CN116850280A - 一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：使用共溶剂将DOTAP和MSA‑2溶解，其中，DOTAP的浓度为10～40mg/mL，MSA‑2的浓度为14～40mg/mL，再将上述混合溶液与角鲨烯共混，得油相，共溶剂与角鲨烯的体积比为1:1.5～2.5；将Tween 80和Span 85溶于柠檬酸盐缓冲溶液，作为水相；向油相中缓慢加入水相，同时超声处理，制备纳米乳液；去除纳米乳液中的共溶剂后，再次超声乳化，得乳液佐剂；将乳液佐剂与抗原共孵育，得纳米疫苗。构建了一种既能吸附抗原又能负载STING激动剂的纳米疫苗递送系统，其可以实现抗原和免疫佐剂的共递送。

Description

一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米药物技术领域，具体涉及一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
癌症(恶性肿瘤)是严重危害人类生命健康的疾病之一。传统癌症的治疗方式主要包括手术治疗、放疗和化疗，但这些大多伴有靶向性差、安全性低、耐药性及易复发/转移等问题。目前，依靠自身免疫系统杀伤肿瘤细胞的免疫疗法受到人们的广泛关注，已被提议作为第四种肿瘤治疗方法。
现有的肿瘤免疫治疗手段包括嵌合抗原受体T细胞疗法(chimeric antigenreceptor T-cell immunotherapy,CAR-T)、免疫检查点抑制剂疗法、过继性T细胞治疗以及肿瘤疫苗。其中，肿瘤疫苗可以利用特定的肿瘤抗原对免疫系统产生刺激，特异性地消除癌细胞，诱导肿瘤消退、根除微小残留疾病、建立持久的抗肿瘤记忆并避免非特异性或不良反应。肿瘤疫苗的设计应考虑肿瘤抗原、制剂形式、免疫佐剂以及递送载体四个关键因素。单纯的抗原往往免疫原性有限，因此有效的疫苗接种需要联合使用免疫佐剂，来提高免疫反应的强度、广度和持久性。
在目前批准使用的疫苗佐剂中，有两种水包油型乳液佐剂MF59和AS03。二者在流感大流行期间被广泛使用，证明了其有效性和安全性。乳液佐剂可以提高记忆B细胞的多样性，诱导产生更高的中和抗体滴度。然而，这种水包油乳液佐剂不能有效诱导细胞介导的免疫反应，而细胞介导的免疫反应是治疗癌症所必需的，并且由于它们与抗原分子的相互作用差，限制了其作为抗原递送载体的免疫效力。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
使用共溶剂将DOTAP和MSA-2溶解，其中，DOTAP的浓度为10～40mg/mL，MSA-2的浓度为14～40mg/mL，再将上述混合溶液与角鲨烯共混，得油相，共溶剂与角鲨烯的体积比为1:1.5～2.5；
将Tween 80和Span 85溶于柠檬酸盐缓冲溶液，作为水相；
向油相中缓慢加入水相，同时超声处理，制备纳米乳液；
去除纳米乳液中的共溶剂后，再次超声乳化，得乳液佐剂；
将乳液佐剂与抗原共孵育，得纳米疫苗。
干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)通路的活化可以激活机体的固有免疫反应，MSA-2是一种非核苷酸类小分子STING激动剂，然而其较差的水溶性不利于细胞摄取，阻碍了其在疫苗药物中的使用。
本发明基于乳液佐剂构建纳米疫苗，将疏水性药物MSA-2包封在乳液油相中，提高了溶解度和生物利用度，减少脱靶效应，避免对正常组织的不良反应，激活STING信号通路，协同增强抗肿瘤效果。
本发明利用超声乳化法制备新型乳液佐剂，构建了一种既能吸附抗原又能负载STING激动剂(MSA-2)的纳米疫苗递送系统，其可以实现抗原和免疫佐剂的共递送。纳米疫苗能够引发更强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)激活，经免疫的小鼠可以产生更高的卵清蛋白(ovalbumin,OVA)特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体滴度。在E.G7-OVA荷瘤小鼠模型中，能有效抑制肿瘤生长，具有较好的肿瘤免疫治疗效果。
