CN110878128A - 一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用。本发明应用大肠杆菌BL21表达纯化了由粘膜佐剂CTA1‑DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白CTA1‑DD‑F，滴鼻免疫小鼠发现，该融合蛋白可刺激特异性体液免疫应答(IgG1、IgG2a、IgA及中和抗体)和细胞免疫应答，与FI‑RSV相比，滴鼻免疫引起Th1类的免疫应答并且引起很小的肺脏病理损伤。此外，与添加CpG佐剂的F蛋白免疫组相比，CTA1‑DD‑F鼻内免疫诱导的血清中和抗体滴度更高，能够有效清除小鼠肺部的病毒。因此，CTA1‑DD粘膜佐剂适用于RSV粘膜疫苗，CTA1‑DD‑F是预防hRSV的潜在候选疫苗。

Description

一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白及其制备方法，还涉及由该融合蛋白制备而成的人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,hRSV)是1957年美国科学家从患有肺炎的儿童体内分离，2017年国际病毒分类委员会将RSV划分到肺病毒科(Pneumoviridae)正肺病毒属(Orthopneumovirus)，包含AB两种血清亚型。
RSV可以通过飞沫吸附于呼吸道粘膜，引起肺炎和支气管炎，主要感染婴幼儿和老年人，感染婴幼儿较重，常常发生下呼吸道感染，严重导致死亡。儿童及成年人上呼吸道较轻。2005年全球大约有66000～199000个小于5岁的儿童死于RSV感染引起的急性下呼吸道感染，其中99％发生在发展中国家。2015年320万名患者因感染RSV住院，导致59600小于5岁的儿童死亡，其中包括27300名小于6个月的婴儿。在许多发达国家RSV的防控很全面，但是在一些中等收入的国家RSV防控比较落后，部分儿童感染RSV后未送进医院并导致死亡，这些病例在统计中往往被忽略。早产儿、支气管和肺发育异常以及先天性心脏病的孩子最容易感染RSV。
hRSV是一种单股负链RNA病毒，含有10个基因，能够编码形成11种蛋白质，其中F蛋白和G蛋白是主要的保护性抗原，G蛋白在结构蛋白中变异最显著，参与病毒的吸附过程。F蛋白相对保守，产生的抗体中和活性高，且能对AB两个亚型产生中和作用，因此RSV疫苗的绝大多数研究都是针对F蛋白的。F蛋白属于I型跨膜糖蛋白，全长574个氨基酸，在109和137位点有弗林蛋白酶切割位点，将F蛋白切割成F2、P27和F1三个片段，切割后F1和F2由两条二硫键连接形成异二聚体，然后三个异二聚体形成三聚体。这种三聚体包含两种构象(pre-F和post-F)，pre-F是一种亚稳定结构，可以向稳定的post-F转变(5)，人体血清中具有强中和活性的抗体大部分由pre-F产生(Ngwuta JO,Chen M,Modjarrad K,Joyce MG,KanekiyoM,Kumar A,Yassine HM,Moin SM,Killikelly AM,Chuang G-Y,Druz A,Georgiev IS,Rundlet EJ,Sastry M,Stewart-Jones GBE,Yang Y,Zhang B,Nason MC,Capella C,Peeples ME,Ledgerwood JE,McLellan JS,Kwong PD,Graham BS.2015.Prefusion F–specific antibodies determine the magnitude of RSV neutralizing activity inhuman sera.Science Translational Medicine 7:309ra162-309ra162.)，因为pre-F具有一个特有的构象表位
Figure BDA0002259533610000021
针对该表位的单克隆抗体有5C4、AM22和D25等，其中D25单抗(MEDI8897)作为治疗性药物已经进入临床试验，5C4是厦门大学夏宁邵团队研制的鼠源抗体。抗原位点II存在于pre-F和post-F中，针对该表位的单克隆抗体有Palivizumab，Motavizumab，其中Palivizumab是一种人源化的小鼠单克隆抗体，也是唯一被批准使用的治疗性单抗。
自上世纪50年代RSV被发现以来，科学家对RSV疫苗进行了大量的实验和探索，但至今没有上市的疫苗，上世纪60年代中期，FI-RSV疫苗随机免疫儿童，当再次感染RSV时，免疫前血清阴性的儿童的感染率比对照组更高，症状更严重，并且造成两名儿童死亡，后来的研究将这种现象称为增强的RSV疾病(enhanced RSV disease,ERD)，ERD可能是由于异常的免疫应答造成的，主要引起Th2免疫应答造成免疫系统失衡。目前进入临床试验的RSV疫苗包括四类，针对3种不同人群(婴幼儿，老年人，孕妇)；唯一进入三期临床试验的疫苗是Novavax研发的颗粒疫苗，但遗憾是该疫苗的F蛋白处于Post-F，因此2016年对老年人的三期临床试验由于没有达到理想的保护效果宣布失败，2015年开始的孕妇临床三期的实验在2019年也宣布失败。目前国内RSV疫苗的研究除了减毒活疫苗以外其他种类疫苗都有尝试，但都是处于临床前研究。随着结构生物学的发展，F蛋白的构象越来越清晰，因此目前认为以Pre-F为基础的疫苗是最有潜力的，都希望疫苗含有稳定的表位
Figure BDA0002259533610000022
RSV感染只局限于呼吸器官，因此RSV疫苗通过呼吸道粘膜免疫能诱导更有效地免疫反应，阻止RSV感染。鼻腔免疫需要有效的粘膜佐剂增强免疫应答，霍乱毒素(choleraeenterotoxin,CT)是一种非常强的粘膜佐剂，但是毒性很高，1997年Agren等人将CT蛋白的CTA1亚基与葡萄球菌蛋白A的D片段的二聚体(DD)串联表达形成CTA1-DD，该粘膜佐剂毒性低并且可以与大多数抗体的Fc片段结合(
Figure BDA0002259533610000031
