira coluna da esquerda, grupo B na segunda coluna, grupo C na terceira coluna e D na quarta coluna). O ELISA IRPC (índice relativo x 100) é representado no eixo y.

[0029]A Fig. 5, relacionada com o Exemplo 4, mostra as curvas de sobrevivência de leitões que foram imunizados passivamente com vacinas combinadas diferentes e, em seguida, desafiados com C. perfringens do Tipo A (A), C. diffícile (B), ou não desafiados (C ), grupos A a D, conforme definidos na Fig. 2. O dia pós-parto dos leitões é representado no eixo x, e a taxa de sobrevivência é no eixo y.

[0030]A Fig. 6, relacionada com o Exemplo 4, é um diagrama de barras que mostra o resultado de uma análise de lesão macroscópica de leitões que foram imunizados passivamente com vacinas combinadas diferentes, em seguida, desafiados com C. difficile ou C. perfringens do Tipo A e, finalmente, humanamente sacrificados para análise de 5 dias após o desafio. Grupos A a D, conforme definidos na Fig. 2 (Grupo A na primeira coluna da esquerda, grupo B na segunda coluna, grupo C na terceira coluna e D na quarta coluna). O eixo x representa o tipo de desafio e o eixo y mostra a pontuação usada para quantificar as lesões macroscópicas (conforme definido no Exemplo 4).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual está invenção pertence no momento do depósito. No entanto, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui fornecidas têm precedência sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

[0032]Como usados aqui, o termo "imunogênico" ou "composição imunológica" refere-se ao material, que provoca uma resposta imunológica no hospedeiro de um tipo de resposta imune celular ou mediada por anticorpos à composição após a administração a um vertebrado, incluindo seres humanos. À composição imunogênica compreende moléculas com propriedades antigênicas, tais como polipeptídeos imunogênicos. Um polipeptídeo imunogênico é geralmente referido como antigênico. Uma molécula é "antigênica" quando é capaz de interagir especificamente com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T. Um polipeptídeo antigênico contém um epítopo de, pelo menos, cerca de 5 e, particularmente, pelo menos cerca de 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou pelo menos 50 aminoácidos. Uma porção antigênica de um polipeptídeo, também referida como m epítopo, pode ser a porção que é imunodominante para o anticorpo ou reconhecimento de receptor de célula T, ou pode ser uma porção usada para gerar um anticorpo para a molécula conjugando a porção antigênica a um polipeptídeo veículo para imunização. A composição imunogênica refere-se de acordo com esta descrição, à molécula ativa, composição compreendendo a referida molécula, ou composição compreendendo mais de uma molécula antigênica à qual é desejada uma reação imune particular. Exemplos de composições imunogênicas incluem os sobrenadantes de culturas de microrganismos, incluindo bactérias, protozoários e vírus. Os referidos sobrenadantes contêm aquelas moléculas antigênicas de interesse para iniciar uma resposta imune contra elas e que foram liberadas (exotoxinas) ou administradas ao meio de cultura onde os microrganismos cresceram e depois que as células ou partículas de microrganismos (vírus) foram separadas. Os sobrenadantes também são denominados como preparações sem células.

[0033]O termo "antígeno" refere-se a uma molécula contra a qual um indivíduo pode iniciar uma resposta imune, por exemplo, uma resposta imune humoral e/ou celular. Dependendo da função pretendida da composição, um ou mais antígenos podem ser incluídos.

[0034] Quanto à expressão "quantidade imunologicamente eficaz", ou "dose imunologicamente eficaz" significa a administração dessa quantidade ou dose de antígeno, ou em uma única dose ou como parte de uma série, que provoca ou é capaz de desencadear uma resposta imune que reduz a incidência de ou diminui a gravidade da infecção ou incidência de doença em um animal, tanto para o tratamento quanto para a prevenção de doença. A quantidade imunologicamente eficaz ou a dose eficaz também é capaz de induzir a produção de anticorpo para o tratamento ou prevenção de doença. Essa quantidade variará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a condição física do indivíduo, e pode ser facilmente determinada por alguém versado na técnica.

[0035]O termo "medicamento", conforme usados aqui, é sinônimo de uma droga farmacêutica ou veterinária (também conhecido como medicamento, medicamento ou simplesmente droga) usada para curar, tratar ou prevenir doenças em animais, incluindo seres humanos, como amplamente aceito. As drogas são classificadas de várias maneiras. Uma distinção importante é entre drogas tradicionais de moléculas pequenas, geralmente derivadas de sínteses químicas, e produtos biofarmacêuticos, que incluem proteínas recombinantes, vacinas, produtos sanguíneos usados terapeuticamente (tal como IVIG), terapia genética, anticorpos monoclonais e terapia celular (por exemplo, terapias com células tronco). Na presente invenção, o medicamento é de preferência, um medicamento veterinário, e ainda mais de preferência, é uma vacina para uso veterinário.

[0036]O termo "vacina", como aqui utilizado, significa uma composição imunogênica da invenção acompanhada por excipientes e/ou veículos adequados que, quando administrados a um animal, provoca ou é capaz de provocar, direta ou indiretamente, uma resposta imune no animal. Particularmente, as vacinas da presente invenção provocam uma resposta imunológica no hospedeiro de um tipo celular ou mediado por anticorpos após a administração ao indivíduo de que é protetor. A vacina pode ser uma "vacina combinada". O termo "vacina combinada" significa que a vacina contém vários antígenos em uma única preparação, protegendo contra duas ou mais doenças ou contra uma doença causada por dois ou mais microrganismos. Assim, a vacina inclui como "ingrediente ativo" uma "composição imunogênica" de acordo com a invenção.

[0037]O termo "toxóide", como aqui utilizado, significa toxina bacteriana cuja toxicidade foi inativada ou suprimida por tratamento químico, molecular ou térmico, enquanto outras propriedades, tipicamente imunogenicidade, são mantidas. Assim, quando usado durante a vacinação, uma resposta imune é montada e a memória imunológica é formada contra os marcadores moleculares do toxóide sem resultar em doença induzida por toxina. Exemplos particulares de procedimentos para obter um toxóide derivado de uma toxina bacteriana incluem o tratamento de uma cultura bacteriana com uma composição compreendendo formaldeído. Além disso, os toxóides inativados podem ser separados das células (por exemplo, por meio de centrifugação). O sobrenadante é, em seguida, filtrado (isto é, por ultrafiltração tangencial) através de filtros de um corte de peso molecular desejado, a fim de enriquecer ou concentrar a solução resultante no toxóide desejado. Por esta metodologia, os sobrenadantes concentrados contendo as toxinas inativadas purificadas (toxóides) são obtidos. No entanto, os toxóides presentes no meio de crescimento bacteriano (em particular, na invenção nos meios de clostrídios) sem etapas de separação ou purificação adicionais também estão incluídos no escopo da invenção e na definição de "toxóide", conforme aqui utilizado.

[0038]A maioria dos toxóides possui a mesma sequência de polipeptídeo que a toxina da qual eles derivam. Assim, quando sequências particulares são indicadas na presente invenção, é recitado indistintamente o termo toxina ou toxóide.

[0039]O termo "gado" refere-se a animais domesticados ou de exploração pecuária criados para produzir produtos tais como alimentos. Particularmente, refere- se a animais produtores de alimentos, tais como gado, ovelhas, cabras, suínos, aves (incluindo aves produtoras de ovos) e equídeos. Mais especificamente, refere-se a animais produtores de alimentos, tais como bovinos, ovinos, caprinos, suínos e equídeos. Ainda mais em particular, na presente invenção refere-se a espécies suínas.

[0040]O termo "veículo" deve ser entendido como um componente farmaceuticamente aceitável que não seja o componente imunogênico. O veículo pode ser orgânico, inorgânico ou ambos. Veículos adequados bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, sem limitação, macromoléculas grandes e metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas virais inativas.

[0041]A expressão "excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a materiais, composições ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Cada componente deve ser farmaceuticamente aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição farmacêutica. Também deve ser adequado para uso em contato com tecidos ou órgãos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou outros problemas ou complicações proporcionais a uma relação de benefício/risco razoável.

[0042]Como aqui utilizado, o termo "hospedeiro" ou "indivíduo" destina-se aos indivíduos alvo em necessidade dos mesmos, aos quais a composição imunogênica ou vacina da invenção são administrados, entre outros seres humanos, mamíferos, gado, ou qualquer outra espécie animal suscetível a ser vacinado com as composições da invenção. De preferência, o mamífero é uma espécie suína, mais de preferência, é um suíno, e mais de preferência, é uma porca gestante, porca jovem gestante ou leitão.

[0043]Como aqui utilizado, o termo "porco" ou "suíno" é destinado a espécies suínas, incluindo, entre outros, porcos, javalis, porcas, porca jovem gestante e leitões de qualquer idade ou qualquer fase do seu ciclo de produção; é destinado particularmente a porcas e porca jovem gestante, e mais particularmente a leitões. Uma porca jovem gestante é uma porca fêmea de aproximadamente 1 ano de idade. O termo refere-se a um porco que não pariu ou deu à luz uma ninhada ou progênie. Uma vez que um porco tenha uma ninhada ou progênie e tenha passado aproximadamente seu primeiro ano, o porco é conhecido como porca.

[0044]Como aqui utilizado, os termos "imunização passiva maternal" e "imunidade passiva maternal" que são usados indistintamente, referem-se à transferência da resposta imunológica de uma composição imunogênica ou de uma vacina da mãe para a progênie, geralmente pela transmissão de anticorpos maternais específicos contra um agente infeccioso, de modo que como resultado do mesmo, uma resposta imune protetora ou proteção passiva que reduz a incidência ou diminui a gravidade da infecção ou incidente de uma doença seja desencadeada na progênie.

A imunidade passiva maternal pode ser alcançada, entre outros, pela ingestão de colostro e/ou leite por lactação, como ocorre em mamíferos, ou a absorção de anticorpos na corrente sanguínea através da placentay por exemplo, ou alternativamente, através do ovo em espécies aviárias. A imunização passiva maternal é alcançada através da administração de uma composição imunogênica ou de uma vacina a um gado fêmea em gestação, particularmente uma porca jovem gestante ou porca antes do parto, isto é, antes do nascimento da ninhada ou progênie. Alternativamente, em espécies aviárias, a transferência de anticorpos maternais (MAb) para seus filhotes é feita através da gema de ovo, onde os anticorpos são absorvidos e entram no sistema circulatório.

[0045]Como exposto acima, os inventores propõem pela primeira vez uma composição imunogênica compreendendo, pelo menos, um toxóide C. diffícile, ou que é o mesmo, um ou mais toxóides C. diffícile, e uma vacina compreendendo a referida composição imunogênica para uso como um medicamento em gado, em particular, para uso em suínos.

[0046]Todas as modalidades particulares da composição imunogênica para uso como um medicamento descrito aqui se aplicam também à vacina para uso como um medicamento compreendendo a referida composição imunogênica.

[0047]Em uma modalidade particular, a composição imunogênica ou a vacina que compreende é para uso como um medicamento em suínos. Mais em particular, é para uso em suínos selecionados a partir do grupo que consiste em porcos, javalis, porcas, porca jovem gestante e leitões.

[0048]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica e a vacina que a compreende, é para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por Clostridium sp. em gado. Esta modalidade também pode ser formulada como o uso da composição imunogênica ou da vacina como definida acima para a fabricação de um medicamento, para o tratamento e/ou prevenção de infecções entéricas ou doenças causadas por Clostridium sp. em gado. Esta modalidade também pode ser formulada como um método de imunização de gado em necessidade do mesmo com uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica ou uma vacina como definida acima, em particular, para o tratamento e/ou prevenção de infecções entéricas ou doenças causadas por Clostridium sp., particularmente, quando o gado é suíno. Mais particularmente, a composição imunogênica ou a vacina é para uso na prevenção e/ou tratamento de infecções entéricas ou doenças causadas por C. diffícile.

