WO2020076141A1 - 재조합 rsv 생백신주 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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김은솜
권태우
홍승혜
김훈
이수진
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Definitions

  • the present invention relates to a live RSV vaccine and a method for producing the same, and more particularly to a live recombinant RSV vaccine and a method for producing the same.
  • Respiratory Syncytial Virus is a virus that is prevalent worldwide and causes respiratory disease and is the leading cause of severe respiratory infection death in infants and young children. Infants and toddlers are the main targets, but it is known to cause respiratory diseases in patients with weakened immunity and respiratory diseases in the elderly. It is the second highest cause of respiratory disease following influenza, but the annual mortality rate from RSV per 100,000 people in infants under 1 year of age is about 1.3 to 2.5 times higher than influenza. According to a report from the WHO in 2002, 64 million people are infected with RSV each year, of which 160,000 die.
  • inactivated vaccine For the purpose of defending RSV disease, a vaccine using an inactivated virus (inactivated vaccine) was developed at first, but it is inactivated due to the occurrence of serious side effects (ERD (enhanced respiratory disease)), such as the disease pathology being more severely induced.
  • ERD enhanced respiratory disease
  • the use of chemical vaccines has become impossible. Therefore, the researchers tried to develop a vaccine that does not have ERD induction and has an excellent ability to induce neutralizing antibodies.
  • the live vaccine has the advantage of not inducing ERD and is capable of inducing neutralizing antibodies, but because RSV is very unstable, it is necessary to consider the stability and safety issues of the virus. When, there was a difficulty in developing the vaccine.
  • RSV belongs to the subfamily Orthopneumoviridae belonging to the Mononegavirales order, Pneumoviridae family.
  • RSV is a medium-sized virus of about 120-200nm. It has a surface structure composed of an envelope and three transmembrane proteins (F, G glycoproteins and SH protein), and a linear negative strand RNA composed of about 15,000 nucleotides is genome ( genome).
  • RSV is divided into serotypes A and B by G protein.
  • the RSV genome encodes 11 proteins, and is composed of parts encoding Structural and Non-structural proteins.
  • Non-structural proteins are Nonstructural (NS) 1 and Nonstructural (NS) 2, and are antagonists of type I interferon, acting on mechanisms to avoid immune responses.
  • fusion (F) protein, glyco (G) protein, and small hydrophobic (SH) protein are sugar proteins that form the surface of the virus, and nucleocapsid (N) protein, phosphoprotein (P), matrix (M) protein, and viral Polymerase (L), etc. constitutes the inside of a virus or plays an important role in virus replication.
  • RSV F protein is an important component of the early entry of the virus entry and fusion with the cell membrane.
  • the F protein antigen is a stabilized form of a pre-fusion type protein, and is difficult to produce and purify, and there is a problem that it is difficult to secure stability, and maintenance of efficacy is not easy.
  • the inventors of the present invention seek to solve the instability of the F protein and develop a new safe form of RSV live vaccine.
  • the present invention is intended to develop a live RSV vaccine strain having excellent stability by substituting or inserting a heterogeneous F protein with high stability.
  • the present invention is intended to develop a live RSV vaccine strain having excellent safety (attenuated) by substitution or insertion with a heterogeneous F protein having high stability.
  • the present invention seeks to develop a new recombinant RSV.
  • the present invention is to provide a novel form of RSV vaccine capable of inducing a defense mechanism against RSV.
  • the present invention is to provide a new type of vaccine that is capable of effective immune system operation by suppressing the immune escaping mechanism by not producing secreted G due to the G protein mutation of RSV.
  • the present invention seeks to produce a bivalent vaccine by insertion or replacement of heterologous F proteins.
  • One embodiment of the present invention provides a genetically recombined respiratory syncytial virus (RSV).
  • RSV respiratory syncytial virus
  • Genes encoding RSV envelope proteins are rearranged to provide a recombinant respiratory syncytial virus (RSV). That is, it provides a recombinant RSV virus in which an external gene is inserted into the RSV gene.
  • an F protein derived from a virus other than RSV is inserted between a glycoprotein (G protein) of RSV and a gene encoding a fusion protein (F protein), or substituted for F protein of RSV.
  • G protein glycoprotein
  • F protein fusion protein
  • a gene encoding an F protein derived from a heterologous virus of the Paramyxoviridae or Pneumoviridae family is inserted, or a gene encoding an F protein of RSV, or a gene encoding an F protein derived from a heterologous virus from the Paramyxoviridae or Pneumoviridae virus family It can be substituted with.
  • the Paramyxoviridae may be any one or more selected from the group consisting of virus genus Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, and Orthopneumovirus, preferably It may be any one or more selected from the group consisting of Measles virus, and Newcastle disease virus.
  • the gene-recombinant respiratory syncytial virus is a gene encoding the envelope protein of the RSV A virus line as an RSV recombinant backbone having SEQ ID NO: 3 based on the human RSV A virus line of SEQ ID NO: 1 ( G protein and F protein expression domain) may be a rearranged recombinant RSV. Preferably it has a cDNA sequence of SEQ ID NO: 4-7. The sequence in which the restriction enzyme sequence was added to the anti-genome of RSV was shown in SEQ ID NO: 2.
  • Another embodiment of the present invention provides a method of preparing an attenuated recombinant RSV comprising an expression vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant RSV antigenomic.
  • a first expression vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant RSV antigenome;
  • N, P, L, and a second expression vector comprising a polynucleotide encoding any one or more proteins selected from the group consisting of M2-1 proteins to produce recombinant RSV.
  • the polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome includes a polynucleotide encoding all or part of a domain of a protein derived from a heterologous virus.
  • the polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome included in the first expression vector may be any one selected from SEQ ID NOs: 4 to 7. Any one of the polynucleotides selected from SEQ ID NOs: 4 to 7 may be cDNA.
  • the first expression vector may include a polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome in the pCC1 plasmid.
  • the expression vector includes a gene that encodes a glycoprotein (G protein) and a fusion protein (F protein) of RSV, but F derived from a heterologous virus of the Paramyxoviridae or Pneumoviridae virus between the G protein and the gene encoding the F protein
  • G protein glycoprotein
  • F protein fusion protein
  • a gene encoding a protein may be inserted, or a recombinant RSV gene substituted with a gene encoding an F protein derived from a paramyxoviridae or a heterologous virus from the family Pneumoviridae instead of a gene encoding RSV fusion protein (F protein) may be included.
  • the recombinant RSV gene may be any one selected from SEQ ID NOs: 4 to 7.
  • the recombinant RSV expression vector includes a T7 promoter, a hammerhead ribosome, a recombinant RSV gene, and a hepatitis delta virus ribosome; And T7 terminators in order.
  • the Paramyxoviridae may be any one or more selected from the group consisting of virus genus Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, and Orthopneumovirus, preferably It may be any one or more selected from the group consisting of Measles virus, and Newcastle disease virus.
  • Another embodiment of the present invention provides an attenuated RSV live vaccine composition comprising a genetic recombinant respiratory syncytial virus (RSV) and a pharmaceutically acceptable carrier according to one embodiment of the present invention.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • a pharmaceutically acceptable carrier according to one embodiment of the present invention.
  • a method for preventing respiratory syncytial virus (RSV) infection by administering the live vaccine composition to the human body.
  • the present invention provides a live RSV virus strain, and is a recombinant respiratory syncytial virus (RSV) in which a polynucleotide encoding all or part of a domain of F protein derived from a heterologous virus is inserted into the RSV genome, wherein the polynucleotide is i) It is inserted in place of the polynucleotide encoding some domains of the RSV F protein, or ii) into any part of the polynucleotides that make up the RSV gene.
  • the recombinant RSV of the present invention can be used as an RSV vaccine strain, has excellent stability, and can be used as a vaccine because it is safe.
  • the present invention is to provide a new type of RSV live vaccine in which a gene encoding the F protein of RSV is replaced with an F protein coding gene of a heterologous virus or an F protein coding gene of a heterologous virus is additionally introduced.
  • Recombinant may refer to a case in which cells having different genetic traits coexist in one organism.
  • “recombined” as used herein is different based on one genetic backbone. It means the case where a new genetic variation occurs because the genetic information (nucleic acid) of the individual is inserted.
  • Recombinant RSV refers to an RSV or RSV-like virus that is directly or indirectly derived from a recombinant expression system, or is propagated from a virus or subviral particle produced therefrom.
  • the recombinant expression system includes a recombinant expression vector, which comprises a functionally linked transcription unit, comprising at least one genetic element or combination of components that has regulatory functions in the expression of the RSV gene. Examples of elements are a promoter, a structure or coding sequence transcribed into RSV mRNA, an appropriate transcription initiation and termination sequence.
  • genome is the total sequencing of an individual's gene, and refers to a collection of all genetic information in an organism.
  • the genome of a virus is used to mean all the genetic information sequences of the whole virus.
  • a “gene” may be understood as a portion encoding a protein, and may be DNA or RNA.
  • introduction means that a new one is added from the original one, and mutation of a gene may be caused by introduction, and deletion, substitution, or insertion may occur.
  • a new gene has been introduced into a genome may mean that a part of the entire gene sequence of an original individual may be substituted or inserted into a gene derived from a new individual. Due to this introduction, the genome sequence of the original individual (eg, backbone) may be longer, shorter, or longer.
  • vaccine strain is also called a vaccine strain, and refers to a population of viruses isolated for use as a vaccine.
