SK16022001A3 - Adjuvantné kombinované prostriedky - Google Patents

Adjuvantné kombinované prostriedky Download PDF

Info

Publication number
SK16022001A3
SK16022001A3 SK1602-2001A SK16022001A SK16022001A3 SK 16022001 A3 SK16022001 A3 SK 16022001A3 SK 16022001 A SK16022001 A SK 16022001A SK 16022001 A3 SK16022001 A3 SK 16022001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antigenic composition
lys
antigen
vertebrate
mpl
Prior art date
Application number
SK1602-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Hagen
Original Assignee
American Cyanamid Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Company filed Critical American Cyanamid Company
Publication of SK16022001A3 publication Critical patent/SK16022001A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Beans For Foods Or Fodder (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka použitia 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A alebo monofosforyllipidu A a jeho derivátov a analógií v komb'ináci s cytokínom alebo lymfokínom, konkrétne faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov-makrofágov alebo interleukínom 12, rovnako ako sa týka adjuvantného prostriedku v antigénnom prípravku na zosilnenie imunitnej reakcie u stavovca na vybraný antigén.
Doterajší stav techniky
Imunitný systém využíva rôzne mechanizmy v boji proti antigénom. Avšak, po imunizácii nie sú aktivované všetky tieto mechanizmy. Protektívna imunita indukovaná imunizáciou je závislá na kapacite vakcíny vyvolať vhodnú imunitnú odpoveď chrániacu pred patogénom alebo eliminujúcu patogén. Podľa typu antigénu môže byť touto reakciou bunková a/alebo humorálna imunitná reakcia.
Súčasnou hypotézou pre úlohu pomocných T-lymfocytov v imunitnej reakcii je to, že T-lymfocyty môžu byť rozdelené na podtriedy podľa cytokínov, ktoré produkujú, a že rôzny cytokínový profil pozorovaný u týchto buniek určuje ich funkciu. Tento model T-lymfocytov obsahuje dve hlavné podtriedy:
THl-lymfocyty, ktoré produkujú interleukín-2 (IL-2) a interferón γ, ktoré zosilňujú bunkovú aj humorálnu (protilátkovú) imunitnú reakciu; a
TH2-lymfocyty, ktoré produkujú interleukín-4, interleukín-5 a interleukín-10 (IL-4, IL-5 a IL-10, v príslušnom poradí), ktoré zosilňujú protilátkové imunitné reakcie (1).
Často je žiadúce zosilniť imunogénny potenciál antigénu na dosiahnutie silnejšej imunitnej reakcie v imunizovanom organizme a na zlepšenie odolnosti imunizovaného jedinca voči agens obsahujúcemu antigénu. V niektorých prípadoch je žiadúce posunutie imunitnej reakcie od predominantne protilátkovej (TH-2) reakcie k viac vyváženej bunkovej (TH-1) a protilátkovej (TH-2) reakcii.
Bunková reakcia zahŕňa tvorbu reakcie CD8+ CTL (cytotoxických T-lymfocytov). Takéto reakcie sú žiadúce pre vývoj vakcín proti intracelulárnym patogénom. Ochrana pred rôznymi patogénmi vyžaduje silnejšie slizničné reakcie, vyššie sérové titre, indukciu CTL a silnú bunkovú odpoveď. Tieto odpovede nie sú dosiahnuté pri použití väčšiny antigénnych prípravkov, vrátane bežných podjednotkových vakcín. Medzi takéto patogény patrí vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV).
Preto existuje potreba vývoja antigénnych prostriedkov, ktoré môžu vyvolať protilátkovú ako aj bunkovú imunitnú reakciu u stavovca.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je použitie adjuvantných kombinovaných prostriedkov v antigénnych prípravkoch, ktoré obsahujú 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A alebo monofosforyl lipid A a jeho deriváty a analógie v kombinácii s cytokínom alebo lymfokínom, konkrétne faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov-makrofágov alebo interleukínom 12 (IL-12) alebo antagonistom alebo agonistom uvedeného cytokínu alebo lymfokínu. Adjuvans je substancia, ktorá zosilňuje imunitnú reakciu, keď je podaná s imunogénom alebo s antigénom. Adjuvantný prostriedok podľa predkladaného vynálezu je podaný spoločne s vybraným antigénom v antigénnej kompozícii. Antigénna kompozícia podľa predkladaného vynálezu zosilňuje imunitnú reakciu u stavovca na vybraný antigén. Vybraným antigénom môže byť polypeptid, peptid alebo fragment získaný z (1) patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita (2) nádorovej bunky (3) alergénu tak, aby interferoval s produkciou IgE a tak aby došlo k zmierneniu alergických reakcií na alergén alebo (4) z amyloidového proteínu, aby sa zabránilo alebo al y sa liečili ochorenia charakterizované ukladaním amyloidu u jedincov.
V jednom vyhotovení vynálezu je vybraný antigén získaný z HIV. Vybraným HIV antigénom môže byť HIV proteín, polypeptid, peptid alebo fragment získaný z uvedeného proteínu.
V konkrétnom vyhotovení vynálezu je HIV antigénom špecifický peptid. V inom vyhotovení vynálezu je antigén získaný z Neisseria gonorrhoeae alebo respiračno-syncitiálneho vírusu.
MPL(tra) môže byť použitý vo forme vodného roztoku alebo vo forme stabilizovanej emulzie olej vo vode (stabilná emulzia alebo SE). Vo výhodnom vyhotovení predkladaného vynálezu emulzia olej vo vode obsahuje skvalén, glycerol a fosfatidylcholín. V SE prostriedka je MPL(tm) zmiešaný s cytokínom alebo lymfokínom za vzniku antigénneho prostriedka pred podaním. Cytokín alebo lymfokín nemusí vstupovať do emulzie. Vo výhodnom vyhotovení vynálezu je MPL(tm) v SE forme. Antigénny prostriedok môže ďalej obsahovať riedidlo alebo nosič.
Vynález je taktiež zameraný na spôsoby zvýšenia schopnosti antigénneho prostriedka (1) obsahujúceho daný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazitu vyvolať imunitnú reakciu u stavovca alebo (2) obsahujúceho nádorový antigén alebo antigén asociovaný s nádorom z nádorových buniek vyvolať terapeutickú alebo profylaktickú protinádorovú reakciu u stavovca alebo (3) obsahujúceho alergén interferovať s produkciou IgE tak, aby bola zmiernená alergická reakcia na alergén, alebo
v. . · ..A . i ......... ; . v · (4) obsahujúceho amyloidový peptid zabrániť alebo liečiť ochorenia charakterizované ukladaním amyloidu u stavovcov prostredníctvom toho, že uvedený antigénny prostriedok obsahuje účinné adjuvantné množstvo kombinácie cytokínu alebo lymfokínu, konkrétne MPL(tm) s GM-CSF alebo IL-12, alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu.
Vynález je ďalej zameraný na spôsoby zvýšenia schopnosti antigénneho prostriedka obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita vyvolať tvorbu cytotoxických T-lymfocytov u stavovca tým, že uvedený antigénny prostriedok obsahuje účinné adjuvantné množstvo kombinácie cytokínu alebo lymfokínu, konkrétne MPL(lm) s GM-CSF alebo IL-12, alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu.
Opis obrázkov na pripojených výkresoch
Obrázok 1 ukazuje recipročné konečné titre určené zo skupín Balb/c samíc myší imunizovaných 25 pg TISP10MN(A)(Cys), multiepitopovým peptidom obsahujúcim 39 aminokyselín, ktorý bol pripravený s CFA alebo IFA (trojuholníkmi) alebo 50 pg MPL(tm) 2% stabilnou emulziou (SE) (štvorčeky). Myši boli imunizované 0. deň a dosyťovacia imunizácia bola uskutočnená 28. deň. Titre IgG, IgGl a IgG2a boli určené v sére odobranom 42.deň pomocou ELISA testu.
Z I \
Obrázok 2 ukazuje efekt SE samotnej, MPL '7 samotného alebo MPL(tm) SE na adjuvantné vlastnosti G7-CSF pre antiT1 SP10MN(A)(-Cys) IgG titre. Skupiny 5 samíc Balb/c myší sa imunizovali 25 pg T1SP1OMN(A)(-Cys) O.deň a dosyťovacia imunizácia sa uskutočnila 28. deň s uvedenými adjuvantnými prostriedkami. CFA a IFA boli emulgované s vodným roztokom peptidu v pomere 1:1. GM-CSF bol použitý v množstve pg/dávku. MPL
TM bol podaný myšiam v konečnej koncentrácii 50 pg vo forme vodného prostriedku alebo v dávke 25 pg ako súčasť stabilnej emulzie s 1% SE. Titre sa stanovili 2 týždne po druhej imunizácii. Údaje predstavujú jednotlivé titre stanovené od 5 myší.
Obrázok 3 ukazuje výsledky vírusového neutralizačného testu. Kombinované séra odobrané 42. deň od myší imunizovaných 0. a 28. deň uvedenými prostriedkami sa nariedili (1/1600) a pridali sa k riedeniu HIVMN adaptovaného na T-lymfocyty pred pridaním k AA bunkám in vitro. Po 7 dňoch kultivácie sa supernatanty bunkovej kultúry testovali na vírusovú reverznú transkriptázu ako indikátor replikácie vírusu.
Obrázok 4 ukazuje proliferáciu buniek sleziny od myší imunizovaných T1SP1OMN(A)(-Cys) a rôznymi adjuvantnými prostriedkami. Bunky sleziny boli stimulované in vitro počas 4 dní 3,3 pg/ml T1SP1OMN(A)(-Cys). Výsledky sú uvedené ako zmena v inkorporácii značeného tymidínu v dôsledku in vitro stimulácie T1SP1OMN(A)(-Cys) počas inkorporácie pri absencii stimulácie (delta cpm).
