ES2903120T3 - Composición y procedimiento para el tratamiento y la prevención de infecciones por enterobacterias - Google Patents

Abstract

Proceso para la preparación de inmunoglobulinas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad entérica causada por bacterias E. coli en un individuo humano que comprende a) separar, como mínimo, el antígeno O O78 de las paredes celulares bacterianas o fragmentos de pared celular por cizalladura, b) eliminar las paredes celulares o los fragmentos de pared celular mediante centrifugación, c) preparar una formulación de vacuna que comprende el antígeno O O78, que está separado de paredes celulares o de fragmentos de pared celular, d) inmunizar un animal huésped no humano con la vacuna de la etapa (c) para inducir, de este modo, al animal huésped para que produzca calostro hiperinmune que comprende las inmunoglobulinas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y procedimiento para el tratamiento y la prevención de infecciones por enterobacterias

Sector de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de inmunoglobulinas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad entérica causada por bacterias E. colien un individuo humano.

De forma adicional, la presente invención se refiere al tratamiento y la profilaxis de trastornos gastrointestinales, a vacunas que comprenden antígenos de patógenos gastrointestinales y a materiales inmunes derivados de sangre, leche y huevos, producidos cuando se inyectan dichas vacunas a animales, entre los que se incluyen ganado y aves de corral.

Estado de la técnica anterior

Para los fines de exposición, la presente invención se explicará en su aplicación a E. coli enterotoxinógena (ETEC, enterotoxigenic E. coli) en seres humanos. Sin embargo, se entenderá que la parte más amplia de la presente invención no está limitada por esta aplicación de ejemplo.

La diarrea causada por E. coli enterotoxinógena (ETEC) causa un malestar significativo en los adultos y puede provocar la muerte por deshidratación de personas jóvenes y mayores. Una parte significativa de la diarrea que sufren los viajeros a destinos tales como México, África y el sudeste asiático, está causada por ETEC.

Un tratamiento que se utiliza actualmente para la diarrea del viajero es la terapia antibiótica profiláctica, por ejemplo, con amoxicilina. Sin embargo, la resistencia a los antibióticos ha reducido la eficacia de la terapia con antibióticos y son comunes efectos secundarios, tales como el estreñimiento o la diarrea.

La terapia sintomática se utiliza para los vómitos y la diarrea, por ejemplo, con clorhidrato de loperamida, sulfato de atropina y clorhidrato de difenoxilato. Sin embargo, el uso inadecuado de loperamida y atropina provoca estreñimiento severo y el uso inadecuado de difenoxilato puede provocar dependencia. Estos agentes tampoco son adecuados para su administración a niños.

Un tratamiento adicional incluye la terapia de reemplazo de líquidos con bebidas isotónicas. Sin embargo, la terapia de reemplazo de líquidos es meramente paliativa y no disminuye la diarrea clínica.

Además, el alivio sintomático y la terapia de líquidos tratarán los síntomas, pero no eliminarán la causa.

Se ha demostrado que la leche y los productos de huevo tienen funciones terapéuticas y preventivas potenciales en el alivio de los síntomas de los trastornos gastrointestinales.

Peterson y Campbell en la Patente US 3,376,198 enseñan la inmunización de ungulados productores de leche para producir anticuerpos o “principios protectores” contra bacterias y virus.

Carlander et al. en BioDrugs 2002; 16 (6): 433-7 enseñan la utilización de anticuerpos derivados de la yema de huevo para disminuir la bacteria Pasteurella en la abertura del tracto gastrointestinal (la boca).

Shimamoto et al. en Hepatogastroenterology 200249(45): 709-714 enseñan la utilización de anticuerpos específicos contra Helicobacter pylori generados en huevos para disminuir el número de bacterias H. pylori en el estómago de los pacientes.

Linggood et al. en la Patente US 4,971,794 enseñan la utilización de calostro bovino hiperinmune como fuente de anticuerpos contra E. coli. Las vacas se vacunaron utilizando preparaciones de pili de una mezcla de cepas. La patente enseña que la vacuna debe comprender antígenos de una pluralidad de cepas de E. coli que expresan pili de tipo 1, pili CFA 1, pili CFA 2 y pili K88. K88 está asociado con ETEC porcina.

Hastings en la Patente US 5,017,372 enseña la utilización de calostro hiperinmune de ungulados como fuente de anticuerpos contra E. coli. La vacuna de ungulado se preparó utilizando el siguiente procedimiento: se cultivaron diversas bacterias E. coli en condiciones tales que se produjeran CFA 1 o CFA 2 o ambos. A continuación, las bacterias se lisaron mediante ultrasonidos para liberar estos antígenos y toxinas termolábiles.

Freedman et al. en The Journal of Infectious Diseases 1998, 177: 662-7, enseñan la utilización de calostro hiperinmune como fuente de anticuerpos contra E. coli. Se preparó una vacuna cultivando cepas de bacterias en un caldo diseñado para optimizar la expresión de CFA y, a continuación, purificando el CFA mediante precipitación seguida de cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.

Tackett et al. en The New England Journal of Medicine, 12 de mayo de 1988, págs. 1240-1243, describen la combinación de una suspensión múltiple de células completas bacterianas inactivadas (tratadas con formaldehído o glutaraldehído) en una vacuna administrada a ganado. Las suspensiones de células completas comprenden E. coli de los serogrupos O: O6, O8, O15, O2O, O25, O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153 y O159, así como enterotoxinas termolábiles, toxina del cólera, CFA 1 y antígeno de superficie 3 de E. coli. Los antígenos O de E. coli, tales como O6, O8, O15, O2O, O25, O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153 y O159 son antígenos termoestables ubicados en la pared celular bacteriana y no en estructuras sobresalientes, tales como pili (fimbrias) o flagelos. Estos antígenos O están compuestos por restos de polisacárido unidos a un complejo de lipooligosacárido central común al material de la pared de la mayoría de las bacterias Gram negativas. Debido a la estrecha asociación entre los antígenos O y la pared celular, las vacunas basadas en el antígeno O se han preparado a partir de paredes celulares o bacterias completas inactivadas. Las endotoxinas de lipopolisacáridos son una parte normal de la pared celular externa de las bacterias y sus regiones tóxicas están incrustadas en la pared celular (véase “Endotoxins in Health and Disease, 1999 capítulo 12 y otros capítulos). Otra razón del hecho de que la práctica veterinaria normal utilice antígenos bacterianos de células completas en lugar de restos de antígenos O individuales es que los antígenos O son endotoxinas; la utilización de concentraciones altas de endotoxinas en ganado gestante se considera problemático en la técnica anterior en términos de bienestar animal y productividad.

La utilización de leche y productos derivados del huevo en la técnica anterior para la prevención de síntomas de trastornos gastrointestinales está asociada con una serie de problemas.

Es probable que la toxina del cólera (véase Tackett et al., 1988) sea difícil de registrar debido a su alta toxicidad. Además, es poco probable que las toxinas termolábiles, aunque altamente inmunógenas, sean protectoras.

La Patente US 4,298,597 se refiere a una vacuna para la diarrea causada por E. coii, que se produce a partir de K99 semipurificado y otros antígenos y organelos subcelulares concentrados de cepas de E. coli seleccionadas.

La Patente EP 0 102 831 A1 se refiere a la producción de anticuerpos mediante la hiperinmunización de un mamífero, tal como una vaca, con una vacuna derivada de bacterias E. coli.

El grado de protección obtenido a partir de los anticuerpos producidos, tal como anteriormente, es insatisfactorio. Uno de los problemas concomitantes es que se necesitan grandes cantidades de concentrado inmunológico para producir un resultado profiláctico satisfactorio. Cuando se utilizan antígenos de células completas, surge una enorme variedad de respuestas de anticuerpos y los ensayos del título de anticuerpos son difíciles de interpretar. Una cuestión clave es si un anticuerpo detectado en particular es protector o no. Las células bacterianas completas tienen muchos antígenos que es poco probable que estén relacionados con la protección. Además, es más probable que las vacunas que comprenden bacterias Gram negativas produzcan reacciones adversas a las vacunas y, por lo tanto, presenten problemas regulatorios debido a informes de ética animal desfavorables e informes de reacciones adversas a productos terapéuticos. Es probable que las reacciones adversas a las vacunas impidan que los productores lecheros participen en cualquier empresa de producción de anticuerpos de la leche.