  • Attenuated live vaccine is a vaccine made from attenuated respiratory syncytial virus (RSV), a toxic agent that is attenuated enough to not cause disease in the host, although the pathogen is still biologically active. It means a vaccine having.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • anti-genome refers to a complementary (+) sense polynucleotide molecule that serves as a template for the synthesis of the progeny RSV genome.
  • Natural RSV generally contains a (-) sense polynucleotide molecule, which codes for a viral protein, eg, glycoprotein (G), fusion (F), N, P, etc., via complementary viral mRNA.
  • An attenuated RSV vaccine can be prepared by recombination of the cDNA encoding the RSV genome or antigenome.
  • a gene encoding a protein or “a protein coding gene” means a gene that produces a protein.
  • One embodiment of the present invention provides a live RSV vaccine strain having excellent stability and safety by inserting the F protein of a heterologous virus based on the RSV genome or substituting the F protein of the RSV and the F protein of the heterologous virus.
  • One embodiment of the present invention provides a recombinant respiratory syncytial virus (RSV) vaccine strain in which a polynucleotide encoding a partial domain of an F protein derived from a heterologous virus is inserted into the RSV genome.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • i) can be inserted in place of a polynucleotide encoding some domain of the RSV F protein, or ii) between a RSV F protein and a polynucleotide encoding the G protein domain.
  • FIG. 2 is a diagram for showing a form in which polynucleotides encoding some domains of F protein of RSV are substituted with some domains of F protein derived from a foreign virus.
  • FIG. 3 is a diagram for showing the form in which some domains of F proteins derived from a foreign virus are inserted while maintaining the polynucleotide encoding the F protein of RSV.
  • the heterologous virus may be substituted with a gene encoding an F protein derived from a heterologous virus of the Paramyxoviridae or Pneumoviridae family.
  • the Paramyxoviridae, or the Pneumoviridae family of viruses may be any one or more selected from the group consisting of virus genus Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, and Orthopneumovirus, preferably It may be any one or more selected from the group consisting of Measles virus, and Newcastle disease virus.
  • the measles virus and Newcastle disease virus can increase the stability of the virus and the safety of the live vaccine virus strain.
  • the RSV virus genome underlying the present invention can use the wild type human RSV A virus strain of SEQ ID NO: 1.
  • RSV virus strains such as RSV A strain, RSV B strain, HRSV A strain, HRSV B strain, BRSV strain, avian RSV strain, etc., but for the purposes of the present invention, RSV A virus strain may be preferred as the RSV basic backbone into which foreign genes are inserted. have. When a foreign gene is introduced using the RSV A virus strain, stability and safety of the recombinant virus produced are excellent, and a mutation rate may be small.
  • One embodiment of the present invention is a first expression vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant RSV antigenome containing a polynucleotide encoding a partial domain of a F protein derived from a heterologous virus, and
  • a method of producing an attenuated RSV vaccine strain that produces recombinant RSV by expressing a second expression vector comprising a polynucleotide encoding any one or more proteins selected from the group consisting of N, P, L, and M2-1 proteins
  • pCC1, pBR322, pUC, and pcDNA3.1 may be used, but when considering size or prevention of cytotoxicity during cloning, pCC1 may be preferably used for this purpose.
  • the second expression vector may be a pCI neo vector, but is not limited thereto.
  • RSV is a negative sense RNA virus.
  • a separate helper gene required for gene synthesis is required.
  • Recombined RSV antigenome and polynucleotides encoding respective N, P, L, and M2-1 proteins are introduced into cells by methods such as transfection, electroporation, mechanical insertion, and transduction can do.
  • Virus infection may occur in cells such as Vero cell, Hep 2 cell, MRC 5 cell, etc., and production of the recombinant RSV virus strain of the present invention in Vero cell may be advantageous.
  • RSV antigenomic RNA may be synthesized by extracellular transfection of cells expressing RSV protein.
  • the polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome may be included in the first expression vector, the helper gene may be included in a vector different from the first expression vector (second expression vector), or may be included in the same vector.
  • the polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome included in the first expression vector may include any polynucleotide selected from SEQ ID NOs: 4 to 7, and any one polynucleotide selected from SEQ ID NOs: 4 to 7 may be cDNA. You can.
  • the first expression vector may include a polynucleotide encoding the recombinant RSV antigenome in the pCC1 plasmid, and for the purpose of facilitating the combination, induce mutation, modify the restriction enzyme site, or regulate the restriction enzyme site.
  • the vector may be modified by inserting a synthesized polylinker containing.
  • the pCC1 plasmid of the present invention can stabilize the recombinant RSV antigenome.
  • the first expression vector comprising the recombinant RSV antigenomic comprises a T7 promoter, a hammerhead ribozyme, an RSV antigenomic, a hepatitis delta virus ribozyme, and a T7 terminator. It may be an expression vector containing the polynucleotide cDNA.
  • the RSV antigenome includes F proteins of Measles virus, Newcastle disease virus, and parainfluenza virus (PIV), wherein the transmembrane (TM) and cytoplasmic tail of CT protein (CT) )
  • TM transmembrane
  • CT cytoplasmic tail of CT protein
  • the polynucleotide encoding the domain may be derived from RSV, but may also be derived from the virus.
  • One embodiment of the present invention provides an attenuated RSV vaccine strain prepared according to the above method.
  • One embodiment of the invention RSV virus strain of the present application; And it provides a live RSV vaccine comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Recombinant RSV vaccine strain produced by one embodiment of the present invention when used for vaccine use, the virus prepared according to the present invention can be used directly as a vaccine preparation, lyophilized, or mixed with a liquid. .
  • the vaccine composition of the present invention includes any pharmaceutical substance that does not itself induce an immune response detrimental to the vertebrate receiving the composition, and any suitable diluent or excipient that can be administered without excessive toxicity with a recombinant RSV vaccine strain It includes a pharmaceutically acceptable carrier comprising a.
  • pharmaceutically acceptable means listed in the United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, or vertebrate and other specifically recognized pharmacopoeia for use in humans.
  • the RSV F antigen of the present invention is administered in an effective amount or amount (defined above) sufficient to stimulate an immune response against one or more strains of RSV virus.
  • Such compositions can be used as vaccines and / or immunogenic compositions to induce protective immune responses in vertebrates.
  • the concentration of the recombinant RSV antigen included in the vaccine is at least about 10 ⁇ g / mL, about 20 ⁇ g / mL, about 30 ⁇ g / mL, about 40 ⁇ g / mL, about 50 ⁇ g / mL, About 60 ⁇ g / mL, about 100 ⁇ g / mL, about 200 ⁇ g / mL, or about 500 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the immunogen is about 10 ⁇ g / mL to about 1 mg / mL, or about 20 ⁇ g / mL to about 500 ⁇ g / mL, or about 30 ⁇ g / mL to about 100 ⁇ g / mL or about 30 ⁇ g / mL To about 50 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the immunogen may be included from 10 ⁇ g / mL to 200 ⁇ g / mL.
  • the vaccine or immunogen composition of the present invention can be administered to animals to induce an immune response against RSV.
  • the animal is a human.
  • the dosage can be adjusted within this range based on, for example, age, physical condition, weight, age, food, time of administration, and other clinical factors.
  • the present invention includes a method of formulating a vaccine or immunogen composition that induces substantial immunity to a subject's infection or at least one symptom thereof, including adding an effective amount of an immunogen to the agent. Stimulation of substantial immunity by a single dose is preferred, but to achieve the desired effect, additional doses may be administered via the same or different routes. In newborns and infants, multiple administrations may be necessary, for example, to induce sufficient levels of immunity.
  • a method of inducing substantial immunity against a viral infection or at least one symptom thereof in a subject comprises administering at least one effective amount of an RSV recombinant F protein or fragment or aggregate thereof.
  • Methods for administering vaccines and / or immunogen agents include parenteral administration (e.g., endothelial, intramuscular, intravenous and subcutaneous), epidural and mucosal (e.g., nasal and oral or pulmonary routes or suppositories), It is not limited to this.
  • the composition is administered intramuscularly, intravenously, subcutaneously, orally or intradermally.
  • the composition is, for example, by injection or temporary injection, absorption through the epithelium or mucous membrane (e.g., oral mucosa, colon, conjunctiva, nasopharynx, central pharynx, vagina, urinary tract, bladder, intestinal mucosa, etc.) It can be administered by any convenient route and can be administered with other biologically active substances. Administration can be systemic or local.
  • Prophylactic vaccine formulations are administered systemically by subcutaneous or intramuscular injection using needles and injections or by needle-free injection devices.
  • the vaccine formulation is administered intranasally by droplet into the upper respiratory tract, large particle aerosol (greater than about 10 microns) or spray.
  • the vaccine and / or immunogenic agent can be administered in a manner that targets mucosal tissue to elicit an immune response at the site of immunization.
  • the site of administration is not limited.
  • One embodiment of the present invention provides a method for preventing respiratory syncytial virus (RSV) infection by administering the RSV vaccine strain of the present invention to the human body.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • the present invention provides a live RSV vaccine strain having excellent stability by substituting or inserting a heterogeneous F protein with high stability.
  • a new recombinant RSV virus strain having an antibody production rate similar to that of wild-type RSV is provided while eliminating the instability and instability of the live vaccine.
  • the present invention provides a live RSV vaccine strain having excellent safety (attenuated) by substitution or insertion with a heterogeneous F protein having high stability.
