JPH08103280A

JPH08103280A - 変異ヒトインスリンレセプターｄｎａ

Info

Publication number: JPH08103280A
Application number: JP7149365A
Authority: JP
Inventors: Yosuke Ebina; 洋介蛯名
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1996-04-23

Abstract

(57)【要約】【目的】インスリン非依存型糖尿病の遺伝子診断への
応用を可能とする変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ
を提供する。【構成】ヒトインスリンレセプターＤＮＡ中８３１番
目のＴｈｒをコードする塩基配列がＡｌａをコードする
塩基配列に変異および／または１３３４番目のＴｙｒを
コードする塩基配列がＣｙｓをコードする塩基配列に変
異した変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ、あるいは
該変異部分を含む上記変異ヒトインスリンレセプターＤ
ＮＡ断片、該断片よりなるインスリン非依存型糖尿病診
断用プローブ、ならびに該断片を含むインスリン非依存
型糖尿病診断剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はインスリン非依存型糖尿
病（Ｎｏｎ−Ｉｎｓｕｌｉｎ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤ
ｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ：以下ＮＩＤＤＭと
いう）におけるインスリンレセプター構造遺伝子の異常
に関し、さらに詳しくは特定部位に変異を含む変異ヒト
インスリンレセプターＤＮＡおよびその断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＮＩＤＤＭは幾つかの遺伝子異常と、肥
満、ストレス、加齢などの環境因子が加わって発症する
と考えられている、人類が抱える最も頻度の高い遺伝病
の１つである。現在我が国にも約５００万人の患者がい
ると言われており、近年、癌、脳卒中、心筋梗塞に次ぐ
４大疾患に指定され、その対策が緊急に望まれている。
ＮＩＤＤＭは通常、食事療法や運動療法によって症状や
検査結果が改善されることが多いことから、これを早期
に、できれば発症前に診断することが望ましい。現在、
ＮＩＤＤＭの診断は、その初期においては、空腹時にグ
ルコース７５ｇを経口投与し、３０分おきに採血して、
２時間血糖値を測定して糖尿病を診断するＯＧＴＴなど
の繁雑な検査をしなくては発見できない場合が多く、簡
単かつ確実な診断法による早期発見と適切な発症予防が
求められている。

【０００３】現在までのところ、ＮＩＤＤＭの原因遺伝
子は明らかになっていないが、インスリン作用機構に関
与する因子の遺伝子、またはインスリン分泌に関与する
因子の遺伝子が候補遺伝子と予想されている。このう
ち、インスリン作用に関与する因子としては、インスリ
ンレセプター、インスリンレセプターサブストレートー
１（ＩＲＳ−１）、グルコーストランスポータータイプ
４などが考えられており、またインスリン分泌に関与す
る因子の遺伝子としては、グルコーストランスポーター
タイプ２、グルコキナーゼ、ミトコンドリア遺伝子など
が考えられている。後者の２つの遺伝子についてＮＩＤ
ＤＭ中での異常について検索されたが、いずれも１％前
後に過ぎないことが報告されている（厚生省糖尿病調査
研究事業発症機序班、平成５年度中間報告）。

【０００４】インスリンが標的細胞に作用するには、そ
の細胞膜上に存在するインスリンレセプターと結合する
ことが必須であり、またＮＩＤＤＭの初期にはインスリ
ン抵抗性が存在するという多くの報告がある（Ｔａｙｌ
ｏｒ，Ｓ．Ｉ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ４１：１４７３−１
４９０，１９９２）ことから、インスリンレセプターが
関与遺伝子である可能性についても検討されてきた。イ
ンスリンレセプターに異常が存在すると、高度のインス
リン抵抗性を示し、高インスリン血症となる重篤な糖尿
病となるはずである。しかしながら、ＮＩＤＤＭではそ
のような特徴を示す症例はほとんどないことから、イン
スリンレセプター異常はＮＩＤＤＭとは関係しないと従
来考えられてきた。

【０００５】一方、最近になって本発明者を含む研究者
によって多くのインスリンレセプター異常症が発見さ
れ、変異の種類により患者の検査結果と症状が多彩であ
ることが明らかとなってきた（Ｍ．Ｔａｉｒａｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：６３−６６，１９８
９；Ｆ．Ｓｈｉｍａｄａｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ
３３５：１１７９−１１８１，１９９０）。これにより
ＮＩＤＤＭの発症原因の一部にインスリンレセプター遺
伝子異常が存在する可能性が示唆された。しかしなが
ら、ＮＩＤＤＭとの関連においてインスリンレセプター
遺伝子異常を大規模かつ系統的に検索したことは今まで
になく、また遺伝子異常の具体的位置についても不明の
ままであった。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】かかる状況において、本発明
者はヒトインスリンレセプター遺伝子異常とＮＩＤＤＭ
との関連を解明すべく、日本人の典型的ＮＩＤＤＭ患者
の血液から染色体ＤＮＡを調製し、インスリンレセプタ
ーＤＮＡの塩基配列を鋭意研究した結果、ＮＩＤＤＭ患
者に有意な頻度のインスリンレセプターの質的異常が存
在することを発見し、本発明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトインスリ
ンレセプターＤＮＡ中８３１番目のＴｈｒをコードする
塩基配列がＡｌａをコードする塩基配列に変異および／
または１３３４番目のＴｙｒをコードする塩基配列がＣ
ｙｓをコードする塩基配列に変異した変異ヒトインスリ
ンレセプターＤＮＡ、あるいは該変異部分を含む上記変
異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ断片を提供する。

【０００８】インスリンレセプターはインスリンを特異
的に結合してその情報を細胞内に伝達する生体膜の受容
体であって、２本のα鎖（７３５残基、分子量８４，２
１４）と２本のβ鎖（６２０残基、分子量６９，７０
０）から成る。インスリンレセプターの遺伝子は２２エ
クソンから成っており、そのうち１１エクソンはαサブ
ユニットをコードし、他の１１エクソンがβサブユニッ
トをコードする（Ｓ．Ｓｅｉｎｏｅｔａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１
１４−１１８，１９８９）。ヒトインスリンレセプター
の塩基配列ならびにこれと対応するアミノ酸配列を配列
表の配列番号１に示す。本願発明の変異ヒトインスリン
レセプタ−ＤＮＡは、βサブユニットエクソン１３の８
３１番目のＴｈｒをコードする塩基配列（ＡＣＧ）がＡ
ｌａをコードする塩基配列（ＧＣＧ）に変異および／ま
たはβサブユニットエクソン２２の１３３４番目のＴｙ
ｒをコードする塩基配列（ＴＡＣ）がＣｙｓをコードす
る塩基配列（ＴＧＣ）に変異した変異ヒトインスリンレ
セプターＤＮＡ、ならびに該変異部分を含む上記変異ヒ
トインスリンレセプターＤＮＡの断片である。本願発明
の変異ヒトインスリンレセプターの変異部位を図７〜１
１に示す配列（配列表の配列番号１の配列と同じ）中に
四角で囲んで示す。

