CN117625618A - 一种檀香醇生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种檀香醇生物传感器及应用，涉及生物工程领域。本发明首次筛选到4个檀香醇响应的启动子，以之构建红色有荧光蛋白表达盒，建立了一定范围内檀香醇浓度与红色荧光蛋白强度的正相关关系，首次建立檀香醇生物传感器，打破了该领域的技术壁垒。本发明构建的檀香醇生物传感器为产物响应型生物传感器，鲜有报道，该生物传感器用于檀香醇高产菌株的筛选，解决了檀香醇本身无色，缺少显色反应，仅能通过质谱分析定量的技术难题。本发明所构建的檀香醇生物传感器核酸结构式为P‑RP‑T，其中的RP可以用抗生素抗性基因代替，以建立檀香醇与抗生素浓度的正相关关系，扩展其应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种檀香醇生物传感器及应用。
背景技术
檀香醇，分子式为C15H24O，是一种双环倍半萜类化合物，存在于天然的檀香油中。根据其末端的羟基位置，分为α-檀香醇(α-santalol)、β-檀香醇(β-santalol)、反式-α-香柠檬醇(trans-α-bergamotol)、檀香二环酮醇(santenone alcohol)和表-β-檀香醇(epi-β-santalo1)。其中α-檀香醇和β-檀香醇占总量的80％，而α-檀香醇又占总量33-55％，起主要的芳香作用。被广泛应用于化妆品、香水行业，同时也具有药用价值，如抗氧化性、抗高血糖、神经保护和抗癌等。天然檀香油主要来自于檀香树心材部分，通过有机试剂萃取，蒸馏等提取手段制备天然檀香精油，而传统的檀香醇获得方法已经不再适用于目前市场对檀香醇产品的需求。近年来，随着合成生物学的发展，微生物细胞工厂异军突起，异源生物合成檀香醇成为解决上述矛盾的新方法之一。然而檀香醇生物合成途径中的细胞色素P450酶活性限制了其高效合成及应用。想要高效快速生产满足市场品质需求的檀香醇则需要借助高通量检测方法以获得高效表达的细胞色素P450酶或微生物底盘，目前，未见檀香醇高通量检测的相关报道，这是因为建立其相应高通量方法存在几个瓶颈问题：第一，檀香醇本身为无色化合物，且缺少显色反应；第二，使用GC-MS检测需要繁琐的样品处理过程，检测周期较长，通量低下；第三，P450酶在真核微生物底盘中的表达水平有限，合成檀香醇的能力较低，且檀香醇为胞内产物，样品需要细胞破碎处理，检测误差较大，故而建立檀香醇高通量筛选方法十分有必要。
檀香醇的前体化合物檀香烯已经实现在毕赤酵母底盘细胞中的高效合成，最高产量达21g/L(Zuo Y，Xiao F，Gao J.Establishing Komagataella phaffii as a CellFactory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2022(26)：70.)，这为下游檀香醇的转化奠定了基础，本发明针对檀香醇生产菌株缺乏高通量筛选方法的主要难题，通过转录组测序筛选檀香醇响应启动子，以建立檀香醇生物传感器及高通量筛选方法并将其应用到高效P450酶高通量筛选以及高效P450酶表达底盘菌株的改造中。
发明内容
现有技术中的生物传感器往往是底物响应型，极少有产物响应型的生物传感器，目前未见檀香醇响应的生物传感器报道，由于檀香醇异源生物合成及检测存在检测通量低、周期长、误差大等问题，建立一种有效的檀香醇高通量筛选方法显得十分必要，为了解决现有技术中的不足，本发明提供了一种檀香醇生物传感器，并利用该生物传感器构建一种基于产物响应的檀香醇菌株筛选方法。具体技术方案如下：本发明提供了一种用于檀香醇生物传感器的启动子，该启动子为檀香醇响应启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQID NO.1～4所示的任意一种。本发明还提供了一种檀香醇生物传感器，含有启动子P、报告基因RP和终止子T；所述启动子P调控报告基因的表达，本发明所述檀香醇响应启动子为以下任意一种：(1)P0728，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；(2)POYE2，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；(3)P1084，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；(4)P0225，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述启动子P、报告基因RP和终止子T位于同一质粒或同一基因组DNA上。相当于将该生物传感器导入宿主细胞中，宿主细胞中存在由本发明所述的檀香醇生物传感器核心元件，存在形式可以为游离质粒也可以是基因组整合。