[0049]Particularmente, a composição imunogênica e a vacina são para uso na prevenção e/ou tratamento de infecções ou doenças entéricas causadas por Clostridium sp., em particular, C. diffícile.

[0050]Em outra modalidade particular, o toxóide C. difficile da composição imunogênica do primeiro aspecto é selecionado a partir do grupo que consiste em um toxóide C. difficile A, um toxóide C. difficile B, um toxóide C. diffícile binário (CDT) e misturas dos mesmos. Mais particularmente, os toxóides da composição imunogênica são selecionados a partir do grupo que consiste em um toxóide C. difficile A, um toxóide C. diffícile B, e misturas dos mesmos. Mais particularmente, os toxóides da composição imunogênica são um toxóide C. difficile A e um toxóide C. difficile B. Ou seja, a composição imunogênica compreende um toxóide C. difficile A e um toxóide C. difficile B.

[0051]Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso como descrito acima compreende uma toxina A derivada de uma cepa C. difficile, um toxóide A derivado da referida toxina e/ou um fragmento imunogênico da referida toxina ou do referido toxóide, em que o toxóide e o fragmento do referido toxóide são imunologicamente eficazes, o que significa que são capazes de provocar uma resposta imune.

[0052]Em outra modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso como descrito acima compreende uma toxina B derivada de uma cepa C. difficile, um toxóide B derivado da referida toxina e/ou um fragmento imunogênico da referida toxina ou do referido toxóide, em que o toxóide e o fragmento do referido toxóide são imunologicamente eficazes, o que significa que são capazes de provocar uma resposta imune.

[0053]Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso como descrita acima compreende um toxóide C. difficile A que é derivado de uma toxina de C. difficile A que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que possui, pelo menos, uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 1. Mais particularmente, a toxina C. diffíicile A compreende a SEQ ID NO: 1. Ainda mais particularmente, a toxina C. difficile A consiste em SEQ ID NO: 1.

[0054]Em outra modalidade particular, o toxóide C. difficile A é derivado de uma toxina C. diffícile A que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 1.

[0055]Em outra modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso como descrito acima compreende um toxóide C. difficile B que é derivado de uma toxina C. difficie B que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que possui, pelo menos, uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 2. Mais particularmente, a toxina C. diffíicile B compreende a SEQ ID NO: 2. Ainda mais particularmente, a toxina C. difficile B consiste em SEQ ID NO: 2.

[0056]Em outra modalidade particular, o toxóide C. diffícile B é derivado de uma toxina C. diffícile B que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 2.

[0057]Em ainda uma modalidade mais particular da composição imunogênica, ela compreende pelo menos o toxóide C. diffícile A que consiste na sequência de toxina SEQ ID NO: 1, e pelo menos, o toxóide C. difficile B que consiste na sequência de toxina SEQ ID NO: 2. Mais particularmente, os toxóides A e B estão presentes em uma relação de 99:0,1 a 0,1:99, particularmente de 50:0,5 a 0,5:50, mais em particular de 10:1 a 1:10. Em particular de 5:1 a 1:5, mais em particular, de 2,5:1 a 1:2,5. Ainda mais, em particular, os toxóides A e B estão presentes em uma relação de 2,5:1.

[0058]Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica ainda compreende, pelo menos, um toxóide C. perfringens. Ou que é o mesmo, um ou mais toxóides C. perfringens. Particularmente, o toxóide é selecionado a partir do grupo que consiste em toxóide alfa, toxóide beta, toxóide beta-2, toxóide epsilon, toxóide teta, toxóide mu, toxóide delta, toxóide iota, toxóide kappa, toxóide lambda, enterotoxóide CPE, toxóide NetB e misturas dos mesmos. Em particular, um toxóide C. perfringens do Tipo A, particularmente toxóide alfa, toxóide beta-2, toxóide teta, toxóide mu, enterotoxóide CPE, toxóide NetB e misturas dos mesmos. Mais particularmente, o toxóide é um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A.

[0059]Em outra modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso como descrita acima ainda compreende uma toxina alfa derivada de uma cepa C. perfringens, um toxóide alfa derivado da referida toxina e/ou um fragmento imunogênico da referida toxina ou do referido toxóide, em que o toxóide e o fragmento do referido toxóide são imunologicamente eficazes, o que significa que são capazes de provocar uma resposta imune.

[0060]A combinação de vários antígenos em uma única composição imunogênica ou em uma vacina compreendendo a referida composição imunogênica é comumente procurada no campo da imunização. Isso é de particular importância quando os patógenos contra os quais a proteção é buscada geralmente são encontrados juntos em infecções. No entanto, o desenvolvimento de composições imunogênicas combinadas ou vacinas combinadas não é simples. Verificou-se que a simples mistura dos componentes de uma combinação de composições imunogênicas ou vacina é complicada pelo fato de que nem todos os antígenos podem ser efetivamente combinados juntos. A redução na imunogenicidade de um antígeno quando combinada com outros componentes - em comparação com o antígeno particular administrado isoladamente - é conhecida como interferência. Um outro problema encontrado na formulação de vacinas combinadas é a estabilidade inerente de seus antígenos compostos ao longo do tempo. As vacinas em solução podem sofrer processos ao longo do tempo que diminuem a imunogenicidade de seus componentes de antígeno, por exemplo, a degradação do antígeno ou a dessorção dos antígenos do adjuvante ao qual foram adsorvidos.

[0061]Considerando o estado da técnica, era inesperado que a combinação junta de um único toxóide de composição imunogênica de diferentes espécies de Clostridium proporcionasse uma imunização eficaz e segura dos indivíduos. Isto é particularmente verdadeiro para a imunização contra C. difficile, que tem sido procurada há muito tempo em diferentes espécies animais. Mais importante, era altamente imprevisível que a imunização alcançada pelas composições imunogênicas combinadas (isto é, vacina combinada com as composições imunogênicas) pudesse ser passivamente transferida para os recém-nascidos e uma proteção eficaz em leitões neonatais também pudesse ser obtida, mesmo desde o primeiro dia da vida.

[0062]Assim, em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma vacina para uso como um medicamento em gado, compreendendo: (a) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides C. difficile, e (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0063]Em uma modalidade particular dos primeiro e segundo aspectos, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, as composições imunogênicas ou a vacina para uso conforme descrito acima são para uso na prevenção e/ou tratamento de infecções entéricas ou doenças causadas por C. difficile, C. perfringens e misturas dos mesmos.

[0064]Em outra modalidade particular dos primeiro e segundo aspectos, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, as composições imunogênicas ou a vacina para uso como descrito acima compreendem um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A que é derivado de uma toxina alfa C. perfringens do Tipo A que compreende a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que possui pelo menos uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 3. Mais particularmente, a toxina alfa C. perfringens do Tipo A compreende a SEQ ID NO: 3. Ainda mais particularmente, a toxina alfa C. perfringens do Tipo A consiste na SEQ ID NO: 3.

[0065]Em outra modalidade particular, o toxóide alfa C. perfringens do Tipo À é derivado de uma toxóide alfa C. perfringens do Tipo A que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 3.

[0066]Em outra modalidade particular dos primeiro e segundo aspectos, as composições imunogênicas ou a vacina que a compreende, compreendem um toxóide C. difficie A, um toxóide C. difficile B, e um toxóide C. perfringens do Tipo A, particularmente um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A.

[0067]Em ainda uma modalidade mais particular dos primeiro e segundo aspectos, as composições imunogênicas ou a vacina que a compreende, compreendem o toxóide C. diffícile A que consiste na sequência de toxina SEQ ID NO: 1, o toxóide C. difficie B que consiste na sequência de toxina SEQ ID NO: 2, e o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A que consiste na sequência de toxina SEQ ID NO:

3. [0O68]As sequências de aminoácidos das toxinas de todos os aspectos da invenção são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 ID No. Toxina Cc.|1 MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYL difficile QLKKLNESIDVFMNKYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSP

A VEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADINAEYNIKLWYDSEAFLV (número de NTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYDRQ acesso KRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSL GenBank RKINSNHGIDIRANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLL P16154; ALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTISRPSSIGLDRWEMIKLEAI versão MKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFSKLENL P16154.2) NVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQ

HLNPAIESDNNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVG FMPEARSTISLSGPGAYASAYYDFINLQENTIEKTLKASDLIEFKF PENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGGSLSED NGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIALAGD DISYEATCNLFSKNPKNSIIIORNMNESAKSYFLSDDGESILELNK YRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSF LDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKIT STLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIM SDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPD TKFILNNLKLNIESSIGDYIY YEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENV SDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVY VETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDOVNGNLLDNIQLDHTSQVN TLNAAFFIQOSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYD SIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEH DPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGIS AGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVP IDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSI SSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVP GLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPYYED TNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYP ISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKN KLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLL SGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISK TSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINT ITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDF VKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGK TNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPI YNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNY YSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRY LEESNKKILQKIRIKGILSNTOASFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFK SFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFD PIEFNLVTGWQOTINGKKYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDG VMQLGVFKGPDGFEYFAPANTONNNIEGQOAIVYQSKFLTLNGKK YYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYF NPDTAIISKBWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSD CVVKIGVFSTSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKK YYFDNNSKAVTGLQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYF NTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTD GIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKK YYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFS YDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPA NTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGK KYYFNLNTAEAATGWOQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWOQTIDGKK YYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFA PANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDG KKYYFNTNTAVAVTGWOQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHF YFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFL YLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTID NKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGG

LFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG Toxina Cc.|2 MSLVNRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVV difficile EKYLKLKDINSLTDIYIDTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNN B (número de NLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKDVNSDYNVNVFYDS acesso NAFLINTLKKTVVESAINDTLESFRENLNDPRFDYNKFFRKRMEII GenBank YDKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTYLSNEYSKEIDELNTYIE P18177; ESLNKITAONSGNDVRNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAAS versão DILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFESIEKPSSVTVDFWEM P18177.3) TKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVOSSFESVLASKSDKSE|

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WLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE Toxina alfa/3 MKRKICKALICAALATSLWAGASTKVYAWDGKIDGTGTHAMIVT C. QGVSILENDLSKNEPESVRKNLEILKENMHELQLGSTYPDYDKN perfringens AYDLYQDHFWDPDTDNNFSKDNSWYLAYSIPDTGESQIRKFSA do Tipo A LARYEWQORGNYKQATFYLGEAMHYFGDIDTPYHPANVTAVDSA (número de GHVKFETFAEERKEQYKINTAGCKTNEAFYTDILKNKDFNAWSK acesso EYARGFAKTGKSIYYSHASMSHSWDDWDYAAKVTLANSQKGT GenBank AGYIYRFLHDVSEGNDPSVGKNVKELVAYISTSGEKDAGTDDYM WP 011590 YFGIKTKDGKTQEWEMDNPGNDFMTGSKDTYTFKLKDENLKID 041; versão DIQNMWIRKRKYTAFSDAYKPENIKIIANGKVVVDKDINEWISGN WP 011590 STYNIK

041.1

[0069] Quando na presente invenção, a identidade com uma sequência (em particular, entre sequências de aminoácidos) é mencionada, isto é, de preferência, determinado usando o algoritmo BLASTP descrito em Altschul, S. F., et. al. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programms", Nucleico Acids Research - 1997, Vol. No. 25, pp. 3389-3402, e NCBI http://www. ncbi.nIm.nih.govw/BLAST. Uma porcentagem particular de identidade abrange variações da sequência devido a mutações conservadoras de um ou mais aminoácidos, levando a uma proteína ainda sendo eficaz, podendo assim provocar uma resposta imune sem ser tóxica. As variações de proteínas também são devidas a inserções ou deleções de um ou mais aminoácidos.