  • the present invention provides a new type of RSV vaccine capable of inducing a defense mechanism against RSV.
  • the present invention provides a new type of vaccine that does not produce secreted G due to the G protein mutation of RSV, and thus suppresses the immune escaping mechanism to enable effective immune system operation.
  • the present invention can produce a bivalent vaccine by insertion or replacement of a heterologous F protein.
  • the present invention provides a new recombinant RSV.
  • 1 is a schematic diagram of RSV Genome.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the form of cutting the F protein site in the RSV genome (arrows indicate the cleavage site) and substituting the form of the F protein of a heterologous virus (eg, NDV).
  • a heterologous virus eg, NDV
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the form of adding F protein of a heterologous virus (eg, MV) between G protein and F protein in the RSV genome.
  • MV heterologous virus
  • Figure 4 shows a picture of inserting F protein derived from an external virus by cutting the MluI and ApaI sites in the backbone of SEQ ID NO: 3.
  • G GE represents the G protein gene end region
  • F GS represents the F protein gene starting region
  • F GE represents the F protein gene end region.
  • the F protein of MV or NDV is inserted, but the T and C domains of F protein are those of RSV.
  • Figure 5 shows the illustration of inserting F protein derived from an external virus by cutting the MluI and MluI sites in the backbone of SEQ ID NO: 3.
  • the MluI and MluI cleavage sites are located between RS G protein and F protein.
  • G GE represents the G protein gene end region
  • F GS represents the F protein gene starting region
  • F GE represents the F protein gene end region.
  • the F protein of MV or NDVF is inserted, but the T and C domains of the added F protein are those of RSV.
  • Figure 6 shows a schematic diagram of cloning the cDNA of the recombinant RSV virus of the present invention into a vector.
  • FIG. 7 is a result showing attenuation through comparison of proliferation rate and proliferation titer for each cell (HEp2 cell, Vero cell, MRC5 cell) of recombinant RSV. Vaccine growth rate and titer were reduced compared to wild type RSV.
  • FIG. 8 is a result showing the attenuation through the comparison of the growth rate and the growth titer in mice of recombinant RSV. Vaccine growth rate and titer were reduced compared to wild type RSV.
  • Figure 10 shows the results of the mouse immune test of recombinant RSV, the results confirming the total antibody titer and neutralizing antibody titer. Sufficient antigen specific and neutralizing antibodies were induced in all groups except Mock. However, G7, a wild type virus fluorinated with formalin, showed relatively low total and neutralizing antibody prices.
  • RSV backbone is wtRSVA_TH10654
  • RSV backbone- MV F substitution is cRSVA_MVF_S,
  • RSV backbone- NDV F substitution is cRSVA_NDVF_S,
  • RSV backbone- MV F insertion is cRSVA_MVF_A
  • RSV backbone- NDV F insertion was indicated by cRSVA_NDVF_A.
  • the mock of FIG. 10 is shown as G1, WtRSVA as G2, cRSVA_MVF_S as G3, cRSVA_NDVF_S as G4, cRSVA_MVF_A as G5, cRSVA_NDVF_A as G6, and FIwtRSVA as G7.
  • Figure 12 shows the results of the NDV immunogenicity test and neutralizing antibody
  • the mocks of FIGS. 12 and 13 are G1, WtRSVA is G2, cRSVA_MVF_S is G3, cRSVA_NDVF_S is G4, cRSVA_MVF_A is G5, cRSVA_NDVF_A is G6, and FIwtRSVA is G7.
  • a wild type RSV A virus strain having the following information was prepared as follows.
  • Measles virus (MV) and Newcastle disease virus (NDV) were selected as F protein donor.
  • the polynucleotide encoding the F protein of the RSV anti-genome was prepared by substituting or inserting the polynucleotide of the F protein derived from a heterologous virus.
  • the genetic sequence is T7 promoter-hammerhead ribozyme-RSV anti-genome-hepatitis delta virus ribozyme-T7 terminator.
  • T7 promoter sequence (TAATACGACTCACTATAGG) was inserted at the 5 ⁇ end.
  • the hammerhead ribozyme sequence (T TTTTTCGCGT CTGATGAGGC CGTTAGGCCG AAACTCCTCT CCGGAGTC) was inserted following the T7 promotor sequence.
  • the hammerhead ribozyme sequence was followed by a wild-type RSV anti-genome sequence and the following mutations were applied.
  • GCGCGCC is inserted between 77nt and 78nt to generate AscI restriction enzyme sequence.
  • AscI restriction enzyme sequence is GGCGCGCC ⁇ 8 bp>, but since the sequence of 77nt is G, only GCGCGCC ⁇ 7 bp> was inserted.
  • Hepatitis delta virus ribozyme sequence followed by T7 terminator sequence (TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG) is inserted.
  • the designed gene (SEQ ID NO: 3) was cloned into a pCC1 vector after in vitro synthesis.
  • the F protein gene sequence was removed and the corresponding measles virus F gene sequence was inserted.
  • the anti-genome information of the Measles virus Edmonston strain (Moraten vaccine) (Accession No .; AF266287.1) was used.
  • the F protein gene corresponds to 5449 to 7110 sequences, and 5449 to 6939 sequences except for the transmembrane region and cytoplasmic tail region sequences were used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the UTR sequence of the F protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the backbone construct A was cut with MluI and ApaI restriction enzymes, and the designed measles virus F gene was inserted.
  • the F protein gene sequence was removed and the corresponding Newcastle disease virus F gene sequence was inserted.
  • the anti-genome information of Newcastle disease virus I-2 strain (Accession No .; AY935499) was used.
  • the F protein gene corresponds to 4544 to 6205 sequences, and 4544 to 6043 sequences except for the transmembrane region and cytoplasmic tail region sequences were used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the UTR sequence of the F protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • Backbone construct A was cut with MluI and ApaI restriction enzymes, and the designed Newcastle disease virus F gene was inserted.
  • the constructs B and C recognize the restriction enzymes MluI / ApaI, insert amplified with Primer 1-Primer 2, and Primer 1 (forward) is 5 'ATAT ACGCGT gtattgttgcaaaagccatg, Primer 2 (reverse) Is 5 'ATAT GGGCCC tgttttatataactataaaatagaa.
  • the measles virus F gene sequence was inserted between the G protein and F protein genes.
  • the F protein gene corresponds to 5449 to 7110 sequences, and 5449 to 6939 sequences except for the transmembrane region and cytoplasmic tail region sequences were used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the 5 ⁇ UTR the 5 ⁇ UTR sequence of the F protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • 3 ⁇ UTR the 3 ⁇ UTR sequence of the G protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the backbone construct A is cut with MluI restriction enzyme and the designed measles virus F gene is inserted.
  • Newcastle disease virus F gene sequence was inserted between the G protein and the F protein gene.
  • the F protein gene corresponds to 4544 to 6205 sequences, and 4544 to 6043 sequences except for the transmembrane region and cytoplasmic tail region sequences were used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the sequence of wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the 5 ⁇ UTR the 5 ⁇ UTR sequence of the F protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • 3 ⁇ UTR the 3 ⁇ UTR sequence of the G protein gene of wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 was used.
  • the Backbone construct A was cut with MluI restriction enzyme and the designed Newcastle disease virus F gene was inserted.
  • a heterologous viral gene is inserted into a site recognized by the restriction enzyme MluI, and insert amplification is performed with Primer 1-Primer 3.
  • Primer 1 forward
  • Primer 3 reverse
  • RSV is a negative sense RNA virus that uses reverse genetics to insert helper genes (N, P, L, and M2-1 protein coding genes of RSV) necessary for gene synthesis when producing viruses in vitro.
  • the N protein gene is cloned using the restriction enzymes XhoI and MluI into the pCI neo vector, sequences 1119 to 2294 of the wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome.
  • the P protein gene is cloned from the wild type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome from 2326 to 3051 sequences using restriction enzymes XhoI and MluI in pCI neo vector.
  • the M2-1 protein gene is cloned into the pCI neo vector using the restriction enzymes XhoI and MluI with the sequences 7647 to 8231 of the wild-type human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome.
  • the N protein gene is shown in SEQ ID NO: 8, the P protein gene in SEQ ID NO: 9, the M2-1 protein gene in SEQ ID NO: 10, and the L protein gene in SEQ ID NO: 11.
  • BHK cells were prepared in a 6-well plate at a concentration of 4 x 10 5 cells / well.
  • T7 polymerase expression vector 2 ug of T7 polymerase expression vector, 2 ug of RSV full length anti-genome vector, 4 kinds of helper gene vector (N, P, M2-1, L) 6 plasmids of 1 ug each were mixed with 10 ul of lipofectamine3000 at the same time and 10 After reacting for a minute, it was transfected into BHK cells. Drop the droplets so that they can be uniformly applied to the cells and shake them 2-3 times to mix well.
  • helper gene vector N, P, M2-1, L
  • viruses Five viruses were infected with 0.1 MOI in Vero cell, HEp2 cell, and MRC-5 and cultured for 9 days. Virus cultures were collected every 1 day and virus titer was analyzed using q-PCR.
  • the vaccine strain which is a mutant virus, was attenuated by decreasing the growth rate and the growth titer compared to the wild-type virus. It can be seen that the recombined viruses can be used as live vaccines. DPI means days post infection.