L,Ekman L,Lycke BLON.1997.Agenetically engineered non-toxic vaccine adjuvant that combines B celltargeting with immunomodulation by cholera toxin A1subunit.Journal ofImmunology 158:3936-3946.)。DD直接与B细胞作用，不需要T细胞的辅助，因此免疫应答更高效。
有鉴于此，本发明提出了一种含有由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白的粘膜疫苗，以期为人呼吸道合胞病毒的预防提供技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够用于预防hRSV的粘膜疫苗及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗，其中含有由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白。
一种由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白，命名为CTA1-DD-F，所述的融合蛋白的CTA1-DD-F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，优选的，所述的融合蛋白CTA1-DD-F由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码。
其中，优选的，所述的融合蛋白CTA1-DD-F由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列通过大肠杆菌表达系统表达、纯化后获得。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)融合蛋白CTA1-DD-F由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成，CTA1-DD-F基因由CTA1-DD和F基因通过融合PCR获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，应用EcoR1和Not1两个酶切位点连在pET28a载体上，得到的表达质粒命名为pET28a-CTA1-DD-F；
(2)构建好的表达质粒pET28a-CTA1-DD-F转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性LB培养基平板，过夜培养，挑取生长良好的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期(OD6000.4～0.8)，向培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM，继续培养；
(3)收集大肠杆菌液，离心，弃上清，留沉淀；用纯水重悬沉淀后超声重悬液，收集包涵体沉淀，弃上清，用纯水清洗包涵体三遍；用平衡液溶解包涵体后离心，留上清样品过柱，获得纯化的融合蛋白CTA1-DD-F；其中，所述的平衡液为含有8M尿素，16mM Na2HPO4，4mMKH2PO4，0.5mM NaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
再进一步，本发明还提出了所述的融合蛋白在制备人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明应用大肠杆菌BL21表达纯化了由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白CTA1-DD-F，滴鼻免疫小鼠发现，该融合蛋白可刺激特异性体液免疫应答(IgG1、IgG2a、IgA及中和抗体)和细胞免疫应答，与FI-RSV相比，滴鼻免疫引起Th1类的免疫应答并且引起很小的肺脏病理损伤。此外，与添加CpG佐剂的F蛋白免疫组相比，CTA1-DD-F鼻内免疫诱导的血清中和抗体滴度更高，能够有效清除小鼠肺部的病毒。因此，CTA1-DD粘膜佐剂适用于RSV粘膜疫苗，CTA1-DD-F是预防hRSV的潜在候选疫苗。
附图说明
图1为pET28a-CTA1-DD-F表达载体的构建；
图2为蛋白SDS-PAGE(A)和构象分析(B)；
图3为粘膜免疫诱导产生特异的体液(A)和CD8+细胞免疫应答(B)；
图4为粘膜免疫诱导产生中和抗体(A)，降低肺脏病毒低度(B)；
图5为粘膜免疫诱导后肺脏灌洗液(A)以及阴道灌洗液(B)产生的IgA抗体；
图6为粘膜免疫诱导产生的细胞因子；
图7为粘膜免疫诱导产生Th1类的体液和细胞免疫应答；
图8为粘膜免疫产生的肺脏病理损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1.材料和方法
1.1佐剂、细胞和毒株
CTA1-DD佐剂是参照Agren等人(
Figure BDA0002259533610000051
L,Ekman L,Lycke BLON.1997.Agenetically engineered non-toxic vaccine adjuvant that combines B celltargeting with immunomodulation by cholera toxin A1subunit.Journal ofImmunology 158:3936-3946.)由本实验室应用pET28a载体在BL21大肠杆菌中表达纯化获得；C型CpG-ODN佐剂(5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’)(Ma Y,Jiao Y-Y,Yu Y-Z,Jiang N,Hua Y,Zhang X-J,Fu Y-H,Peng X-L,Zheng Y-P,Anderson L,He J-S.2018.A Built-InCpG Adjuvant in RSV F Protein DNA Vaccine Drives a Th1 Polarized and EnhancedProtective Immune Response.Viruses 10:38.)由北京擎科生物科技有限公司合成；
Figure BDA0002259533610000052