优选的，所述报告基因为荧光蛋白基因或抗生素抗性基因；所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因；所述抗生素抗性基因为博来霉素抗性基因。在本发明的实施例中，所述红色荧光蛋白基因mCherry的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。终止子T核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了与所述檀香醇生物传感器相关的生物材料，包括如以下任一项：(a)表达盒，含有所述檀香醇生物传感器；(b)重组载体，含有所述檀香醇生物传感器或(a)中表达盒。本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主菌和导入宿主菌的所述与檀香醇生物传感器相关的生物材料。所述宿主菌为毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、东方伊萨酵母中的任意一种。本发明还提供了一种用于檀香醇生物传感器的檀香烯平台菌株，由申请号为CN202210093958.4的专利申请中Pa-4菌株基因组导入SaCPR2基因即可构建檀香烯平台菌株。所述SaCPR2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所使用的启动子为PTEF，苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了所述檀香醇生物传感器在筛选檀香醇高产菌株中的应用。
本发明中一种檀香醇生物传感器的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备一种檀香烯平台菌株，所述平台菌株中含有檀香醇生物传感器，该传感器的核酸结构式为P-RP-T；(2)在步骤(1)中所得宿主细胞基因组中整合启动子-sgRNA-PAM位点-终止子的空表达盒；(3)体外易错PCR构建CYP736A167(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)突变体文库；(4)将步骤(3)所述突变体文库导入步骤(2)所得底盘菌株获得突变菌株库；(5)筛选突变菌株，以获得檀香醇生产菌株，尤其是檀香醇高产菌株。本发明中所述的宿主细胞为真核酵母细胞，可以是毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、东方伊萨酵母等中的任意一种。
更为优选的，本发明中的宿主细胞为毕赤酵母细胞，例如毕赤酵母GS115菌株。
更进一步的，本发明所述的宿主细胞中存在由本发明所述的檀香醇生物传感器核心元件，存在形式可以为游离质粒也可以是基因组整合。需要说明的是，由于所筛选的檀香醇响应启动子为毕赤酵母内源启动子，在原核细胞等其他宿主细胞中并未得到验证，若未脱离本发明构思的情况下，在其他宿主中获得相似效果，应属本发明保护范围。本领域的普通技术人员，可以使用已知方法构建本发明所述生物传感器并将其应用于檀香醇突变菌株的筛选中。其操作流程如下：
(1)转录组分析挖掘檀香醇响应启动子：在毕赤酵母GS115菌株基础上，以是否外源添加檀香醇标准品(购自默克公司)为区分条件进行真核有参转录组分析，该项目由上海美吉生物医药科技有限公司完成。首先接种GS115菌株至YPD液体培养基进行30℃恒温培养12h，后以10％接种量转接至YPD液体摇瓶，保证对照组与实验组初始OD一致，实验组外源添加终浓度为200mg/L的檀香醇标准品，恒温培养36h，样品使用液氮快速冻存送出进行转录组分析。(2)檀香醇响应启动子的表征：在真核有参转录组测序数据的基础上挖掘檀香醇响应的启动子。分析两组差异表达量FC值大于10的启动子，并将它们在毕赤酵母基因组中进行定位标记。