  • viruses Five viruses were administered by concentration of 10 1 to 10 7 pfu / mouse through IN route of BALB / c mice. It was confirmed that viremia was attenuated by detecting q-PCR in blood on day 1-7.
  • FIG. 8 As can be seen in Figure 8, it can be seen that the attenuated in vivo after inoculation compared to the wild-type RSV A virus, through which it was confirmed that the recombinant RSV can be used as a new virus strain.
  • Mock, wtRSVA, cRSVA_MVF_S, cRSVA_NDVF_S, cRSVA_MVF_A, and cRSVA_NDVF_A were immunized twice in mouse IM at a concentration of 1x10 5 pfu / mouse. After 2 weeks, the serum of each mouse was separated, and the total antibody value was measured by ELISA and the neutralizing antibody was measured by plaque reduction neutralization test. The results are shown in FIG. 10. It was confirmed that in all groups except Mock, antibodies specific for RSV antigen and neutralizing virus infection were sufficiently formed.
  • Mock is G1
  • WtRSVA is G2
  • cRSVA_MVF_S is G3
  • cRSVA_NDVF_S is G4
  • cRSVA_MVF_A is G5
  • cRSVA_NDVF_A is G6, and FIwtRSVA is G7.
  • mice Five viruses were inoculated twice into the IM of mice at a concentration of 10 5 pfu / mouse every two weeks. Two weeks after immunization, wild-type RSV was challenged to the mouse nasal cavity at a concentration of 2x10 6 pfu / mouse. On day 1-12, viremia was detected in blood through q-PCR, and body weight change was measured. The results are shown in FIG. 11. It was found that all immune groups effectively inhibited viral infection. In particular, it was found that the infection was suppressed at a level similar to that of the wild-type virus strain, and that the degree of viral infection in blood was significantly less than that of the inactivated strain.
  • the total antibody value and neutralizing antibody value for NDV and MV antigens were measured using the same serum.
  • ELISA was performed by coating the MV and DNV antigens, respectively, to measure the total antibody value.
  • concentrations that inhibited infection of MV and NDV, respectively were measured by plaque inhibition assay.
  • antibodies and virus-neutralizing antibodies specific to each antigen were sufficiently formed only in the group having F antigens of MV and NDV, as shown in FIGS. 12 and 13.
  • antibodies were not formed in each antigen, and neutralizing antibodies were not induced.

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Abstract

본 발명은 RSV의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 재배열된 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)로, RSV의 당단백질(G 단백질)과 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자 사이에 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되거나, RSV의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 제공한다. 본 발명의 재조합 RSV는 RSV 백신주로 사용될 수 있고, 안정성이 뛰어나고, 안전하여 백신으로 사용할 수 있다.

Description

재조합 RSV 생백신주 및 이의 제조 방법
본 출원은 2018년 10월 12일에 출원된 한국출원 제 10-2018-0122162호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다. 본 발명은 RSV 생백신주 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 재조합된 RSV 생백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus, RSV)는 전 세계적으로 널리 유행하는 바이러스로, 호흡기 병증을 유발하며 특히 영유아의 중증 호흡기감염 사망의 주 원인이 되는 바이러스이다. 영유아가 주 감염 대상이지만, 면역력이 약화된 환자와 노인의 호흡기 질환에 감염을 유발하여 치명적인 호흡기 질병을 일으킨다고 알려졌다. 호흡기 병증 유발 원인으로는 인플루엔자에 이어 두 번째로 높지만, 1세 미만 유아에서 10만명당 RSV로 인한 연간 사망률이 인플루엔자에 비해 약 1.3~2.5배 높은 것으로 알려졌다. 2002년 WHO의 보고에 따르면 매년 RSV에 감염 되는 사람이 6천 4백만명이며, 이중 16만 명이 사망한다고 보고하였다.
RSV 질병 방어를 목적으로 처음에는 불활성화된(inactivated) 바이러스를 이용한 백신(불활화 백신)이 개발 되었으나 질병의 병증이 더 심하게 유도되는 등의 심각한 부작용(ERD (enhanced respiratory disease))의 발생으로 불활화 백신 이용은 불가능하게 되었다. 이에 연구자들이 ERD 유발이 없고, 중화 항체 유도 능력이 탁월한 백신을 개발하기 위해 노력하였다.
특히 생백신(Live vaccine)의 경우는 ERD를 유발하지 않고 중화 항체 유도 능력이 탁월하다는 장점이 있지만, RSV가 매우 불안정(metastable)하기 때문에 바이러스의 안정성(stability) 문제와 안전성(safety) 문제를 함께 고려할 때, 백신 개발에 어려움이 있었다.
RSV는 Mononegavirales 목(order), Pneumoviridae과(family)에 속하는 Orthopneumoviridae아과(subfamily)에 속해 있다. RSV는 120-200nm정도의 중간 크기의 바이러스로, envelope와 3개의 transmembrane proteins (F, G glycoproteins 및 SH protein)으로 구성된 표면구조를 가지고 있으며, 약 15,000개의 nucleotide로 이루어진 선형의 음성 가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지고 있다. RSV는 G 단백질에 의해 A, B의 혈청형으로 나뉘어진다. RSV의 게놈은 11개의 단백질을 암호화(coding)하고 있으며, Structural protein과 Non-structural protein을 암호화하는 부분 등으로 구성되어 있다. Non-structural protein은 Nonstructural (NS)1, Nonstructural (NS)2이며 type I interferon의 antagonist로 면역 반응 회피 기작에 작용한다. Structural protein 중 fusion (F) protein, glyco (G) protein, small hydrophobic (SH) protein은 당 단백질로 바이러스의 표면을 구성하며, nucleocapsid (N) protein, phosphoprotein (P), matrix (M) protein, viral polymerase (L) 등은 바이러스 내부를 구성하거나 virus의 복제에 중요한 역할을 한다.
RSV F 단백질은 virus entry 초기 및 cell membrane과의 융합 작용을 하는 중요한 구성요소로 항원성이 높아 vaccine과 antiviral drug의 주요 대상으로 알려져 있다. 그러나 상기 F 단백질 항원은 pre-fusion형 단백질의 안정화된 형태로 생산 및 정제가 어렵고, 안정성 확보가 곤란한 문제가 있으며, 효능 유지가 쉽지 않다.
이에 본 발명의 발명자들은 F 단백질의 불안정성을 해소하고 안전한 새로운 형태의 RSV 생백신을 개발하고자 한다.
본 발명은 안정성이 높은 이종의 F 단백질을 치환 또는 삽입하여 안정성 (stability)이 우수한 생(live) RSV 백신주 개발을 하고자 한다.
본 발명은 안정성이 높은 이종의 F 단백질로 치환 또는 삽입하여 안전성이 우수한(약독화된) live RSV 백신주 개발을 하고자 한다.
본 발명은 새로운 재조합 RSV를 개발하고자 한다.
본 발명은 RSV에 대한 방어기작을 유도할 수 있는 새로운 형태의 RSV 백신을 제공하고자 한다. 본 발명은 RSV 가 갖는 G 단백질 mutation으로 인해 secreted G를 생산하지 않아, immune escaping 기작을 억제하여 효과적인 면역 시스템 가동이 가능할 수 있는 새로운 형태의 백신을 제공하고자 한다.
본 발명은 이종의 F 단백질의 삽입 또는 치환으로 2가 백신을 생산하고자 한다.
본 발명의 일 구현예는 유전자 재조합된 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV)를 제공한다. RSV의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 재배열된 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 제공한다. 즉, 외부 유전자가 RSV 유전자에 삽입된 재조합 RSV 바이러스를 제공한다. 본 발명의 일 실시예는 RSV의 당단백질(G 단백질)과 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자 사이에 RSV가 아닌, 다른 바이러스로부터 유래한 F 단백질을 삽입하거나 RSV의 F 단백질 대신 치환된, 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스를 제공한다. 구체적으로, ① Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되거나, ② RSV의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 상기 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과(family)의 이종 바이러스는 바이러스 속(genus) Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, 및 Orthopneumovirus로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 홍역 바이러스(Measles virus), 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 서열번호 1의 인간 RSV A 바이러스주를 기본으로 하여, 서열번호 3을 갖는 RSV 재조합 백본(backbone)으로 하여 상기 RSV A 바이러스주의 외피 단백질을 코딩하는 유전자(G 단백질과 F 단백질 발현 도메인)가 재배열된 재조합 RSV일 수 있다. 바람직하게 서열번호 4 내지 7의 cDNA서열을 갖는다. RSV의 anti-genome에 제한 효소 서열이 추가된 서열은 서열번호 2로 나타냈다.
본 발명의 다른 구현예는 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하여 약독화된 재조합 RSV를 제조하는 방법을 제공한다. 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터; 및 N, P, L, 및 M2-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 벡터를 함께 발현시켜 재조합 RSV를 생산할 수 있다. 상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종의 바이러스로부터 유래된 단백질의 전체 또는 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 상기 제1 발현 벡터에 포함되는 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다. 상기 제1 발현 벡터는 pCC1 플라스미드에 상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 재조합 RSV 발현벡터를 제공한다. 상기 발현벡터는 RSV의 당단백질(G 단백질)과 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자를 포함하되, 상기 G 단백질과 F 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되거나, RSV의 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자 대신 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 RSV 유전자가 포함될 수 있다. 상기 재조합 RSV 유전자는 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 재조합 RSV 발현용 벡터는 T7 프로모터, 해머헤드 라이보좀, 재조합 RSV 유전자, 헤파티티스 델타 바이러스 라이보좀; 및 T7 종결자를 순서대로 포함한다. 상기 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과(family)의 이종 바이러스는 바이러스 속(genus) Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, 및 Orthopneumovirus로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 홍역 바이러스(Measles virus), 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 일 구현예에 따른 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약독화된 RSV 생백신 조성물을 제공한다. 상기 생백신 조성물을 인체에 투여하여 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 live RSV 바이러스주를 제공하며, RSV 유전체에 이종 바이러스로부터 유래된 F 단백질의 전부 또는 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 i) RSV F 단백질의 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 대신 삽입되거나, ii) RSV 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 어느 한 부분에 삽입된다. 본 발명의 재조합 RSV는 RSV 백신주로 사용될 수 있고, 안정성이 뛰어나고, 안전하여 백신으로 사용할 수 있다.