Obrázok 5 ukazuje CTL aktivitu buniek sleziny izolovaných od myší sedem dní po sekundárnej imunizácii. Bunky sleziny sa ziskaii od skupín 3alb/c myší imunizovarýck 0. a 21. deň 50 pg TlSP10MN(A)(-Cys) v prostriedku spoločne s 50 pg MPL™ v 1% SE s alebo bez 10 pg GM-CSF. Bunky sa kultivovali s HIVMN CTL peptidovým epitopom počas 7 dní. Na posledných päť dní sa do kultúr pridával IL-2. Efektorové bunky sleziny sa pridali kP815 bunkám značeným chrómom pulzovaným HIVMN, inému kmeňu označenému ako HIVihb alebo k inému peptidu v uvedených pomeroch. Percento CTL aktivity sa vypočítalo ako:
(špecificky uvoľnená cpm — spontánne uvoľnená cp) x 100 celková maximálna cpm - spontánne uvoľnená cpm · „E:T “je pomer efektorových a cieľových buniek.
Podrobný opis vynálezu
Adjuvans, cytokíny a lymfokíny sú imunomodulačné zlúčeniny, ktoré môžu zosilňovať a udržiavať vývoj a profil imunitnej odpovede proti rôznym antigénom, ktoré sú sami o sebe slabo imunogénne. Vhodným výberom adjuvans, cytokínov a lymfokínov je možné indukovať dobré humorálne a bunkové imunitné reakcie, ktoré by nevznikli pri absencii adjuvans, cytokínov alebo lymfokínov. Konkrétne, adjuvans, cytokíny a lymfokíny majú významné účinky pri zosilnení imunitnej reakcie na podjednotkové a peptidové antigény vo vakcínach. Ich stimulačná aktivita je taktiež prínosná pre vývoj antigénne špecifických imunitných reakcií namierených proti antigénom. Pre väčšinu antigénov, ktoré vyžadujú silné slizničné reakcie, vysoké sérové titre, indukciu CTL a silné bunkové reakcie poskytujú adjuvans, cytokíny a/alebo lymfokíny stimuly, ktoré nie sú poskytnuté väčšinou antigénnych prostriedkov.
Mnoho štúdií hodnotilo rôzne adjuvantné prostriedky na zvieracích modeloch, ale kamenec (hydroxid hlinitý alebo fosforečnan hlinitý) je v súčasnosti jediným adjuvans povoleným pre všeobecné použitie u človeka. Na jednu skupinu adjuvans, stabilnej emulzie skladajúcej sa z kombinácií voda-voleji alebo olej-vo-vode, je zameraná podstatná pozornosť kvôli jej imunopotenciačnej schopnosti. Tieto prostriedky sa zvyčajne skladajú z rôznych kombinácií metabolizovateľných alebo inertných olejov, ktoré stabilizujú a deponujú antigén v mieste injekcie. Jedným takýmto adjuvans je nekompletné Freundove adjuvans (IFA), ktoré obsahuje minerálny olej, vodu a .emuLgačné činidlo. Kompletné Freundove adjuvans. (CFA) je IFA plus mykobaktérie usmrtené teplom. Pri použití týchto typov adjuvans je významné to, že v mieste vpichu často dochádza k podráždeniu, často v dôsledku infiltrácie mononukleárnymi bunkami, ktorá môže spôsobiť granulomatózne lézie. Preto sa hľadajú nové zlúčeniny a prostriedky vhodné na použitie ako adjuvans.
Jednou takouto zlúčeninou je 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A (MPL(tm)), ktorý je dostupný od Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton, MT)). MPL™ je opísaný v U.S. patente č. 4912094 (2), ktorý je tu uvedený ako odkaz.
Nedávno Ribi ImmunoChem Research Inc. pripravila metabolizovateľnú emulziu olej-vo-vode, ktorá pri zmiešaní s MPL vedie k vzniku stabilizovanej emulzie označenej ako MPL SE. Stabilizovaná emulzia sa vytvorí mikrofluidizáciou MPL™ so skvalenovým olejom, glycerolom a fosfatidylcholínom. Súčasný prostriedok je mikrofluidizovaná emulzia GMP kvality. Emulzie obsahujúce 1 alebo 2% oleje sú opísané v príkladoch.
TM
MPL SE nevedie k vzniku žiadnej detekovateľnej tkaivovej patológie v mieste injekcie pri podkožnom alebo intramuskulárnom podaní balb/c myšiam. Stabilizovaná emulzia obsahujúca rovnaké zložky, ale bez MPL™, boli taktiež pripravené s cieľom porovnania. Konkrétne, podkožnej alebo intramuskulárnej imunizácie 40-aminokyselinovým HIV peptidom T1SP1OMN(A)(+Cys) alebo 39-aminokyselinovým peptidom TI SPI 0MN(A)(-Cys) s deletovaným cysteínom (ktorý neobsahuje cysteínový zvyšok v aminokyselinovej pozícii 17 v peptide tvoreného 40-aminokyselinami (+Cys)), ktorý bol pripravený v kombinácii s adjuvans MPL™ SE a GM-CSF, t41r.neviedla k detekovateľnej bunkovej infiltpá.cii alebo ku tkanivovým abnormalitám počas dvoch týždňov po imunizácii.
Predkladaný vynález taktiež zahŕňa použitie monofosforyl lipidu A, prekursora MPL(tm), ktorý je taktiež opísaný v U.S. patente č. 4912094 (2). Do rozsahu predkladaného vynálezu taktiež spadajú deriváty a analógie MPL™ a monofosforyl lipidu A.
Použitie cytokínov a lymfokínov vo vakcinačných prostriedkoch sa ukázalo ako slibné na zlepšenie a zosilnenie potenciálu vakcíny (3). Bolo preukázané, že cytokín interleukín 12 (IL-12) vyvoláva a zosilňuje bunkovú imunitu, prostredníctvom posunu v expanzii populácie pomocných Tlymfocytov smerom k Th-1 cytokínovému profilu (t.z. v myšom modele k IgG2 podtriede) (4-6). U myší bolo preukázané, že rekombinantný myší IL-12 zosilňuje Thl imunitnú reakciu (3).
IL-12 je produkovaný rôznymi bunkami prezentujúcimi antigén, predovšetkým makrofágy a monocyty. Je zásadným elementom v indukcii Thl lymfocytov z naivných T-lymfocytov. Produkcia IL-12 alebo schopnosť reagovať na IL-12 bcla preukázaná ako zásadná pre vývoj protektívnych Thl reakcií, napríklad počas parazitárnych infekcií, konkrétne pri Leishmaióvej infekcii (7). Efekty IL-12 sú sprostredkované z väčšej časti interferónom gaŕna produkovaným NK bunkami a pomocnými T-lymfocytmi. Interferón-γ je zásadný pri indukcii IgG2a protilátok k T-dependentným proteínovým antigénom (8) a IgG3 odpovedi na T-independentné antigény (9). IL-12, pôvodne označovaný ako faktor stimulujúci prirodzené zabi ji&če je heterodimérnym cytokínom (10). Expresia a izolácia IL-12 proteínu v rekombinantných hostiteľských bunkách je opísaná v publikovanej Medzinárodnej patentovej prihláške WO 90/05147 (11).
Iným cytokínom, ktorý má slibný potenciál ako adjuvans, je GM-CSF. GM-CSF je jedným typom faktora stimulujúceho kolónie (CSF). CSF sú rodinou cytokínov, ktoré indukujú progenitorové bunky v kostnej dreni k diferenciácii na špecifické typy zrelých krvných buniek. Ako je opísané v US patente č. 5078996 (12), ktorý je tu uvedený ako odkaz, aktivuje GM-CSF makrofágy alebo prekurzorové monocyty k nešpecifickej protinádorovej aktivite. Bola opísaná nukleotidová sekvencia génu kódujúceho ľudský GM-CSF (12). Plasmid obsahujúci GM-CSF cDNA bol transformovaný do E.coli a bol uložený v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, pod prírastkovým číslom 39900. Ako je opísané v US patente č. 5229496 (13), ktorý je tu uvedený ako odkaz, bol GM-CSF gén taktiež inserovaný do kvasinkového expresného plazmidu a bol uložený v ATCC pod prírastkovým č. 53157. Ďalej, ako je to opísané v US patentu č. 5073627 (14), ktorý je tu uvedený ako odkaz, bola DNA sekvencia kódujúca GM-CSF s odstránenými glykosylačnými miestami uložená v ATCC pod prírastkovým č. 67231.
Bolo preukázané, že GM-CSF zvyšuje expresiu . . <.·· i.v» proteínových molekúl na bunkách prezentujúcich antigén, ktoré zosilňujú imunitnú reakciu (15), a že zvyšuje sekréciu Ig v triedených myších B-lymfocytoch (16).
Bolo preukázané, že aj iné cytokíny alebo lymfokíny majú imunomodulačnú aktivitu, vrátane napríklad interleukínov Ια, 1 β, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 a 18, interferónov α, β a γ, faktora stimulujúceho kolónie granulocytov a faktorov nekrózy nádorov α a β.
Problémy, ktoré súvisia so systémovým podaním akéhokoľvek cytokínu alebo lymfokínu, spočívajú v biologických následkoch spojených s aktivitou cytokínu alebo lymfokínu. Ďalej, efekty cytokínu alebo lymfokínu súvisiace s vývojom imunitných reakcií špecifických pre antigén, by mali byť lepšie, pokiaľ budú udržané lokálne koncentrácie cytokínu alebo lymfokínu.
V skorších štúdiách boli GM-CSF a IL-12 hodnotené samostatne; bolo pozorované zosilnenie rôznych parametrov imunitnej reakcie.
Predkladaný vynález opisuje, že kombináciou antigénu daného cytokínu alebo lymfokínu ako adjuvans a druhého adjuvans (MPL(tm)), výhodne v stabilnej metabolizovateľnej emulzii), je zosilnená imunitná reakcia špecifická pre antigén.
