JPH0478273B2 - - Google Patents
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- JPH0478273B2 JPH0478273B2 JP62206165A JP20616587A JPH0478273B2 JP H0478273 B2 JPH0478273 B2 JP H0478273B2 JP 62206165 A JP62206165 A JP 62206165A JP 20616587 A JP20616587 A JP 20616587A JP H0478273 B2 JPH0478273 B2 JP H0478273B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は、カルシウム依存性酸素添加酵素の調
製法に関する。
製法に関する。
更に詳しくは、カルシウム受容発光蛋白エクオ
リンの蛋白部分を還元剤及び金属イオン処理する
ことにより、基質に酵素を連続的に添加し、連続
的発光能力を有する酵素を調製する方法に関す
る。
リンの蛋白部分を還元剤及び金属イオン処理する
ことにより、基質に酵素を連続的に添加し、連続
的発光能力を有する酵素を調製する方法に関す
る。
天然に存在するカルシウム受容発光蛋白エクオ
リンは、微量のカルシウムイオンの存在により、
数秒内にその蛋白内に存在するエミツターである
セレンテラジンが酸化して発光する。この一連の
反応は不可逆であり、連続的に長時間発光を持続
することは困難である。
リンは、微量のカルシウムイオンの存在により、
数秒内にその蛋白内に存在するエミツターである
セレンテラジンが酸化して発光する。この一連の
反応は不可逆であり、連続的に長時間発光を持続
することは困難である。
本発明者は、前述の問題を解決すべく遺伝子工
学及び蛋白質工学の手法を用いて研究を行つた。
学及び蛋白質工学の手法を用いて研究を行つた。
天然のエクオリンより得たアポエクオリン（蛋
白質部分）及び組換えDNAで製造したアポエク
オリン（特願昭60−280259，61−249098，61−
245108，61−245109，62−126373，62−126374）
を通常の酵素のように連続的に長時間にわたつて
酸素反応を行なわせることができれば、瞬時に発
光するエクオリンより検出方法としての汎用性が
増大し、連続の発光をＸ−線フイルム等で検出す
ることが可能となる。このことはエクオリンの放
射性同位元素の代用としての利用も可能になり、
利用価値がある。
白質部分）及び組換えDNAで製造したアポエク
オリン（特願昭60−280259，61−249098，61−
245108，61−245109，62−126373，62−126374）
を通常の酵素のように連続的に長時間にわたつて
酸素反応を行なわせることができれば、瞬時に発
光するエクオリンより検出方法としての汎用性が
増大し、連続の発光をＸ−線フイルム等で検出す
ることが可能となる。このことはエクオリンの放
射性同位元素の代用としての利用も可能になり、
利用価値がある。
本発明の要点は、カルシウム受容発光蛋白エク
オリンの蛋白部分（アポエクオリン）の触媒機
能、すなわち基質セレンテラジンが酸素存在下で
カルシウム添加による分解・発光する機能を利用
することにある。
オリンの蛋白部分（アポエクオリン）の触媒機
能、すなわち基質セレンテラジンが酸素存在下で
カルシウム添加による分解・発光する機能を利用
することにある。
天然あるいは組換えDNAで製造したエクオリ
ンは、アポエクオリン−酸素−セレンテラジンが
コンプレツクス状に存在し、Ca2+イオンで瞬時
に発光する。この反応は不可逆であり、基質添
加、還元剤の添加で、非常に微弱の発光しか検出
できず、実用性に乏しい。
ンは、アポエクオリン−酸素−セレンテラジンが
コンプレツクス状に存在し、Ca2+イオンで瞬時
に発光する。この反応は不可逆であり、基質添
加、還元剤の添加で、非常に微弱の発光しか検出
できず、実用性に乏しい。
そこで本発明は、アポエクオリンの高次構造の
変化を考慮して還元剤の処理方法、Ca2+イオン
等の添加順序等の検討を行うことならびに十分な
実用性を有するアポエクオリン、すなわち連続的
発光を触媒するカルシウム依存性酸素添加酵素の
調製法を確立することを目的とする。
変化を考慮して還元剤の処理方法、Ca2+イオン
等の添加順序等の検討を行うことならびに十分な
実用性を有するアポエクオリン、すなわち連続的
発光を触媒するカルシウム依存性酸素添加酵素の
調製法を確立することを目的とする。
本発明者は、以上の目的で研究中のところ、ア
ポエクオリンを適当な濃度の還元剤で処理して還
元型アポエクオリンとし、金属イオンを反応させ
ることにより得られたカルシウム依存性酸素添加
酵素が上述の問題点（註．連続的長時間発光の持
続の不能）を解決し得ることを知つて本発明を完
成した。
ポエクオリンを適当な濃度の還元剤で処理して還
元型アポエクオリンとし、金属イオンを反応させ
ることにより得られたカルシウム依存性酸素添加
酵素が上述の問題点（註．連続的長時間発光の持
続の不能）を解決し得ることを知つて本発明を完
成した。
本発明は下記(1)の主要構成と(2)ないし(3)の実施
態様的構成を有する。
態様的構成を有する。
(1) アポエクオリン（E1）を還元剤で処理して
得られた還元剤処理アポエクオリン（E2）に