La discusión del estado de la técnica anterior en el presente documento se incluye para explicar el contexto de la presente invención. Esto no debe tomarse como una admisión de que cualquier material al que se hace referencia fuera publicado, conocido o formara parte del conocimiento general común en cualquier país.

Características de la invención

Los inventores han realizado el sorprendente descubrimiento de que el tratamiento o la profilaxis mejorada de la enfermedad entérica causada por bacterias Gram negativas en animales y seres humanos se puede conseguir mediante la administración de una vacuna o mediante la administración de material hiperinmune generado contra dicha vacuna, en el que la vacuna se caracteriza por que comprende uno o más antígenos de la pared celular reactivos de una manera característica de los serotipos del grupo O o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento de tratamiento o profilaxis de enfermedad entérica causada por bacterias Gram negativas, incluyendo el procedimiento la etapa de administrar una vacuna o un material hiperinmune generado contra dicha vacuna a un individuo, en el que la vacuna comprende uno o más antígenos de la pared celular reactivos de una manera característica de los serotipos del grupo O, o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer una composición para su utilización en el tratamiento o la profilaxis de enfermedad entérica causada por bacterias Gram negativas, comprendiendo la composición material hiperinmune preparado inmunizando un animal huésped con una vacuna que comprende uno o más antígenos de la pared celular reactivos de una manera característica de serotipos del grupo O, o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

En un aspecto general de la presente invención, se da a conocer un procedimiento de preparación de material hiperinmune para el tratamiento o la profilaxis de disfunción gastrointestinal causada por bacterias Gram negativas enterotoxinógenas, tales como ETEC, siendo generados dichos materiales hiperinmunes contra una vacuna que comprende uno o más antígenos de la pared celular reactivos de una manera característica de serotipos del grupo O, o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular. De forma adicional, se describe la utilización de antígenos de la pared celular en la fabricación de material hiperinmune para el tratamiento o la profilaxis de enfermedad gastrointestinal causada por bacterias Gram negativas, tales como E. coli (ETEC), en el que los antígenos de la pared celular son reactivos de una manera característica de serotipos del grupo O, o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

De forma adicional, se describe un proceso para la preparación de inmunoglobulinas para el tratamiento o la profilaxis de enfermedad gastrointestinal en animales que comprende inmunizar a un animal huésped con una vacuna que comprende uno o más antígenos de la pared celular reactivos de una manera característica de los serotipos del grupo O, o reactivos de una manera característica de los antígenos asociados a lipopolisacáridos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular para inducir, de ese modo, al animal huésped a producir material hiperinmune que comprende las inmunoglobulinas.

En particular, la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de inmunoglobulinas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad entérica causada por bacterias E. coli en un individuo humano, que comprende

a) separar, como mínimo, el antígeno O O78 de las paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular por cizalladura,

b) eliminar las paredes celulares bacterianas o los fragmentos de pared celular mediante centrifugación, c) preparar una formulación de vacuna que comprende el antígeno O O78 que está separado de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular,

d) inmunizar un animal huésped no humano con la vacuna de la etapa (c) para inducir, de este modo, al animal huésped para que produzca calostro hiperinmune que comprende las inmunoglobulinas.

El material hiperinmune que se produce, según los procedimientos de la presente invención, es calostro hiperinmune o extracto de calostro hiperinmune.

Se considera que, como mínimo, algunos de los antígenos de la pared celular se separan de las paredes celulares bacterianas intactas o de fragmentos de pared celular si, después de la centrifugación para eliminar las células completas y los fragmentos celulares sustanciales, se puede detectar, como mínimo, el 10 % de dichos antígenos en el licor sobrenadante. Esta centrifugación debería realizarse en condiciones en las que a) dichos antígenos no formen micelas u otras estructuras agregadas y b) no se comprometa la integridad de la pared celular. De forma preferente, como mínimo, el 20 % de dichos antígenos se puede detectar en el licor sobrenadante, de forma más preferente, como mínimo, el 30 %. De forma preferente, dichos antígenos se separan sustancialmente de paredes celulares bacterianas intactas.

Otro procedimiento que se puede utilizar para determinar si los antígenos de la pared celular se separan o disocian de las paredes celulares bacterianas intactas o de los fragmentos de pared celular es el siguiente: 1) Realizar un ensayo en un licor acuoso que comprende antígenos O y paredes celulares bacterianas Gram negativas o fragmentos de pared celular para determinar el contenido total de antígeno O por ml utilizando condiciones vigorosas que degradarán la estructura de la pared celular y liberarán antígenos O; 2) Establecer qué concentración específica de células Gram negativas, cultivadas en cultivo, tienen un contenido de antígeno O equivalente al contenido de antígeno O determinado en el etapa 1; 3) Medir el contenido (cantidad) de pared celular por ml del cultivo celular identificado en la etapa 2. Este contenido de pared celular contendrá, de forma natural, el nivel de antígeno O medido en la etapa 1. 4) Comparar el contenido de pared celular en la etapa 3 con el contenido del licor original. Si es equivalente, se puede inferir que todos los antígenos O en el licor original tienen su asociación habitual con la pared celular. Sin embargo, si el contenido de pared celular del licor original es menor que el contenido de pared celular en la etapa 3, entonces el licor original contiene antígenos O en exceso del contenido esperado de antígeno O en las paredes celulares y, por lo tanto, parte del antígeno O se disocia de las paredes celulares o de fragmentos de pared. Si el peso del material celular Gram negativo (por ml) en la etapa 3 es W, entonces es preferente que el peso por ml de material de pared Gram negativo en el licor original sea menor de 0,8 W, de forma preferente menor de 0,3 W, de forma más preferente menor de 0,1 W.

La cantidad de antígeno asociado a lipopolisacáridos (antígeno O) presente en un licor acuoso se puede determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como calentamiento, digestión con proteinasa K y calentamiento adicional en presencia de fenol (véase el ejemplo 11). Lyngby et al. han descrito otros ensayos para antígenos asociados a lipopolisacáridos. Un procedimiento conveniente para estandarizar los antígenos asociados a lipopolisacáridos es compararlos con un cultivo celular que tiene un número específico de organismos Gram negativos por ml, o una cantidad específica de material de pared Gram negativo por ml. Puede ser ventajoso comparar con cultivos celulares que tengan 104, 106 o 108 organismos por ml, o superior.

La cantidad de material de pared celular Gram negativo (paredes intactas y fragmentos) presente en un licor acuoso se puede determinar utilizando ensayos para marcadores de pared celular específicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los peptidoglicanos están asociados con las paredes celulares de bacterias Gram negativas, y Li et al. han descrito procedimientos para analizar peptidoglicanos.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra un gel SDS-PAGE teñido con plata del análisis de LPS de una preparación de licor. En el gel SDS-PAGE se muestran muestras antes y después del pretratamiento fenólico. Después del tratamiento, este gel muestra una escalera de LPS típica. También se muestra en el carril izquierdo como control un lisado bacteriano hervido.

Descripción detallada de la invención

En la siguiente descripción detallada de la presente invención se hace referencia, de forma predominante, a la producción y utilización de calostro hiperinmune y extracto de calostro hiperinmune que se obtiene a partir de vacas inmunizadas de forma adecuada. Sin embargo, el alcance de la presente invención no debería considerarse restringido al mismo y se prevé que los procedimientos descritos también se pueden utilizar en la producción de yema de huevo hiperinmune y extracto de yema de huevo hiperinmune.

La preparación de calostro hiperinmune comprenderá, de forma general, inmunizar a un animal huésped, típicamente un animal ungulado, con una vacuna que comprende los antígenos de la pared celular del serotipo del grupo O, como mínimo, algunos de los cuales se separan de paredes celulares intactas. La vacuna se utiliza para inducir la producción en el animal huésped de inmunoglobulinas que se recuperan en la leche del huésped.

El calostro hiperinmune puede utilizarse en el tratamiento o la profilaxis de disfunción gastrointestinal en animales, entre los que se incluyen seres humanos y animales no humanos. El calostro es particularmente útil en el tratamiento o la profilaxis en seres humanos, entre los que se incluyen seres humanos adultos y niños. Sin embargo, el calostro puede utilizarse en el tratamiento de animales no humanos, entre los que se incluyen lechones.