[0070]O toxóide alfa da composição imunogênica de qualquer um dos aspectos da invenção pode ser derivado da toxina alfa naturalmente codificada por uma célula C. perfringens, o toxóide A pode ser derivado da toxina A naturalmente codificada por uma célula de C. difficile, e o toxóide B pode ser derivado da toxina B naturalmente codificada por uma célula de C. diffícile. Em particular, qualquer cepa C. difficile produzindo toxinas A (TcdA) e B (TcdB) e qualquer cepa C. perfringens, particularmente C. perfringens do Tipo A, produzindo toxinas alfa pode ser usada no método da invenção, isto é, a cepa pode ser selecionada, entre outras, a partir de cepas de campo, cepas de coleta ou cepas geneticamente modificadas. Os diferentes toxóides podem ser obtidos a partir da mesma cepa ou de diferentes cepas. O versado na técnica sabe perfeitamente como identificar se uma cepa Clostridium sp. produz uma toxina específica usando técnicas microbiológicas rotineiras.

[007 1]Alternativamente, os toxóides das composições imunogênicas ou vacinas da invenção são derivados de toxinas que são polipeptídeos recombinantes, isto é, são codificadas por um gene que foi geneticamente manipulado.

[0072]Além disso, os toxóides podem estar contidos em uma preparação celular completa ou em uma preparação sem células. Como preparação de células inteiras deve ser entendido que o toxóide está compreendido em uma composição também compreendendo os componentes celulares, geralmente nesses componentes celulares na forma de um lisado celular. Por outro lado, uma preparação sem células deve ser entendida como uma composição compreendendo o toxóide, sendo posteriormente opcionalmente purificada (isolada) a partir de um meio, no qual as células cresceram anteriormente. De preferência, é uma preparação sem células compreendendo o toxóide.

[0073]Os toxóides podem ser obtidos por tratamento químico, clivagem de protease, métodos de DNA recombinante, fazendo fragmentos ou mutações das toxinas (por exemplo, mutações pontuais) ou por tratamento térmico das toxinas correspondentes por meios rotineiros conhecidos pelos versados na técnica. Em particular, o tratamento com BEI (etilenimina binária), acetiletilenimina, beta- propiolactona, detergentes (tal como, TWEENG, TRITONGO X ou sais de alquil trimetilamônio) e glutaraldeído são exemplos de agentes inativadores químicos adequados para uso em inativar toxóides bacterianos da invenção. Outro agente inativador químico é a formalina ou formaldeído. A inativação pode ser realizada usando métodos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade, o formaldeído é de preferência, utilizado na preparação de toxóide. Uma modalidade utiliza cerca de 0,1 a 1% de uma solução de formaldeído para inativar as toxinas de clostrídios.

[0074]Em uma modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. diffíicile são obtidos por um método compreendendo as etapas de: (a) crescer em condições anaeróbias, pelo menos, uma cepa C. difficile produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. difficile A e/ou uma toxina C. diffícile B; (b) inativar a cultura C. difficile; (c) separar opcionalmente as células C. difficile do sobrenadante; e (d) concentrar opcionalmente o sobrenadante da etapa (c) para obter um sobrenadante concentrado.

[0075]EmM uma modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. diffíicile são obtidos por um método compreendendo as etapas de:

(a) crescer em condições anaeróbias, pelo menos, uma cepa C. difficile produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. difficile A e/ou uma toxina C. diffícile B; e (b) inativar a cultura C. difficile.

[0076]Em uma modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. diffíicile são obtidos por um método compreendendo as etapas de: (a) crescer em condições anaeróbias, pelo menos, uma cepa C. difficile produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. difficile A e/ou uma toxina C. diffícile B; (b) inativar a cultura C. difficile; (c) separar as células C. difficile do sobrenadante; e (d) concentrar o sobrenadante da etapa (c) para obter um sobrenadante concentrado.

[0077]EmM uma modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. diffíicile são obtidos por um método compreendendo as etapas de: (a) crescer em condições anaeróbias, pelo menos, uma cepa C. difficile produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. difficile A e/ou uma toxina C. diffícile B; (b) separar as células C. difficile do sobrenadante; (c) concentrar o sobrenadante da etapa (b) para obter um sobrenadante concentrado; e (d) inativar as toxinas C. diffícile no sobrenadante.

[0078]Da mesma forma, em outra modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. perfringens são obtidos por um método que compreende as etapas de:

(a) crescer em condições anaeróbicas, pelo menos, uma cepa C. perfringens produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. perfringens do Tipo A, mais particularmente, toxina alfa C. perfringens do Tipo A; (b) inativar a cultura C. perfringens; (c) separar opcionalmente as células C. perfringens do sobrenadante; e (d) concentrar opcionalmente o sobrenadante da etapa (c) para obter um sobrenadante concentrado.

[0079]Em outra modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. perfringens são obtidos por um método compreendendo as etapas de: (a) crescer em condições anaeróbicas, pelo menos, uma cepa C. perfringens produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. perfringens do Tipo A, mais particularmente, toxina alfa C. perfringens do Tipo A; e (b) inativar a cultura C. perfringens.

[0080]Em outra modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides de C. perfringens são obtidos por um método compreendendo as etapas de: (a) crescer em condições anaeróbicas, pelo menos, uma cepa C. perfringens produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. perfringens do Tipo A, mais particularmente, toxina alfa C. perfringens do Tipo A; (b) inativar a cultura C. perfringens; (c) separar as células C. perfringens do sobrenadante; e (d) concentrar o sobrenadante da etapa (c) para obter um sobrenadante concentrado.

[0081]Em outra modalidade particular para qualquer um dos aspectos da invenção, os toxóides C. perfringens são obtidos por um método compreendendo as etapas de:

(a) crescer em condições anaeróbicas, pelo menos, uma cepa C. perfringens produzindo a toxina ou toxinas de interesse, produzindo em particular, uma toxina C. perfringens do Tipo A, mais particularmente, toxina alfa C. perfringens do Tipo A; (b) separar as células C. perfringens do sobrenadante; (c) concentrar o sobrenadante da etapa (b) para obter um sobrenadante concentrado; e (d) inativar as toxinas C. perfringens no sobrenadante.

[0082]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto têm uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide C. difficile A de 0,1 a 100% (v/v), particularmente de 0,5 a 50% (v/v), e mais particularmente de 1 a 25% (v/v), ainda mais em particular de 1 a 10%.

[0083]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto têm uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide C. difficilte B de 0,1 a 100% (v/v), particularmente de 0,5 a 50% (v/v), e mais particularmente de 1 a 25% (v/v), ainda mais em particular de 1 a 10%.

[0084]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto têm um título imunologicamente eficaz de toxóides C. difficitle A e B (TcdA/TcdB) de, pelo menos, 5,0 títulos citopáticos (CPE, logioCPE/ml), titulados com base no efeito citopático antes da etapa de inativação. Particularmente de pelo menos 5,5, de pelo menos 6,0, de pelo menos 6,5, de pelo menos 7,0, de pelo menos 7,5, de pelo menos 8,0, de pelo menos 8,5, de pelo menos 9,0, de pelo menos 9,5, de pelo menos, 10.0,

de pelo menos 10,5, ou de pelo menos 11,0 CPE. De preferência, entre 5,0 e 11,0 CPE, mais de preferência, entre 6,5 e 9,5 CPE. O ensaio CPE é um método de rotina para a titulação do efeito tóxico. Os detalhes do procedimento são descritos abaixo e são bem conhecidos por qualquer pessoa versada na técnica.

[0085]Em ainda outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto, os toxóides C. difficile A e B (TcdA / TcdB) estão presentes em uma relação de 99:0,1 a 0,1:99, particularmente de 50:0,5 a 0,5:50, mais particularmente de 10:1 a 1:10, particularmente de 5:1 a 1:5, mais particularmente de 2,5:1 a 1:25 e mais particularmente 2,5:1. Em ainda outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto têm uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A de 0,1 a 100% (v/v), particularmente de 0,5 a 50% (v/v), e mais particularmente de 1 a 25% (v/v). Mais em particular de 8 a 10% (v/v).

[0086]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com quaisquer modalidades acima ou abaixo, a composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto têm um título imunologicamente eficaz de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A de, pelo menos, título hemolítico de 8,0 (HA, log2HA50%/ml), titulado com base na atividade hemolítica antes da etapa de inativação. Particularmente de pelo menos 8,5, de pelo menos 9,0, de pelo menos 9,5, de pelo menos 10,0, de pelo menos 10,5, de pelo menos 11,0, de pelo menos 11,5, de pelo menos 12,0, de pelo menos 12,5, de pelo menos 13,0 , de pelo menos 13,5, de pelo menos 14,0, de pelo menos 14,5, de pelo menos 15,0, de pelo menos 15,5, de pelo menos 16,0, de pelo menos 16,5, de pelo menos 17,0, de pelo menos 17,5 ou de pelo menos 18,0 HA. De preferência,

entre 8,0 e 18,0 HA, mais de preferência, entre 11,0 e 17,5 HA. O ensaio de HA é um método de rotina para a titulação do efeito tóxico. Os detalhes do procedimento são descritos abaixo e são bem conhecidos por qualquer pessoa versada na técnica.

[0087]Particularmente, na composição imunogênica para uso de acordo com o primeiro aspecto e na vacina para uso de acordo com o segundo aspecto, os toxóides C. difficile A e B (TcdA/TcdB) e o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A estão presentes em uma relação de 0,1: 99 a 99: 0,1, de preferência, de 0,5:50 a 50:0,5, mais de preferência, de 20:1 a 1:20 e mais de preferência, de 10:2 a 2:10. Mais em particular 2:10.

[0088]Em ainda outra modalidade, a composição imunogênica ou a vacina que a compreende para uso de acordo com os primeiro e segundo aspectos ainda compreende um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo dos microrganismos consistindo em Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila, Clostridium, — Corynebacterium, —Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria “Mycobacterium, “Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema Vibrio e, gênero Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus, rotavírus, falha no pré-desmame do suíno para agente da síndrome de crescer, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus de teno torque (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), e circovírus suíno e combinações dos mesmos.

[0089]Particularmente, a composição imunogênica ou a vacina que a compreende para uso de acordo com os primeiro e segundo aspectos ainda compreende um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6; enterotoxóide de E. coli LT, toxóide C. perfringens do Tipo C; toxóide C. novyi do Tipo B; e combinações dos mesmos. Particularmente, a composição imunogênica ou a vacina que a compreende, compreende os antígenos de adesinas fimbriais E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6; enterotoxóide de E. coli LT, toxóide C. perfringens do Tipo C; e toxóide C. novyi do Tipo B. Particularmente, a composição imunogênica da invenção ainda compreende os antígenos de SUISENGO, RHINISENGO, ERYSENGO, ERYSENGO PARVO, ERYSENGO PARVO LEPTO, PARVOSENGO, VPUREDO (Laboratorios HIPRA, S.A.). Assim, mais particularmente, a composição imunogênica e a vacina para uso como descritos acima para uso na prevenção e/ou tratamento de infecções ou doenças entéricas causadas por um microrganismo selecionado de C. difficile e C. perfringens, são ainda para uso na prevenção e/ou tratamento de infecções ou doenças causadas por um microrganismo selecionado de Clostridium novyi, E. coli e misturas dos mesmos.

[0090]Em outra modalidade particular, a composição imunogênica de acordo com o primeiro aspecto ou a vacina que a compreende de acordo com o segundo aspecto é para uso em um método para fornecer imunização passiva maternal à progênie de um gado fêmea, particularmente por meio de lactação.

[0091]Os veículos, excipientes, etc. adequados para a preparação das vacinas para uso de acordo com a invenção podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão e incluem, como um exemplo de conservantes, aglutinantes, umectantes, emolientes e antioxidantes.

[0092]Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, o excipiente farmaceuticamente aceitável compreende qualquer componente farmaceuticamente aceitável que não seja o componente imunogênico. O veículo pode ser orgânico, inorgânico ou ambos.

Veículos adequados bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, sem limitação, macromoléculas grandes e metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas virais inativas.