【０００９】本願発明の変異ヒトインスリンレセプター
ＤＮＡは、日本人の典型的なＮＩＤＤＭ患者５１人のイ
ンスリンレセプター全２２エクソン遺伝子をＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法にて増幅し、ｐＵ
Ｃ１９ベクターに挿入後、ＤＮＡ塩基配列を決定するこ
とによって得られた。ＤＮＡ塩基配列分析の結果、片親
の遺伝子のβサブユニットエクソン１３の８３１番目の
ＴｈｒがＡｌａに変異している症例が３例と、また片親
の遺伝子のβサブユニットエクソン２２の１３３４番目
のＴｙｒがＣｙｓに変異している症例が１例発見され
た。

【００１０】前者の変異（Ｔｈｒ^８３１→Ａｌ
ａ^８３１）に見られるアミノ酸置換は従来までに報告さ
れていないものである。ｃＤＮＡ上でこの変異を作り、
動物細胞で強制発現させ、レセプター機能を解析した
が、顕著なレセプター機能の障害は見られなかった。し
かしながら、この変異は正常人２７２人を検索したとこ
ろ発見されず、また統計学的処理によりＮＩＤＤＭ発症
と関連していることが明らかとなった。さらに、この変
異（ＩＲ^Ａ８３１）とＮＩＤＤＭ発症との関連を試験す
るために、ＩＲ^Ａ８３１をもつ一家系についてのデータ
を分析した。その結果、ＩＲ^Ａ８３１のｈｅｔｅｒｏｚ
ｙｇｏｕｓ変異がＮＩＤＤＭ発症の原因であることが強
く示唆された。

【００１１】一方、後者の変異（Ｔｙｒ^１３３４→Ｃｙ
ｓ^１３３４）に関しても顕著なレセプター機能の障害は
観察されなかった。また、一家系を解析した結果、この
変異はこの家族のＮＩＤＤＭ発症とは関連していないと
思われた。しかし、この変異インスリンレセプターはＰ
Ｉ３−キナーゼと結合できなかった。本発明者らは最近
インスリンシグナル伝達、特にインスリンによるグルコ
ーストランスポーターのｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎに
はＰＩ３−キナーゼが関与していることを証明している
（Ｆ．Ｋａｎａｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：７６２
−７６８，１９９３）。したがって、この変異がＮＩＤ
ＤＭ発症と関連している可能性を示唆するものである。

【００１２】本願発明の変異ヒトインスリンレセプター
ＤＮＡはＮＩＤＤＭ発症原因遺伝子の少なくとも約６％
の質的変異を構成し、ＮＩＤＤＭの遺伝子診断への応用
を可能とする有意な数値である。ＮＩＤＤＭの発症に関
与する遺伝子は複数存在し、またそれぞれの遺伝子の中
の変異はｈｏｔｓｐｏｔが存在し、そのうち本願発明
の変異インスリンレセプターＤＮＡの変異部分を含む数
箇所が主要なものを占めると予想される。したがって、
今後他の関与変異が解明されると、本願発明の変異ヒト
インスリンレセプターＤＮＡまたは該変異ヒトインスリ
ンレセプターＤＮＡの断片と組み合わせることにより、
簡単かつ確実なＮＩＤＤＭの遺伝子診断が可能となる。
さらにかかる遺伝子診断と従来の診断法を組み合わせて
ＮＩＤＤＭの早期診断を行うことにより適切な予防と治
療に多大な貢献をするものと思われる。

【００１３】また上記の診断に用いるには、本願発明の
変異部分を含む変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ、
該変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡの断片のみなら
ず、これらと相補的なＤＮＡまたはその断片も診断プロ
ーブとして有用である。したがって、（ａ）ヒトインス
リンレセプターＤＮＡ中、βサブユニットエクソン１３
の８３１番目のＴｈｒをコードする塩基配列（ＡＣＧ）
がＡｌａをコードする塩基配列（ＧＣＧ）に変異した変
異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ断片、（ｂ）ヒトイ
ンスリンレセプターＤＮＡ中、βサブユニットエクソン
２２の１３３４番目のＴｙｒをコードする塩基配列（Ｔ
ＡＣ）がＣｙｓをコードする塩基配列（ＴＧＣ）に変異
した変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ断片、（ｃ）
上記（ａ）または（ｂ）の変異ヒトインスリンレセプタ
ーＤＮＡ断片と相補的なＤＮＡ断片、も本願発明のＮＩ
ＤＤＭの診断プローブとして有用である。

【００１４】これらの診断プローブ用ＤＮＡ断片は一般
に、上記変異部分を含む約１００塩基までの塩基、好ま
しくは変異部分を含む１０〜５０塩基、より好ましくは
変異部分を含む１０〜３０塩基の長さの塩基配列で構成
される。

【００１５】本願発明のＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、例
えば、シリカなどの支持体上での固相法を利用するＤＮ
Ａ自動合成機を用いて本願発明の塩基配列に従って合成
することができる。

【００１６】本願発明にかかる上記遺伝子診断は、本願
発明によって明らかにされ特徴付けられた前記特定の変
異を検出するものである限りにおいて、その手法等には
何らの限定もなく各種の方法を広く採用することができ
る。本願発明によって検出すべき遺伝子変異が明らかに
されこれが特定されている以上、かかる本願開示に従え
ば、その検出の為の方法の適宜採用は当業者に容易であ
ろう。