이하에서 구체적으로 설명한다.
본 발명은 RSV 의 F 단백질을 코딩하는 유전자를 이종의 바이러스의 F 단백질 코딩 유전자로 치환하거나, 이종의 바이러스의 F 단백질 코딩 유전자를 추가로 도입한 새로운 형태의 RSV 생백신을 제공하고자 한다.
[용어의 정의]
“재조합된(Recombinant)”은 하나의 생물체 안에 유전 형질이 다른 세포가 함께 존재하는 경우를 의미할 수 있으며, 특히 본원에서 사용된 “재조합된”은 하나의 유전적 백본(backbone)을 기초로 상이한 개체의 유전적 정보(핵산)가 삽입되어 새로운 유전적 변이가 발생되는 경우를 의미한다.
재조합 RSV라 함은 재조합 발현체계로부터 직간접적으로 유래되거나 또는 그들로부터 생산된 바이러스나 서브바이러스입자로부터 증식된 RSV 또는 RSV-유사 바이러스를 의미한다. 재조합 발현체계는 재조합 발현벡터를 포함하는데, 이는 RSV 유전자의 발현에서 조절기능을 가지는 적어도 하나의 유전적 구성요소 (element) 또는 구성요소들의 조합체를 포함하는, 기능적으로 연결된 전사 단위를 포함하며, 구성요소의 예로는 프로모터, RSV mRNA로 전사되는 구조 또는 코딩 서열, 적절한 전사 개시와 종결 서열이 있다.
본원에서 사용된 “유전체(genome)”는 한 개체의 유전자(gene)의 총 염기서열이며, 한 생물체가 지닌 모든 유전정보의 집합체를 의미한다. 예를 들어 바이러스의 유전체는 바이러스 전체의 모든 유전정보서열을 아우르는 의미로 사용된다.
본원에서 사용된 “유전자(gene)”는 단백질을 암호화하는 부분으로 이해될 수 있으며, DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본원에서 사용된 “도입”의 의미는 본래 가진 것에서 새로운 것이 추가되는 것을 의미하는 것으로, 도입으로 인해 유전자의 변이가 유발될 수 있고, 결실, 치환, 또는 삽입 등이 일어날 수 있다.
예를 들어, 본원에서 “유전체에 새로운 유전자가 도입되었다”는 의미는 본래 개체가 가지고 있는 전체 유전자 염기 서열 중 일부가 새로운 개체로부터 유래된 유전자로 치환되거나 삽입될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 이러한 도입으로 인해 본래 개체(예를 들어 backbone)가 갖는 유전체 염기서열보다 길어질 수도 있고, 짧아질 수도 있고, 길이가 유지될 수도 있다.
본원에서 사용된 “백신주”는 백신균주(vaccine strain)으로도 불리며, 백신으로 이용되기 위해 분리된 바이러스 집단을 의미한다.
본원에서 사용된 “약독화된(attenuated) 생백신”이란 약화된 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)로 만드는 백신으로, 병원체가 여전히 생물학적 활성이 있기는 하나 숙주 내에서 질병을 잘 유발하지 않을 만큼 약화된 독성을 가지는 백신을 의미한다.
본원에서 사용된 “안티게놈(anti-genome)”이란 자손 RSV 게놈의 합성을 위한 주형으로 작용하는 상보적인 (+)센스 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 천연 RSV는 일반적으로 (-) 센스 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하며, 이는 상보적인 바이러스 mRNA를 통해 바이러스 단백질, 예를 들어, 당단백질(G), 융합(F), N, P 등을 코드한다. RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 재조합으로 약독화된 RSV 생백신주를 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 “단백질을 암호화하는 유전자” 또는 “단백질 코딩 유전자”는 단백질을 생성하는 유전자를 의미한다.
본 발명의 일 구현예는 RSV 유전체를 기본으로 이종 바이러스의 F 단백질을 삽입하거나, 또는 RSV의 F 단백질과 이종 바이러스의 F 단백질을 치환하여 안정성 및 안전성이 우수한 live RSV 백신주를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 RSV 유전체에 이종 바이러스로부터 유래된 F 단백질의 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 백신주를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는
i) RSV F 단백질의 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 대신 삽입되거나, ii) RSV F 단백질과 G 단백질 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있다.
도 2는 RSV의 F 단백질 중 일부 도메인을 암호화는 폴리뉴클레오티드가 외래 바이러스로부터 유래된 F 단백질 중 일부 도메인으로 치환된 형태를 보여주기 위한 그림이다.
도 3은 RSV의 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그대로 유지하고, 외래 바이러스로부터 유래된 F 단백질 중 일부 도메인이 삽입된 형태를 보여주기 위한 그림이다.
상기 이종 바이러스는 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 상기 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과(family)의 이종 바이러스는 바이러스 속(genus) Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Metapneumovirus, 및 Orthopneumovirus로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 홍역 바이러스(Measles virus), 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 특히 상기 홍역 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스는 바이러스의 안정성 및 생백신 바이러스주의 안전성을 높일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 기본이 되는 RSV 바이러스 유전체는 서열번호 1의 야생형 인간 RSV A 바이러스주를 이용할 수 있다. RSV 바이러스주는 RSV A 주, RSV B 주, HRSV A 주, HRSV B 주, BRSV 주, 조류 RSV 주 등 다양하지만, 본 발명의 목적상 외래 유전자가 삽입되는 RSV 기본 백본은 RSV A 바이러스주가 바람직할 수 있다. 상기 RSV A 바이러스주를 이용하여 외래 유전자가 도입되는 경우 생산된 재조합 바이러스의 안정성 및 안전성이 우수하고, 돌연변이 발생율이 적을 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 이종의 바이러스로부터 유래된 F 단백질의 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터 및
N, P, L, 및 M2-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 벡터를 함께 발현시켜 재조합 RSV를 생산하는 약독화된 RSV 백신주를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제1 발현 벡터는 pCC1, pBR322, pUC, pcDNA3.1 등이 사용될 수 있으나, cloning 과정 중 사이즈나 세포독성 방지 등을 고려할 때, 본 목적상 pCC1이 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 제2 발현 벡터는 pCI neo 벡터를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
RSV는 negative sense RNA 바이러스로 reverse genetics를 이용하여 in vitro에서 바이러스 생산 시, 유전자 합성에 필요한 별도의 헬퍼 유전자(helper gene)가 필요하다. 재조합된 RSV 안티게놈 및 각각의 N, P, L, M2-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 형질감염(transfection), 일렉트로포레이션(electroporation), 기계적인 삽입, 형질도입과 같은 방법으로 세포에 도입할 수 있다. Vero cell, Hep 2 cell, MRC 5 cell 등과 같은 세포에서 바이러스의 감염이 일어날 수 있으며, Vero cell 에서 본 발명의 재조합된 RSV 바이러스주 생산이 유리할 수 있다.
재조합된 RSV 안티게놈 및 각각의 N, P, L, M2-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 방법은 업계에서 일반적으로 사용하는 방법이 이용될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
다른 구현예에서 세포외에서 RSV 안티게놈 RNA를 합성하여 RSV 단백질을 발현하는 세포에 형질감염하여 합성할 수도 있다.
재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제1 발현 벡터에 포함시키고, 헬퍼 유전자를 제1 발현 벡터와 다른 벡터(제2 발현 벡터)에 포함시킬 수도 있고, 같은 벡터에 포함시킬 수도 있다.
제1 발현 벡터에 포함되는 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 상기 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.
상기 제1 발현 벡터는 pCC1 플라스미드에 상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 것일 수 있으며, 조합을 용이하게 할 목적으로 돌연변이를 유발하거나, 제한효소 자리를 변형하거나 또는 조절된 제한효소 자리를 포함하는 합성된 폴리링커를 삽입하여 벡터를 변형할 수도 있다.
본 발명의 pCC1 플라스미드는 재조합된 RSV 안티게놈을 안정화할 수 있다.
바람직하게 재조합된 RSV 안티게놈을 포함하는 제1 발현 벡터는 T7 프로모터, 해머헤드 라이보좀(hammerhead ribozyme), RSV 안티게놈, 헤파티티스 델타 바이러스 라이보좀(hepatitis delta virus ribozyme), 및 T7 종결자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 cDNA가 포함된 발현벡터일 수 있다.