Antigény vybrané na použitie v antigénnych prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu sú peptidy aiebo polypeptidy získané z proteínov, rovnako ako akékoľvek fragmenty nasledujúcich zlúčenín: sacharidov, proteínov, poly,alebo oligonukleotidov alebo iných makromolekulových zložiek. Výraz „peptid“, ako je tu použitý, označuje sériu aspoň 6 aminokyselín a obsahujúci aspoň jednu antigénnu determinantu, zatiaľčo „polypeptid“ je molekula dlhšia ako peptid, ale nevytvárajúca kompletný proteín. Výraz „fragment“, ako je tu použitý, označuje časť sacharidu, proteínu, poly- alebo oligonukleotidu alebo iných makromolekulových zložiek. V prípade HIV obsahuje antigénny prípravok podľa predkladaného vynálezu ďalej kftpipletné HIV proteíny.
Vynález je doložený modelovým systémom využívajúcim peptidové antigény z HIV. Tieto peptidy sú opísané v US patentoch č. 5013548 (17) a 5019387 (18), ktoré sú tu uvedené ako odkazy alebo sú odvodené od takýchto peptidov. Tieto peptidy obsahujú aminokyselinové sekvencie, ktoré zodpovedajú regiónu HIV obalového proteínu, proti ktorému vznikajú neutralizačné protilátky a T-lymfocyty.
HIV je ľudský retrovírus, ktorý je kauzálnym agens syndrómu získanej imunodeficience (AIDS). HIV infikuje Tlymfocyty imunitného systému tým, že sa viaže glykoproteínom svojho vonkajšieho obalu na CD4 (T4) molekulu na povrchu Tlymfocytov, takže využíva CD4 (T4) molekulu ako receptor na prienik do a infikovanie T-lymfocytov. Pokusy o indukci protektívnej imunitnej reakcie špecifickej pre HIV pomocou imunizácie mali veľmi slabý úspech. V súčasnosti sa skúma mnoho postupov v snahe o určenie účinnej a protektívnej vakcinačnej stratégie. Medzi tieto postupy patrí použitie atenuovaných a rekombinantných bakteriálnych vektorov, ktoré exprimujú antigénne epitopy z HIV (19), použitie rekombinantných adenovírusov (20) alebo vírusov vakcínie (21), použitie DNA vakcín (22) a použitie syntetických peptidov obsahujúcich rôzne T-lymfocytárne a β-lymfocytárne epitopy HIV (23).
Bolo preukázané, že glykoprotein gpl20 vonkajšieho obalu HIV je schopný indukovať neutralizačné protilátky u človeka. Bolo preukázané, že rekombinantný proteín PB1, ktorý kóduje približne 1/3 celej gpl20 molekuly, obsahuje časť obalového proteínu, ktorý indukuje tvorbu neutralizačných protilátok. Avšak, štúdie na šimpanzoch preukázali, že ani intaktné gpl20, ani PB1 nie sú schopné vyvolať produkciu vysokých titrov neutralizačných protilátok.
Bežnými metódami boli syntetizovaný krátke peptidy, ktoré zodpovedajú antigénnym determinantám gpl20 a ktoré generujú protilátkovú odpoveď proti gpl20, ktorá neutralizuje vírus a indukuje odpoveď T-lymfocytov a CTL proti vírusu.
Jedným takýmto peptidom je HIV-1MN peptid obsahujúci C4/V3 multiepitop označený ako T1SP1OMN(A)(+Cys), a jeho varianty s deletovaným cysteínom T1SP1OMN(A)(-Cys). Tieto peptidy obsahujú Th, TCtl a B epitopy, ale neindukujú protilátky, ktoré interferujú s väzbou na CD4. Predtým bolo preukázané, že tieto C3/V4 HIV peptidy sú sľubnými kandidátmi pri indukcii imunitných odpovedí, keď sú podané spoločne s CFA adjuvans alebo s adjuvans podobnými CFA (24-29). Tieto peptidy obsahujú epitopy, o ktorých bolo predtým preukázané, že vyvolávajú CD4+ T-lymfocytárnu reakciu u myší ako aj u ľudí, a obsahujú základnú neutralizačnú determinantu ako aj miesto rozpoznávané CD8+ CTL ako u Balb/c myší, tak aj u ľudí, ktorí sú HLA B7+. Nedávno bolo preukázané, že 39aminokyselinový peptid je imunogénny a bezpečný u pacientov infikovaných HIV (28).
T1SP1OMN(A)(+Cys) má nasledujúcu sekvenciu 40aminokyselín:'
Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO.T) (26).
T1SP1OMN(A)(-Cys) bol syntetizovaný bez cysteínu v pozícii 17 a má nasledujúcu sekvenciu 39-aminokyselín:
Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala
Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2) .
Tento cysteínový zvyšok je umiestnený mimo funkčnej epitópy rozpoznávanej Th lymfocytmi, CTL alebo Blymfocytmi. Iné HIV peptidy z rôznych regióno vírusového genómu sú opísané v US Patente č. 5861243 (30), US Patente č. 5932218 (3 1), UŠ Patente č. 5939074 (32), US Patente č. 5993819 (33), US Patente č. 6037135 (34) a Publikovanej Európskej patentovej prihláške č. 671,947 (35), ktoré sú tu taktiež uvedené ako odkazy.
HIV antigén môže byť protein, polypeptid, peptid alebo fragment uvedeného proteínu. Protein môže byť glykoproteín, ako je gp41, gpl20 alebo gpl60. Alternatívne môže protein byť protein kódovaný génmi ako je gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef alebo env. Peptidy získané z takýchto proteínov budú obsahovať aspoň jednu antigénnu determinantu (epitóp) s dĺžkou aspoň šesť aminokyselín.
Imunitná odpoveď na HIV peptid môže byť zosilnená kovalentným naviazaním (konjugáciou) peptidu na farmaceutický prijateľný nosič. Príklady vhodných nosičov sú tetanický toxoid, difterický toxoid,i prílipkovýhemokyanin a iné peptidy zodpovedajúce T-lymfocytárnym epitópom HIV gpl20 glykoproteínu.
V súčasnosti sa predpokladá, že úspešná vakcinačná stratégia proti HIV vyžaduje vyvolanie slizničnej imunity voči HIV, rovnako ako dobrej CTL odpovede. V nedávnej štúdii uskutočnenej na myšiach s použitím TISPIOMN(A) multiepitópového peptidu a slizničného adjuvans (cholerového toxínu) bolo preukázané, že intranazálna imunizácia indukuje neutralizačné sérové IgGl protilátky (36). Ďalšia štúdia taktiež využívajúca peptidy HIV-V3 sľučky preukázala indukciu slizničnej IgA protilátky a silnú bunkovú reakciu, vrátane indukcie CTL špecifických pre peptid (37). Funkčná úloha vysokých titrov systémových a neutralizačných protilátok v prevencii alebo stabilizácii jedincov infikovaných HIV je neznáma, aj keď sa predpokladá, že vysoké titre protilátky špecifickej pre vírus sú významné pri prevencii šírenia vírusu.
Vo výhodnom vyhotovení vynálezu je pripravená stabilná emulzia olej-vo-vode, ktorá obsahuje MPL(tm), ktorá je potom szmiešaná s cytokínmi IL-12 a GM-CSF. Údaje uvedené ďalej ukazujú, že táto kombinácia vedie k indukcii vysokých titrov sérových HlV-neutralizačných protilátok. Kombinácia MPL™ SE a GM-CSF indukuje vysoké titre IgA a IgG protilátok špecifických pre antigén vo vagíne imunizovaných myší. Imunizácia myší jedným z TISPIOMN(A) peptidov pripravených spoločne s MPL™ SE a GM-CSF indukuje silnú bunkovú imunimú odpoveď, ako je určená zvýšením antigénnešpecifickej bunkovej proliferácie a sekrécie cytokínov do kultúry, rovnako ako indukciou CTL reakcie špecifickej pre peptid.
Vo všeobecnosti prostriedky antigén/adjuvans obsahujúce MPL™ alebo MPL™ SE v kombinácii s GM-CSF alebo IL-12 a daným proteínom alebo peptidom indukujú vysoké titre antigénne-špecifických a vírus-neutralizujúcich protilátok, významný posun v pomere podtried IgG smerom k vyššej produkcii komplement-fixačných IgG protilátok (v prospech IgG2a u «myší), vyššiu produkciu cytokínov a bunkovej proliferácie z mononukleárnych buniek v reakcii na stimuláciu antigénom in vitro. Tieto vlastnosti neboli pozorované pri prostriedkoch antigénu a SE v neprítomnosti MPL(tm) s alebo bez
GM-CSF alebo IL-12. Prostriedky podľa predkladaného vynálezu taktiež indukujú dobré bunkové reakcie, ako je určené indukciou CTL.
Prínos MPL™ SE spočíva v tom, že prostriedok neindukuje granulomatóznu akumuláciu a zápal v mieste injekcie; takéto reakcie v mieste injekcie sú obvykle indukované prostriedkami obsahujúcimi adjuvans vo forme emulzie voda-voleji alebo olej-vo-vode.
Schopnosť indukovať zosilnenú imunitnú reakciu v dôsledku stimulačného účinku MPL™ v kombinácii s GM-CSF alebo IL-12 v neprítomnosti lokálneho granulomatózneho zápalu nebola opísaná pre iné adjuvantné prostriedky v súčasnosti navrhnuté na liečbu HIV.
Bola uskutočnená séria pokusov na porovnanie MPL™ (s alebo bez SE) plus GM-CSF alebo IL-12 s MPL(,m), SE, GMCSF, IL-12 alebo CFATFA samostatne alebo spoločne s HIV peptidom. Teraz je prezentovaný súhrn výsledkov, po ktorom nasleduje podrobnejšia diskusia.