Alum(40mg/ml)购自于Thermo Fisher公司；
HEp-2细胞由本实验室保存；HRSV(存于25％的蔗糖)由本实验室保存。
1.2主要的试剂和仪器设备
BALB/C小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司；PMA+Ionomycin购买于深圳市达科为生物工程有限公司；EcoR1和Not1限制性内切酶，T4连接酶购自于NEB公司；表达载体pET28a和pET32a由本实验室保存；菌株BL21(DE3)和DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司；山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG1，山羊抗小鼠IgG2a和山羊抗小鼠IgA购自于达科为生物技术有限公司；5C4(识别表位
Figure BDA0002259533610000053
只结合融合前构象的F蛋白)和8C2(可结合融合前和融合后构象的F蛋白)抗体由厦门大学夏宁邵惠赠；Mouse IFN-γprecoated ELISPOT kit，
Mouse IL-4precoated ELISPOT kit，小鼠淋巴细胞分离液，尼龙网9x9cm，MouseAnti-Respiratory syncytial virus F protein(RSV-F)IgG ELISA kit，MouseIFN-γElisa kit，Mouse IL-10Elisa kit，Mouse IL-12p70Elisa kit，Mouse IL-4Elisakit，Mouse IL-2Elisa kit购自于达科为生物技术有限公司；
LB(A+)板：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g Nacl和15g琼脂粉溶解于800mL去离子水中，用1mol/L的NaOH调节pH为7.0，定容至1000mL。高压灭菌，待温度降至55℃，加入1mL 100mg/mL氨苄，倒板。
LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L(约0.2ml)NaOH调PH值至7.0，用去离子水定容至1L，高压灭菌20min后即可使用，保存于4℃。
Hep-2细胞生长液：MEM培养基，10％胎牛血清，2mol/L谷氨酰胺)，40U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和0.2％碳酸氢钠。
平衡液(磷酸盐缓冲液)：pH＝7.4，8M尿素，16mM Na2HPO4，4mM KH2PO4，0.5mMNaCl。
洗涤液(不同浓度咪唑)：pH＝7.4，8M尿素，16mM Na2HPO4，4mM KH2PO4，0.5mMNaCl，(40mM、60mM、80mM、100mM、120mM、150mM)咪唑。
1.3蛋白表达
融合前构象的F蛋白包含26～513aa，缺失了105～146氨基酸，C端加入Foldon序列，F1蛋白上增加两对二硫键(A149C，Y458C)，替换两个疏水性氨基酸(S190F，V207C)，基因由上海生工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。应用EcoR1和Not1两个酶切位点连在pET28a载体上，得到的载体命名为pET28a–F。
粘膜佐剂CTA1-DD由霍乱毒素(cholerae enterotoxin,CT)蛋白的CTA1亚基和葡萄球菌蛋白A的D片段的二聚体(DD)串联表达形成，基因由上海生工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应用EcoRI和NotI两个酶切位点连在pET28a载体上，得到的载体命名为pET28a-CTA1-DD。
融合蛋白CTA1-DD-F由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成，CTA1-DD-F基因由CTA1-DD和F基因通过融合PCR获得，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示，应用EcoRI和NotI两个酶切位点连在pET28a载体上，得到的载体命名为pET28a-CTA1-DD-F，pET28a-CTA1-DD-F表达载体的构建如图1。
构建好的表达质粒pET28a-CTA1-DD、pET28a-F和pET28a-CTA1-DD-F转化表达菌株BL21(DE3)，均匀涂布卡那霉素抗性LB培养基平板，过夜培养(约12h)。挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期(OD600约0.4～0.8)，取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM，继续培养。诱导3小时后，取1ml诱导后的菌液，离心后弃上清，加入1mlPBS重悬菌体然后超声破壁，离心后对上清和沉淀跑SDS-PAGE，并做WB验证。确定诱导表达条件后，进行大量培养。
1.4蛋白的纯化和构象验证
收集大肠杆菌液，5000rpm室温离心10min，弃上清，留沉淀；用纯水重悬沉淀后超声重悬液，工作时间3s，间隙时间5s，全程时间20min；12000rpm，10min，收集包涵体沉淀，弃上清，用纯水清洗包涵体三遍；用平衡液溶解包涵体后12000rpm离心30min，留上清样品过柱。
将5C4(1mg/ml)和8C2抗体(1mg/ml)用PBS稀释1000倍，96孔板每孔加入100ul后4℃包被过夜(100ng/well)。PBST洗3次，每孔加入5％的脱脂乳200μL，37℃封闭2h，PBST洗3次。将CTA1-DD-F、F和F1抗原用PBS做10倍倍比稀释，孵育1h，PBST洗三遍，加入1000倍稀释的palivizumab(50mg/ml)抗体孵育1h，PBST洗三遍，加入HRP标记的山羊抗人(1:5000)抗体。
1.5小鼠免疫