El calostro hiperinmune del animal huésped inmunizado con la vacuna de antígenos de la pared celular puede administrarse directamente en forma de leche. Alternativamente, la leche de calostro hiperinmune puede tratarse mediante procedimientos conocidos en la técnica para enriquecer o aislar las inmunoglobulinas. Así, el producto puede ser leche entera, leche desnatada o proteína de suero. Los productos derivados del calostro hiperinmune se pueden preparar en preparaciones, tales como aditivos alimentarios, soluciones acuosas, preparaciones oleosas, emulsiones, geles, etc., y estas preparaciones se pueden administrar por vía oral, tópica, rectal, nasal, bucal o vaginal. Las preparaciones pueden administrarse en formulaciones de dosificación que contienen vehículos aceptables no tóxicos convencionales y también pueden incluir uno o más aditivos aceptables, entre los que se incluyen sales, polímeros, disolventes, tampones, excipientes, agentes de carga, diluyentes, excipientes, agentes de suspensión, agentes lubricantes, adyuvantes, vehículos, sistemas de administración, emulsionantes, disgregantes, absorbentes, conservantes, surfactantes, colorantes, aromatizantes o edulcorantes. Una forma de dosificación preferente de la presente invención es un polvo para incorporar en bebidas, píldoras, jarabes, cápsulas, comprimidos, gránulos, perlas, grageas masticables o aditivos alimentarios, utilizando técnicas conocidas en la técnica.

En el caso de que la composición se administre como un comprimido, el comprimido se puede preparar prensando o moldeando el principio activo, con uno o más ingredientes accesorios incluidos opcionalmente. Los comprimidos prensados se pueden preparar prensando, en una máquina adecuada, el principio activo en una forma que fluye libremente, tal como un polvo o gránulos, mezclado, opcionalmente, con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, surfactante o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar en una máquina adecuada, moldeando juntos una mezcla del principio activo en polvo y un vehículo adecuado, humedecido con un diluyente líquido inerte.

Los antígenos O se pueden separar de las paredes celulares bacterianas mediante la aplicación de una cantidad eficaz de cizalladura, homogeneización o calor o mediante combinaciones eficaces de los mismos. Las condiciones preferentes utilizadas para efectuar la separación se pueden establecer llevando a cabo la siguiente prueba: centrifugar la suspensión de células completas que se han tratado para efectuar la separación y eliminar las células completas y los fragmentos celulares sustanciales. Recoger el licor libre de células resultante y hacerlo pasar por un gel según el siguiente protocolo:

A) Análisis de LPS de licores libres de geles

Añadir un volumen igual de solución estándar de fenol a una muestra de licor obtenida tal como se describió anteriormente, agitar con vórtex e incubar en un baño de agua a 65 oC durante 15 minutos, agitando con vórtex cada 5 minutos para desnaturalizar la proteína en el licor.

Centrifugar durante 10 minutos a 4 oC y recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo.

Añadir 1 volumen de tampón Laemmli 3x a 2 volúmenes de muestra y separar en un gel SDS-PAGE al 15 %.

B) Tinción con plata de LPS

El siguiente procedimiento se utiliza para teñir, de forma preferente, LPS (Hitchcock y Brown, 1983):

(i) fijación durante la noche en 200 ml de isopropanol al 25 % (vol/vol) en ácido acético al 7 % (vol/vol)

(ii) 5 minutos de oxidación en 150 ml de agua destilada con 1,05 g de ácido peryódico y 4 ml de isopropanol al 25 % (vol/vol) en ácido acético al 7 % (vol/vol) (solución preparada justo antes de utilizar)

(iii) ocho lavados de 30 minutos con 200 ml de agua destilada cada vez

(iv) tinción con plata de 10 minutos en una solución que consiste en NaOH 0,1 M (28 ml), hidróxido de amonio concentrado (29,4 %), nitrato de plata al 20 % (p/vol) (5 ml) y agua destilada (115 ml) (preparar la solución justo antes de utilizar y agitar constantemente mientras se hace)

(v) cuatro lavados de 10 minutos con 200 ml de agua destilada cada vez

(vi) 5-10 minutos de revelado en 250 ml de solución reveladora (ácido cítrico [50 mg], formaldehído al 37 % [0,5 ml], agua destilada [cantidad suficiente para preparar 1 litro de solución] preparada justo antes de su utilización a una temperatura óptima de 26 oC para ayudar a la tinción preferencial de LPS

(vii) 1 hora en solución de parada (200 ml de agua destilada más 10 ml de ácido acético al 7 % [vol/vol]) (viii) almacenar el gel en glicerol al 5 % y secar entre láminas de celulosa

En una realización particularmente preferente de la presente invención, los antígenos O se separan de las paredes celulares bacterianas agitando el licor, por ejemplo, utilizando un homogeneizador, típicamente un homogeneizador que comprende un rotor y un estator. De forma preferente, la relación entre la velocidad periférica del rotor (en metros por segundo) y el espacio entre el rotor y el estator (en milímetros) está en un intervalo de 0,2 a 20, de forma preferente, de 0,4 a 12, de forma más preferente, de 0,8 a 6 y, de la forma más preferente, de 1 a 4. Se pueden utilizar otros homogeneizadores en los que la región de cizalladura máxima tiene un valor de cizalladura similar al valor de cizalladura en los espacios entre el rotor y el estator anteriores. De forma preferente, los antígenos O se separan de la pared celular mediante tratamiento térmico en el intervalo de 40 a 80 oC, de forma preferente de 50 a 70 oC. La duración del tratamiento es, de forma preferente, de 10 a 200 minutos, de forma más preferente, de 30 a 60 minutos.

Es preferente que la vacuna comprenda, además, los antígenos de pilus o similares a de pilus CFA-1 o CFA-2 u otros CFA o supuestos CFA o combinaciones de los mismos, estando, como mínimo, algunos de dichos antígenos separados de las paredes celulares bacterianas intactas. Estos antígenos pueden estar asociados con pili que se han desprendido de la pared celular. Se han descrito en la técnica procedimientos para preparar dichos antígenos o pili separados, por ejemplo, Linggood en la Patente US 4,971,794.

Es preferente que las bacterias de las que se aísla cada tipo de antígeno O se cultiven en sistemas de cultivo bacterianos separados, y después de la separación del antígeno O de las bacterias, los antígenos componentes se añaden juntos para formar un componente de la vacuna.

Los antígenos del serotipo O en la vacuna comprenden O78. De forma adicional, los antígenos del serotipo O en la vacuna se seleccionan entre el conjunto: O6, O8, O15, O25, O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153, O159 y otros antígenos del serotipo O asociados con E. colienterotoxinógena.

El licor que contiene el antígeno O separado puede contener material extraño. De forma preferente, el licor se purifica, de forma adicional, mediante precipitación de proteínas extrañas con sulfato de amonio, lo que implica un aumento gradual de la concentración de sulfato de amonio del 0 al 20 %, y centrifugar el material extraño.

De forma preferente, el antígeno O separado se concentra más. De forma preferente, al licor anterior al 20 % de sulfato de amonio, se añade más sulfato de amonio hasta una concentración final del 40 % y se centrifuga para proporcionar antígenos O en el precipitado. El sulfato de amonio se puede eliminar mediante resuspensión y diálisis, por ejemplo, a través de una membrana que tiene un tamaño de corte en el intervalo de 1.500 a 10.000 unidades de peso molecular (Dalton).

El material dializado está constituido, de forma preferente, en el intervalo de 0,1 a 10 mg/ml de proteína, de forma preferente, de 0,5 a 3 mg/ml de proteína, y se añade a un adyuvante de vacuna como Montanide (vendido por Seppic, París, Francia), hidróxido de aluminio (disponible de Sigma Chemical Company, St Louis, MO, Estados Unidos) o QuilA (un ISCOM que consiste en micelas de saponina/colesterol modificadas con antígeno y descrito en la Patente US 6,383,498) u otros adyuvantes de vacunas conocidos en la técnica.