【００１７】例えばかかる方法は、上記特定された位置
の塩基配列の解析を行うことによっても可能であり、も
ちろんこれを包含する。サザンハイブリダイゼーション
法やドットハイブリダイゼーション法（いずれもＳｏｕ
ｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９
８：５０３−５１７，１９７５等参照）も採用しうる選
択であろう。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ法（Ｒｅｓ
ｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型分析
法）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Ｏｒｉｔａ，
Ｍ．，ＩＷａｈａｎａ，Ｈ．，Ｋａｎａｚａｗａ，
Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄＳｅｋｉｙａ，
Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．
Ｓ．Ａ．，８６：２７６６−２７７０，１９８９等参
照）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＰＣＲ−
特異的配列オリゴヌクレオチド法）、ＰＣＲ−ＳＳＯと
ドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特
異的オリゴヌクレオチド法（ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｏｌｉｇｏｍｅｒ：ＡＳＯ；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．
Ｋ．，Ｂｕｇａｗａｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．
Ｔ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ａｎｄＥｒｌｉｃｈ，
Ｈ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６３−１６６，１
９８６等参照）等のＰＣＲ法を利用するＤＮＡの増幅手
法との組み合わせによる方法は、少量のＤＮＡ試料を利
用して簡便かつ容易にしかも感度および精度の高い検出
が可能であり好ましく例示することができる。

【００１８】特に本発明においては、その簡便さから、
ＲＦＬＰ法および／または対立遺伝子特異的ハイブリダ
イゼーション法の採用を好ましく例示することができ
る。以下に、かかる検出法を例にとり、より詳細に説明
する。

【００１９】なお、本発明の検出法において採用され得
る各種の操作、例えば、一部ＤＮＡの化学合成、ＤＮＡ
の切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、
ＤＮＡの単離、精製、複製、選択等はいずれも常法に従
うことができる［分子遺伝学実験法、共立出版（株）１
９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９
９０年発行等参照］。例えば、ＤＮＡの単離精製は、ア
ガロースゲル電気泳動法等に従うことができ、ＤＮＡ配
列の決定は、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．ａｎｄＣｏｕｌｓｏｎ，
Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：５４６３−５４６７，１９７７）
や、マクサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．ａ
ｎｄＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９−５６０，１９８
０）等に従うことができる。上記ＤＮＡ塩基配列の決定
は、市販のシークエンスキット等を用いることによって
も容易に行い得る。ＤＮＡの特定領域の増幅のためのＰ
ＣＲ法もまた常法（例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｓ
ｃｈａｒｔ，Ｓ．，Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．Ａ．，Ｍｕｌ
ｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｅｒｌｉｃ
ｈ，Ｈ．Ａ．ａｎｄＡｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５等参
照）に従うことができる。これら各種の基本的操作は、
例えば本出願に引用の各種文献においても採用されてお
り、後述の実施例とともに参照される。

【００２０】本発明の検出法において、測定対象である
ゲノムＤＮＡは、ヒト由来のサンプルであり、これを含
むものであれば特に限定なく採用できる。ゲノムＤＮＡ
は、これらサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製
することができる。

【００２１】該ゲノムＤＮＡより、本発明にかかる変異
部位を含むＤＮＡ領域を増幅し、多量にかつ濃縮された
被検体を得ることができる。これは、例えばＰＣＲ法に
従い実施でき、上記エクソン１３または２２の変異部位
を含む領域のみを特異的に増幅するように適宜選択した
プライマーを採用することにより行われる。かかるプラ
イマーの設定は常法に従えばよく、また増幅する領域の
塩基長等にも制限はなく通常１００ｂｐから５００ｂｐ
とすることができる。かかるプライマー設定の好適な例
は、例えばフランキングイントロニック配列（ｆｌａｎ
ｋｉｎｇｉｎｔｒｏｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ）に相
同性のプライマー（Ｓｅｉｎｏ，Ｓ．，Ｓｅｉｎｏ，
Ｍ．ａｎｄＢｅｌｌ，ＧＬ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３
９：１２３−１２８，１９９０）を採用するものであ
り、これは後述の実施例におけるエクソン１３にかかる
領域の増幅のために使用されている。また、エクソン２
２にかかる領域の増幅では、一例として、センスプライ
マー：５’−ＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＴＧ
ＴＧＣＴＧＧ−３’とアンチセンスプライマー：５’−
ＡＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＴ−
３’が採用されている。かかるプライマー設定によれ
ば、それぞれ３２２ｂｐ（エクソン１３）および３４６
ｂｐ（エクソン２２）の増幅されたＤＮＡフラグメント
として上記所望領域が提供される。

【００２２】ＰＣＲ法に従い増幅された所望ＤＮＡ領域
を利用し、その領域に含まれる本願発明特定の変異を検
出確認することができる。後述する実施例では、エクソ
ン１３にかかる変異の検出はＲＦＬＰ法に従い実施され
ている。Ａｌａ^８３１（ＧＣＧ）の変異は、制限酵素Ｃ
ｆｏＩの特異的切断サイトを生じさせている。したがっ
て、かかる変異を有する上記エクソン１３のＰＣＲ増幅
産物（３２２ｂｐ）は、これをＣｆｏＩ消化に付すこと
により、１０２ｂｐと２２０ｂｐの２つのフラグメント
を与え、一方、この変異のない野生型ではこの切断は生
じない（３２２ｂｐ）。生成したフラグメントは常法に
従い特定バンドとして確認される。

【００２３】エクソン２２にかかる変異の検出では、前
記した診断プローブ用ＤＮＡ断片を利用する、対立遺伝
子特異的ハイブリダイゼーション法が採用されている。
これは、前記した特定の診断プローブを採用して本願発
明特定の変異を検出する限りにおいて常法に従い行うこ
とができるが、例えば後述する実施例において採用され
た条件は次の通りである。

【００２４】ニトロセルロースフィルターに移した上記
エクソン２２のＰＣＲ増幅物（３４６ｂｐ）のハイブリ
ダイゼーションは、プローブ溶液（６×ＳＳＣ、１０×
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍ
ｌサケ精子ＤＮＡおよび^３２Ｐ標識プローブを含む）
中、３０℃一晩にて実施された。ハイブリダイズしたフ
ィルターは、２回洗浄（０．１％ＳＤＳの６×ＳＳＣ
中、５４℃、各２０分間）後、常法によるオートラジオ
グラフィーに付された。ここで採用された、野生型（Ｔ
ｙｒ^１３３４：ＴＡＣ）と区別しうるＩＲ^{ｃ１３３４}：
変異（Ｃｙｓ^１３３４：ＴＧＣ）特異的なプローブは、
^３２Ｐ標識プローブ：５’−ＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＡ
ＧＧＧＡＴＧＴ−３’である。

【００２５】上記のようにして得られたバンド（エクソ
ン１３の変異にかかる１０２ｂｐと２２０ｂｐの２つの
バンドまたはエクソン２２の変異にかかる３４６ｂｐの
ハイブリダイズしたバンド）のパターンおよび確認によ
り、本願発明にかかる変異の存在検出をすることができ
る。

