CN106119287A

CN106119287A - 一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白的重组载体及方法

Info

Publication number: CN106119287A
Application number: CN201610757052.2A
Authority: CN
Inventors: 彭涛; 许煜华; 卢全占; 马书智; 王弋; 尹海滨; 安鸿
Original assignee: SOUTHERN CHINA UNITED VACCINE INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: SOUTHERN CHINA UNITED VACCINE INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2036-08-29
Also published as: CN106119287B

Abstract

本发明公开了一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的重组载体及方法，重组载体由骨架载体和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表达框构成，呼吸道合胞病毒F蛋白表达框位于载体启动子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之间由2A序列连接。本发明的重组载体，同时表达多个基因，表达的蛋白可以高效自剪切为F2和F1，进而形成F1‑F2同源三聚体。本发明方法可以高效制备得到纯化的F蛋白，得到的纯化F蛋白可以作为抗原使用，可以诱导高水平的抗体免疫反应。

Description

一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的重组载体及方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及一种表达RSV F蛋白重组载体及F蛋白制备方法。

背景技术

人呼吸道合胞病毒（RSV）是副粘病毒科、肺炎病毒亚科、肺病毒属的病原性病毒。RSV的基因组是编码11个蛋白的负链RNA分子。RNA基因组与病毒N蛋白紧密关联形成包裹在病毒包膜内的核衣壳。根据G糖蛋白的抗原性的不同，已有A和B两个亚型。RSV主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其他类型的细胞。机体在对抗RSV感染中起主要作用的是细胞免疫，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是清除受病毒感染细胞的关键因素。CD4+T细胞和CD8+T细胞在清除上、下呼吸道内的病毒过程中均能发挥有效的作用。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，共同参与病毒外膜与宿主细胞膜的融合以及细胞培养过程中合胞体的形成，其中G、F为两个重要的膜蛋白成分。G蛋白不仅与病毒和细胞的黏附有关，而且RSV病毒的A、B两亚型的主要差异也存在于G蛋白中，并且G蛋白在亚型间及亚型内变异极大，是RSV逃逸机体免疫攻击的重要手段。F蛋白与病毒进入细胞并形成特征性的合胞体有关，还具有促使RSV在感染细胞间传播及溶血的作用。

F和G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原。但G蛋白具有较高的亚型特异性及变异性，故不宜制成疫苗，与之相比F蛋白的抗原性比较稳定，较少变异，并且F蛋白是诱导机体产生免疫保护的主要蛋白，它诱导产生的抗体能保护机体免受RSV A、B两亚型病毒的侵袭，而G蛋白抗体仅对同亚型病毒提供保护，所以F蛋白更有研究价值。

虽然已研制过多种形式的RSV疫苗，如福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)、亚单位疫苗和减毒疫苗、冷适应株疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗等，但至今尚无可用于预防RSV感染的疫苗问世。同时，由于FI-RSV失败的阴影及RSV疫苗研制中面临的动物模型局限、免疫接种人群免疫系统发育不成熟、母传抗体干扰和存在两种不同抗原亚型等诸多复杂问题，使学术界及产业界一度等对成功研制出有效的RSV疫苗产生了怀疑和悲观情绪。不过，随着阿斯利康医学免疫公司和美国生物制药Novavx公司疫苗候选物的研发，特别是Novavx公司的F蛋白纳米粒子基因工程呼吸道合胞病毒疫苗已完成Ⅰ、Ⅱ期临床实验，证明肌肉注射该疫苗的耐受性良好，具有较好的免疫原性，因此研究F蛋白基因工程疫苗具有广阔的前景。

RSV F蛋白由mRNA翻译为约574个左右氨基酸的蛋白，称为F0。F0的翻译后加工包括通过内质网中的信号肽酶移除N端信号肽。转运高尔基体内的细胞蛋白酶（特别是弗林蛋白酶（furin））还在两个位置（约109/110和约136/137）切割F0。该切割导致短干扰序列移除并产生两种仍彼此相关的亚基，称为F1（约50kDa，C端约为残基137-574）和F2（约20kDa，N端，约为残基1-109）。F1在N端含疏水性融合肽以及2个两性七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜结构域。3个F1-F2异源二聚体在病毒粒子中组装为F1-F2同源三聚体。由于RSV F蛋白加工、构造和重折叠的复杂性，比较难以获得纯化的、均质的免疫原性制备物。