DOTAP与Tween 80、Span 85共同作为表面活性剂，吸附在油水界面，稳定乳液液滴。DOTAP可以通过酸碱相互作用、静电相互作用及亲疏水相互作用实现乳液对疏水性佐剂MSA-2和负电性抗原蛋白质的共负载。角鲨烯具有良好的生物可降解性和生物相容性，作为乳液油相的核心成分。
因为Tween 80有高HLB值(亲水亲油平衡值)，Span 85有低HLB值(亲水亲油平衡值)，经过实验表明，这两种表面活性剂的复配有助于在油水界面形成更坚固的界面膜，降低乳液液滴粒径，提高乳液的稳定性。小粒径和稳定的乳液液滴有利于乳液佐剂在生产过程中实现无菌过滤，且经过早期的体内实验发现，乳液液滴大小是乳液佐剂效力的较为重要的因素。
在一些实施例中，所述共溶剂为氯仿。氯仿是一种非极性溶剂，根据相似相溶原理，其对阳离子脂质DOTAP和疏水性佐剂MSA-2有较好的溶解性，同时氯仿的沸点较低，方便后续通过抽真空的方式除去。
优选的，当采用氯仿作为共溶剂时，先将DOTAP溶解在氯仿中，再继续溶解MSA-2。DOTAP是蜡状固体，比较难转移，先称量DOTAP到离心管中，加入氯仿溶解，再将该液态混合物加入到MSA-2固体粉末中，这样能最大程度的避免物质的损失，提高负载量。
此外，从结构方面：MSA-2是一种固体粉末，在溶解状态下具有可电离的羧基，显弱酸性。先将DOTAP溶解在氯仿中，在溶解状态下，其强极性的正电头基可以与后加入的MSA-2通过酸碱相互作用、静电相互作用相结合，更好地增溶MSA-2。
在一些实施例中，角鲨烯与水相的体积比为1:10～25。
在一些实施例中，超声的条件为：在100～200W超声条件下，超声60s～6min。
优选的，先在100～200W超声条件下，超声2～6min，抽真空去除共溶剂后，再在100～200W超声条件下，超声1～2min。
进一步优选的，抽真空的时间为1～4min，优选为2～3min。
在一些实施例中，柠檬酸盐缓冲溶液的pH值为6.0。
优选的，水相中Tween 80的浓度为3-8mg/mL，Span 85的浓度为3-8mg/mL。
优选的，水相中Tween 80的浓度为4-7mg/mL，Span 85的浓度为4-7mg/mL。
在一些实施例中，将乳液佐剂与抗原共孵育的条件为：在4～37℃下混匀30～120min。
优选的，将乳液佐剂与抗原共孵育的条件为：在37℃下混匀90min。
优选的，共孵育时，抗原OVA溶液与乳液的体积比为1:50～100。
第二方面，本发明提供一种基于乳液佐剂的纳米疫苗，由所述制备方法制备而成。
第三方面，本发明提供所述基于乳液佐剂的纳米疫苗在制备肿瘤预防或治疗药物中的应用。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
本发明基于乳液佐剂构建纳米疫苗，共同递送抗原和免疫佐剂，介导了有效的抗原提呈细胞激活，动物实验证明了其作为疫苗对肿瘤的预防和治疗效果。
本发明基于乳液佐剂构建纳米疫苗，将疏水性药物MSA-2包封在乳液油相中，提高了溶解度和生物利用度，减少脱靶效应，避免对正常组织的不良反应，激活STING信号通路，协同增强抗肿瘤效果。
本发明制备乳液佐剂的过程温和简便，安全、耐受性良好的药用辅料赋予其良好的生物相容性，可实现疫苗规模化量产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1纳米疫苗DMMF59+OVA的制备示意图；
图2为本发明实施例1所制备的DMMF59乳液冷冻电镜图以及乳液照片；
图3为本发明实施例1、对比例1、对比例2中所制备的DMMF59、DMF59、MF59乳液的粒径表征；
图4为本发明实施例1、对比例1、对比例2中所制备的DMMF59、DMF59、MF59乳液，随时间变化其粒径监测数据；
图5为本发明实施例2的骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendriticcells,BMDCs)成熟实验结果图，其中a～b图为BMDCs表面共刺激分子表达水平，c～f图分别为细胞培养上清中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IFN-β分泌情况；
图6为本发明实施例3的小鼠免疫接种流程示意图；
图7为本发明实施例3中，第14天和第28天小鼠血清中OVA特异性IgG抗体滴度情况；
图8为本发明实施例4的荷瘤小鼠肿瘤免疫治疗流程示意图；