...t·.. ‘V'prvom pokuse produkovali Balb/c myši imunizované podkožné C4/V3 HIV peptidom TISP10MN(A)(-Cys), ktorý bol pripravený s MPL™ SE a GM-CSF, sérové titre IgG vyššie ako 10 iba po dvoch injekciách. Protilátková odpoveď bola neutralizačná pre HIV a vykazovala významné zvýšenie v IgGl, IgG2a a IgG2b titroch protilátok špecifických pre peptid. Bunky sleziny stimulovanej v kultúre peptidom uvoľňovali vyššie množstvo IL-4, IL-5 a interferónu-γ. Spolu tieto skutočnosti ukazujú na indukciu vyváženej odpovede Thl/Th2 typu. Vo vaginálnom výplachu od myší imunizovaných MPL™ SE, a GMCSF boli generované IgG a IgA protilátky, ktoré boli špecifické pre Tl SP10MN(A)(-Cys). Tieto skutočnosti ukazujú, že kombinácia MPL™ SE a GM-CSF s HlV-peptidovým antigénom vedie k indukcii výhodného profilu imunitnej reakcie.
V tomto prvom pokuse produkovali Balb/c myši imunizované HIV peptidom T1SP1OMN(A)(-Cys) a adjuvantným prípravkom obsahujúcim SE alebo GM-CSF titre lgG protilátok špecifických pre peptid (tabuľka 1). Stabilná emulzia olej-vovode (SE) skladajúca sa zo skvalénu, glycerolu a emulgačného činidla (fosfatidylcholínu) vykazovala schopnosť zvyšovať titre IgG špecifických pre peptid pri zmiešaní s TlSP10MN(A)(Cys). Titre IgG indukované pri imunizácii 25 g T1SP1OMN(A)(Cys) v SE indukovali titre sekundárnej reakcie, ktoré boli približne 1/5 titrov indukovaných u myší imunizovaných peptidom a CFA s dosyťovacou imunizáciou peptidom v IFA. U príjemcov vakcín formulovaných v CFA/IFA sa bežne vyvíjali titre IgG špecifických pre TlSP10MN(A)(-Cys) v reakcii na primárnu imunizáciu. Pre porovnanie boli myši imunizované 25 g T1SF1OMN(A)(-Cys) peptidu samotného.
Vodné a SE prípravky MPL™ sa porovnávali s reakciou indukovanou pri imunizácii myší s Freundovým adjuvans alebo cýťokínmi IL-12 a GM-CSF. U príjemcov T1SP1OMN(A)(-Cys) v zmesi s IL-12 neboli obvykle generované titre protilátok špecifických pre peptid v niekoľkých opakovaných pokusoch. Naopak, u príjemcov GM-CSF alebo MPL™ SE plus T1SP1OMN(A)(-Cys) sa generovali nízke, ale ľahko detekovateľné titre IgG protilátok. Pridanie IL-12 alebo GMCSF k prípravkom obsahujúcim MPL™ SE plus T1SP1OMN(A)(Cy-s) peptid indukovalo významne vyššie titre Ig.Gsv reakcii na imunizáciu. Ďalej, imunizácia myšej MPL™ SE a GM-CSF v kombinácii viedlo k titrom sekundárnej odpovede, ktoré boli konzistentne vyššie ako titre u myší imunizovaných akýmkoľvek iným testovaným prípravkom. Titre IgG špecifických pre peptid boli vyššie ako titre u myší imunizovaných až 125 pg T1SP1OMN(A)(-Cys) vo Freundovýcb adjuvans.
Žiadúcim rysom imunitnej reakcie špecifickej pre HIV je to, aby sa jednalo o vyváženú bunkovú a humorálnu reakciu. Jednotlivé izotypy imunoglobulíno boli korelované s posunom podtried pomocných T-lymfocytov k prevahe Thl alebo Th2. Cytokíny, ktoré každá z týchto podtried pomocných Tlymfocytov secernuje, majú aktivitu v riadení prešmyku podtried IgG. Titre podtried IgG boli stanovené zo súboru sér odobraných dva týždne po druhej imunizácii (tabuľka 2). Imunizácia myšej T1SP1OMN(A)(-Cys) samotným alebo v prípravku s buď GMCSF alebo s IL-12, viedla k zisteniu nulových alebo nízkych titrov podtried IgG v niekoľkých opakovaných pokusoch. IgG3 protilátky nemohli byť detekované ELISA. Skupiny myší imunizované TISP10MN(A)(-Cys) v emulzii s CFA a pri dosyťovacej imunizácii s IFA generovali predominantnú IgGl protilátkovú odpoveď špecifickú pre T1 SP 10MN(A)(-Cys). Prípravky peptidu s SE, MPL™ SE, MPL™ SE plus IL-12 alebo MPL™ SE plus GM-CSF taktiež generovali vysoké titre IgGl protilátky. Príjemcovia vakcín formulovaných v SE opakovane vykazovali signifikantné titre IgGl, ale nie signifikantné titre IgG2a alebo IgG2b. Zahrnutie MPL™ do SE prípravkov viedlo k zvýšeniu titrov IgG2a a IgG2b protilátok špecifických pre T1SP1OMN(A)(-Cys). Zahrnutí IL-12 alebo GM-CSF spoločne s MPL™ SE a TISP10MN(A)(-Cys) viedlo k posunu pomeru titra IgGl:IgG2a protilátok. Bez cytokínu indukovali vakcíny formulované v MPL™ SE podobné titre IgGl a IgG2a. Ako IL'κ'·12, tak GM-CSF zvyšovali relatívne sérové koncentrácie IgG2a špecifických pre peptid. Ďalej, kombinácia MPL™ SE a GMCSF taktiež indukovala významné zvýšenie titrov IgG2b protilátok špecifických pre T1SP1OMN(A)(-Cys) (47-násobok v porovnaní s MPL™ SE a 74-násobok v porovnaní so SE). Titre generované u myší imunizovaných MPL™ SE a GM-CSF spoločne s TI SP 10MN(A)(-Cys) peptidom boli konzistentne najvyššie zo všetkých vakcinačných skupín.
Na stanovenie toho, Či sú vysoké titre merané zo séra získaného od myší imunizovaných T1SP1OMN(A)(-Cys), MPL™ SE a GM-CSF reprezentatívne pre jednotlivé myši v skupine, boli titre jednotlivých myší v tejto skupine porovnávané s titrami myší imunizovaných peptidom pripraveným vo Freundovom adjuvans (obr. 1). Bolo určené, že priemer jednotlivých sérových titrov pre IgG, IgGl a IgG2a bol podobný titrom meraným zo súboru séra (údaje nie sú uvedené). Spoločná príprava TI SP10MN(A)(-Cys) s MPL™ SE a GM-CSF viedla k indukcii titrov IgG, IgGl a IgG2a, ktoré boli významne vyššie ako titre indukované u myší imunizovaných CFA/IFA. U všetkých myší imunizovaných peptidom formulovaným v MPL™ SE a GM-CSF sa indukovali vyššie titre IgG protilátok ako sú titre zistené u myší imunizovaných CFA/IFA prípravkom. Tieto výsledky ukazujú, že kombinácia MPL™ SE s GM-CSF vyvoláva lepší profil protilátkovej odpovedie ako je: určené vysokými titrami protilátky špecifickej pre peptid a výhodnú distribúciu IgG podtried. Tento prostriedok bežne indukuje najvyššie titre špecifické pre T1SP1OMN(A)(-Cys) zo všetkých použitých vakcín.
Bolo uskutočnené porovnanie anti-TlSP10MN(A)(-Cys) IgG titrov u myší imunizovaných GM-CSF formulovaným spoločne s vodným MPLítm),.. SE alebo·?,,MPL™ SE s cieľom stanovenia efektu GM-CSF ako adjuvantného doplnku (obr. 2). Výsledky ukazujú, že kombinovanie MPL™ SE s GM-CSF a peptidom je jedinečné v indukcii vysokého titra protilátky.
MPL™ plus GM-CSF vyvoláva titre porovnateľné s CFA/IFA. Tak sa zdá, žei adjuvantné vlastnosti MPL™ a GM-CSF sú synergné, ak sú formulované spoločne, kde MPL™ je buď vo vodnej forme alebo vo forme stabilnej emulzie.
v
Ďalej sa stanovili titre protilátky špecifickej pre TI SP 10MN(A)(-Cys) v kvapaline z vaginálnych laváží od myší štyri týždne po druhej imunizácii (tabuľka 3). U myší imunizovaných MPL SE plus GM-CSF boli indukované vyššie titre ako IgA, tak IgG protilátky. Titre protilátok vo vaginálnych lavážach od mytší imunizovaných inými prostriedkami neboli bežne detekované. Pretože pomer IgG ku IgA vo vaginálnych lavážach je v prospech IgG, a pretože slgA nebol meraný, nemôže byť vyslovený záver, že IgA protilátky detekované vo vaginálnej laváží je syntetizovaný lokálne sliznicou. Ďalej, je pravdepodobné, že detekované titre IgA a IgG sú dôsledkom transsudovaného imunoglobulínu secernovaného z plazmatických jbuniek lokalizovaných distálne do vaginálnej sliznice.
Tieto výsledky ukazujú, že myši imunizované HIV peptidom T1SP?1OMN(A)(-Cys), formulovaným s MPL™ SE v kombinácii s GM-CSF alebo IL-12ý majú vysoké titre sérových protilátok špecifických pre peptid.
Pre hodnotenie toho, či sú tieto titre protilátok funkčne efektívne, bolo . sérum analyzované na schopnosť inhibovať infekciu buniek laboratórne adaptovaným kmeňom HIV in vitro. Test meral aktivitu reverznej transkriptázy vírusu, ktorá bola uvoľnená do supernatantu „kulisy z buniek infikovaných vhodným kmeňofn HIV. Sérum od myší imunizovaných MPL™ SE a GM-CSF alebo MPL™ SE a IL-12 v obidvoch prípadoch významne zniž< valo infekčnosť vírusu (obr. 3). Maximum jednotiek vírusovej reverznej transkriptázy boli v rozsahu od 9481 do 10411. Séra od myší imunizovaných týmto prípravkom inhibovaia replikáciu vírusu. Aj pri riedení vírusu iba 1/20 inhibovala sérum od myší imunizovaných MPL™ SE a GM-CSF spoločne s TI SP 10MN(A)(-Cys) vírusovú replikáciu o približne 50%. Sérové neutralizačné titre pre tento prípravok boli určené ako vyššie ako 1600 v porovnaní so 71 pre sérum od myší imunizovaných MPL™ SE, IL-12 a HIV peptidovým prípravkom.