【００２６】なお、このような遺伝子診断をするに際し
て、本願発明にかかる変異の存在検出をするための手段
あるいは試薬を有効成分として含有する診断剤を利用す
るのが好適である。したがって、本願発明は、かかるイ
ンスリン非依存型糖尿病診断剤をも提供する。該診断剤
は、本願発明にかかる変異の存在検出をするための方法
に応じた、特異的な試薬が必須成分として含有される。
かかる特異的試薬は、採用する検出方法に従い適宜設定
されるが、例えば、前記した診断プローブ用ＤＮＡ断片
および／または特定の制限酵素等の本願発明にかかる変
異を特異的に検出するための手段に必要な試薬として特
徴付けられる。また、本願発明の変異にかかる領域を特
異的にＰＣＲ増幅するための試薬、例えばそのために設
定されたプライマー等は、本発明診断剤の必須成分とは
考えられないが、これらは、ハイブリダイゼーションの
ための試薬類と同様に、本発明診断剤に含ませることも
できる。

【００２７】以下の実施例において本願発明を詳しく説
明するが、本願発明はこれに限定されるものではない。

【００２８】

【実施例】

実施例１：ヒト染色体ＤＮＡの分離千葉大学医学部第２内科牧野博士らのグループより日本
人の典型的ＮＩＤＤＭ患者約１００名の血液１０ｍｌず
つを恵与された。ヒト染色体ＤＮＡの分離は以下の手順
で行った。１）２本の５０ｍｌブルーキャップチューブにそれぞれ
４５ｍｌのＡ液（０．３２ＭＳｕｃｒｏｓｅ、１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ
_２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１０ｍｌのコマゴ
メピペットを用いて入れた。２）約１０ｍｌの血液を採取した。３）血液約５ｍｌずつをＡ液の入った２本のブルーキャ
ップチューブに移して、転倒混和した。４）４℃にて３，０００ｒｐｍで１０分遠心した。５）上清を注意深く捨てて、さらにこのチューブをキム
ワイプの上に逆さに立てて液を除いた。６）このチューブに５ｍｌのコマゴメピペットで４ｍ１
のＢ液（０．０７５ＭＮａＣｌ、０．０２４ＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０））を加えて混合し、ペレットを底から
剥がした。これをもう１本のチューブに移して、ボルテ
ックスミキサーでよく混合した。７）この混合液にオートピペットにて１ｍｌのＣ液（５
％ＳＤＳと２ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを
等量加えたもの）を加え、よく混合して一晩３７℃で反
応させた。８）５ｍｌのコマゴメピペットで５ｍｌのフェノール溶
液を加え、キャップをして充分混合した。これにさらに
５ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１）混合液を加えてキャップをして３０分混合した。９）１５ｍｌのオレンジキャップのコニカルチューブに
全液を移し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。１０）先端を切ったパスツールピペットで上清を注意深
く取り、新しいオレンジキャップチューブに移した。５
ｍｌのフェノール・クロロホルム混合液（１：１）を加
え、３０分混合した。１１）３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。１２）先端を切ったパスツールピペットで上清を注意深
く取り、１本の５０ｍｌのブルーキャップチューブに移
した。１３）オートピペットで０．５ｍｌのＤ液（３Ｍ酢酸ナ
トリウム）を加え、キャップを締めて混合した後、コマ
ゴメピペットで１０ｍｌの冷エタノール（９９．９％）
をゆっくり重層した。１４）キャップを締めてゆっくり転倒混和すると、染色
体ＤＮＡは白い不溶物として出現した。これをパスツー
ルピペットの先を曲げたものですくいとり、そっと１ｍ
ｌの７０％エタノール溶液中に約１５秒間浸した後、該
不溶物を２００μｌのＥ液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）が入ったエッペ
ンドルフチューブに移した。１５）エッペンドルフチューブにキャップをして、ボル
テックスミキサーで数回混合し、ＤＮＡをよく溶かし
た。

【００２９】また、非糖尿病者２７２名から同様にして
染色体ＤＮＡを分離した。

【００３０】実施例２：ＰＣＲ法によるインスリンレセ
プター遺伝子エクソンの増幅とサブクローニングおよび
プラスミドＤＮＡの分離清野ら（Ｓ．Ｓｅｉｎｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１４−１
１８，１９８９；Ｓ．Ｓｅｉｎｏｅｔａｌ．，Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ３９：１２３−１２８，１９９０）の方
法により、インスリンレセプター遺伝子のすべての２２
エクソンを増幅できるプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ
法によって、インスリンレセプター遺伝子を増幅した。

【００３１】すなわち、０．５ｍｌのチューブに下記組
成の混合Ｆ液９９μｌを加えてからＤＮＡ１μｌ（１μ
ｇ）を加えて混合した：上記混合物にサンプルの蒸発防止のためにミネラルオイ
ルを重層し、また熱伝導率をよくするために、ヒートボ
ックスのウエルにもミネラルオイルを１滴ずつ入れた。
これを用いて以下の条件でＰＣＲを実施した。

【００３２】

【００３３】ＰＣＲで増幅されたサンプルにクロロホル
ム１００μｌを加えて、よくボルテックスミキサーで混
合し、１分間遠心した。下層をパスツールピペットで充
分に除いて、上層からＤＮＡを得た。

【００３４】このようにして得たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動に付して精製し、アルカリホ
スファターゼ処理したｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位へ
ライゲーションさせ、大腸菌へこの組換え体を導入し
た。数百個のアンピシリン耐性コロニーから１２個のコ
ロニーを拾いだし、５０％以上のコロニーにＰＣＲＤ
ＮＡ断片が入っていることを各エクソンごとに確認し
た。残り数百個のコロニー全部を寒天培地からかきと
り、液体培地で増殖後、アルカリ法により粗プラスミド
ＤＮＡを分離し、さらにポリエチレングリコール沈殿法
を用いてＲＮＡを除いた。本実施例の方法のように多数
の大腸菌トランスフォーマントを用いると、父方、母方
両遺伝子からのＰＣＲ産物はほぼ同量含まれると考えら
れ、したがってこのような方法で分離したＤＮＡの塩基
配列には父方と母方の遺伝子配列が出現してくることに
なる。

