WO2004097414A1 - インスリンレセプターαサブユニットの測定方法 - Google Patents

Abstract

　血中に遊離のインスリンレセプターαサブユニットが存在することが見出された。そして、血液試料中のインスリンレセプターαサブユニットとインスリンレセプターαサブユニットを認識する抗体を接触させ、両者の結合を検出する工程を含む、インスリンレセプターαサブユニットの測定方法が提供された。血中の遊離のインスリンレセプターαサブユニットの測定は、糖尿病のリスクファクターの評価に有用である。　更に本発明の測定方法により、糖尿病あるいはがん患者における血中の遊離のインスリンレセプターαサブユニット濃度が有意に高いことが明らかにされた。血中の遊離のインスリンレセプターαサブユニットは、糖尿病あるいはがんのマーカーとして有用である。

Description

明細書 インスリンレセプター aサブュニットの測定方法 技術分野

本発明は、 血中の遊離インスリンレセプター αサブュニットの測定方法に関す る。 また本発明は、 糖尿病並びにがんの診断方法に関する。 背景技術

インスリンは、 生体のエネルギー源であるグルコースの代謝調節において重要 な役割を果たしているホルモンである。 膝ランゲルハンス島3細胞で産生された インスリンは、 インスリンレセプターを有する細胞に作用し、 細胞によるダルコ ースの取り込みを促す。 インスリンの作用によって、 生体の血糖値は適切な範囲 . に維持されている。 糖尿病は、 なんらかの原因によってインスリンの作用が不十 分になった結果としてもたらされる病態の 1つである。

インスリンの作用が不十分になる主な原因として、 インスリンの分泌機能の異 常と、 インスリンに対する感受性の低下があげられる。 前者は 1型糖尿病 (Type 1 Diabetes Mellitus)と呼ばれる。 1型糖尿病においては、 インスリンに対する応 答性は維持されているため、 インスリンの投与によって血糖値のコントロールが 可能である。 1型糖尿病はィンスリン依存性の糖尿病（Insulin Dependent Diabet es Mellitus ; IDDM)とも呼ばれ、 若年性の糖尿病の主な原因となっている。

—方、 後者は、 2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus)と呼ばれている。 2型 糖尿病は、 インスリン非依存性糖尿病（Non- Insulin Dependent Diabetes Mellitu s ;NIDDM)とも呼ばれ、 成人に多いタイプの糖尿病である。 日本では糖尿病患者の 9 5 %が 2型糖尿病であると言われている。 2型糖尿病患者は、 生体のインスリン に対する応答性が低下しているため、 インスリンを投与しても血糖値をコント口 ールすることができない。 2型糖尿病は幾つかの遺伝子異常と、 肥満、 ストレス、 加齢などの環境因子が加わって発症すると考えられている。 現在、 日本にも約 7 0万人の 2型糖尿病患者がいると言われており、 その数は高齢化にともなって 増加している。 糖尿病予備軍も含めると 1 6 2 0万人もの患者がいるという予測 もある。 したがって、 2型糖尿病の診断や治療は、 現代社会の重要な研究課題で ある。

現在までのところ、 2型糖尿病の原因遺伝子は明らかになっていない。 インス リン作用機構に関与する因子の遺伝子、 またはィンスリン分泌に関与する因子の 遺伝子が候補遺伝子と予想されている。 このうち、 インスリン作用に関与する因 子としては、 次のような因子が考えられている。

ィンスリンレセプター、

インスリンレセプターサブストレート一 1 (IRS- 1)、

グノレコーストランスポータータイプ 4など

またインスリン分泌に関与する因子の遺伝子として、 次のような因子の関与が 予想されている。

グノレコーストランスポータータイプ 2、

ダルコキナーゼ、

ミトコンドリア遺伝子など

さて、 インスリンが標的細胞に作用するには、 その細胞膜上に存在するインス リンレセプターと結合することが必須である。 また 2型糖尿病の初期には、 イン スリン抵抗性が存在するという多くの報告がある（非特許文献 1 ZTaylor, S. I. Dia betes 41 : 1473- 1490， 1992)。 これらのことから、 インスリンレセプターの異常と 糖尿病の関係についても検討されてきた。 インスリンレセプターの機能に異常が 存在すると、 高度のインスリン抵抗性を示し、 重篤な糖尿病となるはずである。 一方、 最近になって本発明者を含む研究者によって多くのインスリンレセプタ 一異常症が発見され、 変異の種類により患者の検査結果と症状が多彩であること が明らかとなってきた（非特許文献 2 /M. Taira et al. , Science 245 : 63-66, 1989、 非特許文献 3 /F. Shimada et al. , Lancet335 : 1179- 1181， 1990)。 これにより 2型 糖尿病の発症原因の一部にィンスリンレセプター遺伝子異常が存在する可能性が 示唆された。 実際本発明者らは、 2型糖尿病の遺伝子診断を可能とする多型の 1 つを明らかにし、 既に特許出願している （特許文献 1 /特開平 8- 103280) 。

インスリンレセプターは、 αと βの 2つのサブュニットで構成されるへテロ 4 量体構造の受容体蛋白質である。 αサブユニットは細胞外にあり、 βサブュニッ トは細胞膜を貫通している。 aサブュニットはその C末端側にある Cys残基の SH基 を介して、 βサブュニットの細胞外ドメインと SS結合によって結合している。

インスリンが aサブユニットと結合すると、 サブユニットの細胞内ドメイン のチロシン残基が自己リン酸化され、 インスリンのシグナルが細胞に伝達される _c 細胞膜にあったインスリンレセプターは、 インスリンとの結合の後にエンドサイ トーシスにより細胞内に取り込まれる （受容体の半減期は 7時間） 。 インスリン レセプターの数はインスリン濃度の増加に伴って減少する。 これを下降調節 (dow n regulation) といつ ₀

本発明者らによって見出されたインスリンレセプターの多型は、 j3サブュニッ トの 8 3 1位の Thrが Alaに変異している（IRA831)。 このアミノ酸の置換を原因と するインスリンレセプターの機能異常は確認されなかった。 し力 し、 遺伝統計学 的には IRA831と 2型糖尿病との強い関連性が示された。

一方、 最近、 いくつかの疾患においてレセプターの異常に基づく疾患、 血中に フリーのレセプターが存在することによる疾患が報告されている （非特許文献 4 /Frode TS, Tenconi P, Debiasi MR, Medeiros YS Tumour necrosis factor - al pha, interleukin-2 soluble receptor and different inflammatory parameters in patients with rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2002 Dec ; 11 (6) ： 345-9、 非特許文献 5 /Baron AT, Cora EM, Lafky Jl, Boardraan CH, Buen afe MC, Rademaker A, Liu D， Fishman DA, Podratz KC, Maihle NJ "Soluble Ep i dermal Growth Factor Receptor (sEGFR/sErbBl) as a potential Risk, Screen ing, and Diagnostic Serum Biomarker of Epithelial Ovarian Cancer. " Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev, 2003 Feb ； 12 (2) ： 103-13、 非特許文献 6 /Begu in Y. "Soluble transferrin receptor for the evaluation of erythropoiesis and iron status. " Clin Chem Acta, 2003 Mar ； 329 (1—2) ： 9—22) 。 また、 ィ ンスリンレセプター αサブュニットを血中に放出するトランスジエニックマウス において、 高血糖、 高インスリン血症が観察されている （非特許文献 7 /ERIK Μ.

SCHAEFER et al. DIABETES vol. 43, 143—153 ； 1994) 。 しかし、 ヒトにおいて 血中に遊離のインスリン受容体が存在することは報告されていない。

さて、 疾患にともなって生体試料におけるレベルが変化する物質は、 しばしば 疾患の診断マーカーとして有用である。 たとえば生体試料に含まれるがんの指標 となる物質は、 腫瘍マーカー（tumor marker)と呼ばれる。 生体試料に含まれる腫 瘍マーカーは、 がんが存在する場合にその存在レベルが健常者と比較して有意に 変化している。 したがって、 腫瘍マーカーの測定値に基づいて、 被検者ががんを 有している可能性を推定することができる。 通常、 腫瘍マーカーのみでがんの有 無を確定診断することは難しいとされている。 し力 し、 がんに関する、 より高度 な詳細な検査を必要としている被検者をスクリーニングするには、 Jffi瘍マーカー の測定は有効と考えられている。

また腫瘍マーカーの中には、 がんの大きさや進行度に相関して、 その測定レべ ルが変化するものがある。 このような JS瘍マーカーは、 がんの治療効果の指標と して有用である。

これまでに多くの腫瘍マーカーが報告されてきた。 一般に、 腫瘍マーカーは、 もともと正常な組織にも存在している物質であることが多い。 また健常者であつ ても、 生理的な条件や、 がん以外の疾患によって、 腫瘍マーカーの測定レベルが 変化する場合もある。 そのため、 がんを有していない被検者が陽性と判定される 可能性がある。 がんを有していない被検者が陽性と判定されることを、 偽陽性 (fa lse-positive)という。 逆に、 がんと診断されるべき被検者であっても、 腫瘍マー カーが正常範囲にとどまる場合もある。 この場合は、 陽性であるべき被検者が陰 性と判定される。 これを偽陰性 (false - negative)という。

陽性か陰性かの判定は、 腫瘍マーカーの測定レベルとカツトオフ値との関係に よって求められる。 つまり、 がん患者で有意に測定値が高い腫瘍マーカーであれ ば、 腫瘍マーカーの測定値がある値 （カットオフ値） 以上の場合に、 がんが疑わ れる。 一般に、 カットオフ値を高く設定すれば、 偽陰性が増加し、 偽陽性が減る ₍ 逆に、 カットオフ値を低くすれば、 偽陰性は減るものの、 偽陽性が増える。 偽陰 性の増加は、 検査漏れを意味しているので、 できるだけ小さいほうが望ましい。 一方で、 偽陽性の増加は、 検査の必要の無い被検者に、 より高度な検査を施すこ とになる。 つまり、 偽陰性あるいは偽陽性のいずれをも、 許容できる範囲に留め ることができる腫瘍マーカ一は、 より実用的な月重瘍マーカーであると言うことが できる。