设计构建GS115-Cas9-RP菌株，其基因组中RP前端预留20bp sgRNA+NGG序列。根据启动子序列设计整合引物，聚合酶链式反应扩增批量启动子后，分别导入GS115-Cas9-RP菌株中，得到一系列表达RP的启动子毕赤酵母菌株，将阳性转化子接种至24孔板30℃恒温培养12h，后以10％的接种量转接至新的24孔板中进行培养，分为两组，一组作为对照，一组外源添加终浓度为200mg/L的檀香醇标准品，温度30℃，摇床转速800rpm培养36h后酶标仪测定两组报告基因表达强度值。(3)正相关性测试：采用外源添加梯度浓度檀香醇标准品进行正相关性测试，檀香醇梯度浓度设置范围为0-300mg/L。将构建的具有传感器功能的毕赤酵母菌株进行试管培养12h后，转接至摇瓶培养，添加梯度浓度檀香醇，继续培养至36h，酶标仪检测报告基因表达强度，以建立生物传感器对檀香醇的应答关系。(4)功能测试：构建不同浓度檀香醇产量的菌株，并将生物传感器分别导入所述菌株中，将所构建的含有生物传感器的不同檀香醇产量的工程菌株作为实验菌株，进行试管培养12h，后以合适接种量转接至摇瓶，保证各实验组初始OD一致，进行摇瓶发酵培养，36h后使用酶标仪检测分析报告基因的表达强度，另一方面，GC-MS定量各组檀香醇产量，观察分析生物传感器在体内的应答反应。(5)檀香醇生物传感器的应用：本发明利用转录组测序分析结合实验表征到多个可以响应檀香醇浓度的启动子其中有4个具有高响应能力P0728(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)、POYE2(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)、P1084(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)以及P0139(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)。其与RP基因mCherry和终止子TAOX1组成的表达盒可以将檀香醇浓度转换为红色荧光强度，起到檀香醇浓度传感的作用。在此基础上，使用易错PCR技术对檀香醇合成关键酶基因CYP736A167进行突变，构建突变文库，转入传感器菌株，孵育6h后，取适量孵育液均匀涂布在抗性平板上，随机挑取转化子使用96孔板发酵培养，初步利用酶标仪分析荧光表达强度，并将高荧光强度的菌株转接至24孔板进行发酵培养，GC-MS定量檀香醇，最终获得檀香醇高产菌株。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
(1)本发明首次筛选到4个檀香醇响应的启动子，以之构建红色有荧光蛋白表达盒，建立了一定范围内檀香醇浓度与红色荧光蛋白强度的正相关关系，首次建立檀香醇生物传感器，打破了该领域的技术壁垒。(2)本发明构建的檀香醇生物传感器为产物响应型生物传感器，鲜有报道，该生物传感器用于檀香醇高产菌株的筛选，解决了檀香醇本身无色，缺少显色反应，仅能通过质谱分析定量的技术难题。(3)本发明所构建的檀香醇生物传感器核酸结构式为P-RP-T，其中的RP可以用抗生素抗性基因代替，以建立檀香醇与抗生素浓度的正相关关系，扩展其应用前景。
附图说明
图1为一种檀香醇生物传感器的总设计图。
图2为Int1-sgRNA20-mCherry质粒图谱。
图3为檀香醇响应启动子底盘构建示意图。
图4为檀香醇响应启动子表征结果图。
图5为檀香醇传感器响应曲线图。
图6为檀香醇传感器体内效果测试结果图。
图7为CYP736A167突变体檀香醇产量图。
图8为檀香醇的GC-MS检测质谱图。
具体实施方式
一种檀香醇生物传感器的总设计图如图1所示，檀香醇生物传感器表征的关键质粒示意图如图2所示，制备方法及应用详见实施例。
实施例1：檀香烯平台菌株的构建
檀香烯合成生物底盘构建已经公开(申请号：CN202210093958.4)，即为专利文献的实施例4中构建的多拷贝檀香烯毕赤酵母重组菌株Pa-4，本发明所述Int均指的是毕赤酵母GS115基因组插入位点，所使用的Int-pTEF-tAOX1、Int-pGAP-tAOX1、HZP-sgRNA、HHP-sgRNA和HGP-sgRNA等辅助质粒信息与下文所述Int1、Irnt2、Irnt6、Int16、Irnt20、Im33的位点信息及所用donor和sgRNA引物序列信息均与申请号CN202210093958.4的专利文献中的一致。在Pa-4菌株基础上基因组导入SaCPR2基因所得STOsensor-0菌株即为檀香烯平台菌株。
