CN104853769A - Rsv f融合前三聚体 - Google Patents

Rsv f融合前三聚体 Download PDF

Info

Publication number
CN104853769A
CN104853769A CN201380060643.9A CN201380060643A CN104853769A CN 104853769 A CN104853769 A CN 104853769A CN 201380060643 A CN201380060643 A CN 201380060643A CN 104853769 A CN104853769 A CN 104853769A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rsv
leu
ser
asn
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380060643.9A
Other languages
English (en)
Inventor
A.卡尔菲
K.斯万逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of CN104853769A publication Critical patent/CN104853769A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

公开了含有RSV F胞外域多肽的复合物和用于制备所述复合物的方法。所述RSV F胞外域多肽可以呈融合前形式。

Description

RSV F融合前三聚体
相关申请
本申请要求2012年11月20日提交的美国专利申请号61/728,498以及2013 年10月11日提交的美国专利申请号61/890,086的权益。上述申请的完整教导通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2013年11月18日生成，名为PAT055275-WO-PCT_SL.txt，大小为76,359字节。
发明背景
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺炎病毒属 (Pneumovirus)中的包膜不分节负链RNA病毒。其为儿童出生后第一年中儿童间细支气管炎和肺炎的主要原因。RSV还引起重复感染，包括严重下呼吸道疾病，其可在任何年龄发作，特别是在老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人中。
为了感染宿主细胞，副粘病毒诸如RSV，像其它包膜病毒诸如流感病毒和HIV，需要病毒膜与宿主细胞的膜融合。对于RSV，保守融合蛋白(RSV F)通过偶联不可逆的蛋白重折叠和膜并置来融合病毒和细胞膜。在基于副粘病毒研究的现有模型中，所述RSV F蛋白最初折叠为亚稳态“融合前”构型。在细胞进入过程中，所述融合前构型经历重折叠且构型变化为其稳定的“融合后”构型。
RSV F蛋白由mRNA翻译为约574个氨基酸的蛋白，称为F0。F0的翻译后加工包括通过内质网中的信号肽酶去除N端信号肽。反式高尔基体中的细胞蛋白酶 (特别是弗林蛋白酶(furin))还在两个位置(约109/110和约136/137)切割F0。该切割导致短干扰序列的去除并且产生两个保持彼此结合的亚单位，称为F1(~50kDa；C 端；约残基137-574)和F2(~20kDa；N端；约残基1-109)。F1在其N端含有疏水性融合肽和还有两个两亲性七肽重复区域(HRA和HRB)。HRA接近所述融合肽，HRB接近所述跨膜结构域。三个F1-F2异源二聚体在病毒颗粒中组装为F1-F2同源三聚体。
现在还未获得但期望针对RSV感染的疫苗。生产疫苗的一种可能方法是基于纯化的RSV F蛋白的亚单位疫苗。然而，对于该方法，期望纯化的RSV F蛋白是随时间稳定的单一形式和构型，在疫苗批次之间一致且方便纯化。
RSV F蛋白可被截短，例如通过缺失跨膜结构域和胞质尾，以允许其表达为可以可溶的胞外域。此外，尽管RSV F蛋白最初翻译为单体，但该单体被切割且组装为三聚体。当RSV F蛋白为切割的三聚体形式时，暴露所述疏水性融合肽。不同三聚体例如可溶性胞外域三聚体上的所述暴露的疏水性融合肽可彼此结合，导致形成玫瑰花结型。所述疏水性融合肽也可与例如来自用于表达重组可溶RSV F蛋白的细胞的脂质和脂蛋白结合。由于RSV F蛋白加工、结构和重折叠的复杂性，难以获得纯化的、均质的免疫原性制备物。
RSV F的融合前形式含有在融合后形式上不存在的表位。参见，例如，Magro, M.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(8):3089-94 (2012))。 因此，对于疫苗，稳定的融合前形式通常被认为是抗原性上更期望的。已经使用GCN-稳定化的一般方案产生了几种RSV F构建体。然而，在每种情况下，无论HRB是否用GCN、工程改造的二硫键或设计以加强三聚体HRB疏水核心相互作用的点突变稳定化，结果是无法从细胞有效表达和输出的蛋白。制备具有对其弗林蛋白酶切割位点的突变以防止融合肽释放的融合后RSV F的尝试导致RSV F无法形成与在充分研究的副流感病毒F中观察到的三聚体类似的三聚体。
因此，需要改善的RSV F蛋白组合物和用于制备RSV F蛋白组合物的方法。
发明概述
本发明涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽(每个包含内源HRA区域)，和至少一个寡聚化多肽，其中三个胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽形成六螺旋束，条件是RSV F多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。任选地，每个RSV F胞外域多肽可以包含HRB区域，且每个寡聚化多肽可以包含寡聚化区域。六螺旋束可以包含每个RSV F胞外域的HRB区域和每个寡聚化肽的寡聚化区域。寡聚化区域可以包含RSV F HRA氨基酸序列。任选地，所述复合物可以由三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽组成。所述寡聚化多肽中的一个或多个可以进一步包含可操作连接至寡聚化区域的功能性区域。所述功能性区域可以独立地选自免疫原性载体蛋白、抗原、颗粒形成多肽、脂质和可以使寡聚化多肽与脂质体或微粒结合的多肽。所述功能性区域可以是抗原。所述抗原可以是RSV G。任选地，所述 RSV F胞外域多肽中的一个或多个是未切割的RSV F胞外域多肽。任选地，所述 RSV F胞外域多肽中的一个或多个是切割的RSV F胞外域多肽。任选地，所述RSV F胞外域多肽中每个含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点。任选地，所述RSV F胞外域多肽中的一个或多个可以包含WO 2011/008974(其整体通过引用并入本文)中先前描述的氨基酸序列或突变。所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列可以包含选自以下的序列： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中省略信号肽和/或HIS标签的任何上述物质。所述RSV F胞外域多肽中的至少一个可以是包含C端6螺旋束形成部分的重组多肽。C端六螺旋束形成部分可以包含包膜病毒的融合蛋白的七肽重复区域。所述七肽重复区域可以是来自包膜病毒的I型融合蛋白的HRA或HRB。例如，所述七肽重复区域可以选自RSV F HRA、RSV F HRB和HIV gp41 HRA。任选地，所述六螺旋束包含三个重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分和每个寡聚化肽的寡聚化区域。所述RSV F胞外域多肽可以呈融合前构型。所述RSV F复合物的特征可在于当在负染电子显微图中观察时的圆形。所述RSV F复合物可以包含RSV F的融合后形式上不存在的融合前表位。
本发明还涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽(每个含有内源HRA区域和内源HRB区域)，所述RSV F胞外域多肽中的至少一个进一步包含C端6螺旋束形成部分，其中所述复合物的特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源HRB区域形成的六螺旋束。
本发明还涉及用于产生呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物的方法，所述方法包括：a) 提供RSV F蛋白胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽，由此产生RSV F复合物，其中所述RSV F胞外域多肽中的三个和所述寡聚化多肽中的至少一个形成六螺旋束，条件是所述RSV F胞外域多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。(a)中提供的RSV F胞外域多肽可以是未切割的RSV F胞外域多肽。(a)中提供的RSV F胞外域多肽可以含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点。(a)中提供的RSV F胞外域多肽可以是纯化的单体。任选地，所述方法可以进一步包括(c) 用蛋白酶切割产生的复合物中的RSV F蛋白胞外域多肽。(a)中提供的RSV F蛋白胞外域多肽可以在昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母细胞、四膜虫细胞或其组合中表达。每个RSV F胞外域多肽可以包含HRB区域，且每个寡聚化多肽可以包含寡聚化区域。每个RSV F胞外域多肽可以包含HRB区域，且每个外源寡聚化多肽可以包含寡聚化区域。所述六螺旋束可以包含每个RSV F胞外域多肽的HRB区域和每个寡聚化肽的寡聚化区域。每个寡聚化区域可以包含RSV F HRA氨基酸序列。所述复合物可以由三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽组成。所述寡聚化多肽中的一个或多个可以进一步包含可操作连接至寡聚化区域的功能性区域。步骤(a)中提供的所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列可以包含选自以下的序列： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中省略信号肽和/或HIS标签的任何上述物质。任选地，所述RSV F胞外域多肽中的至少一个可以是包含C端6螺旋束形成部分的重组多肽。任选地，所述C端6螺旋束形成部分可以包含包膜病毒的融合蛋白的融合区域的七肽重复区域。所述七肽重复区域可以是来自包膜病毒的I型融合蛋白的HRA或HRB。例如，所述七肽重复区域可以是RSV F HRA、RSV F HRB或HIV gp41 HRA。所述六螺旋束可以包含三个重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分和每个寡聚化肽的寡聚化区域。产生的复合物中的RSV F胞外域多肽可以呈融合前构型。产生的复合物中的RSV F胞外域多肽的特征可在于当在负染电子显微图中观察时的圆形。产生的复合物中的RSV F胞外域多肽可以包含RSV F的融合后形式上不存在的融合前表位。
本发明还涉及用于产生呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物的方法，所述方法包括：a) 提供含有C端6螺旋束形成部分的RSV F蛋白胞外域多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽，由此产生RSV F复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽，且特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源性HRB区域形成的六螺旋束。
本发明还涉及通过任何本文所述的方法产生的呼吸道合胞病毒(RSV F)复合物。
本发明还涉及包含如本文所述的呼吸道合胞病毒(RSV F)复合物的免疫原性组合物。
本发明还涉及在受试者中诱导针对RSV F的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫原性组合物施用于受试者。
附图简要说明
图1A是野生型RSV F蛋白的示意图，其显示信号序列或信号肽(SP)、p27接头区、融合肽(FP)、HRA结构域(HRA)、 HRB结构域(HRB)、跨膜区(TM)和胞质尾(CT)。所述胞外域的C端边界可变化。图1B是其中已经去除跨膜结构域和胞质尾且在C端已经添加任选的HIS6标签(SEQ ID NO:41)的RSV F胞外域构建体的总体示意图。它描述与图1A的示意图共有的特征和任选的HIS6标签(HIS标签) (SEQ ID NO:41)。弗林蛋白酶切割位点存在于氨基酸位置109/110和136/137。图1C显示RSV F(野生型)的氨基酸100-150的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)和其中一个或两个弗林蛋白酶切割位点和/或融合肽区域突变或缺失的几种蛋白(Furmt-SEQ ID NO:3；Furdel-SEQ ID NO:4；Furx-SEQ ID NO:5；Furx R113Q, K123N, K124N-SEQ ID NO:6；Furx R113Q, K123Q, K124Q-SEQ ID NO:7；Delp21 furx-SEQ ID NO:8；Delp23 furx-SEQ ID NO:9；Delp23 furdel-SEQ ID NO:11；N端弗林蛋白酶-SEQ ID NO:12；C端弗林蛋白酶-SEQ ID NO:13；融合肽缺失1-SEQ ID NO:26；和Xa因子-SEQ ID NO:14)。在图1C中，符号“-”表明该位置的氨基酸缺失。为了清楚起见，图1A、1B和1C中的残基编号涉及野生型A2毒株RSV F，从N端信号肽开始，且其在含有氨基酸缺失的构建体中没有改变。
图2A-2D显示来自RSV的几种毒株的F蛋白氨基酸序列的比对。使用Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16(22):10881-10890公开的算法获得比对，其使用默认参数(Blossum 62符号比较表，缺口开放罚分：12，缺口延伸罚分：A2，毒株A2的 F蛋白(登录号AF035006) (SEQ ID NO:27)；CP52，CP52毒株的F蛋白(登录号 AF013255)(SEQ ID NO:28)；B，B毒株的F蛋白(登录号AF013254)(SEQ ID NO:29)；long，long毒株的F蛋白(登录号AY911262)毒株(SEQ ID NO:30)，和 18537毒株，18537毒株的F蛋白(登录号Swiss Prot P13843) (SEQ ID NO:31)。还显示F蛋白序列的共有序列(SEQ ID NO:24)，其具有以下特殊符号的定义： “!” 是I和V中任一者，“$”是L和M中任一者，“%”是F和Y中任一者，且“#”是N、D、Q、E、B和Z中任一者。这些定义获得自Corpet核酸研究参考(Corpet Nucleic Acids Research)中提到的MultAlinTM软件。
图3是示意图，其显示体外三聚化过程，由此表达和纯化含有HRB(胞外域肽)的RSV F单体溶液，然后与HRA肽(寡聚化肽)混合，诱导六分子复合物的形成，所述六分子复合物含有来自F蛋白的HRB和RSV单体/三聚体“头”形式的HRA肽以及人工6螺旋束(A、B和C)。纯化三聚体，并且可以任选地使用胰蛋白酶以切割可切割单体，其可允许形成融合前F的球状头部 (D和E)。
图4是显示在HRA肽存在的情况下三聚化的RSV F单体(呈融合前构型)的假设模型的图。在左边，本发明人表明在PIV5融合前结构的单链后建模的单体融合前前体的假设结构。朝向分子底部延伸的HRB螺旋是可能非结构化的，并且为清楚起见在本文中描述为螺旋。箭头表明以RSV F单体的质量的约五倍过量添加的RSV F HRA肽的引入。在右边，本发明人表明三聚化单体的假设结构。三聚体可能通过分子中的球状头部中的链(上)和新形成的6螺旋束(下)之间的接触进行维持。
发明详述
本发明人发现，产生同源三聚体的形式的重组RSV F多肽，当它们在病毒颗粒上出现时，需要切割RSV F多肽，并且当未切割多肽时，形成RSV F多肽单体。当体内切割RSV F胞外域时，蛋白形成结合细胞碎片的三聚体，使得纯化困难。
本发明人已经开发体外方法，其使用寡聚化肽或插入的寡聚化部分，以产生RSV F复合物，其中寡聚化多肽或插入的寡聚化部分中的所有或部分与RSV F多肽的部分(例如，HRB、HRA和插入序列)形成六螺旋束。因此，在一些方面，本发明涉及可溶性RSV F多肽复合物，其含有三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽。如本文所述，所述复合物是稳定的，并且可以方便地以商业规模生产。稳定的复合物能够产生免疫原性组合物，其中所述蛋白具有降低的聚集或降解的倾向，当将所述组合物施用于受试者时，其提供更可预测的免疫应答。在一些实施方案中，所述复合物中的RSV F胞外域的结构呈融合前构型。所述融合前构型的表位可能够更好地引发可以识别且中和天然病毒颗粒的抗体。本发明还涉及用于产生此类复合物的方法、包含所述复合物的免疫原性组合物和使用所述复合物和组合物的方法。
