CN110665379A - 一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法 - Google Patents

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宋厚辉
孙静
俞慧飞
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
    • B01F23/41—Emulsifying
    • B01F23/4105—Methods of emulsifying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

本发明涉及生物制剂处理技术，旨在提供一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法。包括：取含有疫苗抗原的水相和作为油相的乳化佐剂，一并加入无菌离心管中得到混合液；称取与混合液等重的无菌陶瓷珠加入混合液中，封闭离心管；将离心管置于均质仪中，对离心管中的混合物进行震荡处理后获得乳化物；将离心管移至离心机中，对乳化后的混合物进行离心处理；停止离心后，陶瓷珠与乳化物自动分离，上层液体即为均一的油包水乳化物。本发明可有效解决传统乳化方法缺点，较短时间即能达到非常好的乳化效果，可用于疫苗成分免疫接种前的乳化以及各种油包水型制剂的乳化。本发明所述方法简单，迅速，产量可观，具有稳定可靠的显著效果。

Description

一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法
技术领域
本发明属于生物制剂处理技术，尤其是涉及一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法。
背景技术
乳化是一种液体以极微小液滴均匀地分散在互不相溶的另一种液体中的作用。乳化是液-液界面现象，两种不相溶的液体，如油与水，在容器中分成两层，密度小的油在上层，密度大的水在下层。若加入适当的表面活性剂在强烈的搅拌下，油被分散在水中，形成乳状液，该过程叫乳化。
使用疫苗对动物进行免疫接种时，由于直接接种抗原免疫效果差，需要将弗氏佐剂与水溶性抗原乳化，以形成稳定的油包水乳剂，乳化效果好坏是获得高效价抗体的关键。但是，传统的乳剂制备法均存在显著的缺陷。例如，注射器抽拉法费时费力、乳钵研磨法抗原损失较大、超声波乳化法易破坏抗原结构，不能适应实际应用需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法，包括以下步骤：
(1)按体积比1∶1取含有疫苗抗原的水相和作为油相的乳化佐剂，一并加入无菌离心管中得到混合液；
(2)称取与混合液等重的无菌陶瓷珠加入混合液中，封闭离心管；
(3)将离心管置于均质仪中，对离心管中的混合物进行震荡处理后获得乳化物；
(4)将离心管移至离心机中，对乳化后的混合物进行离心处理；停止离心后，陶瓷珠与乳化物自动分离，上层液体即为均一的油包水乳化物。
本发明中，所述步骤(3)中，控制均质仪的转速为4000rpm/min，震荡15～21次，每次震荡间隔30s。
本发明中，所述步骤(4)中，控制离心转速为4500rpm/min，离心时间为1分钟。
本发明中，所述陶瓷珠的平均直径为0.5mm。
本发明中，所述抗原是具有诱导免疫原性的蛋白类物质。
本发明中，所述乳化佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂(或其他能产生油包水型免疫混合物的油性佐剂)。
本发明中，所述均质仪是型号为Bertin Precellys 24Dual的多功能生物样品均质器。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明使用陶瓷珠和均质仪对水相和油相进行快速乳化，可有效解决传统乳化方法缺点，较短时间即能达到非常好的乳化效果。并且，利用本发明制备的抗原经常规免疫后能够获得高特异性、高效价的抗体，可用于疫苗成分免疫接种前的乳化以及各种油包水型制剂的乳化。
2、本发明采用价格低廉的惰性陶瓷材料辅助乳化，可根据乳化物各成分的用量，进行量产。
3、本发明所述方法简单，迅速，产量可观，很好地克服了现有乳化方法样品损失大、乳化不完全、费力、破坏样品等缺点，具有稳定可靠的显著效果。
附图说明
图1为不同抗原乳化效果(油包水状态)检测结果；
图2为利用Western Blot方法对抗体反应性的检测结果(抗体稀释倍数均为1∶2000)。
具体实施方式
下式实例中使用的Bertin Precellys 24Dual多功能生物样品均质器是一台集研磨、裂解、均质为一体的多功能、高通量样品均质器、细胞破碎仪、组织匀浆机。它通过三维高速振动(最高6800rpm)，辅助研磨珠的敲打，达到对样品进行研磨、裂解、均质的目的。
本实例中分别选用单增李斯特菌硫氧还蛋白、氨基肽酶和溶血素作为实例抗原进行乳化。
(1)将500μg的单增李斯特菌硫氧还蛋白、氨基肽酶和溶血素分别加到各自对应的灭菌离心管中，用10mM PBS将体积补至500μL；然后加入500μL等体积弗氏完全佐剂，再向每管中加入与混合物等重的无菌陶瓷珠。
(2)利用均质仪对离心管中的混合物进行乳化，乳化时控制均质仪的转速为4000rpm/min，震荡15～21次，每次震荡间隔30s；乳化完毕得到乳化后的混合物；
(3)将乳化后的混合物在4500rpm/min下离心处理1min，乳化物即与陶瓷珠分离，上层液体即为均一稳定的油包水免疫抗原。
(4)用移液枪吸取20μL抗原滴入冷水，抗原呈滴状浮于水面，表明乳化完全，为合格的油包水剂(如图1)。
(5)将油包水剂按照常规方法免疫新西兰兔，利用Western Blot方法检测制备的三种多克隆抗体具备特异性强、效价高等优点(如图2)，能够用于后续的抗体检测应用。
以上所实施例中使用了本技术领域常用的三种抗原，而使用的佐剂均为弗氏完全佐剂，由于弗氏不完全佐剂的物理性状与弗氏完全佐剂相同，因此如选用弗氏不完全佐剂也可实现相同的乳化效果。

Claims (7)

1.一种针对疫苗抗原的油包水型乳化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按体积比1∶1取含有疫苗抗原的水相和作为油相的乳化佐剂，一并加入无菌离心管中得到混合液；
(2)称取与混合液等重的无菌陶瓷珠加入混合液中，封闭离心管；
(3)将离心管置于均质仪中，对离心管中的混合物进行震荡处理后获得乳化物；
(4)将离心管移至离心机中，对乳化后的混合物进行离心处理；停止离心后，陶瓷珠与乳化物自动分离，上层液体即为均一的油包水乳化物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，控制均质仪的转速为4000rpm/min，震荡15～21次，每次震荡间隔30s。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，控制离心转速为4500rpm/min，离心时间为1分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述陶瓷珠的平均直径为0.5mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原是具有诱导免疫原性的蛋白类物质。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳化佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述均质仪是型号为BertinPrecellys24Dual的多功能生物样品均质器。
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