RSV F0 在形成具有免疫原性的抗原物之前需要弗林蛋白酶的酶切，在昆虫细胞表达系统中弗林蛋白酶表达量不足或者活性不高，导致F0不能完全被切割为F2和F1，影响F1-F2同源三聚体的形成，严重限制了F蛋白的表达效率。

此外，F蛋白的纯化也是极为重要的，现有技术缺乏高效的F蛋白纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达RSV F蛋白的重组载体及方法，该表达载体表达的F蛋白在不需要弗林蛋白酶存在的情况下高效剪切为F2和F1。

本发明所采取的技术方案是：

一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体，由骨架载体和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表达框构成，呼吸道合胞病毒F蛋白表达框位于载体启动子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之间由2A序列连接；2A序列为编码含D-X-E-X-N-P-G-P氨基酸序列的核酸序列。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体中，呼吸道合胞病毒F蛋白表达框的序列根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体的宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体的骨架载体选自pFastBac^TM-1和pFastBac^TM-dual。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体的F1蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体的F2蛋白基因序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体的2A序列如SEQ ID NO：3所示。

一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，包括如下步骤：

1)使用上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体转化大肠杆菌DH10 multiBac感受态细胞，培养后提取重组大肠杆菌DH10 multiBac的质粒，获得重组杆状病毒载体；

2)使用重组杆状病毒载体转染Sf9细胞，培养后得到包含编码F蛋白基因的重组杆状病毒；

3)使用包含编码F蛋白基因的重组杆状病毒感染宿主细胞，培养至产生足够的F蛋白；

4)收集宿主细胞并使用裂解液裂解细胞，裂解液的组成为25 mM Tris-Cl (pH 8.0)、50 mM NaCl, 0.1 % NP9；

5)去除细胞碎片，得到的清液分别经过强阴离子柱EMD TMAE、外源凝集素亲和介质GST-Sepharose 4B和强阳离子EMD SO3纯化，得到纯化的呼吸道合胞病毒F蛋白。

本发明的有益效果是：

本发明的重组载体，同时表达多个基因，表达的蛋白可以高效自剪切为F2和F1，进而形成F1-F2同源三聚体。

本发明方法可以高效制备得到纯化的F蛋白，得到的纯化F蛋白可以作为抗原使用，可以诱导高水平的抗体免疫反应。

附图说明

图1是Bac- F2-2A-F1免疫荧光和Western blot分析图；

图2是Bac- F2-2A-F1 F蛋白SDS-PAGE和Western blot分析图；

图3是F蛋白免疫小鼠血清中和RSV A2中和抗体分析；

图4是不同优化序列的蛋白表达情况；

图5是不同培养基对蛋白表达情况的影响。

具体实施方式

下面结合具体实验，进一步说明本发明的技术方案。

1主要材料

病毒：RSV long RSV A2；

细胞：昆虫细胞Sf9。

1.2 主要试剂

PremerStar DNA聚合酶（大连宝生物）；

Bac重组杆状质粒提取试剂盒（Omiga生物）；

卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG（北京鼎国）；

LB培养基（Sigma）；

Grace's培养基、FBS（Gibco)；

Cellfectinll脂质体（Sigma）；

Palivizumab单抗；

HRP羊抗人二抗（Invitrogen）；

Donkey Anti-human Alexa Fluor 488(Invitrogen)。

表达呼吸道合胞病毒F蛋白载体的构建

根据宿主细胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，得到优化后的RSV F1蛋白和F2蛋白的基因序列，分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

设计引物，将F1蛋白和F2蛋白的基因序列通过2A序列（SEQ ID NO：3）（对应的核酸序列为：SEQ ID NO：4）连接，置于pFastBac 1质粒的Ppolh启动子下，获得穿梭载体pFastBacTM1-F2-2A-F1，即表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体。

类似的，可以使用其他骨架载体构建得到表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体。

呼吸道合胞病毒F蛋白的表达纯化

1)将构建得到的穿梭载体pFastBacTM1-F2-2A-F1通过Invitrogen的Bac-to-Bac 系统，转化大肠杆菌DH10 multiBac，培养后，筛选提取阳性重组大肠杆菌DH10 multiBac的质粒，获得重组杆状病毒载体；