定义
RSV F蛋白的“融合后构型”是三聚体，其特征在于存在包含3个内源HRB区域和3个内源HRA区域的六螺旋束。融合后构型特征进一步在于当在负染电子显微图中观察时的圆锥形和/或缺乏融合前表位。参见，例如，Magro, M.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(8):3089-94 (2012))。
RSV F蛋白的“融合前构型”是三聚体，其中所述内源HRA区域不与内源HRB区域相互作用以形成六螺旋束。六螺旋束可以融合前构型存在，条件是内源HRA区域不是六螺旋束的部分。融合前构型的特征进一步在于当在负染电子显微图中观察时的圆形(类似于PIV5融合前F结构中所看到的(参见，例如，Yin HS,等人(2006) Nature 439(7072):38-44))和/或融合后构型上不存在的融合前表位。参见，例如，Magro, M.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(8):3089-94 (2012))。
如本文所使用，术语“内源HRA区域”是指在与天然存在的F蛋白的F0形式的氨基酸序列中的HRA区域基本上相同的位置的F多肽中存在的HRA区域。在RSV F蛋白诸如RSV F胞外域多肽或重组RSV F胞外域多肽的情况下，内源HRA区域来自约氨基酸154至约氨基酸206。氨基酸编号基于包括信号肽的RSV F的野生型A2的序列(SEQ ID NO:1)，并且氨基酸位置分配至缺失的残基。例如，如果RSV F的融合肽所有或部分缺失时，缺失的氨基酸将进行编号，使得HRA区域的氨基酸具有与野生型序列中相同的位置编号。
如本文所使用，术语“插入的HRA区域”是指在与天然存在的F蛋白的F0形式的氨基酸序列中的HRA区域不同的位置的F多肽中存在的HRA区域。例如，RSV F多肽可以含有插入的HRA区域，例如位于HRB区域的羧基末端，和内源HRA区域。
如本文所使用，“RSV F胞外域多肽”是指实质上含有成熟RSV F蛋白的胞外部分的 RSV F多肽，其具有或不具有所述信号肽(例如约氨基酸1至约氨基酸524，或约氨基酸22至约氨基酸524)，但缺乏天然存在的RSV F蛋白的跨膜结构域和胞质尾。所述RSV F胞外域多肽包含HRB结构域。
如本文所使用，“切割的RSV F胞外域多肽”是指已经在约101/102至约160/161的一个或多个位置处切割以产生两个亚单位的RSV F胞外域多肽，其中一个亚单位包含F1，另一个亚单位包含F2。
如本文所使用，“C端未切割的RSV F胞外域多肽”是指在约101/102至约131/132 的一个或多个位置处切割且在约132/133至约160/161的一个或多个位置处没有切割以产生两个亚单位的RSV F胞外域多肽，其中一个亚单位包含F1，另一个亚单位包含F2。
如本文所使用，“未切割的RSV F胞外域多肽”是指在约101/102至约160/161的一个或多个位置处没有切割的RSV F胞外域多肽。未切割的RSV F胞外域多肽可以是，例如，单体或三聚体。
如本文所使用，“纯化的”蛋白或多肽是重组或合成生产，或由其天然宿主产生的蛋白或多肽，其已经从重组或合成生产系统或天然宿主的其它组分中分离出，使得相对于组合物中存在的其它大分子组分，所述蛋白的量明显高于粗制备物中存在的量。通常，纯化的蛋白将占制备物中至少约50％的蛋白，更优选制备物中至少约75％、至少约80％、 至少约85％、至少约90％、至少约95％的蛋白。
如本文所使用，“基本上不含脂质和脂蛋白”是指当在SDS PAGE凝胶上观察蛋白和/ 或多肽(例如，RSV F多肽)纯度且使用UV280吸收或BCA分析测量总蛋白含量以及使用磷脂酶C测定(Wako，编号433-36201)测定脂质和脂蛋白含量时，基于质量至少约95％不含脂质和脂蛋白的组合物、蛋白或多肽。
如本文所使用，“改变的弗林蛋白酶切割位置”是指天然存在的RSV F蛋白中约 位置106-109处和约位置133-136处的氨基酸序列，所述序列被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶识别并切割，但在未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中含有一种或多种氨基酸替换、一种或多种氨基酸缺失、或一种或多种氨基酸替换和一种或多种氨基酸缺失的组合，使得含有改变的弗林蛋白酶切割位点的RSV F胞外域多肽分泌自细胞，所述细胞产生在所述改变的弗林蛋白酶切割位点处未切割的所述多肽。
如本文所使用，“寡聚化多肽”是指多肽或多肽缀合物，其是与本文描述的RSV F多肽分离的分子，并且包含寡聚化区域和任选的功能区域。寡聚化区域含有可以结合RSV F胞外域多肽且与RSV F胞外域多肽的相应部分形成六螺旋束的氨基酸序列。例如，当寡聚化多肽包含RSV F HRA氨基酸序列时，它可以与RSV F多肽的内源HRB区域形成六螺旋束。当寡聚化多肽含有寡聚化区域和功能区域时，两个区域可操作地连接，使得寡聚化区域可以与RSV F胞外域多肽形成六螺旋束，并且所述功能区域保留期望的功能活性。
如本文所使用，“C端6-螺旋束形成部分”是指重组RSV F胞外域多肽的部分，其可以形成六螺旋束，且1)位于天然存在的RSV F蛋白的内源HRB区域的C端，且2)没有在天然存在的RSV F蛋白的该位置中发现。在一个实例中，C端6螺旋束形成部分是RSV F的HRA区域，其被插入RSV F的内源HRB区域的C端，其使用或不使用接头序列。C端6-螺旋束形成部分可以与一个或多个寡聚化多肽或与重组RSV F多肽的内源部分形成六螺旋束。
适用于本发明的RSV F蛋白胞外域的特征在本文中参考具体氨基酸进行描述，所述氨基酸由来自A2毒株的RSV F蛋白的序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置标识。RSV F蛋白胞外域可具有来自A2毒株或任何其它期望毒株的F蛋白的氨基酸序列。当使用来自除了A2毒株以外的毒株的F蛋白胞外域时，所述F蛋白的氨基酸编号参考来自A2毒株的F蛋白的编号进行编号，其中根据需要插入缺口。这可通过将任何期望的RSV F蛋白和毒株A2的F蛋白的序列比对来实现，如本文中对于来自A2毒株、CP52 毒株、B毒株、long毒株、和18537毒株的F蛋白所显示。参见图2。优选用Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16(22):10881-10890公开的算法产生序列比对，其使用默认参数(Blossum 62符号比较表，缺口开放罚分：12，缺口延伸罚分：2)。
RSV F糖蛋白
RSV的F糖蛋白通过病毒颗粒包膜和宿主细胞质膜之间的融合指导病毒穿入。其为I型单次跨膜整合膜蛋白，具有四个一般结构域：N端ER-移位信号序列(SS)、胞外域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾(CT)。CT含有单一棕榈酰化的半胱氨酸残基。F蛋白的序列在RSV分离株之间高度保守，但不断进化(Kim等人 (2007) J Med Virol 79: 820-828)。不像大多数副粘病毒，RSV中的F蛋白可以介导进入和多核体形成，而不依赖于其它病毒蛋白(在其它副粘病毒中，除了F以外通常需要HN)。
hRSV F mRNA被翻译为称作F0的574个氨基酸前体蛋白，其在N端含有信号肽序列，该序列在内质网中由信号肽酶去除。反式高尔基体中细胞蛋白酶(具体为弗林蛋白酶)在两个位置(氨基酸109/110和136/137)切割F0，去除短糖基化插入序列并且产生两个亚单位，称为F1 (~50kDa；C端；残基137-574)和F2 (~ 20kDa；N端；残基1-109)(参见例如图1)。F1在其N端含有疏水性融合肽和还有两个疏水性七肽重复区域(HRA和HRB)。HRA接近所述融合肽，HRB接近所述跨膜结构域(参见例如图1)。所述F1-F2异源二聚体在病毒颗粒中被组装为同源三聚体。
RSV作为单一血清型存在，但具有两种抗原亚组：A和B。所述两组的F糖蛋白在氨基酸序列中约90％相同。所述A亚组、所述B亚组或两组的组合或杂合体可用于本发明。所述A亚组的实例序列为SEQ ID NO:1 (A2毒株；GenBank GI：138251；Swiss Prot P03420)，所述B亚组的实例序列为SEQ ID NO:2 (18537毒株；GI：138250；Swiss Prot P13843)。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2均为574氨基酸序列。A2毒株中的信号肽为氨基酸 1-21，但在18537毒株中，其为1-22。在两个序列中，所述TM结构域来自约氨基酸 530-550，但已经可替代地报道为525-548。
本发明可使用任何期望的RSV F氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1或2具有同一性的序列。通常其将与SEQ ID NO:1或2具有至少 75％同一性，例如与SEQ ID NO:1或2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、 至少97％、至少98％、至少99％同一性。所述序列可以天然存在于RSV中。
优选地，使用所有或部分F蛋白的胞外域，其可包含：
(i)包含SEQ ID NO:1的约氨基酸22-525的多肽；
(ii)包含SEQ ID NO:2的约氨基酸23-525的多肽；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少75％同一性(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)的氨基酸序列的多肽；或
(iv)包含(i)、(ii)或(iii)的片段的多肽，其中所述片段包含至少一种F蛋白表位。所述片段将通常至少约100个氨基酸长，例如至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450个氨基酸长。
所述胞外域可以是有或没有所述信号肽的F0形式，或可包含彼此结合的两种分离的肽链(例如F1亚单位和F2亚单位)，例如所述亚单位可通过二硫键连接。因此，约氨基酸101至约氨基酸161的所有或部分，诸如氨基酸110-136，可不存在所述胞外域。因此所有或部分所述胞外域可包含：
(v)与所述第一多肽链结合的第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链包含与SEQ ID NO:1的约氨基酸22至约氨基酸101或SEQ ID NO:2的约氨基酸23至约氨基酸101具有至少75％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性)的氨基酸序列，且所述第二肽链包含与SEQ ID NO:1的约氨基酸162至约525或SEQ ID NO:2的约氨基酸162至525具有至少75％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、 至少98％、至少99％或甚至100％同一性)的氨基酸序列；
(vi)与所述第一多肽链结合的第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链包含含有SEQ ID NO:1的约氨基酸22至约氨基酸101或SEQ ID NO:2的约氨基酸23至约氨基酸109的片段的氨基酸序列，且所述第二肽链包含SEQ ID NO:1的约氨基酸162至约氨基酸525或SEQ ID NO:2的约氨基酸161至约氨基酸525的片段。所述片段中的一种或两种将包含至少一个F蛋白表位。所述第一肽链中的片段将通常为至少20个氨基酸长，例如至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80个氨基酸长。所述第二肽链中的片段将通常为至少100个氨基酸长，例如至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450个氨基酸长；或
(vii)通过弗林蛋白酶消化(i)、(ii)、(iii)或(iv)可获得的分子。
因此，用本发明使用的氨基酸序列可以天然存在于RSV F蛋白内(例如缺乏TM和CT 的可溶性RSV F蛋白，SEQ ID NO: 1或2的约氨基酸522-574)，和/或其相对天然RSV序列可具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 个)单一氨基酸突变(插入、缺失或取代)。例如，已知突变F蛋白以消除其弗林蛋白酶切割序列，从而防止细胞内加工。在某些实施方案中，所述RSV F蛋白缺乏TM和CT(SEQ ID NO: 1或2的约氨基酸522-574)，并且相对于天然RSV序列含有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个)单一氨基酸突变(插入、缺失或取代)。
RSV F多肽或蛋白可含有防止所述弗林蛋白酶切割位点(即SEQ ID NO:1和2的氨基酸109和136)中的一个或两个处的切割的一个或两个突变。含有此类突变的RSV F胞外域多肽不被产生所述多肽的细胞在体内切割，且作为单体产生。合适的弗林蛋白酶突变的实例包括用 RARK (SEQ ID NO:32)、RARQ (SEQ ID NO:33)、QAQN (SEQ ID NO:34)或IEGR (SEQ ID NO:35)替换SEQ ID NO:1或2的氨基酸残基106-109。或者或此外，可以用RKKK (SEQ ID NO:36)、ΔΔΔR, QNQN (SEQ ID NO:37)、QQQR (SEQ ID NO:38)或IEGR (SEQ ID NO:39)替换SEQ ID NO:1或2的氨基酸残基133-136 。(Δ表明所述氨基酸残基已经缺失。)如果需要，这些突变可与本文所述或本领域已知的其它突变组合，诸如所述p27区域(SEQ ID NO:1或2的氨基酸110-136)中的突变，包括所述p27区域的所有或部分的缺失。
通常，改变未切割的RSV F蛋白胞外域的氨基酸序列以防止在约位置109/110和约位置136/137的弗林蛋白酶切割位置切割，但其含天然存在或插入的蛋白酶切割位置，切割时产生F1亚单位和F2亚单位。例如，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可具有改变的氨基酸序列以防止在约位置109/110和约位置136/137处的弗林蛋白酶切割位点的切割，但其从约位置101至约位置161含有一个或多个天然存在或插入的蛋白酶切割位点。
本领域普通技术人员可容易地设计且设想将允许宿主细胞生产且表达未切割的 RSV F蛋白胞外域多肽的各种具体氨基酸序列，包括没有在约位置109/110和约位置 136/137处的弗林蛋白酶切割位点切割的氨基酸序列。通常，独立地替换或缺失作为约位置109/110和约位置136/137处的弗林蛋白酶切割位点的部分或位于其邻近的一个或多个氨基酸。已知适合于阻止RSV F蛋白胞外域多肽的切割的一些氨基酸取代和缺失。例如，抑制109/110处的切割的取代R108N、R109N、R108N/R109N，抑制136/137处的切割的取代 K131Q或位置131-134的氨基酸的缺失已经描述于Gonzalez-Reyes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:9859-9864 (2001)。已经描述含有氨基酸取代R108N/R109N/ K131Q/R133Q/ R135Q/R136Q的未切割的RSV F胞外域多肽。Ruiz-Arguello等人, J. Gen. Virol.85:3677687 (2004)。如本文描述，导致所述RSV F胞外域多肽以未切割形式从宿主细胞中分泌的额外RSV F蛋白氨基酸序列含有改变的弗林蛋白酶切割位点，例如改变约位置106-109和约位置133-136处的氨基酸序列。所述改变的弗林蛋白酶切割位点在约位置106-109处含有至少一个氨基酸取代或缺失，和在约位置133-136处含有至少一个氨基酸取代或缺失。
类似地，可以容易地设计和设想含有蛋白酶切割位点(例如，天然存在的或插入的)的未切割RSV F蛋白胞外域多肽的各种特定氨基酸序列，当切割时，其产生包含F1的第一亚单位和包含F2的第二亚单位。例如，RSV F蛋白的约位置101至约位置161的氨基酸序列含有胰蛋白酶切割位点，并且可以切割胰蛋白酶切割位点中的一个或更多个，例如，在体外，通过胰蛋白酶切割以产生F1和F2亚单位。如果需要，可以将一个或多个合适的蛋白酶识别位点插入未切割RSV F蛋白胞外域多肽，例如，约位置101至约位置161之间。插入的蛋白酶识别位点可以使用适当的蛋白酶切割以产生F1和F2亚单位。
在具体实施方案中，所述RSV F多肽或蛋白诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的氨基酸残基100-150的序列，或其可溶性胞外域为
RSV F复合物
所述复合物含有RSV F胞外域三聚体，并且其特征在于六螺旋束，其条件是内源性HRA不是六螺旋束的部分。
在一个方面，所述复合物可以含有复合物形式的RSV F胞外域三聚体，其含有三个RSV F胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽。寡聚化多肽含有寡聚化区域或部分，其可以与RSV F胞外域多肽的部分结合以形成六螺旋束。因此，所述复合物含有六螺旋束，其由RSV F胞外域多肽的部分和寡聚化多肽的所有或部分形成。
RSV F胞外域含有能够形成六螺旋束的部分。例如，RSV F胞外域多肽的HRB区域可以与含有RSV F的HRA区域的氨基酸序列的寡聚化多肽形成六螺旋束。