【００３５】実施例３：ＤＮＡ塩基配列の決定アイソトープを用いたｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｍａｘａｍ，
Ａ．Ｍ．ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５６０−５
６４，１９７７）により実施例２で得られたＤＮＡ断片
の塩基配列を決定した。簡単にのべると、ＰＣＲによる
ＤＮＡ増幅に用いたプライマーをＤＮＡ断片にハイブリ
ダイゼーションさせ、アイソトープラベルしたｄＣＴＰ
を用いてシーケネースでＤＮＡ合成させ、電気泳動後、
オートラジオグラフィーを行った。

【００３６】その結果、アミノ酸置換を伴わないＤＮＡ
塩基配列の変異が１０カ所と、アミノ酸置換を伴う変異
が４例発見された。

【００３７】上記アミノ酸置換を伴う変異のうち３例は
インスリンレセプターβサブユニットエクソン１３の８
３１番目のアミノ酸ＴｈｒがＡｌａに変異した以下の変
異をもつものであった。

【００３８】この変異を有するＮＩＤＤＭ患者を含む５名のＮＩＤＤ
Ｍ患者のインスリンレセプターβサブユニットエクソン
１３のＤＮＡ塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真を
図１に示す。３番目のレーンの患者はＴｈｒ^８３１（Ａ
ＣＧ）とＡｌａ^８３１（ＧＣＧ）の両配列をもつｈｅｔ
ｅｒｏｚｙｇｏｔｅであることが判明した。これと同じ
配列をもつ患者が他に２名存在した。

【００３９】また、アミノ酸置換を伴う変異の他の１例
はインスリンレセプターβサブユニットエクソン２２の
１３３４番目のアミノ酸ＴｙｒがＣｙｓに変異した以下
の変異をもつものであった。

【００４０】この変異を有するＮＩＤＤＭ患者を含む８名のＮＩＤＤ
Ｍ患者のインスリンレセプターβサブユニットエクソン
２２のＤＮＡ塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真を
図２に示す。７番目のレーンの患者はＴｙｒ
^１３３４（ＴＡＣ）とＣｙｓ^１３３４（ＴＧＣ）の両配
列をもつｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅであることが判明し
た。

【００４１】実施例４：哺乳動物細胞で発現させた変異
インスリンレセプターの機能的性状の検討試験方法（１）発現プラスミドの構築ｃＤＮＡ上でＰＣＲ法を用いて２種の人工変異ｃＤＮＡ
であるインスリンレセプター：ＩＲ^Ａ８３１（Ｔｈｒ
^８３１がＡｌａ^８３１に変異したもの）およびＩＲ
^{Ｃ１３３４}（Ｔｙｒ^１３３４がＣｙｓ^１３３４に変異し
たもの）を作製した。

【００４２】次いで人工変異ｃＤＮＡであるＩＲ
^Ａ８３１、ＩＲ^{Ｃ１３３４}を哺乳動物発現ベクターＳＲ
α（Ｙ．Ｔａｋｅｂｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌＢｉｏｌ．８：４６６−４７２，１９８８）（それ
ぞれＳＲαＩＲ^Ａ８３１およびＳＲαＩＲ^{Ｃ１３３４}）
にサブクローニングした。対照として用いた野生型イン
スリンレセプターは文献記載の方法（Ｆ．Ｋａｎａｉ
ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４
５２３−１４５２６，１９９３）で構築し、ＳＲαＩＲ
^ＷＴとした。（２）野生型インスリンレセプターおよび人工変異イン
スリンレセプターを発現するＣＨＯ細胞の樹立リン酸カルシウム沈殿法により、ＣＨＯ細胞をＳＲαＩ
Ｒ^ＷＴ、ＳＲαＩＲ^Ａ８３１またはＳＲα
^{Ｃ１３３４}（各１０μｇ）、およびｐＳＶ２−ｎｅｏ
（１μｇ）でトランスフェクションした。Ｇ４１８（Ｓ
ｉｇｍａ社製）４００μｇ／ｍｌで選択した後、ヒトイ
ンスリンレセプターを発現する細胞を、文献記載の方法
（Ｈ，Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．２８０：７６９−７７５，１９９１）を用いて
^１２５Ｉ−標識インスリン結合により同定した。細胞表
面のレセプターの数はスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ）分析（Ｇ．Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４
９）によって計算した。（３）レセプターチロシンキナーゼ活性の測定文献記載の方法（Ｈ．Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：７６９−７７５，１９９
１）を用いて、９６ウエルプレートでＩＲ^ＷＴおよびＩ
Ｒ^Ａ８３１のインスリン刺激したレセプター自己リン酸
化を実施した。レセプターβ−サブユニットへの^３２Ｐ
の取り込みは６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出し、Ｂｉｏ−
ｉｍａｇｅ−ａｎａｌｙｚｅｒＢＡＳ２０００で測定
した。（４）インスリンレセプターとＰＩ３−キナーゼのα−
タイプｐ８５サブユニットとのインスリン誘導複合体の
形成ＰＩ３−キナーゼのα−タイプｐ８５サブユニット、な
らびに野生型または人工変異インスリンレセプター（Ｉ
Ｒ）を一過性に発現させるために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ^ＴＭ試薬（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＣＯＳ−７
細胞をＳＲαｐ８５α（１．５μｇ）とＳＲαＩＲ、Ｓ
ＲαＩＲ^Ａ８３１またはＳＲαＩＲ^{Ｃ１３３４}（各１．
５μｇ）でトランスフェクションした。１０^−７Ｍイン
スリンで１０分間刺激した後、細胞溶解物を調製し、Ｉ
Ｒのβサブユニットを認識する抗ＩＲ抗体１Ｇ２、また
はウサギポリクローナル抗ｐ８５α抗体、ならびにタン
パク質Ｇ−セファロースとともにインキュベートした。
免疫沈降物を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。抗
ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）またはＩＲのαサブユ
ニットを認識する抗インスリンレセプター抗体３Ｂ１１
を用いてイムノブロットを行った。結果（１）Ａ８３１変異上記試験方法（２）によって得られたＩＲ^ＷＴ（クロー
ンＮｏ．１２、２１）およびＩＲ^Ａ８３１（クローンＮ
ｏ．１０、１７）を安定に発現する２つのクローンを検
討した。