(1)疫苗的准备：将纯化蛋白的buffer换做生理盐水，A组每只小鼠滴鼻免疫10μgF和5μg CTA1-DD佐剂，B组每只小鼠滴鼻免疫10μg F和10μg CpG佐剂，C组每只小鼠滴鼻免疫10μg F蛋白，D组每只小鼠滴鼻免疫10μgCTA1-DD-F蛋白，E组每只小鼠肌肉注射免疫100μL FI-RSV和100μg铝佐剂，F组为PBS对照组。
(2)将6-8W的BALB/c小鼠随机分为6组(A-F)，5组实验组(A-E)每只8只，PBS对照组(F)6只，分别在第0和21天肌肉注射免疫小鼠(100μl/只)，小鼠于第14d尾尖采血，于35天每只小鼠滴鼻攻毒hRSV A Long(1×105PFU)并采集血液，小鼠免疫方案见表1。
(3)攻毒四天后，脱臼处死小鼠，采血液和肺脏，右肺保存在病毒液中，左肺固定，饲养46天。
表1小鼠免疫方案
Figure BDA0002259533610000071
Figure BDA0002259533610000081
1.6血清抗体测定与肺脏病毒测定
攻毒4d后，异氟烷麻醉小鼠，然后眼球采血，脱臼处死小鼠后无菌取小鼠右侧肺脏放于1ml的DMEM培养基中，称重后放入30个左右的无菌钢珠，置于组织碾磨器碾磨均匀，冻存于-80℃，12,000rpm离心15min后取上清测定病毒滴度，应用噬斑减少中和试验。
将纯化后的RSV F蛋白稀释为2μg/mL，96孔板每孔加入100ul(200ng/孔)后4℃包被过夜。PBST洗3次，每孔加入5％的脱脂乳200μL，37℃封闭2h，PBST洗3次。
取14d和28d采集的血液做10倍倍比稀释，山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG1和山羊抗小鼠IgG2a稀释5000倍，当检测血清OD450值大于或等于阴性小鼠血清OD450值的2.1倍时，判定为阳性。
1.7肺脏和阴道灌洗液的分离检测
二免14d后取4只实验组小鼠和2只PBS组小鼠，眼球采血后脱臼处死小鼠，将小鼠气管切开，用自制的小鼠支气管肺泡灌洗器冲洗小鼠肺脏3次，1mL灌洗液(含有1％双抗的PBS液体)回收率达到90％左右，对900μL肺泡灌洗液离心取上清；用200μL灌洗液多次冲洗小鼠阴道，对200μL肺泡灌洗液离心取上清；用ELISA方法检测肺泡灌洗液上清液中Th1(IL-2，IL-12，IFN-γ)和Th2(IL-4，IL-5，IL-10)类细胞因子的含量。
同时检测肺泡灌洗液和阴道灌洗液中IgA抗体，包被的ELISA板每孔加入100μL肺泡灌洗液或阴道灌洗液，山羊抗小鼠IgA二抗1:5000倍稀释，一抗和二抗各孵育1h，酶标仪读OD450值。
1.8ELISPOT分析
无菌取出免疫39d后小鼠脾脏组织，放入含有4mL左右小鼠淋巴细胞分离液的培养皿中，用注射器内芯碾磨放在200目的尼龙网上的脾脏。碾磨后将分离液转移到15mL离心管中，覆盖1mL的1640培养基，800g离心25min取出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，混匀后250g离心5min收集小鼠脾脏细胞，然后加入培养液使细胞浓度为1×106/mL。
Elispot检测分泌IL-4和IFN-γ的T细胞数量，每孔加入10μL RBF蛋白(10μg/mL)刺激，阳性对照加入10μL阳性刺激物(达科为)，阴性对照加入10μL培养基，其他操作参照ELISPOT试剂盒说明书进行。
Elispot检测RSV特异性CD8+T细胞的免疫应答，F蛋白H-2Kd限制性CTL表位85-93个氨基酸KYKNAVTEL和249-258个氨基酸TYMLTNSELL多肽(12)，纯度95％，由生工合成，每孔各加入10μL浓度为30μg/mL的多肽。
1.9肺脏组织HE染色
小鼠攻毒4d后解剖取右肺称重，放入1.5ml的EP管中(含有1ml病毒分离液)；无菌操作，每管放入30个左右的钢珠，在组织碾磨器上碾磨肺脏；8000g离心3min，取上清测定病毒滴度。
小鼠左肺放入10％中性福尔马林溶液进行固定，做HE染色，观察肺泡周围炎性细胞的浸润程度和肺泡壁厚度。
2.实验结果
2.1蛋白纯化与构象鉴定
应用亲和层析纯化F蛋白，F1蛋白和CTA1-DD-F蛋白，SDS-PAGE分析可以看到F蛋白大小在60kDa左右，F1蛋白大小在40kDa左右，CTA1-DD-F蛋白大小在90kDa左右，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(图2A)。应用双抗体夹心ELISA检测F蛋白，F1蛋白和CTA1-DD-F蛋白构象，5C4抗体(只识别融合前构象F蛋白)和8C2抗体包被ELISA板子，用Palivizumab作为二抗检测结合抗原的多少，图2B显示，8C2包被的ELISA板子随着F1蛋白浓度增加OD450值也随之增加，5C4包被的ELISA板子随着F1蛋白浓度增加OD450值不随之增加；随着F蛋白和CTA1-DD-F蛋白浓度增加，两种抗体包被的ELISA板子OD450值都随之增加；因此可以证明F蛋白和CTA1-DD-F蛋白含有抗原表位
Figure BDA0002259533610000091
而F1蛋白不含有该表位，即F蛋白和CTA1-DD-F蛋白处于融合前构象，F1蛋白处于融合后构象。
2.2滴鼻免疫CTA1-DD-F产生特异的体液和CD8+细胞免疫应答
取初免14d和二免14d的小鼠血清做10倍倍比稀释，用包被F蛋白的ELISA板子检测特异性IgG抗体滴度，图3A显示滴鼻免疫组产生的抗体滴度都在104左右，高于FI-RSV免疫组。用F蛋白H-2Kd限制性CTL表位合成的多肽刺激脾细胞，滴鼻免疫组中CTA1-DD-F免疫组CD8+细胞分泌IFN-γ最多，表明CTA1-DD-F蛋白诱导产生的CD8+细胞免疫应答高于其他免疫组(图3B)。
2.3滴鼻免疫CTA1-DD-F产生中和抗体，降低肺脏病毒滴度
二免后14d取小鼠血清做噬斑减少中和试验，图4A显示CTA1-DD+F和CTA1-DD-F免疫组产生的抗体中和滴度达到28左右，与单独免疫F蛋白组具有统计学意义，表明CTA1-DD粘膜佐剂能增强免疫应答，产生更高滴度的中和抗体。
攻毒4天后噬斑实验检测肺脏病毒滴度，图4B中，CTA1-DD-F免疫组病毒滴度最低，显著低于F蛋白单独免疫组，FI-RSV和PBS组小鼠肺脏病毒滴度最高，表明FI-RSV对小鼠保护效果很差。
2.4滴鼻免疫CTA1-DD-F产生粘膜免疫应答(IgA抗体)