如果需要，本文所述的复合物中存在的一个或多个RSV F胞外域可以是重组RSV F胞外域多肽，其包括插入的C端6螺旋束形成部分。此类重组RSV F胞外域多肽可以使用本领域常规的方法来制备。C端6-螺旋束形成部分可以来自RSV F，但是存在于与所述部分在天然存在的RSV F中出现的位置不同(或除了其以外)的C端位置。在一个实例中，C端6螺旋束形成部分是RSV F的HRA区域。此类重组RSV F胞外域多肽可以与含有RSV F的HRB区域的氨基酸序列的寡聚化多肽形成六螺旋束。或者，C端6-螺旋束形成部分可以是从除了RSV F以外的蛋白获得的外源部分，诸如HIV gp41的HRA区域。许多六螺旋束形成多肽是本领域众所周知的，诸如包膜病毒的I型融合蛋白(诸如RSV F、PIV等)的七肽重复区域(例如，HRA和HRB)。参见，例如，Weissenhorm等人, FEBS Letters 581: 2150-2155 (2007)，表1。
寡聚化多肽包含寡聚化区域，其可以与RSV F多肽的胞外域的部分，例如，HRB或插入的C端6螺旋束形成部分结合，并且由此引起复合物形成。适合于用作寡聚化区域的许多合适的多肽序列是本领域众所周知的，诸如包膜病毒的融合蛋白(诸如RSV F、PIV等)的七肽重复区域(例如，HRA和HRB)。
例如，当RSV F胞外域多肽包含HRB时，寡聚化区域可以含有RSV F HRA的氨基酸序列。类似地，当重组RSV F胞外域多肽包含C端6-螺旋束形成部分(其是RSV F的HRA区域或HIV gp41的HRA区域)，例如，寡聚化区域可以分别是RSV F的HRB区域或HIV gp41的HRB区域。
如果需要，寡聚化多肽可以进一步包含可操作连接至寡聚化区域的功能区域。用于在多肽(即，寡聚化区域)和期望的功能区域(诸如另一种多肽、脂质、合成聚合物)之间产生可操作连接的合适的方法是本领域众所周知的。例如，寡聚化多肽可以是这样的多肽，其中包含寡聚化区域的氨基酸序列和包含功能性区域的氨基酸序列是连续多肽链的组分，其有或没有间隔性接头序列。在一个实施方案中，所述寡聚化多肽可以表达且纯化作为寡聚化肽和额外功能区域的融合体。例如，寡聚化多肽可以包含RSV F HRA区域且融合至RSV G中央结构域，其有或没有间隔性接头序列。此外，两个多肽或一个多肽和另一个分子(例如，脂质、合成聚合物)可以使用多种已知的方法直接或通过接头化学缀合。参见，例如，Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, Academic Press, Inc. 2008。
合适的功能区包括免疫原性载体蛋白、抗原、颗粒形成多肽(例如，病毒颗粒或非感染性病毒样颗粒)、脂质和可以使寡聚化多肽与脂质体或微粒结合的多肽(例如，疏水性肽，诸如跨膜区，或者形成卷曲螺旋的多肽)的所有或部分。当功能区含有免疫原性载体蛋白、抗原、颗粒形成多肽、脂质或可以使寡聚化多肽与脂质体或微粒结合的多肽的部分时，含有的部分足以用于期望的功能。例如，当寡聚化多肽含有免疫原性载体蛋白的部分时，该部分足以改善RSV F复合物的免疫原性。类似地，当寡聚化多肽含有抗原的部分时，该部分足以诱导免疫应答。
合适的免疫原性载体蛋白是本领域众所周知的，并且包括，例如，白蛋白、钥孔血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、rEPA (无毒绿脓假单胞菌ExoProteinA)、不可分型的流感嗜血杆菌蛋白D(NTHiD)、N19多表位等。
合适的抗原是本领域众所周知的，并且包括来自病原体(例如，病毒、细菌或真菌病原体)的任何抗原。示例性抗原包括，例如，RSV蛋白，诸如RSV F和RSV G，HIV蛋白诸如HIV gp41，流感蛋白诸如血细胞凝集素，和副粘病毒蛋白诸如hPIV5、hPIV3或新城疫病毒的融合蛋白。
合适的颗粒形成肽是本领域众所周知的，并且包括，例如，形成病毒颗粒的病毒多肽，诸如来自轮状病毒(VP4和VP7)、诺达病毒、诺如病毒、人乳头瘤病毒(L1和L2))、细小病毒B19(VP1和VP2)、乙型肝炎病毒(核心蛋白)的衣壳蛋白，以及自我装配肽纳米颗粒的单体，例如，如美国专利申请公开号2011/0020378中描述。在一个实施方案中，寡聚化多肽包含可操作连接至自我装配肽纳米颗粒的单体的寡聚化区域，如美国专利申请公开号2011/0020378中描述。
合适的脂质是本领域众所周知的，并且包括，例如，脂肪酸、甾醇、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯和磷脂。此类脂质可以锚定RSV F复合物，其将它们含至脂质体、膜、水包油乳液液滴和其它结构。可以用作寡聚化多肽的功能区的示例性脂质包括肉豆蔻酰基、棕榈酰基、糖磷脂酰肌醇、聚乙二醇化脂质、中性脂质和纳米盘。有利地，肉豆蔻酰基、棕榈酰基和糖磷脂酰肌醇可以通过在合适的宿主细胞中表达编码寡聚化多肽的构建体而体内并入寡聚化多肽。
可以使寡聚化多肽与脂质体或微粒结合的多种合适的多肽可以包括在寡聚化多肽且是本领域众所周知的(参见，例如，WO2010/009277和WO2010/009065)。例如，可以使用疏水性多肽，例如，跨膜区或融合肽，其与脂质体或脂质纳米颗粒结合或插入脂质体或脂质纳米颗粒。形成卷曲螺旋的多肽可用于将寡聚化多肽连接至含有卷曲螺旋形成肽的其它结构，例如，合成的纳米颗粒或脂质体；病毒多肽，或病毒颗粒。在一个实施方案中，寡聚化多肽包含可操作连接至卷曲螺旋形成肽的寡聚化区域，所述卷曲螺旋形成肽可以将复合物结合至自我装配肽单体，如美国专利申请公开号2011/0020378中描述。
在一些实施方案中，本发明是含有三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽的RSV F复合物。所述复合物的特征在于由三个RSV F胞外域多肽中每个的HRB区域和三个寡聚化多肽中每个所有或部分(即，寡聚化区域)形成的六螺旋束。在这种类型的复合物中，每个寡聚化肽的寡聚化区域优选包含RSV F的HRA区的氨基酸序列。
在具体实施方案中，RSV F胞外域多肽是重组的，并且每个包含C端6螺旋束形成部分。这些实施方案中的复合物的特征在于由三个RSV F胞外域多肽中每个的C端6螺旋束形成部分和三个寡聚化多肽中每个的所有或部分(即，寡聚化区域)形成的六螺旋束。
在其它方面，该复合物不包括寡聚化多肽。该方面的复合物含有三个RSV F胞外域多肽，其中至少一个含有C端6螺旋束形成部分。所述复合物的特征在于C端6螺旋束形成部分和RSV F胞外域多肽的内源部分形成的六螺旋束。例如，此类复合物可以含有一个、两个或三个重组RSV F胞外域多肽，其含有C端6螺旋束形成部分，诸如插入的RSV F HRA氨基酸序列。C端6螺旋束形成部分(例如，插入的HRA序列)可以与内源(例如，HRB)区域形成六螺旋束。不希望受任何特定理论束缚，据信， C端6螺旋束形成部分可以在RSV F多肽上折叠回以便与多肽的内源部分相互作用，并且形成六螺旋束。因此，在该方面，可以包括接头序列，以允许C端6螺旋束与多肽的内源部分相互作用并且形成六螺旋束。
所述复合物中的RSV F胞外域多肽中的一个或多个可以是未切割的RSV F胞外域多肽，并且其余可以是切割的RSV F胞外域多肽。在某些具体实施方案中，所述复合物中的RSV F胞外域多肽中每个含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点。
在具体实施方案中，RSV F胞外域多肽的氨基酸序列包含选自以下的序列：SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中省略信号肽和/或HIS标签的任何上述物质。
在更具体的实施方案中，RSV F胞外域多肽的氨基酸序列选自： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)和其中省略信号肽和/或HIS标签的任何上述物质。
在进一步具体实施方案中，对应于野生型RSV F多肽诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的残基100 – 150的RSV F胞外域多肽的氨基酸序列选自： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)和其中省略信号肽和/或HIS标签的任何上述物质。
在具体实施方案中，寡聚化多肽的氨基酸序列选自： SEQ ID NO:16 (RSV HRA，HRA的寡聚化肽)、SEQ ID NO:17 (HRA_短，比RSV HRA略短的寡聚化肽，SEQ ID NO:16)和其中省略GST序列、切割序列和/或接头序列的任何上述物质。在SEQ ID NO:16-17中，普通文本的序列是谷胱甘肽S转移酶(GST)，加下划线的序列是切割序列，加双下划线的序列是接头，并且粗体序列是HRA。
在具体实施方案中，RSV F复合物含有RSV F胞外域多肽和包括功能区的寡聚化多肽，诸如抗原。例如，该寡聚化多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:18(RSV Gb CC HRA短，其中HRA寡聚化序列融合至来自毒株b的RSV G的中央结构域)，SEQ ID NO:19 (RSV Ga CC HRA短，其中HRA寡聚化序列融合至来自毒株a的RSV G的中央结构域)，SEQ ID NO:20 (RSV Gb CC HRB，其中HRB寡聚化序列融合至来自毒株b的RSV G的中央结构域)，SEQ ID NO:21 (RSV Ga CC HRB，其中HRB寡聚化序列融合至来自毒株a的RSV G的中央结构域)，或者其中省略谷胱甘肽S转移酶(GST)序列、切割序列和/或氨基末端接头序列的任何上述物质。在SEQ ID NO:18-21中，普通文本的序列是GST，加下划线的序列是切割序列，加双下划线的序列是接头，加点下划线的序列是Gb或Ga序列，并且粗体序列是HRA或HRB。
在其它具体实施方案中，RSV F复合物包含选自以下的RSV F胞外域构建体：SEQ ID NO:22 (RSV F delP23 furdel截短的HRA HIS)、SEQ ID NO:23 (RSV F delP23 furdel C509C510 C481C489 HRA HIS)或其中省略HIS标签和/或接头的上述物质中的任一种。在SEQ ID NO:22-23中，普通文本的序列是RSV F胞外域序列，加下划线的序列是插入的C端HRA序列，加双下划线的序列是接头，并且粗体序列是HIS标签。SEQ ID NO:23还包括在位置481、489、509和510引入的半胱氨酸。
在具体实施方案中，所述复合物中的RSV F胞外域多肽呈融合前构型。不希望受任何特定理论束缚，据信，RSV F三聚体的融合前形式被稳定在本文所述的复合物中，因为寡聚化多肽诱导复合物形成，并且防止RSV F蛋白的HRB和HRA区域相互作用。RSV F蛋白的HRB和天然HRA区域的相互作用导致重折叠为融合后形式。
在其它具体实施方案中，复合物的特征在于当在负染电子显微图中观察时的圆形。
在其它具体实施方案中，所述复合物包含RSV F的融合后形式上不存在的融合前表位。
任选地，可以将额外半胱氨酸残基插入HRB区域以形成二硫键，并且进一步稳定本文所述的RSV F复合物。
在某些实施方案中，RSV F复合物可以进一步稳定在融合前形式中，其使用链间二硫化物，包括WO 2012/158613(以其整体通过引用并入本文)中公开的那些，使用缀合至寡聚化剂的肽，所述寡聚化剂包括但不限于病毒样颗粒(VLP)、白蛋白或RSV G，或使用其它突变，所述突变进一步稳定单体，使得其在配制和免疫后保留其融合前构型。
用于制备复合物的方法
本发明还涉及用于产生本文所述的RSV F复合物的方法。在一个方面，本发明涉及用于产生RSV F复合物的方法，所述RSV F复合物包含三个RSV F胞外域多肽、三个寡聚化多肽，且特征在于六螺旋束。所述方法包括：a) 提供RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽，由此产生RSV F复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽，三个寡聚化多肽，且特征在于六螺旋束。如本文中所述，所述六螺旋束由RSV F胞外域多肽的部分和寡聚化多肽的所有或部分形成。
如果需要，一个或多个RSV F胞外域多肽可以是重组RSV F胞外域多肽，其包括插入的C端6螺旋束形成部分，诸如，例如RSV F的HRA区域或HIV gp41的HRA区域。在该方法实践中，寡聚化多肽包含寡聚化区域，其可以与RSV F胞外域多肽的部分（例如，HRB）或插入的C端6螺旋束形成部分结合，并且由此引起复合物形成。
任选地，该方法可以进一步包括步骤c) 用合适的蛋白酶切割在产生的复合物中的RSV F蛋白胞外域多肽，由此产生RSV F复合物，其包含三个切割的RSV F胞外域多肽，所述寡聚化多肽中的三个，且特征在于六螺旋束。
使用该方法形成的复合物含有三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽。因此，这些多肽的化学计量可以用于该方法中。然而，可以使用过量的寡聚化多肽，并且在实践中，可以使用10倍摩尔过量或更多的寡聚化多肽。在用于形成RSV F复合物的合适条件下组合RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽。通常，在缓冲的水溶液(例如，约5至约9的pH)中组合RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽。如果需要，可以使用温和的变性条件，诸如，通过包括尿素，少量的有机溶剂或热，以温和变性RSV F胞外域多肽。
再次，不希望受任何特定理论束缚，据信，本文所述的方法适合于产生稳定的复合物，其中RSV F胞外域多肽呈融合前构型。
RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽的任何合适的制剂可以用于本方法中。例如，含有期望多肽的调节细胞培养基可以用于所述方法中。然而，优选在所述方法中使用纯化的RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽。
在所述方法中使用未切割的RSV F胞外域多肽提供了优势。如本文所述，已经发现，天然RSV F胞外域的体内切割RSV F多肽导致产生融合后胞外域，其是疏水性的，聚集的，并且难以纯化。具有设计以稳定融合前形式的工程改造的特征的RSV F多肽的体内切割导致不良产率或未处理/错误折叠的RSV F蛋白。然而，在体内未切割的RSV F胞外域多肽以与单体相同的良好产率产生，并且当融合肽在这些胞外域多肽中改变时，蛋白可以是可溶的且未聚集。未切割的单体可以在所述方法中方便地纯化和使用，以产生RSV F复合物。因此，优选的是，纯化的RSV F胞外域多肽单体用于所述方法中。所述方法中提供和使用的RSV F胞外域多肽优选是未切割的RSV F胞外域多肽，并且更优选地，未切割的RSV F胞外域多肽含有改变的弗林蛋白酶切割位点。在具体实施方案中，所述方法中提供和使用的RSV F胞外域多肽的氨基酸序列包括选自下列的序列： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中改变或省略信号肽和/或HIS标签和/或融合肽的任何上述物质。
在更具体实施方案中，所述方法中提供和使用的RSV F胞外域多肽的氨基酸序列选自： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)和其中改变或省略信号肽和/或HIS标签和/或融合肽的任何上述物质。
在进一步具体实施方案中，对应于野生型RSV F多肽诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的残基100 – 150的(所述方法中提供和使用的)RSV F胞外域多肽的氨基酸序列选自： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)和其中改变或省略信号肽和/或HIS标签和/或融合肽的任何上述物质。