2)将上一步获得的重组杆状病毒载体转染Sf9细胞获得相应的第一代重组杆状病毒，即重组呼吸道合胞杆状病毒，分别命名为Bac- F2-2A-F1-V1，以MOI=0.1对各病毒进行连续扩增，获得的第三代病毒Bac- F2-2A-F1-V3；

3)将Bac- F2-2A-F1-V3以MOI=1感染Sf9悬浮细胞，样品表达2L，培养4天待细胞完全病变后收获细胞沉淀；

4)将收获的细胞以10ml/mg加入裂解液25mM phosphate buffer，pH 8.0；50mM NaCl；0.1% NP9；在冰上均匀搅拌2h，然后将裂解产物使用JA-14转子（Beckman）高速离心收集上清，再将上清液经分别经强阴离子柱EMD TMAE，外源凝集素亲和介质GST-Sepharose 4B和强阳离子EMD SO3纯化即可获得呼吸道合胞病毒F蛋白。

重组杆状病毒蛋白表达Western blot分析

按照Invitrogen说明书，将上述制得的Bac- F2-2A-F1-V3重组杆状病毒以MOI=1感染Sf9悬浮细胞，以SF900-Ⅱ为悬浮培养基，培养4天，收集细胞和上清，取细胞和上清样品进行10%的SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭过夜，PBST漂洗5次，以1:4000稀释一抗Palivizumab，室温孵育2h，PBST稀释5次，HRP标记的二抗羊抗人室温孵育1.5h，PBST漂洗5次，利用超敏发光液（A液25ml、B液25ml）进行压片显色。检测结果如图1（B）所示，检测到的目的蛋白为F0和F1蛋白（Palivizumab中和位点集中在F1上，F2检测不到）。

F蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析，检测结果如图2所示， SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明，F蛋白纯度能达到90%以上。

呼吸道合胞病毒F蛋白疫苗效力分析

疫苗的制备和免疫程序

稀释制备的呼吸道合胞病毒F蛋白，并分别加入1/10体积的AL(OH)₃佐剂（1000mg/ml）混合，使得蛋白浓度为10µg/ml，利用以上纯化的F蛋白对六周龄的BALB/c母鼠分别在0， 28天免疫两次，每次每只分别免疫20μg、5μg、1μg，。同时设置同样处理的未感染病毒的Sf9细胞作为阴性对照，每组免疫10小鼠。5周后小鼠眼球采血，收集血清，-80℃分装保存。

免疫小鼠血清中和抗体滴度

取各组小鼠血清样品，56℃灭活30min，用无血清的RPMI-1640培养基成倍比稀释。

F-20μg、F-5μg和F-1μg免疫小鼠血清中和RSV A2株，将RSV A2用1640培养基稀释到100 PFU/100μl。稀释后的病毒液、样品各取100μl，混合均匀，在37℃细胞培养箱放置2小时。吸去Hep-2细胞培养上清，取200μl混合液加入到6孔板Hep-2细胞中，加入阴性对照，放入37℃继续培养2h。每孔加入4 ml 1%的甲基纤维素，放置于CO₂培养箱中5天，去培养基，结晶紫染色，统计出斑情况，能使空斑数减少50%的血清稀释度判定为血清的中和抗体滴度，计算各个样品的中和抗体滴度。

实验结果如图3所示，本发明制备的F蛋白1μg、5μg和20μg免疫小鼠血清中和RSVA2都可以诱导1：256左右的中和效价，免疫剂量达到1μg以后，中和效价没有明显变化，说明当免疫剂量达到1ug时，中和效价达到最高；上述结果说明，本发明制备的呼吸道合胞病毒F蛋白诱导产生的抗体分别对RSV A2有较强的中和作用，因此本发明制备的呼吸道合胞病毒F蛋白可作为预防呼吸道合胞病毒感染相关疾病的疫苗。

密码子优化对F蛋白表达量的影响

按照上述表达呼吸道合胞病毒F蛋白载体的构建、呼吸道合胞病毒F蛋白的表达纯化的操作，使用现有通用方法优化得到的密码子序列F1’（ SEQ ID NO：5）替换SEQ ID NO：1所示的RSV F1蛋白，F2’（SEQ ID NO：6）替换SEQ ID NO：2所示的F2蛋白的基因序列，2A’替换SEQID NO：4所示的2A序列，检测其表达情况。检测结果如图4所示，图中，1为常规方法优化后的密码子序列的表达结果，2为本发明方法优化后的表达结果，从图中可以看出，本发明方法优化的密码子序列具有更高的表达活性，表达出来的F蛋白是常规方法优化序列的近3倍。