偽陽性や偽陰性をどの程度許容できるかは、 そのがんの診断の難易度、 治療方 法の有無、 あるいはがん患者の数などによっても変化する。 また他に比較すべき 腫瘍マーカーが知られているかどうかも、 重要な判断基準である。 更に、 既にが んを有することが明らかな患者における治療効果の確認、 あるいは再発の監視に おいては、 腫瘍マーカーは継続して測定される。 このような用途においては、 偽 陰性あるいは偽陽性の問題よりも、 がんに対する応答特性が重要視される。 これ らの判断基準に基づいて、 いくつかの B重瘍マーカーが実用化されている。 以下に 現在広く利用されている腫瘍マーカーの例を示す。

AFP (肝がん、 腎がん、 消化器系のがん）

CEA (肝がん、 腎がん、 消化器系のがん）

CA19-9 (すいがん、 胆道がん、 大腸がん）

CA125 (卵巣がん）

PSA (前立腺がん） NSE (肺がん-小細胞がん -）

CYFRA (肺がん-扁平上皮がん -）

これらの腫瘍マーカーは、 特定のがん種において、 腫瘍マーカーとして実用化 されたものと、 比較的多様ながん種に対して腫瘍マーカーとして認知されている ものがある。 たとえば、 NSEあるいは CYFRAなどは、 特定のがん種に対する腫瘍マ 一力一である。 他方、 AFP、 あるいは CEAなどは、 比較的多様ながん種において、 陽性化する腫瘍マーカーであると言える。

がん種に対する特異性が低く、 多様ながん種の腫瘍マーカーとして利用可能な 腫瘍マーカーは、 特に広域性 (broad spectrum)腫瘍マーカーと呼ばれる。 広域性 腫瘍マーカーは、 幅広いがん種の検出や治療効果の判定に利用することができる 点で、 がん種特異的なマーカーよりも有利である。 AFPあるいは CEAなどの公知の 広域腫瘍マーカーは、 肝臓、 消化器、 腎などの特定のがん種においては腫瘍マー カーとしての有用性が認められている。 しかしその他のがん種においては、 必ず しも腫瘍マーカーとしての有用性が認知されていない。 したがって、 公知の腫瘍 マーカーでは診断することが困難ながん種をカバーすることができる腫瘍マーカ 一が提供されれば有用である。

いくつかの疾患においては、 血中にフリーのレセプターが存在することが報告 されている （非特許文献 4〜 6 ) ことは既に述べた。 また、 インスリンレセプタ 一 _αサブユニットを血中に放出するトランスジヱニックマウスが、 高血糖、 高ィ ンスリン血症を呈することも確認されている （非特許文献 7 ) 。 しかし、 ヒトに おいて血中の遊離のィンスリン受容体ががんと関連していることを示唆する報告 はない。 これまでのインスリンレセプター αサブュニットと癌を結びつける知見 といえば、 1985年 2月， 米国 Genentech社と米国 MemorialSloan Kettering Cancer Centerのグループが、 ヒト .インスリン受容体の遺伝子をクローン化、 全ァミノ 酸配列を決定し、 アミノ酸配列の解析から， 上皮細胞増殖因子 （EGF) 受容体、 お ょぴガン遺伝子 src蛋白と相同性があることがわかったことが挙げられる。 発明の開示

本発明は、 血中に存在する遊離のインスリンレセプターの αサブュニットの測 定方法およぴ糖尿病並びにがんの診断方法の提供を課題とする。

本発明者らは、 インスリンの作用を妨げる原因について研究を続けた。 そして、 血中に遊離の状態で存在するインスリンレセプターの αサブュニットが、 インス リンの作用を妨げ、 高血糖をもたらすことを明らかにした。 本発明者らは、 生体 における遊離のインスリンレセプター αサブュニットと糖尿病の関係についての 解析を進めるために、 その測定系を確立する必要があると考えた。 そこで本発明 者らは、 血中に遊離した αサブユニットの測定方法を確立し本発明を完成した。 すなわち本発明は、 以下のインスリンレセプター αサブユニットの測定方法、 測 定用試薬、 糖尿病の診断方法並びに糖尿病の診断用試薬に関する。

〔1〕 次の工程を含む、 血中の遊離インスリンレセプター αサブユニットの測定 方法。

(1) 血液試料をインスリンレセプター αサブユニットを認識する抗体と接 触させる工程、

(2) 前記抗体と血液中に存在するインスリンレセプター αサブュニットの 結合を検出する工程、 および

(3) 両者の結合のレベルに基づいて血中の遊離ィンスリンレセプター αサ ブユニットの量を決定する工程

〔2〕 前記インスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体が固相に結合し ているか、 または固相に結合可能な標識を有する第 1の抗体であり、 第 1 の抗体に結合したインスリンレセプター αサブュニットをインスリンレセ プターひサブユニットを認識する第 2の抗体の結合によつて検出する工程 を含む、 〔1〕 に記載の方法。

〔3〕 インスリンレセプター αサブユニットを認識する抗体を含む、 血中の遊離 インスリンレセプター _αサブュニットの測定用試薬。

〔4〕 次の工程を含む、 糖尿病の診断方法。

a ) 被検者の生体試料における、 遊離インスリンレセプター _αサブュニッ トの量を測定する工程

b ) 該遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を、 対照と比較する 工程、 および

c ) 該被検者の生体試料における該遊離ィンスリンレセプターひサブュ- ットの量が対照と比較して高い場合に被検者が糖尿病であると判定す る工程

〔5〕 生体試料が血液試料である 〔4〕 に記載の診断方法。

〔6〕 遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を 〔1〕 に記載の方法によ り測定する、 〔5〕 に記載の診断方法

〔7〕 インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含むペプチドを認 識する抗体からなる糖尿病の診断用試薬。

あるいは本発明は、 インスリンレセプター αサブユニットのアミノ酸配列を含 むぺプチドを認識する抗体の、 糖尿病の診断用試薬の製造における使用に関する ₍ もしくは本発明は、 インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含む ぺプチドを認識する抗体の、 糖尿病の診断における使用に関する。

また本発明者らは、 生体における遊離のインスリンレセプター αサブュニット の役割について鋭意研究を続ける過程において、 各種がん患者由来の血清中のィ ンスリンレセプター αサブュニットを測定したところ、 各種がん患者の測定値と 健常者の測定値との間で有意な差が認められることを初めて実証した。 すなわち 本癸明者らは、 インスリンレセプター ctサブュニットの測定ががん診断に有用で あることを見出し、 本発明を完成した。 したがって本発明は、 以下のがんの診断 方法、 並びにがん診断用試薬に関する。

〔8〕 次の工程を含む、 がんの診断方法。 (a)被検者の生体試料における、 遊離インスリンレセプターひサブュニット の量を測定する工程

(b)該遊離インスリンレセプター αサブュニットの量を、 対照と比較するェ 程、 および

(c)該被検者の生体試料における該遊離ィンスリンレセプター αサブュニッ トの量が対照と比較して高い場合に被検者ががんであると判定する工程 〔9〕 生体試料が血液試料である上記 〔8〕 に記載の診断方法。

〔1 0〕 遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を 〔1〕 に記載の方法に より測定する、 〔9〕 に記載の診断方法

〔1 1〕 インスリンレセプター αサブユニットのアミノ酸配列を含むペプチドを 認識する抗体を含む、 がんの診断用試薬。

あるいは本発明は、 インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含 むぺプチドを認識する抗体の、 がんの診断用試薬の製造における使用に関する。 もしくは本発明は、 インスリンレセプター aサブュニットのアミノ酸配列を含む ペプチドを認識する抗体の、 がんの診断における使用に関する。

本発明は、 血中の遊離のインスリンレセプター αサブュニットの測定方法を提 供した。 これまで、 血中の遊離のインスリンレセプター αサブユニットの存在は 確認されていなかった。 またその測定方法も確立されていなかった。 本発明者ら により、 血中の遊離のインスリンレセプター αサブユニットは、 インスリンの作 用を妨げることが明らかにされた。 したがって、 血中の遊離のインスリンレセプ ター _αサブュニットの測定は、 糖尿病のリスクを明らかにするために有用である < 本発明者らは、 実際に糖尿病患者の血中の遊離のインスリンレセプター αサブュ ニット濃度が有意に高いことを明らかにした。 したがって、 本発明は糖尿病の診 断方法として有用である。

また本発明は、 遊離のインスリンレセプター αサブユニットの測定に有用な、 遊離型のインスリンレセプター αサブユニットとその製造方法を提供した。 本発 - 1 o - 明によって得ることができる、 遊離型のひサブユニットは、 標準試料や免疫原と して利用することができる。

また、 本発明は、 新たな癌の診断方法を提供した。 これまで、 遊離のインスリ ンレセプター _αサブユニットとの癌と関連が実証された例は報告されていなかつ た。 本発明者らは、 各種癌患者の血中の遊離のインスリンレセプター αサブュニ ット量が健常者より有意に高くなることを明らかにした。 したがって、 遊離のィ ンスリンレセプター _αサブュニットは、 がんマーカーとして利用することができ る。

本発明は、 次の工程を含む、 血中の遊離インスリンレセプター αサブユニット の測定方法を提供する。

(1) 血液試料をインスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体と接触させ る工程、

(2) 前記抗体と血液中に存在するインスリンレセプター αサブュニットの結合を 検出する工程、 および

(3) 両者の結合のレベルに基づいて血中の遊離インスリンレセプター αサブュニ ットの量を決定する工程

本発明において、 「遊離」 とは、 当該分子が血液中に分散して存在しているこ とを言う。 通常インスリンレセプターは、 細胞膜表面に局在する蛋白質である。 更に、 インスリンレセプターは、 骨格筋、 脂肪組織、 肝臓、 脳などに多く発現し ていることが明らかにされている。 つまり、 リンパ球などの血液細胞では、 イン スリンレセプターの顕著な発現は見られない。 したがって、 血中には遊離のイン スリンレセプターが存在するか否か不明であった。 ところが実際には、 血液中に もインスリンレセプターサブュニットが遊離していることが本発明者らによって 明らかにされた。

インスリンレセプターの測定方法については、 既に公知 （Human insulin recep tor radioimmunoassay ： applicablity to insu丄 in— resistant state. Am. J. Phy siol. 257 (Endocrinol. Metab. 20) E451- E457, 1989) である。 しかし血中に遊離の インスリンレセプター _αサブュニットが存在することは知られていないし、 その 測定方法も、 確立されていない。 わずかに血中における αサブユニットの存在の 可能性を指摘した文献 （J Clin Endocrinol Metab. 1992 May; 74 (5)： 1116-21. ) があるのみである。