En una forma preferente de la presente invención, el adyuvante utilizado para preparar una emulsión de vacuna es “Montanide ISA 206”, un adyuvante veterinario aprobado por la NRA fabricado por Seppic y suministrado por Tall Bennett en Australia. Montanide ISA 206 es una composición inmunoestimulante que contiene ésteres de ácido octadecenoico y anhidromanitol en solución oleosa. Ha sido desarrollado para la fabricación de vacunas de aceites mixtos y está controlado toxicológicamente y es de alta pureza. Este adyuvante permite la preparación de una emulsión de inmunógeno/adyuvante de tipo mixto “agua en aceite en agua” (w/o/w), que es eficaz, bien tolerada, muy fluida y fácil de inyectar. Este tipo de formulación produce una respuesta inmune rápida a partir de los antígenos disponibles inmediatamente presentes en la fase acuosa y una respuesta inmune duradera a partir del antígeno confinado en la fase oleosa.

De forma preferente, se añade un volumen de material dializado reconstituido a de 0,3 a 3 volúmenes de adyuvante de vacuna, de forma preferente, de 0,7 a 1,5 volúmenes de adyuvante de vacuna. Se conocen en la técnica muchos procedimientos de análisis de proteínas, por ejemplo, el ensayo de proteínas de Lowrey (J. Biol Chem 1951, 193: 265-275).

El régimen de vacunación que conduce a la producción de calostro hiperinmune implica, de forma preferente, la inyección a un animal con de 0,3 a 15 ml de vacuna en de 2 a 8 ocasiones antes del parto. El período de tiempo entre vacunaciones sucesivas es de 1 a 4 semanas, de forma más preferente de 2 a 3 semanas. El calostro se deriva de mamíferos, de forma preferente ungulados, de forma más preferente vacas lecheras. Los procedimientos para la producción y el procesamiento de calostro se dan a conocer en la Patente US 5,780,028.

El calostro hiperinmune procesado se puede formular como un comprimido o como un polvo dentro de una cápsula o como un aditivo para una mezcla de bebida, tal como se describe en la Patente US 5,780,028.

De forma preferente, la formulación que comprende calostro hiperinmune comprende, además, un resto antimicrobiano de calidad alimentaria, tal como extractos de cítricos y antisépticos a base de yodo. De forma preferente, el resto antimicrobiano es el extracto de semilla de pomelo de la familia química difenol hidroxibenceno vendido con el nombre de producto Citridal por NutriBiotics de Ripton, Vermont, Estados Unidos.

Un calostro hiperinmune preferente para una formulación de dosis oral comprende anticuerpos contra una pluralidad de antígenos. Dicho calostro hiperinmune preferente se prepara separando dichos antígenos en dos o más lotes de vacunas y vacunando dos o más rebaños de ganado con lotes individuales y mezclando el calostro de los rebaños. De forma preferente, la vacuna comprenderá el antígeno de E. coli O78 y otros antígenos seleccionados entre el conjunto que consiste en O6, O8, O9, O15, O2O, O25, O27, O29, O30, O63, O64, O88, O105, O114, O115, O126, O127, O128, O148, O153, O159.

De forma preferente, un lote de vacuna comprenderá el antígeno de E. coli O78 y el antígeno de pilus CFA1, y el otro lote de vacuna comprenderá antígenos seleccionados entre el conjunto que consiste en antígenos del serotipo O O6, O8, O15, O25, O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153, O159 y antígeno de pilus CFA 2. De forma preferente, los antígenos del serotipo O se seleccionan entre el conjunto O6, O8, O78, O128.

Aunque en su aspecto más amplio la presente invención puede aplicarse en este tratamiento o profilaxis de enfermedades gastrointestinales causadas por una variedad de organismos, es particularmente adecuada para el tratamiento de infecciones gastrointestinales de E. coli enterotoxinógena y particularmente en el tratamiento o la profilaxis de la diarrea del viajero.

Por consiguiente, en una realización particularmente preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento o utilización, tal como se definió anteriormente, en el que la bacteria Gram negativa es E. coli. En la realización más preferente, el procedimiento se utiliza en la profilaxis o el tratamiento de la diarrea.

La presente invención se describirá, a continuación, con referencia a los siguientes ejemplos. Debe entenderse que los ejemplos se proporcionan a modo de ilustración de realizaciones de la presente invención y que no limitan en modo alguno el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 - Fabricación de una vacuna de cepa única contra E. coli

Este ejemplo describe la preparación de una vacuna, según la presente invención, en la que el antígeno de pared es O78 y el antígeno de pilus es CFA1. El procedimiento es el siguiente.

Día 0

(Etapa A) Rejuvenecimiento de la cepa

La cepa a rejuvenecer es E. coli H10407 (Taurchek et al, PNAS Estados Unidos 2003, 99: 7066-7071). Tomar 2 placas de CFA (Evans et al, Infect Immun 1977; 18: 330-337) del frigorífico de medios y colocarlas en la cabina de seguridad biológica. Retirar el vial que contiene E. coli H 10407 del depósito de nitrógeno líquido y colocar en la cabina de seguridad biológica. Abrir el vial y utilizar un asa estéril para retirar una pequeña cantidad de material congelado. Sembrar por estrías este material sobre placas de CFA. Colocar las “placas de rejuvenecimiento” en la incubadora a 37 oC durante la noche en condiciones aeróbicas.

Día 1

(Etapa B) Inoculación de la “suspensión inicial”

Examinar cada “placa de rejuvenecimiento” en busca de crecimiento puro. Si hay crecimiento puro, proseguir.

Trabajando en la cabina de seguridad biológica, retirar varias colonias de una “placa de rejuvenecimiento” con un asa estéril e inocular una botella McCartney que contenga 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2. Utilizar botellas McCartney y PBS que se hayan esterilizado en autoclave.

(Etapa C) Inoculación de “placas de vacuna”

Inocular 50 p.l de “suspensión inicial” en cada una de las múltiples placas de CFA (placas de nutrientes microbiológicos formuladas para permitir la producción de CFA).

Las placas de CFA se preparan utilizando casaminoácidos al 1 % (BD Difco) y extracto de levadura al 0,15 % (Oxoid) en agar al 2 % que contenía MgSO4 (anhidro) al 0,005 % y MnCl2 (tetrahidratado) al 0,0005 %, tal como se describe en la preparación del medio (Evans et al., Infect Immun 1977; 18: 330-337). Colocar las “placas de vacuna” en la incubadora a 37 oC durante 18-24 horas en condiciones aeróbicas.

Día 2

(Etapa D) Prueba de hemaglutinación en “placas de vacuna” para probar la producción de pilus

Llevar a cabo la prueba de hemaglutinación (Evans et al., Infect Immun 1977; 18: 330-337). Probar una “placa de vacuna” para cada cepa que se utilizará en el lote. Si es positivo, proseguir.

(Etapa E) Lavado de “placas de vacunas”

Retirar las “placas de vacuna” de la incubadora. Comprobar en cada una la contaminación y rechazar las placas afectadas.

Trabajando en la cabina de seguridad biológica, utilizar 1,5-2,0 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M estéril (pH 7,2) para lavar el crecimiento bacteriano de las superficies de las “placas de vacuna” en una botella de Schott estéril. Enfriar previamente el tampón en hielo antes de su utilización. Añadir azida de sodio hasta una concentración final del 0,05 % a los “lavados de vacunas”. Mantener los “lavados de vacunas” en hielo durante, como mínimo, 30 minutos antes de comenzar la homogeneización.

(Etapa F) Enumeración de los “lavados de vacunas”

Realizar la enumeración de los “lavados de vacunas”. Asegurarse de que el material se haya agitado completamente para dispersar todos los grumos y que las diluciones seleccionadas sean adecuadas para el grado de concentración de células bacterianas en los lavados para el lote que se está fabricando.

(Etapa G) Muestreo de pureza

Reunir materiales suficientes para realizar pruebas de pureza en cada “lavado de vacunas” (es decir, 3 placas HBA, 3 placas TSA y 3 placas MAC).

Trabajando en la cabina de seguridad biológica, sembrar por estrías cada “lavado de vacuna” en 3 placas HBA, 3 TSA y 3 MAC, en placas para colonias individuales. Colocar las placas en la incubadora a 37 oC en condiciones aeróbicas.

Día 3

(Etapa H) Primera lectura de las “placas de prueba de pureza”

Realizar la primera lectura en las “placas de prueba de pureza”. Si las placas contienen solo colonias de E. coli, proseguir.

