ES2207258T3

ES2207258T3 - Procedimiento para acelerar el crecimiento oseo y del cartilago y su recuperacion.

Info

Publication number: ES2207258T3
Application number: ES99933921T
Authority: ES
Inventors: Kathleen Rodgers; Gere Dizerega
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2019-07-12
Also published as: JP2002520334A; JP3686335B2; EP1094829B1; EP1094829B8; DE69911609T2; US6258778B1; EP1094829A2; CA2328871A1; JP2005120094A; WO2000002905A3; AU4986999A; WO2000002905A2; CA2328871C; AU756785B2; DE69911609D1; ATE250423T1

Abstract

Utilización de por lo menos un agente activo que comprende una secuencia de por lo menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R1-R8 en la secuencia de fórmula general I R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 en la que R1 y R2 conjuntamente forman un grupo de fórmula X-RA-RB-, en la que X es H o uno a tres grupos de péptido, o está ausente, RA está adecuadamente seleccionado de entre H, Asp, Glu, Asn, Acpc (ácido 1-aminociclopentano carboxílico), Ala, Me2Gly, Pro, Bet, Glu(NH2), Gly, Asp(NH2) y Suc, RB está adecuadamente seleccionado de entre Arg, Lys, Ala, Orn, Cidra, Ser(Ac), Sar, D-Arg y D-Lys; R3 se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu, norLeu, Ile, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr; R4 se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(PO3)2, Thr, Ala, Ser, homoSer y azaTyr; R5 se selecciona de entre el grupo constituido por Ile, Ala, Leu, norLeu, Val y Gly; R6 es His, Arg ó 6-NH2-Phe; R7 es Pro o Ala; y R8 se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), Ile y Tyr, excluyendo las secuencias que incluyen R4 como grupo Tyr terminal, o está ausente, para la preparación de una composición farmacéutica para por lo menos uno de los tratamientos siguientes: mejora de la recuperación ósea en un mamífero, mejora de la implantación ósea y de la prótesis en un mamífero y unión y fijación de los implantes de cartílago al hueso o a otro tejido en un mamífero.

Description

Procedimiento para acelerar el crecimiento óseo y del cartílago y su recuperación.

Referencia cruzada

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud provisional U.S. nº de serie 60/092.653 presentada el 13 de julio de 1998 y una continuación en parte de la solicitud provisional U.S. nº de serie 60/130.855 presentada el 8 de marzo de 1999.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para la recuperación, regeneración e implantación del hueso y del cartílago.

Antecedentes de la invención

Los mecanismos naturales de recuperación, consolidación y crecimiento son similares para el hueso y el cartílago. (Patente U.S. nº 5.686.116). Aunque la recuperación, la consolidación y el aumento requieren una serie compleja de sucesos que no están bien definidos, es sabido que se requieren factores naturales específicos para conseguir estos objetivos. Dichos factores se liberan o migran en el área lesionada y estimulan a los osteoblastos, condrocitos y odontoblastos en el hueso y en el cartílago para estimular la formación de la matriz y el remodelado de la zona herida. (ten Dijke et al., Bio/Technology, 7:793-798 (1989)).

El tejido óseo vivo se está reponiendo continuamente por procesos de resorción y deposición de matriz ósea y de minerales. Este proceso acoplado temporal y espacialmente, denominado remodelación ósea, lo realizan en gran parte dos poblaciones de células, los osteoclastos y los osteoblastos. (Patente U.S. nº 5.656.598, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia). El proceso de remodelación se inicia cuando se agrupan los osteoclastos procedentes de la médula ósea o de la circulación en la superficie del hueso y eliminan un paquete de hueso en forma de disco. La matriz ósea y el mineral se sustituyen posteriormente por un grupo de osteoblastos agrupados en la superficie ósea reabsorbida procedente de la médula ósea. Los osteoblastos son derivados de precursores mesenquimáticos (estromales) locales que se diferencian en los osteoblastos.

El hueso nuevo se puede formar por tres mecanismos básicos: osteogénesis, osteoconducción y osteoinducción. (Patente U.S. nº 5.464.439 incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia). En el trasplante osteógeno, los osteoblastos viables y los periosteoblastos se mueven de un lugar a otro del cuerpo donde establecen centros de formación ósea. Los injertos de hueso esponjoso y de médula proporcionan dichas células viables. TGF-beta ha demostrado estimular la proliferación y la síntesis de la matriz de los osteoblastos (Centrella, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:2869-2874) e inhibir la formación y la actividad de los osteoclastos (Chenu, et al. (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:683-5687; Kiebzak et al. (1988) J. Bone Min. Res. 3:439-446) y estimular la formación ósea local in vivo. (Joyce, et al.(1990) J. Cell. Biol. 110:2195-2207; Noda y Camilliere (1989) Endocrinology 124:2991-2294). Otros factores descritos para estimular el aumento óseo incluyen las proteínas morfogenéticas del hueso (documento WO 88/00205), el factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) (Endocrinol. Metab. 13:E367-72, 1986) y la paratirina (J. Bone & Min. Res. 1:377-381, 1986).

Los miembros de la familia de las proteínas morfogenéticas del hueso han demostrado ser útiles para la producción de cartílago y la formación del hueso. Por ejemplo, BMP-2 ha demostrado ser capaz de provocar la formación de cartílago nuevo y/o tejido óseo in vivo en un modelo de implante ectópico de la rata, véase la patente U.S. nº 5.013.649; en anomalías mandibulares en perros, véase Toriumi et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 117:1101-1112 (1991); y en anomalías segmentarias femorales en la oveja, véase Gerhart et al., Trans. Orthop. Res. Soc., 16:172 (1991). Otros miembros de la familia BMP también han demostrado tener actividad osteógena, incluyendo BMP-4, -6 y -7 (véase Wozney, Bone Morphogenetic Proteins and Their Gene Expression, in Cellular and Molecular Biology of Bone, págs. 131-167 (Academic Press, Inc. 1993)). Las proteínas de BMP se han mostrado también para demostrar la actividad inductiva y/o la diferenciación que potencia la actividad en una variedad de otros tejidos, incluyendo el cartílago. (Patente U.S. nº 5.700.774, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia).

La osteogénesis directa no tiene lugar en el trasplante de segmentos grandes de hueso cortical o de hueso de bancos alógenos. Más bien, tiene lugar la osteoconducción en la que el hueso muerto actúa como un armazón para el crecimiento de los vasos sanguíneos, seguido de la reabsorción del implante y de la deposición del hueso nuevo. Este proceso es muy lento sin embargo, requiriendo con frecuencia años para reunir una gran anomalía segmentaria.

La osteoinducción es la transformación fenotípica del tejido conectivo en el hueso mediante un estímulo apropiado. Como este concepto implica, la formación del hueso se puede producir incluso en zonas no esqueléticas. La osteoinducción se prefiere sobre la osteoinducción, ya que los trasplantes de este tipo se incorporan típicamente en el hueso del huésped en un periodo de dos semanas. En cambio, se ha descubierto que los trasplantes osteoconductores no se incorporan hasta un año después de la implantación. Para proporcionar un medio adecuado para la osteoinducción, se debería seleccionar un material que fuese no sólo capaz de provocar osteogénesis en todo su volumen, sino también que fuese biocompatible, no inflamatorio y que poseyese la capacidad de ser reabsorbido finalmente por el cuerpo y sustituido por hueso nuevo natural.

Entre las enfermedades patológicas asociadas con la función anormal de las células óseas se encuentran la osteoporosis y la osteoartritis, la enfermedad de Paget, la osteohalisterisis, la osteomalacia, la periodontitis, la pérdida de hueso producida por el mieloma múltiple y otras formas de cáncer, la pérdida de hueso producida por efectos secundarios de otros tratamiento médicos (tales como con esteroides) y la pérdida de masa ósea relacionada con la edad. La masa de matriz inorgánica inadecuada coloca a un paciente en situación de riesgo de insuficiencia esquelética, como por ejemplo pueden resultar fracturas óseas de traumatismos mínimos de la vida diaria. Dichas fracturas producen enfermedad o morbilidad, siempre que exista una recuperación o consolidación insuficiente de las fracturas. En determinados estados patológicos la reabsorción mediada por osteoclastos no está regulada por osteoblastos pero la realizan las células cancerosas, que infectan los organismos o las células inmunes del huésped. En esos estados patológicos, la reabsorción del hueso excede mucho la formación del hueso. Dicha actividad osteoclástica acelerada conduce a la liberación excesiva de calcio procedente del mineral inorgánico en el hueso, con una pérdida neta correspondiente de masa esquelética, a menudo con una alteración asociada a la homeostasis del calcio en forma de concentraciones elevadas de calcio. (Patente U.S. nº 5.686.116, incorporada como referencia en su totalidad en la presente memoria).