【００４３】図３ＡはＩＲ^ＷＴ（クローン１２、２１）
およびＩＲ^Ａ８３１（クローン１０、１７）のスッキャ
ッチャード分析を示す。各クローンのインスリン結合部
位の数を測定した。高親和性結合部位の数はＩＲ^ＷＴお
よびＩＲ^Ａ８３１のそれぞれについて１細胞当たり１．
１、１．５×１０^６および０．５、０．９×１０^６であ
り、解離定数（Ｋｄ）は２．８、３．５ｎＭおよび１．
７、２．７ｎＭであった。レセプターからの^１２５Ｉ−
インスリンのｐＨ依存性解離を試験したところ、ＩＲ
^ＷＴおよびＩＲ^Ａ８３１のいずれにおいても、ｐＨが
７．５から５．５に減少するのに応じて解離が起こるこ
とが観察され、野生型と人工変異型で差はなかった。

【００４４】また、上記（３）の試験方法によりこれら
のレセプター自己リン酸化活性を測定した。得られた結
果を図３Ｂ示す。図から明らかなように、レセプター自
己リン酸化活性はレセプター数に応じて増加した。５０
％最大（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）刺激はＩＲ^ＷＴお
よびＩＲ^Ａ８３１それぞれにおいて、５．５、５．４×
１０^−１０Ｍおよび５．０、４．９×１０^−１０Ｍであ
り、野生型と人工変異型の間で顕著な差はなかった。

【００４５】さらに、内在基質ＩＲＳ−１に対するチロ
シンキナーゼ活性を抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２
０）を用いるイムノブロットで測定した。得られた結果
を図３Ｃに示す。図から明らかなように、ＩＲＳ−１
（分子量１６０，０００）は、レセプターβユニット
（分子量９５，０００）の自己リン酸化速度と平行して
チロシン残基においてインスリン依存的にリン酸化され
た。

【００４６】次いで各ＩＲを安定に発現するＣＨＯクロ
ーン間の相違を排除するために、ＩＲ^ＷＴおよび１Ｒ
^Ａ８３１を一過性に発現するＣＯＳ細胞を用いてインス
リン結合とレセプター自己リン酸化を試験した。その結
果、野生型と人工変異レセプターとの間にインスリン結
合親和性およびレセプターキナーゼ活性の顕著な相違は
見られなかった。また、レセプタープロセシング、イン
ターナリゼーション、分解、インスリン刺激によるグル
コース取り込み、グリコーゲン合成、およびＤＮＡ合成
などにおいても野生型と人工変異レセプターとの間に顕
著な相違は観察されなかった。したがって、Ａ８３１変
異に顕著なレセプター機能の障害は見いだされなかっ
た。（２）Ｃ１３３４変異Ａ８３１と同様の実験をＣ１３３４変異について実施し
て、ＩＲ^{Ｃ１３３４}のレセプター機能障害を検討した。

【００４７】ＩＲを安定に発現するＣＨＯクローンを用
いる試験では、ＩＲ^{Ｃ１３３４}とＩＲ^ＷＴとの間の顕著
な相違は観察されなかった。

【００４８】ただし、ＰＩ３−キナーゼに対する親和性
では相違が見られた。ＩＲの自己リン酸化されたＴｙｒ
^１３３４は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ
の８５−ｋＤａ制御サブユニット（ｐ８５）のＳＨ２ド
メインとの推定的結合モチーフ（Ｙ（Ｐ）ＸＸＭ）に位
置していることが知られている（Ｄ．Ｊ．ＶａｎＨｏ
ｒｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：２９−３２，１９９４）。インスリンに応答するＰ
Ｉ３−キナーゼへの自己リン酸化ＩＲの結合によってこ
の酵素が活性化されるので、このメカニズムはＩＲＳ−
１によるＰＩ３−キナーゼの活性化の別経路であるかも
知れない。本発明者らは先に、ＰＩ３−キナーゼがグル
コーストランスポータータイプ４（ＧＬＵＴ４）の転移
を媒介することを報告している（例えば、Ｆ．Ｋａｎａ
ｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：７６２−７６８，１９
９３参照）ので、ＩＲＣ１３３４とＰＩ３−キナーゼの
Ｐ８５との直接的相互作用を試験した。

【００４９】まず、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニ
ットをＩＲ^ＷＴ、ＩＲ^Ａ８３１およびＩＲ^{Ｃ１３３４}を
用いてＣＯＳ細胞中で一過性に発現させた。インスリン
処理の後、細胞溶解物を抗ＩＲβ抗体（αＩＲβ）また
は抗ｐ８５抗体（αｐ８５）のいずれかで沈降させた
（図４）。免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体（αＰ
Ｙ）（図４Ａ）または抗ＩＲのαサブユニット抗体（α
ＩＲα）（図４Ｂ）を用いるイムノブロットにより試験
した。一過性発現系においては、インスリン処理によっ
て、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブユニットのチロシン
リン酸化、ならびにｐ８５のＩＲ^ＷＴへの結合が刺激さ
れた。抗ＩＲα抗体を用いるイムノブロットで測定した
ところ、抗ＩＲβ抗体は、ＩＲ^ＷＴ、ＩＲ^Ａ８３１およ
びＩＲ^{Ｃ１３３４}をほぼ同定数に沈降させた（図４
Ｂ）。抗ｐ８５抗体を用いるイムノブロットで測定した
ところ、抗ｐ８５抗体はＩＲ^ＷＴ、ＩＲ^Ａ８３１および
ＩＲ^{Ｃ１３３４}をほぼ同定度に沈降させた。

【００５０】次いで、ｐ８５およびＩＲβのチロシンリ
ン酸化、ならびにｐ８５のＩＲ^ＷＴ、ＩＲ^Ａ８３１およ
びＩＲ^{Ｃ１３３４}への結合を試験した。抗ホスホチロシ
ン抗体（図４Ａ）を用いるイムノブロットで測定したと
ころ、すべてのＩＲは同定度にｐ８５をチロシン残基で
リン酸化した。ＩＲ^{Ｃ１３３４}のチロシンリン酸化はＩ
Ｒ^ＷＴおよびＩＲ^Ａ８３１と比較して減少しており（図
４Ａ）、この減少はＩＲ^{Ｃ１３３４}のチロシンキナーゼ
活性の減少と関連していなかった。基質への^３ ^２Ｐの取
り込み試験によると、ＩＲ^{Ｃ１３３４}は自己リン酸化部
位および内在基質ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１に対し
て、ＩＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞中でのＩＲ^ＷＴ
やＩＲ^Ａ８３１とほとんど同定度のチロシンキナーゼ活
性を示すので、抗ホスホチロシン抗体はＩＲβのその他
の自己リン酸化部位よりも自己リン酸化Ｙ^１３３４の部
位をより良く認識するように思われる。抗ｐ８５抗体は
ＩＲ^ＷＴおよびＩＲ^Ａ８３１を共沈させたが、ＩＲ
^{Ｃ１３３４}は共沈させなかった（図４Ｂ）。このこと
は、ＩＲ^{Ｃ１３３４}がｐ８５とは結合しないこと、なら
びにｐ８５に対するＩＲの主要結合部位はＹ^１３３４残
基であることを示唆する。