[0093]Além disso, se desejado, o veículo pode conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como, por exemplo, agentes umectantes, agentes dispersantes, agentes emulsificantes, agentes tampão (por exemplo, tampão de fosfato), agentes quelantes (por exemplo, EDTA, ácido cítrico, ácido acético), agentes estabilizadores, tais como carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, manitol, sorbitol, amido ou dextranos) ou proteínas (por exemplo, albumina, caseína, soro bovino ou leite desnatado).

[0094]As composições da presente invenção para os usos propostos de acordo com os primeiro e segundo aspectos, podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. Os excipientes e/ou veículos apropriados, e suas quantidades, podem facilmente ser determinados por aqueles versados na técnica de acordo com o tipo de composição que está sendo preparado.

[0095]Os excipientes geralmente usados em vacinas incluem, sem limitação, todo e qualquer solvente, meio de dispersão, agentes umectantes, agentes quelantes, agentes emulsificantes, revestimentos, imunomoduladores, imunoestimulantes, adjuvantes, agentes estabilizadores, tais como carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, manitol, sorbitol, amido ou dextranos), diluentes, agentes tampão (por exemplo, tampão de fosfato), proteínas (por exemplo, albumina, caseína, soro bovino ou leite desnatado), conservantes, agentes isotônicos, agentes retardadores de adsorção e similares. Em modalidades preferidas, especialmente aquelas que incluem composições imunogênicas liofilizadas, agentes estabilizadores para uso na presente invenção incluem estabilizadores para liofiização ou criodessecação. As características físico-químicas dos excipientes, bem como, o nome dos produtos comerciais sob os quais são comercializados, podem ser encontrados no livro R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4'" edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].

[0096]Os adjuvantes também podem opcionalmente ser incorporados na vacina da invenção para aumentar a eficácia dos mesmos. Alternativamente, o adjuvante pode ser administrado antes ou após a administração da vacina da invenção.

[0097]Assim, em outra modalidade, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto da invenção ainda compreende um adjuvante. Os adjuvantes, como é bem conhecido na técnica, são estimulantes não específicos do sistema imune, que, administrados junto com o antígeno, aumentam a resposta imunológica. Particularmente, adjuvantes como aqui utilizados, podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, óxido de alumínio, dipeptídeos de muramil, vitamina E, esqualeno, esqualeno, saponinas, por exemplo, Quil A, QS-21, ginseng, zimosan, glucanos, polímeros de bloco não iônicos, monofosforil lipídico A, óleos vegetais, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, emulsões do tipo W/O, OW, W/O/W, sistema adjuvante Ribi (Ribi Inc.), enterotoxina lábil ao calor de E. coli (recombinante ou de outro modo), toxina da cólera, dimetilaminoetildextrano, dextranos ou análogos ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade particular, o adjuvante compreende hidróxido de alumínio, dietilaminoetil dextrano e Ginseng.

[0098]Em outra modalidade, a vacina para uso de acordo com o segundo aspecto da invenção é para prevenir e/ou tratar Clostridium sp. infecções e/ou doenças entéricas no gado. Particularmente suínos, em que os suínos são selecionados a partir do grupo que consiste em porcos, javalis, porcas, porcas jovens e leitões. Mais particularmente, é para fornecer imunidade passiva materna à progênie de uma porca jovem ou porca anterior à ave, isto é, antes do parto ou do nascimento da progênie.

[0099]Em uma modalidade particular, a vacina para uso de acordo com a invenção é para fornecer imunidade passiva materna à progênie (também conhecida como descendência ou ninhada) de um gado fêmea, particularmente de um gado fêmea fértil e/ou gestante durante a lactação. Mais particularmente, a imunidade passiva materna ou a proteção da progênie depende da transferência de anticorpos específicos da fêmea fértil e/ou fêmea de gado gestante para sua prole na forma de anticorpos colostrais que protegerão passivamente a ninhada.

[00100]Como será mostrado nos exemplos abaixo, a imunização de fêmeas permitiu a imunização passiva de sua progênie, devido ao fato de que os anticorpos também detectados no soro e colostro das fêmeas passaram pela lactação e atingiram efetivamente a progênie. Isso permitiu a proteção da progênie após desafio com as espécies de Clostridium.

[00101]Em uma modalidade mais particular, a composição imunológica ou a vacina da presente invenção é para uso em um método de fornecer imunidade passiva materna contra uma doença clostridial para a progênie de uma porca ou porca jovem, ou para a progênie de qualquer fêmea de gado, referido método compreendendo a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica, ou da vacina à porca ou porca jovem antes da parição (ou a qualquer fêmea de gado); em que os leitões (ou progênie) são fornecidos com imunidade passiva materna, particularmente através da lactação. Ainda em outra modalidade particular, as doenças clostridiais (ou doenças causadas por Clostridium sp.) são infecções e/ou doenças entéricas. Ainda em outra modalidade particular, o Clostridium Sp. é selecionado entre C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Em uma modalidade ainda particular, o método acima para fornecer imunidade passiva materna, particularmente por meio de lactação, compreende a administração de, pelo menos, duas doses da quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica ou da vacina da invenção para o gado fêmea.

[00102]Alternativamente, isso pode ser formulado como um método de fornecer imunidade passiva maternal à progênie de um animal gado fêmea em gestação, particularmente por meio de lactação, contra uma doença causada por Clostridium sp., o método compreendendo a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica ou a vacina da presente invenção para o animal gado fêmea em gestação antes do nascimento da progênie. Em uma modalidade particular, o método compreende a administração de, pelo menos, duas doses da quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica, ou a vacina da invenção para o animal gado fêmea em gestação. Em outra modalidade particular, o gado fêmea em gestação é suíno. Ainda em outra modalidade particular, as doenças causadas por Clostridium sp. são infecções e/ou doenças entéricas. Ainda em outra modalidade particular, o Clostridium sp. é selecionado entre C. difficile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Mais particularmente, o Clostridium sp. é selecionado dentre C. difficile, C. perfringens do Tipo A e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium.

[00103] Também alternativamente, isso pode ser formulado como o uso da quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica ou da vacina da invenção, conforme definido acima, para a fabricação de um medicamento para o fornecimento de imunidade passiva maternal contra infecções ou doenças entéricas causadas por Clostridium sp. Mais especificamente, o Clostridium sp. é selecionado entre C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Mais particularmente, o

Clostridium sp. é selecionado dentre C. diffícile, C. perfringens do Tipo A e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. As vacinas da invenção são tipicamente preparadas como vacinas parenterais na forma de soluções, emulsões ou suspensões líquidas. Elas também podem ser preparadas em uma forma sólida adequada para serem dissolvidas ou suspensas em um veículo líquido antes da injeção.

[00104]Particularmente, a vacina da invenção é (a) na forma líquida; ou (b) na forma de pó seco, liofilizada, por criodessecação, seca por pulverização OU seca com espuma.

[00105]O volume típico de uma dose de uma vacina de injeção da invenção é entre 0,1 ml e 5 ml, particularmente entre 0,15 ml e 3 ml, e mais particularmente entre 0,2ml e 2 ml. Normalmente, para administração intramuscular, é utilizado entre 0,5 ml e 5 ml, particularmente entre 1 ml e 3 ml, e mais particularmente entre 1 ml e 2 ml.

[00106]Os veículos líquidos que podem ser utilizados para preparar a vacina da invenção incluem, por exemplo, água (em particular, água para injeção), solução salina com uma concentração de sal fisiológica ou o líquido de cultura, em que as bactérias são cultivadas.

[00107]A composição imunológica do primeiro aspecto da invenção ou da vacina do segundo aspecto da invenção pode ser administrada por diferentes vias de administração. As vias particulares incluem, mas não são limitadas à via oral, transdérmica, transmucosa (isto é, mucosa e/ou submucosa), intradérmica, subcutânea, intramuscular, intranasal, por meio de aerossol, intraperitoneal ou intravenosa. Particularmente, elas são administradas por via intramuscular. De acordo com a duração e eficácia desejadas do tratamento, as composições e vacinas de acordo com a invenção podem ser administradas uma ou várias vezes, também de forma intermitente, por exemplo, diariamente, por vários dias, semanas ou meses e/ou em diferentes dosagens. O momento das doses depende de fatores bem conhecidos na técnica. Após a administração inicial, uma ou mais doses adicionais podem ser administradas para manter e/ou aumentar a eficácia das doses iniciais. Particularmente, as composições imunogênicas ou as vacinas da invenção são administradas várias vezes. Mais particularmente, o plano de vacinação compreende duas doses administradas antes do parto, a primeira dose administrada a aproximadamente 6 semanas antes do parto e a segunda dose a aproximadamente 3 semanas antes do parto. Em uma modalidade, quando o plano de vacinação de duas doses foi administrado a um animal pela primeira vez, em seguida, apenas uma dose única é necessária no seguinte parto. Portanto, as composições imunogênicas ou as vacinas da invenção também podem ser administradas em uma dose única. A vacina da invenção pode ser preparada de acordo com o processo padrão utilizado pelo versado na técnica para a preparação de formulações farmacêuticas adequadas para as diferentes formas de administração, conforme é descrito, por exemplo, no manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20*" edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]. Mais particularmente, a vacina é para uso por via intramuscular.

[00108]Como exposto acima, um terceiro aspecto da invenção está relacionado a uma composição imunogênica compreendendo, (a) um ou mais toxóides C. difficile selecionados a partir do grupo que consiste em toxóide C. diffícile A, toxóide C. difficile B e misturas dos mesmos; e (b) um ou mais toxóides C. perfringens do Tipo A.

[00109]Uma modalidade do terceiro aspecto da invenção está relacionada a uma composição imunogênica compreendendo, (a) um ou mais toxóides C. difficile selecionados a partir do grupo que consiste em toxóides C. difficie A, toxóides C. diffcie B e misturas dos mesmos; e compreendendo ainda o toxóide C. difficile binário (CDT); e

(b) um ou mais toxóides C. perfringens do Tipo A.

[00110]Uma modalidade do terceiro aspecto da invenção está relacionada a uma composição imunogênica compreendendo, (a) um ou mais toxóides C. difficile selecionados a partir do grupo que consiste em toxóide C. difficile A, toxóide C. diíffície B e misturas dos mesmos e, opcionalmente, compreendendo ainda o toxóide C. difficile binário (CDT); e (b) um ou mais toxóides alfa C. perfringens do Tipo A.

[00111]Outra modalidade do terceiro aspecto compreende um toxóide C. difficile A, um toxóide C. difficile B e um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A. Mais particularmente, o toxóide C. diffícile A é derivado de uma toxina C. diffícile A que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que possui, pelo menos, uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 1. Ainda mais particularmente, a toxina C. difficie A compreende a SEQ ID NO: 1 e, ainda mais particularmente, a toxina C. difficile A consiste em SEQ ID NO: 1. Também mais particularmente, a composição imunogênica compreende o toxóide C. difficile B que é derivado de uma toxina C. diffícile B que compreende a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que possui, pelo menos, uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 2. Ainda mais particularmente, a toxina C. difficie B compreende a SEQ ID NO: 2, e ainda mais particularmente, a toxina C. difficile B consiste em SEQ ID NO: 2.

[00112]Em outra modalidade particular, o toxóide C. difficile A é derivado de uma toxina C. diffícile A que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 1.

[00113]Em outra modalidade particular, o toxóide C. difficile B é derivado de uma toxina C. diffícile B que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 2.

[00114]Outra modalidade particular do terceiro aspecto, opcionalmente em combinação com as modalidades acima ou abaixo, a composição imunogênica compreende o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A que é derivado de uma toxina alfa C. perfringens do Tipo A que compreende SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que possui, pelo menos, uma identidade de sequência de 80% com a SEQ ID NO: 3. Ainda mais particularmente, a toxina alfa C. perfringens do Tipo A compreende SEQ ID NO: 3 e, mais particularmente, a toxina alfa C. perfringens consiste na SEQ ID NO: 3.

[00115]Em outra modalidade particular, o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A é derivado de uma toxina alfa C. perfringens do Tipo A que possui uma identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 3.