尽管可使用任何合适的方法，但将通常通过在重组宿主系统中表达通过在合适的重组宿主细胞中表达编码所述胞外域的重组构建体来制备RSV F胞外域多肽(例如，未切割的RSV F胞外域多肽)。合适的重组宿主细胞包括例如，昆虫细胞(例如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕蛾(Bombyx mori)、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni))、哺乳动物细胞(例如人、非人灵长类、马、牛、绵羊、狗、猫和啮齿类(例如仓鼠))、禽类细胞(例如鸡、鸭和鹅)、细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.))、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母 (Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母 (Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、四膜虫细胞 (例如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila))或其组合。许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞是本领域众所周知的。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细 胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(衍生自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离株((Invitrogen))。合适的哺乳动物细胞包括例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型 DNA转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC.6细 胞(ECACC保藏号96022940)、Hep G2细胞、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、胎猕猴肺细胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、Madin-Darby狗肾(“MDCK”)细胞(例如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34；或 MDCK 33016、DSM ACC 2219)、幼仓鼠肾(BHK)细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞(例如EBx®细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞(例如，描述于例如Vaccine 27:4975-4982 (2009)和WO2005/042728的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系(ProBioGen))、EB66细胞等。
合适的昆虫细胞表达系统，诸如杆状病毒系统，是本领域技术人员已知的，且描述于例如Summers和Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以试剂盒形式商购自尤其Invitrogen, San Diego CA。禽类细胞表达系统也是本领域技术人员已知的，且描述于例如美国专利号5,340,740；5,656,479；5,830,510；6,114,168；和6,500,668；欧洲专利号EP 0787180B；欧洲专利申请号EP03291813.8；WO 03/043415；和WO 03/076601。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的，且描述于例如Yeast Genetic Engineering (Barr等人, eds., 1989) Butterworths, London。
编码RSV F蛋白胞外域的重组构建体可使用常规方法在合适的载体中制备。用于在昆虫或哺乳动物细胞中表达重组蛋白的许多合适的载体是本领域众所周知且常用的。合适的载体可含有许多组分，包括但不限于一种或多种以下组分：复制起点；可选择的标记基因；一种或多种表达控制元件，诸如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)，和/或一种或多种翻译信号；和用于靶向所选宿主细胞(例如哺乳动物来源的或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中的分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体诸如pFastBac (Invitrogen)产生重组杆状病毒颗粒。所述杆状病毒颗粒经扩增，且用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用将驱动所述构建体在期望的哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中表达的载体。
RSV F蛋白胞外域多肽可使用任何合适的方法纯化。例如，用于通过免疫亲和层析纯化RSV F胞外域多肽的方法是本领域已知的。Ruiz-Arguello等人, J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004)。纯化期望的蛋白的合适方法，包括沉淀和各种类型的层析，诸如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合和大小排阻是本领域众所周知的。可以使用这些或其它合适方法中的两种或更多种生成合适的纯化方案。如果需要，所述RSV F蛋白胞外域多肽可包括有助于纯化的“标签”，诸如表位标签或HIS标签。此类标记的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地从例如条件培养基中纯化。
除了所述RSV F序列，多肽还可包括的额外的序列。例如，多肽可包括有利于纯化的序列（例如，多聚-His序列）或C端6螺旋束形成部分。类似地，为了表达的目的，F蛋白的天然前导肽可以取代为不同的肽。
寡聚化多肽含有寡聚化区域，并且如果需要，可以进一步含有如本文所述的功能性区域。用于寡聚化区域的合适的氨基酸序列(例如，RSV F的HRA区域的氨基酸序列)是本领域众所周知的，这是合适的功能性区域。寡聚化多肽可以使用任何合适的方法，诸如通过化学合成、在合适的宿主细胞中的重组表达、化学缀合等来制备。
在其它方面，本发明涉及用于产生RSV F复合物的方法，所述RSV F复合物含有三个RSV F胞外域多肽，其中至少一个含有C端6螺旋束形成部分，但不包括寡聚化多肽。用于产生此类复合物的方法与用于产生含有寡聚化多肽、但省略寡聚化多肽的复合物的方法是基本上相同的。具体而言，所述方法包括：a) 提供含有C端6螺旋束形成部分的RSV F胞外域多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽，由此产生RSV F复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽，且特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源性HRB区域形成的六螺旋束。
当期望含有切割的RSV F胞外域多肽的RSV F复合物时，可以使用任选的步骤c)，可以用合适的蛋白酶切割产生的复合物中的RSV F蛋白胞外域多肽。合适的蛋白酶包括可以切割RSV F胞外域多肽(优选未切割的RSV F胞外域多肽)以形成F1和F2亚单位的任何蛋白酶。通常，所述蛋白酶将切割约位置101至约位置161之间的天然或插入的切割位点。可以使用的一种蛋白酶是胰蛋白酶。通常，RSV F复合物的胰蛋白酶消化使用以重量计1:1000胰蛋白酶:RSV F复合物或对于1 mg RSV F复合物的10-15 BAEE单位的胰蛋白酶来进行。在典型反应中，将来自牛血浆的胰蛋白酶(Sigma Aldrich, T8802:10,000-15,000 BAEE单位/ mg胰蛋白酶)在25 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl中稀释至1 mg/ml浓度，并且RSV F蛋白胞外域多肽(在25 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl中)在37℃消化1小时。切割反应可以使用胰蛋白酶抑制剂终止。
在一些实施方案中，所述方法包括：a) 提供RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽和至少一种寡聚化多肽，由此产生RSV F复合物，其包含所述RSV F胞外域多肽中的三个、所述寡聚化多肽中的至少一个，且特征在于六螺旋束。六螺旋束包含每种RSV F胞外域多肽的HRB区域和每种寡聚化肽的寡聚化结构域。在更具体的实施方案中，寡聚化肽的寡聚化结构域包含RSV F的HRA区域的氨基酸序列，并且六螺旋束包含每种RSV F胞外域多肽的HRB区域和每种寡聚化肽的HRA区域。在一个具体的实施方案中，寡聚化肽的三个寡聚化结构域包含RSV F的HRA区域的氨基酸序列，并且六螺旋束包含三个RSV F胞外域多肽中每个的HRB区域和三个寡聚化肽中每个的HRA区域。
在其它实施方案中，所述方法包括：a) 提供包含C端6螺旋束形成部分的重组RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽，和b) 在适合于形成RSV F复合物的条件下组合重组RSV F胞外域多肽和寡聚化多肽，由此产生RSV F复合物，其包含所述RSV F胞外域多肽中的三个、所述寡聚化多肽中的三个，且特征在于六螺旋束。六螺旋束包含每种重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分和每种寡聚化肽的寡聚化结构域。在更具体的实施方案中，分别地，所述C端6螺旋束形成部分是RSV F或HIV gp41的HRA区域，并且寡聚化肽的寡聚化结构域包含RSV F或HIV gp41的HRB区域的氨基酸序列。在此类实施方案中，六螺旋束包含每种RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分(即，插入的HRA区域)和每种寡聚化肽的HRB区域。
本发明还包括使用本文所述的方法产生的RSV F复合物。
免疫原性组合物
本发明提供包含本文公开的RSV F复合物的免疫原性组合物。组合物优选适合于施用于哺乳动物受试者，诸如人，且包括一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂，包括佐剂。此类组分的充分讨论参见Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 第20版, ISBN: 0683306472。组合物将通常是水性形式。当所述组合物是免疫原性组合物时，当施用于哺乳动物诸如人时，其将引发免疫应答。所述免疫原性组合物可用于制备用于免疫哺乳动物的疫苗制剂。
所述免疫原性组合物可包括单一活性免疫原性剂或几种免疫原性剂。例如，所述组合物可含有RSV F复合物和一种或多种其它RSV蛋白(例如G蛋白和/ 或M蛋白)和/或一种或多种来自其它病原体的免疫原。免疫原性组合物可以包含单价RSV F复合物，其含有三个RSV F胞外域和三个HRA肽，并且如果需要，其可以含有来自RSV F或另一种病原体的一个或多个额外抗原。在一个实例中，免疫原性组合物是二价的，并且包含还含有另一种RSV F抗原诸如RSV G蛋白的RSV F复合物。如本文所述，此类多价复合物可以使用寡聚化多肽产生，所述寡聚化多肽含有寡聚化区域，所述寡聚化区域可操作连接至来自RSV G的氨基酸序列，诸如来自RSV G的中央结构域的氨基酸序列。
所述组合物可包括防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基本上不含(即少于5μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的免疫原性组合物。特别优选不含防腐剂的免疫原性组合物。
为了控制张度，优选包括生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以以1至20mg/ml存在。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物将通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg的摩尔渗透压浓度，并且将更优选落在290-310 mOsm/kg的范围内。
组合物可包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris 缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂一起)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将包括在5-20mM范围内。组合物的pH将通常为5.0至8.1，更通常6.0至8.0，例如6.5至7.5，或 7.0至7.8。因此，本发明的方法可以包括在包装之前调整散装疫苗的pH的步骤。
所述组合物优选是无菌的。所述组合物优选无热原，例如每剂量含有<1 EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1 EU。该组合物优选不含谷蛋白。人疫苗通常以约0.5ml的剂量体积施用，尽管可将一半剂量(即约0.25ml)施用于儿童。
本发明的免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，免疫调节剂中的一种或多种包括一种或多种佐剂，例如两种、三种、四种或更多种佐剂。佐剂可包括下面进一步讨论的TH1佐剂和/或TH2佐剂。
优选地，该免疫原性组合物包含展示RSV-F糖蛋白的融合前构型中存在的表位的RSV F复合物。一种示例性组合物包含含有切割的RSV F胞外域多肽的RSV F复合物。另一种示例性组合物包含含有未切割的RSV F胞外域多肽的RSV F复合物。
治疗方法和施用
本发明的组合物适合于施用于哺乳动物，且本发明提供了在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将本发明的组合物(例如免疫原性组合物)施用于哺乳动物的步骤。所述组合物(例如免疫原性组合物)可用于产生疫苗制剂以免疫哺乳动物。所述哺乳动物通常是人，且所述RSV F复合物通常含有人RSV F蛋白胞外域。然而，所述哺乳动物可以是任何其它易受RSV感染的哺乳动物，诸如可以被牛RSV感染的牛。
本发明还提供组合物，其用作药物，例如用于针对RSV感染免疫患者。
在具体实施方案中，本发明提供包含如上所述的RSV F复合物的免疫原性组合物，其用于在受试者中诱导针对RSV F的免疫应答，其中所述方法包括将所述免疫原性组合物施用于受试者。
本发明还提供如上所述的RSV F复合物在制备用于在患者中引起免疫应答的药物中的用途。
这些方法和应用引起的免疫应答将通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价RSV接种后的抗体应答的方法是本领域众所周知的。
本发明的组合物可以许多合适方式施用，诸如肌内注射(例如入臂或腿中)、皮下注射、鼻内施用、口服施用、皮内施用、经皮施用、透皮施用等。施用的合适途径将取决于所述哺乳动物的年龄、健康和其它特征。临床医生将能够基于这些和其它因素确定施用的适当途径。
免疫原组合物和疫苗制剂可用于治疗儿童和成年人，包括孕妇。因此，受试者可以小于1 岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。用于接受疫苗的优选受试者为老人(例如>50岁、>60岁，且优选>65岁)和孕妇。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群。
治疗可通过单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径(例如肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等)给予。多于一个剂量(通常两个剂量)的施用特别可用于未免疫的患者中。多个剂量将通常间隔至少1周 (例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16 周等)进行施用。
可将使用本发明的组合物产生的疫苗制剂与其它疫苗基本上同时(在相同用药咨询或访问健康护理专业人员或疫苗接种中心期间)施用于患者。
其它病毒
除了与人RSV使用，本发明还可使用肺炎病毒科(Pneumoviridae)和副粘病毒科(Paramyxoviridae)的其它成员，包括但不限于牛呼吸道合胞病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3和副流感病毒5。
因此，本发明提供包含来自肺炎病毒科或副粘病毒科的F糖蛋白的免疫原性组合物， 其中所述F糖蛋白呈融合前构型。
本发明还提供包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽展示肺炎病毒科或副粘病毒科的F糖蛋白的融合前构型中存在、但在所述糖蛋白的融合后构型中不存在的表位。
本发明还提供这些多肽和用于接种的组合物等。
通用
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”和“基本上由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”意指，例如x±l0%。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，等。
当动物(特别是牛)材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不含传染性海绵状脑病(TSE)、特别是不含牛海绵状脑病(BSE)的来源。总体上，优选在动物来源材料完全不存在的情况下培养细胞。
当化合物作为组合物的部分施用于机体时，则该化合物可以替代地被合适的前药替代。
当细胞底物用于重配或反向遗传程序时，其优选已经批准用于人疫苗生产的细胞底物，例如，如Ph Eur总纲5.2.3中的细胞底物。
优选通过MPSRCH程序(Oxford Molecular)执行的 Smith-Waterman同源性搜索算法，使用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的同一性， 其中参数为缺口开放罚分＝12且缺口延伸罚分＝1。
实施例
以下实施例仅用于说明本发明的范围，因此并非旨在以任何方式限制该范围。