(Etapa I) Homogeneización del “lavado de vacunas”

Homogeneizar el “lavado de vacunas” en el homogeneizador durante un total de 15 minutos a intervalos de un minuto, con un minuto de enfriamiento en un baño de hielo entre cada intervalo. Centrifugar el “lavado de vacunas homogeneizado” en la centrífuga de alta velocidad a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 oC. Conservar los sobrenadantes (HVW super 1) y almacenar a 4 oC durante 1-3 días.

Día 4

(Etapa J) Segunda lectura de las “placas de prueba de pureza”

Realizar la segunda comprobación de las placas de prueba de pureza. Si las placas contienen solo colonias puras de E. col, proseguir.

Día 6

(Etapa K) Separación de la fracción de LPS

Centrifugar el “HVW super 1” en la centrífuga de alta velocidad a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 oC. Conservar el sobrenadante (HVW super 2).

Añadir sulfato de amonio saturado estéril al “HVW super 2” lentamente durante 1 hora hasta alcanzar una saturación del 20 %. Agitar el “HVW super 2” en un agitador magnético mientras se añade el sulfato de amonio saturado. Al final de la hora, dejar que el material se equilibre durante 30 minutos.

Centrifugar el “HVW super 2” en la centrífuga de alta velocidad a 12.000 x g durante 20 minutos. Conservar el sobrenadante (HVW super 3).

Añadir sulfato de amonio saturado estéril al “HVW super 3” lentamente durante 1 hora hasta alcanzar el 40 % de saturación. Agitar el “HVW super 3” en un agitador magnético mientras se añade el sulfato de amonio saturado. Al final de la hora, dejar que el material se equilibre durante 30 minutos.

Centrifugar el “HVW super 3” en la centrífuga de alta velocidad a 12.000 x g durante 20 minutos. Conservar el sedimento (fracción de LPS). Resuspender la “fracción de LPS” en tampón de fosfato de sodio 0,05 M frío pH 7,2 en una proporción de 10 ml de tampón por cada 250 placas de CFA que se utilizaron para producir el “lavado de vacuna” a partir del cual se derivó originalmente la “fracción de LPS”.

(Etapa L) Diálisis de “fracciones de LPS”

Dializar la fracción de “LPS”, utilizando una membrana de corte de 3.500 PM, durante 24-48 horas a 4 oC frente a 250-1.000 volúmenes de tampón de fosfato de sodio 0,05 M frío, pH 7,2. Cambiar el tampón cada 2-8 horas durante la diálisis. Cuando se haya completado, conservar el “dializado de LPS” en hielo hasta que esté listo para ensayar el contenido de proteína.

Día 7

(Etapa M) Ensayo del contenido de proteínas del “dializado de LPS”

Utilizar el ensayo de proteínas de Lowry para medir el contenido de proteínas de cada “dializado de LPS”. Sobre la base de los resultados, diluir cada “dializado de LPS” para que contenga 1 mg/ml de proteína en tampón fosfato de sodio 0,05 M pH 7,2 y almacenar en una botella Schott estéril.

(Etapa N) Inactivación de la vacuna

Añadir formaldehído a cada “dializado de LPS” de modo que la concentración final de formalina sea del 0,3 %. Almacenar el “dializado de LPS formalinizado” a 4 oC durante 3 días.

Día 10

(Etapa O) Comprobación de esterilidad, parte 1

Realizar una comprobación básica de esterilidad en cada “dializado de LPS formalinizado” inoculando 0,5 ml de cada uno en 3 caldos de tubo de TSB. Colocar los “tubos de control de esterilidad” en la incubadora a 37 oC en condiciones aeróbicas.

Día 14

(Etapa P) Comprobación de esterilidad, parte 2

Comprobar los “tubos de control de esterilidad” para detectar ausencia de crecimiento. Si el crecimiento puro está ausente, proseguir.

(Etapa Q) Almacenamiento de “dializado de pilus/LPS formalinizado”

Para un almacenamiento más prolongado del “dializado de LPS formalinizado”, colocarlo a menos 20 oC.

Día 14 o posterior

(Etapa R) Adición de adyuvante, fase uno

Llevar el “dializado de LPS formalinizado” a 30 oC colocándolo en un baño de agua. Al mismo tiempo, llevar un volumen equivalente del adyuvante (Montanide ISA 206) a 30 oC en un baño de agua.

Verter el adyuvante en un vaso de precipitados grande que haya sido esterilizado en autoclave (S13). Utilizar el mezclador de laboratorio Ika con la paleta de 3 palas para agitar el adyuvante a 200 RPM. Añadir el “dializado de LPS formalinizado” gradualmente durante 2 minutos. Aumentar la velocidad a 2.000 RPM y mantenerla durante 10 minutos.

Almacenar a 4 oC durante 24 horas.

Día 15 o posterior

(Etapa S) Adición de adyuvante, fase dos

El día después de la etapa L anterior, llevar la “vacuna con adyuvante de la primera fase” a 30 oC en un baño de agua. Verter el material calentado en un vaso de precipitados grande que haya sido esterilizado en autoclave (S13). Utilizar el mezclador de laboratorio Ika con la paleta de 3 palas para agitar el material a 200 RPM durante 2 minutos. Aumentar la velocidad a 2.000 RPM y mantenerla durante 10 minutos. Almacenar a 4 oC durante 24 horas.

(Etapa T) Comprobación de la calidad de la emulsión

El día después de la etapa M anterior, utilizar una pipeta Pasteur estéril para tomar una pequeña alícuota de la “vacuna con adyuvante de la segunda fase”. Llenar un vaso de precipitados de 250 ml con aproximadamente 200 ml de agua. Colocar una gota de la alícuota sobre la superficie del agua. Si la gota se diluye parcialmente, dando una apariencia lechosa al agua, entonces es agua en aceite en agua y es aceptable. Almacenar a 4 oC durante 24 horas. Día 16 o posterior

(Etapa U) Llenado

Trabajando en la cabina de seguridad biológica, utilizar un embudo y un recipiente de medición que hayan sido esterilizados en autoclave para medir el volumen adecuado de la vacuna. Para paquetes de almohadillas de 250 ml, este es 253-255 ml. Verter este material en paquetes de almohadillas que hayan sido esterilizados por radiación gamma. A continuación, se utilizan tapones de goma y tapas de metal esterilizados en autoclave para cerrar la parte superior de cada paquete de almohadillas. A continuación, este proceso se repite hasta que se haya llenado el número adecuado de paquetes de almohadillas para el lote.

(Etapa V) Muestreo de retención

Adquirir una muestra de retención.

(Etapa W) Muestreo de control de calidad para pruebas de esterilidad y pruebas de nivel de formalina libre Utilizando el material sobrante al final del proceso de llenado, llenar una muestra de 20 ml en una botella MacCartney que haya sido esterilizada en autoclave. Utilizar el mismo embudo y recipiente de medición que se utilizaron para llenar el resto del ciclo. Utilizar esta muestra para realizar pruebas de esterilidad y pruebas de nivel de formalina libre.

(Etapa X) Etiquetado

Etiquetar cada lote.

Almacenar en frigorífico.

(Etapa Y) Primera comprobación de esterilidad

Cuatro días después del llenado, realizar la primera comprobación de los “tubos de prueba de esterilidad” y las “placas de prueba de esterilidad”, tal como se describe en Pruebas de esterilidad.

(Etapa Z) Segunda comprobación de esterilidad

Siete días después del llenado, realizar la segunda comprobación de los “tubos de prueba de esterilidad” y las “placas de prueba de esterilidad”, tal como se describe en Pruebas de esterilidad.

(Etapa AA) Tercera comprobación de esterilidad

Once días después del llenado, realizar la tercera comprobación de los “tubos de prueba de esterilidad”, tal como se describe en Pruebas de esterilidad.

(Etapa AB) Cuarta comprobación de esterilidad

Catorce días después del llenado, realizar la cuarta verificación de los “tubos de prueba de esterilidad”, tal como se describe en Pruebas de esterilidad.

(Etapa AC) Utilización del producto

El lote es aceptable para su utilización si cumple las siguientes especificaciones:

• Aspecto físico: un líquido cremoso lechoso en un paquete de almohadillas de plástico etiquetado con la etiqueta de formato aprobado que incluye el nombre “Vacuna contra E. coliAnadis”.

• Pureza: presencia de un crecimiento puro de E. coli en todas las placas de prueba de pureza para cada cepa en el momento de la primera y la segunda comprobaciones de pureza.