图9为本发明实施例4中，治疗期间小鼠肿瘤体积变化曲线；
图10为本发明实施例4中，第20天小鼠的离体肿瘤质量统计图；
图11为本发明实施例4中，治疗期间小鼠的体重变化曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明的第一个方面，利用探头式低频超声制备乳液，制备过程简单。该超声乳化技术可以实现对例如紫草油、肉豆蔻酸异丙酯、角鲨烷、生育酚等其他油的均质，得到纳米乳液。
本发明的第二个方面，一种基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，制备时所需材料包括角鲨烯，Tween 80，Span 85，DOTAP，MSA-2，OVA。
具体制备方法包括：
利用氯仿作为共溶剂溶解DOTAP和MSA-2，将其与角鲨烯共混作为油相；将Tween80和Span 85溶于柠檬酸盐缓冲溶液，作为水相。向油相中缓慢加入水相，超声制备纳米乳液。超声结束后抽真空去除残留的氯仿，再次超声乳化一段时间。
注射前，将乳液佐剂与抗原共孵育，即可得到纳米疫苗。
本发明的第三个方面，一种基于乳液佐剂的纳米疫苗，由上述方法制备获得。
本发明的第四个方面，一种上述纳米疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用。
鉴于已有的MF59乳液难以实现抗原与不同机制免疫佐剂的共递送，不能有效诱导细胞介导的免疫反应，作为疫苗递送系统存在一定的限制性。本发明提出了一种基于乳液佐剂的纳米疫苗及其制备方法和应用。
本发明的某一具体实施方式中，提供一种基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，制备时所需材料包括角鲨烯，Tween 80，Span
85，DOTAP，MSA-2，OVA。
具体制备方法包括：
利用氯仿作为共溶剂溶解DOTAP和MSA-2，将其与角鲨烯共混作为油相；将Tween80和Span 85溶于柠檬酸盐缓冲溶液，作为水相。向油相中缓慢加入水相，超声制备纳米乳液。超声结束后抽真空去除残留的氯仿，再次超声乳化一段时间。
注射前，将乳液佐剂与抗原共孵育，即可得到纳米疫苗。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种基于乳液佐剂的纳米疫苗，由上述方法制备获得。
本发明的又一具体实施方式中，一种上述基于乳液佐剂的纳米疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
准确称量3mg DOTAP，向其中加入75μL氯仿，充分溶解后，向其中加入3mg MSA-2，充分溶解，得到溶液A。
准确称量20mg Tween 80以及20mg Span 85，向其中加入4mL柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，得到水相B。
向A中加入150μL角鲨烯，使用涡旋混合仪将两者混合均匀，得到混合油相C。向C中缓慢加入3mL水相B。
使用探头式超声，将探头置于水相溶液与混合油相溶液的界面处，以150W的功率超声3min，外加冰浴，得到乳液D。
将乳液D转移至圆底烧瓶中，抽真空3min。抽真空结束，转移至10mL离心管中，以150W的功率超声1min，外加冰浴，得到乳液DMMF59，其粒径表征如图3中所示。
使用三次水配制浓度为10mg/mL的OVA溶液，将其与DMMF59乳液以1:100的体积比混合，在37℃下使用垂直混合仪共孵育90min。得到最终产品纳米疫苗：DMMF59+OVA。
该纳米疫苗的制备过程如图1所示，DOTAP以胶束的形式将MSA-2包封在上层的混合油相C中，下层是溶解了Tween 80和Span85的水相B，将超声探头置于油水两相界面处，超声波的扰动作用将上层油相破碎成小的油滴，表面活性剂迅速吸附到油滴与水的界面上，形成坚固的界面膜，通过静电排斥作用和空间位阻效应，防止油滴的絮凝，形成稳定的DMMF59乳液；同时，DOTAP也能作为表面活性剂吸附在油滴界面处，使得该乳液表面带正电，向乳液中加入抗原OVA后，能够通过静电相互作用和亲疏水相互作用实现对蛋白质的吸附。DMMF59乳液的冷冻电镜及照片如图2所示。