实施例1 - 从昆虫细胞纯化RSV F蛋白的方案
表达RSV F构建体的杆状病毒繁殖如下：
将一百微升P1储存病毒添加至50 ml稀释至0.8 x 106/ml (在Sf500培养基中生长)的SF9细胞(Invitrogen)中，并且使其感染/生长约5-6天。感染使用Cedex仪器监测。当细胞活力为<50％时，杆状病毒生长被认为完成，而细胞直径主要从~13 nm增加至~16nm。
将1 ml P2储存物添加至1升稀释至0.8 x 106/ml的Sf9细胞，并且允许其生长5-6天。感染使用Cedex仪器监测。当细胞活力为<50％时，杆状病毒生长被认为完成，而细胞直径主要从~13 nm增加至~16nm。
在Sf9细胞或HiFive细胞(Invitrogen)的培养物中实施表达，其中，除非进行测试表达以测定适当的m.o.i.，将10 ml P3(第3代)杆状病毒储存物以2 x 106/ml添加至每升细胞。允许表达继续~72小时。
在取细胞/培养基悬浮液的等分试样用于SDS-PAGE分析后，通过经由3000 r.p.m.离心细胞~30分钟从培养基沉淀细胞收获细胞。
将硫酸铜(II)添加至培养基至500微摩尔的最终浓度，并且将1升具有铜的培养基添加至~15 ml螯合性IMAC树脂(BioRad Profinity)。
然后使用重力柱从流通物分离蛋白结合的树脂。所述树脂用至少10个树脂体积的平衡缓冲液(25 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl)洗涤，并且蛋白用至少10个树脂体积的洗脱缓冲液(25 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑)洗脱。
洗脱溶液用无EDTA完全蛋白酶抑制剂(Pierce)和EDTA掺入至1mM的最终浓度。洗脱溶液然后在4℃针对16个体积的平衡缓冲液透析至少两次。将洗脱溶液上样至用Ni++预上样的一个或两个HiTrap螯合柱上。(单个5 ml柱通常足以用于10升表达。) 使用能够递送具有以下梯度概况(2 ml/min流速)的洗脱缓冲液的梯度的FPLC从柱上洗脱蛋白：
a. 0至5％洗脱缓冲液，经60 ml
b. 5至40％洗脱缓冲液，经120 ml
c. 40至100％洗脱缓冲液，经60 ml。
含有RSV F蛋白的级分通过SDS-PAGE分析使用考马斯染色和/或western印迹评估(通常，RSV F洗脱~170 ml至所述梯度)： 将材料浓缩至约0.5-1 mg/ml；并且将EDTA添加至1 mM最终浓度。
使用FPLC，收集1ml级分。通过大小排阻层析(SEC)用16/60 Superdex柱(GE Healthcare)使用平衡缓冲液作为流动相将RSV F材料(保留体积约75 ml)与昆虫蛋白污染物(保留时间约60 ml)解析开来。
使用SDS-PAGE用考马斯染色分析级分，并且合并足够纯的RSV F材料，并且浓缩至约1 mg/ml。
实施例2 - RSV F不可切割的单体 + HRA肽的设计
将由Anaspec (RSV F HRA肽，RSV残基160-207)合成的HRA肽(寡聚化多肽)重悬浮至SEC缓冲液(25 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl)，并且280 nm的UV吸光度(每1 mg/ml 1 AU：估算)用于估算蛋白浓度。
根据实施例1中描述的RSV F昆虫纯化方案纯化RSV F不可切割的胞外域(Delp21Furx，胞外域多肽)。
胞外域通过SEC制备型纯化以约75 ml的洗脱体积纯化，这与作为单体的胞外域一致。~0.75 mg/ml(如上通过UV估算)用于形成复合物。
接下来，将0.5 mls ~0.75 mg/ml RSV F单体添加至0.5 ml肽溶液，并且根据RSV F纯化方案在SEC柱上分离1ml复合物溶液。结果总结于表1中。
表1. 添加或不添加HRA肽的情况下的RSV F单体的SEC保留体积。
表1显示添加HRA肽后RSV F单体(Delp23 Furdel)的保留体积的变化。未切割的单体单独迁移，保留时间为~75 ml，而添加HRA肽的单体迁移，保留时间为~60 ml。为了比较，公开的RSV F三聚体(融合肽缺失)迁移，保留时间为~65 ml。RSV F单体 + HRA样品的保留体积为~60 ml，与单体相比，这与三聚体洗脱更一致。这种保留体积的转变表明肽 - F蛋白相互作用和HRA肽和RSV F不可切割的胞外结构域之间的复合物的三聚体的形成(即，具有三个HRA肽和三个F不可切割的胞外结构域的杂-六聚体)。
该不可切割的胞外域F:HRA肽复合物将通过电子显微镜(EM)进行评估，以确定是否形成三叶草种类或融合前球状头部(如图3中预测)。此外，肽复合物形成将用可切割的RSV F胞外域重复，所述可切割的RSV F胞外域可以用胰蛋白酶消化为F1/F2种类。如果形成融合前F球状头部，且这种融合前RSV F的行为类似于副流感F，我们预期稳定融合前形式将阻止玫瑰花结(rosette)形成。
实施例3 – 添加C端6螺旋束形成序列
将序列，诸如额外的RSV HRA或HIV gp41 HRA添加至实施例2中所述的复合物以形成C端6螺旋束，因此允许在分别添加RSV HRB或HIV gp41 HRB的情况下三聚化。这可具有将来自单体的RSV HRB约束至其天然融合前HRB三聚体茎、而不是融合后样6螺旋束的额外优势。
实施例4 – 添加HRB二硫化物
将HRB二硫化物添加至实施例2中描述的HRB。因此，当单体的三聚化发生时，半胱氨酸添加在适当的位置以形成期望的二硫化物，提供额外水平的融合前稳定性。
实施例5 – 添加融合至肽的缀合的蛋白
代替添加HRA、HRB或gp41肽(实施例3)，添加与这些肽融合的缀合的蛋白，诸如RSV G、白蛋白或KLF缀合物蛋白。例如，将HRA肽-RSV G中央结构域构建体添加至F单体蛋白。在HRA肽诱导的三聚化后，将RSV G中央结构域蛋白结合至F，制备F/G复合物，其可以在接种后提供进一步的免疫原性。
实施例6 - RSV F单体与HRA肽的三聚化
在本实施例中，使用如实施例2中所述的相同方法，将RSV F单体(Delp23 Furdel截短的HIS构建体)与5倍质量的RSV HRA合成产生的肽(SEQ ID NO:40)混合。
在与RSV HRA肽混合之前和之后，使用Wyatt SEC柱和Waters HPLC以PBS作为RSV F单体的流动相进行MALS分析。结果总结于表2中。
表2. 添加或不添加HRA肽的情况下的RSV F单体的SEC-MALS分析。
表2显示在与5倍质量的RSV HRA肽混合之前和之后，使用Wyatt SEC柱(WTC-030S5)和Waters HPLC以PBS作为RSV F单体(Delp23 Furdel截短的HIS构建体)的流动相的SEC-MALS分析的保留时间和光散射结果。在添加HRA肽后，RSV F单体的主要峰的保留时间从~11.5 min转变至~10.5 min。保留时间的转变和质量的增加与HRA肽引起RSV F单体以形成三聚体的模型一致。对于各单体或与肽三聚化的单体，对于每种种类观察的质量在合理的误差范围内。
实施例7 – 用BIAcoreTM分析证明的RSV F单体与融合前特异性抗体D25 Fab的结合
McLellan, J.S.等人(Science, 340:1113-7 (2013))公开了与抗体D25的Fab结合的其融合前构型的RSV F的晶体结构，所述抗体D25的Fab结合至对融合前构型独特、但在融合后结构上不存在的表位。
可以通过蛋白与D25 Fab的结合测试RSV F单体是否是融合前前体(即，折叠的蛋白能够结合融合前特异性抗体或Fab)。这可以用本领域技术人员已知的任何实验，诸如通过ELISA，表面等离子共振分析诸如BIAcoreTM、ITC、大小排阻层析、通过非变性凝胶电泳的迁移、AUC、Western或斑点印迹等来完成。
使用常规实验室方法在大肠杆菌细胞中使用McLellan, J.S.等人, 2013中公开的序列(具有用于纯化的HIS-标签和Strep-标签)产生D25 Fab用于该研究。
在本实施例中，实施BIAcoreTM分析(表面等离子共振分析)，其表明D25 Fab对RSV F单体(未切割的F)的特异性结合。将D25 Fab使用标准酰胺化学法如操作手册(BIAcoreTM/GE Healthscience)所述固定在CM5芯片上。将D25 Fab上样至芯片表面上至~75 RU。将RSV F单体(未切割的RSV F Delp23 Furdel)在BIAcoreTM流动相(具有0.05% N20去污剂的PBS)中稀释至30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7.5 nM、5 nM、3.75 nM、5 nM和0 nM浓度。针对双空白记录结合的传感图(初始传感图代表F2-F1通道，其中F2是D25固定的通道且F1是用胺偶联处理的无蛋白通道。将0 nM初始传感图从各其它传感图立即减去，以产生下示且用于拟合的最终浓度传感图。)结合常数和误差通过使用BIAcoreTM评估软件拟合至1:1结合模型来测定。
BIAcoreTM分析的结果总结于表3中。
表3. RSV F单体与D25 Fab的结合的BIAcoreTM分析。
计算的结合亲和力(KD)显示于表3中，这表明RSV F单体能够结合融合前特异性抗体D25。此外，紧密结合数据(KD 5.3 x 10-11 M)表明，融合前表位在蛋白表面上进行。D25已知紧密结合至融合前RSV F(McLellan, J.S.等人, 2013)。如果RSV F单体呈融合前构型，则本领域技术人员会期望结合亲和力是非常紧密的，在mM范围，或更紧密。用芯片上的D25 Fab和RSV F单体的BIAcoreTM分析证明了KD 5.3 x 10-11M的结合亲和力。如果RSV F单体应当呈融合前构型，则这种紧密结合与预期的结合是一致的。
RSV F未切割的亚单位抗原(F单体)在这项工作中首先被证明呈融合前构型。该抗原应当引发针对先前公开的融合后抗原的优异免疫应答。
实施例8 – 用SEC证明的RSV F单体与D25 Fab的结合
大小排阻色谱可用于证明抗原和抗体的结合。这通常用制备色谱(即，Superdex P200或Superdex 200 PC 3.2/30)或在分析HPLC诸如Wyatt MALS SEC柱上来完成。
在添加或不添加1:1摩尔量的D25 Fab的情况下对RSV F单体进行分析型HPLC-SEC。在如实施例6中所述的Waters MALS系统上用PBS作为流动相运行色谱，并且结果总结于表4中。
表4. RSV F单体与D25 Fab的结合的HPLC-SEC分析。
表4显示，在添加D25 Fab的情况下，RSV F单体迁移至新的、降低的保留时间，这与结合至D25 Fab的RSV F单体的质量一致，如斯托克斯半径和MALS分析所证明。保留时间的降低表明D25结合至RSV F单体。此外，RSV F单体峰迁移至新的保留时间是接近完全的，这表明几乎所有RSV F单体能够结合融合前特异性D25 Fab，这表明RSV F单体在其融合前构型中是相当均匀的。
实施例9 – 用SEC证明的RSV F单体和三聚化单体与D25 Fab的结合
在本实施例中，进行制备型SEC，并且结果表明，RSV F单体和与HRA肽三聚化的单体结合至D25 Fab，融合前特异性Fab。
该实验用microFPLC (GE Healthcare)使用25 mM Tris pH 7.5和50 mM NaCl作为流动相进行。RSV F单体(未切割的RSV F Delp23 Furdel)在SEC制备型柱(GE Healthcare的micro Superdex 200)上运行，并且结果总结于表5中。
表5. RSV F单体和三聚化的F单体与D25 Fa的结合的制备型SEC分析
表5.　a 将D25 Fab以1:1摩尔比添加至RSV单体。
　　　b 将HRA肽以F单体的~5倍质量添加至RSV F单体。
　　　c 收集~1.2 ml的三聚化的F级分(参见正上方的行)，并且将约10倍过量的D25 Fab添加至该级分并且在SEC上重新运行。
如表5中所总结，单独的RSV F单体(Delp23 Furdel)具有~1.4 ml的保留时间，而RSV F单体加上D25 Fab迁移至~1.3 ml的保留时间，这表明单体可以结合融合前特异性D25 Fab。RSV F单体加上F单体的~5倍质量的HRA肽迁移至1.2 ml的新的保留时间，表明在肽结合后RSV F单体(三聚化的单体)的寡聚化。RSV F三聚化的单体加上D25 Fab迁移至1.1 ml的保留时间，这表明融合前特异性Fab能够结合三聚化的单体。
本实施例证明，RSV F单体是融合前抗原，并且在与RSV F HRA肽三聚化后，所述蛋白保留融合前表位，使其成为如初始预测的融合前三聚体抗原。
本文引用的所有文献的完整教导在此通过引用并入本文。
序列表
<110> GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
<120> RSV F融合前三聚体
<130> VN55275-WO-PCT
<140> PCT/EP2013/07416
<141> 2013-11-19
<150> 61/890,086
<151> 2013-10-11
<150> 61/728,498
<151> 2012-11-20
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 1
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 2
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 2
Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Val Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser
115 120 125
Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Met Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
450 455 460
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys
565 570
<210> 3
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 3
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Lys Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Lys Lys Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 4
<211> 48
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 4
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Gln Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
35 40 45
<210> 5
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 5
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Gln
20 25 30
Asn Gln Asn Gln Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 6
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 6
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Glu Leu Pro Gln Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Asn Asn Thr Asn Val Thr Leu Ser Gln
20 25 30
Asn Gln Asn Gln Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 7
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 7
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Glu Leu Pro Gln Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Gln Gln Thr Asn Val Thr Leu Ser Gln
20 25 30
Asn Gln Asn Gln Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 8
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Gln Asn Gln Asn Gln Asn
1 5 10 15
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
20 25 30
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 9
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Gln Asn Gln Asn Phe Leu