本発明において、 血中に存在するインスリンレセプター αサブユニットは、 ィ ンスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体との結合を利用して測定する ことができる。 本発明に用いるインスリンレセプター αサブュニットを認識する 抗体は、 公知の方法によって得ることができる。 本発明において、 インスリンレ セプター aサブユニットの量は、 試料中の濃度として測定することができる。 試 料の単位体積あたりの量が濃度であることはいうまでも無い。

たとえばィンスリンレセプターの組み換え体を免疫原として、 本発明に必要な 抗体を得ることができる。 本発明者らは、 後に述べるようなアミノ酸配列をコー ドする cDNAの利用により、 インスリンレセプター αサブュニットを細胞外に分泌 させることができることを明らかにした。 このようにして得ることができる分泌 型のポリべプチド、 あるいはその断片等も本発明の抗体を得るための免疫原に利 用することができる。

たとえば配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードする分泌型のポリぺプチ ド、 あるいはその断片等は、 本発明の抗体を得るための免疫原として有用である ( これらのポリペプチドは、 公知のインスリンレセプター αサブユニットの cDNA、 あるいは配列番号： 1に示す塩基配列 （またはその断片） を発現可能に保持する ベクターで適当な宿主を形質転換することによって得ることができる。 配列番 号： 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、 ヒ トインスリンレセプタ 一遺伝子中、 シグナルぺプチド （一 2 7〜一： L ) 、 αサブュニット （ 1〜 7 3 5 ) 、 および ]3サブユニットの一部 （7 3 6〜9 2 6 ) の領域を構成するァミノ 酸配列をコードしている。 カツコ内は各領域の配列番号： 2における位置を示し ている。

必要な塩基配列からなる DNAは、 インスリンレセプター αサブュニット発現組織 から調製した mE Aを利用してクローニングすることができる。 あるいは、 公知の インスリンレセプター αサブュニットの cDNAの塩基配列を改変して配列番号： 1 に示した塩基配列からなる DNAを得ることもできる。 このようにして発現されたィ ンスリンレセプター aサブュニットの組み換え体は、 本発明に用いる抗体を得る ための免疫原として好ましい。

また、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、 かつインスリンレセプター αサブュニットとの免疫学的同 等性を有する分泌型のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、 配列番 号： 1に記載の塩基配列と 9 0 %以上のホモロジ一を有し、 かつインスリンレセプ ター αサブュニットとの免疫学的同等性を有する分泌型のポリぺプチドをコ一ド するポリヌクレオチドを利用して、 免疫原となるポリペプチドを取得し、 インス リンレセプター _αサブュニットの測定に使用する抗体を得てもよい。

あるいは、 インスリンレセプター αサブユニットのドメインペプチドを免疫原 に用いることもできる。 免疫原とするドメインペプチドは、 ペプチド合成装置に よって容易に合成することができる。 合成べプチドはキヤリァタンパク質に結合 させることによって、 免疫原とすることができる。

合成べプチドをキヤリァ蛋白質に結合させるためには、 マレイミ ドベンゾィル- Ν—ヒ ドロスクシンィミ ト法 ^maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide method^ 以 下 MBS法と省略する） 等が一般に用いられている。 具体的には、 合成ペプチドにシ スティンを導入し、 その SH基を利用して MBSによって KLHと架橋させる。 システィ ン残基の導入は、 合成したペプチドの N末端であっても、 C末端であってもよい。 なおキヤリァタンパク質には、 KLHのほかにもゥシ血清アルブミン等の任意のタン パク質を用いることができる。 KLHは、 免疫原性が強いことから好ましいキャリア タンパク質のひとつである。 こうして得られた免疫原を、 適当なアジュバントと混合して免疫動物に免疫す る。 アジュパントには、 フロイントコンプリートアジュバント（FCA)、 あるいはィ ンコンプリートアジュバント等が公知である。 免疫操作は、 抗体価の上昇が確認 されるまで適当な間隔で繰り返される。 本発明における免疫動物は特に限定され ない。 具体的には、 マウス、 ラット、 あるいはゥサギなどの一般的な免疫動物を 利用することができる。

抗体をモノクローナル抗体として得る場合には、 その産生に有利なものを利用 すれば良レ、。 たとえばマウスでは、 細胞融合用の骨髄腫細胞株が多く知られてい るうえに高い確率でハイプリ ドーマを樹立可能な技術が既に確立されている。 し たがってマウスは、 望ましい免疫動物のひとつである。

更に、 免疫処理は ώ iraに限定されない。 培養した免疫担当細胞をインビトロ で免疫感作する方法を採用することもできる。 これらの方法によって得られた抗 体産生細胞を、 形質転換させクローニングを行う。 モノクローナル抗体を得るた めに抗体産生細胞を形質転換する方法は、 細胞融合に限定されない。 たとえば、 ウィルスの感染によってクロ一ユング可能な形質転換体を得る方法が知られてい る。

本発明に用いるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 各種の抗原 に対する反応性に基づいてスクリーニングすることができる。 具体的には、 まず、 免疫原として用いたィンスリンレセプター αサブュニットやそのドメィンぺプチ ドに対する結合活性を指標に抗体産生細胞を選ぶ。 スクリーニングで選び出され たポジティブクローンは、 必要に応じてサブクローニングされる。

樹立したハイプリ ドーマを適当な条件の下で培養し、 産生される抗体を回収す れば本発明に用いるモノクローナル抗体を得ることができる。 ハイブリ ドーマは、 ホモハイプリ ドーマの場合には同系の動物の腹腔に接種して生体内培養が可能で ある。 この場合、 モノクローナル抗体は腹水として回収される。 ヘテロハイプリ ドーマの場合にはヌードマウスを宿主として生体内培養が可能である。 生体内培養のみならず、 適当な培養環境を与えて生体外で培養することも一般 に行われている。 たとえば RPMI1640や DMEM等の基礎培地がハイブリ ドーマの培地 として一般に利用されている。 これらの培地には、 抗体産生能を高く維持するた めに動物血清等の添加剤を加えることができる。 生体外でハイプリ ドーマを培養 する場合には、 モノクローナル抗体は培養上清として回収することができる。 培 養上清は、 培養終了時に細胞から分離することにより回収することもできるし、 あるいはホロ一ファイバーを応用した培養装置においては、 培養を継続しながら 連続的に回収することも可能である。

腹水や培養上清として回収したモノクローナル抗体は、 飽和硫安塩析によりそ のィムノグロブリン分画を分取し、 更にゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィ 一等の精製工程を経て本発明に用いるモノクローナル抗体とする。 この他にモノ クローナル抗体が IgGであれば、 プロティン A力ラムゃプロティン Gカラムによる アブイ二ティクロマトグラフィーに基づく精製方法が有効である。

一方、 本発明に用いる抗体をポリクローナル抗体として得るには、 免疫後に抗 体価の上昇した個体から採血し、 その血清を分離することにより抗血清を得るこ とができる。 抗血清から公知の方法でィムノグロブリンを精製し、 本発明に用い る抗体とすることができる。 ィムノグロブリンの精製において、 インスリンレセ プター αサブュニットをリガンドとするィムノアフィニティクロマトグラフィー を組み合わせれば、 インスリンレセプター ο;サブュニット特異抗体とすることが できる。

また、 以下に示す市販の抗体を組み合わせて本発明の測定に用いることができ る。 例えば、 モノクローナル抗体としては、 抗ヒトインスリンレセプターアルフ アサブュニット （Neomarker MS632) (LabVision社） 、 抗ヒトインスリンレセプ ターアルファサブユニット （IM0365) (ィムノテック社） 、 MAB1138 (ケミコン 社） などが挙げられる。 ポリクローナル抗体としては、 抗ヒトインスリンレセプ ターアルファサブユニット （ゥサギ） H- 78 (サンタクルーズ社） などを用いるこ とができる。

インスリンレセプター _αサブュニットに対する抗体が、 インスリンレセプター _αサブユニットと接触すると、 抗体は、 抗原抗体反応によって当該抗体が認識す る抗原決定基 （ェピトープ） に結合する。 抗原に対する抗体の結合は、 各種のィ ムノアツセィの原理によって検出することができる。 ィムノアッセィは、 不均一 系の分析方法と、 均一系の分析方法に大別される。 ィムノアツセィの感度と特異 性を高い水準に維持するためには、 モノクローナル抗体の利用が望ましい。 各種 のィムノアッセィフォーマツトによる本発明のインスリンレセプター αサブュニ ットの測定方法について、 具体的に述べる。

まず、 不均一系ィムノアッセィによるインスリンレセプター αサブユニットの 測定方法について述べる。 不均一系ィムノアッセィにおいては、 インスリンレセ プター αサブュニットに結合した抗体を結合しなかつたものと分離して検知する しくみが必要である。

分離を容易に行うために固相化試薬が一般に用いられる。 たとえば、 まずイン スリンレセプター αサブユニットを認識する抗体を固定した固相を用意する （固 相化抗体） 。 これにインスリンレセプター αサブユニットを結合させ、 更に標識 した第 2抗体を反応させる。

固相を液相から分離し、 更に必要に応じて洗浄すれば、 固相上にはインスリン レセプター αサブュニットの濃度に比例して第 2抗体が残る。 第 2抗体を標識し ておけば、 この標識に基づくシグナルを測定することによりインスリンレセプタ 一 _αサブュニットを定量することができる。

抗体の固相への結合方法は、 任意である。 たとえばポリスチレンなどの疎水性 素材には、 抗体を物理的に吸着させることができる。 あるいは、 各種の官能基を 表面に有する素材に対して、 抗体を化学的に結合させることもできる。 更に、 結 合性のリガンドで標識された抗体を、 当該リガンドの結合パートナーで捕捉する ことによって固相に結合することもできる。 結合性リガンドとその結合パートナ 一の組み合わせとしては、 アビジン一ビォチンなどを示すことができる。 固相と 抗体とは、 第 2抗体との反応と同時、 あるいはその後に結合させることができる ₍ 同様に第 2抗体の標識化も、 必ずしも直接標識でなくてもよい。 すなわち、 抗 体に対する抗体や、 アビチン一ビォチンといった結合性の反応を利用して間接的 に標識することもできる。

インスリンレセプター _αサブュニット濃度が既知の標準試料によって得られた シグナル強度に基づいて、 試料中のインスリンレセプター αサブュニット濃度が 決定される。