상기 RSV 안티게놈은 홍역 바이러스(Measles virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 및 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)의 F 단백질을 포함하되, 상기 F 단백질의 트랜스 멤브레인(TM) 및 사이토플라스믹 테일(CT) 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RSV로부터 유래된 것을 사용할 수 있지만, 상기 바이러스로부터 유래된 것을 사용할 수도 있다. 본 발명의 일 구현예는 상기 방법에 따라 제조된 약독화된 RSV 백신주를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 본 원의 RSV 바이러스주; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 RSV 생백신을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의해 제조된 재조합된 RSV 백신주는 백신 용도로 사용할 때, 본 발명에 따라 제조된 바이러스를 백신제제로 직접적으로 사용하거나, 동결건조시켜 사용하거나, 액체에 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 이 조성물을 투여받는 척추동물에 해로운 면역 반응을 자체로 유발하지 않는 임의의 약학적 물질을 포함하고, 재조합 RSV 백신주와 함께 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 적절한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 미국 약전, 유럽 약전 또는 척추동물 및 더욱 구체적으로 인간에 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되는 것을 의미한다. 본 발명의 RSV F 항원은 RSV 바이러스의 하나 이상의 균주에 대항하여 면역 반응을 자극하는데 충분한 유효량 또는 양(위에서 정의함)으로 투여된다. 이런 조성물은 척추동물에서 보호성 면역반응을 유도하기 위한 백신 및/또는 면역원성 조성물로서 사용될 수 있다.
한 비-제한적인 실시태양에서, 백신에 포함되는 재조합 RSV 항원의 농도는 적어도 약 10㎍/mL, 약 20㎍/mL, 약 30㎍/mL, 약 40㎍/mL, 약 50㎍/mL, 약 60㎍/mL, 약 100㎍/mL, 약 200㎍/mL, 또는 약 500㎍/mL이다. 특정 양태에서, 면역원의 농도는 약 10㎍/mL 내지 약 1mg/mL, 또는 약 20㎍/mL 내지 약 500㎍/mL, 또는 약 30㎍/mL 내지 약 100㎍/mL 또는 약 30㎍/mL 내지 약 50㎍/mL이다. 다른 실시태양에서 면역원의 농도는 10㎍/mL 내지 200㎍/mL 포함될 수 있다.
본 발명의 백신 또는 면역원 조성물은 RSV 에 대항하여 면역 반응을 유도하도록 동물에게 투여될 수 있다. 한 실시태양에서, 동물은 인간이다. 통상적으로, 복용량은, 예를 들어, 나이, 신체 조건, 체중, 나이, 식품, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 기초로 이 범위 내에서 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효량의 면역원을 상기 제제에 첨가하는 단계를 포함하여, 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 실질적 면역성을 유발하는 백신 또는 면역원 조성물을 제제화하는 방법을 포함한다. 1회 복용량에 의한 실질적 면역성의 자극이 바람직하지만, 원하는 효과를 얻기 위해서, 동일하거나 다른 경로를 통해 추가 복용량이 투여될 수 있다. 신생아 및 유아에서, 예를 들어, 충분한 수준의 면역을 유발하기 위해 복수의 투여가 필요할 수 있다. 투여는 감염에 대항하는 충분한 수준의 보호를 유지하기 위해 필요한 경우, 유년 시기에 걸쳐 간격을 주고 계속될 수 있다. 한 실시태양에서, 피험자에서 바이러스 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 실질적 면역성을 유도하는 방법은 적어도 1회 유효량의 RSV 재조합 F 단백질 또는 이의 단편 또는 집합체를 투여하는 단계를 포함한다. 백신 및/또는 면역원 제제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 내피, 근육내, 정맥 및 피하), 경막외 및 점막(예를 들어, 비강 및 경구 또는 폐 경로 또는 좌약)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시태양에서, 상기 조성물은 근육내, 정맥, 피하, 경구 또는 피내로 투여된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막 안쪽(예를 들어, 구강 점막, 결장, 결막, 비인 강, 인두중앙부, 질, 요로, 방광, 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적으로 활성인 물질과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국부적 일 수 있다. 예방 백신 제제는 바늘 및 주사를 사용하여 피하 또는 근육내 주사 또는 바늘 없는 주사 장치에 의해 전신으로 투여된다. 선택적으로, 백신 제제는 상기도 속으로의 방울, 큰 입자 에어로졸(약 10 마이크론보다 큼) 또는 분사에 의해 비강으로 투여된다. 전달의 상기 경로 중 임의의 것은 면역 반응을 일으키는 반면에, 비강 투여는 바이러스의 침투 위치에서 점막 면역성을 유발하는 증가된 효과를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 백신 및/또는 면역원성 제제는 면역화의 부위에 면역 반응을 유발하도록 점막 조직을 표적으로 하는 방식으로 투여될 수 있다. 투여 부위는 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예는 본 원의 RSV 백신주를 인체에 투여하여 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 안정성이 높은 이종의 F 단백질을 치환 또는 삽입하여 안정성 (stability)이 우수한 생(live) RSV 백신주를 제공한다. 일반적으로 생백신이 갖고 있는 불안전성 및 불안정성을 해소하면서도 야생형 RSV 와 비슷한 수준의 항체 생성율을 갖는 새로운 재조합 RSV 바이러스주를 제공한다.
본 발명은 안정성이 높은 이종의 F 단백질로 치환 또는 삽입하여 안전성이 우수한(약독화된) live RSV 백신주를 제공한다.
본 발명은 RSV에 대한 방어기작을 유도할 수 있는 새로운 형태의 RSV 백신을 제공한다.
본 발명은 RSV 가 갖는 G 단백질 mutation으로 인해 secreted G를 생산하지 않아, immune escaping 기작을 억제하여 효과적인 면역 시스템 가동이 가능할 수 있는 새로운 형태의 백신을 제공한다.
본 발명은 이종의 F 단백질의 삽입 또는 치환으로 2가 백신을 생산할 수 있다.
본 발명은 새로운 재조합 RSV를 제공한다.
도 1은 RSV Genome을 도식화한 그림이다.
도 2는 RSV genome에서 F 단백질 부위를 절단(화살표는 절단 부위를 나타냄)하고 이종의 바이러스(예를 들어, NDV)의 F 단백질로 치환한 형태를 보여주는 개략도이다.
도 3은 RSV genome에서 G 단백질과 F 단백질 사이에 이종의 바이러스(예를 들어, MV)의 F 단백질을 추가한 형태를 보여주는 개략도이다.
도 4는 서열번호 3의 백본에서 MluI 및 ApaI 부위를 절단하여 외부 바이러스로부터 유래된 F 단백질을 삽입한 그림을 보여준다. ③ final construct의 G GE는 G 단백질 gene end region을, F GS는 F 단백질 gene starting region을, F GE는 F 단백질 gene end region을 나타낸다. MV 또는 NDV의 F 단백질이 삽입되나, F 단백질의 T 및 C 도메인은 RSV 의 것을 이용한다.
도 5는 서열번호 3의 백본에서 MluI 및 MluI 부위를 절단하여 외부 바이러스로부터 유래된 F 단백질을 삽입한 그림을 보여준다. MluI 및 MluI 절단 부위는 RSV의 G 단백질과 F 단백질 사이에 위치한다. ③ final construct의 G GE는 G 단백질 gene end region을, F GS는 F 단백질 gene starting region을, F GE는 F 단백질 gene end region을 나타낸다. MV 또는 NDVF의 F 단백질이 삽입되나, 추가되는 F 단백질의 T 및 C 도메인은 RSV의 것을 이용한다.
도 6은 본 발명의 재조합 RSV 바이러스의 cDNA를 벡터에 클로닝한 모식도를 보여준다.
도 7은 재조합 RSV의 각 세포별(HEp2 cell, Vero cell, MRC5 cell) 증식속도 및 증식 titer 비교를 통해 약독화를 보여주는 결과이다. Wild type RSV에 비해 백신주의 증식 속도 및 titer가 감소하였다.
도 8은 재조합 RSV의 마우스내에서 증식속도 및 증식 titer 비교를 통해 약독화를 보여주는 결과이다. Wild type RSV에 비해 백신주의 증식 속도 및 titer가 감소하였다.
도 9는 온도에 따른 재조합 RSV의 안정성 결과를 보여준다. 4℃, 37℃, 60℃ 모두에서 wild type RSV에 비해 열 안정성이 높아졌다.
도 10은 재조합 RSV의 마우스 면역 시험 결과를 보여주는 것으로, 총항체가 및 중화 항체가를 확인한 결과이다. Mock을 제외한 모든 그룹에서 충분한 항원 특이 및 중화 항체가 유도되었다. 다만, formalin으로 불화화된 wild type virus인 G7의 경우 상대적으로 매우 낮은 총항체가와 중화항체가를 보였다.
RSV backbone 은 wtRSVA_TH10654,
RSV backbone- MV F 치환은 cRSVA_MVF_S,
RSV backbone- NDV F 치환은 cRSVA_NDVF_S,
RSV backbone- MV F 삽입은 cRSVA_MVF_A, 그리고
RSV backbone- NDV F 삽입은 cRSVA_NDVF_A로 나타내었다.
도 10의 Mock는 G1으로, WtRSVA는 G2로, cRSVA_MVF_S는 G3으로, cRSVA_NDVF_S는 G4로, cRSVA_MVF_A는 G5로, cRSVA_NDVF_A는 G6로, 그리고 FIwtRSVA는 G7으로 나타냈다.
도 11은 재조합 RSV 면역후 wild RSV를 challenge하여 방어력을 측정한 결과이다. Mock를 제외한 모든 그룹에서 충분한 방어면역을 유도하였다. 다만, formalin으로 불화화된 wild type virus인 G7의 경우 다소 부족한 방어면역 효과를 나타내었다.