Aunque los procedimientos para dirigir la nueva formación de hueso son conocidos, se necesitan procedimientos mejorados que proporcionen el crecimiento acelerado del hueso. Por ejemplo, los agentes terapéuticos aprobados actualmente para la osteoporosis son antirreabsorbentes. Como tales, no son tan eficaces en los pacientes con osteoporosis probada de ambos tipos (densidad disminuida del hueso con fracturas de las vértebras y/o de la cadera) o en pacientes con osteoporosis de tipo II. Además, el agente preventivo más afectado actualmente para la osteoporosis en uso es la terapia con estrógeno, que no es un agente terapéutico aceptable para mujeres con historial de cáncer de mama o cáncer endometrial o para hombres con osteoporosis.

Igualmente, la implantación con éxito y la función de los implantes óseos depende de la unión del hueso adyacente al implante. (Patente U.S. nº 5.686.116). Dicha unión requiere la recuperación del hueso mediante la formación de nuevos componentes de la matriz en la interfase entre el implante y el hueso próximo al implante. Un diez por ciento estimado de los aparatos protésicos para huesos y articulaciones que se colocan en las personas fallan al funcionar debido a la falta de unión del hueso al implante. La discapacidad resultante requiere con frecuencia la reoperación y la reimplantación del aparato. Además, del cinco al diez por ciento de todas las facturas óseas nunca se recuperan. Aunque se han propuesto muchos procedimientos para curar estas fracturas óseas que no se consolidan, ninguna ha demostrado todavía ser satisfactoria. Basándose en todo lo anterior, existe una necesidad evidente en la técnica para mejorar los procedimientos que proporcionen el crecimiento acelerado del hueso.

El cartílago es un tipo especializado de tejido conectivo denso de células embebidas en una matriz. Existen varias clases de cartílago. (Patente U.S. nº 5.736.372, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia). El cartílago translúcido que tiene una matriz homogénea que contiene fibras de colágeno se encuentra en el cartílago articular, en los cartílagos costales, en el septum de la nariz, en la laringe y en la tráquea. El cartílago articular es el cartílago hialino que cubre las superficies articulares de los huesos. El cartílago costal conecta las costillas verdaderas y el esternón. El cartílago fibroso contiene fibras de colágeno. El cartílago amarillo es una red de fibras elásticas que sostienen las células de cartílago que se encuentran principalmente en la epiglotis, el oído externo y el conducto auditivo. El cartílago es un tejido hecho de matriz extracelular compuesta principalmente de compuestos orgánicos de colágeno, ácido hialurónico (un proteoglucano) y condrocitos, que son responsables de la producción de cartílago. El colágeno, el ácido hialurónico y el agua atrapados dentro de estos elementos de la matriz orgánica proporciona propiedades elásticas exclusivas y la resistencia del colágeno. Los condrocitos producen colágenos tanto de tipo I como de tipo II. El colágeno de tipo II no se encuentra en el hueso, mientras que el colágeno de tipo I se encuentra en el hueso. (Patente U.S. nº 5.686.116). Se ha demostrado anteriormente que los factores de crecimiento endógeno TGF beta y BMP provocan ambos la formación de cartílago nuevo y del hueso. Wozney et al. Science, 242:1528-1533 (1988) y Sporn et al. J. Cell Biol. 105:1039-1045 (1987).

En el cartílago, la síntesis del colágeno se necesita para la recuperación, consolidación y crecimiento así como para la unión con éxito de los injertos y de los equipos protésicos. (Patente U.S. nº 5.686.116). El colágeno es la principal proteína estructural responsable de la integridad estructural del cartílago. Así pues, es esencial un suministro adecuado de condrocitos para producir suficientes cantidades de colágeno para la recuperación, consolidación y crecimiento del cartílago. Otras proteínas distintas del colágeno, tales como osteonectina, fibronectina y proteoglucanos, son también importantes para la recuperación del cartílago.

Las células tales como los sinoviocitos que se encuentran en los espacios articulares adyacentes al cartílago desempeñan un papel importante en el metabolismo del cartílago. Los sinoviocitos producen metaloproteinasas, tales como las colagenasas que son capaces de descomponer el cartílago. Se sabe que TGF beta inhibe la liberación celular (y probablemente la síntesis) de las metaloproteinasas y que induce a los condrocitos (células formadoras de cartílago) a producir nuevos componentes de la matriz y a inhibir la producción de enzimas destructores del cartílago con el fin de efectuar la recuperación, consolidación y crecimiento del cartílago. Sporn et al. (1987). Se ha demostrado también que los ratones con insuficiencia en el péptido relacionado con la paratirina (PTHrP) presentan maduración anormal del cartílago, lo cual indica que PTHrP es un factor esencial para el desarrollo y la maduración de los condrocitos. (Patente U.S. nº 5.700.774).

Los implantes de cartílago se utilizan con frecuencia en cirugía reconstructiva o plástica, tal como en la rinoplastia. Existe una necesidad en la técnica de procedimientos que aumenten la proliferación de condrocitos y la síntesis de colágeno e inhiban, de este modo, la destrucción de cartílago y aumenten la recuperación del cartílago. Dichos procedimientos deberían aumentar la utilidad clínica de la recuperación del cartílago que incluye, pero no se limita a los injertos de cartílago y a la consolidación de los injertos de cartílago.

Aunque alguno de los procedimientos anteriores se han presentado con éxito limitado, continúa habiendo una necesidad en la técnica de mejorar los procedimientos para el aumento del hueso y la recuperación del cartílago, la consolidación y el aumento y para mejorar la unión y la fijación del hueso y de los implantes de cartílago.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona composiciones para 1) mejorar la recuperación del hueso y del cartílago; 2) la implantación ósea y de la prótesis; 3) la unión y la fijación del cartílago al hueso o a otros tejidos; y procedimientos para la proliferación de condrocitos; todos las cuales comprenden la administración de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, angiotensina II (AII), análogos de AII, fragmentos de AII o sus análogos o agonistas receptores de tipo 2 AII AT_{2}.

Estos y otros aspectos de la invención se pondrán de manifiesto a la luz de la descripción detallada siguiente.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama de barras que presenta el efecto de AII, AIII y GSD37B (10 \mug/ml) sobre la proliferación de condrocitos.

La figura 2 es un diagrama de barras que presenta el efecto de AII, GSD36, GSD37B, GSD38B y GSD28 (10 \mug/ml) de la invención sobre la proliferación de condrocitos.

La figura 3 es un diagrama de barras que presenta el efecto de AII, 1GD, 2GD y 3GD (10 \mug/ml) sobre la proliferación de condrocitos.

La figura 4 es un diagrama de barras que presenta el efecto de AII, AII(1-7), GSD22A, GSD24B y GSD28 (10 \mug/ml) de la invención sobre la proliferación de condrocitos.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Todas las referencias, patentes y solicitudes de patente están incorporadas en la presente memoria en su totalidad como referencias.

En esta solicitud, a menos que se indique de otro modo, las técnicas utilizadas se pueden encontrar en alguna de las diversas referencias bien conocidas tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology (M.P. ej.: Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2ª ed. (R.I. Freshney, 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY) Gene Transfer and Expression Protocols, págs 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.) y el catálogo de Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX).

Tal como se define en la presente memoria, la expresión "aumento de la recuperación del hueso" se refiere al aumento de la velocidad de formación de hueso nuevo mediante la remodelación, osteogénesis, osteoconducción y/o osteoinducción del hueso. Los procedimientos de la invención para aumentar la recuperación del hueso en un mamífero incluyen los que estimulan la formación de hueso y los que se oponen a la pérdida de hueso. De este modo, los procedimientos se pueden utilizar para (1) proporcionar a un sujeto una cantidad de sustancia suficiente para actuar de forma profiláctica que impida el desarrollo de un estado de debilidad y/o de insalubridad; o (2) proporcionar a un sujeto una cantidad de sustancia suficiente para aliviar o eliminar un estado patológico y/o los síntomas de un estado patológico y de un estado de debilidad y/o de insalubridad.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aumento de la recuperación del cartílago" comprende la consolidación y regeneración de las lesiones de cartílago, desgarros, deformaciones o anomalías y la utilización profiláctica para evitar lesiones en el tejido cartilaginoso.

La presente invención satisface la necesidad de composiciones para aumentar la recuperación del hueso en un mamífero que padece fracturas, anomalías y trastornos óseos que producen huesos debilitados, tal como en la osteoporosis, osteoartritis, enfermedad de Paget, osteohalisterisis, osteomalacia, periodontitis, pérdida de hueso producida por el mieloma múltiple y otras formas de cáncer, pérdida de hueso producida por los efectos secundarios de otros tratamientos médicos (tales como con esteroides) y la pérdida de masa ósea relacionada con la edad. Además, el crecimiento del hueso, puede aumentar en gran medida en varios aparatos protésicos de forma que tales partes artificiales se anclen firme y permanentemente en el tejido esquelético circundante mediante un puente óseo natural.