上記不均一系ィムノアッセィのための固相化抗体および第 2抗体は、 インスリ ンレセプター αサブユニットを認識する抗体、 あるいはその抗原結合部位を含む 断片であれば、 任意の抗体を利用することができる。 したがって、 モノクローナ ル抗体、 ポリクローナル抗体、 あるいは両者の混合物や組み合わせであってよい, なお両者をモノクローナル抗体とするときには、 異なるェピトープを認識するモ ノクローナル抗体を組み合わせるのが好ましい。

このような不均一系ィムノアッセィは、 測定対象抗原を抗体で挟むことからサ ンドィッチ法と呼ばれている。 サンドィッチ法は、 測定感度や再現性に優れるた め、 本発明における好ましい測定原理の 1つである。

不均一系のィムノアッセィには、 競合阻害反応原理を応用することもできる。 すなわち、 抗体に対する既知濃度のインスリンレセプター αサブュニットの結合 を、 試料中のインスリンレセプター αサブュニットが競合的に阻害する現象に基 づくィムノアッセィである。 既知濃度のインスリンレセプター αサブュニットを 標識しておき、 抗体に反応した （またはしなかった） インスリンレセプター αサ ブュニットを測定すれば試料中のインスリンレセプター _αサブュニット濃度を決 定することができる。

既知濃度の抗原と試料中の抗原とを同時に抗体に反応させれば競合的な反応系 が成立する。 また試料中の抗原と抗体の反応後に既知濃度の抗原とを反応させれ ば、 阻害的な反応系による分析が可能である。 いずれの反応系においても、 抗体、 あるいは試薬成分として用いる既知濃度の抗原のいずれか一方を標識成分とし、 他方を固相化試薬としておくことにより操作性に優れる反応系を構成することが できる。

これら不均一系のィムノアッセィにおいて、 標識成分としては放射性同位元素、 蛍光物質、 発光物質、 酵素活性物質、 肉眼的に観察可能な物質、 あるいは磁気的 に観察可能な物質などが用いられる。 これらの標識物質の具体例を以下に示す。 酵素活性物質：

ぺノレ才キシダーゼ グノレコース才キシダーゼ

アルカリホスファターゼ 乳酸脱水素酵素、 あるいは ゥレアーゼ、 カタラーゼ アミラーゼ等

蛍光物質： テトラメチルローダミンィソチオシァネート、

置換ローダミンイソチオシァネート、 あるいは

ジクロロトリアジンィソチオシァネート等

放射性同位元素：

トリチウム、

1²⁵1、 あるいは

181 J

中でも酵素のような非放射標識は、 安全性、 操作性、 感度等の点で有利な標識 のひとつである。 酵素標識と抗体、 あるいはインスリンレセプター αサブュニッ トとは、 過ョゥ素酸法やマレイミド法等の公知の方法により結合することができ る。

一方、 固相としては、 ビーズ、 容器内壁、 微粒子、 多孔質担体、 あるいは磁性 粒子などが用いられる。 これらの固相は、 ポリスチレン、 ポリカーボネート、 ポ リビュルトルエン、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリ塩ィヒビュル、 ナイロン、 ポリメタタリレート、 ラテックス、 ゼラチン、 ァガロース、 ガラス、 金属、 ある いはセラミック等の素材を利用して成型されたものを利用できる。 これらの固相 素材の表面に、 抗体等を化学的に結合するための官能基を導入した固相素材も知 られている。 固相と抗体 （あるいは抗原） についても、 ポリ- L-リジンゃグルター ルアルデヒド処理といった化学的な結合や、 物理吸着といった公知の結合方法を 応用することができる。

ここで例示した不均一系のィムノアッセィでは、 いずれも固相 液相の分離ェ 程や洗浄工程が必要となるが、 サンドィッチ法の変法であるィムノクロマトダラ フ法によれば、 これらの工程を簡単に処理することが可能である。

すなわち、 毛管現象によって試料溶液の移送が可能な多孔質担体に固相化抗体 を固定し、 その中を標識抗体と混合したインスリンレセプター αサブュニット含 有試料を毛管現象によって展開する。 展開中にインスリンレセプター αサブュニ ットは標識抗体と反応し、 更に固相化抗体と接触すると、 その位置に捕捉される _c インスリンレセプター αサブュニットと反応しなかった標識抗体は、 固相化抗体 に捕捉されることなく通過する。

結果的に固相化抗体の位置に残る標識抗体のシグナルを指標にィンスリンレセ プター αサブュニットの存在を検知することができる。 標識抗体を多孔質担体の 上流に予め保持させておけば、 試料溶液の滴下だけで全ての反応が開始し完結す るので、 きわめて簡便な反応系を構成することができる。 ィムノクロマトグラフ 法においては、 着色粒子のような肉眼的に識別しうる標識成分を組み合わせるこ とにより、 特殊な読取装置さえ不要な分析デバィスを構成することができる。

続いて均一系のィムノアッセィについて説明する。 以上のような反応液の分離 を必要とする不均一系の免疫学的分析方法に対して、 均一系の分析方法によって もインスリンレセプター αサブユニットを測定することができる。 均一系の分析 方法では、 抗原抗体反応の反応生成物を反応液から分離することなく検出するこ とができる。

抗原抗体反応に伴って生成する沈降物を観察することにより、 抗原性物質の定 量的な分析を行う免疫学的沈降反応は、 代表的な均一系の分析方法である。 免疫 学的沈降反応にはポリクローナル抗体を利用するのが一般的である。 モノクロ一 ナル抗体を応用する場合には、 インスリンレセプター αサブユニットに対して異 なるェピトープに結合する複数種のモノクローナル抗体を利用するのが好ましい。 免疫学的な反応に伴う沈降反応生成物は、 肉眼的に観察することもできるし、 あ るいは光学測定することにより数値化することもできる。

液相中での免疫学的な複合体の形成を利用したこれらの免疫学的分析方法に対 して、 ゲル中で反応を行う方法も公知である。 たとえば、 ォクテロニー法、 SRID 法、 あるいは免疫電気泳動法などがそうである。 これらのゲル中での反応に基づ く分析方法においても、 複数種のモノクローナル抗体の利用によつて明瞭な沈降 線を観察できるようになる。

抗体を感作した微粒子の抗原による凝集を指標とする免疫学的粒子凝集反応も、 一般的な均一系の分析方法である。 この方法でも先に延べた免疫学的沈降反応と 同じように、 ポリクローナル抗体、 あるいは複数種のモノクローナル抗体の組み 合わせを利用することができる。 微粒子への抗体の感作は、 抗体の混合物を感作 しても良いし、 あるいは抗体ごとに感作した粒子を混合することによつて調製す ることもできる。 こうして得られた微粒子は、 インスリンレセプター サブュニ ットとの接触により、 マトリクス状の反応生成物を生じる。 反応生成物は、 粒子 の凝集として検出することができる。 粒子の凝集は、 肉眼で観察することもでき るし、 光学測定することにより数値化することもできる。

均一系のィムノアッセィとして、 エネルギー転移や酵素チャンネリングに基づ く免疫学的分析方法が知られている。 エネルギー転移を利用した方法においては、 抗原上の接近したェピトープを認識する複数の抗体に対して、 それぞれドナー ァクセプターの関係にある異なる光学標識を結合させるようにする。 免疫学的な 反応が起きると両者が接近するため、 エネルギー転移現象が生じ、 消光や蛍光波 長の変化といったシグナルにつながる。 一方、 酵素チャンネリングとは、 やはり 接近したェピトープに結合する複数の抗体に対し、 一方の反応生成物が他方の基 質となっているような関係にある酵素の組み合わせを標識として利用する。 免疫 学的な反応によって両者が接近すると、 酵素反応が促進されることから両者の結 合を酵素反応速度の変化としてとらえることができる。

本発明はまた、 インスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体を含む、 血中の遊離インスリンレセプター αサブュニットの測定用試薬を提供する。 血中 に遊離インスリンレセプター αサブュニットが存在することは本発明者らが得た 新規な知見である。 したがって、 インスリンレセプター αサブユニットを認識す る抗体が、 血中の遊離インスリンレセプター αサブュュット測定用試薬として有 用であることも新規に見出された知見である。 本発明の測定用試薬を構成する抗 体は、 上記のようなアツセィフォーマットに応じて、 標識したり、 あるいは固相 に結合しておくことができる。

ここに例示した各種免疫学的分析方法に必要な標識抗体 （あるいは抗原） や固 相化抗体 （あるいは抗原） は、 濃度を検定したインスリンレセプター αサブュ二 ット標準、 希釈や洗浄に用いられる緩衝液等と組み合わせたキットとすることが できる。 '

本発明によるインスリンレセプター αサブュニットの測定方法には、 血液試料 が用いられる。 血液試料とは、 全血、 全血から分離された血清や血漿が含まれる < 全血は、 血球成分を溶血させた後に、 分析試料とすることもできる。 更に、 血液 試料は、 必要に応じて希釈することができる。

血中にインスリンレセプター _αサブュニットが遊離の状態で存在していること は、 本発明者らによって明らかにされた新規な知見である。 血中のインスリンレ セプター αサブユニットは、 健常者にも見出される。 しかしマウスを用いた実験 では、 血中へのインスリンレセプター αサブユニットの投与は、 高血糖とインス リン分泌量の上昇をもたらした。 したがって、 血中のインスリンレセプター aサ プユニットは、 糖尿病（2型糖尿病）のリスクファクター、 あるいは 2型糖尿病の 増悪因子として重要である。 そして、 生体における血中の遊離のインスリンレセ プター aサブュニットの測定は、 被検者の糖尿病のリスクを評価するために有用 な情報であると言える。

本発明者らは、 血中に遊離型のインスリンレセプター aサブュニットが存在す ることを明らかにした。 遊離型のインスリンレセプター aサブュニットをィムノ アツセィによって測定するためには、 それを認識する抗体が必要である。 また、 その抗体に対して生体中の遊離のインスリンレセプターひサブュニットと同様の 反応性を有する標準試料として利用可能な抗原が必要である。 本発明は、 このよ うな抗体を得るための免疫原、 あるいは標準試料として利用することができるィ ンスリンレセプター _aサブュニットの製造に有用なポリヌクレオチドを提供する _c すなわち本発明は、 以下の（a) - (d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド、 およ ぴ該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。

(a)配列番号： 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド

(b)配列番号： 2に記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド

(c)配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつインスリンレセプター αサブュニットとの免疫学的同等 性を有する分泌型のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド

(d)配列番号： 1に記載の塩基配列と 9 0 %以上のホモロジ一を有し、 かつィンス リンレセプター _αサブュニットとの免疫学的同等性を有する分泌型のポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド

(a)配列番号： 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、 ヒ トインスリ ンレセプター遺伝子中、 それぞれ以下の領域を構成するアミノ酸配列をコードし ている。 カツコ内に各領域の配列番号： 2における位置を示した。 また配列番 号： 1に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、 図 2にアンダー ラインをつけて示した。

シグナルぺプチド （― 2 7〜一 1 )

αサブユニット （1〜7 3 5 ) 、 および

βサブュニットの一部 （ 7 3 6〜 9 2 6 )

このようなポリヌクレオチドは、 配列番号： 1に示した塩基配列に基づいて、 当業者が合成することができる。 あるいは公知のインスリンレセプターの cDNAか ら、 必要な塩基配列を取得することもできる。 たとえば実施例においては、 ヒト インスリンレセプター遺伝子を制限酵素 Ssplで消化することにより、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得ている。

本発明者らは、 ヒ トインスリンレセプター αサブユニットに対して 3サブュニ ットの一部を付加したアミノ酸配列を発現させたときに、 発現生成物が細胞外に 効率的に分泌されることを見出した。 一般に細胞膜上に発現するレセプター分子 は、 細胞膜成分の除去が障害となって、 精製が容易でない。 あるいは細胞膜成分 の除去によって、 レセプター分子そのものの構造が維持できなくなる場合があつ た。 したがって、 レセプター分子を分泌型の蛋白質として発現させることは、 製 造技術として有用である。

本発明は、 遊離型のインスリンレセプター αサブュニットの標準試料あるいは 免疫原として有用なポリペプチドの産生を目的とする。 細胞外に分泌された組み 換え体は、 生体における存在形態と同じ遊離型の分子とみなすことができる。 つ まり、 たとえば組織から抽出された細胞膜上のレセプター分子に比べて、 分泌型 の蛋白質として発現させた本発明のポリべプチドは、 標準試料あるいは免疫原と して好ましい。

本発明のポリヌクレオチドは、 前記（c)または（d)に記載のポリヌクレオチドを 含む。 本発明において、 免疫学的同等性は、 抗体との反応性に基づいて決定する ことができる。 すなわち、 血中の遊離のインスリンレセプター aサブユニットに 対する抗体の反応性を、 ある蛋白質が吸収するとき、 この蛋白質は、 血中の遊離 のインスリンレセプター αサブュニットと免疫学的に同等であると言うことがで きる。 更にある蛋白質を適当な宿主細胞において発現させたときに、 その蛋白質 が細胞の培養上清に分泌されれば、 当該蛋白質が分泌型であることを証明するこ とができる。 通常、 インスリンレセプター遺伝子を形質転換体において発現させ た場合には、 J3サブユニットの膜貫通ドメインの機能によって、 レセプター分子 は細胞膜上に局在し、 培養上清中に αサブユニットを見出すことは難しい。

前記インスリンレセプター αサブュニットと免疫学的に同等なタンパク質にお いて変異するアミノ酸の数は、 免疫学的な同等性を保持する限り制限されない。 インスリンレセプター αサブユニットの場合、 変異するアミノ酸の数は通常、 100 アミノ酸以内であり、 好ましくは 50アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 30ァ ミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内である。 またその変異部位 は、 免疫学的な同等性を保持する限り制限されない。

アミノ酸配列の変異は、 人為的なものであっても、 自然において生じる変異で あってもよい。 アミノ酸を置換する場合には、 保存的置換を利用することができ る。 一般に蛋白質の機能の維持のためには、 置換するアミノ酸は、 置換前のアミ ノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。 このようなアミノ酸 残基の置換が、 保存的置換と呼ばれている。

例えば、 Ala、 Val、 Leu、 lieヽ Pro、 Met、 Phe、 Trpは、 いずれも非極性アミノ 酸に分類されるため、 互いに似た性質を有する。 また、 非荷電性のアミノ酸とし ては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Ginが挙げられる。 あるいは、 酸性アミノ 酸としては、 Aspおよび Gluが挙げられる。 更に、 塩基性アミノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。 これらの各グループを構成するアミノ酸は、 互いに似た 性質を有している。 そのため、 グループ内の他のアミノ酸に置換したときに、 蛋 白質の機能が維持される可能性が高い。

このような蛋白質は、 配列番号： 1に記載の塩基配列に変異を導入することに よって得ることができる。 既知の塩基配列からなる遺伝子に変異を導入する技術 は公知である。 あるいは、 化学合成によって目的とするアミノ酸配列からなる蛋 白質を調製することもできる。

また、 前記免疫学的に同等なタンパク質を単離するための他の方法としては、 ハイプリダイゼーシヨンスクリーニングを利用することができる。 たとえば、 配 列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、 またはその断片を利用 して、 これと相同性の高い DNAを単離することは当業者にとって容易である。 次に、 こうして単離された DNAの中から、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるポ リペプチドと免疫学的に同等な蛋白質をコードする DNAを選択することも、 当業者 が通常行いうることである。

このように配列番号： 1に記載の塩基配列カ らなる DNAとハイプリダイズする DN Aがコードするポリペプチドであって、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からな るポリべプチドと免疫学的に同等なポリぺプチドもまた本発明のポリべプチドに 含まれる。 免疫学的に同等なポリペプチドをコードする DNAを単離するためのハイ ブリダイゼーシヨンのストリンジェンシ一は、 当業者であれば適宜選択すること ができる。

ハイプリダイゼーシヨンの条件としては具体的には、 例えば 5 X SSC、 ホルムァ ミド非存在下で 25°Cの条件が挙げられる。 好ましくは 6 X SS (、 40%ホルムアミド で 25°Cで行う。 更に好ましくは 5 X SSC、 50%ホルムアミドで 40°Cで行う。 ハイプ リダィゼーシヨン後の洗浄は、 例えば、 2 X SSC、 37°Cで洗浄する。 好ましくは I X SSC、 55°Cで洗浄する。 更に好ましくは 1 X SSC、 60°Cで洗浄する。

また、 ハイブリダィゼーシヨンスクリーニングに代えて、 配列番号： 1に記載 の塩基配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 PCR法を利 用して本発明のポリヌクレオチドを単離することもできる。

上記ハイブリダィゼーシヨンスクリーニングまたは PCR法により単離することが できる、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと免疫学的に 同等なポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、 通常、 配列番号： 1に記 载の塩基配列と高い相同性を有する。 本発明における高い相同性とは、 ポリヌク レオチドの一部ではなく全体にわたって少なくとも 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 さらに好ましくは 4 0 %以上、 さらに好ましくは 6 0 %以上、 さらに 好ましくは 8 0 %以上の配列の同一性を有することを言う。 塩基配列の相同性を 決定するためのアルゴリズムが公知である （宮田隆ら著 「コンピューターによる 遺伝子のホモロジ一解析」 （遺伝子研究法 I、 東京化学同人） ） 。

本発明のポリヌクレオチドは、 例えば、 組み換えタンパク質の生産に用いるこ とが可能である。 本発明のポリペプチドを組み換えタンパク質として生産するた めの宿主としては、 大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞等を用いることができる ₍ 宿主細胞に応じて、 それぞれ適切なベクターが特定される。 各宿主細胞には、 た とえば次のような発現ベクターを用いることができる。

大腸菌： pGEXK(- ³ (フアルマシア） など

酵母： pYES2 (インビトロゲン） など、

昆虫細胞： PVL1392 (インビトロゲン） など、

動物細胞： pRc/CMV² (インビトロゲン） など

これらのベクターの宿主への導入方法としては、 生物学的方法、 物理的方法、 化学的方法などが当業者に知られている。 生物学的方法としては、 例えば、 ウイ ルスベクターを使用する方法を挙げることができる。 物理的方法としては、 例え ば、 エレクト口ポレーシヨン法、 ジーンガン（GENEGUN)法、 あるいはマイクロイン ジェクシヨン法が挙げられる。 また、 化学的方法としては、 例えば、 リボフヱク シヨン法、 リン酸カルシウム法、 DEAE-Dextran法が挙げられる。

宿主内で生産された組換えタンパク質は、 任意の方法で精製することができる ₍ 具体的には、 イオン交換カラム法、 ァフィ二ティーカラム等を利用する方法など が一般に用いられている。 組み換えタンパク質を GSTや 6 XHisなどとの融合タンパ ク質として発現させることによって、 検出や精製を容易にする方法も公知である ₍ 前記 (a) - (d)に記載されたポリヌクレオチドは、 いずれもインスリンレセプター _αサブユニット （または免疫学的同等性を有するポリペプチド） を分泌型の蛋白 質として発現させるために利用することができる。 細胞外に分泌されたインスリ ン αサブユニットは、 培養上清から容易に回収することができる。 あるいは、 培 養上清をそのまま標準試料や免疫原として用いることもできる。

たとえば、 血中の遊離のインスリンレセプター αサブユニットを測定するため の標準試料は、 次のようにして製造することができる。 まず、 前記の形質転換体 の培養上清を回収する。 回収された培養上清は、 そのまま、 あるいは目的の発現 生成物を精製した後に、 発現生成物の量を検定する。 発現生成物が純粋な蛋白質 として精製された場合には、 その蛋白質濃度を測定することによって、 発現生成 物の量を決定することができる。 あるいは培養上清のように、 もしも不純物が混 在するときには、 各種のクロマトグラフィーや電気泳動法などによって、 目的と する発現生成物を単離して、 その量を決定することができる。 発現生成物の量が 決定されれば、 当該蛋白質の標準試料として利用することができる。

なお、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 ヒトのインスリンレセプターに 由来するアミノ酸配列である。 このアミノ酸配列に対して、 異なるアミノ酸配列 を有するポリべプチドを発現生成物として利用した場合には、 両者のアミノ酸配 列の相違に基づいて、 分子量の相違を補正することができる。