金属イオンを反応せしめることを特徴とするカ
ルシウム依存性酸素添加酵素の調製法。
得られた還元剤処理アポエクオリン（E2）に
金属イオンを反応せしめることを特徴とするカ
ルシウム依存性酸素添加酵素の調製法。
(2) アポエクオリンとして、天然産の発光蛋白よ
り得られたまたは組み換えDNAの手法により
得られたアポ蛋白を用いる前記第(1)項に記載の
方法。
り得られたまたは組み換えDNAの手法により
得られたアポ蛋白を用いる前記第(1)項に記載の
方法。
(3) 金属イオンとしてカルシウムイオン若しくは
ストロンチウムイオンを用いる前記第(1)項に記
載の方法。
ストロンチウムイオンを用いる前記第(1)項に記
載の方法。
本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
Ａ 本発明に使用するアポエクオリン（E1）：
天然産の発光蛋白（エクオリン）を常法により
分離精製して得られたアポ蛋白である。
分離精製して得られたアポ蛋白である。
分離精製法としては、例えば、エクオリンに適
量のカルシウム源（例えばCaCl2）を添加して発
光させ、該発光後の反応物にカルシウム除去剤例
えばEDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）の適
量を加えてエクオリンと結合しているCa2+を除
去し、被除去物を分離処理例えば、カラムクロマ
トグラフイーによつて分離することによりアポエ
クオリンを取得する。
量のカルシウム源（例えばCaCl2）を添加して発
光させ、該発光後の反応物にカルシウム除去剤例
えばEDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）の適
量を加えてエクオリンと結合しているCa2+を除
去し、被除去物を分離処理例えば、カラムクロマ
トグラフイーによつて分離することによりアポエ
クオリンを取得する。
本発明に使用するアポエクオリンは、また、組
換えDNAの手法により、大腸菌内においてアポ
エクオリン発現可能プラスミドを用いて直接産生
したアポエクオリン（註．先行文献については後
述実施例参照）または、このものを例えば陰イオ
ン交換クロマトグラフイーによりさらに精製した
ものであつてもよい。
換えDNAの手法により、大腸菌内においてアポ
エクオリン発現可能プラスミドを用いて直接産生
したアポエクオリン（註．先行文献については後
述実施例参照）または、このものを例えば陰イオ
ン交換クロマトグラフイーによりさらに精製した
ものであつてもよい。
Ｂ アポエクオリンの還元：
アポエクオリンの還元とは、該蛋白のジスフイ
ド結合（−Ｓ−Ｓ−）の開裂を意味する。かゝる
還元に使用可能な還元剤は限定されないが例え
ば、メルカプトエタノール若しくはジチオスレイ
トールを挙げることができる。還元条件は限定さ
れないが、例えば０℃〜40℃好ましくは０℃〜10
℃で、10分〜10時間好ましくは30分〜３時間アポ
エクオリン溶液と還元剤の混合液を静置する。
ド結合（−Ｓ−Ｓ−）の開裂を意味する。かゝる
還元に使用可能な還元剤は限定されないが例え
ば、メルカプトエタノール若しくはジチオスレイ
トールを挙げることができる。還元条件は限定さ
れないが、例えば０℃〜40℃好ましくは０℃〜10
℃で、10分〜10時間好ましくは30分〜３時間アポ
エクオリン溶液と還元剤の混合液を静置する。
Ｃ カルシウム依存性酸素添加酵素の調製及び測
定： 上述Ｂで得られた還元型アポエクオリンに好ま
しくは基質セレンテラジンを混合し、該混合液を
ルミフオトメーター中の反応キユベツト内にセツ
トしたのち、適量の例えば30mM CaCl2溶液を注
入する。基質セレンテラジンと30mM CaCl2溶液
の混合順序は逆にしてもよい。このようにセツト
されたカルシウム依存性酸素添加酵素の連続的な
発光を相対発光値として記録する（註．後述実施
例及び図１，２参照）。
定： 上述Ｂで得られた還元型アポエクオリンに好ま
しくは基質セレンテラジンを混合し、該混合液を
ルミフオトメーター中の反応キユベツト内にセツ
トしたのち、適量の例えば30mM CaCl2溶液を注
入する。基質セレンテラジンと30mM CaCl2溶液
の混合順序は逆にしてもよい。このようにセツト
されたカルシウム依存性酸素添加酵素の連続的な
発光を相対発光値として記録する（註．後述実施
例及び図１，２参照）。
なお、図３にエクオリンとカルシウム依存性酸
素添加酵素との関係を示した。
素添加酵素との関係を示した。
本発明によれば、天然のエクオリンより分離し
たアポエクオリンまたは、組換えDNA法で製造
したアポエクオリンを適当濃度の還元剤で処理し
て還元型アポエクオリンを取得したのち、これに
カルシウムイオン及び基質セレンテラジンを添加
することにより連続的に発光させることが可能と
なる。また、上述のような連続発光が可能となる
ことにより、この発光をＸ線フイルム等で撮影
し、最終的にカルシウムイオンの検出が可能にな
る。
たアポエクオリンまたは、組換えDNA法で製造
したアポエクオリンを適当濃度の還元剤で処理し
て還元型アポエクオリンを取得したのち、これに
カルシウムイオン及び基質セレンテラジンを添加
することにより連続的に発光させることが可能と
なる。また、上述のような連続発光が可能となる
ことにより、この発光をＸ線フイルム等で撮影
し、最終的にカルシウムイオンの検出が可能にな
る。
〔実施例〕
アポエクオリンの調製法