La presente invención además satisface la necesidad de composiciones para mejorar la recuperación de cartílago en un mamífero, acelerando la proliferación de condrocitos y, de este modo, aumentando la síntesis de colágeno para su utilización en la recuperación de cartílago. Tales composiciones tienen aplicación en la consolidación del cartílago, por ejemplo en desgarros, deformidades y otras anomalías de cartílagos articulares en el hombre y otros animales. Las composiciones tienen utilización profiláctica en la prevención de daños en el tejido cartilaginoso, así como utilización en la fijación mejorada del cartílago en el hueso o en otros tejidos y en la recuperación de las anomalías para el tejido del cartílago. La formación de nuevo tejido cartilaginoso provocada por los compuestos de la presente invención contribuye a la recuperación de traumatismos congénitos provocados u otras anomalías del cartílago de otro origen y es asimismo útil en cirugía para la unión o recuperación del cartílago. Las composiciones de la invención pueden ser también útiles en el tratamiento de la artritis y de otras anomalías del cartílago. Las composiciones de la presente invención se pueden también utilizar en otras indicaciones en las que se desee consolidar o regenerar el tejido del cartílago. Las composiciones de la presente invención proporcionan un medio para atraer células formadoras de cartílago, estimular el crecimiento de células formadoras de cartílago o provocar la diferenciación de progenitores de células formadoras de cartílago y condrocitos.

Los procedimientos de la presente invención también proporcionan un medio definido químicamente mejorado para acelerar la proliferación de condrocitos (células formadoras de cartílago). En otra forma de realización, las composiciones y los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para tratar líneas celulares condrocíticas, tales como de condrocitos articulares, para mantener el fenotipo condrocítico y la supervivencia de las células. Las poblaciones de células tratadas son por consiguiente también útiles para aplicaciones en terapia génica.

La patente U.S. nº 5.015.629 de DiZerega (cuya descripción completa se incorpora en la presente memoria como referencia) describe un procedimiento para aumentar la velocidad de consolidación del tejido lesionado, que comprende la aplicación a dicho tejido de angiotensina II (AII) en una cantidad suficiente para dicho aumento. La aplicación de AII en el tejido lesionado aumenta de forma significativa la velocidad de cicatrización de la herida, conduciendo a una reepitelización y recuperación del tejido más rápidas. El término AII se refiere a un octapéptido presente en el hombre y en otras especies que tiene la secuencia Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 1]. La formación biológica de la angiotensina se inicia mediante la acción de la renina en el sustrato angiotensinógeno del plasma (Clouston et al., Genomics 2:240-248 (1988); Kageyama et al., Biochemistry 23:3603-3609; Ohkubo et al., Proc.Natl. Acad. Sci. 80:2196-2200 (1983); incorporada en la presente memoria cada referencia en su totalidad). La sustancia así formada es un decapéptido denominado angiotensina I (AI) que se transforma en AII mediante el enzima transformador de angiotensina (ACE) que elimina los restos His-Leu C-terminales procedentes de AI [SEC ID nº: 37]. AII es un agente hipertensor y está disponible en el comercio.

Los estudios han demostrado que AII aumenta la mitogénesis y la quimiotaxia en las células cultivadas que están implicadas en la recuperación de la herida y también aumenta su liberación de los factores de crecimiento y de las matrices extracelulares (diZerega, patente U.S. nº 5.015.629; Dzau et al., J.Mol. Cell. Cardiol. 21:S7 (supl. III) 1989; Berk et al., Hypertension 13:305-14 (1989); Kawahara, et al., BBRC 150:52-9 (1988); Naftilan, et al., J. Clin. Invest. 83:1419-23 (1989); Taubman et al., J. Biol. Chem. 264:526-530 (1989); Nakahara, et al., BBRC 184:811-8 (1992); Stouffer y Owens, Circ. Res. 70:820 (1992); Wolf, et al., Am. J. Pathol. 140:95-107 (1992); Bell y Madri; Am. J. Pathol. 137:7-12 (1990). Además, AII demostró ser angiógeno en modelos de córnea del ojo del conejo y de la membrana corioalantoica de los polluelos (Fernández, et al., J. Lab. Clin. Med. 105:141 (1985); LeNoble, et al., Eur. J. Pharmacol. 195:305-6 (1991). Además, los análogos de AII y de angiotensina III y sus fragmentos han demostrado ser eficaces en la cicatrización de heridas. (Patente U.S. nº 5.629.292; solicitud internacional nº WO 95/08565; solicitud internacional nº WO 95/08337; solicitud internacional nº WO 96/39164; todas las referencias se incorporan en su totalidad en la presente memoria).

Los estudios anteriores han sugerido que tanto la angiotensina I (AI) como la AII estimulan la reabsorción in vitro del hueso por los osteoclastos incubados en secciones de hueso, pero solamente en presencia de osteoblastos, lo que sugiere que el efecto de la angiotensina II no era directo, sino que más bien está mediado por la interacción hormonal primaria en las células del linaje osteoblástico. (Hatton et al., J. Endocrinol. 152:5-10 (1997)). La estimulación por AI de la reabsorción del hueso fue inhibida por los inhibidores ACD, lo cual sugiere que la formación de AII a partir de AI era responsable de la estimulación de la reabsorción del hueso. Ni AI ni AII demostraron presentar ningún efecto en la formación de osteoclastos. Así pues, este estudio sugiere que la destrucción local del hueso puede estar mediada por la estimulación por AII de la reabsorción del hueso.

Otros estudios han demostrado la estimulación por AII del ADN y de la síntesis de colágeno in vitro en cultivos primarios de osteoblastos inmaduros aislados fenotípicamente procedentes del periostio de la bóveda craneal de la rata fetal y del hueso trabecular del hombre adulto. (Lamparter et al., J. Cell. Physiol. 175:89-98 (1998)). No se detectó ningún efecto directo de AII sobre las poblaciones de células primarias con un fenotipo maduro del osteoblasto y se propuso un efecto indirecto de los osteoblastos precursores sensibles en AII. Estudios similares in vitro en poblaciones de células ricas en osteoblastos demostraron un efecto similar, mientras que no se regula la estimulación de la proliferación madura de osteoblastos. (Hiruma et al., Biochem and Biophys. Res. Commun. 230:176-178 (1997)). Otro estudio sugiere que AII puede decelerar la diferenciación y la formación del hueso de los osteoblastos de la bóveda craneal de la rata. (Hagiwara et al., J. of Endocrinology 156:543-550 (1998)).

Basándose en todos los estudios anteriores, no existen expectativas de que la utilización de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, AII, análogos de AII, fragmentos de AII o sus análogos o los agonistas del receptor del tipo 2 AII AT_{2} sean eficaces para mejorar la recuperación del hueso y del cartílago o eficaces en la aceleración de la proliferación de condrocitos y de la síntesis de colágeno.

Los estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que una clase de AII y análogos de AII y sus fragmentos estimulan la proliferación de células madre mesenquimáticas, que dan origen a las células que producen hueso y cartílago. (Solicitud de patente U.S. nº 09/012.400, presentada el 23 de enero de 1998, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia).

Se ha identificado un agonista de péptido selectivo para el receptor AT2 (AII presenta una afinidad 100 veces mayor para AT2 que para AT1). Este péptido es p-aminofenilalanina 6-AII ["(p-NH_{2}-Phe)6-AII)"], Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Xaa-Pro-Phe [SEC ID nº: 36] en la que Xaa es p-NH_{2}-Phe (Speth y Kim, BBRC 169:997-1006 (1990)). Este péptido proporcionó características de unión comparables a los antagonistas de AT2 en los modelos experimentales probados (Catalioto, et al., Eur. J. Pharmacol. 256:93-97 (1994); Bryson, et al., Eur. J. Pharmacol. 225:119-127 (1992).

Se han examinado los efectos del receptor AII y de los antagonistas del receptor AII en dos modelos experimentales de lesión y recuperación vascular que sugieren que ambos subtipos de receptor AII (AT1 y AT2) desempeñan un papel en la cicatrización de heridas (Janiak et al., Hypertension 20:737-45 (1992); Prescott, et al., Am. J. Pathol. 139:1291-1296 (1991); Kauffman, et al., Life Sci. 49:223-228 (1991); Viswanathan, et al., Peptides 13:783-786 (1992); Kimura, et al., BBRC 187:1083-1090 (1992).

Se han enfocado muchos estudios a AII(1-7) (restos 1-7 de AII) u otros fragmentos de AII para evaluar su actividad. AII(1-7) produce algún, pero no todo el intervalo de efectos producidos por AII. Pfeilschifter, et al., Eur. J. Pharmacol. 225:57-62 (1992); Jaiswal, et al., Hypertension 19(supl. II):II-49-II-55 (1992); Edwards y Stack, J. Pharmacol. Exper. Ther. 266:506-510 (1993); Jaiswal, et al., Pharmacol. Exper. Ther. 265:664-673 (1991); Jaiswal, et al., Hypertension 17:1115-1120 (1991); Portsi, et al., Br. J. Pharmacol. 111:652-654 (1994).

Como se define en lo sucesivo, una clase preferida de agonistas AT2 para su utilización según la presente invención comprende angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, AII, análogos de AII, fragmentos de AII o sus análogos o los agonistas del receptor del tipo 2 AII AT_{2} con p-NH-Phe en una posición correspondiente a una posición 6 de AII. Además de los agentes de péptidos, varios agentes no peptídicos (p. ej.: peptidomiméticos) con el requisito de actividad agonista de AT2, se contemplan además para su utilización según la presente invención.