도 12는 NDV 면역원성 시험 결과 및 중화항체가 결과를 보여준다,
도 13은 MV 면역원성 시험 결과 및 중화항체가 결과를 보여준다.
도 12 및 13의 Mock는 G1으로, WtRSVA는 G2로, cRSVA_MVF_S는 G3으로, cRSVA_NDVF_S는 G4로, cRSVA_MVF_A는 G5로, cRSVA_NDVF_A는 G6로, 그리고 FIwtRSVA는 G7으로 나타냈다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
1. 야생형 RSV A 바이러스주 준비
아래의 정보를 갖는 야생형 RSV A 바이러스주를 아래와 같이 준비하였다.
- Definition ; Human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 / complete genome
- Accession No. ; KU950464.1
- Length ; 15232 bp
- Host ; Homo sapiens / female / 12 weeks
- Collection date ; 19-Feb-2014
- Country ; USA
- Subtype ; RSV A
서열번호 1로 나타냈다.
2. F 단백질 공여자(Donor) 바이러스 준비
F 단백질 donor로 홍역 바이러스(Measles virus (MV)), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus(NDV)) 를 선택하였다.
3. RSV 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 제조
이하의 Backbone construct A를 기본으로 하여, RSV anti-genome이 갖는 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이종 바이러스로부터 유래된 F 단백질의 폴리뉴클레오티드로 치환 또는 삽입하여 제작하였다.
(1) Backbone construct A의 디자인 (서열번호 3)
유전자 순서는 T7 promoter - hammerhead ribozyme - RSV anti-genome - hepatitis delta virus ribozyme - T7 terminator 순으로 한다.
5` 말단에 T7 promoter 서열(TAATACGACTCACTATAGG) 삽입하였다. T7 promotor 서열에 이어 hammerhead ribozyme 서열 (T TTTTTCGCGT CTGATGAGGC CGTTAGGCCG AAACTCCTCT CCGGAGTC)을 삽입하였다. Hammerhead ribozyme 서열에 이어 야생형 RSV anti-genome 서열을 삽입하고 아래의 변이가 적용되었다.
야생형 RSV의 anti-genome 서열을 기반으로 하여,
77nt와 78nt사이에 GCGCGCC를 삽입하여 AscI 제한효소 서열을 생성한다. (AscI 제한효소 서열은 GGCGCGCC<8 bp>인데 77nt의 서열이 G이므로 GCGCGCC<7 bp> 만 삽입하였다.)
1) 1079nt와 1080nt 사이에 CCTGCAGG (SbfI 제한 효소) 서열을 삽입한다.
2) 4600nt와 4601nt 사이에 GGCCGGCC (FseI 제한 효소) 서열을 삽입한다.
3) 4800nt와 4802nt 염기인 ATG(M)를 ATT(I) 서열로 치환한다.
4) 5639nt와 5640nt 사이에 ACGCGT (MluI 제한 효소) 서열을 삽입한다.
5) 7595nt와 7596nt 사이에 GGGCCC (ApaI 제한 효소) 서열을 삽입한다.
6) 야생형 RSV antigenome 서열에 이어 hepatitis delta virus ribozyme 서열(GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGAC)을 삽입한다.
7) Hepatitis delta virus ribozyme 서열에 이어 T7 terminator 서열 (TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG )을 삽입한다.
8) 5`최말단에 ACGCGAAAAAATGCGTACAAC 서열 삽입하고, 3`최말단에 GTTTTTGACACTTTTTTTCTCGT 서열 삽입한다. 여기서 5`최말단에 삽입된 ACGCGAAAAAATGCGTACAAC은 3' leader로 표시하고, 3`최말단에 삽입된 GTTTTTGACACTTTTTTTCTCGT은 5' trailer로 표시하였다.
디자인된 유전자 (서열번호 3)를 in vitro 합성 후 pCC1 vector에 cloning 하였다.
G 단백질 서열 중 하나의 point mutation 유도(M48I)을 도입하였다.
(2) Measles virus F 치환 construct B의 디자인 (서열번호 4)
상기 Backbone construct A 를 기본으로,
F 단백질 유전자 서열을 제거하고 대응하는 measles virus F 유전자 서열을 삽입하였다.
Measles virus인 Edmonston strain (Moraten vaccine)의 anti-genome 정보(Accession No.; AF266287.1)를 사용하였다.
Edmonston strain anti-genome에서 F 단백질 유전자는 5449 ~ 7110 서열에 해당하며, 이중 transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열을 제외한 5449 ~ 6939 서열을 사용하였다. Transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 서열을 사용하였다. 5` UTR 및 3`UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 F 단백질 유전자의 UTR 서열을 사용하였다.
Backbone construct A를 MluI과 ApaI 제한효소로 절단하고 디자인한 measles virus F 유전자를 삽입하였다.
(3) Newcastle disease virus F 치환 construct C의 디자인 (서열번호 5)
Backbone construct A 를 기본으로,
F 단백질 유전자 서열을 제거하고 대응하는 Newcastle disease virus F 유전자 서열을 삽입하였다.
Newcastle disease virus인 I-2 strain의 anti-genome 정보(Accession No. ; AY935499)를 사용하였다.
I-2 strain 게놈에서 F 단백질 유전자는 4544 ~ 6205 서열에 해당하며, 이중 transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열을 제외한 4544 ~ 6043 서열을 사용하였다. Transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 서열을 사용하였다. 5` UTR 및 3`UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 F 단백질 유전자의 UTR 서열을 사용하였다.
Backbone construct A를 MluI과 ApaI 제한효소로 절단하고 디자인한 Newcastle disease virus F 유전자를 삽입하였다.
도 4에서 도식화한 바와 같이, 상기 construct B 및 C는 제한효소 MluI/ApaI를 인식하고, Primer 1-Primer 2로 insert 증폭하였으며, Primer 1 (forward)는 5' ATAT ACGCGT gtattgttgcaaaaagccatg, Primer 2 (reverse)는 5' ATAT GGGCCC tgttttatataactataaaatagaa 이다.
(4) Measles virus F 삽입 construct D의 디자인 (서열번호 6)
Backbone construct A 를 기본으로,
G 단백질과 F 단백질 유전자 사이에 measles virus F 유전자 서열을 삽입하였다.
Measles virus인 Edmonston strain (Moraten vaccine)의 유전자 정보(Accession No. ; AF266287.1)를 사용하였다.
Edmonston strain 게놈에서 F 단백질 유전자는 5449 ~ 7110 서열에 해당하며, 이중 transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열을 제외한 5449 ~ 6939 서열을 사용하였다. Transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 서열을 사용하였다. 5` UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 F 단백질 유전자의 5` UTR서열을 사용하였다. 3`UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 G 단백질 유전자의 3`UTR 서열을 사용하였다.
Backbone construct A를 MluI 제한효소로 절단하고 디자인한 measles virus F 유전자를 삽입한다.
(5) Newcastle disease virus F 삽입 construct E의 디자인 (서열번호 7)
Backbone construct A 를 기본으로,
G 단백질과 F 단백질 유전자 사이에 Newcastle disease virus F 유전자 서열을 삽입하였다.
Newcastle disease virus인 I-2 strain의 유전자 정보(Accession No. ; AY935499)를 사용하였다.
I-2 strain 게놈에서 F 단백질 유전자는 4544 ~ 6205 서열에 해당하며, 이중 transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열을 제외한 4544 ~ 6043 서열을 사용하였다. Transmembrane region과 cytoplasmic tail region 서열은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 서열을 사용하였다. 5` UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 F 단백질 유전자의 5` UTR서열을 사용하였다. 3`UTR은 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654의 G 단백질 유전자의 3`UTR 서열을 사용하였다.
Backbone construct A를 MluI 제한효소로 절단하고 디자인한 Newcastle disease virus F 유전자를 삽입하였다.
도 5에 도식화한 바와 같이, 제한효소 MluI로 인식하는 부위에 이종 바이러스 유전자를 삽입하며, Primer 1-Primer 3로 insert 증폭을 진행한다. Primer 1 (forward)는 5' ATAT ACGCGT gtattgttgcaaaaagccatg, Primer 3(reverse)는 5' ATAT ACGCGT gctttttaatgacta tcagttactaaatgcaatat 이다.
4. Helper gene의 디자인 (4종)
RSV는 negative sense RNA 바이러스로 reverse genetics를 이용하여 in vitro에서 바이러스 생산 시, 유전자 합성에 필요한 helper gene (RSV의 N, P, L, M2-1 단백질 암호화 유전자)을 함께 넣어 준다.
(1) N 단백질 유전자는 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome의 1119 ~ 2294 서열을 pCI neo vector에 제한효소 XhoI과 MluI을 이용하여 cloning한다.
(2) P 단백질 유전자는 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome의 2326 ~ 3051 서열을 pCI neo vector에 제한효소 XhoI과 MluI을 이용하여 cloning한다.
(3) M2-1 단백질 유전자는 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome의 7647 ~ 8231 서열을 pCI neo vector에 제한효소 XhoI과 MluI을 이용하여 cloning한다.
(4) L 단백질 유전자는 야생형 human respiratory syncytial virus strain RSVA / TH_10654 anti-genome의 8539 ~ 15036 서열을 pCI neo vector에 제한효소 XhoI과 MluI을 이용하여 cloning한다.