• Esterilidad: ausencia de cualquier indicación de crecimiento en placas o tubos en el momento de la comprobación de esterilidad y la prueba de esterilidad formal inicial, o ausencia de cualquier signo de crecimiento durante la repetición de la prueba, tal como se describe en Pruebas de esterilidad.

• Potencia: mayor o igual a 1,0 mg de proteína por ml de producto terminado.

• Nivel de formalina libre: el nivel en la muestra de control de calidad no es superior al 0,002 % p/v.

• Calidad de la emulsión: una gota de la vacuna emulsionada colocada en agua se diluye parcialmente, dando al agua un aspecto lechoso.

Ejemplo 2 - Preparación de calostro hiperinmune

La vacuna preparada, según el ejemplo 1, se utilizó para la preparación de calostro hiperinmune, de la siguiente manera.

Las vacas son inmunizadas, por un veterinario titulado, con una inyección de 2 ml de una emulsión de la vacuna en adyuvante en el tejido muscular del lado del cuello. Se administran hasta 5 inyecciones en 2 intervalos semanales durante los meses 6 a 8,5 de gestación, cesando 1 mes antes del parto. Se toman muestras de sangre de una selección de las vacas inmunizadas y se analizan para determinar el nivel de anticuerpos específicos. Los resultados de estos ensayos se utilizan para determinar si se ha conseguido un título satisfactorio.

Para limitar la posibilidad de autoinoculación, las inmunizaciones solo las realiza un veterinario titulado, con la ayuda de personal experimentado en el manejo de ganado. Durante la inmunización, las vacas se sujetan de forma adecuada, por ejemplo, en una manga para hacienda, un brete de contención o en un carrusel de ordeño giratorio, para dar un acceso claro al músculo del cuello. El sitio de inyección se rasura y desinfecta antes de la inmunización y las inyecciones posteriores se administran en sitios alternativos en el mismo animal.

El procedimiento de fabricación después de la recogida del calostro hiperinmune crudo del primer ordeño se describe a continuación.

Ejemplo 3 - Preparación de vacunas

Este ejemplo describe la preparación de una vacuna, según un procedimiento típico de las enseñanzas del estado de la técnica anterior.

Se prepararon vacunas bovinas y anticuerpos calostrales contra la cepa H10407 de E. coli, antígenos de pilus y toxinas, según los procedimientos descritos a continuación.

Preparación de anticuerpos calostrales. Los anticuerpos se aislaron del calostro de vacas lecheras inmunizadas con la cepa de E. colienterotoxinógena H10407 y una selección de antígenos de pilus y enterotoxina termolábil (LT). Las vacas estuvieron bajo supervisión veterinaria y fueron alojadas en una granja lechera experimental. Véase J. Husu et al. (1993).

Preparación de vacunas. Se prepararon antígenos bacterianos para la producción de las vacunas a partir de la cepa de E. coli enterotoxinógena H10407 (O78:H11 CFA/I+ ST+ LT+). Se purificaron tres antígenos de esta cepa:

(i) suspensión inactivada con formalina de células completas (109 bacterias por ml);

(ii) enterotoxina termolábil (2 mg/ml)

(iii) CFA/I (2 mg/ml)

Las vacunas se prepararon emulsionando un volumen igual de cada antígeno con el mismo volumen de adyuvante incompleto de Freund.

Además de los antígenos anteriores, se utilizó una vacuna comercial con adyuvante oleoso que contenía antígenos de pilus purificados de E. coli K88ac, K99 y 987P (Vacuna contra E. coli; Commonwealth Serum Laboratories Ltd.). Procesamiento de calostros y aislamiento de inmunoglobulinas de suero. Se recogió leche de calostro de vacas inmunizadas durante las primeras semanas de lactancia. La leche se recogió en recipientes individuales y se mantuvo congelada hasta su procesamiento. Brevemente, la grasa de la leche se eliminó por centrifugación y la leche desnatada se pasteurizó a 56 oC durante 30 minutos y, a continuación, se coaguló mediante adición de cuajo. Después de eliminar la cuajada de leche que contenía caseína, el suero se centrifugó y se desechó el precipitado fino. Se añadió lentamente al suero un volumen igual de solución saturada de sulfato de amonio con pérdida continua. Después de la centrifugación, se guardó el precipitado resultante y se desechó el sobrenadante que contenía lactosa y sales.

El precipitado se disolvió en NaCl 0,32 M al 30 % del volumen original. Esta solución se dializó extensamente frente a 5 volúmenes de solución salina utilizando un aparato Amicon con el cartucho SIY 30 de membrana en espiral. La solución de anticuerpo se concentró hasta el 10 % de sólidos, se congeló rápidamente y se liofilizó. Finalmente, el polvo de anticuerpo liofilizado se esterilizó mediante irradiación y (25 KGrays). Véase Hilpert (1984), Antibodies - A Laboratory Manual (1988) y Cravioto et al. (1982).

Ejemplo 4 - Determinación de antígenos O separados de la pared celular

Este ejemplo proporciona un procedimiento para generar 106 ufc/ml de bacterias Gram negativas, para eliminar los antígenos O de estas bacterias y para determinar la cantidad de antígenos O derivados de la pared celular de estas bacterias. Los procedimientos de este ejemplo permiten calcular un “equivalente bacteriano de LPS”, es decir, la cantidad de bacterias que contendrán una determinada cantidad de LPS. En el siguiente ejemplo, 3 mg por ml de LPS equivalen a 106 ufc/ml de bacterias ETEC Gram negativas.

Reactivos

Solución salina tamponada con fosfato (PBS)

Tampón de lisis SDS-PAGE (20 ml) preparado de la siguiente manera:

• Añadir 40 pl de 2-mercaptoetanol por 960 pl de tampón justo antes de la utilización (4 %)

Procedimiento

1. Las cepas bacterianas se cultivan durante la noche a 37 oC en placas de agar nutritivo (NA).

2. Al día siguiente, las bacterias se recogen en PBS y se ajustan hasta un equivalente de McFarlane 0,5 (1 x 108 UFC/ml).

3. A continuación, la suspensión bacteriana se diluye 100 veces en PBS para dar 1 x 106 UFC/ml.

4. Esta preparación se dispensa en alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf estériles y se centrifuga a 13.000 rpm durante tres minutos para sedimentar las bacterias.

5. Después de la centrifugación, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 50 pl de tampón de lisis SDS-PAGE.

6. A continuación, las muestras se hierven durante diez minutos, se enfrían brevemente en hielo y se pulsan en la centrífuga para recoger la condensación.

7. Se añaden 2,5 pl de proteinasa K (20 mg/ml) a cada tubo y se incuban en un baño de agua a 60 oC durante una hora.

8. Después de la incubación, se añade un volumen igual de fenol a cada tubo, se agita con vórtex y se incuban adicionalmente en un baño de agua a 65 oC durante 15 minutos, agitando con vórtex cada cinco minutos.

9. A continuación, la muestra se centrifuga durante diez minutos a 4 oC y la fase acuosa se recupera en un tubo nuevo para la cuantificación de LPS.

Cuantificación de LPS

La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) cromógeno es una prueba cuantitativa para la endotoxina bacteriana Gram negativa. Se mezcla una muestra con el LAL suministrado en el kit y se incuba a 37 oC durante diez minutos. A continuación, se mezcla una solución de sustrato con la muestra de LAL y se incuba a 37 oC durante seis minutos adicionales. La reacción se detiene con SDS al 10 %. Si hay endotoxina presente en la muestra, se desarrollará un color amarillo medido a una absorbancia de 405 nm. La cantidad de endotoxina en la muestra se mide con la utilización de una curva patrón de endotoxina.

1. La muestra de LPS extraída con fenol se diluye a 1 ml en agua con reactivo LAL y se preparan diluciones adicionales para el ensayo en el ensayo de LAL (1/10, 1/50, 1/250, 1/1.250)

2. Se preparan diluciones estándar de endotoxina para la curva patrón (3 pg/ml-0,02 pg/ml) haciendo diluciones en serie dos veces en agua con reactivo LAL.

3. Procedimiento para bandeja de 96 pocillos:

Muestra Blanco Muestra de prueba o patrón de endotoxina 50 pl -Agua con reactivo LAL - 50 pl LAL 50 pl 50 pl • Mezclar e incubar a 37 oC durante diez minutos. Sustrato cromógeno 100 pl 100 pl • Mezclar e incubar a 37 oC durante seis minutos adicionales. Tampón de parada (SDS al 10 %) 50 pl 50 pl

Leer DO 405 nm en el lector de placas ELISA.