本発明において、 ある蛋白質の標準試料とは、 当該蛋白質としてどれだけの量 の蛋白質が含まれているのかを、 予め決定した試料を言う。 標準試料は、 必要に 応じて希釈系列とすることができる。 希釈系列について、 先に述べたようなィム ノアッセィによってシグナルが計測される。 標準試料の蛋白質濃度と計測された シグナルの関係を、 標準曲線 （standard curve、 または検量線） として表すこと ができる。 こうして作製された標準曲線に基づいて、 実際の被検試料から得られ たシグナルから当該試料に含まれる測定対象物質の濃度を決定することができる < あるいは希釈系列の測定結果に基づいて回帰式を作製し、 被検試料の測定値を代 入することによって、 当該試料に含まれる測定対象物質の濃度を決定することも できる。

また本発明は、 次の工程を含む、 糖尿病の診断方法を提供する。

a ) 被検者の生体試料における、 遊離インスリンレセプター _αサブユニットの量 を測定する工程

b ) 該遊離インスリンレセプターひサブユニットの量を、 対照と比較する工程、 および

c ) 該被検者の生体試料における該遊離インスリンレセプター αサブュニットの 量が対照と比較して高い場合に被検者が糖尿病であると判定する工程 あるいは、 本発明は、 次の工程を含む、 がんの診断方法を提供する。

(a)被検者の生体試料中における、 遊離インスリンレセプター αサブュニットの量 を測定する工程

(b)該遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を、 対照と比較する工程、 お よび

(c)該被検者の生体試料における該遊離インスリンレセプター αサブュニットの量 が対照と比較して高い場合に被検者ががんであると判定する工程

本発明は、 糖尿病、 あるいはがん患者のインスリンレセプター αサブユニット 量が健常者と比較して有意に高いことが初めて明らかにされたことに基づいてい る。 インスリンレセプターは、 インスリンに特異的に結合する糖蛋白で、 分子量 は約 35〜40万と大きく、 《2 3 2というサブユニット構造をとっている （α :分子 量 1²〜13万， i3 ： 9万） 。 インスリンレセプターは、 インスリン結合活性のみなら ずチロシン特異的プロテイン 'キナーゼ活性を有しており、 インスリンとの結合 により活性化し、 細胞内にシグナルを伝える。 このためインスリンレセプターは、 通常、 筋肉などインスリンの標的組織の細胞膜上に局在する。 骨格筋、 脂肪組織、 肝臓、 脳などにインスリンレセプターが多く発現しているしていることが明らか になっているが、 リンパ球などの血液細胞では、 インスリンレセプターの顕著な 発現は見られない。 したがって従来は、 血中には遊離のインスリンレセプターが 存在するか否か不明であつた。

本発明の診断方法において、 生体試料中の遊離のインスリンレセプターの量は、 先に述ぺたような方法によって測定することができる。 特にサンドィツチ法は、 測定感度や再現性に優れるため、 本発明における好ましい測定原理の 1つである。 測定の結果は、 対照と比較される。 本発明において対照とは、 たとえば健常者の 生体試料の測定によって得られた遊離のィンスリンレセプターの量を示すことが できる。 健常者とは、 糖尿病あるいはがんでないことが明らかなヒトが含まれる。 望ましくは、 健常者とは、 疾患を有していないことが明らかなヒトである。

本発明の診断方法において、 生体試料とは、 生体から採取された任意の試料が 含まれる。 具体的には、 たとえば血液試料、 尿試料、 あるいは乳頭分泌物等は生 体試料に含まれる。 本発明の好ましい生体試料は血液試料である。 本発明者らは、 血液に遊離のインスリンレセプターが存在することを明らかにしている。 血液試 料は、 血液から分離された血液分画を含む。 具体的には、 血清、 血漿、 あるいは 血球成分を溶血させることによって得ることができる溶血試料などの試料は、 血 液試料に含まれる。 これらの試料の調製方法は公知である。 たとえば、 被検者か ら採取された血液から調製された血液試料を用いて、 本発明の診断方法を実施す ることができる。 更に、 血液試料は、 必要に応じて希釈することができる。

本発明はまた、 （1)成体から採取された血液試料中の遊離ィンスリンレセプター _αサブユニットの濃度を測定し、 （2)対照と比較する工程を含む、 糖尿病あるいは がんの検査方法を提供する。 対照との比較の結果、 有意に測定値が高い場合に、 被検者は、 糖尿病あるいはがんを有する可能性が高いことが明らかにされる。

たとえば両者の比較の結果、 健常者よりも遊離インスリンレセプターひサブュ ニットの量が高い場合には、 被検者が糖尿病あるいはがんであると判定される。 遊離インスリンレセプター αサブユニットの量の比較のためには、 通常、 たとえ ば健常者における前記遊離インスリンレセプター ο:サブュニットの量に基づいて、 標準値が設定される。 この標準値をもとに、 一定の範囲が許容範囲とされる。 一 般に、 標準値の ± 2 S. D.〜土 3 S. D.が許容範囲とされる。 本発明においては、 対 照と比較して測定値が高いことが指標となる。 したがって、 許容範囲として設定 された値の最大値が、 判定基準として利用されることになる。 この判定基準とし て利用することができる値は、 カツトオフ値と呼ばれる。

一般に、 マーカーとなる物質の測定値に基づいて、 統計学的に標準値や許容範 囲を設定する手法は公知である。 被検者における遊離インスリンレセプター αサ ブユニットの量が許容範囲 （カットオフ値） よりも高い値を示せば、 その被検者 は糖尿病であると予想される。 また許容範囲内、 あるいは許容範囲に満たない場 合には、 糖尿病あるいはがんの可能性は低いと予想される。

あるいは本発明に基づいて、 被検者が糖尿病のリスクファクターを有するかど うかを予測することができる。 実施例において示したように、 血中の遊離のイン スリンレセプター _αサブュニットの存在は、 糖尿病のリスクファクターである。 したがって、 たとえ被検者が糖尿病を有していない場合であっても、 対照と比較 して血中の遊離のインスリンレセプター サブュニットの測定値が高い場合には、 被検者は糖尿病のリスクファクターを有すると予測することができる。 リスクフ アクターの予測は、 本発明における糖尿病の診断に含まれる。

本発明によるがんの診断方法においては、 被験者の遊離インスリン.レセプター _αサブュニットの量が健常者よりも高い場合には、 被検者はがんであると判定さ れる。 本発明において診断の対象となるがんの種類は限定されない。 実施例に示 すとおり、 遊離インスリンレセプター αサブュュットの量は、 多様ながんの患者 の生体試料において有意に高値を示した。 したがって、 本発明の診断方法によつ てがんを有する可能性があると判定されたときには、 臓器を問わず、 なんらかの がんを有している可能性があることを示している。 本発明におけるがんは、 原発 巣か転移巣かを問わない。 また本発明におけるがんは、 固形がんにも限定されな い。 しかし、 好ましいがんとしては、 固形がんを示すことができる。 たとえば、 肺、 食道、 すい臓、 結腸、 乳、 肝、 直腸、 あるいは皮膚に生じるがんを、 本発明 によつて診断することができる。

本発明はまた、 インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含むぺ プチドを認識する抗体からなる糖尿病あるいはがんの診断用試薬を提供する。 血 中の遊離インスリンレセプター αサブュニットが糖尿病あるいはがんの診断に有 用であることは本発明者らが得た新規な知見である。 本発明の診断用試薬を構成 する抗体は、 上記のようなアツセィフォーマットに応じて、 標識したり、 あるい は固相に結合しておくことがでぎる。

本発明において、 インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含む ぺプチドを認識する抗体とは、 たとえば配列番号： 2に記載のァミノ酸配列から 選択された連続するアミノ酸配列を有するぺプチドを認識する抗体を含む。 通常、 抗体は、 3ァミノ酸残基以上のァミノ酸配列によつて構成される抗原決定基を認 識できるとされている。 本発明における抗体によって認識される好ましいァミノ 酸配列の長さは、 通常 3以上、 好ましくは 5以上、 たとえば 7〜 2 0アミノ酸残 基である。 8〜9アミノ酸残基のペプチドは、 一般に、 当該タンパク質に固有の 抗原決定基を構成しうる。

本明細書中に例示した各種免疫学的分析方法に必要な標識抗体 （あるいは抗 原） や固相化抗体 （あるいは抗原） は、 濃度を検定したインスリンレセプター α サブュニット標準、 希釈や洗浄に用いられる緩衝液等と組み合わせたキットとす ることができる

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明

図 1は、 実施例においてィンスリンレセプター αサブュニットの CH0細胞におけ る発現のために用いた cDNAによってコードされるアミノ酸配列と、 インスリンレ セプターの全長アミノ酸配列との関係を示す図である。 図 2は、 インスリンレセプター前駆蛋白質のアミノ酸配列に占める、 各サブュ ュットのアミノ酸配列、 および実施例において発現させた組み換え体のアミノ酸 配列の関係を示す図である。 図中、 大文字で示したのが サブユニット、 αサブ ュニットの Ν末端側と C末端側に小文字で示したアミノ酸配列が、 それぞれシグナ ルペプチドと i3サブユニットのアミノ酸配列である。 ]3サブユニットのアミノ酸 配列中、 ボックスで囲んだ部分が膜貫通領域 (TM)である。 図 1における Sspl切断 断片によってコードされるアミノ酸配列にアンダーラインを付けて示した。

図 3は、 抗インスリンレセプター αサブユニット抗体カラムによる、 インスリ ンレセプター _αサブュニットの精製結果を示す写真である。 抗インスリンレセプ ター （αサブユニット抗体、 ィムノテック 0365) 抗体カラムに吸着させたインス リンレセプター _αサブュニットを、 1. 5M MgCl₂含有ホウ酸ナトリゥム緩衝液で溶 出し、 溶出液を 200 / 1ずつ分取した。 それぞれのフラクションから 20 / Lをとり、 7. 5% SDS - PAGEし、 銀染色した。

図 4は、 実施例において作製したインスリンレセプター _αサブュニットの標準 曲線（standard curve)を示すグラフである。 図中、 縦軸は 4 5 O nmにおける吸光 度を、 横軸はサンプル中のインスリンレセプター _αサブュニット濃度 (ng/raL)を示 す。

図 5は、 インスリンレセプター αサブュニットを投与したマウスにおける血糖 値の経時的変化を示すグラフである。 図中、 縦軸は血糖値 (mg/mL)を、 横軸はイン スリンレセプター ctサブユニットを投与した時間を- 10とする経過時間 （分） を示 す。

図 6は、 ィンスリンレセプター aサプュニット投与の 1 0分後に、 糖負荷を与 えたマウスにおける血糖値の経時的変化を示すグラフである。 図中、 縦軸は血糖 値 (mg/mL)を、 横軸はインスリンレセプター aサブュニットを投与した時間を - 10 とする経過時間 （分） を示す。