Sérové anti-TlSP10MN(A)(-Cys) titre od týchto skupín myší boli podobné (aj keď o niečo vyššie) ako titre vyvolané imunizáciou myší CFA a IFA. Sérum od myší imunizovaných TISP10MN(A)(-Cys) v emulzii s CFA/IFA nevykazovalo v tomto teste neutralizáciu HIV. Sérum od myší imunizovaných peptidom a kombináciou MPL SE plus GM-CSF ako adjuvans vykazovalo vyššiu neutralizačnú aktivitu ako akékoľvek iné sérum; Pri ekvivalentných riedeniach sérum od myší imunizovaných HIV peptidoni a kombináciou MPL1'4 SE plus GM-CSF neutralizovalo vyššie koncentrácie vírusu ako sérum od príjemcov iných vakcín.
Potom sa merala proľiferácia buniek sleziny špecifická pre HlV-peptid v kultre. Ako pri meraní bunkovej reaktivity na TI SP 10MN(A)(-Cys) boli bunky sleziny kultivované in vitro s peptidom alebo s kontrolnými proteínmi. Test meral inkorporáciu 3H-tymidínu do DNA deliacich sa buniek (tabuľka 4). Oproti bunkám sleziny od myší imunizovaných bez adjuvans proliferovali bunky sleziny od myší imunizovaných TlSP10MN(A)(-Cys) formulovaným so SE silne v reakcii na peptid. Bunky sleziny od príjemco vakcíny nereagovali v kultúre na irelevantný antigén (lyzozým) alebo na stimuláciu bez antigénu. Všetky skupiny reagovali podobne na stimuláciu mitogénom ConA. Vo väčšine skupín nič nepoukazovalo na proliferačnú odpoveď závislú na dávke špecifického antigénu. Pre všetky tri dávky peptidu bol najvyšší stupeň proliferácie určený pre skupiny myší imunizované GM-CSF formulovaným společne s MPL™ SE. Najnižšia proliferácia bola zistená pre bunky sleziny od skupiny myší imunizovaných vakcínami formulovanými s použitím CFA/IFA alebo IL-12 plus HIVpeptidu. Bunky sleziny imunizované peptidom a buď SE alebo GM-CSF inkorporovali podobné koncentrácie tymidínu v kultúre. Tieto výsledky ukazujú, že kombinovanie HIVpeptidu s MPL™ SE spoločne s GM-CSF dodávajú myším bunkám sleziny najvyšší potenciál pre proliferáciu v reakcii na prezentáciu antigénu in vitro.
Kultivované bunky sleziny sa testovali na svoj potenciál secernovať do supernatantu kultúry cytokíny IL-4 (tabuľka 5) a interferón-γ (tabuľka 6). Tieto cytokíny sa stanovili v supernatantoch kultúr získaných po 3 a 6 dňoch in vitro stimulácie antigénom alebo mitogénom. Meranie IL-4, cytokínu asociovaného s Th2 pomocnými lymfocytmi, preukázalo, že zatiaľčo všetky skupiny produkovali detekovateľné koncentrácie v reakcii na stimuláciu mitogénom ConA na 3. deň, iba myši imunizované MPL™' SE alebo MPL™ SE plus GM-CSF produkovali IL-4 v reakcii na stimuláciu peptidom. Iba myši imunizované MPL™ SE plus GM-CSF a T1SP1OMN(A)(-Cys) secernovali do kultúry detekovateľné množstvá IL-4 pri všetkých dávkach peptidu použitých na stimuláciu buniek sleziny. Na 6. deň kultivácie secernovali bunky sleziny od myší imunizovaných peptidom spoločne s MPL™ SE plus GM-CSF vyššie množstvo IL-4 ’äko bunky od myší imunizovaných peptidom spoločne s MPL™ SE, MPL™ SE plus IL-12 alebo SE. Koncentrácie IL-4 boli ešte vyššie ako koncentrácie indukované stimuláciou týchto buniek v kultúre ConA. Bunky sleziny kultivovanej od myší imunizovaných MPL™ SE plus GM-CSF taktiež secernovali do kultúry detekovateľné množstvá IL-5 (čo je iný cytokín asociovaný s Th2 pomocnými lymfocytmi (nie je uvedené)) v reakcii na 6-dennú stimuláciu TI SP 10MN(A)(-Cys). Bunky sleziny od žiadnej inej skupiny neprodukovali detekovateľné koncentrácie IL-5 v kultúrach.
V reakcii na 3-dennú stimuláciu kultúr ConA secernovali bunky sleziny do všetkých skupín myší detekovateľné koncentrácie interferónu-γ do kultúry (tabuľka 6). Iba bunky od myší imunizovaných MPL™ SE alebo MPL™ SE plus GM-CSF produkovali detekovateľné koncentrácie interferónu-γ v reakcii na 3-dennú stimuláciu HIV peptidom. Na konci 6-dennej stimulácie kultúry boli najvyššie koncentrácie interferónu-γ pozorované v reakcii na ConA a peptid. Zaujímavé boli koncentrácie interferónu-γ merané zo supernatantov kultúr buniek sleziny od myší imunizovaných MPL™ SE alebo MPL™ SE plus GM-CSF. Bunky sleziny od týchto dvoch skupín secernovali významne vyššie koncentrácie interferónu-γ do supernatantov kultúry ako bunky sleziny od myší imunizovaných peptidom spoločne s MPL™ SE plus IL-12 alebo SE.
Výsledky prvého pokusu ukazujú, že zahrnutie MPL do stabilnej emulzie olej-vo-vode, a potom zmiešanie emulzie s HIV peptidom TI SP 10MN(A)(-Cys) a GM-CSF, viede k indukcii neutralizačných protilátok. Ďalej, súčasné formulovanie GM-CSF s MPL™ SE a vakcinačným antigénom vedie k zvýšeným hladinám IL-4, IL-5 a interferónu-γ secernovaným do supernatantov kultúr a zosilňuje proliféračnú odpoveď buniek sleziny stimulovaných v kultúre imunizačným antigénom. Prostriedok taktiež indukuje najvyššie titre IgG,
IgG2a a IgG2b zo všetkých dostupných vakcín. Iba skupina myší imunizovaných MPL™ SE a GM-CSF spoločne s peptidom mala detekovateľné titre IgG a IgA vo vaginálnej laváži opakovane v niekoľkých pokusoch. Kombinácia MPL™ SE, IL-12 a peptidu taktiež viedla k zvýšeným titrom IgGl a IgG2a, lepšej neutralizácii vírusu, lepšej proliferácii buniek sleziny a sekrécii IL-4 a interferónu-γ.
Imunizácia myší akýmkoľvek jediným adjuvans pripraveným s HIV peptidom neprodukovala imunitné reakcie s tvorbou neutralizačných protilátok.
Často bolo pozorované, že imunizácia myší TI SP 10MN(Ä)(-Cys), spoločne s MPL™ SE alebo MPL™ vo vodnom prípravku, indukovala dobré titre protilátky. Tieto prostriedky avšak konzistentne neindukovali imunitnú reakciu majúcu titre vaginálnych protilátok, titre neutralizačných protilátok (alebo silnú CTL odpoveď, ako je to opísané ďalej v príklade 8). Príležitostne indukovali MPL™ SE alebo MPL s peptidom merateľné titre IgA a IgG vo vaginálnej kvapaline. V niektorých pokusoch viedlo pridanie buď IL-12, alebo GM’T'Tlyf
CSF k MPL vo vakcinačnom prípravku k dosiahnutiu titrov, ktoré boli podobné ako titre produkované u myší imunizovaných CFA/IFA alebo akýmkoľvek z MPL™ SE prípravkov s alebo bez cytokínu. Toto pozorovanie naznačuje, že SE forma MPL™ nie je nutná na dosiahnutie vysokých titro antiséra špecifického pre HlV-peptid. Pridanie GM-CSF k SE vehikulu zvyšuje titre špecifické pre peptid v porovnaní s myšami imunizovanými SE samotným alebo SE a IL-12. Vo všeobecnosti avšak bola indukcia dobrých titrov IgG2a a IgG2b protilátok závislá na. formulovaní peptidu s MPL™ SE a GM-CSF. Je zaujímavé, že tento prostriedok indukoval titre IgG, ktoré boli podobné ako titre indukované počas imunizácie inými prostriedkami, ako je CFA/IFA a peptid. Kombinácia MPL™ SE s GM-CSF a peptidom bola jedinou formuláciou, ktorá vykazovala indukciu ako vysokých titrov neutralizačnej protilátky, tak CTL (viď príklad 8). Použitie IL-12 s MPL™ SE a peptidom taktiež indukovalo priaznivý profil imunitnej reakcie. Výsledky ukazujú, že MPL SE pripravený súčasne s cytokínmi GM-CSF a IL-12 spôsobuje kvalitatívny posun v protilátkovej reakcii v porovnaní s imunizáciou CFA a IFA. Predpokladá sa, že tento posun je zodpovedný za zvýšené koncentrácie IgG2a a IgG2b.
V druhom pokuse sa postupovalo podľa protokolu prvého pokusu s Balb/c-HIV peptidom s použitím drobných modifikácií. MPL™ bol taktiež aplikovaný vo vodnej forme, s alebo bez cytokínu.
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom T1SP1OMN(A)(Cys) bez adjuvans neindukovala významné titre protilátky. Naopak, formulovanie peptidovélio antigénu s rôznymi kombináciami adjuvans/cytokínov viedlo k indukcii vysokých titrov protilátky po 2 imunizáciách.