【００５１】実施例５：統計学的処理正常人２７２名を解析して本願発明のヒトインスリンレ
セプターＤＮＡ中８３１番目のＴｈｒがＡｌａに変異し
た変異インスリンレセプターＤＮＡをもつ者を検索した
ところこの変異部位をもつ者は見いだされなかった。そ
こでカイ二乗検定による統計学的処理によって本願発明
の変異インスリンレセプターＤＮＡとＮＩＤＤＭとの関
連性を試験した。この結果を以下の表１に示す。

【００５２】１）非糖尿病者はＯＧＴＴなどの検査を行って診断した
ものではなく、問診により自身を含め、両親、兄弟姉
妹、両祖父母が糖尿病の症状がなく、また糖尿病と診断
され通院などもしていない者を非糖尿病者として扱っ
た。２）Ｔ^８３１→Ａ^８３１の変異はＹａｔｅｓの連続補正
を行ったカイ二乗検定によりＰ（危険率）＜０．０５で
ＮＩＤＤＭ発症に有意に差がある。またＮＩＤＤＭの自
然発症率が５％と仮定して非糖尿病者２７２名のうち５
％（１４名）がＮＩＤＤＭのＴ^８３１のグループに移行
したとしてもなお上記検定にて有意の差がある。

【００５３】実施例６：家系解析（１）ＩＲ^{Ｃ１３３４}とＮＩＤＤＭ発症との関連ＩＲ^{Ｃ１３３４}とＮＩＤＤＭ発症との関連を試験するた
めに、ＩＲ^{Ｃ１３３４}をもつ一家系についてのデータを
分析した。

【００５４】この家系では、母親と次男が糖尿病と診断
され、また他の２人の子供（Ｔ．Ｓ．およびＳ．Ｋ．）
と本人（Ｙ．Ｙ．）も糖尿病であった（図５Ａ）。しか
しながら、ＴＡＣ（Ｔｙｒ^１３３４）→ＴＧＣ（Ｃｙｓ
^１３３４）における対立遺伝子特異的ハイブリダイゼー
ションで試験した（図５Ｂ）ところ、このうちの２人
（Ｔ．Ｓ．およびＳ．Ｋ．）は正常なＩＲ（ＩＲ
^{Ｙ１３３４}）をもっており、本人（Ｙ．Ｙ．）だけがＩ
Ｒ^{Ｃ１３３４}をもっていた。したがって、この家系解析
では、突然変異ＩＲ^{Ｃ１３３４}がこの家系においてはＮ
ＩＤＤＭの発症の共通原因ではないことを示唆した。（２）ＩＲ^Ａ８３１とＮＩＤＤＭ発症との関連ＩＲ^Ａ８３１とＮＩＤＤＭ発症との関連を試験するため
に、ＩＲ^Ａ８３１をもつ一家系についてのデータを分析
した。父親は死亡しているため変異については確認でき
なかったが、ＮＩＤＤＭであったことが分かっている。
母親は、高齢のため検査不能であった。また本人を含む
その４人の兄弟のうち、３人がＮＩＤＤＭで、１人が正
常と糖尿病の中間型であるＩＧＴ（ｉｍｐａｒｅｄｇ
ｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）であり、これら４
人すべてがＩＲ^Ａ８３１のｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅで
あった。（図６参照）。なお、ＩＲ^Ａ８３１の検出は前
述した制限酵素ＣｆｏＩの特異的切断サイトを生じさせ
る方法によって行った（図６Ｂ）。家族間の結婚は除外
した。ＩＲ^Ａ８３１の対立遺伝子は父親に由来すると思
われた。この家系解析は、ＩＲ^Ａ８３１のｈｅｔｅｒｏ
ｚｙｇｏｕｓ変異がＮＩＤＤＭ発症の原因であることを
強く示唆するものである。

【００５５】

【発明の効果】本願発明の変異ヒトインスリンレセプタ
ーＤＮＡはＮＩＤＤＭ発症原因遺伝子の少なくとも約６
％の質的変異を構成し、この変異を指標とするＮＩＤＤ
Ｍの遺伝子診断への応用を可能とする有意な数値であ
る。本願発明の変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ、
またはこれを今後解明される他の部位での変異と組み合
わせて簡単かつ確実なＮＩＤＤＭの遺伝子診断が可能と
なる。さらにかかる遺伝子診断と従来の診断法を組み合
わせてＮＩＤＤＭの早期診断を行うことにより適切な予
防と治療が可能となる。文明病とも呼ばれるＮＩＤＤＭ
患者の数は今後とも増加する傾向にあり、本願発明の産
業上の大きな利用価値が期待できる。

【００５６】

【配列表】

【００５７】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＮＩＤＤＭ患者５名のインスリンレセ
プターβサブユニットエクソン１３の塩基配列の一部分
を示す電気泳動の写真である。

【図２】図２は、ＮＩＤＤＭ患者８名のインスリンレセ
プターβサブユニットエクソン２２の塩基配列の一部分
を示す電気泳動の写真である。

【図３】図３は、野生型（ＩＲ^ＷＴ）および変異型（Ｉ
Ｒ^Ａ８３１）レセプターのインスリン結合（Ａ）ならび
にレセプターチロシンキナーゼ活性（Ｂ、Ｃ）を示す。（Ａ）：、ＩＲ^ＷＴ（クローンＮｏ．１２：○−−−
○；Ｎｏ．２１：●−●）、またはＩＲ^Ａ８３１（クロ
ーンＮｏ．１０：△−−−△；Ｎｏ．１７：▲−▲）を
発現するコンフルエントＣＨＯ細胞を種々の濃度の
^１２５Ｉ−インスリンとともに４℃で１２時間インキュ
ベートした。結合^１２５Ｉ−インスリンの放射能を測定
し、スキャッチャード法によりプロットした。（Ｂ）：
インスリン依存性のレセプター自己リン酸化活性を、
（Ａ）と同じセルラインを用いてインスリンレセプター
βサブユニットに取り込まれた^３２Ｐの量として表し
た。（Ｃ）：（Ａ）と同じセルラインを用いて、ＩＲＳ
−１およびＩＲβサブユニットのインスリン依存性のチ
ロシンリン酸化を抗ホスホチロシン抗体によるイムノブ
ロットの図（電気泳動の写真）である。