用包被F蛋白的ELISA板子检测肺脏灌洗液和阴道灌洗液特异性IgA抗体，F+CpG免疫组小鼠肺脏灌洗液中IgA抗体最多，其次是CTA1-DD-F免疫组和F蛋白免疫组，PBS和FI-RSV免疫组IgA抗体最低(图5A)。阴道灌洗液中IgA抗体水平与肺脏灌洗液IgA抗体水平相似(图5B)。
2.5滴鼻免疫CTA1-DD-F产生Th1类的免疫应答
为确定滴鼻免疫引起的免疫应答类型，我们应用ELISA方法检测二免14d后小鼠肺脏灌洗液中Th1(IL-2，IL-12p70，IFN-γ)类和Th2(IL-4，IL-5，IL-10)类细胞因子的含量。从图6可以看出，FI-RSV免疫组肺脏灌洗液中Th2(IL-4，IL-5，IL-10)类细胞因子的含量显著高于其他滴鼻免疫组，但是Th1类细胞因子比其他滴鼻免疫组低。说明FI-RSV主要引起Th2类的细胞因子，与之前的报道结果相似。
为了确定粘膜免疫后小鼠免疫应答的类型，我们检测血清中IgG1和IgG2a抗体滴度，从图7中可以看出只有FI-RSV免疫组IgG1抗体滴度是高于IgG2a抗体滴度的，其他滴鼻免疫组都是IgG2a抗体滴度高，表明滴鼻免疫诱导Th1类的体液免疫应答。
我们应用Elispot进一步检测细胞免疫类型，用F蛋白刺激分离的淋巴细胞发现FI-RSV免疫组分泌IL-4的淋巴细胞显著高于其他粘膜免疫组，而分泌IFN-γ的淋巴细胞则显著低于滴鼻免疫组。进一步验证了粘膜免疫可以诱导小鼠产生Th1类免疫应答。
2.6滴鼻免疫减少肺脏病理变化
FI-RSV免疫组肺脏病理损伤最严重的，肺泡壁增厚，肺泡腔变小，周围有炎性细胞浸润；粘膜免疫组中支气管上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常，肺泡壁没有明显增厚，周围也没有炎性细胞浸润(图8)。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用
<130> KLPI190715
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
aacgacgaca aactgtaccg tgctgactct cgtccgccgg acgaaatcaa acagtctggt 60
ggtctgatgc cgcgtggtca gtctgaatac ttcgaccgtg gtacccagat gaacatcaac 120
ctgtacgacc acgctcgtgg tacccagacc ggtttcgttc gtcacgacga cggttacgtt 180
tctacctcta tctctctgcg ttctgctcac ctggttggtc agaccatcct gtctggtcac 240
tctacctact acctgtacgt tctggctacc gctccgaaca tgttcaacgt taacgacgtt 300
ctgggtgctt actctccgca cccggacgaa caggaagttt ctgctctggg tggtatcccg 360
tactctcaga tctacggttg gtaccgtgtt cacttcggtg ttctggacga acagctgcac 420
cgtaaccgtg gttaccgtga ccgttactac tctaacctgg acatcgctcc ggctgctgac 480
ggttacggtc tggctggttt cccgccggaa caccgtgctt ggcgtgaaga accgtggatc 540
caccacgctc cgccgggttg cggtaacgct ccgcgttctt ctgctgacgc tcagcagaac 600
aacttcaaca aagaccagca gtctgctttc tacgaaatcc tgaacatgcc gaacctgaac 660
gaagctcagc gtaacggttt catccagtct ctgaaagacg acccgtctca gtctaccaac 720
gttctgggtg aagctaaaaa actgaacgaa tctcaggctc cgaaagctga cgctcagcag 780
aacaacttca acaaagacca gcagtctgct ttctacgaaa tcctgaacat gccgaacctg 840
aacgaagctc agcgtaacgg tttcatccag tctctgaaag acgacccgtc tcagtctacc 900
aacgttctgg gtgaagctaa aaaactgaac gaatctcagg ctccgaaa 948
<210> 2
<211> 1428
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
cagaacatca ccgaagaatt ctaccagtct acctgctctg ctgtttctaa aggttacctg 60
tctgctctgc gtaccggttg gtacacctct gttatcacca tcgaactgtc taacatcaaa 120
gaaaacaaat gcaacggtac cgacgctaaa gttaaactga tcaaacagga actggacaaa 180
tacaaaaacg ctgttaccga actgcagctg ctgatgcagt ctaccccggc taccggttct 240
ggttctgcta tctgctctgg tgttgctgtt tgcaaagttc tgcacctgga aggtgaagtt 300
aacaaaatca aatctgctct gctgtctacc aacaaagctg ttgtttctct gtctaacggt 360
gtttctgttc tgaccttcaa agttctggac ctgaaaaact acatcgacaa acagctgctg 420
ccgatcctga acaaacagtc ttgctctatc tctaacatcg aaaccgttat cgaattccag 480
cagaaaaaca accgtctgct ggaaatcacc cgtgaattct ctgttaacgc tggtgttacc 540