4. A continuación, se representan gráficamente las mediciones de DO de la curva patrón (DO frente a concentración de endotoxina).

5. A continuación, las concentraciones de muestra desconocidas se calculan leyendo cada DO de la curva patrón y calculando la cantidad de endotoxina presente.

Ejemplo 5 - Tratamiento de seres humanos utilizando extracto de calostro hiperinmune

Protección frente a la diarrea causada por Escherichia coli enterotoxinógena (ETEC H01047) mediante tratamiento oral con una preparación en comprimidos de extracto de calostro bovino procedente de ganado vacunado contra antígenos y toxinas bacterianos.

Los comprimidos fueron fabricados por Anadis Limited a partir del calostro de ganado lechero inmunizado contra múltiples antígenos y toxinas bacterianos. Dos ensayos de control doble ciego involucraron a un total de 90 voluntarios sanos y probaron la protección proporcionada por las formas del comprimido (y el placebo) contra una dosis de provocación de 1-2 x 109 E. coli O78.

El primer estudio, con 30 participantes, evaluó el efecto de comprimidos que contenían 400 mg de extracto de calostro tomado con tampón de bicarbonato de sodio. Hubo un 93,4 % de protección en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo del 26,7 %. El segundo estudio probó comprimidos que contenían 400 mg de extracto de calostro administrados con tampón (85,7 % de protección) o sin tampón (80 % de protección) y 200 mg de extracto de calostro administrados sin la bebida de tampón (64,3 % de protección), en comparación con el grupo de placebo del 14,3 %.

Las formulaciones de comprimidos activos fueron significativamente (p <0,001) mejores que los tratamientos con placebo para proteger a los voluntarios de los signos clínicos de diarrea después de la provocación con dosis patógenas de E. coli enterotoxinógena. Los estudios sugieren que esta formulación en comprimidos de extracto de calostro bovino que contiene anticuerpos contra múltiples bacterias enterotoxinógenas y toxinas tiene el potencial de prevenir la diarrea clínica asociada con estas bacterias. La diferencia entre los tratamientos con tampón y sin tampón no fue estadísticamente significativa.

Ejemplo 6 - Tratamiento de seres humanos utilizando calostro hiperinmune

Este ejemplo describe la protección en un ensayo en seres humanos utilizando un comprimido de calostro producido a partir de calostro hiperinmune inducido por la vacuna descrita en el ejemplo 3.

Se reclutaron e inscribieron veintidós voluntarios adultos sanos para un ensayo de provocación doble ciego. La mitad recibió comprimidos de inmunoglobulina bovina específica para E. coli con solución de bicarbonato o comprimidos de placebo de leche desnatada con solución de bicarbonato. Los voluntarios tomaron el tratamiento asignado tres veces al día durante 7 días. El séptimo día se administró una provocación de 1 x 109 E. coli cepa H010407 (ETEC O78) como bebida a todos los participantes. A continuación, se observó a los participantes en busca de signos de enfermedad gastrointestinal inducida por ETEC.

La tasa de ataque de diarrea en los grupos fue: 4/11 en el grupo de producto, 7/11 en el grupo de placebo (p = 0,2). El tratamiento (comprimido de calostro hiperinmune) proporcionó el 44 % de eficacia protectora contra la diarrea causada por ETEC H010407 en comparación con el grupo de placebo.

Ejemplo 7 - Procedimiento de determinación del título de anticuerpos

Este ejemplo describe un ensayo Elisa en el que la placa de microtitulación se recubre con células de E. coli completas. El ensayo es un ensayo de título de anticuerpos y el desarrollo del color está catalizado por el conjugado de IgG anti-bovina de cabra-peroxidasa.

Se dispensaron 0,5 microgramos de células de E. coli termoinactivadas en 100 pl de tampón de recubrimiento de carbonato-bicarbonato en cada pocillo de una placa Maxisorp Immuno-plate de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) y se dejó a 4 oC durante la noche. Las placas se lavaron 6 veces en tampón PBS-Tween al 0,05 % que comprendía NaCl 137 mM, KH2PO41,5 mM, Na2HPO48 mM, pH 7,4. Se añadieron a cada pocillo 100 pl de cada suero de prueba o calostro, diluidos en PBS-Tween que contenía 12 mg/ml de caseína y se incubaron a 37 oC durante 2 horas. Las placas se lavaron 6 veces en tampón PBS-Tween, después de lo cual se añadieron a cada pocillo 100 pl de conjugado de IgG anti-bovina de cabra-peroxidasa (Southern Biotacnology Associates, Inc., Birmingham, AL, Estados Unidos), diluido 1:4.000 en PBS-Tween-caseína. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 oC y se lavaron 6 veces. Se añadieron 100 pl de sustrato de peroxidasa (Kirkegaard and Perry Lab. Inc., Gaithersburg, MD, Estados Unidos) a cada pocillo y se dejaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 2 M y las placas se leyeron en un lector de placas Diagnostics Pasteur LP400 (Sanofi, Mames-la-Coquette, Francia) a 450 mm. Los resultados se expresaron como la DO neta media (después de restar la reacción en blanco) de pocillos duplicados analizados, como mínimo, en dos ocasiones distintas.

Ejemplo 8 - Protocolo de inmunización alternativo

Se produjeron anticuerpos en suero utilizando un antígeno preparado según el ejemplo 1. La inmunización de la vaca fue tal como se describe en el ejemplo 2, excepto en que se administraron tres inyecciones a intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última de estas inyecciones, se tomó una muestra de sangre para la determinación del título de anticuerpos.

Ejemplo 9 - Producción de anticuerpos en suero utilizando un antígeno de célula completa

Con el objetivo de comparar la respuesta inmunológica de los antígenos de la pared celular separados y los antígenos de células completas, se generaron anticuerpos en suero contra antígenos de células completas utilizando el siguiente procedimiento.

El antígeno de células completas se preparó de la siguiente manera: se inocularon 100 ml de caldo Luria con E. coli H 10407 y se incubaron a 37 oC durante la noche con agitación. El cultivo resultante se centrifugó para sedimentar las bacterias, que se resuspendió en 100 ml de PBS estéril y se calentó a 100 oC durante 2,5 horas. La concentración de proteína se midió utilizando el ensayo de proteína Bio-Rad y se ajustó a 1 miligramo/ml. La adición de adyuvante fue tal como se describe en el ejemplo 1. Las vacas se vacunaron utilizando el procedimiento del ejemplo 7 y se extrajeron muestras de sangre, tal como se describe en el ejemplo 7.

Ejemplo 10 - Comparación de antígenos de células completas frente a antígenos de pared celular separados Se procesaron sueros derivados del grupo A (18 vacas), tal como en el ejemplo 7 en el ensayo Elisa descrito en el ejemplo 7. También se procesaron sueros derivados del grupo B (14 vacas), tal como en el ejemplo 9 en el ensayo Elisa del ejemplo 6. Los resultados fueron:

El título de anticuerpos generados utilizando la vacuna de la presente invención (grupo A) fue significativamente mayor que el título de anticuerpos generados utilizando la vacuna de células completas (grupo B). Este resultado es sorprendente porque el título se determinó utilizando células completas inmovilizadas en la placa de Elisa.

Ejemplo 11 - Seguridad animal

Una investigación de 1.200 vacas lecheras vacunadas, según el protocolo del ejemplo 2, no mostró problemas de bienestar significativos o reacciones en el sitio o pérdida de producción.

Ejemplo 12

El siguiente ensayo se basa en la utilización de anticuerpos generados en el calostro de vacas para realizar un análisis por inmunotransferencia del factor de colonización. Los anticuerpos se preparan según el procedimiento de la presente invención, con la condición de que se incorporen antígenos CFA (pilus) en la vacuna.

• Tampones y reactivos

10 x Tampón de electroforesis Tris/Glicina/SDS:

Tris 15 g

Glicina 72 g

SDS 5 g

Completar hasta 1 litro con dH2O. Diluir 1/10 para preparar una “solución de trabajo”.