[00116]Ainda em outra modalidade, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, essas novas composições imunogênicas da invenção compreendem ainda um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo de microrganismos consistindo em Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria “Mycobacterium, “Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema Vibrio e, gênero Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus, rotavírus, falha no pré-desmame do suíno para agente da síndrome de crescer, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus de teno torque (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), e circovírus suíno e combinações dos mesmos.

[00117]Mais particularmente, os antígenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6; enterotoxóide de E. coli LT, toxóide C. perfringens do Tipo C; toxóide C. novyi do Tipo B; e combinações dos mesmos. Particularmente, a composição imunogênica ou a vacina que a compreende, compreende os antígenos E. coli F4ab, F4ac, adesinas fimbriais F5 e F6; enterotoxóide E. coli LT, toxóide C. perfringens do Tipo C; e toxóide C. novyi do Tipo B. Particularmente, a composição imunogênica da invenção ainda compreende os antígenos de SUISENGGO, RHINISENGO, ERYSENGO, ERYSENGO PARVO, ERYSENGO PARVO LEPTO, PARVOSENGO, VPUREDO (Laboratorios HIPRA, S.A.).

[00118]Os toxóides podem ser obtidos como descritos acima e podem estar contidos em uma preparação celular completa, em uma preparação sem células (sobrenadantes) ou mesmo como proteínas completamente purificadas, o que significa que os toxóides foram isolados dos referidos sobrenadantes e a composição final compreende um solvente e o toxóide. Os métodos para purificar totalmente as proteínas são aqueles conhecidos pelo versado na técnica incluindo, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho, SDS-PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida) ou por cromatografia líquida de alta performance ou cromatografia em fase reversa ou por diálise, entre outros.

[00119]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto tem uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide C. difficile A de 0,1 a 100% (v/v), particularmente de 0,5 a 50% (v/v), e mais particularmente de 1 a 25% (v/v), ainda mais em particular de 1 a 10% (v/v).

[00120]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto tem uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide C. difficile

B de 0,1 a 100% (v/v), particularmente de 0,5 a 50 % (v/v), e mais particularmente de 1 a 25% (v/v), ainda mais em particular de 1 a 10% (v/v).

[00121]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto tem um título imunologicamente eficaz de toxóides C. difficie Ae B (TcdA/TcdB) de, pelo menos, 5,0 títulos citopáticos (CPE, logioCPE/ml), titulado com base no efeito citopático antes da etapa de inativação. Particularmente de pelo menos 5,5, de pelo menos 6,0, de pelo menos 6,5, de pelo menos 7,0, de pelo menos 7,5, de pelo menos 8,0, de pelo menos 8,5, de pelo menos 9,0, de pelo menos 9,5, de pelo menos 10,0, de pelo menos 10,5, ou de pelo menos 11,0 CPE. De preferência, entre 5,0 e 11,0 CPE, mais de preferência, entre 6,5 e 9,5 CPE. O ensaio CPE é um método de rotina para a titulação do efeito tóxico. Os detalhes do procedimento são descritos abaixo e são bem conhecidos por qualquer pessoa versada na técnica. Em ainda outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto, os toxóides C. difficile A e B (TcdA/TcdB) estão presentes em uma relação de 99:0,1 a 0,1:99, de preferência, de 50:0,5 a 0,5:50, mais de preferência, de 10:1 a 1:10, mais de preferência, de 5:1 a 1:5, mais de preferência, de 2,5:1 a 1:25 e mais de preferência, 2,5:1.

[00122]Em ainda outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto possui uma quantidade imunologicamente eficaz de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A de 0,1 a 100% (v/v), de preferência, de 0,5 a 50% (v/v), e mais de preferência, de 1 a 25% (v/v). Ainda mais, de preferência, de 8 a 10% (v/v).

[00123]Em outra modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade acima ou abaixo, a composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto tem um título imunologicamente eficaz de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A com pelo menos 8,0 títulos hemolíticos (HA, log2HA50%/ml), titulado com base na atividade hemolítica antes da etapa de inativação. Particularmente, de pelo menos 8,5, de pelo menos 9,0, de pelo menos 9,5, de pelo menos 10,0, de pelo menos 10,5, de pelo menos 11,0, de pelo menos 11,5, de pelo menos 12,0, de pelo menos 12,5, de pelo menos 13,0, de pelo menos 13,5, de pelo menos 14,0, de pelo menos 14,5, de pelo menos 15,0, de pelo menos 15,5, de pelo menos 16,0, de pelo menos 16,5, de pelo menos 17,0, de pelo menos 17,5 ou de pelo menos 18,0 HA. De preferência, entre 8,0 e 18,0 HA, mais de preferência, entre 11,0 e 17,5 HA. O ensaio de HA é um método de rotina para a titulação do efeito tóxico. Os detalhes do procedimento são descritos abaixo e são bem conhecidos por qualquer pessoa versada na técnica.

[00124]Particularmente, na composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto da invenção, o toxóide C. difficile A (TcdAY/B (TcdB) e o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A estão presentes em uma relação de 0,1:99 a 99:0,1, de preferência, de 0,5:50 a 50:0,5, mais de preferência, de 20:1 a 1:20 e mais, de preferência, de 10:2 a 2:10. Ainda mais, de preferência, 2:10.

[00125]Como descrito acima, um quarto aspecto da invenção também se refere a uma vacina compreendendo a composição imunogênica do terceiro aspecto da invenção e um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. Todas as modalidades particulares da composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto da invenção, também se aplicam à vacina do quarto aspecto da invenção.

[00126]EM uma modalidade particular, a vacina da invenção ainda compreende um adjuvante.

[00127]Os —excipientes, veículos e adjuvantes que podem estar compreendidos na vacina do quarto aspecto da invenção foram descritos acima. Bem como a via de administração e o plano de vacinação. As vias particulares incluem, mas não são limitadas à via oral, transdérmica, transmucosa (isto é, mucosa e/ou submucosa), intradérmica, subcutânea, intramuscular, intranasal, por meio de aerossol, intraperitoneal ou intravenosa. Particularmente elas são administradas por via intramuscular. De acordo com a duração e eficácia desejadas do tratamento, as composições de acordo com a invenção podem ser administradas uma ou várias vezes, também de forma intermitente, por exemplo, diariamente por vários dias, semanas ou meses e/ou em diferentes dosagens. O momento das doses depende de fatores bem conhecidos na técnica. Após a administração inicial, uma ou mais doses adicionais podem ser administradas para manter e/ou aumentar a eficácia das doses iniciais. Particularmente, as composições imunogênicas ou as vacinas da invenção são administradas várias vezes. Mais particularmente, o plano de vacinação compreende duas doses administradas antes do parto, a primeira dose administrada a aproximadamente 6 semanas antes do parto e a segunda dose a aproximadamente 3 semanas antes do parto. Em uma modalidade, quando o plano de vacinação de duas doses foi administrado a um animal pela primeira vez, em seguida, apenas uma dose é necessária no seguinte parto. Portanto, as composições imunogênicas ou as vacinas da invenção também podem ser administradas em uma dose única. A vacina da invenção pode ser preparada de acordo com o processo normal utilizado pelo versado na técnica para a preparação de formulações farmacêuticas adequadas para as diferentes formas de administração, conforme é descrito, por exemplo, no manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20*" edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]. Mais particularmente, a vacina é para uso por via intramuscular.

[00128]A composição imunogênica de acordo com o terceiro aspecto da invenção, bem como qualquer vacina que a compreenda, como descrita para o quarto aspecto, é para uso como um medicamento. Mais em particular para prevenir e/ou tratar infecções ou doenças entéricas em um indivíduo. Assim, pode ser administrado em um indivíduo em necessidade do mesmo em uma quantidade imunologicamente eficaz em um método para prevenir e/ou tratar infecções ou doenças entéricas causadas por Clostridium sp. Ou seja, a composição imunogênica ou a vacina como definida acima é para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças entéricas causadas por Clostridium sp. Mais em particular, o Clostridium sp. é selecionado entre C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Mais particularmente, o Clostridium sp. é selecionado dentre C. difficile, C. perfringens do Tipo A e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Em uma modalidade particular, a vacina para uso de acordo com o quarto aspecto da invenção é para prevenir e/ou tratar infecções e/ou doenças entéricas Clostridium sp. no gado. Particularmente suínos, em que os suínos são selecionados a partir do grupo que consiste em porcos, javalis, porcas, porcas jovens e leitões. Mais particularmente, é para fornecer imunidade passiva maternal à progênie de uma porca jovem ou porca anterior à ave, isto é, antes do parto ou nascimento da progênie, particularmente por meio de lactação.

[00129]Em um quinto aspecto da invenção, a composição imunogênica ou a vacina que a compreende, como definida ou de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores da invenção, são para uso como um medicamento, que é para uso em um método para fornecer imunização passiva maternal para a progênie de um gado fêmea, particularmente por meio de lactação, o método que compreende administrar a composição imunogênica ou a vacina ao animal gado fêmea em gestação antes do nascimento da progênie. Particularmente, a imunidade passiva ou proteção da progênie depende da transferência de anticorpos maternais específicos do gado fêmea fértil e/ou gestante para sua prole na forma de anticorpos colostrais que protegerão passivamente sua ninhada.

[00130]Como será mostrado nos exemplos abaixo, a imunização de fêmeas permitiu a imunização passiva maternal de sua progênie, devido ao fato de que os anticorpos também detectados no soro e colostro das fêmeas passaram pela lactação e atingiram efetivamente a progênie. Isso permitiu a proteção da progênie após desafio com as espécies de Clostridium.

[00131]Em uma modalidade mais particular do quinto aspecto da invenção, é para uso em um método de fornecer imunidade passiva maternal contra uma doença clostridial para a progênie de uma porca ou porca jovem, ou para a progênie de qualquer gado fêmea, o referido método compreendendo administrar uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica, ou a vacina para a porca ou porca jovem antes da parição (ou para qualquer gado fêmea), em que os leitões (ou progênie) são fornecidos com imunidade passiva maternal, particularmente através da lactação. Ainda em outra modalidade particular, as doenças causadas por Clostridium sp. são infecções e/ou doenças entéricas. Ainda em outra modalidade particular, o Clostridium sp. é selecionado entre C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Em uma modalidade ainda particular, o método acima para fornecer imunidade passiva maternal, particularmente por meio de lactação, compreende a administração de, pelo menos, duas doses da quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica, ou a vacina da invenção para o gado fêmea.

[00132]Alternativamente, o acima pode ser formulado como um método de fornecer imunidade passiva maternal à progênie de um animal gado fêmea em gestação, particularmente por meio de lactação, contra doenças causadas por Clostridium sp., o método compreendendo a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica ou a vacina que a compreende, para o animal gado fêmea em gestação antes do nascimento da progênie. Em uma modalidade particular, o método compreende a administração de, pelo menos, duas doses do animal gado fêmea em gestação. Em outra modalidade particular, o animal gado fêmea em gestação é suíno. Ainda em outra modalidade particular, a doença causada por Clostridium sp. é infecções e/ou doenças entéricas. Ainda em outra modalidade particular, o Clostridium sp. é selecionado entre C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Também alternativamente, isso pode ser formulado como o uso de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica ou da vacina que a compreende, para a fabricação de um medicamento para o fornecimento de imunidade passiva maternal contra infecções ou doenças entéricas causadas por Clostridium sp. Mais especificamente, o Clostridium sp. é selecionado entre C. difficile, C. perfringens e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium. Mais particularmente, o Clostridium sp. é selecionado dentre C. diffícile, C. perfringens do Tipo A e misturas dos mesmos, e as infecções ou doenças entéricas são causadas por essas espécies de Clostridium.

[00133]Como exposto anteriormente, um sétimo aspecto da invenção é um kit de vacinação que compreende: (a) uma composição imunogênica como definida acima, de acordo com o terceiro aspecto; (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável; (c) opcionalmente um adjuvante; e (d) opcionalmente instruções para seu uso.