accccggttt ctacctacat gctgaccaac tctgaactgc tgtctctgat caacgacatg 600
ccgatcacca acgaccagaa aaaactgatg tctaacaacg ttcagatcgt tcgtcagcag 660
tcttactcta tcatgtgcat catcaaagaa gaagttctgg cttacgttgt tcagctgccg 720
ctgtacggtg ttatcgacac cccgtgctgg aaactgcaca cctctccgct gtgcaccacc 780
aacaccaaag aaggttctaa catctgcctg acccgtaccg accgtggttg gtactgcgac 840
aacgctggtt ctgtttcttt cttcccgcag gctgaaacct gcaaagttca gtctaaccgt 900
gttttctgcg acaccatgaa ctctcgtacc ctgccgtctg aagttaacct gtgcaacgtt 960
gacatcttca acccgaaata cgactgcaaa atcatgacct ctaaaaccga cgtttcttct 1020
tctgttatca cctctctggg tgctatcgtt tcttgctacg gtaaaaccaa atgcaccgct 1080
tctaacaaaa accgtggtat catcaaaacc ttctctaacg gttgcgacta cgtttctaac 1140
aaaggtgttg acaccgtttc tgttggtaac accctgtact gcgttaacaa acaggaaggt 1200
aaatctctgt acgttaaagg tgaaccgatc atcaacttct acgacccgct ggttttcccg 1260
tctgacgaat tcgacgcttc tatctctcag gttaacgaaa aaatcaacca gtctctggct 1320
ttcatccgta aatctgacga actgctgggt tacatcccgg aagctccgcg tgacggtcag 1380
gcttacgttc gtaaagacgg tgaatgggtt ctgctgtcta ccttcctg 1428
<210> 3
<211> 2376
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
aacgacgaca aactgtaccg tgctgactct cgtccgccgg acgaaatcaa acagtctggt 60
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ctgtacgacc acgctcgtgg tacccagacc ggtttcgttc gtcacgacga cggttacgtt 180
tctacctcta tctctctgcg ttctgctcac ctggttggtc agaccatcct gtctggtcac 240
tctacctact acctgtacgt tctggctacc gctccgaaca tgttcaacgt taacgacgtt 300
ctgggtgctt actctccgca cccggacgaa caggaagttt ctgctctggg tggtatcccg 360
tactctcaga tctacggttg gtaccgtgtt cacttcggtg ttctggacga acagctgcac 420
cgtaaccgtg gttaccgtga ccgttactac tctaacctgg acatcgctcc ggctgctgac 480
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aacttcaaca aagaccagca gtctgctttc tacgaaatcc tgaacatgcc gaacctgaac 660
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aacaacttca acaaagacca gcagtctgct ttctacgaaa tcctgaacat gccgaacctg 840
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aacgttctgg gtgaagctaa aaaactgaac gaatctcagg ctccgaaaca gaacatcacc 960
gaagaattct accagtctac ctgctctgct gtttctaaag gttacctgtc tgctctgcgt 1020
accggttggt acacctctgt tatcaccatc gaactgtcta acatcaaaga aaacaaatgc 1080
aacggtaccg acgctaaagt taaactgatc aaacaggaac tggacaaata caaaaacgct 1140
gttaccgaac tgcagctgct gatgcagtct accccggcta ccggttctgg ttctgctatc 1200
tgctctggtg ttgctgtttg caaagttctg cacctggaag gtgaagttaa caaaatcaaa 1260
tctgctctgc tgtctaccaa caaagctgtt gtttctctgt ctaacggtgt ttctgttctg 1320
accttcaaag ttctggacct gaaaaactac atcgacaaac agctgctgcc gatcctgaac 1380
aaacagtctt gctctatctc taacatcgaa accgttatcg aattccagca gaaaaacaac 1440
cgtctgctgg aaatcacccg tgaattctct gttaacgctg gtgttaccac cccggtttct 1500