(1)SaCPR2重组表达载体的构建
SaCPR2的编码基因(序列如SEQ ID NO.7所示)由金斯瑞生物科技有限公司合成，以其为模板，设计引物SaCPR2-F/SaCPR2-R扩增目的基因SaCPR2，利用无缝克隆方法将其与AatII酶切后的载体Int52-pTEF-tAOX1进行组装，转化到大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int52-pTEF-SaCPR2-tAOX1。
所用引物序列如下：SaCPR2-F：acattttagttattcgccaacatgcaattatcctccgttaaattaattc；
SaCPR2-R：CATCCTCTTGATTAGAATCTAGttaccaaacatccctcaaatatctacc。
(2)向导RNA重组表达载体HZP-sgRNA-Int52的构建
以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物Int52-sgRNA-F和Int52-sgRNA-R，利用载体HZP-sgRNA中酶切位点BsaI引入Int52-sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HZP-sgRNA-Int52(Int52：左侧基因PAS_chr2-1_0661，右侧基因PAS_chr2-1_0662)。所用引物序列如下：Int52-sgRNA-F：tgtggcgcgacacgatctagacag；
Int52-sgRNA-R：AAACctgtctagatcgtgtcgcgc。
(3)STOsensor-0菌株的构建
以重组载体Int52-pTEF-SaCPR2-tAOX1为模板设计引物Int52-donor-F和Int52-donor-R，进行PCR得到对应的线性化的片段Int52-donor，将其和对应的重组guide质粒HZP-sgRNA-Int52同时转化进入毕赤酵母细胞Pa-4菌株获得重组菌株STOsensor-0。同时传代几次丢掉抗性质粒。所用引物序列如下：Int52-donor-F：tctcatgtacctccatcagaatagc；Int52-donor-R：gtgagtgatatcacggacagtcaag。
实施例2：檀香醇响应启动子的挖掘与表征
在毕赤酵母GS115菌株基础上，以是否外源添加檀香醇标准品(购自默克公司)为区分条件进行真核有参转录组分析，该项目由上海美吉生物医药科技有限公司完成。分析两组差异表达量FC值大于10的启动子(表1)，并将它们在毕赤酵母基因组中进行定位标记。首先构建GS115-Cas9-mCherry菌株，将系列启动子转入该菌株后进行荧光强度测试，筛选高差异倍数的启动子作为候选。
(1)GS115-Cas9-mCherry菌株的构建
以GS115-Cas9菌株(由毕赤酵母GS115菌株基因组引入Cas9蛋白编码基因得到)出发，在该菌株基因组中mCherry前端预留20bp sgRNA-Int20+NGG序列。设计整合引物mCherry-F/mCherry-R扩增目的条带agaagaaaatgcgaaacaggNGG-mCherry，按照实施例1所述方法构建Int1-agaagaaaatgcgaaacaggNGG-mCherry-tAOX1、HZP-sgRNA-Int1、HGP-sgRNA-Int20质粒(tAOX1核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)，聚合酶链式反应扩增批量启动子后(菌株构建所用启动子信息及所用引物序列如表1所示)，将agaagaaaatgcgaaacaggNGG-mCherry-tAOX1整合至基因组Int1位点；将系列启动子整合至基因组Int20位点。构建示意图如图3所示。
表1启动子信息及引物序列表
(2)启动子荧光表征