[00134]Este kit de vacinação como definido acima é, em particular, para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por Clostridium sp. Além disso, o kit de vacinação também pode ser um kit de peças de vacinação.

[00135]Outros kits de vacinação para vacinar um indivíduo contra uma infecção ou doença causada por Clostridium sp. também fazem parte da invenção. Em particular, aqueles que compreendem a vacina do quarto aspecto da invenção e outras composições imunológicas e/ou vacinas contra outra doença ou condições patológicas causadas por microrganismos. Em particular, também fazem parte da invenção os kits que compreendem um ou mais frascos com as composições imunogênicas da invenção, e/ou as vacinas que os compreendem e, opcionalmente, outras vacinas contra outras doenças, juntamente com instruções (tal como um folheto) com a indicação para utilização na prevenção e/ou tratamento de doenças, em particular, aquelas causadas por C. difficile em gado e outras doenças quando combinadas com a vacina da invenção. Os kits de vacinação também podem conter, além disso, outro recipiente contendo uma solução aquosa para reconstituir a composição final a ser administrada. O kit de vacinação pode opcionalmente incluir um ou mais dispositivos (médicos) para a administração. Em outra modalidade particular, o kit de vacinação é para uso em doenças causadas por C. diffíicile e C. perfringens em gado. Em outra modalidade particular, o kit de vacinação é para uso em infecções entéricas ou doenças causadas por C. diffícile, C. perfringens e misturas dos mesmos.

[00136]Em toda a descrição e reivindicações, a palavra "compreender" e variações da palavra, não pretendem excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Além disso, a palavra "compreender" abrange o caso de "consistindo em". Objetos, vantagens e características adicionais da invenção serão evidentes por aqueles versados na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os seguintes exemplos são fornecidos a título de ilustração, e não pretendem limitar a presente invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as combinações possíveis de modalidades particulares e preferidas aqui descritas.

Modalidades Adicionais

[00137]A presente invenção também fornece as seguintes modalidades, conforme definidas nos itens 1 a 27 abaixo:

1. Composição imunogênica que compreende um ou mais toxóides Clostridium difficile (C. difficile) para uso como um medicamento em gado.

2. Composição imunogênica para uso, de acordo com o item 1, em que o gado é suíno.

3. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 2, em que é para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por Clostridium sp.

4. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, em que é para prevenir e/ou tratar infecções e/ou doenças entéricas de Clostridium sp.

5. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, em que o toxóide é selecionado a partir do grupo que consiste em toxóide C. difficile A, toxóide C. difficile B, toxóide binário C. diffícile, e misturas dos mesmos.

6. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, compreendendo um toxóide C. difficile A e um toxóide C. diffícile B.

7. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, compreendendo ainda um ou mais toxóides Clostridium perfringens (C. perfringens).

8. Composição imunogênica para uso, de acordo com o item 7, em que o um ou mais toxóides C. perfringens é um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A.

9. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, compreendendo ainda um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo de microrganismos consistindo em Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria “Mycobacterium, “Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella,

Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema Vibrio e gênero Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de suíno, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus, rotavírus, falha no pré-desmame do suíno para agente da síndrome de crescer, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus de teno torque (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), circovírus suíno e combinações dos mesmos.

10. Composição imunogênica para uso, de acordo com o item 9, em que o um ou mais antígenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6; enterotoxóide E. coli LT; toxóide C. perfringens do Tipo C; toxóide C. novyi do Tipo B; e combinações dos mesmos.

11. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, em que é para uso em um método para fornecer imunização passiva maternal à progênie de um gado fêmea, opcionalmente por meios de lactação.

12. Vacina para uso como um medicamento em gado, que compreende: (a) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides C. difficile conforme definidos em qualquer um dos itens 1a 10; e (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Vacina para uso, de acordo com o item 12, compreendendo ainda um adjuvante.

14. Vacina para uso, de acordo com qualquer um dos itens 12 a 13, em que é para fornecer imunidade passiva maternal à progênie de um gado fêmea, por meios de lactação.

15. Vacina para uso, de acordo com qualquer um dos itens 12 a 14 ou a composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, em que é para uso por via intranasal, intradérmica, transmucosa (mucosa e/ou submucosa), subcutânea, por meio de aerossol, intramuscular, intravenosa ou oral.

16. Composição imunogênica, que compreende: (a) um ou mais toxóides C. difficile selecionados a partir do grupo que consiste em um toxóide C. difficile A (TcdA), um toxóide C. diffícile B (TcdB) e misturas dos mesmos; e (b) um ou mais toxóides C. perfringens do Tipo A.

17. Composição imunogênica, de acordo com o item 16, compreendendo um toxóide C. diffícile A, um toxóide C. diffícile B e um toxóide alfa C. perfringens do Tipo A.

18. Composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 16 a 17, compreendendo ainda um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo de microrganismos consistindo em Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila, Clostridium, — Corynebacterium, —Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria “Mycobacterium, “Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema Vibrio e gênero Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de suíno, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus, rotavírus, falha no pré-desmame do suíno para agente da síndrome de crescer, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus de teno torque (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), circovírus suíno e combinações dos mesmos.

19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 18, em que um ou mais antígenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6, enterotoxóide E. coli LT, toxóide C. perfringens do Tipo C, toxóide C. novyi do Tipo B e combinações dos mesmos.

20. Vacina compreendendo a composição imunogênica como definida em qualquer um dos itens 16 a 19 e um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Vacina, de acordo com o item 20, compreendendo ainda um adjuvante.

22. Processo para preparar a vacina, de acordo com qualquer um dos itens 20 a 21, em que compreende a etapa de misturar a composição imunogênica como definida em qualquer um dos itens 16 a 19 com um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

23. Kit de vacinação, que compreende: (a) uma composição imunogênica como definida em qualquer um dos itens 16 ais (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável; (c) opcionalmente um adjuvante; e (d) opcionalmente instruções para seu uso.

24. Kit de vacinação, como definido no item 23, para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por Clostridium sp., opcionalmente infecção e/ou doença entérica de Clostridium sp., em que o Clostridium sp. é selecionado a partir de C. difficile, C. perfringens e misturas dos mesmos.

25. Composição imunogênica para uso, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, a composição imunogênica como definida em qualquer um dos itens 16 a 19, a vacina para uso de acordo com qualquer um dos itens 12 a 15, e a vacina como definida em qualquer um dos itens 20 a 21, em que é para uso em um método de fornecer imunidade passiva maternal à progênie de um gado fêmea, opcionalmente por meio de lactação, o método compreendendo administrar a composição imunogênica ou a vacina ao animal gado fêmea em gestação antes do nascimento da progênie.

26. Composição imunogênica ou vacina para uso, de acordo com o item 25, em que o método de proporcionar imunidade passiva maternal compreende a administração de, pelo menos, duas doses ao animal gado fêmea em gestação.

27. Composição imunogênica ou vacina para uso, de acordo com qualquer um dos itens 25 a 26, que é para uso por via intranasal, intradérmica, transmucosa (mucosa e/ou submucosa), subcutânea, por meio de aerossol, intramuscular, intravenosa ou oral.

Exemplos Exemplo 1: Produção da vacina da invenção

[00138]Diferentes composições de vacina foram preparadas. Antes de formular as composições de vacina, as toxinas inativadas, isto é, os toxóides, foram obtidos como descrito abaixo.

1.1 Produção de toxinas TcdA e TcdB inativadas por C. difficile

[00139]A cepa B-7727 C. diffícile foi utilizada para obter as toxinas TcdA e TcdB. Esta cepa é um isolado de campo a partir de Laboratorios HIPRA, S.A. e produz ambas as toxinas TcdA e TcdB. Colônias de C. diffícile foram inoculadas em 10 ml contendo 36 g/L de caldo BHI (Brain Heart Infusion, Becton Dickinson f 237500) suplementado com 0,5% de extrato de levedura (Becton Dickinson %212750) e 0,05% de L-cistina (Amresco %0206) em um tubo Hungate de 20 x 150 mm, sob uma atmosfera de 5% de CO2:5% de H2:90% de N2 e incubadas a 37ºC durante a noite. Uma quantidade de 1-2 ml desta cultura durante a noite foi usada para inocular uma alça do tubo de diálise (corte de MW 10kDA, SpectrumLabs f132129) suspensa em um balão erlenmeyer de 4 L contendo 4 L de caldo BHI suplementado com 0,5% de extrato de levedura e 0,05% de L-cistina. O balão foi incubado a 37ºC em uma incubadora anaeróbica. Após 5-7 dias, o material no tubo de diálise foi coletado e o sobrenadante foi clarificado por centrifugação (15.000 x g, 20 minutos) e esterilizado por filtração com um diâmetro de poro de 0,22 um. Após a filtração da esterilização, uma solução de formaldeído foi adicionada a uma concentração final de 0,8% p/v e mantida durante 6 dias a 37ºC com agitação, a fim de inativar o sobrenadante. Finalmente, uma diálise foi realizada com PBS para remover o formaldeído residual.

[00140]O sobrenadante contendo os toxóides TcdA e TcdB purificados foi, em seguida, armazenado a 4ºC para a futura preparação da vacina. A quantificação das toxinas TcdA/TcdB foi realizada analisando seu efeito citopático (CPE) antes da etapa de inativação. Para o ensaio de atividade, células de rim de macaco verde africano (Vero) foram usadas da seguinte forma: 10º células Vero/ml foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades em 100 ul de Glasgow MEM estéril (ThermorFisher) estéril contendo 10% (v/v) de soro bovino fetal e incubadas 3-4 horas para permitir a adesão das células. Diluições em série de 10 vezes de filtrados de cultura foram preparadas em duplicado em Glasgow MEM estéril + 10% de FBS e 10 ul foram adicionados às células Vero. As cavidades de controle foram dispensadas apenas com o diluente. As placas foram incubadas durante 4 dias (37ºC e 5% de CO»), coradas com violeta de cristal usando procedimentos padrão e a densidade óptica (OD) foi medida com um leitor de placa de 96 cavidades a 595 nm. O título de citotoxicidade foi definido como o recíproco da diluição da amostra que forneceu 50% de toxicidade celular (CPE; logioCPE/ml). A relação de TcdA:TcdB no sobrenadante foi de aproximadamente 2,5:1.

1.2 Produção de toxina alfa inativada por C. perfringens do Tipo À

[00141]Cepa 4476 C. perfringens do Tipo A foi utilizada para produzir a toxina alfa. Esta cepa é um isolado de campo a partir de Laboratorios HIPRA, S.A. A cultura C. perfringens do Tipo A foi cultivada sob condições anaeróbicas em Meio de Carne Cozida (Becton Dickinson %226730) preparado seguindo as instruções do fabricante. A mesma foi cultivada sob condições estritas de anaerobiose a 37ºC e cerca de 4-5 horas. O sobrenadante foi clarificado por centrifugação (15.000 x g, 20 minutos) para separar as células C. perfringens do Tipo A (pélete) e esterilizado por filtração com um diâmetro de poro de 0,22 um. Uma solução de formaldeído e glicina foi adicionada ao sobrenadante até uma concentração final de 0,8% p/v para inativar a cultura. O sobrenadante foi mantido 8 dias a 4ºC com agitação. Uma vez completada a inativação, o sobrenadante resultante foi concentrado usando ultrafiltrtação com tamanho de poro de 10 kDa, seguido por uma etapa de diafiltração com PBS. Após a concentração, uma etapa final de filtração esterilizante foi realizada. O sobrenadante concentrado contendo o toxóide alfa purificado foi, em seguida, armazenado a 4ºC para a futura preparação da vacina.