Los análogos activos de AII, fragmentos de AII y sus análogos de particular interés según la presente invención comprenden una secuencia constituida por al menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R^{1}-R^{8} en la secuencia de fórmula general I.

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-R^{6}-R^{7}-R^{8}

en la que R^{1} y R^{2} conjuntamente forman un grupo de fórmula

X-R^{A}-R^{B}-,

en la que X es H o uno a tres grupos de péptidos, o está ausente,

R^{A} está adecuadamente seleccionado de entre H, Asp, Glu, Asn, Acpc (ácido 1-aminociclopentano carboxílico), Ala, Me^{2}Gly, Pro, Bet, Glu(NH_{2}), Gly, Asp(NH_{2}) y Suc,

R^{B} está adecuadamente seleccionado de entre Arg, Lys, Ala, Orn, Cidra, Ser(Ac), Ser, D-Arg y D-Lys;

R^{3} se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu, norLeu, Ile, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr;

R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}, Thr, Ala, Ser, homoSer y azaTyr;

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por Ile, Ala, Leu, norLeu, Val y Gly;

R^{6} es His, Arg o 6-NH_{2}-Phe;

R^{7} es Pro o Ala; y

R^{8} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), Ile y Tyr, excluyendo las secuencias que incluyen R^{4} como grupo Tyr terminal, o está ausente.

Los compuestos comprendidos dentro de la categoría de agonistas de AT2 útiles en la práctica de la invención incluyen los análogos de AII indicados anteriormente sometidos a la limitación de que R^{6} es p-NH_{2}-Phe.

Las combinaciones especialmente preferidas para R^{A} y R^{B} son Asp-Arg, Asp-Lys, Glu-Arg y Glu-Lys. Las formas de realización particularmente preferidas de esta clase incluyen las siguientes: AII, AIII o AII(2-8), Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 2]; AII(3-8), también conocida como des1-AIII o AIV, Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 3]; AII(1-7), Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro [SEC ID nº: 4]; AII(2-7). Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro [SEC ID nº: 5]; AII(3-7), Val-Tyr-Ile-His-Pro [SEC ID nº: 6]; AII(5-8), Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 7]; AII(1-6), Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His [SEC ID nº: 8]; AII(1-5), Asp-Arg-Val-Tyr-Ile [SEC ID nº: 9]; AII(1-4, Asp-Arg-Val-Tyr [SEC ID nº: 10]; y AII(1-3), Asp-Arg-Val [SEC ID nº: 11]. Otras formas de realización preferidas incluyen: Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº:12] y Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe [SEC ID nº:13]. Todavía otra forma de realización preferida comprendida dentro del alcance de la invención es un péptido con la secuencia Asp-Arg-Pro-Tyr- Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 31]. AII(6-8), His-Pro-Phe [SEC ID nº: 14] y AII(4-8), Tyr, Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 15] se probaron también y se observó que no eran eficaces.

En una forma de realización particularmente preferida de las composiciones para la proliferación de condrocitos, síntesis de colágeno, recuperación de cartílago y unión y fijación del cartílago al hueso o a otros tejidos, los compuestos activos de la presente invención se seleccionan de entre los que comprenden la siguiente fórmula general:

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-His-Pro-R^{6}

en la que

R^{1} se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, Gly y Asp;

R^{2} se selecciona de entre el grupo constituido por Arg, cidra u ornitina;

R^{3} se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ile, Ala, Leu y norLeu o Pro;

R^{4} se selecciona de entre Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}y Ala;

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por Ile, Ala, Val, Leu y norLeu; y

R^{6} es Phe, Ile o está ausente.

Las formas de realización particularmente preferidas de esta clase de compuestos se seleccionan de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

En una forma de realización particularmente preferida de las composiciones para la recuperación del hueso y la implantación de la prótesis en el hueso, los compuestos activos de la presente invención se seleccionan de entre los que comprenden la siguiente fórmula general:

Asp-Arg-R^{1}-R^{2}-Ile-His-Pro-R^{3}

en la que

R^{1} selecciona de entre el grupo constituido por Ile, Pro, Ala, Val, Leu y norLeu;

R^{2} se selecciona de entre Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}; y

R^{3} es Phe, o está ausente.

Más particularmente las formas de realización preferidas de esta clase de compuestos se seleccionan de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 41 y SEC ID nº: 45.

Otra clase de compuestos de particular interés según la presente invención son los de fórmula general II

R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-R^{6}-R^{7}-R^{8}

en la que R^{2} se selecciona de entre el grupo constituido por H, Arg, Lys, Ala, Orn, Cidra, Ser(Ac), Sar, D-Arg y D-Lys;

R^{3} se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu y norLeu, Ile, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr;

R^{4} se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}, Thr, Ser, homoSer, Ala y azaTyr;

R^{5} se selecciona de entre el grupo constituido por Ile, Ala, Leu y norLeu, Val y Gly;

R^{6} es His, Arg ó 6-NH_{2}-Phe;

R^{7} es Pro o Ala; y

R^{8} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), Ile y Tyr.

Una subclase particularmente preferida de los compuestos de fórmula general II tiene la fórmula

R^{2}-R^{3}-Tyr-R^{5}-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 16]

en la que R^{2}, R^{3} y R^{5} son tal como se definieron anteriormente. Se prefiere particularmente la angiotensina III de la fórmula Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 2]. Otros compuestos preferidos incluyen péptidos con las estructuras Arg-Val-Tyr-Gly-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 17] y Arg-Val-Tyr-Ala-His-Pro-Phe [SEC ID nº: 18]. El fragmento AII(4-8) fue ineficaz en pruebas repetidas; se cree que esto es debido a la tirosina expuesta en el terminal-N.

En las fórmulas anteriores, se emplean las abreviaturas estándar de tres letras para los restos de aminoácidos. En ausencia de una indicación en sentido contrario, se sobreentiende la forma L- del aminoácido. Otros residuos se abrevian de la forma siguiente:

TABLA 1

1

Se ha sugerido que AII y sus análogos adoptan bien una expresión gamma o beta (Regoli, et al., Pharmacological Reviews 26:69 (1974). En general, se cree que las cadenas laterales neutras en las posiciones R^{3}, R^{5} y R^{7} pueden estar implicadas en el mantenimiento de la distancia apropiada entre los grupos activos en las posiciones R^{4}, R^{6} y R^{8} responsables principalmente de la unión a los receptores y/o de la actividad intrínseca. Las cadenas laterales hidrófobas en las posiciones R^{3}, R^{5} y R^{8} pueden también desempeñar un papel importante en la conformación global del péptido y/o contribuir a la formación de una hipotética bolsa hidrófoba.

Cadenas laterales apropiadas en el aminoácido en la posición R^{2} pueden contribuir a la afinidad de los compuestos para los receptores objetivo y/o desempeñar un papel importante en la conformación del péptido. Por esta razón, se prefieren particularmente Arg y Lys como R^{2}.

Para los fines de la presente invención, se cree que R^{3} puede estar implicado en la formación de enlaces de hidrógeno lineales o no lineales con R^{5} (en el modelo de expresión gamma) o R^{6} (en el modelo de la expresión beta). R^{3} participaría también en la primera expresión en una estructura beta antiparalela (que ha sido propuesta también como posible estructura). En cambio, en otras posiciones en la fórmula general I, parece que las ramificaciones beta y gamma son igualmente eficaces en esta posición. Además, un enlace de hidrógeno sencillo puede ser suficiente para mantener una conformación relativamente estable. Por consiguiente, R^{3} se puede seleccionar adecuadamente de entre Val, Ala, Leu, norLeu, Ile, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr.

Con respecto a R^{4}, los análisis conformacionales han sugerido que la cadena lateral en esta posición (así como en R^{3} y R^{5}) contribuye a un grupo hidrófobo que se cree que es esencial para la ocupación y estimulación de los receptores. Así pues, R^{4} se selecciona preferentemente de entre Tyr, Thr, Tyr(PO_{3})_{2}, homoSer, Ser y azaTyr. En esta posición, se prefiere particularmente Tyr ya que puede formar un enlace de hidrógeno con la zona del receptor capaz de aceptar un hidrógeno del hidroxilo fenólico (Regoli, et al., 81974), supra). R^{3} puede ser también adecuadamente Ala.

En la posición R^{5}, es particularmente deseable un aminoácido con una cadena \beta alifática alicíclica. Por consiguiente, aunque Gly sea adecuado en la posición R^{5}, es preferible que el aminoácido en esta posición se seleccione de entre Ile, Ala, Leu, norLeu, Gly y Val.