对比例1
为了对比负载有MSA-2的纳米疫苗激活STING通路后对免疫应答的影响，一种未负载MSA-2的乳液的制备方法，包括步骤：
准确称量3mg DOTAP，向其中加入75μL氯仿。准确称量20mg Tween 80以及20mgSpan 85，向其中加入4mL柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，得到水相B。
向A中加入150μL角鲨烯，使用涡旋混合仪将两者混合均匀，得到混合油相C。向C中缓慢加入3mL水相B。
使用探头式超声，将探头置于水相溶液与混合油相溶液的界面处，以150W的功率超声3min，外加冰浴，得到乳液D。
将乳液D转移至圆底烧瓶中，抽真空3min。抽真空结束，转移至5mL离心管中，以150W的功率超声1min，外加冰浴，得到乳液DMF59，其粒径表征如图3中所示。
使用三次水配制浓度为10mg/mL的OVA溶液，将其与DMF59乳液以1:100的体积比混合，在37℃下使用垂直混合仪共孵育90min。得到对比例1纳米疫苗：DMF59+OVA。
对比例2
为了对比不同抗原内化量的纳米疫苗产生的免疫应答情况，一种未加入DOTAP，同时也未负载MSA-2的乳液的制备方法，包括步骤：
准确称量20mg Tween 80以及20mg Span 85，向其中加入4mL柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，得到水相B。向10mL离心管中加入150μL角鲨烯，向该油相中缓慢加入3mL水相B。
使用探头式超声，将探头置于水相溶液与角鲨烯油相的界面处，以150W的功率超声3min，外加冰浴，得到乳液MF59，其粒径表征如图3中所示。
使用三次水配制浓度为10mg/mL的OVA溶液，将其与MF59乳液以1:100的体积比混合，在37℃下使用垂直混合仪共孵育90min。得到对比例2纳米疫苗：MF59+OVA。
实施例2
为了评价纳米疫苗对抗原提呈细胞的活化水平，进行小鼠BMDCs成熟实验，包括步骤：
选取6～8周雄性C57BL/6小鼠，按照已有的方法从小鼠的肱骨中提取，获得的骨髓细胞经红细胞裂解液处理后培养于六孔板中，之后每隔两天半量换液。培养至第六天，将细胞慢慢吹散，得到细胞悬液，离心后接种至24孔板中，密度为2×104个/孔，6～8小时后加入不同的材料进行刺激共培养24h，分别是PBS、OVA、OVA+MSA-2、MF59+OVA(对比例2)、DMF59+OVA(对比例1)、DMMF59+OVA(实施例1)。刺激结束后，将孔板中的细胞缓慢吹散，离心后收集细胞培养上清，用荧光标记的抗小鼠抗体APC-CD11c、FITC-CD80、PE-Cy7-CD86对细胞团进行染色，采用流式细胞仪进行检测。收集的细胞培养上清通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子的分泌情况。
如图5的a～b图所示，与OVA、OVA+MSA-2、MF59+OVA、DMF59+OVA相比，纳米疫苗DMMF59+OVA能够上调BMDCs表面CD80、CD86的表达水平；图5的c～f图表明其能够诱导更多IL-6、IFN-γ、TNF-α的分泌，同时明显的IFN-β的产生证明细胞中STING通路的成功激活，表明本发明所制备的纳米疫苗DMMF59+OVA可以有效促进BMDCs成熟，诱导相关细胞因子的分泌。
实施例3
为了考察纳米疫苗诱导的免疫应答能力，进行小鼠免疫接种实验，包括步骤：
将6～8周雄性C57BL/6小鼠随机分为6组，分组为PBS组、OVA组、OVA+MSA-2组、MF59+OVA(对比例2)组、DMF59+OVA(对比例1)组、DMMF59+OVA(实施例1)组，每组6只小鼠，进行右后腿肌肉注射，每只小鼠给药体积为100μL，OVA给药量为10μg，MSA-2给药量为0.1mg，分别于第0天、第14天免疫一次，在第14天和第28天对小鼠进行眼眶取血，4℃条件下静置2h以上，3000rpm离心10min，取血清通过ELISA检测血清中抗体的分泌情况。
图6为本发明实施例3的小鼠免疫接种流程示意图，图7为第14天和第28天小鼠血清中OVA特异性IgG抗体滴度情况，结果表明，与PBS、OVA、OVA+MSA-2、MF59+OVA、DMF59+OVA相比，经本发明的纳米疫苗DMMF59+OVA两次免疫后，小鼠血清中产生了更高水平的OVA特异性IgG抗体滴度，显著提高乳剂的免疫应答能力。