[00142]A quantificação das toxinas foi realizada testando sua atividade hemolítica (HA) antes da etapa de inativação, como se segue: A atividade hemolítica foi determinada usando eritrócitos de camundongo lavados recentemente desenhados, suspensos em PBS a 0,5%. Volumes (0,1 ml) de suspensão de eritrócitos foram adicionados a volumes iguais de diluições em série de duas vezes de toxina em 0,9% de solução salina. Após incubação durante 1 h a 37ºC, a placa foi centrifugada e a densidade óptica (OD) do sobrenadante foi medida a 405 nm. O título hemolítico (HA, log2HA50%/ml) foi definido como o recíproco da diluição da amostra que forneceu 50% da hemólise celular.

[00143]Os toxóides da invenção também podem ser obtidos a partir de metodologias alternativas, tais como metodologias sintéticas, por exemplo, por sínteses químicas de fragmentos e ligação adicional para obter toda a sequência do toxóide. Eles também podem ser obtidos por meios de tecnologias recombinantes de DNA, como peptídeos recombinantes produzidos em bactérias ou em leveduras. O versado na técnica está ciente desses métodos alternativos e reconhecerá que, embora os toxóides na vacina ou na composição imunogênica da invenção possam ter as sequências selecionadas a partir das SEQ ID NO: 1, 2 e 3, ou uma sequência que tenha pelo menos 80% de identidade de sequência com as SEQ ID NO: 1,2 e3, eles também serão eficazes em termos de provocar a resposta imune quando obtida por métodos alternativos que não os descritos no Exemplo 1.

1.3 Composições de vacina

[00144]Diferentes composições de vacina e contendo diferentes títulos dos toxóides da invenção foram preparadas da seguinte forma:

1.3.1 Vacina A: formulações de toxóide C. difficile

[00145]Toxóides C. difficie TcdA e TcdB obtidos de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.1. foram titulados com base no efeito citopático (CPE; logioCPE/ml) obtido antes da inativação. A vacina A foi formulada para obter um título de 9,4 CPE. A relação de toxóide TcdA/TcdB foi de 2,5:1.

[00146]A vacina A foi formulada da seguinte forma: 25% (v/v) do toxóide TecdA/TcdB (fase antigênica) foram misturados com PBS e 5% (p/v) de uma solução de ginseng a 4% (p/v), a solução foi, em seguida, homogeneizada. Foram adicionados 25% (p/v) de um gel de hidróxido de alumínio e o volume foi ajustado com PBS até atingir 100% do volume, obtendo-se uma suspensão para injeção. Por fim, o pH da formulação da vacina foi ajustado para 7,4-7,8.

[00147]Esta formulação de vacina A foi subsequentemente utilizada no Exemplo 2.

1.3.2 Vacina B: formulações de toxóide C. difficile

[00148] Toxóide C. difficile TcdA/TedB obtido de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.1. foi titulado com base no efeito citopático (CPE; logioCPE/ml) obtido anteriormente à inativação e diluído 10 vezes, a fim de obter a vacina B com um título de 8,4 CPE. A relação de toxóide TcdA/TcdB foi de 2,5: 1.

[00149]A vacina B foi formulada da seguinte forma: 2,5% (v/v) de toxóide TecdA/TcdB (fase antigênica) foram, em seguida, misturados com PBS e 5% (p/v) de uma solução de ginseng a 4% (p/v), a solução foi, em seguida, homogeneizada. Foram adicionados 25% (p/v) de um gel de hidróxido de alumínio e o volume foi ajustado com PBS até atingir 100% do volume, obtendo-se uma suspensão para injeção. Por fim, o pH da formulação da vacina foi ajustado para 7,4-7,8.

[00150]Esta formulação de vacina B foi subsequentemente usada no Exemplo

2.

1.3.3 Vacina 1: formulações de toxóide C. difficile combinadas com toxóide alfa C. perfringens do Tipo A e outros antígenos.

[00151]Toxóide C. difficile TcdA/TedB obtido de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.1. foi titulado com base no efeito citopático (CPE; logioCPE/ml) obtido anteriormente à inativação e diluído até atingir um título de 8,8 CPE para formular a vacina 1. A relação de toxóide TcdA/TcdB foi de 2,5:1.

[00152]Toxóide alfa C. perfringens do Tipo A obtido de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.2. foi titulado com base na atividade hemolítica (HA, log2HA50%/ml) obtida antes da inativação. A vacina 1 foi preparada para obter um título de 14,5 HA de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A.

[00153]A vacina 1 foi formulada da mesma maneira que a vacina A. Nesse caso, a fase antigênica continha: 25% (v/v) de toxóide C. difficitle TcdA/TcdB e 25% (v/v) de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A. Toxóide C. difficile TcdA/TcedB e toxóide alfa C. perfringgens do Tipo A estavam presentes em uma relação de 1:1. A fase antigênica foi misturada com 2% (p/v) de DEAE-Dextran e com 10% (p/v) de uma solução de ginseng a 4% (p/v) e 30% (p/v) de gel de hidróxido de alumínio. À formulação foi homogeneizada e a suspensão para injeção foi completada com PBS até atingir 100% do volume atingido. O pH foi finalmente ajustado para 7,4-7,8.

Outros antígenos:

[00154]A suspensão para injeção previamente obtida foi, em seguida, misturada na relação de 1:1 com SUISENGO (LABORATORIOS HIPRA, S.A.). SUISENGO é uma vacina comercial contra colibacilose e clostridiose suína neonatal,

que contém os seguintes antígenos: adesinas fimbriais F4ab, F4ac, Fo e F6 e enterotoxóide LT de E. coli, toxóide C. perfringens do Tipo C e toxóide C. novyi do Tipo B.

[00155]A formulação da vacina 1 em combinação com SUISENGO foi subsequentemente usada no Exemplo 3.

1.3.4 Vacina 2: formulações de toxóide C. difficile combinadas com toxóide alfa C. perfringens do Tipo A e outros antígenos Antígenos C. difficile:

[00156]Toxóide C. difficile TcdA/TedB obtido de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.1. foi titulado com base no efeito citopático (CPE; logioCPE/ml) obtido antes da inativação e diluído para atingir um título de 8,5 CPE para formular a vacina 2. A relação de toxóide TcdA/TcdB foi de 2,5:1.

Antígenos C. perfringens:

[00157]Toxóide alfa C. perfringens do Tipo A obtido de acordo com um procedimento análogo ao descrito na seção 1.2. foi titulado com base na atividade hemolítica (HA, 10g2HA50%/ml) obtida anteriormente à inativação e diluído para atingir um título de 13,5 HA de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A para formular a Vacina

2.

[00158]A vacina 2 foi formulada como vacina 1. Nesse caso, a fase antigênica continha 12,5% (v/v) de toxóide C. difficitle TcdA/TcdB e 12,5% (v/v) de toxóide alfa C. perfringens do Tipo A, que corresponde a uma relação de toxóide C. diffícile TcdA/TcdB e toxóide alfa C. perfringens do Tipo A de 1:1. A mistura foi homogeneizada com 2% (p/v) de DEAE-Dextran, 10% (p/v) de solução de ginseng a 4% (p/v) e 30% (p/v) de gel de hidróxido de alumínio. A suspensão para injeção obtida foi completada com PBS até atingir 100% do volume e o pH foi finalmente ajustado para 7,4-7,8.

Outros antígenos:

[00159]A suspensão para injeção previamente obtida foi, em seguida, misturada na relação de 1:1 com SUISENGO (LABORATORIOS HIPRA, S.A.). SUISENGO é uma vacina comercial contra colibacilose e clostridiose suína neonatal, que contém os seguintes antígenos: adesinas fimbriais F4ab, F4ac, Fo e FB e enterotoxóide LT de E. coli, toxóide C. perfringens do Tipo C e toxóide C. novyi do Tipo B.

[00160]A formulação da vacina 2 sozinha ou em combinação com SUISENGO foi subsequentemente usada no Exemplo 3.

Exemplo 2: Resposta sorológica contra o toxóide C. difficile TcdA e TcdB de borcos imunizados com uma vacina da invenção

[00161]Um total de 24 porcos com 12 semanas de idade e livres de anticorpos contra as toxinas C. diffícile foi separado em três grupos de 8 porcos cada um. O primeiro grupo (A) recebeu a vacina A descrita na seção 1.3.1 (contendo um título TecdA/TcdB de 9,4 CPE), o segundo grupo (B) recebeu a vacina B descrita na seção

1.3.2. (contendo um título TcdA/TcdB de 8,4 CPE) e o terceiro grupo (C) recebeu uma vacina de placebo que consiste em uma solução de PBS. Os porcos receberam 2 doses de 2 ml da vacina por via intramuscular, administradas em um intervalo de 3 semanas entre a primeira (dia 0) e a segunda dose (dia 21).

[00162]Para determinar a resposta sorológica induzida nos animais imunizados, foram coletadas amostras de soro dos animais em diferentes dias do estudo (7 dias antes da primeira dose da vacina (-7), dia 20, dia 44 e dia 55 após a primeira dose da vacina) e foram analisadas por ELISA para detectar a presença de anticorpos contra as toxinas C. difficitle TcdA/TcdB.

[00163]Os resultados demonstraram claramente um aumento dos níveis de anticorpos para ambos os antígenos nos grupos vacinados em comparação com o grupo de controle (Fig. 1, A e B). Desta maneira, a vacina da invenção mostrou uma resposta imune clara contra as toxinas TcdA e TcdB de C. diffícile, além disso foi observado que os anticorpos eram anticorpos neutralizantes. Exemplo 3: Resposta sorológica de porcas imunizadas com diferentes vacinas combinadas

[00164]Um total de 16 porcas em gestação às 6 semanas antes do parto e livre de anticorpos contra a toxina alfa C. perfringens do Tipo A e toxinas C. difficile TcdA e TcdB foi selecionado para este estudo. As porcas foram divididas em quatro grupos diferentes de 4 animais cada (A a D). Cada grupo recebeu um tratamento diferente: * Grupo A: Vacina 1 em combinação com SUISENGGO, conforme descrito na seção 1.3.3. * Grupo B: Vacina 2 em combinação com SUISENGGO, conforme descrito na seção 1.3.4. * Grupo C: Vacina 2 sozinha (sem SUISENGO). * Grupo D: Vacina de placebo (adjuvante sem a fase antigênica).

[00165]Todos os grupos foram imunizados com o mesmo plano de administração. O plano de administração consistia em 2 doses de 2 ml administradas por via intramuscular, com um intervalo de 3 semanas entre as mesmas. A primeira dose foi administrada 6 semanas antes do parto (dia 0) e a segunda dose 3 semanas antes do parto (dia 21). A primeira dose foi dada no lado direito do pescoço e a segunda dose no lado esquerdo. Os grupos que foram vacinados também com SUISENGO (grupos A, B) receberam uma injeção de 4 ml, como o SUISENGO foi misturado na relação de 1:1 com a vacina experimental, de modo que uma injeção de 2 ml para cada vacina foi usada no protocolo da vacina. Resposta sorológica de porcas contra antígenos C. diffícile e C. perfringens

[00166]As análises da resposta sorológica contra os antígenos presentes na vacina da invenção foram desenvolvidas usando duas técnicas: ELISA e seroneutralização. O soro foi extraído no dia da primeira vacinação (dia 0) e nos dias e 44 após a primeira vacinação. Foi observada uma clara soroconversão em todos os antígenos para ambos C. difficile e C. perfringens em todos os animais que foram imunizados em comparação ao grupo de controle (Fig. 3). Resposta sorológica de porcas imunizadas com uma vacina combinada

[00167]Para determinar a resposta sorológica induzida pelo SUISENGO, os soros das porcas de todos os quatro grupos foram extraídos no dia 44 após a primeira vacinação e analisados por ELISA para detectar a presença de anticorpos contra antígenos SUISENGO (Fig. 2). Uma clara soroconversão também foi observada para os grupos A e B para todos os antígenos. Estes resultados indicam que a associação de SUISENGO com a vacina da invenção funciona bem e a eficácia de SUISENGO também é satisfatória quando combinada com a vacina da invenção.