'Imunizácia peptidom a IL-12 alebo len SE viedla, k dosiahnutiu titrov, ktoré boli nerozlíšiteľné od titrov indukovaných bez adjuvans (tabuľka 7). Príjemcovia peptidu pripraveného spoločne s GM-CSF mali slabé zvýšenie titrov. V porovnaní s príjemcami vakcíny obsahujúcej CFA/IFA vykazoval mikrofluidizovaný MPL™ SE podobný titer protilátky špecifickej pre peptid. V porovnaní s príjemcami vakcíny .pj^ahujúcej CFA/IFA indukoval, MPL™ SE .,\yššie koncentrácie IgG2a špecifických pre peptid. Použité imunizačné protokoly mohli ovplyvniť pozorovaný titer protilátok. Avšak imunizácia myší peptidom pripraveným s MPL™ (vodným) indukovala vysoké titre protilátky špecifickej pre peptid. Pridánie GM-CSF alebo IL-125 k tomuto prostriedku viedlo k zvýšeniu titrov na viac ako 106. Preto indukuje kombinácia HIV peptidu s MPL™ a cytokínmi IL-12 alebo GM-CSF vysoký tietr protilátky špecifickej pre peptid.
Iba skupina myší imunizovaných peptidom a buď MPL™ a IL-12 alebo MPL™ a GM-CSF generovala relatívne vysoké titre protilátky v kvapaline z vaginálnej laváže (tabuľka 8). Ďalej len skupina myší imunizovaných MPL™ a IL-12 s peptidom produkovala IgA špecifické pre peptid.
Proliferačná kapacita buniek sleziny v kultúre bola určená s použitím inkorporácie tymidínu v reakcii na in vitro r
stimuláciu peptidom. Údaje v tabuľke 9 sú prezentované tak, aby bola normalizovaná proliferácis, štandardizáciou vzhľadom k maximálnej proliferácii, ako bola určená pomocou stimulácie ConA. Bunky sleziny od myší imunizovaných MPL SE spoločne s buď GM-CSF alebo IL-12 rovnako ako od myší imunizovaných iba GM-CSF demonštrovali slabú proliferáciu v reakcii na peptid. Naopak, bunky sleziny od myší imunizovaných peptidom v kombinácii s MPL a GM-CSF vykazovali významnú proliferáciu.
Taktiež sa merala produkcia cytokínov z buniek sleziny kultivovaných in vitro. Pre IL-4 iba myši imunizované MPL™ SE v kombinácii s GM-CSF a T1SP1OMN(A)(-Cys) secernovali dobré hladiny IL-4 v reakcii na stimuláciu peptidom (tabuľka 10). Pre interferón-γ produkovali myši imunizované MPL™„SE a buď GM-CSF alebo IL-12 alebo vodnýmJMPL™ s GM-CSF alebo IL-12 ľahkoo detekovateľné koncentrácie tohto cytokínu do supernatantu kultúry (tabuľka 11).
Tak indukovala kombinácia cytokínov GM-CSF alebo IL12 s MPL™ alebo MPL™ SE vysoké titre protilátky špecifickej pre peptidový antigén. Titre boli podobné titrom indukovaným imunizáciou myší peptidom a CFA/IFA. Údaje ukazujú, že tieto kombinácie taktiež indukujú najvyššie proliferačné reakcie buniek sleziny v kultúre, a že indukujú populáciu buniek sleziny, ktoré secernujú najvyššie koncentrácie interferónu-γ v reakcii na stimuláciu peptidom.
Výsledky tohto druhého pokusu ukazujú, že príprava TI SP 10MN(A)(-Cys) spoločne s MPL™ a cytokínmi GM-CSF a IL-12 indukuje profil imunitnej reakcie, ktorý je podobný alebo lepší, ako profil indukovaný u myší imunizovaných peptidom a CFA pri použití dosyťovacej imunizácie peptidom a IFA.
Histologické hodnotenie (nie je uvedené) miesta injekcie dva týždne po druhej imunizáčii ukázalo, že myši imunizované mikrofluidizovaným MPL™ SE nevytvárajú mononukleárnu infiltráciu dermis. Tkanivá farbené hematoxylínom/eosínom vyzerali ako tkanivá pripravené od jedincov, ktorým nebolo podané žiadne adjuvans. Naopak, u Balb/c myší imunizovaných CFA a IFA ako adjuvans (emulzia voda-v-oleji) bola preukázanámasívna akumulácia mononukleárnych buniek v 'tomto regióne. Príjemcovia MPL™ SE spoločne s GM-CSF a peptidom vykazovali nevýznamnú, ale aj napriek tomu zreteľnú infiltráciu mononukleárnymi bunkami v porovnaní s príjemcami MPL™ SE bez GM-CSF. Tkanivá od myší imunizovaných len GM-CSF a peptidom neboli vyšetrované.
Protokoly druhého pokusu ,boli. použité v,..r-treťom pokuse, v ktorom boli namiesto Balb/c myší použité Swiss-Webster myši. Swiss-Webster myši boli použité na určenie adjuvantných účinkov pri použití HIV peptidového antigénu v situácii, keď
MHC-restrihovaný epitóp pomocných T-lymfocyto neovplyvňuje imunitnú reakciu. Swiss-Webster myši sú krížený kmeň myší; preto neboli uskutočnené žiadne štúdie na bunkách. V tomto pokuse sa merali len recipročné titre IgG a IgA protilátok proti HIV peptidu. Ako je uvedené v tabuľkách 12 a 13, bol profil reakcie porovnateľný s profilom získaným od Balb/c myší v prvom a druhom pokuse.
V štvrtom pokuse sa postupovalo podľa protokolu druhého pokusu, s drobnými modifikáciami s použitím Balb/c myší. Ako je uvedené v tabuľke 14, adjuvantné prípravky MPL spoločne s GM-CSF alebo s IL-12 vyvolávali významne vyššiu IgG GMT reakciu ako MPL™ samotný. Ako je uvedené v tabuľke 15, adjuvantné prípravky MPL™ SE spoločne s GMCSF vyvolávali významnú tvorbu IgG2b podtriedy. Adjuvantné prípravky MPL™ spoločne s GM-CSF alebo s IL-12 vyvolávali významne vyššiu IgG2a reakciu ako MPL™ samotný, zatiaľčo prípravky MPL™ SE spoločne s buď GM-CSF alebo s IL-12 ’T’Xyf vyvolávali vyššiu reakciu v IgG2a podtritde ako MPL samotný. Ako je uvedené v tabuľke 16, adjuvantné prípravky MPL spoločne s GM-CSF alebo s IL-12 vyvolávali významne vyššie titreíIgG vo vaginálnej kvapaline ako MPL™ samotný. Nakoniec, ako je uvedené na obr. 4, adjuvantné prostriedky MPL™ spoločne s GM-CSF alebo s IL-12, rovnako ako prostriedky MPL™ SE spoločne s GM-CSF alebo IL-12 vykazovali lepšiu proliferáciu buniek sleziny ako MPL™ samotný alebo MPL™ SE samotný v príslušnom poradí.
V piatom pokuse sa postupovalo podľa protokolu druhého ϋ,νι-.-,. pokusu, s drobnými modifikáciami, s použitím. Balb/c myší; IL12 nebol použitý v adjuvantných prostriedkoch. Ako je uvedené v tabuľke 17, adjuvantné prípravky MPL™ spoločne s GM-CSF vyvolávali významne vyššiu IgG2a a IgG2b reakciu ako MPL samotný. Ďalej, adjuvantné prípravky MPL™ spoločne s GMCSF vyvolávali významne vyššiu reakciu pre všetky podtriedy IgG ako MPL™ samotný.
V šiestom pokuse sa postupovalo podľa protokolu druhého pokusu, s drobnými modifikáciami, s použitím Balb/c myší; IL-12 nebol použitý v adjuvantných prostriedkoch. HIV peptidom bol peptid s dĺžkou 40 aminokyselín (v dôsledku prítomnosti cysteínu v aminokyselinovej pozícii 17). Ako je uvedené v tabuľke 18, adjuvantné prípravky obsahujúce MPL™ spoločne s GM-CSF vyvolávali významne vyššiu reakciu pre všetky podtriedy IgG ako MPL™ samotný; a významne vyššiu reakciu pre všetky podtriedy ako MPL™ samotný.
V siedmom pokuse sa postupovalo podľa protokolu šiesteho pokusu, s drobnými modifikáciami, s použitím Balb/c myší; IL-12 nebol použitý v adjuvantných prostriedkoch. Ako je uvedené v tabuľke 19, adjuvantné prípravky obsahujúce MPL™ SE spoločne s GM-CSF vyvolávali významne vyššiu reakciu pre všetky podtriedy IgG ako MPL™ SE samotný; a adjuvantné prípravky obsahujúce MPL™ spoločne s GM-CSF vyvolávali významne vyššiu reakciu pre všetky podtriedy ako MPL samotný. .
V ôsmom pokuse, ktorý bol meraním funkčnej bunkovej imunity, sa hodnotila schopnosť buniek sleziny od myší imunizovaných MPL™ SE alebo MPL™ SE plus GM-CSF formulovaných spoločne s multiepitópovým peptidom T1SP1OMN(A)(+Cys), generovať CTL odpovede špecifické pre HIVmn. . . .
Ako je uvedené na obr. 5, bunky sleziny od myší imunizovaných MPL™ SE alebo MPL™ SE plus GM-CSF demonštrovali nižšiu aktivitu k cieľovým bunkám, ktoré boli buď neznačené alebo pulzne značené IIIB CTL epitópom. Bunky sleziny od myší imunizovaných T1SP1OMN(A)(+Cys) pripraveným spoločne s MPL™ SE a GM-CSF indukovali dobrú HIVMN-špecifickú CTL aktivitu po jedinej imunizácii. HIVMnšpecifická CTL sprostredkovaná lýza cieľových buniek bola značne zosilnená pri meraní uskutočnenom sedem dní po sekundárnej imunizácii (obr. 5). V samostatných pokusoch myši imunizované bez adjuvans neindukovali CTL reakcie. Myši imunizované vodným MPL™ a peptidom generovali nízke (<30%) CTL odpovede špecifické pre peptid.