(1) 天然エクオリンからの調製法
天然のエクオリン（100μg）に30mM CaCl2
（500μ）を添加し、発光させる。発光後100mM
EDTA（エチレンジアミンテトラアセト酢酸500μ
）を加えCa2+を除去した後、セフアテツクス
G25カラムクロマトグラフイー（100×10φmm）に
よりアポエクオリンを得る。
（500μ）を添加し、発光させる。発光後100mM
EDTA（エチレンジアミンテトラアセト酢酸500μ
）を加えCa2+を除去した後、セフアテツクス
G25カラムクロマトグラフイー（100×10φmm）に
よりアポエクオリンを得る。
(2) 組換えDNAの手法による調製法
大腸菌内に於て、アポエクオリン発現可能プラ
スミドを用いて産生したアポエクオリン（特願昭
60−280259（特開昭62−171695）、61−249098（特
開昭63−102695）、61−245108（特開昭63−
98387）、61−245109（特開昭63−98398）、62−
126373（特開昭63−291593）、62−126374（特開昭
63−291586）、Biochemistry1986.25 8425−8429
井上ら）、あるいは陰イオン交換クロマトグラフ
イー（DEAE−セルロフアイン、DEAEセフアセ
ル等）を用いてさらに精製したアポエクオリンを
得る。
スミドを用いて産生したアポエクオリン（特願昭
60−280259（特開昭62−171695）、61−249098（特
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井上ら）、あるいは陰イオン交換クロマトグラフ
イー（DEAE−セルロフアイン、DEAEセフアセ
ル等）を用いてさらに精製したアポエクオリンを
得る。
アポエクオリンの還元剤での処理法（還元型
アポエクオリンの調製法） アポエクオリン（100μg）の２ml溶液に蛋白質
のジスルフイド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）を開裂す
る能力を有する２−メルカプトエタノール100μ
を添加し、４℃で１時間以上放置することによ
り還元型アポエクオリンを調製することができ
る。
アポエクオリンの調製法） アポエクオリン（100μg）の２ml溶液に蛋白質
のジスルフイド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）を開裂す
る能力を有する２−メルカプトエタノール100μ
を添加し、４℃で１時間以上放置することによ
り還元型アポエクオリンを調製することができ
る。
カルシウム依存性酸素添加酵素の測定法及び
測定 前２項で調製した還元型アポエクオリン2μ
と基質セレンテラジン2μ（100μg／ml）を混合
し、ラボサイエンス社(株)製（東京）ルミフオトメ
ーターTD−4000型の反応キユベツト内にセツト
し100μの30mM CaCl2溶液を注入し、あるい
は、還元型アポエクオリン2μに100μの30mM
CaCl2溶液を注入し、混合した後、基質セレンテ
ラジン2μを注入し、連続的な発光をレコダー
により相対発光値（relative light units， rlu）
で記録する。
測定 前２項で調製した還元型アポエクオリン2μ
と基質セレンテラジン2μ（100μg／ml）を混合
し、ラボサイエンス社(株)製（東京）ルミフオトメ
ーターTD−4000型の反応キユベツト内にセツト
し100μの30mM CaCl2溶液を注入し、あるい
は、還元型アポエクオリン2μに100μの30mM
CaCl2溶液を注入し、混合した後、基質セレンテ
ラジン2μを注入し、連続的な発光をレコダー
により相対発光値（relative light units， rlu）
で記録する。
実際に還元剤未処理物及び処理物の発光曲線及
び、酵素、基質Ca2+イオンの混合順序による影
響について図１，２に示す。
び、酵素、基質Ca2+イオンの混合順序による影
響について図１，２に示す。
図１は還元剤未処理のアポエクオリンについて
であり、同図中記号は次のとおりである。
であり、同図中記号は次のとおりである。
Ａ：還元剤未処理アポエクオリン （2μ）
Ｂ：基質セレンテラジン （2μ）
Ｃ：２−メルカプトエタノール （2μ）
Ｄ：CaCl2 （100μ）
であり、矢印は、注入ポイントである。
図１のａ〜ｃは、CaCl2添加による連続発光
〃 ｄ〜ｆは、セレンテラジンの添加による
連続発光。
連続発光。
カルシウムイオンを最初に添加した場合は、
ｄ，ｆに示されるように、非常に微弱の発光しか
検出されない。また１分間程度の２−メルカプト
エタノール処理は同図ａ，ｂ，ｃ，ｅに示される
ように10倍程度の効果がある。
ｄ，ｆに示されるように、非常に微弱の発光しか
検出されない。また１分間程度の２−メルカプト
エタノール処理は同図ａ，ｂ，ｃ，ｅに示される
ように10倍程度の効果がある。
そこで、最初に還元剤で処理（12時間処理）し
たアポエクオリンについて示したのが図２であ
る。図２において、 ａは還元剤処理をしたアポエクオリン（A′）
と基質セレンテラジン（Ｂ）を混合し、２分間後
にカルシウム（Ｄ）に注入し、その連続発光を示
したものであり、 ｂは還元剤処理したアポエクオリン（A′）と
カルシウム溶液（Ｄ）を混合し、２分間後に基質
セレンテラジン（Ｂ）を注入し、その連続発光を
示したものである。図２ａ，ｂの場合明らかに図