SF900-Ⅱ培养基添加不同成分对F蛋白表达量的影响

按上述呼吸道合胞病毒F蛋白的表达纯化的方法，分别在SF900-Ⅱ培养基添加不同的成分，其中，组（1）添加SF900-Ⅱ培养基质量的0.3%聚醚F-68，并添加终浓度为5g/L葡萄糖；组（2）添加SF900-Ⅱ培养基质量的0.3%聚醚F-68；组（3）为对照组，为SF900-Ⅱ培养基。实验结果如图5所示。从较长可以看出，组（1）的F蛋白表达量显著高于其他两组，说明其可以有效促进F蛋白的表达。

<110> 广东华南联合疫苗开发院有限公司

<120> 一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的重组载体及方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 1

ttcctgggat tcctgctggg agtcggaagc gcaattgcgt ctggagtggc tgtttccaag 60

gtgctccact tggagggtga agtcaacaag atcaaatcag ctctcttgag tacaaacaag 120

gccgtggtct cattgagtaa cggtgtctcg gttctgacct ccaaggtgct ggacctcaaa 180

aactacattg ataagcagct gctccccatc gttaacaaac aaagctgctc catttctaac 240

atcgagactg tgatcgaatt ccagcaaaag aacaacaggt tgctggagat cacaagagaa 300

ttctcggtga acgctggagt taccactccc gtctccacat acatgctgac gaactcagag 360

ctcttgagtc tcattaacga catgccaatc accaacgatc agaagaaatt gatgtcgaac 420

aacgtccaaa tcgttagaca gcaatcgtac tccatcatgt caatcattaa ggaggaagtg 480

ctggcttacg ttgtgcagtt gccactgtac ggtgtcatcg acaccccgtg ctggaaactc 540

catactagcc ctttgtgtac aacgaacaca aaggaaggct ctaacatctg cctgacccgc 600

actgaccgtg gatggtactg tgataacgct ggtagcgtct ctttcttccc acaggccgag 660

acttgcaagg tccaaagcaa ccgcgttttc tgtgacacca tgaactcgct cactttgccg 720

tccgaagtga acctctgcaa cgtcgacatc ttcaacccta agtacgattg taaaatcatg 780

actagcaaga cagacgtttc cagctctgtg attacctcac tgggcgctat cgtgagttgc 840

tacggaaaga cgaaatgtac cgcctctaac aaaaaccgtg gtatcattaa gactttcagc 900

aacggctgcg actacgtttc taacaagggt gtggatacag tgagtgtcgg caacacgctc 960

tactacgtca acaagcagga gggaaaatct ttgtacgtta agggtgaacc gatcattaac 1020

ttctacgacc ctctggtctt cccctcagac gagttcgatg catcaatcag tcaggttaac 1080

gaaaaaatca accaatcact cgcgttcatc aggaagagtg atgagctgct ccacaacgtg 1140

aacgctggca agtctaccac taacattatg atcacaacga tcattatcgt gattatcgtc 1200

attttgctgt cactgatcgc agtgggcctc ttgctgtact gcaaagcgag aagtactcct 1260

gtcacactga gcaaggacca actctctgga attaacaaca tcgccttctc caactaa 1317

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 2

atggagctgc tgattctgaa agccaacgca attactacga ttctcaccgc tgtcacattc 60

tgcttcgcat ctggtcaaaa cattactgag gaattctacc agagtacctg ctcggcagtc 120

tccaagggct acctgagcgc gctccgtacg ggatggtaca cctccgtgat cactatcgag 180

ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaac ggcactgacg ccaaggttaa attgatcaag 240