각각 N 단백질 유전자는 서열번호 8, P 단백질 유전자는 서열번호 9, M2-1 단백질 유전자는 서열번호 10, L 단백질 유전자는 서열번호 11로 나타냈다.
5. 바이러스 rescue
BHK cell을 6well plate에 4 x 10 5 cell/well 농도로 준비하였다.
다음 날, T7 polymerase 발현 vector 2ug, RSV full length anti-genome vector 2ug, helper gene vector 4종(N, P, M2-1, L) 각 1ug의 총 6종의 plasmid를 동시에 lipofectamine3000 10ul와 혼합하고 10분간 반응시킨 뒤 BHK cell에 transfection하였다. 세포에 균일하게 적용될 수 있도록 방울방울 떨어트리고 2~3회 흔들어 잘 혼합될 수 있도록 한다.
5일간 37℃ CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양하고 배양액을 회수하여 새롭게 준비된 6 well plate의 Vero cell(3 x 10 5/well)에 1ml씩 감염하여 다시 5일간 배양하고 바이러스 용액을 얻었다. 이와 같은 방식으로 재조합 wild type RSV 1종, RSV 백신주 4종을 생산하였다.
해당 기술은 통상적으로 연구자들이 RSV 바이러스를 rescue 하기 위해 주로 사용하는 실험법으로 특별한 기술적 한계점은 없다. 본 연구에서는 여러 유사 기술 중 특히 “ BAC-Based Recovery of Recombinant Respiratory Syncytial Virus (RSV); Reverse Genetics of RNA Viruses pp 111-124” 그리고 “RNA Virus Reverse Genetics and Vaccine Design; Viruses 2014, 6, 2531-2550 의 자료를 참고하여 실험에 응용하였다. 배양액을 회수하여 IFA, RT-PCR, 유전자 서열 분석을 통해 바이러스를 검출하였다.
① RSV backbone strain ; wtRSVA_TH10654(Wild type control)
② RSV backbone strain- MV F 치환 ; cRSVA_MVF_S(변이 바이러스)
③ RSV backbone strain - NDV F 치환 ; cRSVA_NDVF_S(변이 바이러스)
④ RSV backbone strain- MV F 삽입 ; cRSVA_MVF_A(변이 바이러스)
⑤ RSV backbone strain- NDV F 삽입 ; cRSVA_NDVF_A(변이 바이러스)
6. In vitro 약독화 시험
5종의 바이러스를 Vero cell, HEp2 cell, MRC-5에 0.1 MOI를 감염하고 9일간 배양하였다. 매 1일 간격으로 바이러스 배양액을 수집하고 q-PCR을 이용하여 virus titer를 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 야생형 바이러스에 비해 변이바이러스인 백신주가 증식속도와 증식 titer가 감소하여 약독화 되었음을 확인하였다. 이를 통해 재조합된 바이러스들은 생백신주로 사용될 수 있음을 알 수 있다. DPI는 days post infection을 의미한다.
7. In vivo 약독화 시험
5종의 바이러스를 BALB/c 마우스의 IN route를 통해 10 1 ~ 10 7 pfu/mouse 의 농도별로 투여하였다. 1~7일 차 blood에서 q-PCR을 이용하여 viremia를 검출하여 약독화 되었음을 확인하였다.
그 결과는 도 8에 나타냈다. 도 8에서 확인할 수 있듯이 야생형 RSV A 바이러스와 비교해 접종 후 in vivo 에서 약독화되었음을 알 수 있고, 이를 통해 재조합된 RSV는 새로운 바이러스주로 사용될 수 있음을 확인하였다.
8. 바이러스 안정성 시험
5종의 바이러스를 60℃, 37℃, 4℃에서 시간별 생존력을 조사하였다. HEp2 cell을 이용한 plaque assay를 통해 샘플 내 live virus titer 분석을 진행하였다. 분석 결과, 모든 온도 조건에서 wild type에 비하여 변이 바이러스의 안정성이 증가되었음을 확인하였다. RSV 바이러스의 특성상 분리된 바이러스의 안정성이 매우 떨어지는데, 도 9의 결과에서 확인할 수 있듯이, 재조합된 RSV 바이러스는 야생형에 비해 고온, 사람의 체온, 그리고 저온에서도 야생형 바이러스주에 비해 안정성이 우수하다.
9. 면역원성 시험
Mock, wtRSVA, cRSVA_MVF_S, cRSVA_NDVF_S, cRSVA_MVF_A, 및 cRSVA_NDVF_A를 마우스 IM에 1x10 5 pfu/mouse 농도로 2회 면역하였다. 2주 후에 각 마우스의 혈청을 분리하고 ELISA를 통해 총항체가 및 plaque reduction neutralization test를 통해 중화항체를 측정하였다. 그 결과는 도 10에 나타냈다. Mock를 제외한 모든 그룹에서 RSV 항원에 특이적 IgG 항체와 virus 감염을 중화하는 항체가 충분히 형성되었음이 확인되었다. Mock는 G1으로, WtRSVA는 G2로, cRSVA_MVF_S는 G3으로, cRSVA_NDVF_S는 G4로, cRSVA_MVF_A는 G5로, cRSVA_NDVF_A는 G6로, 그리고 FIwtRSVA는 G7으로 나타냈다. 재조합된 RSV 바이러스주들은 RSV 야생형과 비슷한 수준의 항체를 생성하였고, 불활화된 G7에 비해서는 항체 생성율이 훨씬더 우수하다는 것을 알 수 있다. 도 10의 결과를 통해 재조합된 RSV 바이러스주들은 야생형 바이러스 수준으로 항체를 생성하면서도, 안정성이 우수하여 뛰어난 바이러스주로 이용될 수 있음을 확인하였다.
10. 면역 효력 시험
5종의 바이러스를 마우스의 IM에 10 5pfu/mouse 농도로 2주 간격 2회 접종하였다. 면역 후 2주 후 야생형 RSV를 2x10 6pfu/mouse 의 농도로 마우스 비강에 challenge하였다. 1~12일차 blood에서 viremia를 q-PCR을 통해 검출하고, body weight 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 11에 나타냈다. 모든 면역 그룹에서 바이러스 감염을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 특히 야생형 바이러스주와 비슷한 수준으로 감염이 억제되는 것을 알 수 있었으며, 불활화 바이러스주에 비해서는 혈액 내 바이러스 감염 정도가 현저히 적었음을 알 수 있다.
11. MV와 NDV 에 대한 면역원성 시험
상기 9. 항목의 실험 방법과 유사하게, 동일 혈청을 이용하여 NDV와 MV 항원에 대한 총항체가와 중화항체가를 측정하였다. 총항체가 측정을 위해 MV와 DNV 항원을 각각 coating 하여 ELISA를 수행하였다. 중화항체 측정을 위해, MV와 NDV 의 감염을 각각 억제하는 농도를 plaque inhibition assay로 측정하였다. 그 결과, 도 12 및 도 13에서처럼 MV와 NDV의 F 항원을 가지는 그룹에서만 각각의 항원에 특이적인 항체와 바이러스 중화항체가 충분히 형성되었음이 확인 되었다. 그러나, 이종의 F 가 삽입되지 않는 그룹은 각 항원에 특히 항체가 형성되지 않았으며 중화항체도 유도되지 않았다.

Claims (16)

  1. RSV의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 재배열된 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)로,
    RSV의 당단백질(G 단백질)과 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자 사이에 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되거나,
    RSV의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스는 Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus , Morbillivirus, Respirovirus , Rubulavirus, Metapneumovirus, 및 Orthopneumovirus로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV).
  3. 제1항에 있어서, 상기 이종 바이러스는 홍역 바이러스(Measles virus), 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV).
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 서열번호 1의 야생형 인간 RSV A 바이러스주의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 재배열된, 재조합 RSV.
  5. 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터; 및
    N, P, L, 및 M2-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 벡터를 함께 발현시켜 재조합 RSV를 생산하며,
    상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종의 바이러스로부터 유래된 단백질의 전체 또는 일부 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된, 약독화된 재조합 RSV를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 발현 벡터에 포함되는 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드는 cDNA인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 제1 발현 벡터는 pCC1 플라스미드에 상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된, 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 재조합 RSV 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종의 바이러스로부터 유래된 단백질은 F 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 재조합 RSV 발현벡터로,
    RSV의 당단백질(G 단백질)과 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자를 포함하되, 상기 G 단백질과 F 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되거나,
    RSV의 융합 단백질 (F 단백질)을 코딩하는 유전자 대신 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스 유래의 F 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 RSV 유전자가 포함된, 재조합 RSV 발현용 벡터
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 RSV 유전자는 서열번호 4 내지 7 중에서 선택된 어느 하나인 재조합 RSV 발현용 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 상기 재조합 RSV 발현용 벡터는 T7 프로모터, 해머헤드 라이보좀, 재조합 RSV 유전자, 헤파티티스 델타 바이러스 라이보좀; 및 T7 종결자를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 RSV 발현용 벡터.
  13. 제10항에 있어서, 상기 Paramyxoviridae, 또는 Pneumoviridae 바이러스과의 이종 바이러스는 홍역 바이러스(Measles virus), 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 재조합 RSV 발현용 벡터.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약독화된 RSV 생백신 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, RSV; 및 홍역 바이러스(Measles virus (MV)) 또는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus(NDV)) 감염 예방용 2가 백신 조성물.
  16. 제14항의 RSV 백신 조성물을 인체에 투여하여 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염을 예방하는 방법.
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