1 5 10 15
Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
20 25
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 10
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Gln Gln Asn Gln Gln Gln Arg
1 5 10 15
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
20 25 30
<210> 11
<211> 28
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 11
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Gln Gln Gln Gln Arg Phe Leu
1 5 10 15
Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser
20 25
<210> 12
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 12
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Gln Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Gln Gln Thr Asn Val Thr Leu Ser Gln
20 25 30
Asn Gln Asn Gln Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 13
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 13
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Gln Ala Gln Asn Glu Leu Pro Gln Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Gln Gln Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 14
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 14
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Ile Glu Gly Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Ile Glu Gly Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 15
<211> 41
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 15
Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Arg Ala Ile Ala Ser
35 40
<210> 16
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 16
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Leu Glu Gly Glu
245 250 255
Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val
260 265 270
Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu
275 280 285
Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val
290 295 300
<210> 17
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 17
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Leu Glu Gly Glu
245 250 255
Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val
260 265 270
Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu
275 280 285
Lys Asn
290
<210> 18
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 18
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Arg Leu Lys Asn
245 250 255
Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe
260 265 270
Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys
275 280 285
Lys Thr Ile Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Leu Glu Gly Glu Val
290 295 300
Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser
305 310 315 320
Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys
325 330 335
Asn
<210> 19
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 19
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Arg Gln Asn Lys
245 250 255
Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe
260 265 270
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys
275 280 285
Lys Arg Ile Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Leu Glu Gly Glu Val
290 295 300
Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser
305 310 315 320
Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys
325 330 335
Asn
<210> 20
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 20
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Arg Leu Lys Asn
245 250 255
Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe
260 265 270
Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys
275 280 285
Lys Thr Ile Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Pro Ser Asp Glu Phe
290 295 300
Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala
305 310 315 320
Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn
325 330
<210> 21
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 21
Met His His His His His His Gly Ser Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu
50 55 60
Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys
85 90 95
Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg
100 105 110
Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys
115 120 125
Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
130 135 140
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro
145 150 155 160
Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro
165 170 175
Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile
180 185 190
Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile
195 200 205
Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His
210 215 220
Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Glu Val
225 230 235 240
Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Arg Gln Asn Lys
245 250 255
Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe
260 265 270
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys
275 280 285
Lys Arg Ile Pro Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Pro Ser Asp Glu Phe
290 295 300
Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala
305 310 315 320
Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn
325 330
<210> 22
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 22
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Gln Gln Gln Gln
100 105 110
Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly
115 120 125
Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile
165 170 175
Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser
180 185 190
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu
195 200 205
Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val
210 215 220
Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp
225 230 235 240
Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln
245 250 255
Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu
260 265 270
Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr
275 280 285
Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys
290 295 300
Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys
305 310 315 320
Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys
325 330 335
Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu
340 345 350
Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr
355 360 365
Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile
370 375 380
Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr
385 390 395 400
Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys
405 410 415
Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr
420 425 430
Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly
435 440 445
Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu
450 455 460
Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu
465 470 475 480
Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Leu Glu Gly Glu
485 490 495
Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val
500 505 510
Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly His His His His His His
530 535 540
<210> 23
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 23
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Gln Gln Gln Gln
100 105 110
Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly
115 120 125
Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile
165 170 175
Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser
180 185 190
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu
195 200 205
Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val
210 215 220
Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp
225 230 235 240
Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln
245 250 255
Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu
260 265 270
Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr
275 280 285
Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys
290 295 300
Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys
305 310 315 320
Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys
325 330 335
Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu
340 345 350
Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr
355 360 365
Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile
370 375 380
Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr
385 390 395 400
Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys
405 410 415
Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr
420 425 430
Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly
435 440 445
Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Cys Phe Pro Ser Asp Glu
450 455 460
Phe Cys Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu
465 470 475 480
Ala Phe Ile Arg Lys Cys Cys Glu Leu Leu His Asn Leu Glu Gly Glu
485 490 495
Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val
500 505 510
Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly His His His His His His
530 535 540
<210> 24
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成共有多肽"
<220>
<221> 变体
<222> (114)..(114)
<223> /替换="Phe"
<220>
<221> 变体
<222> (152)..(152)
<223> /替换="Val"
<220>
<221> 变体
<222> (200)..(200)
<223> /替换="Asp"
<220>
<221> 变体
<222> (356)..(356)
<223> /替换="Glu"
<220>
<221> 变体
<222> (402)..(402)
<223> /替换="Val"
<220>
<221> 变体
<222> (477)..(477)
<223> /替换="Phe"
<220>
<221> 变体
<222> (537)..(537)
<223> /替换="Ile"
<220>
<221> 变体
<222> (544)..(544)
<223> /替换="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(574)
<223> /注="序列中给出的变体残基就关于变体位置的注释中的那些而言没有优先"
<400> 24
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Tyr Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 25
<211> 51
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 25
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ala Ser
50
<210> 26
<211> 42
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 26
Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Arg Ser Ala Ile Ala Ser
35 40
<210> 27
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 27
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Ile Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 28
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 28
Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser
115 120 125
Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Gly Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
450 455 460
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys
565 570
<210> 29
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 29
Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser
115 120 125
Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
450 455 460
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys
565 570
<210> 30
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 30
Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Thr Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His His Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 31
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 31
Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Val Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro
100 105 110
Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser
115 120 125
Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Met Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
450 455 460
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys
565 570
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 32
Arg Ala Arg Lys
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 33
Arg Ala Arg Gln
1
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 34
Gln Ala Gln Asn
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 35
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 36
Arg Lys Lys Lys
1
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 37
Gln Asn Gln Asn
1
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 38
Gln Gln Gln Arg
1
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 39
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 40
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 40
Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn
1 5 10 15
Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys
20 25 30
Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val
35 40 45
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成的6xHis标签"
<400> 41
His His His His His His
1 5

Claims (29)

1.呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含
三个RSV F胞外域多肽各自包含内源HRA区域，和
至少一个寡聚化多肽，其中所述三个胞外结构域多肽和所述至少一个寡聚化多肽形成六螺旋束，条件是所述RSV F多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。
2.权利要求1的RSV F复合物，其中：
(i) 每个RSV F胞外域多肽包含HRB区域，且每个寡聚化多肽包含寡聚化区域；和/或
(ii) 所述六螺旋束包含每个RSV F胞外域多肽的HRB区域和每个寡聚化肽的寡聚化区域。
3.权利要求2的RSV F复合物，其中每个寡聚化区域包含RSV F HRA氨基酸序列。
4.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中所述复合物由三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽组成。
5.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中所述寡聚化多肽中的一个或多个进一步包含可操作地连接至寡聚化区域的功能区域。
6.权利要求5的RSV F复合物，其中所述功能区域独立地选自免疫原性载体蛋白、抗原、颗粒形成多肽、脂质和使所述寡聚化多肽与脂质体或颗粒结合的多肽。
7.权利要求6的RSV F复合物，其中所述功能区域是抗原，并且其中所述抗原是RSV G。
8.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中：
(i) 所述RSV F胞外域多肽中的一个或多个是未切割的RSV F胞外域多肽；
(ii) 所述RSV F胞外域多肽中的一个或多个是切割的RSV F胞外域多肽；和/或
(iii) 所述RSV F胞外域多肽中的每个含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点。
9.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列包含选自以下的序列： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中省略或改变信号肽和/或HIS标签和/或融合肽的任何上述物质。
10.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中所述RSV F胞外域多肽中的至少一个是包含C端6螺旋束形成部分的重组多肽。
11.权利要求10的RSV F复合物，其中所述C端六螺旋束形成部分包含包膜病毒的融合蛋白的七肽重复区域。
12.权利要求11的RSV F复合物，其中所述七肽重复区域选自RSV F HRA、RSV HRB和HIV gp41 HRA。
13.权利要求10-12中任一项的RSV F复合物，其中所述六螺旋束包含三个重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束成形部分和每个寡聚化肽的寡聚化区域。
14.前述权利要求中任一项的RSV F复合物，其中：
(i) 所述RSV F胞外域多肽呈融合前构型；
(ii) 所述复合物的特征在于当在负染电子显微图中观察时的圆形；和/或
(iii) 所述复合物包含RSV F的融合后形式上不存在的融合前表位。
15.呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽，其各自含有内源HRA区域和内源HRB区域，所述RSV F胞外域多肽中的至少一个进一步包含C端6螺旋束形成部分，其中所述复合物的特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源HRB区域形成的六螺旋束。
16.用于产生呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物的方法，其包括：
a)提供RSV F蛋白胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽，和
b)在适合于形成RSV F复合物的条件下组合所述RSV F胞外域多肽和所述至少一个寡聚化多肽，由此产生RSV F复合物，其中所述RSV F胞外域多肽中的三个和所述寡聚化多肽中的至少一个形成六螺旋束，条件是所述RSV F胞外域多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。
17.权利要求16的方法，其中a)中提供的RSV F胞外域多肽：
(i) 是未切割的RSV F胞外域多肽；
(ii) 每个含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点；
(iii) 是纯化的单体；和/或
(iv) 在昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母细胞、四膜虫细胞或其组合中表达。
18.权利要求16或17的方法，其进一步包括(c) 用蛋白酶切割产生的复合物中的RSV F蛋白胞外域多肽。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中每个RSV F胞外域多肽包含HRB区域，且每个外源寡聚化多肽包含寡聚化区域。
20.权利要求19的方法，其中所述六螺旋束包含每个RSV F胞外域多肽的HRB区域和每个寡聚化肽的寡聚化区域。
21.权利要求16-20中任一项的方法，其中：
(i) 所述至少一个寡聚化多肽包含RSV F HRA氨基酸序列；
(ii) 所述复合物由三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽组成；
(iii) 所述寡聚化多肽中的一个或多个进一步包含可操作地连接至所述寡聚化区域的功能区域；
(iv) 步骤a)中提供的所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列包含选自以下的序列： SEQ ID NO:8 (Del21 Furx)、SEQ ID NO:3 (Furmt)、SEQ ID NO:4 (Furdel)、SEQ ID NO:5 (Furx)、SEQ ID NO:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID NO:7 (Furx R113Q、K123Q、K124Q)、SEQ ID NO:9 (Delp23Furx)、SEQ ID NO:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID NO:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID NO:12 (N端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:13 (C端弗林蛋白酶)、SEQ ID NO:14 (因子Xa)、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:26 (融合肽缺失1)和其中省略或改变信号肽和/或HIS标签和/或融合肽的任何上述物质；和/或
(v) 所述RSV F胞外域多肽中的至少一个是包含C端6螺旋束形成部分的重组多肽。
22.权利要求21的方法，其中所述C端6螺旋束形成部分包含包膜病毒的融合蛋白的七肽重复区域。
23.权利要求22的方法，其中所述七肽重复区域选自RSV F HRA、RSV F HRB和HIV gp41 HRA。