En el angiotensinógeno, AI, análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, análogos de AII, fragmentos y análogos de fragmentos de particular interés según la presente invención, R^{6} es His, Arg o 6-NH_{2}-Phe. Las propiedades exclusivas del anillo imidazólico de histidina (p. ej.: ionización a pH fisiológico, capacidad para actuar como donante o aceptor de protones, carácter aromático) se cree que contribuyen a su particular utilidad como R^{6}. Por ejemplo, los modelos conformacionales sugieren que His puede participar en la formación del enlace de hidrógeno (en el modelo beta) o en la segunda expresión de la estructura antiparalela que influye en la orientación de R^{7}. Igualmente, se considera actualmente que R^{7} debería ser Pro para proporcionar la orientación más deseable de R^{8}. En la posición R^{8}, tanto un anillo hidrófobo como un terminal carboxilo aniónico parecen ser particularmente útiles en la unión a los receptores de los análogos en cuestión; por consiguiente, Tyr y especialmente Phe se prefieren para los fines de la presente invención.

Los análogos de particular interés incluyen los siguientes:

TABLA 2

2

Los polipéptidos de la presente invención se pueden sintetizar por cualquier procedimiento convencional, que incluye, pero no se limita a, los indicados en J. M. Stewart y J. D Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984) y J. Meienhofer, Hormonal Protein and Peptides, vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1973) para la síntesis en fase sólida y E. Schoroder y K. Lubke, The Peptides, vol. 1, Academic Press, Nueva York, (1965) para la síntesis en solución. Las exposiciones de los tratados anteriores están incorporadas en la presente memoria como referencia.

En general; estos procedimientos implican la adición sucesiva de aminoácidos protegidos a una cadena de péptido en crecimiento (Patente U.S. nº 5.693.616, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad). Normalmente, bien el aminoácido o el grupo carboxílico del primer aminoácido y cualquier grupo reactivo de la cadena lateral están protegidos. Este aminoácido protegido se une a continuación bien a un soporte sólido inerte, o se utiliza en solución, y el siguiente aminoácido en la secuencia, también protegido adecuadamente, se añade en condiciones suaves para la formación del enlace amido. Después que todos los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia apropiada, se eliminan los grupos protectores y cualquier soporte sólido para dar el polipéptido en bruto. Se desala y purifica el polipéptido, preferentemente por cromatografía, para dar el producto final.

Preferentemente, los péptidos se sintetizan según metodologías estándar en fase sólida, tal como se puede realizar en un sintetizador de péptidos, modelo 430A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), según las instrucciones del fabricante. Otros procedimientos para sintetizar péptidos o peptidomiméticos, ya sea por metodologías en fase sólida o en fase líquida, son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones para mejorar la recuperación, implantación y aumento del hueso y del cartílago en un mamífero comprendiendo la administración de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, angiotensina II (AII), análogos de AII, fragmentos de AII o sus análogos o agonistas receptores de tipo 2 AII AT_{2} (denominados en lo sucesivo "agentes activos"). Los compuestos se pueden administrar solos o en combinación con otros compuestos que mejoran la recuperación, implantación y aumento del hueso y/o del cartílago, incluyendo pero sin limitarse a la proteína-2 morfógena del hueso, la proteína-4 morfógena del hueso, la proteína-6 morfógena del hueso, la proteína-7 morfógena del hueso, el factor-beta transformador del crecimiento, el factor de crecimiento de tipo insulina y la paratirina.

Los agentes activos se pueden administrar por cualquier vía adecuada, incluyendo por vía oral, parenteral, por atomizador para inhalación, por vía rectal o tópica en formulaciones de dosificación unitarias que contienen excipientes, adyuvantes y vehículos. Dichos vehículos pueden incluir un armazón de tántalo o de hidroxiapatita como vehículo con los compuestos de la invención embebidos en éste. Como alternativa, se pueden utilizar sustratos poliméricos para la administración de compuestos al hueso o al cartílago, tales como los sustratos poliméricos expuestos en las patentes U.S. nº 5.443.515, nº 5.171.273, nº 5.607.474; nº 4.916.207; y nº 5.324.775; incorporadas todas las referencias en su totalidad en la presente memoria. El término parenteral, tal como se utiliza en la presente memoria incluye la vía tópica (es decir, colocación en el hueso), subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratendinosa, intraespinal, intracraneal, intratorácica, técnicas de infusión o intraperitoneal.

Los agentes activos de la presente invención se pueden incorporar además en un recubrimiento sobre la superficie de un aparato protésico. Tales recubrimientos pueden estar compuestos por un polímero que permite la difusión lenta de los agentes activos a una velocidad suficiente para mejorar la unión al hueso durante un periodo de tiempo adecuado. Los recubrimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidroxiapatito, metacrilato y fosfato tricálcico. Además, los recubrimientos poliméricos se pueden aplicar solamente en las zonas sobre el aparato protésico en las que se desea el crecimiento del hueso. Los injertos de hueso se pueden recubrir con, empapar o sumergir en un líquido de lavado o en un gel antes de la implantación con el fin de impregnar el injerto con los agentes activos. La administración tópica o local de los agentes activos bien a la zona de implantación o al propio implante, se prefiere, a medida que disminuye la exposición al fármaco para los tejidos y órganos que no requieren tratamiento.

Los agentes activos se pueden preparar en forma sólida (incluyendo gránulos, polvos o supositorios) o en forma líquida (p. ej.: soluciones, suspensiones o emulsiones). Los compuestos de la invención se pueden aplicar en una variedad de soluciones. Las soluciones adecuadas para su utilización según la invención son estériles, disuelven cantidades suficientes de péptido y no son perjudiciales para la aplicación propuesta. A este respecto, los compuestos de la presente invención son muy adecuados pero son hidrolizados por ácidos y bases fuertes. Los compuestos de la presente invención son solubles en disolventes orgánicos y en soluciones acuosas a pH 5 a 8.

Los agentes activos se pueden someter a operaciones farmacéuticas convencionales tal como la esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, etc.

Para su administración, los agentes activos se combinan generalmente con uno o más adyuvantes apropiados por la vía de administración indicada. Los compuestos se pueden mezclar con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y de calcio de los ácidos fosfórico y sulfúrico, acacia, gelatina, alginato de sodio, polivinilpirrolidina y/o alcohol polivinílico y en comprimidos o en cápsulas para la administración convencional. Como alternativa, los compuestos de la invención se pueden disolver en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, etanol, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semillas de algodón, goma de tragacanto y/o varios tampones. Otros adyuvantes y modos de administración son bien conocidos en la técnica farmacéutica. El excipiente o diluyente puede incluir material retardador, tales como el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera u otros materiales bien conocidos en la técnica.

Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel (p. ej.: linimentos, lociones, pomadas, cremas o pastas) y gotas adecuadas para la administración en los ojos, oídos o nariz.

El régimen de dosificación para mejorar la recuperación del hueso y del cartílago con agentes activos está basado en una variedad de factores, que incluyen el tipo de lesión, edad, peso, sexo, enfermedad del individuo, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el particular compuesto empleado. Así pues, el régimen de dosificación puede oscilar ampliamente, pero puede ser determinado de forma rutinaria por un médico que utilice los procedimientos normalizados. Los niveles de dosificación del orden de entre 0,1 ng/kg y 10 mg/kg de peso corporal de los agentes activos sirven para todos los procedimientos de utilización expuestos en la presente memoria.

A modo de ejemplo, el régimen de dosificación para acelerar la recuperación del hueso y del cartílago con los agentes activos en los que están embebidos los compuestos en un armazón utilizado para el hueso y/o el cartílago, tales como de tántalo o hidroxiapatito, se basaría en el volumen de hueso a reponer y no en el peso del paciente que se está tratando. Después de la determinación del volumen de dosis específica que se debe administrar al paciente, calculado sobre la base de la anomalía, se prepara la dosis individual. El producto final del fármaco administrado se puede mezclar en condiciones asépticas en una proporción de: 1 parte (20%) de los agentes activos (en una concentración comprendida entre aproximadamente 0,001 \mug/ml y aproximadamente 5 mg/ml) a 4 partes (80%) de diluyente.

El régimen de tratamiento variará también dependiendo de la enfermedad que se está tratando, basándose en una variedad de factores, que incluyen el tipo de lesión, edad, peso, sexo, enfermedad del individuo, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el particular compuesto empleado. Por ejemplo, los agentes activos se administran a un paciente de osteoporosis durante 30 días como máximo. La terapia se administra 1 a 6 veces al día en las dosis descritas anteriormente.

En una forma de realización preferida, el agente activo se administra por vía subcutánea. Una dosis subcutánea adecuada del principio activo del agente activo se administra preferentemente entre aproximadamente 0,1 ng/kg y aproximadamente 10 mg/kg dos veces al día durante un tiempo suficiente para mejorar la recuperación del hueso o del cartílago. En una forma de realización más preferida, la concentración del agente activo está comprendida entre aproximadamente 100 ng/kg de peso corporal y aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal. En la forma de realización más preferida, la concentración del agente activo esta comprendida entre aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal. El régimen de dosificación maximiza los beneficios terapéuticos de la invención en el paciente a la vez que minimiza el aumento de agonista requerido. Dicha aplicación minimiza los costes los posibles efectos secundarios perjudiciales.