１の未処理のアポエクオリンに比べ、約５倍程度
発光活性が高く、しかも同程度に連続的に発光す
る。すなわち、連続的に機能するカルシウム依存
性酸素添加酵素が調製できたわけである。
たアポエクオリンについて示したのが図２であ
る。図２において、 ａは還元剤処理をしたアポエクオリン（A′）
と基質セレンテラジン（Ｂ）を混合し、２分間後
にカルシウム（Ｄ）に注入し、その連続発光を示
したものであり、 ｂは還元剤処理したアポエクオリン（A′）と
カルシウム溶液（Ｄ）を混合し、２分間後に基質
セレンテラジン（Ｂ）を注入し、その連続発光を
示したものである。図２ａ，ｂの場合明らかに図
１の未処理のアポエクオリンに比べ、約５倍程度
発光活性が高く、しかも同程度に連続的に発光す
る。すなわち、連続的に機能するカルシウム依存
性酸素添加酵素が調製できたわけである。
これらの一連の反応を、エクオリンを含めて示
したのが、図３であり、還元剤処理により連続的
に発光する説明である。
したのが、図３であり、還元剤処理により連続的
に発光する説明である。
図１〜３は、本発明の実施例の説明図である。
図１及び２において、 Ａ，A′：還元剤未処理または処理アポエクオ
リン Ｂ：基質セレンテラジン Ｃ：２−メルカプトエタノール Ｄ：CaCl2 を示し、 ↓：それぞれの薬剤の注入を示す。 また、図３は、エクオリンとカルシウム依存性
酸素添加酵素の反応関係を示すフローシートであ
る。
図１及び２において、 Ａ，A′：還元剤未処理または処理アポエクオ
リン Ｂ：基質セレンテラジン Ｃ：２−メルカプトエタノール Ｄ：CaCl2 を示し、 ↓：それぞれの薬剤の注入を示す。 また、図３は、エクオリンとカルシウム依存性
酸素添加酵素の反応関係を示すフローシートであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アポエクオリン（E1）を還元剤で処理して
得られた還元剤処理アポエクオリン（E2）に金
属イオンを反応せしめることを特徴とするカルシ
ウム依存性酸素添加酵素の調製法。 ２ アポエクオリンとして、天然産の発光蛋白よ
り得られたまたは組換えDNAの手法により得ら
れたアポ蛋白を用いる特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 ３ 金属イオンとしてカルシウムイオン若しくは
ストロンチウムイオンを用いる特許請求の範囲第
１項に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62206165A JPS6447379A (en) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | Preparation of calcium-dependent oxygenation enzyme |
| EP88110862A EP0303817B1 (en) | 1987-08-19 | 1988-07-07 | A process for preparing a calcium-dependent oxygenase |
| DE3852527T DE3852527T2 (de) | 1987-08-19 | 1988-07-07 | Verfahren zur Herstellung einer Calciumabhängigen Oxygenase. |
| US07/218,299 US5023181A (en) | 1987-08-19 | 1988-07-13 | Process for preparing a calcium-dependent oxygenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62206165A JPS6447379A (en) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | Preparation of calcium-dependent oxygenation enzyme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6447379A JPS6447379A (en) | 1989-02-21 |
| JPH0478273B2 true JPH0478273B2 (ja) | 1992-12-10 |
Family
ID=16518883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62206165A Granted JPS6447379A (en) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | Preparation of calcium-dependent oxygenation enzyme |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5023181A (ja) |
| EP (1) | EP0303817B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6447379A (ja) |