Tampón de transferencia (100 ml):

Tris 0,56 g

Glicina 0,30 g

dH2O 80 ml

Metanol 20 ml

SDS al 10 % 360 pl

Combinar los reactivos en el orden anterior y dejar enfriar antes de utilizar.

3 x Tampón Laemmli (8 ml):

dH2O 0,8 ml

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 3,0 ml

Glicerol 2,4 ml

SDS 0,48 g

2-p-Mercaptoetanol* 1,2 ml

Azul de bromofenol al 0,05 % (p/v) 0,6 ml

* Añadir justo antes de la utilización

Combinar 1 volumen de tampón Laemmli con 2 volúmenes de muestra.

• Preparaciones de factor de colonización en bruto

Esparcir cepas de E. coli enterotoxinógena (ETEC) en placas de CFA duplicadas y hacer crecer durante la noche a 37 oC (producción de CF) y temperatura ambiente (producción de CF suprimida). Raspar la mitad de una placa de células en 1 ml de PBS y pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender. Agitar en vórtex brevemente.

Incubar las suspensiones celulares en un baño de agua a 60 oC durante 30 minutos para liberar los factores de colonización. Sedimentar las células por centrifugación (14.000 rpm/20 minutos) y se recuperar los sobrenadantes en tubos nuevos.

La preparación en bruto debería contener tanto factor de colonización como LPS cuando se expresen por las cepas utilizadas.

• SDS-PAGE

Verter geles de SDS-poliacrilamida al 15 % con gel de apilamiento al 4 % de la siguiente manera:

De separación al 15 % (4 geles) De apilamiento al 4 % (4 geles)

dH2O 7,2 ml 6,4 ml Tris 1 M pH 8,8 5 ml NA Tris 0,5 M pH 6,8 NA 2,5 ml Accugel (40 %) 7,5 ml 1 ml SDS al 10 % 200 |^ l 100 |^ l APS al 10 % 100 |^ l 50 |^ l TEMED 10 |^ l 10 |^ l Vol total 20 ml 10 ml

Combinar 2 volúmenes de cada preparación de CF en bruto y 1 volumen de tampón Laemmli 3 x para obtener un volumen final suficiente de ~25 |j.l por pocillo requerido (es decir, si se carga cada muestra en geles duplicados, combinar 40 l de CF y 20 l de Lb). Hervir durante 5 minutos, enfriar en hielo y girar brevemente para recoger la condensación.

Cargar 20 |j.l de cada muestra por pocillo y procesar los geles durante 30 minutos a 100 V (a través del gel de apilamiento) y 1,5 horas a 150 V (el frente de colorante correrá hasta el extremo).

Transferir las proteínas a la nitrocelulosa utilizando un aparato Trans-Blot (0,08 A máximo por mini gel, 30 minutos) y bloquear las membranas durante la noche a 4 oC en PBS+Tween 20 al 0,1 % (PBS-T)+leche desnatada en polvo (SMP, skim milkpowder) al 10 %.

• Inmunotransferencia

Enjuagar las transferencias con PBS-T (5 minutos de agitación)

Incubar las transferencias con calostro de vacas hiperinmunizadas con una vacuna que comprende antígenos CFA (100 mg/ml en PBS) diluido 1/200 en PBS-T+SMP al 5 % durante 2 horas con agitación suave.

Enjuagar las transferencias y lavar con PBS-T durante 1 x 15 minutos y 2 x 5 minutos.

Incubar las transferencias con IgG anti-bovina de cabra-HRPO (1/20.000) en PBS-T+SMP al 5 % durante 1 hora con agitación suave.

Lavar tal como se indicó anteriormente, drenar el exceso de PBS-T y colocar transferencias húmedas en una lámina superior. Preparar el reactivo ECL, dejar caer 1 ml en cada gel y dejar durante 1 minuto. Colocar otra lámina superior sobre las transferencias y secar el exceso de reactivo ECL asegurándose de que la parte superior en la que se colocará la película esté seca. Exponer las transferencias a la película de rayos X durante el tiempo requerido (generalmente 3 minutos inicialmente y, a continuación, aumentar o disminuir desde ese punto).

Referencias

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Endotoxins in Health and Disease, eds H. Brade, S Opal, S Vogel, D Morrison; Marcel Dekker Inc 1999 Capítulo 12 y otros capítulos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la preparación de inmunoglobulinas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad entérica causada por bacterias E. coli en un individuo humano que comprende

a) separar, como mínimo, el antígeno O O78 de las paredes celulares bacterianas o fragmentos de pared celular por cizalladura,

b) eliminar las paredes celulares o los fragmentos de pared celular mediante centrifugación,

c) preparar una formulación de vacuna que comprende el antígeno O O78, que está separado de paredes celulares o de fragmentos de pared celular,

d) inmunizar un animal huésped no humano con la vacuna de la etapa (c) para inducir, de este modo, al animal huésped para que produzca calostro hiperinmune que comprende las inmunoglobulinas.

2. Proceso, según la reivindicación 1, en el que la vacuna comprende, además, los antígenos de pilus o similares a de pilus CFA-1 o CFA-2 u otros factores de colonización o supuestos factores de colonización o combinaciones de los mismos, separándose, como mínimo, algunos de dichos antígenos de las paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

3. Proceso, según la reivindicación 2, en el que, como mínimo, el 20 %, de forma preferente, el 40 %, de forma más preferente, el 60 % del antígeno CFA se disocia de paredes celulares bacterianas o de fragmentos de pared celular.

4. Proceso, según la reivindicación 1, en el que la fuerza de cizalladura se aplica mediante homogeneización que se realiza en una configuración rotor-estator, en el que la proporción de la velocidad periférica del rotor (en metros por segundo) con respecto al espacio entre el rotor y el estator (en milímetros) está en un intervalo de 0,2 a 20, de forma preferente, en el intervalo de 0,4 a 12, de forma más preferente, en el intervalo de 0,8 a 6.

5. Proceso, según la reivindicación 1, en el que la E. coli es ETEC, EHEC o EPEC.

6. Proceso, según la reivindicación 5, en el que la E. coli es ETEC y la vacuna comprende antígenos O adicionales, que se seleccionan entre el grupo que consiste en O6, O15, O25, O27, O63, O114, O115, O128, O148, O153 y O159.

7. Proceso, según la reivindicación 6, en el que el antígeno O separado se purifica utilizando precipitación con sulfato de amonio.

8. Proceso, según la reivindicación 7, en el que se utiliza una precipitación inicial para eliminar proteínas extrañas y se utiliza una precipitación final para proporcionar los antígenos O en el precipitado.

9. Proceso, según la reivindicación 6, en el que la vacuna comprende un grupo, como mínimo, de dos antígenos O, y los antígenos O individuales se aíslan y cultivan en sistemas de cultivo bacteriano separados y, después de la separación de los antígenos O individuales de las paredes celulares bacterianas, dichos antígenos se añaden conjuntamente en la vacuna.

10. Proceso, según la reivindicación 9, en el que la vacuna comprende, además, CFA-1 y/o CFA-2.

11. Proceso, según la reivindicación 10, en el que un grupo de dicho grupo, como mínimo, de dos antígenos O comprende el antígeno de E. coliO78 y el antígeno de pilus CFA-1, y el otro grupo de dicho grupo, como mínimo, de dos antígenos O comprende antígenos seleccionados entre el conjunto que consiste en antígenos del serotipo O O6, O8, O15, O25, O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153, O159 y antígeno de pilus CFA-2.

12. Proceso, según la reivindicación 11, en el que la vacuna incluye un adyuvante seleccionado entre uno o más del grupo que consiste en una composición inmunoestimulante que contiene ésteres de ácido octadecenoico y anhidromanitol en una solución oleosa, QuilA e hidróxido de aluminio.

13. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el animal huésped es una vaca que se inmuniza con dicha vacuna para producir una respuesta inmune a dicha vacuna, y se recoge calostro hiperinmune de la vaca vacunada.

14. Proceso, según la reivindicación 13, en el que el calostro hiperinmune se prepara separando dichos antígenos en dos o más lotes de vacuna individuales y vacunando dos o más rebaños de ganado con lotes de vacuna individuales respectivos y, posteriormente, mezclando el calostro de los rebaños.

15. Proceso, según la reivindicación 14, en el que el calostro hiperinmune se purifica, como mínimo, de forma parcial, mediante filtración, pasteurización y/o eliminación de fases heterogéneas.