Para la administración subcutánea, el principio activo puede comprender entre 0,0001% y 10% p/p, p. ej.: del 1% al 2% en peso de la formulación, aunque puede comprender tanto como el 10% p/p, pero preferentemente no más del 5% p/p y más preferentemente del 0,1% al 1% de la formulación.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, el agente activo se administra por vía tópica en la zona de hueso o de cartílago con pérdida o para recuperación. Las dosis tópicas adecuadas y la concentración del principio activo en la formulación son tal como se describieron para la administración subcutánea.

En otra forma de realización preferida, el agente activo se administra en la zona deseada de recuperación del hueso o del cartílago, tal como la administración en cápsulas en el tejido gingival en las zonas de reabsorción ósea o en un armazón implantado quirúrgicamente en la zona de una fractura de hueso sin unión. Las dosis adecuadas y la concentración de principio activo en la formulación son tal como se describieron para la administración subcutánea.

En otra forma de realización de la invención, se presentan los procedimientos ex vivo o in vivo para mejorar la recuperación del cartílago mediante aislamiento de las poblaciones de condrocitos de un paciente, poniendo en contacto la población de células aisladas con el agente activo y la reinfusión posterior de la población de condrocitos en el paciente. Se han descrito procedimientos para el aislamiento de poblaciones de condrocitos. (Kato et al., J. Cell Biol., vol. 100, páginas 477-485 (1985); patentes U.S. nº 4.642.120; nº 5.053.050; y 5.736.372, incorporada cada una en la presente memoria en su totalidad como referencia).

En una forma de realización preferida, se obtiene médula ósea autóloga u homóloga procedente de la cresta ilíaca o del conducto femoral, mediante aspiración con una aguja para biopsia ósea. (Patente U.S. nº 5.053.050). Las células aspiradas se inyectan en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene tripsina al 0,25% e se inyectan sucesivamente mediante agujas de calibres 17, 18 y 20 para conseguir una sola suspensión celular. Las células se colocan en placas con una densidad de 50 a 100 x 10^{6} células en discos de cultivo de tejido de 100 mm alimentados con medio BGI b (GIBCO) con 15% de F.C.S. (suero de ternero fetal). El medio se cambia diariamente o a medida que se necesita por el ritmo de proliferación de las células. El medio se complementa con aproximadamente entre 0,1 ng/ml y 10 mg/ml de principio activo. Se subcultivan las células semanalmente y después de 5 a 6 subcultivos se consigue una población celular estromal fibroblástica pura. Esta población celular se trata a continuación con tripsina y se pone en un cultivo en suspensión con una densidad de 3 a 8 x 10^{6} células/ml de ascorbato de sodio añadido diariamente al medio. Las células fibrobásticas estromales comienzan a aglomerarse inmediatamente y después de tres a siete días la mayoría de las células están en agregados de 30 a 60 células. Todos los agregados expresan un fenotipo condrógeno, según se determinó empleando sondas histoquímicas e inmunohistoquímicas para análisis.

Aunque se prefiere médula ósea procedente de condrocitos, se pueden utilizar condrocitos de origen autólogo u homólogo o condrocitos homólogos comprometidos, o cualquier otra célula progenitora de origen mesenquimático. Se puede observar que esta formulación inicial comprende la purificación, proliferación y manipulación de una población que expresa un fenotipo condrógeno. Más específicamente, las células proliferantes son de la clase que comprende células de estroma de médula ósea, no humanas, condrocitos embrionarios comprometidos y cualquier célula mesenquimática no diferenciada.

En una forma de realización preferida, se evalúa el efecto proliferante de los agentes activos de la invención en las células de cartílago por la reactividad a un anticuerpo dirigido contra una proteína que se sabe que está presente en concentraciones más altas en las células proliferantes que en las células no proliferantes, que incluye pero no se limita al antígeno nuclear de la célula proliferante (PCNA o ciclina; Zimed Laboratories, San Francisco Sur, California). Se pueden identificar células viables utilizando una técnica tal como el análisis de exclusión con azul de tripano. Se lavan las células que se han de reinfundir en el paciente para eliminar todos los vestigios del fluido del cultivo, se vuelven a poner en suspensión en un medio adecuado y a continuación se sedimentan y se lavan varias veces. Después del lavado final, las células se vuelven a poner en suspensión entre 0,7 x 10^{6} y 50 x 10^{6} células por ml en un medio apropiado y se administran como se describe más adelante.

Como alternativa, los efectos de los agentes activos sobre la síntesis del componente en las células de hueso y de cartílago se determinan en el cultivo del órgano y en las células aisladas midiendo los niveles de dos proteínas de la matriz, según se describe en la patente U.S. nº 5.686.116 incorporada como referencia en su totalidad en la presente memoria. El colágeno de tipo I es la proteína con matriz principal del hueso y del cartílago. El colágeno está compuesto casi íntegramente de prolina, OH-prolina, alanina y glicina. Así pues, la síntesis del colágeno del hueso nuevo se puede determinar midiendo la absorción de ^{3}H-Pro o siguiendo el aspecto de ^{3}H-OH-Pro, que se forma por transformación de la prolina posterior a su incorporación en el colágeno. La osteocalnina es una proteína con matriz específica del hueso que se cree que es una señal celular para los osteoclastos que atraen al hueso para iniciar la destrucción del hueso. Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7734-7738 (1982). Por consiguiente, la disminución de la síntesis de osteocalcina está asociada a la recuperación del hueso.

Se puede utilizar cualquier sinoviocito (formador de cartílago). En una forma de realización preferida, se utiliza la línea celular HIG-82, línea celular permanente del cartílago que conserva muchas propiedades presentes en los sinoviocitos normales. Georgescu et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 24:1015-1022 (1988).

Los sinoviocitos se exponen a un agente activo durante 24 a 48 horas, después de las cuales se aísla el ARN celular total por medios estándar. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)). La detección del ARNm para el colágeno de tipo I se puede realizar mediante técnicas estándar en la técnica que incluyen pero no se limitan a la reacción en cadena de polimerasa por transcripción (RT-PCR) utilizando cebadores específicos para el colágeno de tipo I o para la osteocalcina o la transferencia de Northern del ARN seguida de hibridación con sondas para el colágeno de tipo I o la osteocalcina. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)).

Como alternativa, la expresión de la síntesis del colágeno de tipo I se determina en el cultivo del órgano según se describe en la patente U.S. nº 5.686.116. En una forma de realización preferida, los huesos de la bóveda craneal (cráneo) de ratas recién nacidas se colocan en placas estériles de cultivo con un medio nutritivo para mantener la viabilidad. En este estado, crecen los tejidos estructurales formando nuevos componentes de la matriz (colágeno muy específico del hueso), pero su crecimiento es muy lento. Kream et al., Endocrinol., 116:296-302 (1985). Se incuba la semibóveda craneal de fetos de ratas de 21 días durante 48 horas en presencia y ausencia de angiotensinógeno, AI, análogos de AI, fragmentos de AI y sus análogos, AII, análogos de AII, fragmentos de AII y sus análogos y/o agonistas del receptor de tipo 2 AII AT_{2}. Se añade ^{3}H-Pro durante las 18 horas finales de la incubación. Los resultados demuestran que AII aumenta las concentraciones de prolina (Pro) y la hidroxiprolina (OH-Pro) en la semibóveda craneal fetal de la rata demuestra que AII puede aumentar el nivel de la síntesis de colágeno de tipo I en un sistema normal de cultivo óseo.

En otra forma de realización, la presente invención comprende una composición para mejorar la recuperación ósea o de cartílago in vivo mediante administración de los agentes activos de la invención. En una forma de realización, los compuestos de la invención se inyectan en el tejido subcutáneo sobre la bóveda craneal derecha de los ratones. El vehículo de referencia es PBS complementado con BSA al 1%. Se administra heparina a una dosis de 50 unidades/ml. Los animales se sacrifican el día 14 y se mide el crecimiento del hueso mediante histomorfometría.

Se limpian las muestras de hueso para cuantificación procedentes de los tejidos adyacentes y se fijan en formalina tamponada al 10% durante 24 a 48 horas, se descalcifican en EDTA al 14% durante 1 a 3 semanas, se procesan en alcoholes graduados y se empapan en cera de parafina. Se preparan secciones de la bóveda craneal y del fémur. Se seleccionan secciones representativas para la evaluación histomorfométrica de los efectos del agente activo en la formación del hueso y en la reabsorción del hueso. Se miden las secciones utilizando un accesorio de la cámara para trazar directamente la imagen del microscopio sobre la placa digitalizadora. Se miden los cambios del hueso en las secciones recogidas 200 mu m aparte, sobre 4 campos adyacentes de 1 \times 1 mm tanto en las partes inyectadas como no inyectadas de la bóveda craneal. Se identifica el hueso nuevo por su textura, más bien que por la estructura laminar y los osteoclastos y osteoblastos se identifican por su morfología distintiva. Se utiliza el programa informático de histomorfometría (Osteomeasure, Osteometrix, Inc., Atlanta) para procesar la entrada al digitalizador para determinar los contajes celulares y las áreas o los perímetros característicos.