Jedným problémom pri hodnotení potenciálnej účinnosti imunogénnych prostriedkov proti HIV je to, že u primátov iných ako človek sa po infekcii HIV nerozvíjajú príznaky podobné AIDS. Potenciálny zvierací model teda nenapodobňuje príznaky spôsobené HIV. Našťastie sa u primátov iných ako človek infikovaných vírusom opičej imunodeficiencie (SIV), ktorý je veľmi príbuzný s HlV, vyvíjajú príznaky podobné AIDS.
Toto umožňuje hodnotení SIV antigénov na primátoch. SIV antigén môže byť protein, polypeptid, > peptid alebo fragment uvedeného proteínu. Protein môže byť glykoproteín, ako je gp41, gpl20 alebo gpl60. Alternatívne môže protein byť protein kódovaný génmi ako je gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef alebo env. Peptidy získané z takýchto proteínov budú obsahovať aspoň jednu antigénnu determinantu (epitóp) s dĺžkou aspoň šesť aminokyselín.
Analogicky. s HIV sú u primátov použité multiepitópové SIV peptidy. Bol uskutočnený pokus pre hodnotenie toho, či môžu rôzne peptidy v kombinácii s MPL™ SE a GM-CSF vyvolať CTL odpoveď. Opice makak rhesus boli imunizované podkožné v 0., 4., 8. a 18. týždni MPL™ SE a GM-CSF spoločne s jedným z nasledujúcej sady troch peptidov (viď tabuľku 20):
(1) Každý peptid obsahoval nasledujúci Mamu A*01 restrihovaný CTL epitóp:
Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO: 3) (gag) (38, 39)
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 4) (pol) (40)
Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:5) (env) (40);
(2) Alternatívne bol každý z týchto troch peptidov naviazaný na promiskuitný Th-lymfocytárny epitóp majúci nasledujúcu sekvenciu:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID NO: 6) (adaptované zo 41).
J
Tak mali tieto tri peptidy nasledujúce sekvencie:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO 7);
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala'Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 8);
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:9).
Heparinizovaná krv sa odoberala každé dva týždne a mononukleárne, bunky periférneej krvi sa analyzovali na CTL pomocou testu uvoľňovaníia 51Cr, tetramerového farbenia Čerstvých mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) a tetramerového farbenia kultivovaných PBMC. Tetramerové farenie čerstvých PBMC a cytolytické usmrtenie podľa uvoľnenia 51Cr neukázali žiadnu aktivitu. Avšak imunizácia opíc makak rhesus Mamu A*01 restrihovaným Th/CTL peptidovým koktailom formulovaným s MPL™ SE a GM-CSF viedla
.. í . , ·. ......
k detekcii tetramér-pozitívnych CD8 + T-lymfocytov. Výsledky uvedené v tabuľkách 21-24 sú uvedené ako percento pozitívnych, tetramér-pozitívnych CD8+ (tabuľky 21-23) alebo CD4+ (tabuľka 24) T-lymfocytov detekovaných v PBMC kultivovaných s príslušným peptidom počas 11 dní.
Všetky štyri mamu A*01 pozitívne zvieratá imunizované CTL epitópmi buď s (Rh55, Rh 142) alebo bez (Rh73, Rh 80) Th epitópmi demonštrovali CD8 pozitívny tetramér pozitívne bunky špecifické pre gag, pol a env. Ako sa predpokladalo, neboli žiadne tetramér-pozitívne CD8 lymfocyty detekované u Mamu A*01 negatívnych zvierat (Rh41, Rh47). SIV gag a env špecifické imunitné reakcie boli pozorované po primárnej imunizácii, zatiaľčo pol špecifická tetramérová pozitivita bola pozorovaná po dosyťovacej imunizácii. Pretože dosyťovacia dávka v 18. týždni nezvýšila ďalej reakciu, nie sú v tabuľkách 21-24 uvedené údaje pre,-obdobie po 14 týždňov.
Spolu je možné uviesť, že imunizácia opíc makak rhesus Mamu A*01 restrihovanými Th/SIV gag, pol a env CTL epitópovými koktailmi pripravenými s MPL™ SE a ľudským GM-CSF ako adjuvans vyvolávala bunkovú odpoveď, ako je dokázané senzitívnym a špecifickým tetramérovým testom.
Proteín porin B od Neisseria gonorrhoeae, taktiež známy ako PIB proteín, bol exprimovaný rekombinantné (42, tu uvedené ako odkaz) a je kandidátovým antigénom pri prevencii alebo léčbe infekcií spôsobených Neisseria gonorrhoeae.
Bola uskutočnená séria pokusov na porovnanie MPL (s alebo bez SE) plus GM-CSF alebo IL-12 a MPL™ (s alebo bez SE) samotným spoločne s modifikovanou verziou porinu B Neisseria gonorrhoeae, v ktorom je 16 aminokyselín na aminokonci z’fágu a potom nasleduje zrelá forma porinu B. Teraz bude prezentovaný súhrn výsledkov.
V prvom pokuse Swiss-Webster myši imunizované podkožné v oblasti pánvy rekombinantným porinom B generovali titre protilátky špecifickej pre antigén, čo dokazuje, že porin B je vhodným potenciálnym antigénom. Pridanie GMCSF k MPL a porinu B viedlo k zvýšeniu sérových titrov IgG a IgG2a v porovnaní s príjemcami MPL™ a porinu B (viď tabuľky 25 a 26).
V druhom pokuse Swiss-Webster myši imunizované podkožné v oblasti pánvy porinem B plus IL-12 a MPL™ alebo MPL™ SE generovali vyššie titre protilátky špecifické pre antigén (predovšetkým IgG) v porovnaní s príjemcami MPL™ alebo MPL™ SE a porinu B. Vyššie titre boli pozorované ako po primárnych, tak po sekundárnych imunizáciách. Zahrnutie IL-12 do prostriedkov viedlo k približne 10-násobnému zvýšeniu titrov IgG v kvapaline z vaginálnej laváže (viď tabuľka 27).
Prečistený natívny fúzny (F) proteín ľudského respiračné syncytiálneho vírusu (RSV) v prirodzenej dimérnej forme je kandidátom na antigén pri prevencii infekcií spôsobených RSV (43, tu uvedené ako odkaz).
Bola uskutočnená séria štúdií pre porovnanie MPL s alebo bez SE) plus GM-CSF alebo IL-12 a MPL™ (s alebo bez SE) fosforečnanom hlinitým alebo Stimulon(tm) QS-21 samotným, spoločne s prečisteným natívnym F proteínom RSV. Teraz bude prezentovaný súhrn výsledkov.
V prvom pokuse Balb/c myši imunizované podkožné natívnym RSV F proteínom generovali titre protilátky špecifickej pre antigén, čo dokazuje, že F proteín je vhodným potenciálnym antigénom. Pridanie GM-CSF k MPL™ viedlo k zvýšeniu titrov protilátok proti F proteínu v porovnaní s MPL™ samotným, ako po primárne, tak po sekundárnej imunizácii (viď tabuľka 28), a taktiež indukovalo silnejšiu bunkovú odpoveď na in vitro stimuláciu buniek sleziny ako MPL™ samotný (viď tabuľka 29). Pridanie GM-CSF k MPL™ SE viedlo k zosilneniu primárnej IgG odpovede na F proteín v porovnaní s MPL™ SE samotným (viď tabuľka 28).
Druhý pokus bol uskutočnený podľa prvého pokusu. Pridanie GM-CSF k MPL™ viedlo k zvýšeniu titrov protilátok proti F proteínu v porovnaní s MPL™ samotným, ako po primárnej, tak po sekundárnej imunizácii (viď tabuľka 30). Pridanie GM-CSF k MPL™ SE viedlo taktiež k zvýšeniu titrov protilátok proti F proteínu v porovnaní s MPL™ SE samotným po primárnej. imunizácii (viď tabuľka 30). Pridanie GM-CSF k prípravkom F proteínu plus MPL™ alebo MPL™ SE indukovalo vyššie percento RSV-špecifickej splenickej CTL aktivity ako prípravky bez GM-CSF, ako bolo stanovené na bunkách sleziny od imunizovaných myší (viď tabuľka 31).
V treťom pokuse bol IL-12 zamenený za GM-CSF. Kombinácia IL-12 a MPL™ indukovala vyššie titre IgG po primárnej imunizácii v porovnaní s prípravkom F proteínu a MPL™ samotným (viď tabuľka 32). Avšak, pridanie IL-12 k MPL™ alebo MPL™ SE nemalo žiadny vplyv na RSVšpecifickú CTL aktivitu, ako bola zmeraná in vitro stimuláciou efektorových buniek (viď tabuľka 33).
Jeden pokus bol uskutočnený pre porovnanie MPL™ (s alebo bez SE) plus GM-CSF s MPL™ (s alebo bez SE) samotným, spoločne s NP (nukleokapsidovým) proťeínom chrípkového vírusu. Neboli dostupné dostatečné množstvá NP pre uskutočnenie pokusov pre meranie titrov protilátok. Myši imunizované NP peptidom s alebo bez adjuvans boli analyzované na odpoveď buniek sleziny na antigénnu stimuláciu 14 dní po poslednej imunizácii. Použitie GM-CSF v prostriedkoch obsahujúcich MPL™ alebo MPL™ SE viedlo k značnej redukcii CTL aktivity (údaje nie sú uvedené).
- Nie je jasné, prečo bol získaný tento anomálny výsledok. Môže sa jednať o technický problém pri uskutočnení testu.
Antigénne prostriedky podľa predkladaného vynálezu modulujú imunitnú odpoveď tým, že zlepšujú protilátkovú odpoveď hostiteľa a bunkovú imunitu po podaní antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita, a adjuvantné množstvo MPL™ (vo vodnej forme alebo vo forme stabilnej emulzie) v kombinácii s cytokínom alebo lymfokínom, konkrétne GMCSF alebo IL-12. O ďalších cytokínoch alebo lymfokínoch bolo preukázané, že majú imunomodulačnú aktivitu, vrátane napríklad interleukínov Ια, 1β, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 a 18, interferónov α, β a γ, faktora stimulujúceho kolónie granulocytov a faktorov nekrózy nádorov a a β.