24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述六螺旋束包含三个重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束成形部分和每个寡聚化肽的寡聚化区域。
25.权利要求16-24中任一项的方法，其中产生的复合物中的RSV F胞外域多肽：
(i) 呈融合前构型；
(ii) 特征在于当在负染电子显微图中观察时的圆形；和/或
(iii) 包含RSV F的融合后形式上不存在的融合前表位。
26.用于产生呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物的方法，其包括：
a)提供含有C端6螺旋束形成部分的RSV F蛋白胞外域多肽，和
b)在适合于形成RSV F复合物的条件下组合RSV F胞外域多肽，由此产生RSV F复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽，且特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源HRB区域形成的六螺旋束。
27.通过权利要求16-26中任一项的方法产生的呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物。
28.免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-15和27中任一项的呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物。
29.在对象中诱导针对RSV F的免疫应答的方法，其包括将权利要求28的免疫原性组合物施用于所述对象。
CN201380060643.9A 2012-11-20 2013-11-19 Rsv f融合前三聚体 Pending CN104853769A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261728498P 2012-11-20 2012-11-20
US61/728498 2012-11-20
US201361890086P 2013-10-11 2013-10-11
US61/890086 2013-10-11
PCT/EP2013/074169 WO2014079842A1 (en) 2012-11-20 2013-11-19 Rsv f prefusion trimers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104853769A true CN104853769A (zh) 2015-08-19

Family

ID=49622826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380060643.9A Pending CN104853769A (zh) 2012-11-20 2013-11-19 Rsv f融合前三聚体

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20150329597A1 (zh)
EP (1) EP2922570A1 (zh)
JP (1) JP2016501196A (zh)
KR (1) KR20150085843A (zh)
CN (1) CN104853769A (zh)
AU (1) AU2013349778A1 (zh)
BR (1) BR112015011389A2 (zh)
CA (1) CA2890135A1 (zh)
EA (1) EA201590683A1 (zh)
IL (1) IL238520A0 (zh)
MX (1) MX2015006377A (zh)
SG (1) SG11201503369RA (zh)
WO (1) WO2014079842A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119287A (zh) * 2016-08-29 2016-11-16 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白的重组载体及方法
CN106946994A (zh) * 2017-03-09 2017-07-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抑制丙型肝炎病毒感染的蛋白及其应用
WO2018095330A1 (zh) * 2016-11-22 2018-05-31 黄立民 重组rsv抗原
CN110506060A (zh) * 2017-03-30 2019-11-26 昆士兰大学 嵌合分子及其用途
CN116162136A (zh) * 2021-11-24 2023-05-26 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN117304280A (zh) * 2023-11-28 2023-12-29 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种重组rsv f蛋白及其应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102450375B1 (ko) * 2013-03-13 2022-10-04 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 선융합(prefusion) RSV F 단백질 및 이의 용도
US9738689B2 (en) 2013-03-13 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion RSV F proteins and their use
EP2974739A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
WO2016061149A1 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 Medgenics Medical Israel Ltd. Genetically-modified micro-organ secreting a therapeutic peptide and methods of use thereof
US10744193B2 (en) 2015-03-30 2020-08-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic RSV polypeptides
JP6873054B2 (ja) 2015-06-12 2021-05-19 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム アデノウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチド
JO3555B1 (ar) 2015-10-29 2020-07-05 Merck Sharp & Dohme جسم مضاد يبطل فعالية فيروس الالتهاب الرئوي البشري
IL260203B1 (en) 2015-12-23 2024-05-01 Pfizer Protein mutants of RSV F
AU2018238522A1 (en) 2017-03-23 2019-10-03 Alpha-O Peptides Ag Self-assembling protein nanoparticles with built-in six-helix bundle proteins
SG11201908999QA (en) 2017-04-04 2019-10-30 Univ Washington Self-assembling protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus f proteins and their use
KR102679227B1 (ko) * 2019-02-28 2024-06-28 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤 Rsv f/g 키메라 백신
CN114502572A (zh) 2019-09-04 2022-05-13 华盛顿大学 展示副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的自组装蛋白纳米结构及其用途
WO2023187743A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-05 The University Of Queensland Improved chimeric polypeptides and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009079796A1 (en) * 2007-12-24 2009-07-02 Id Biomedical Corporation Of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2010149743A2 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
WO2011008974A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149650A (en) * 1986-01-14 1992-09-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Vaccines for human respiratory virus
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
FR2726003B1 (fr) 1994-10-21 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires
FR2832423B1 (fr) 2001-11-22 2004-10-08 Vivalis Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire
FR2836924B1 (fr) 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
CA2713879C (en) 2008-02-01 2020-01-07 Alpha-O Peptides Ag Self-assembling peptide nanoparticles useful as vaccines
WO2010009065A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Amphipathic peptide compositions
CA2730737A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Immunogenic amphipathic peptide compositions
CN106146671B (zh) 2008-12-09 2020-03-31 诺瓦瓦克斯股份有限公司 修饰的rsv f蛋白及其使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009079796A1 (en) * 2007-12-24 2009-07-02 Id Biomedical Corporation Of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2010149743A2 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
WO2011008974A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119287A (zh) * 2016-08-29 2016-11-16 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白的重组载体及方法
WO2018095330A1 (zh) * 2016-11-22 2018-05-31 黄立民 重组rsv抗原
CN106946994A (zh) * 2017-03-09 2017-07-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抑制丙型肝炎病毒感染的蛋白及其应用
CN110506060A (zh) * 2017-03-30 2019-11-26 昆士兰大学 嵌合分子及其用途
CN110506060B (zh) * 2017-03-30 2024-05-07 昆士兰大学 嵌合分子及其用途
CN116162136A (zh) * 2021-11-24 2023-05-26 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN117304280A (zh) * 2023-11-28 2023-12-29 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种重组rsv f蛋白及其应用
CN117304280B (zh) * 2023-11-28 2024-04-16 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种重组rsv f蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2922570A1 (en) 2015-09-30
IL238520A0 (en) 2015-06-30
AU2013349778A1 (en) 2015-05-28
KR20150085843A (ko) 2015-07-24
JP2016501196A (ja) 2016-01-18
EA201590683A1 (ru) 2015-11-30
MX2015006377A (es) 2015-07-21
SG11201503369RA (en) 2015-06-29
CA2890135A1 (en) 2014-05-30
BR112015011389A2 (pt) 2017-08-22
WO2014079842A1 (en) 2014-05-30
US20150329597A1 (en) 2015-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104853769A (zh) Rsv f融合前三聚体
US20140141037A1 (en) Rsv f prefusion trimers
ES2563730T3 (es) Composiciones de proteína RSV F y procedimientos de fabricación de las mismas
CN103547676B (zh) 颗粒形式的免疫原性组合物和用于产生其的方法
EP2974739A1 (en) RSVF trimerization domains
CN103442731B (zh) 表达系统
KR101359723B1 (ko) 기능성 인플루엔자 바이러스 유사 입자들
US20160008456A1 (en) Functional influenza virus-like particles (vlps)
CN102481359A (zh) 重组rsv抗原
US20210102178A1 (en) Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs
JP2023534840A (ja) Ｍ２／ｂｍ２欠失インフルエンザベクターを使用したワクチン
US11285205B2 (en) Influenza antigens
CN109073639B (zh) 具有异源表位和/或改变的成熟切割位点的流感血凝素的组合物
CN106163553A (zh) 多聚体‑多表位流感多肽的组合物及其产生
Thomsen et al. Applications of insect cell gene expression in pharmaceutical research
US20220289796A1 (en) Methods and compositions for stabilized recombinant flavivirus e protein dimers
Azarm The Functional and Antigenic Diversity of the Henipavirus Glycoproteins
Ogrodowicz Studies on low pH-activated HA2 from Influenza haemagglutinin
Cseke Cloning, Expression and Structural Characterization of Human Metapneumovirus Fusion Glycoprotein
KR20040084916A (ko) 인플루엔자 바이러스 벡터의 패키징을 위한 신호

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150819