Como alternativa, se pueden utilizar los agentes activos de la invención para potenciar la función de los osteoblastos en animales íntegros. En una forma de realización preferida, un modelo para la actividad anormal de los osteoblastos, ratas Sprague-Dawley destetadas, se colocan a dieta de fosfato y deficiente en vitamina D según las instrucciones del fabricante (dieta nº 80039, Teklad, Madison, Wis.). Los animales a dieta se mantienen además en la oscuridad para impedir la síntesis de nueva vitamina D. Los animales colocados en dichas condiciones presentan formación anormal del hueso y una marcada insuficiencia en la masa ósea total.

Un grupo de las ratas destetadas a dieta se trata con el agente activo con aproximadamente entre 0,1 ng/kg y 10 mg/kg, administrados por inyección subcutánea, cada 21 días. Un grupo a dieta permanece sin tratar y sirve como referencia. Las referencias de las camadas que no están a dieta y que no se tratan con el agente activo suministran muestras de sangre en el momento del sacrificio de los animales a dieta para la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina. En el momento del sacrificio, se extraen los huesos largos de los animales a dieta para su análisis posterior.

La actividad de la fosfatasa alcalina del suero se utiliza como un indicador válido de la actividad de los osteoblastos, de modo que el aumento de los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina son una prueba del recambio óseo anormal en los animales experimentales. La actividad de la fosfatasa alcalina del suero se determina midiendo la hidrólisis del fosfato de p-nitrofenilo mediante muestras de suero según el procedimiento de Lowry et al., J. Biol. Chem., 207:19-37 (1954). La actividad notablemente elevada de la fosfatasa alcalina del suero indica la actividad anormal de los osteoblastos. En cambio, se demuestra la normalización de la función de la célula ósea mediante la disminución del nivel de actividad del fosfato alcalino del suero y el aumento de la masa ósea (analizada mediante la determinación del peso de la ceniza de los huesos) en comparación con los animales de referencia.

Como alternativa, se utiliza un modelo de la anomalía del cartílago articular con mucho espesor en la articulación femoral-rotuliana de conejos adultos para evaluar la capacidad de los compuestos de la presente invención que afectan la recuperación del cartílago y del hueso, según se describe en la patente U.S. nº 5.700.774, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia. Se anestesiaron conejos blancos adultos de Nueva Zelanda y se prepararon para su intervención quirúrgica estéril. Una anomalía de 3 \times 3 mm en el cartílago articular y en el hueso subcondral subyacente se perfora en el surco rotuliano de la articulación de la rodilla. La anomalia se deja vacía, se rellena con colágeno esponjoso (referencias) o se empapa con colágeno esponjoso con una cantidad comprendida aproximadamente entre 0,1 ng/ml y 10 mg/ml de agente activo. Se cierra la incisión y se deja que se muevan libremente los animales dentro de sus jaulas durante 4 semanas. Después de 4 semanas se practica a los animales la eutanasia de forma humanitaria y se evalúa histológicamente la arquitectura del tejido, la cantidad y calidad del tejido de la recuperación en la anomalía ósea articular del cartílago/subcondral. Se realiza el análisis de Northern para fenotipado adicional.

En una forma de realización adicional, se pueden recubrir implantes dentales y ortopédicos con los compuestos de la invención. En general, los aparatos del implante se recubren con los agentes activos de la invención disueltos a una concentración comprendida en el intervalo entre 0,1 ng/ml y 10 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2 mg/ml de albúmina de suero. El extremo poroso del implante se sumerge en la solución y se seca con aire (o se liofiliza) o se implanta inmediatamente en la zona ósea. Se aumenta la viscosidad de la solución para recubrimiento, si se desea, añadiendo hialuronato a una concentración final de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml o añadiendo otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Como alternativa, la solución que contiene el agente activo se mezcla con gel de colágeno o colágeno humano (p. ej.: Zyderm Registered TM Collagen Implant, Collagen Corp., Palo Alto Calif.) a una concentración final de colágeno de 2 mg/ml a 100 mg/ml para formar una pasta o gel, que se utiliza a continuación para recubrir el extremo poroso del aparato del implante. El aparato del implante recubierto se coloca en la zona ósea inmediatamente o se seca con aire y se rehidrata con PBS antes de la implantación, con el objeto de maximizar la formación de hueso nuevo en el implante a la vez que minimizar el crecimiento del tejido blando en la zona del implante.

En otra forma de realización, se pueden utilizar los procedimientos de la presente invención para tratar líneas celulares condrocíticas, tales como los condrocitos articulares, para mantener el fenotipo condrocítico y la supervivencia de las células. Las poblaciones de células tratadas son, por lo tanto, útiles para las aplicaciones de la terapia génica.

Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes activos como ingredientes para su utilización en la invención. Las composiciones comprenden los agentes activos junto con un compuesto o compuestos que mejoran también la implantación del hueso o del cartílago, la recuperación o la regeneración, que incluye, pero no se limita a la proteína-2 morfógena del hueso, a la proteína-4 morfógena del hueso, a la proteína-6 morfógena del hueso, a la proteína-7 morfógena del hueso, al factor beta transformador del crecimiento, al factor de crecimiento de tipo insulina y a la paratirina, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, incluyendo este término cualquier excipiente que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de los agentes activos y otros compuestos y que no sean tóxicos para el huésped al que se administra. La dosis y la administración de las composiciones farmacéuticas variará dependiendo de la enfermedad que se esté tratando, sobre la base de una variedad de factores, incluyendo el tipo de lesión, la edad, peso, sexo, estado médico del individuo, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el compuesto particular empleado, como anteriormente. Así pues, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede ser determinado rutinariamente por un médico utilizando procedimientos estándar.

La presente invención satisface la necesidad de mejorar la recuperación ósea y del cartílago en un mamífero que padece una amplia variedad de trastornos y lesiones, que incluyen pero no se limitan a fracturas de huesos, anomalías y trastornos que están producidos por huesos debilitados, tal como en la osteoporosis, osteoartritis, enfermedad de Paget, osteohalisterisis, osteomalacia, periodontitis; la pérdida ósea producida por el mieloma múltiple y otras formas de cáncer; la pérdida ósea producida por efectos secundarios de otros tratamientos médicos (tal como con esteroides); la pérdida de masa ósea relacionada con la edad; desgarros del cartílago articular, las deformaciones y otros anomalías del cartílago tales como la artritis y la lesión del tejido cartilaginoso.

Ejemplo 1 Procedimiento para el cultivo de condrocitos de conejo

Se aislaron condrocitos del cartílago de las articulaciones de la rodilla de ratones adultos y se cultivaron según el procedimiento de Okazaki et al. (Ann. Rheum. Dis. 55:181-186, 1996). En resumen, se picaron explantes de cartílago en pequeños trozos (aproximadamente de 1,5 mm por 1,5 mm). Se digirieron los trozos de tejido a 37ºC sucesivamente en hialuronidasa al 0,05% (415 U/mg de proteína) durante 10 minutos, tripsina de tipo III al 0,2% (10.000 U/mg de proteína, Sigma) y EDTA 0,53 mM durante 15 minutos y colagenasa tipo I al 0,2% (136 U/mg de proteína, Sigma) durante 30 minutos. Se lavaron las muestras a continuación y se incubaron toda la noche a 37ºC en CO_{2} al aire en medio Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con suero de ternero fetal al 10%, 3,5 mg/ml de glucosa, colagenasa de tipo I al 0,2% y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina).

Después de esta incubación, se recogieron las células y se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2). Se contaron las células a continuación con un hemocitómetro y se volvieron a poner en suspensión a razón de 1 \times 10^{5} células/ml en F12 de Ham complementado con suero de ternero fetal y antibióticos. Se transfirió una alícuota de 10 ml de las células a matraces de 25 cm^{3} recubiertos con colágeno (recubiertos con colágeno aislado de los tendones de la cola de la rata) e incubados a 37ºC en CO_{2} al 5% al aire. Cinco a siete días después del comienzo del cultivo, se separaron las células en tripsina-EDTA al 0,05% (GIBCO-BRL) a 37ºC en CO_{2} al 5% al aire. Después de la separación se lavaron una vez las células con solución salina tamponada con fosfato, se centrifugaron y se volvieron a poner en suspensión a razón de 200 células/ml en F12 de Ham complementado con suero de ternero fetal y antibióticos. Se dividieron en partes alícuotas doscientos microlitos de células en pocillos recubiertos con colágeno de una placa de microvaloración de 96 pocillos y se dejo que se adhirieran, tras lo cual, se añadió a los pocillos 10 \mug/ml de AII y del análogo de AII y fragmentos de los péptidos relacionados en la Tabla 3 para evaluar sus efectos en la proliferación de condrocitos los días 1, 2 y 3 después del comienzo del cultivo. Se cuantificó el número de células tiñendo las células con colorante Giemsa y contando al microscopio el número de núcleos detectados. Los datos (Figs. 1-4) demuestran que el AII, el análogo de AII y los fragmentos de los péptidos aceleran la proliferación de condrocitos.