図 7は、 健常者検体 7 0例のインスリンレセプター αサブュニットの測定値分 布を示すグラフである。 図中、 縦軸は各測定値 (ng/mL)の度数 （人数） または累積 (%) を、 横軸はインスリンレセプター αサブユエット濃度 (ng/mL)を示す。 図 8は、 糖尿病患者および健常人の血中インスリンレセプター αサブュニット 濃度 (ng/mL)の有意差検定の結果を示す図である。

図 9は、 各種がん患者および健常者血清中のィンスリン受容体ひサブュニット 濃度の分布を示す図である。 図中、 縦軸は血清中のインスリン受容体 αサブュニ ット濃度測定値 (ng/mL)を、 横軸は疾患 （がん） の種類を示す。 発明を実施するための最良の形態

以下実施例に基づいて、 本発明をより具体的に説明する。

1 . ヒトインスリン受容体 _αサブユニット cDNAの構築

CH0細胞でインスリンレセプター aサブュ-ットを培養上淸中に分泌させるため の cDNAを構築した。 本実施例において構築した cDNAの構造を図 1に示す。 ヒトイ ンスリン受容体の全長 cDNA (NM_000208)を含む pcDLl- HIR717 (Ebina et al. Cell. 40, 747-758, 1985)を利用し、 異なる位置で切断して各 cDNAを得た。 各 cDNAはそ れぞれ次に示すような構造を有する。

CH0-HIR：インスリンレセプター _aサブュニット + j3サブュ-ット

CHO-HIR ( a ) ：インスリンレセプター aサブュニットのみ

CH0 - HIR (Pstl) ： aサブュニットと サブュニットの N末端側 1-150ァミノ酸 CH0- HIR (SspI) ： aサブュニットと サブュ-ットの N末端側 1 - 191ァミノ酸 βサブュ-ットの膜貫通ドメインは、 Ν末端側 1 9 5 - 2 1 7に位置する。 つま り CH0- HIR (Pstl)および CHO- HIR (SspI)は、 いずれも βサブュニットの一部を含む 力 膜貫通ドメインは欠いている。 図 2において、 ）3サブユニットのアミノ酸配 列 （C末端側の小文字の部分） のうち、 ボックスで囲んだ部分が膜貫通領域に相当 する。

各 cDNAを動物細胞発現べクタ一 pCX 2に揷入して MRおよびその改変体の発現プ W

- 3 3 - ラスミドを得た。 それぞれの制限酵素は Takara (0tsu， Japan)及び New England Bi oLabs (Beverly, MA)より購入した。

2 . 培養および遺伝子導入

チャイニーズハムスター卵巣（CH0)細胞は、 F- 12 Nutrient Mixture (Ham' s F - 1 2, Invitrogen, Carlsbad, CA) 培地を用いて 5°/。 C0₂インキュベーターで培養した _c 10 /z gの 1で得た各発現プラスミドを制限酵素 Sea Iにより直線化し、 0. 5 _§ブラ ストサイジン（pSV2- bsr， Funakoshi, Tokyo, Japan)と共にエレク ト口ポレーショ ンにより CH0細胞に導入した。 トランスフヱクションから 24時間後より 10 /X g/mlブ ラストサイジン耐性 F- 12培地に交換し、 2週間後に残ったコロニーを単離した。 M Rの発現については、 ポリアクリルアミド電気泳動おょぴ抗 IR a抗体を用いたゥェ スタンプ口ッティングにより確認した。

3 . αサブユニットの精製

発現量の高いクローンを 10% FCSを含む F- 12培地で増幅し， 150 mm細胞培養デッ シュ（Corning)を用いて培養した。 100%まで培養後、 HEPES緩衝液 [20 mM HEPES (pH 7. 4) , 140mM NaCl, 5 mM KC1, 2. 5 mM MgCl₂， 1 mM CaClJ で 3回洗浄後，ディ シュ 1枚あたり 20 mlの無血清培地（CH0- S- SFM II DPM, Invitrogen)に交換した。

4日間培養した培地を回収し、 遠心分離 (1300 X _g、 10分、 4°C)により細胞成分 を除去した後の上清を集めた。 上清 1 mlあたり 6 μ 1 (50%懸濁液）の小麦胚芽レク チン（WGA)ァガロース （Amersham) を加え、 4 °C で 2時間ローテートして吸着させ た。 ァガロースは 5回洗浄した。 1回目と 5回目は HEPES緩衝液 [50 mM HEPES (p H 7. 4)、 150 mM NaCl, 1% Triton X- 100] で洗浄した。 2〜4回目の洗浄液は、 塩濃度を 500 mMとした。 吸着したタンパクは 0. 2 M N-ァセチルダルコサミン含有 H EPES緩衝液で溶出した。 抗インスリンレセプター ( aサブュニット抗体、 ィムノ テック 0³⁶5) 抗体カラム（べットポリューム； 0. 5 ml)に溶出したサンプルを加え て 4 °C で 1時間ローテ一トして吸着させた。 べットポリュームの 10倍量の HEPES緩 衝液でカラムを 3回洗浄したが、 この時も 2回目の洗浄は塩濃度を 500 mMに高めた _c 1. 5M MgCl₂含有ホウ酸ナトリゥム緩衝液で 200 μ 1ずつ分取した。

各フラクションにおけるインスリンレセプター αサブュニットの精製度は、 次 のようにして評価した。 まずそれぞれのフラクションから 20 Lをとり、 7. 5% SD S - PAGE及ぴ銀染色を行った。 染色後のゲルの写真を図 3に示した。 インスリンレ セプターひサブユニットに相当する分子量を有する蛋白質が、 ほぼ純粋な蛋白質 として単離されていることが確認できた （IR _aで示したパンド） 。 染色後のゲノレ を透過型スキャナーで読みとり NIHイメージソフトゥヱァで評価した。 蛋白質濃度 【ま protein assay dye reagent (BioRad, Hercules, CA)を用 ヽて BSAを標準 ίこして Bradfold法により定量した。

4 . 抗ヒトインスリンレセプター αサブユニット抗体の作製

精製したヒ トインスリンレセプター αサブユニットを用いて、 ゥサギ （日本白 色メス 3. 5kg) に対し皮下免疫した （約 1 0箇所、 1回 Z週） 。 5回免疫後に耳 下静脈より少量を採血し、 血清を分離して ELISAにより抗体価をチェックした。 まず 1/100M生理的リン酸化緩衝食塩液 (PBS) にヒ トインスリンレセプターひサ ブユニットを溶解して 0. lmg/mLの溶液を調製し、 この溶液をヌンク社製 96穴マイ クロプレート 「マキシソープ」 に 100 L添カ卩した。 室温 （20〜25°C) で 3時間放 置した後、 ゥエル内の溶液を吸引除去し、 5%のゥシ血清アルブミンを含む ΡΒ330 μ Lを加えた。 約 18時間 4°Cに静置し、 カップの未反応部分をブロックした。 ブロッ キング液を除き 300 μ Lの PBSで 3回洗浄して ELISA用プレートとした。

PBSで希釈した抗血清を希釈し、 希釈の系列を作製した。 希釈した抗血清 100 L を ELISAプレートの各ゥエルに加えた。 室温 （20〜25°C) で 1時間静置した後、 反 応液を除き、 続いて 30 μ ίの PBSで 4回洗浄した。 次に、 希釈したペルォキシダー ゼ標識抗ゥサギ IgG ( (株） 医学生物学研究所製） 100 / Lを加えた。 室温 （20~2 5°C) で 1時間静置反応させた後、 再度 30 μ Lの PBSで 4回洗浄した。

洗浄後のゥエルに 3， 3'，5， 5， -テトラメチルベンジジンと過酸化水素の溶液 100 _μ Lを発色基質として加えた。 一定時間反応させた後 1規定硫酸を添加して反応を停 止し、 波長 450nmにおける吸光度を測定した。 測定結果を図 4のグラフに示す。 こ の結果から明らかなように、 得られた抗血清は十分な抗体価を示した。 このよう に十分な抗体価を示したゥサギについては耳下静脈より 70mlの採血を行い、 約 30m 1の抗血清を得た。 さらに、 このようにして得たポリクローナル溶液から DEAEセル ロースカラムを用いて IgG分画を精製した。

5 . 標識抗体の作製

0. 1 M炭酸緩衝液 (_PH8. 5)に溶解した抗ゥサギ IgGモノクローナル抗体（2B9、 5 i g /mL)と HS- LC- ΒΙ0ΤΙΝ ( P I E R C E社製 25 μ g/mL) を混合し、 室温で 4時間ス ターラーを用いて攪捽した。 IgGと HS-LC- BI0TINは、 モル比が 1 ： 6 0になるよ うに混合した。 攪拌後、 この溶液を生理的リン酸緩衝液 ( P B S ) に透析し、 ビ ォチン標識抗体を得た。

6 . ヒ トインスリン受容体ひサブユニットの ELISAの構築

抗ヒトインスリン受容体 αサブュニッ ト抗体を 40 g/mL〜80 /z g/mLの濃度にな るように 0. 1M炭酸塩緩衝液 (pH9. 6)で希釈調製した。 希釈した抗体溶液を 96穴のマ イク口プレート （匪 C社製、 ィムノブレークアパートモジュールマキシソープ #47

3768) の各ゥエルに 100 At Lずつ分注した。 マイクロプレートは、 湿潤箱中で 2〜

8°C、 ー晚放置して抗体を結合させた。

インキュベート後、 抗体溶液を捨て、 PBSで 2回洗浄した。 余分な水分を除去し た後ブロッキング液 （1°/。BSA、 0. P/。NaN₃を含む PBS) を 1ゥエル当たり 200 し加え た。 マイクロプレートを湿潤箱中で 2〜8°C、 ー晚静置してブロッキングした。 ブ ロッキング後、 ブロッキング液を捨て余分な水分を除去した。 更にプレートを風 乾し、 使用時まで乾燥剤と共にアルミ袋に保存した。

7 . ELISAの評価

精製ヒトインスリン _αサブュニットを検体希釈用緩衝液 (20niM Tris-HCl, 150m M NaCl, 1% BSA, 10%正常マウス血清、 25mg/mL MAK33， 0. l%NaN₃、 1% ゥシ γ - グロブリン、 0. 056°/。 Tween 20, pH7. 5) で希釈しスタンダードとした。 検体は検 体希釈液で 2倍希釈し、 抗体感作マイクロプレートに 1ゥエル当たり 100 μ Lずつ 分注して室温で 3時間反応させて抗体 ·抗原複合物を形成させた。