caagagctgg ataagtacaa aaacgcagtg acagaactgc agctgctcat gcaatctact 300

cctgctacca acaacagggc aagg 324

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 5

<211> 1317

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 5

ttcctgggtt tcctgctggg tgttggttct gctatcgctt ctggtgttgc tgtttctaaa 60

gttctgcacc tggaaggtga agttaacaaa atcaaatctg ctctgctgtc taccaacaag 120

gcggttgtga gcctgtcgaa tggtgtcagc gttctgacct ctaaagttct ggatctgaaa 180

aactacatcg ataaacagct gctgccaatc gttaacaaac agtcttgttc tatctctaac 240

atcgaaaccg ttatcgaatt ccagcagaaa aacaaccgtc tgctggaaat cacccgtgaa 300

ttctctgtta acgctggtgt tactacccca gtaagcacct acatgctgac caactctgaa 360

ctgctgtctc tgatcaacga tatgccaatc accaacgatc agaaaaaact gatgtctaac 420

aacgttcaga tcgttcgtca gcagtcttac tctatcatgt ctatcatcaa agaagaagtt 480

ctggcttacg ttgttcagct gccactgtac ggtgttatcg ataccccatg ttggaaactg 540

cacacctctc cactgtgtac caccaacacc aaagaaggtt ctaacatctg tctgacccgt 600

accgatcgtg gttggtactg tgataacgct ggttctgttt ctttcttccc acaggctgaa 660

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acctctaaaa ccgatgtttc ttcttctgtt atcacctctc tgggtgctat cgtttcttgt 840

tacggtaaaa ccaaatgtac cgcttctaac aaaaaccgtg gtatcatcaa aaccttctct 900

aacggttgtg attacgtttc taacaaaggt gttgataccg tttctgttgg taacaccctg 960

tactacgtta acaaacagga aggtaaatct ctgtacgtta aaggtgaacc aatcatcaac 1020

ttctacgatc cactggtttt cccatctgat gaattcgatg cttctatctc tcaggttaac 1080

gaaaaaatca accaatcgct ggcgttcatc cgtaaatcgg atgaactgct gcacaacgtt 1140

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gttaccctgt ctaaagatca gctgtctggt atcaacaaca tcgctttctc taactaa 1317

<210> 6

<211> 324

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 6

atggaactgc tgatcctgaa agctaacgct atcaccacca tcctgaccgc tgttaccttc 60

tgtttcgctt ctggtcagaa catcaccgaa gaattctacc agtctacctg ttctgctgtt 120

tctaaaggtt acctgtctgc tctgcgtacc ggttggtaca cctctgttat caccatcgaa 180

ctgtctaaca tcaaagaaaa caaatgtaac ggtaccgatg ctaaagttaa actgatcaaa 240

caggaactgg ataaatacaa aaacgctgtt accgaactgc agctgctgat gcagtctacc 300

ccagctacca acaaccgtgc tcgt 324

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<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttctggtg ctaccaactt ctctctgctg aaacaggctg gtgatgttga agaaaaccca 60

ggtcca 66

Claims

1.一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的载体，由骨架载体和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表达框构成，呼吸道合胞病毒F蛋白表达框位于载体启动子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F2和F1之间由2A序列连接；2A序列为编码含D-X-E-X-N-P-G-P氨基酸序列的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：呼吸道合胞病毒F蛋白表达框的序列根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：骨架载体选自pFastBac^TM-1和pFastBac^TM-dual。

5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：F1蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：F2蛋白基因序列如SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：2A序列如SEQ ID NO：3所示。

8.一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，包括如下步骤：

使用权利要求1～7任意一项所述的载体转化大肠杆菌DH10 multiBac感受态细胞，培养后提取重组大肠杆菌DH10 multiBac的质粒，获得重组杆状病毒载体；

使用重组杆状病毒载体转染Sf9细胞，培养后得到包含编码F蛋白基因的重组杆状病毒；

使用包含编码F蛋白基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞，培养至产生足够的F蛋白；

收集宿主细胞并使用裂解液裂解细胞；

去除细胞碎片，得到的清液分别经过强阴离子柱EMD TMAE、外源凝集素亲和介质GST-Sepharose 4B和强阳离子EMD SO3纯化，得到纯化的呼吸道合胞病毒F蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：培养转染后Sf9细胞的培养基为添加有质量分数为0.3%聚醚F-68的SF900-Ⅱ培养基，或添加有质量分数为0.3%聚醚F-68和5g/L葡萄糖的SF900-Ⅱ培养基。

10.根据权利要求8呀9所述的方法，其特征在于：裂解液的组成为25 mM Tris-Cl (pH8.0)、50 mM NaCl, 0.1 % NP9。