TABLA 3

3

Ejemplo 2 Consolidación del hueso

Ratas Sprague-Dawley hembra se sometieron a anestesia intramuscular con cetamina/rompum y se prepararon para una intervención quirúrgica estéril rasurando las zonas quirúrgicas y frotando con frotes de Betadine seguido de etanol al 70%. A continuación se colocó la rata sobre un campo estéril en una posición decúbito lateral orientada hacia el cirujano. Se cubrieron a continuación las patas rasuradas con solución de Betadine y se taparon asépticamente. Se realizó una encisión paralela al eje longitudinal de la diáfasis media derecha. Se separó el músculo a lo largo de los planos fasciales para exponer la tibia. Se perforó a continuación una anomalía de 1,4 mm desde la parte lateral del eje medio del córtex con el fin de que la anomalía se extendiese desde un lado cortical al otro, a través de la médula ósea. Se utilizó a continuación solución salina estéril (NaCl 0,9%) para inyectables, para limpiar el área quirúrgica de los desechos de tejido y de los fragmentos de hueso. Ya sea la solución del polímero hidrón (vehículo: Hidrón al 10%, etanol al 60% y polímero de polietilenglicol al 1%) o el péptido (AII, AII(1-7) o 9GD a 1 mg/ml) en solución de polímero hidrón se colocó en la anomalía ósea para rellenar la anomalía con polímero (aproximadamente 0,1 ml de polímero). Se cerró la incisión con sutura 3-0 vicrilo utilizando sutura continua de colchonero. Se dejó que los animales se repusiesen de la anestesia, se suministró Bupronex para la analgesia y se les dejó libres de movimiento hasta la eutanasia 7 días después.

Mediante observación a groso modo, se rellenaron completamente las anomalías que recibieron los péptidos de la invención con nuevo tejido que había comenzado a calcificar. La mayoría de las anomalías de referencia se rellenaron menos del 50% con nuevo tejido y no se observó ningún endurecimiento del tejido. Estos datos demuestran que los péptidos de la invención aceleran la formación del nuevo tejido óseo.

Después de la evaluación a groso modo, se separó el tejido muscular del hueso y se colocaron los huesos en formalina para su fijación. Después de 2 días en formaldehido tamponado al 10%, se colocaron los tejidos en una solución descalcificadora (Rapid Bone Decal, American MasterTech Scientific, Inc. Lodi, CA) diluida 3:1 durante 6 horas. Después de la descalcificación, se cortó el hueso por la mitad a lo largo del eje, se empapó en parafina, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina.

La evaluación microscópica de las secciones de tejido confirmó a groso modo las observaciones. El día 7, los huesos en los que se había rellenado la anomalía con Hidrón (placebo) presentaban una pérdida del relleno de fibrina en la mayoría de las células observadas siendo de naturaleza inflamatoria. Ocasionalmente, se observó en la zona de la lesión una célula que parecía ser de origen mesenquimático o unos vasos sanguíneos. En todos los animales tratados con péptido, se observó crecimiento extensivo de las células estromales en numerosos vasos sanguíneos. En aproximadamente el 50% de los animales tratados con péptido, se observó tejido con apariencia de hueso nuevo. Estos datos apoyan claramente la capacidad de estos péptidos de angiotensina para acelerar la formación de nuevo hueso.

TABLA 4

4

Debe entenderse que la invención no se limita a los detalles exactos de la operación, o a los compuestos, composiciones, procedimientos o formas de realización exactos mostrados y descritos, ya que resultan evidentes para los expertos en la materia modificaciones obvias y equivalentes y la invención está únicamente limitada, por consiguiente, por el alcance completo de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Utilización de por lo menos un agente activo que comprende una secuencia de por lo menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R^{1}-R^{8} en la secuencia de fórmula general I

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-R^{6}-R^{7}-R^{8}

en la que R^{1} y R^{2} conjuntamente forman un grupo de fórmula

X-R^{A}-R^{B}-,

en la que X es H o uno a tres grupos de péptido, o está ausente,

R^{B} está adecuadamente seleccionado de entre Arg, Lys, Ala, Orn, Cidra, Ser(Ac), Sar, D-Arg y D-Lys;

R^{6} es His, Arg o 6-NH_{2}-Phe;

R^{7} es Pro o Ala; y

R^{8} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), Ile y Tyr, excluyendo las secuencias que incluyen R^{4} como grupo Tyr terminal, o está ausente, para la preparación de una composición farmacéutica para por lo menos uno de los tratamientos siguientes: mejora de la recuperación ósea en un mamífero, mejora de la implantación ósea y de la prótesis en un mamífero y unión y fijación de los implantes de cartílago al hueso o a otro tejido en un mamífero.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por angiotensinógeno, SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por angiotensinógeno, SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que el agente activo comprende una secuencia de la fórmula

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-His-Pro-R^{6}

en la que

R^{1} se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, Gly y Asp;

R^{2} se selecciona de entre el grupo constituido por Arg, cidra u ornitina;

R^{4} se selecciona de entre Tyr, Tyr(PO_{3})_{2} y Ala;

R^{6} es Phe, Ile o está ausente para la proliferación de condrocitos, la síntesis de colágeno, la recuperación del cartílago, y la unión y la fijación del cartílago al hueso o a otros tejidos.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

7. Utilización según la reivindicación 1, en el que el agente activo comprende una secuencia de fórmula

Asp-Arg-R^{1}-R^{2}-Ile-His-Pro-R^{3}

en la que

R^{2} se selecciona de entre Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}; y

R^{3} es Phe, o está ausente,

para mejorar la implantación del hueso y de la protesis en un mamífero.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 41 y SEC ID nº: 45.

9. Utilización según la reivindicación 1, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una secuencia de fórmula general I.

10. Utilización según la reivindicación 2, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

11. Utilización según la reivindicación 3, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

12. Utilización según la reivindicación 4, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

13. Utilización según la reivindicación 5, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

14. Utilización según la reivindicación 6, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

15. Utilización según la reivindicación 7, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

16. Utilización según la reivindicación 8, en la que el agente activo está constituido esencialmente por una o más de las secuencias referidas.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de un producto farmacéutico para mejorar la recuperación del hueso en un mamífero, en la que el mamífero padece una enfermedad seleccionada de entre el grupo constituido por fracturas óseas, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad de Paget, osteohalisteresis, osteomalacia, perodontitis, pérdida ósea producida por el cáncer, pérdida ósea producida por el tratamiento con esteroides y pérdida de masa ósea relacionada con la edad.

18. Procedimiento para el cultivo de condrocitos que comprende la puesta en contacto de los condrocitos con una cantidad eficaz para acelerar la proliferación de los condrocitos de por lo menos un agente activo que comprende una secuencia de por lo menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R^{1}-R^{8} en la secuencia de fórmula general I.

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-R^{6}-R^{7}-R^{8}

en la que R^{1} y R^{2} conjuntamente forman un grupo de fórmula

X-R^{A}-R^{B}-,

en la que X es H o uno a tres grupos de péptido, o está ausente,

R^{6} es His, Arg o 6-NH_{2}-Phe;

R^{7} es Pro o Ala; y

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por angiotensinógeno, SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID
nº: 45.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el agente activo comprende una secuencia según la fórmula

R^{1}-R^{2}-R^{3}-R^{4}-R^{5}-His-Pro-R^{6}

en la que

R^{1} se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, Gly y Asp;

R^{2} se selecciona de entre el grupo constituido por Arg, cidra u ornitina;

R^{4} se selecciona de entre Tyr, Tyr(PO_{3})_{2}y Ala;

R^{6}es Phe, Ile o está ausente.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en la que el agente activo comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 38, SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que la concentración de agente activo está comprendida entre aproximadamente 0,1 ng/ml y aproximadamente 1,0 mg/ml.

23. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que la composición farmacéutica comprende además por lo menos un compuesto seleccionado de entre la proteína-2 morfógena del hueso, proteína-4 morfógena del hueso, proteína-6 morfógena del hueso, proteína-7 morfógena del hueso, el factor beta transformador del crecimiento, el factor de crecimiento de tipo insulina y la paratirina, en una cantidad eficaz para mejorar la recuperación, regeneración o implantación del hueso o del cartílago en el mamífero.

24. Composición farmacéutica, que comprende

(a): una cantidad eficaz para mejorar la recuperación del hueso o del cartílago, la implantación del hueso y de la prótesis o la implantación del cartílago en un mamífero de por lo menos un agente activo que comprende una secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16

(b): una cantidad eficaz para mejorar la recuperación del hueso o la implantación del hueso y de la prótesis en un mamífero de por lo menos un compuesto seleccionado de entre la proteína-2 morfógena del hueso, proteína-4 morfógena del hueso, proteína-6 morfógena del hueso, proteína-7 morfógena del hueso, el factor beta transformador del crecimiento, el factor de crecimiento de tipo insulina y la paratirina; y

(c): un excipiente farmacéuticamente aceptable.