实施例4
为了评价纳米疫苗在体内的抗肿瘤效果，进行荷瘤小鼠治疗实验，步骤包括：
首先构建小鼠肿瘤模型，在第0天，于C57BL/6小鼠皮下注射1×106个E.G7-OVA细胞。在第4天将小鼠随机分成6组，分别为PBS组、OVA组、OVA+MSA-2组、MF59+OVA(对比例2)组、DMF59+OVA(对比例1)组、DMMF59+OVA(实施例1)组。分别于第5天、第10天、第15天对荷瘤小鼠进行肌肉免疫注射，每只小鼠给药体积为100μL，OVA给药量为10μg，MSA-2给药量为0.1mg。治疗期间，每两天记录动物体重和肿瘤体积，肿瘤体积(V)计算公式为：V＝0.5×L×W2，其中L和W分别为肿瘤的长度和宽度。
图8为本发明实施例4的荷瘤小鼠肿瘤免疫治疗流程示意图。如图9和图10所示，与PBS、OVA、OVA+MSA-2、MF59+OVA、DMF59+OVA相比，本发明的纳米疫苗DMMF59+OVA对肿瘤的生长有最佳抑制作用，治疗结束后肿瘤的质量最小。
图11表明，治疗期间各组实验小鼠的体重没有明显差别，证明纳米疫苗的生物安全性。以上结果说明，本发明的纳米疫苗DMMF59+OVA有较好的肿瘤免疫治疗效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
使用共溶剂将DOTAP和MSA-2溶解，其中，DOTAP的浓度为10～40mg/mL，MSA-2的浓度为14～40mg/mL，再将上述混合溶液与角鲨烯共混，得油相，共溶剂与角鲨烯的体积比为1:1.5～2.5；
将Tween 80和Span 85溶于柠檬酸盐缓冲溶液，作为水相；
向油相中缓慢加入水相，同时超声处理，制备纳米乳液；
去除纳米乳液中的共溶剂后，再次超声乳化，得乳液佐剂；
将乳液佐剂与抗原共孵育，得纳米疫苗。
2.根据权利要求1所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述共溶剂为氯仿；
优选的，当采用氯仿作为共溶剂时，先将DOTAP溶解在氯仿中，再继续溶解MSA-2。
3.根据权利要求1所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：角鲨烯与水相的体积比为1:10～25。
4.根据权利要求1所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：超声的条件为：在100～200W超声条件下，超声60s～6min；
优选的，先在100～200W超声条件下，超声2～6min，抽真空去除共溶剂后，再在100～200W超声条件下，超声1～2min；
进一步优选的，抽真空的时间为1～4min，优选为2～3min。
5.根据权利要求1所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：柠檬酸盐缓冲溶液的pH值为6.0；
优选的，水相中Tween 80的浓度为3-8mg/mL，Span 85的浓度为3-8mg/mL；
优选的，水相中Tween 80的浓度为4-7mg/mL，Span 85的浓度为4-7mg/mL。
6.根据权利要求1所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：将乳液佐剂与抗原共孵育的条件为：在4～37℃下混匀30～120min。
7.根据权利要求6所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：将乳液佐剂与抗原共孵育的条件为：在37℃下混匀90min。
8.根据权利要求6所述的基于乳液佐剂的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：共孵育时，抗原OVA溶液与乳液的体积比为1:50～100。
9.一种基于乳液佐剂的纳米疫苗，其特征在于：由权利要求1-8任一所述制备方法制备而成。
10.权利要求9所述基于乳液佐剂的纳米疫苗在制备肿瘤预防或治疗药物中的应用。
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