acctacatgc tgaccaactc tgaactgctg tctctgatca acgacatgcc gatcaccaac 1560
gaccagaaaa aactgatgtc taacaacgtt cagatcgttc gtcagcagtc ttactctatc 1620
atgtgcatca tcaaagaaga agttctggct tacgttgttc agctgccgct gtacggtgtt 1680
atcgacaccc cgtgctggaa actgcacacc tctccgctgt gcaccaccaa caccaaagaa 1740
ggttctaaca tctgcctgac ccgtaccgac cgtggttggt actgcgacaa cgctggttct 1800
gtttctttct tcccgcaggc tgaaacctgc aaagttcagt ctaaccgtgt tttctgcgac 1860
accatgaact ctcgtaccct gccgtctgaa gttaacctgt gcaacgttga catcttcaac 1920
ccgaaatacg actgcaaaat catgacctct aaaaccgacg tttcttcttc tgttatcacc 1980
tctctgggtg ctatcgtttc ttgctacggt aaaaccaaat gcaccgcttc taacaaaaac 2040
cgtggtatca tcaaaacctt ctctaacggt tgcgactacg tttctaacaa aggtgttgac 2100
accgtttctg ttggtaacac cctgtactgc gttaacaaac aggaaggtaa atctctgtac 2160
gttaaaggtg aaccgatcat caacttctac gacccgctgg ttttcccgtc tgacgaattc 2220
gacgcttcta tctctcaggt taacgaaaaa atcaaccagt ctctggcttt catccgtaaa 2280
tctgacgaac tgctgggtta catcccggaa gctccgcgtg acggtcaggc ttacgttcgt 2340
aaagacggtg aatgggttct gctgtctacc ttcctg 2376
<210> 4
<211> 792
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile Lys GlnSer Gly 20
Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met AsnIle Asn 40
Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp GlyTyr Val 60
Ser Thr Ser Ile Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu SerGly His 80
Ser Thr Tyr Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn Val AsnAsp Val 100
Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly GlyIle Pro 120
Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu GlnLeu His 140
Arg Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro AlaAla Asp 160
Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp Arg Glu Glu ProTrp Ile 180
His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala Pro Arg Ser Ser Ala Asp Ala GlnGln Asn 200
Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro AsnLeu Asn 220
Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln SerThr Asn 240
Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp AlaGln Gln 260
Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met ProAsn Leu 280
Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser GlnSer Thr 300
Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gln AsnIle Thr 320
Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser AlaLeu Arg 340
Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu AsnLys Cys 360
Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr LysAsn Ala 380
Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Gly Ser Gly SerAla Ile 400
Cys Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn LysIle Lys 420
Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val SerVal Leu 440
Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro IleLeu Asn 460
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln LysAsn Asn 480
Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr ProVal Ser 500
Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro IleThr Asn 520
Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser TyrSer Ile 540
Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu TyrGly Val 560
Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn ThrLys Glu 580
Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn AlaGly Ser 600
Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val PheCys Asp 620
Thr Met Asn Ser Arg Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp IlePhe Asn 640
Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser ValIle Thr 660
Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser AsnLys Asn 680
Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys GlyVal Asp 700
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Cys Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys SerLeu Tyr 720
Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser AspGlu Phe 740
Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe IleArg Lys 760
Ser Asp Glu Leu Leu Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala TyrVal Arg 780
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 792

Claims (6)

1.一种由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白，命名为CTA1-DD-F，其特征在于，所述的融合蛋白的CTA1-DD-F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白CTA1-DD-F由SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列编码。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白CTA1-DD-F由SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列通过大肠杆菌表达系统表达、纯化后获得。
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)融合蛋白CTA1-DD-F由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成，CTA1-DD-F基因由CTA1-DD和F基因通过融合PCR获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，应用EcoR1和Not1两个酶切位点连在pET28a载体上，得到的表达质粒命名为pET28a-CTA1-DD-F；
(2)构建好的表达质粒pET28a-CTA1-DD-F转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性LB培养基平板，过夜培养，挑取生长良好的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期(OD6000.4～0.8)，向培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM，继续培养；
(3)收集大肠杆菌液，离心，弃上清，留沉淀；用纯水重悬沉淀后超声重悬液，收集包涵体沉淀，弃上清，用纯水清洗包涵体三遍；用平衡液溶解包涵体后离心，留上清样品过柱，获得纯化的融合蛋白CTA1-DD-F；其中，所述的平衡液为含有8M尿素，16mM Na2HPO4，4mMKH2PO4，0.5mM NaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
5.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白在制备人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗中的用途。
6.一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有权利要求1-3任一项所述的由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白。
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