反応後のゥエルを、 洗浄用緩衝液 (PBS+0. 05% Tween 20) で 5回洗浄した。 余 分な水分を除いた後、 検体希釈用緩衝液で希釈したピオチン標識抗体を 1ゥエル 当たり 100 // Lずつ分注し、 室温で 3時間反応させた。 反応後、 同じ洗浄用緩衝液 で 5回洗浄した。 余分な水分を除いた後、 アビジン HR P希釈用緩衝液 (20mM Tr is-HCl, 150mM NaCl, 1% BSA, 0. 15% Proclin, pH7. 5) で希釈したアビジン標識 ペルォキシダーゼを 1ゥエル当たり 100 L添加して室温で 3時間反応させた。 こ の反応により、 抗体'抗原 ·ピオチン化抗体 ·アビジン標識ペルォキシダーゼ複 合物を形成させた。

反応後のゥエルを洗浄用緩衝液で 5回洗浄した。 余分な水分を除いた後、 TM B発色基質 （MO S S社、 TMBH- 100) を 1ゥエル当たり 100 μ L添加した。 室温で 約 20分間反応させて発色させた後、 1ゥエル当たり 100 / Lの 1規定硫酸を加えて 発色を停止した。 次いで波長 450nmにおける吸光度を測定した。 検体中のインスリ ンレセプター aサブユニットの濃度は、 スタンダードの吸光度より作成した検量 線から読み取った。 上記のようにして構築した ELISAによって、 インスリンレセプ ター αサブュニットを測定できることが確認された。

8 . インスリンレセプター _αサブユニットの投与の影響

8 - 1 0週令の雄マウスを 1 6時間絶食後、 pentobarbital麻酔し頸静脈より精 製したインスリンレセプター αサプユニットを 1 0 O ng投与した。 インスリンレ セプター αサブュニットは、 0. 1%BSAを含む の生理食塩水に溶解して投与し た。 インスリンレセプター サブユニット投与後のマウスから、 経時的に尾静脈 より採血し血糖値を測定した。 対照として、 0. 1°/。BSAを含む の生理食塩水の みを同様にしてマゥスに投与した。

結果は図 5に示した。 対照のマウスは絶食状態が続くため少しずつ血糖値は低 下した。 一方インスリンレセプター αサブュニットを血中投与したマウスでは、 血糖値の経時的な上昇が観察された。 これは投与したインスリンレセプター αサ ブュニットがインスリンと結合することにより、 インスリンの作用が阻害された と考えられる。

9 . インスリンレセプター αサブユニットの投与の影響 （グルコース負荷）

7と同じ条件でインスリンレセプターひサブュニットを投与した 1 0分後に、 腹空内にグルコース （ 2 g/Kg body weight)を投与した。 グルコースの投与後に経 時的に尾静脈より採血し血糖値を測定した。 対照として、 0. 1%83 を含む50 しの 生理食塩水のみを同様にして投与したマゥスに、 同量のグルコースを投与した。 結果は図 6に示した。 インスリンレセプター αサブユニットを投与すると、 グ ルコース負荷試験で耐糖能異常を示すことが確認された。 以上の 2つの結果は、 インスリンレセプター αサブュニットが血中に存在すると、 インスリンと結合し インスリン作用を阻害し、 血糖値を上昇させ、 糖尿病の増悪因子になる可能性が 高いことを示す。

1 0 . 糖尿病患者血清中のィンスリン受容体 αサブュニットの測定

2種類の抗ヒトインスリン受容体 αサブユニットモノクローナル抗体 （マウス） を用いて、 血中のインスリン受容体 αサブュニットを測定するサンドイッチ ELISA を開発した。

標識抗体は上記の方法に従い、 モノクローナル抗体を用いて作成した。 0. 1M炭 酸緩衝液 （ ρ Η8. 5) に溶解した抗 _αサプュニットモノクローナル抗体（ΙΜ0365) 5 μ g/mLと HS - LC- BIOTIN (PIERCE社製 25 μ g/mL) を混合し、 室温で 4時間スターラー を用いて撹拌した。 IgGと NHS- LC- BIOTINはモル比が 1 ： 6 0になるように混合し た。 撹拌後、 この溶液を生理的リン酸緩衝液 (PBS) に透析し、 ビォチン標識抗体 を得た。

同様に、 モノクローナル抗体を用いて固相プレートの作成した。 抗 サブュニ ットモノクローナル抗体 （Neomarker MS632) を 0. 1M炭酸緩衝液 （pH9. 6) に 10 /z g /mLの濃度に溶解して lOO ^ L/well 4 °C—晚感作した後、 PBS+ 1 %BSAを 200 μ L/ weir添加して室温で 2時間ブロッキングし、 風乾して密封し、 保存した。

これらの抗体を用いて、 上記の測定条件に従って検体のィンスリン受容体 αサ ブュニット濃度を測定した。

健常者の検体として、 徳島大学医学部の学生から提供された血清のうち糖尿病 の家族歴のある検体及ぴ¾ぴのある検体を除いた 70検体を測定した。 その分布か らノンパラメトリック法により平均値 + 3 SDを暫定的なカットオフ値とした （図 7 ) 。 その結果、 カットオフ値は 13. 3 g/mLとなった。

次いで、 徳島大学医学部において、 インフォームドコンセントを実施して提供 された糖尿病患者検体 168検体を測定した （図 8 ) 。 その結果、 糖尿病患者血清中 のィンスリン受容体 αサブュニットの濃度は平均 10. 7 μ g/mL、 最大値 23. 3 μ g/mL となり、 健常者との間に明らかな差が認められた。

このことから、 血中のインスリン受容体 αサブユニットの測定値は、 糖尿病診 断において有用であると考えられた。

1 1 . がん患者血清中のィンスリン受容体 αサブュニットの測定

次いで、 ベンダーより購入した各種がん患者血清を検体として、 インスリン受 容体 _αサブユニットの濃度を測定した。 測定した患者検体は、 肺癌、 食道癌、 す い臓癌、 結腸癌、 乳癌、 肝臓癌、 直腸癌各 10検体である。 測定の結果を表 1及ぴ 図 9に示す。 ィンスリン受容体 αサブュニットの濃度は、 いずれの癌においても 健常人と比較して有意に高い値を示した。 このことから、 血中におけるインスリ ン受容体 αサブュニットの測定は、 癌の診断に有用であるといえる。 - 9 -

3¾丄

13ng/mL以上 陽性率

月 ΐ癌 20/20 100

食道癌 10/10 100

すい臓癌 9/10 90

結腸癌 19/20 95

乳癌 9/10 90

肝臓癌 6/10 60

直腸癌 10/10 100

皮膚癌 8/10 80

健常者 0/70 0 産業上の利用可能性

本発明により、 血中の遊離のィンスリン受容体 aサブュ-ッ トの測定方法が提 供された。 血中の遊離のインスリン受容体 aサブユニットの測定値は、 糖尿病の 診断マーカーとして有用である。 すなわち血中の遊離のインスリン受容体 _aサブ ュニットの測定値が対照と比較して高い場合には、 被検者は糖尿病であること、 あるいは糖尿病のリスクファクターを有することが予測される。

また、 本発明により、 新たながんの診断方法が提供された。 血中の遊離のイン スリン受容体 aサブュニットの測定値は、 がんの診断マーカーとして有用である _t すなわち血中の遊離のィンスリン受容体 _aサブュニットの測定値が対照と比較し て高い場合には、 被検者はがんであることが予測される。 インスリン受容体 aサ ブユニットは、 幅広い臓器のがんに対して、 健常者よりも高い測定値を示した。 したがって、 インスリン受容体 αサブユニットは、 複数の種類のがんのいずれに 対してもマーカーとして利用することができる。 すなわち、 本発明によって、 新 たな広域腫瘍マーカーが提供された。

Claims

請求の範囲 次の工程を含む、 血中の遊離インスリンレセプター αサブユニットの測定方 法。

(1) 血液試料をィンスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体と接触 させる工程、

(2) 前記抗体と血液中に存在するインスリンレセプターひサブュニットの結 合を検出する工程、 および

(3) 両者の結合のレベルに基づいて血中の遊離インスリンレセプター αサブ ユニットの量を決定する工程

前記インスリンレセプター αサブュニットを認識する抗体が固相に結合して いる力、 または固相に結合可能な標識を有する第 1の抗体であり、 第 1の抗 体に結合したインスリンレセプター αサブュニットをインスリンレセプター _αサブュニットを認識する第 2の抗体の結合によって検出する工程を含む、 請求項 1に記載の方法。

インスリンレセプター αサブユニットを認識する抗体を含む、 血中の遊離ィ ンスリンレセプター αサブュニヅトの測定用試薬。

次の工程を含む、 糖尿病の診断方法。

a ) 被検者の生体試料における、 遊離インスリンレセプター αサブユニット の量を測定する工程

b ) 該遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を、 対照と比較するェ 程、 および

c ) 該被検者の生体試料における該遊離インスリンレセプターひサブュニッ トの量が対照と比較して高い場合に被検者が糖尿病であると判定するェ 程

生体試料が血液試料である請求項 4に記載の診断方法。

6 . 遊離インスリンレセプター αサブュニットの量を請求項 1に記載の方法によ り測定する、 請求項 5に記載の診断方法

7 . インスリンレセプター αサブュニットのアミノ酸配列を含むペプチドを認識 する抗体からなる糖尿病の診断用試薬。

8 . 次の工程を含む、 がんの診断方法。

(a)被検者の生体試料における、 遊離インスリンレセプター _αサブュニットの 量を測定する工程

(b)該遊離インスリンレセプター _αサブュニットの量を、 対照と比較する工程、 および

(c)該被検者の生体試料における該遊離ィンスリンレセプター _αサブュニット の量が対照と比較して高い場合に被検者ががんであると判定する工程

9 . 生体試料が血液試料である請求項 8に記載の診断方法。

1 0 . 遊離インスリンレセプター αサブユニットの量を請求項 1に記載の方法に より測定する、 請求項 9に記載の診断方法。

1 1 . インスリンレセプター αサブユニットのアミノ酸配列を含むペプチドを認 識する抗体からなるがんの診断用試薬。