Anticorpos no colostro

[00168]Para determinar a transferência da imunidade maternal, o colostro de todas as porcas foi coletado no dia do nascimento. A resposta sorológica foi analisada por ELISA e seroneutralização para detectar anticorpos específicos contra a toxina alfa C. perfringens do Tipo A e toxinas C. difficile TcdA e TcdB.

[00169] Observou-se que as amostras de colostro coletadas nos animais imunizados continham títulos muito altos de anticorpos específicos contra a toxina alfa C. perfringens do Tipo A e toxinas C. difficile TcdA e TcdB quando comparadas ao grupo de placebo (Fig. 4).

Exemplo 4: Eficácia da vacina da invenção por imunização passiva a leitões

[00170]Neste exemplo, a eficácia da vacina foi avaliada após uma infecção experimental em leitões imunizados passivamente via colostro.

[00171]Um total de 98 leitões recém-nascidos foi utilizado neste estudo. Os leitões vieram das porcas imunizadas no Exemplo 3. Os leitões recém-nascidos de cada porca foram classificados em três grupos. Cada grupo recebeu um desafio diferente. A distribuição está descrita na Tabela 2. Tabela 2: Resumo dos grupos de distribuição de leitões Grupo de desafio Nº de Nº de Desafio Grupo experimental Exemplo 3: porcas leitões de leitões 8 C. perfringens A 4 | 8 | cdqifície NS NO Dr 8 C. perfringens 4 8 C. difície NS O | ec 4 C. difícile NS O O Rr | C. perfringens 4 C. diffícile STO Rr

[00172]O desafio experimental foi dado a leitões de um dia de idade por via intraperitoneal com uma injeção de 2 ml. Os leitões foram desafiados com a dose de DL100% de cada toxina titulada anteriormente. As toxinas foram obtidas por um processo análogo ao descrito no Exemplo 1, mas sem a etapa de inativação (desafio homólogo).

[00173]Como realizado em porcas no Exemplo 3, o sangue no dia do nascimento foi extraído dos leitões para obter soros, a fim de analisá-lo sorologicamente por ELISA e seroneutralização. Observou-se que todos os animais provenientes de porcas imunizadas continham altos níveis de anticorpos maternos específicos contra a toxina alfa C. perfringens do Tipo A e toxinas C. difficile TcdA/TcdB. Este exemplo demonstra que a transferência de anticorpo via colostro ocorreu eficientemente em todos os grupos imunizados.

[00174]Para determinar a eficácia da vacina em leitões, todos os leitões mortos e sobreviventes foram necropsiados (leitões sobreviventes necropsiados no final do estudo, dia 5 após o desafio). O escore de mortalidade e lesões macroscópicas foram determinados em todos os grupos experimentais.

[00175]O escore de lesões macroscópicas foi calculado pela soma dos escores de hidrotórax e ascite. Esses escores foram atribuídos como O, 1 ou 2 com base na ausência, lesão leve ou intensa observada, respectivamente.

[00176]A avaliação da sobrevida foi a variável mais relevante para avaliar a eficácia. Diferenças significativas foram observadas entre os grupos experimentais. Foi observado um aumento significativo da sobrevida em leitões nascidos de porcas imunizadas com a vacina da invenção (Fig. 5).

[00177] Também foi observada uma redução significativa no escore da lesão macroscópica entre os grupos imunizados (A, B, C) em relação ao grupo placebo (D) (Fig. 6).

[00178]Vacinas multivalentes adicionais da invenção também foram testadas em suínos e os animais foram desafiados também com cepas heterólogas C. difficile e C. perfringens do Tipo A. Os ensaios foram realizados com diferentes títulos de CPE para os toxóides TcdA e TcdB de C. diffícile e diferentes títulos de HA para o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A. Os ensaios incluíram títulos de CPE do toxóide C.. diffícile TecdA/TcdB tão baixos como 6,7, 7,0, 7,3, 7,8 e 8,0 CPE. Da mesma forma, os títulos de HA do toxóide alfa C. perfringens do Tipo A foram tão baixos quanto 11,0 e 12,0 HA. Além disso, também foram testadas atividades de 15.3, 16.3 e 17.3 para o toxóide alfa C. perfringens do Tipo A em combinação com os toxóides C. difficile TcdA/TcdB. Adicionalmente, estas vacinas foram produzidas seguindo os mesmos protocolos descritos nos exemplos acima. As vacinas também foram formuladas com os mesmos adjuvantes que os descritos nos exemplos acima. As vacinas testadas também incluíram a combinação com SUISENGO (LABORATORIOS HIPRA, S.A.) em uma relação de 1:1, como descrito anteriormente.

[00179]Os resultados obtidos com todas as formulações adicionais testadas em diferentes atividades de CPE e HA para C. difficile e C. perfringens do Tipo A, respectivamente, mostraram diferenças significativas nas respostas sorológicas. Em particular, os títulos de anticorpos nas porcas em gestação vacinadas foram significativamente maiores do que nas não vacinadas. Além disso, foram observadas diferenças significativas em relação à sobrevivência entre os leitões de porcas em gestação vacinadas e não vacinadas. As taxas de sobrevivência observadas também foram significativamente maiores no primeiro grupo.

[00180]A partir dos resultados obtidos com todas as formulações testadas, pode-se concluir que todas foram eficazes. Uma taxa de sobrevida acima de 50% e/ou média das lesões (soma dos escores hidrotórax e ascite) <1 para ambos os desafios foi um bom indicador da eficácia das vacinas testadas. Além disso, quando as vacinas experimentais dos exemplos foram associadas a outros antígenos, tais como os antígenos presentes no SUISENGO, não foi observada uma diminuição significativa da eficácia, demonstrando uma boa compatibilidade entre o SUISENGO e a vacina da invenção.

[00181]Todos os resultados obtidos sustentam que a resposta imunológica das vacinas da invenção nas porcas em gestação vacinadas se correlaciona totalmente com a resposta da imunidade passiva maternal transferida para a progênie, de modo que um efeito protetor das referidas vacinas seja obtido nos leitões, mesmo a partir do primeiro dia de vida.

Lista de Citações Literatura da Patente

[00182]Documento WO2014144567A2

[00183]Documento US20150140033A1 Literatura sem Patente

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2.Debast, S. B. et al. Clostridium difficile PCR ribotype 078 toxinotype V found in diarrhoeal pigs identical to isolates from affected humans. Environ. Microbiol. 11, 505—511 (2009).

3.Lawley, T. D. et al. Antibiotic treatment of Clostridium difficile carrier mice triggers a supershedder state, spore-mediated transmission, and severe disease in immunocompromised hosts. Infect. Immun. 77, 3661-3669 (2009).

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5.Voth, D. E. & Ballard, J. D. Clostridium difficile Toxins: Mechanism of Action and Role in Disease. Clin. Microbiol. Rev. 18, 247-263 (2005).

6.Barroso, L. A., Wang, S.-Z., Phelps, C. J., Johnson, J. L. & Wilkins, T. D. Nucleotide sequence of Clostridium difficile toxin B gene. Nucleic Acids Res. 18, 7499 (1990).

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8.Anderson, M. A. & Songer, J. G. Evaluation of two enzyme immunoassays for detection of Clostridium difficile toxins A and B in swine. Vet. Microbiol. 128, 204—- 206 (2008).

9.Songer, J. G. The emergence of Clostridium difficile as a pathogen of food animals. Anim. Heal. Res. Rev. 5, 321—326 (2004).

10.Songer, J. G. & Uzal, F. A. Clostridial Enteric Infections in Pigs. J. Vet. Diagnostic Investig. 17, 528—-536 (2005).

11.Chan, G. et al. The epidemiology of clostridium perfringens type a on Ontario swine farms, with special reference to cpb2-positive isolates. BMC Vet. Res. 8, 156 (2012).

12.Cruz-Junior, E. C. et al. A surveillance of enteropathogens in piglets from birth to seven days of age in Brazil. Pesqui. Vet. Bras. 33, 963—969 (2013).

13.Justin, N. et al. The first strain of Clostridium perfringens isolated from an avian source has an alpha-toxin with divergent structural and kinetic properties. Biochemistry 41, 6253-6262 (2002).

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóide de Clostridium difficile (C. difficile), CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir uma doença causada por Clostridium sp em gado.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o gado é suíno.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é para prevenir e/ou tratar infecções e/ou doenças entéricas de Clostridium sp.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o toxóide é selecionado a partir do grupo que consiste em toxóide A de C. difficile, toxóide B de C. difficile, toxóide Binário de C. difficile, e misturas dos mesmos.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição imunogênica compreende um toxóide A de C. diffícile e um toxóide B de C. diffícile.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição imunogênica compreende ainda um ou mais toxóide de Clostridium perfringens (C. perfringens).

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais toxóide de C. perfringens é um toxóide alfa de C. perfringens do Tipo A.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição imunogênica compreende ainda um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo de microrganismos que consiste no gênero Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila,

Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio e Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de suíno, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus, rotavírus, agente da síndrome do fracasso do desenvolvimento pós-desmame do suíno, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus torque teno (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), circovírus suíno e combinações dos mesmos.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais antígenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6; enterotoxóide de E. coli LT; toxóide de C. perfringens do Tipo C; toxóide de C. novyi do Tipo B; e combinações dos mesmos.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é para fornecer imunização passiva maternal à progênie de uma fêmea de gado.

11. Uso de uma vacina que compreende: (a) uma composição imunogênica compreendendo um ou mais toxóides de C. difficile, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável; CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir uma doença causada por Clostridium sp em gado.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a vacina compreende ainda um adjuvante.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é para fornecer imunidade passiva maternal à progênie de uma fêmea de gado.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser utilizado por via intranasal, intradérmica, transmucosa (mucosa e/ou submucosa), subcutânea, por meio de aerossol, intramuscular, intravenosa ou oral.

15. Composição imunogênica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) um ou mais toxóide de C. difficile selecionado a partir do grupo que consiste em um toxóide A de C. difficile (TcdA), um toxóide B de C. difficile (TcdB) e misturas dos mesmos; e (b) um ou mais toxóide de C. perfringens do Tipo A.

16. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um toxóide A de C. difficile, um toxóide B de C. diffícile e um toxóide alfa de C. perfringens do Tipo A.

17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um ou mais antígenos adicionais, em que o antígeno adicional é selecionado a partir de um grupo de microrganismos que consiste no gênero Actinobacillus, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Chlamydia e Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, — Enterococcus, —Erysipelothris,, Escherichia —Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Isospora, Lawsonia, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio e Yersinia, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de suíno, vírus da gripe suína, vírus da gastroenterite contagiosa, parvovírus suíno, vírus da encefalomiocardite, coronavírus,

rotavírus, agente da síndrome do fracasso do desenvolvimento pós-desmame do suíno, vírus da febre suína clássica, vírus da febre suína Africana, calicivírus, vírus torque teno (TTV), coronavírus de gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica suína (PED), circovírus suíno e combinações dos mesmos.

18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais antígenos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em adesinas fimbriais de E. coli F4ab, F4ac, F5 e F6, enterotoxóide de E. coliLT, toxóide de C. perfringens do Tipo C, toxóide de C. novyi do Tipo B e combinações dos mesmos.

19. Vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição imunogênica, como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 18, e um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

20. Vacina, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

21. Processo para preparar a vacina, como definida na reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de misturar a composição imunogênica, como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 18, com um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

22. Kit de vacinação CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma composição imunogênica, como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 18; (b) um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável; (c) opcionalmente um adjuvante; e (d) opcionalmente instruções para seu uso.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, e vacina, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é para fornecer imunidade passiva maternal à progênie de uma fêmea de gado, em que a composição imunogênica ou a vacina é formulada para ser administrada ao animal fêmea de gado em gestação antes do nascimento da progênie.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é para fornecer imunidade passiva maternal, em que o medicamento é formulado para ser administrado em, pelo menos, duas doses ao animal fêmea de gado em gestação.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser usado por via intranasal, intradérmica, transmucosa (mucosa e/ou submucosa), subcutânea, por meio de aerossol, intramuscular, intravenosa ou oral.