| DE (1) | DE3852527T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106692945A (zh) * | 2008-03-11 | 2017-05-24 | 昆西生物科学有限公司 | 含有脱辅基水母蛋白的组合物及其使用方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH04179477A (ja) * | 1990-11-13 | 1992-06-26 | Chisso Corp | 発光蛋白エクオリン標識抗体 |
| US5648218A (en) * | 1993-02-12 | 1997-07-15 | Sealite Sciences, Inc. | Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof |
| WO1994018342A1 (en) * | 1993-02-12 | 1994-08-18 | Sealite Sciences, Inc. | Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof |
| WO1995021191A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | William Ward | Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein |
| BE1009196A3 (fr) * | 1995-03-09 | 1996-12-03 | Univ Catholique Louvain | Composition pharmaceutique, cosmetique et/ou alimentaire aux proprietes anti-oxydantes. |
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| US6247995B1 (en) | 1996-02-06 | 2001-06-19 | Bruce Bryan | Bioluminescent novelty items |
| US5942407A (en) * | 1996-06-25 | 1999-08-24 | Immunomatrix, Inc. | Light-emitting immunoassay |
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| WO1999049019A2 (en) | 1998-03-27 | 1999-09-30 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
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| DE602004030136D1 (de) | 2003-08-12 | 2010-12-30 | Chisso Corp | Fluoreszenzprotein |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62171695A (ja) * | 1985-12-14 | 1987-07-28 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ214563A (en) * | 1984-12-31 | 1991-05-28 | Univ Georgia | Production of apoaeqorin using recombinant dna |
| JPS62261942A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-14 | Chisso Corp | 金属の検出方法 |
-
1987
- 1987-08-19 JP JP62206165A patent/JPS6447379A/ja active Granted
-
1988
- 1988-07-07 DE DE3852527T patent/DE3852527T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-07 EP EP88110862A patent/EP0303817B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-13 US US07/218,299 patent/US5023181A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62171695A (ja) * | 1985-12-14 | 1987-07-28 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3852527D1 (de) | 1995-02-02 |
| EP0303817B1 (en) | 1994-12-21 |
| EP0303817A2 (en) | 1989-02-22 |
| US5023181A (en) | 1991-06-11 |
| DE3852527T2 (de) | 1995-07-06 |
| JPS6447379A (en) | 1989-02-21 |
| EP0303817A3 (en) | 1990-07-04 |
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