【図４】図４は、正常および２種の人工変異インスリン
レセプター：ＩＲ^Ａ８３１またはＩＲ^{Ｃ１３３４}と、Ｐ
Ｉ３−キナーゼのｐ８５サブユニットとのインスリン誘
導化複合体形成を示す。ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サブ
ユニット（ｐ８５）をＣＯＳ細胞中で、野生型（ＩＲ
^ＷＴ）または人工変異型ＩＲ（ＩＲ^Ａ８３１またはＩＲ
^{Ｃ１３３４}）とそれぞれ一過性に同時発現させた。１０
^−７Ｍインスリンの存在下において、細胞溶解物をＩＲ
の抗βサブユニット（αＩＲβ）または抗ｐ８５（αｐ
８５）抗体によって免疫沈降させた。免疫沈降物を
（Ａ）では抗ホスホチロシン抗体（αＰＹ）で、（Ｂ）
ではＩＲの抗αサブユニット抗体（αＩＲα）でイムノ
ブロットの図（電気泳動の写真）である。

【図５】図５は、ＩＲ^{Ｃ１３３４}の変異をもつ一家系の
ＮＩＤＤＭ発症と変異の関連を示す。（Ａ）：ＴＡＣ
（Ｔｙｒ^１３３４）→ＴＧＣ（Ｃｙｓ^１３３４）の置換
をもつ家系分析である。四角は男性を、丸は女性を表
す。黒で塗ったものはＮＩＤＤＭ患者であり、矢印は本
人を表し、また斜線をいれたものは故人を表す。
（Ｂ）：対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを示
す電気泳動の写真である。３名の患者または正常人のゲ
ノムＤＮＡから得たインスリンレセプターエクソン２２
由来のＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、ニトロセ
ルロースフィルターにトランスファーした。突然変異対
立遺伝子に特異的な^３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプ
ローブでハイブリダイゼーションした後、フィルターを
オートラジオグラフィーに付した。本人（Ｙ．Ｙ．）の
１つの対立遺伝子にＩＲ^{Ｃ１３３４}変異（３４６ｂｐ断
片）が同定されたが、兄（Ｔ．Ｓ．）および姉（Ｓ．
Ｋ．）には観察されなかった。

【図６】図６は、ＩＲ^Ａ８３１の変異をもつ一家系のＮ
ＩＤＤＭ発症と変異の連関を示す図である。（Ａ）ＡＣ
Ｇ（Ｔｈｒ^８３１）→ＧＣＧ（Ａｌａ^８３１）の置換を
もつ家系分析である。ＩＲ^Ａ８３１変異が本人（Ｙｈ．
Ｔ．）、２人の兄（Ｉ．Ｔ．およびＹｏ．Ｔ．）ならび
に姉（Ｔ．Ｏ．）の１つの対立遺伝子に同定された。矢
印は本人、四角は男性、丸は女性を表す。黒で塗ったも
のはＮＩＤＤＭ患者であり、黒白模様はＩＧＴ（ｉｍｐ
ａｒｅｄｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）であ
り、また斜線をいれたものは故人を表す。（Ｂ）：制限
酵素消化によるＩＲ^Ａ８３１の検出を示す電気泳動の写
真である。エクソン１３のＰＣＲ断片におけるＩＲ
^Ａ８３１変異は制限酵素ＣｆｏＩの特異的部位を切断す
る。変異型ＰＣＲ断片のＣｆｏＩ消化物（３２２ｂｐ）
は１０２ｂｐと２２０ｂｐのバンドとして出現するが、
野生型ではこの切断が阻害される。

【図７】図７は、ヒトインスリンレセプターをコードす
るＤＮＡ（その１）である。

【図８】図８は、ヒトインスリンレセプターをコードす
るＤＮＡ（その２）である。

【図９】図９は、ヒトインスリンレセプターをコードす
るＤＮＡ（その３）である。

【図１０】図１０は、ヒトインスリンレセプターをコー
ドするＤＮＡ（その４）である。本願発明の変異ヒトイ
ンスリンレセプターの変異部位（８３１番目アミノ酸）
を四角で囲んで示す。

【図１１】図１１は、ヒトインスリンレセプターをコー
ドするＤＮＡ（その５）である。本願発明の変異ヒトイ
ンスリンレセプターの変異部位（１３３４番目アミノ
酸）を四角で囲んで示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 14/72 8318−4Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトインスリンレセプターＤＮＡ中８３
１番目のＴｈｒをコードする塩基配列がＡｌａをコード
する塩基配列に変異および／または１３３４番目のＴｙ
ｒをコードする塩基配列がＣｙｓをコードする塩基配列
に変異した変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡ、ある
いは該変異部分を含む上記変異ヒトインスリンレセプタ
ーＤＮＡ断片。
【請求項２】ヒトインスリンレセプターＤＮＡ中、β
サブユニットエクソン１３の８３１番目のＴｈｒをコー
ドする塩基配列（ＡＣＧ）がＡｌａをコードする塩基配
列（ＧＣＧ）に変異した請求項１記載の変異ヒトインス
リンレセプターＤＮＡまたは該変異部分を含むその断
片。
【請求項３】ヒトインスリンレセプターＤＮＡ中、β
サブユニットエクソン２２の１３３４番目のＴｙｒをコ
ードする塩基配列（ＴＡＣ）がＣｙｓをコードする塩基
配列（ＴＧＣ）に変異した請求項１記載の変異ヒトイン
スリンレセプターＤＮＡまたは該変異部分を含むその断
片。
【請求項４】ＰＩ３−キナーゼと結合しない請求項１
記載の変異ヒトインスリンレセプターＤＮＡまたは該変
異部分を含むその断片。
【請求項５】請求項１記載の変異ヒトインスリンレセ
プターＤＮＡと相補的なＤＮＡまたは該変異部分を含む
その断片。
【請求項６】請求項１から５のいずれか１項に記載の
変異ヒトインスリンレセプター断片よりなるインスリン
非依存型糖尿病診断用プローブ。
【請求項７】請求項１から５のいずれか１項に記載の
変異ヒトインスリンレセプター断片を含むインスリン非
依存型糖尿病診断剤。