将各启动子整合菌株阳性转化子接种至24孔板(液体YPD培养基，装液量3mL)30℃恒温培养12h，后以10％的接种量转接至新的24孔板中进行培养，分为两组，一组作为对照，一组外源添加终浓度为200mg/L的檀香醇标准品，温度30℃，摇床转速800rpm培养36h后酶标仪测定两组报告基因强度值。结果如图4所示，表征的大多数启动子对檀香醇有不同程度的响应，其中筛选到4个有较大荧光强度差异值的檀香醇响应启动子P6(P0728)、P11(POYE2)、P2(P1084)和P8(P0225)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
实施例3：檀香醇生物传感器响应曲线建立
以STOsensor-6菌株为例，配置不同浓度檀香醇标准品进行体外添加檀香醇响应实验，建立响应曲线，具体实施如下：
STOsensor-6为实验菌株，挑取单菌落于YPD培养基，30℃过夜培养。以10％的接种量转接至新鲜的YPD培养基，30℃摇瓶培养至对数期，分别添加0mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L和300mg/L檀香醇，继续培养至36h，取200μL培养基转移至96孔板，稀释一定倍数，利用酶标仪进行荧光与OD600检测。以二者比值定义荧光强度建立生物传感器的响应曲线(图5)。结果显示，生物传感器对檀香醇有较好的荧光应答，应答范围约为3倍。
实施例4：檀香醇生物传感器体内功能测试
构建不同檀香醇产量的sensor菌株STOsensor-A～C，进行生物传感器的体内响应测试，具体实施如下：
如实施例1所述SaCPR2重组表达载体的构建方法，构建3个CYP736A167基重组表达质粒：Int2-pTEF-CYP736A167-tAOX1、Int12-pTEF-CYP736A167-tAOX1和Int6-pTEF-CYP736A167-tAOX1。CYP736A167基因序列如SEQ ID NO.9所示。使用Int2位点整合pTEF-CYP736A167-tAOX1表达盒至STOsensor-0菌株基因组得到STO-A；使用Int12位点整合pTEF-CYP736A4167-tAOX1表达盒至STO-A菌株基因组得到STO-B菌株；使用Int6位点整合pTEF-CYP736A4167-tAOX1表达盒至STO-B菌株基因组得到STO-C菌株，即得到含有不同CYP736A167基因拷贝数的不同檀香醇产量菌株STO-A～C。
在STO-A～C基础上使用Int33位点分别整合P6-mCherry-tAOX1表达盒，使用引物序列如下：Int33-sensor-F：actaacccacattttcctcctagcacgtgaatcttttaaatgcaatcgcgtaccagccc，Int33-sensor-R：taatctaactagtttgccgcgaccaccatacaatatttaTCTCACTTAATCTTCTGTAC。
得到菌株STOsensor-A～C，挑取单菌落于YPD培养基，30℃过夜培养。以10％的接种量转接至新鲜的YPD培养基，30℃摇瓶培养36h，取200μL培养基转移至96孔板，稀释一定倍数，利用酶标仪进行荧光与OD600检测。同时分别取1mL发酵液进行样品制备，GC-MS分析檀香醇产量(图6)。结合实施例3分析，该生物传感器的体内体外实验均表现出较好的檀香醇应答正相关性，说明该生物传感器可用于构建檀香醇高产菌株的筛选方法。
实施例5：檀香醇生物传感器的应用
在上述实施例1-4的基础上构建檀香醇菌株的筛选方法，具体实施如下：
(1)CYP736A167突变文库的构建
体外易错PCR构建P450酶基因(序列如SEQ ID NO.9所示)突变文库，使用试剂为全式金DNA聚合酶，使用引物序列如下，
EP-P167-F：tcttttattctcactacatacattttagttattcgccaacATGAGCCCTGCTACAGCAG，
EP-P167-R：CTGCATCTCTCAGGCAAATGGCATTCTGACATCCTCTTGATCAGGACTCCAACCGGTAC；使用的易错PCR体系如表2所示。
表2易错PCR体系
(2)CYP736A167突变菌株的制备
在STOsensor-0菌株基础上按照实施例2所述方法构建并整合pTEF-agaagaaaatgcgaaacaggNGG-tA OXl序列(其中pTEF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)以获得STOsensor-0-PT菌株，使用位点为Int1，所用donor与sgRNA引物同实施例2所述。接着将步骤(1)中所制备的P450突变文库电转化至STOsensor-0-PT菌株的Int20位点得到P450突变体库STOsensor-muts。
(3)酶标仪分析
将步骤(2)所述P450突变体库孵育6h后均匀涂布至含有博来霉素抗性的YPD固体培养基，继续培养至单菌落，随机挑取约1000个转化子进行96孔板YPD培养，保证各菌株接种初始OD一致，培养一定时间后统一使用酶标仪测定红色荧光强度，酶标仪检测的激发波长/发射波长分别为575nm/612nm。根据分析结果挑选批量高荧光强度值的菌株进行24孔板发酵，3天后GC-MS定量突变体檀香醇产量。
(4)重组菌株的培养
挑取STOsensor-muts单菌落，分别接种于5mL YPD(葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L)试管中培养，30℃，250rpm培养12h，然后以1％接种量分别接种到装液量3mL的YPD培养基的24孔板中，每个菌株三个平行，30℃，800rpm培养3天，每24h补加2％的葡萄糖。
(5)檀香醇的检测方法
样品处理：取发酵液1mL，加入等体积乙酸乙酯及适量氧化锆研磨珠进行细胞破碎处理30min，12000rpm离心1min，取上层有机相过0.22μm尼龙滤膜，后进行GC-MS检测。GC-MS检测条件：SIM，Agilent 7890A/5975C GC-MS，色谱柱：HP5(非极性，30m×0.25mm×0.25μm)。模式：脉冲无分流模，进样器温度250℃。氦气流速为0.8mL/min，脉冲压力设定为25psi，0.5min。
扫描范围：M/z 40-500；SIM：M/z 93、94、105、107、119、122和202(停留时间50ms)。HP5升温程序：40℃/min，3分钟；10℃/min至130℃，2℃/min至180℃，50℃/min至300℃；300℃，10分钟。
按照(4)中所述培养方法培养毕赤酵母工程菌株，采用(5)中所述检测方法测定檀香醇产量，检测质谱图如图8所示，高荧光强度突变体孔板产量如图7所示。最终筛选到3株较高檀香醇产量的工程菌株，分别为STOsensor-mut5、STOsensor-mut6和STOsensor-mut19(图7)。
Claims (10)
1.一种用于檀香醇生物传感器的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQID NO.1～4所示的任意一种。
2.一种檀香醇生物传感器，其特征在于，含有启动子P、报告基因RP和终止子T；所述启动子P调控报告基因的表达，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的任意一种。
3.根据权利要求2所述的檀香醇生物传感器，其特征在于，所述启动子P、报告基因RP和终止子T位于同一质粒或同一基因组DNA上。
4.根据权利要求2所述的檀香醇生物传感器，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白基因或抗生素抗性基因；
所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因；所述抗生素抗性基因为博来霉素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的檀香醇生物传感器，其特征在于，所述红色荧光蛋白基因mCherry的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求2所述的檀香醇生物传感器，其特征在于，终止子T核苷酸序列为SEQID NO.6所示。
7.与权利要求2～6任一所述檀香醇生物传感器相关的生物材料，其特征在于，包括如以下任一项：
(a)表达盒，含有权利要求2～6任一所述檀香醇生物传感器；
(b)重组载体，含有权利要求2～6任一所述檀香醇生物传感器或(a)中表达盒。
8.一种基因工程菌，包括宿主菌和导入宿主菌的权利要求7所述与檀香醇生物传感器相关的生物材料。
9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、东方伊萨酵母中的任意一种。
10.权利要求2～6任一所述檀香醇生物传感器在筛选檀香醇高产菌株中的应用。
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