Agonisty alebo antagonisty uvedených cytokinov alebo lymfokínov taktiež spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Výraz „agonista“, ako je tu uvedený, označuje molekulu, ktorá zosilňuje aktivitu alebo funkciu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu. Príkladom takéhoto agonistu je zlúčenina napodobujúca uvedené cytokiny alebo lymfokíny. Výraz „antagonista“ označuje molekulu, ktorá inhibuje alebo bráni aktivite uvedených cytokinov alebo lymfokínov. Príkladom takýchto antagonistov sú solubilýy receptor pre IL-4 a solubilný receptor pre TNF.
Výraz „efektívne adjuvantné množstvo“, ako je tu použitý, označuje dávku kombinácie adjuvans opísaných vyššie, ktorá je vhodná na vyvolanie zosilnenej imunitnej reakcie u stavovca. Konkrétna dávka závisí od veku, hmotnosti a zdravotného stavu hostiteľa, rovnako ako od spôsobu podania antigénu. Vo výhodných vyhotoveniach využíva kombinácia adjuvans MPL v dávke 1-100 pg/dávku. Vhodné dávky budú ľahko určené odborníkom v odbore. Antigénne prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť taktiež zmiešané s imunologický prijateľnými riedidlami alebo nosičmi bežným spôsobom pre prípravu injekčných kvapalných roztokov alebo suspenzií.
«^Antigénne prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú podávané ľuďom alebo iným stavovcom rôznymi cestami, vrátane napríklad intranazálneho, orálneho, vaginálneho, rektálneho, parenterálneho, intraderinálneho, transdermálneho (viď napríklad Medzinárodná prihláška WO 98/20734 (44), tu uvedená ako odkaz), intramuskulárneho, intraperitoneálneho, podkožného, intravenózneho a intraarteriálneho podania. Dávka antigénnej zložky alebo zložiek v antigénnom prostriedku sa bude líšiť podľa typu určitého antigénu, rovnako ako podľa veku, hmotnosti a zdravotného stavu príjemcu vakcíny a spôsobu podania. Opäť budú vhodné dávky ľahko určené odborníkom v odbore. Je výhodné, aj keď nie je nutné, aby antigén a kombinácie adjuvans boli podané v rovnakej dobe. Počet dávok a dávkovací protokol pre antigénny prostriedok bude taktiež určený odborníkom v odbore. V niektorých prípadoch môžu adjuvantné vlastnosti kombinácie adjuvans znižovať počet dávok alebo dobu dávkovacieho protokolu.
Kombinácie adjuvans podľa predkladaného vynálezu sú vhodné na použitie v antigénnych prostriedkoch obsahujúcich rôzne antigény z rôznych patogénnych mikroorganizmov, vrátane vírusov, baktérií, húb alebo parazitov infikujúcich človeka alebo iné stavovce alebo z nádorových buniek. Antigén môže obsahovať peptidy alebo polypeptidy odvodené od proteínov rovnako ako fragmenty nasledujúcich zlúčenín: šäčharidov, proteínov, poly alebo oligonukľéotidó'v, nádorových buniek, alergénov, amyloidového proteínu alebo iných makromolekulových zložiek. V niektorých prípadoch obsahuje antigénny prípravok viac ako jeden antigén.
Požadované vírusové vakcíny obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré sú .určené pri prevencii a/alebo na liečbu ochorení,, spôsobených napríklad, vírusom ľudskej imunodeficiencie, vírusom opičej imunodeficiencie, respiračné syncytiálnym vírusom, parainfluenzovými vírusmi typov 1-3, chrípkovým vírusom,
Herpes simplex vírusom, ľudským cytomegalovírusom, vírusom hepatitídy A, vírusom hepatitídy B, vírusom hepatitídy C, ľudským papillomavírusom, poliovírusom, rotavírusom, calicivírusmi, osýpkovým vírusom príušníc, ružienkovýmvírusom, adenovírusom, vírusom besnoty, vírusom psinky, vírusom dobytčieho moru, koronavírusom, parvovírusom, vírusmi infekčnej rinotracheitídy, vírusom mačacej leukémie, vírusom mačacej infekčnej peritonitídy, vírusom vtáčej infekčnej bursitídy, vírusom Newcastle ochorenia, vírusom Marekovej choroby, vírusom prasačieho respiračného a reprodukčného syndrómu, vírusom konskej arteritídy a rôznymi vírusmi encefalitídy.
Požadované bakteriálne vakcíny obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré sú určené na prevenciu a/alebo liečbu ochorení spôsobených napríklad, baktériami Haemophilus influenzae (ako typizovateľnou tak netypizovateľnou), Haemophilus somnus, Moraxelía catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, komplexom Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.
Požadované vakcíny proti hubovým patogénom obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré sú určené na prevenciu a/alebo liečbu ochorení spôsobených napríklad, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma.
Požadované vakcíny proti parazitom obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré sú určené na prevenciu a/alebo liečbu ochorení spôsobených napríklad, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.
Požadované vakcíny na vyvolanie terapeutického alebo profylaktického protinádorového účinku u stavovca obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré obsahujú nádorový antigén vrátane napríklad, prostatického špecifického antigénu, karcinoembryonálneho antigénu, MUC-1, Her2, CA-125 a MAGE-3.
Požadované vakcíny na zmiernenie reakcie na alergény u stavovca obsahujúce adjuvantné prípravky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú tie, ktoré obsahujú alergén alebo jeho fragment. Príklady takýchto alergénov sú opísané v US patente č. 5830877 (45) a v publikovanej Medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 99/51259 (46), ktoré sú tu uvedené ako odkazy, vrátane peľu, hadích jedov, zvieracej srsti, hubových spór a liekov (ako je penicilín). Vakcíny interferujú s produkciou IgE protilátok, ktoré sú známou príčinou alergických reakcií.
Požadované vakcíny na prevenciu alebo liečbu ochorení charakterizovaných ukladaním amyloidu u stavovca, ktoré obsahujú adjuvantné kombinácie podľa predkladaného vynálezu, zahŕňajú tie, ktoré obsahujú amyloidový peptid (APP). Takýmto ochorením je predovšetkým Alzheimerova choroba, amyloidóza a amyloidogénna choroba. β-amyloidový peptid (tiež označovaný ako Αβ peptid) je 42-aminokyselinový fragment APP, ktorý sa tvorí štiepením APP β a γ sekretázou a ktorý má nasledujúcu sekvenciu:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala íle íle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val íle Ala (SEQ ID NO: 10).
U niektorých pacientov prebieha ukladanie amyloidu vo forme agregovaného Αβ peptidu. Prekvapivo bolo teraz zistené, že podanie izolovaného Αβ peptidu indukuje imunitnú reakciu proti Αβ peptidovej zložke amyloidových depozít u stavovca (47). Preto môžu vakcíny podľa predkladaného vynálezu obsahovať adjuvantné kombinácie podľa predkladaného vynálezu plus Αβ peptid, rovnako ako fragmenty Αβ peptidu a protilátky proti Αβ peptidu alebo jeho fragmentom. Jedným takýmto fragmentom Αβ peptidu je 28-aminokyselinový peptid majúci nasledujúcu sekvenciu (48):
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO: 11).
V prípade HIV a SIV obsahuje antigénny prípravok aspoň jeden protein, polypeptid, peptid alebo fragment získaný z uvedeného proteínu. V niektorých prípadoch obsahuje antigénny prostriedok viac HIV alebo SIV proteínov, polypeptidov, peptidov a/alebo fragmentov.
Adjuvantné kombinované prípravky podľa predkladaného vynálezu sú taktiež vhodné na použitie ako adjuvans v polynukleotidových vakcínach (tiež známych ako DNA vakcíny). Takéto vakcíny môžu ďalej obsahovať facilitačné činidlá, ako je bupivicain (viď US patent č. 5593972 (42), ktorý je tu uvedený ako odkaz).
Pre lepší opis predkladaného vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú iba ilustratívne a v žiadnom prípade neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.
Príklady vyhotovenia vynálezu
Pokus 1
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Príklad 1
Materiály a metódy
Zvieratá
Samice Baíb/c myší vo veku 7-9 týždňov boli zakúpené od Taconic farms, Inc. (Germantown, NY). Všetky myši boli chované v boxoch schválených American Association for Accreditation of Laboratory Animal Čare. Myši sa nechali aklimatizovať v boxoch počas jedného týždňa pred začatím pokusov.
Peptidy '
Sekvencie multiepitópového HIV-1MN peptidu
T1SP1OMN(A)(-Cys) je nasledujúci: Lys Gin íle íle Asn Met
Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2). Tento peptid bol opísaný skôr (28, 29) a obsahuje sekvencie z HIV-1 gpl20MN, ktoré vyvolávajú reakciu CD4+ Th-lymfocytov u myší aj u človeka, základnú neutralizačnú determinantu a miesto rozpoznávané CD8+ CTL u Balb/c myší. Peptid bol získaný od Dr. R. Scearce (Duke University, Durham, NC). Pre CTL analýzu sa peptidy zodpovedajúce CTL epitópu vo V3 sľučke HIV-1-mb (Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr íle (SEQ ID NO:12), H-2Dd restrihovaný alebo HIV-1-Mn (íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr (SEQ ID NO 13), H-2Dd restrihovaný, kúpili od Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX). Peptidy sa solubilizovali v sterilnej vode a pred použitím sa zriedili vhodnými puframi alebo bunkovým kultivačným médiom.
Adjuvans
Všetky adjuvantné prípravky obsahujúce MPL™ beli získané od Ribi Immunochem Research, Inc. (Hamilton, MT). MPL™ bol pripravený ako vodný prostriedok s použitím trietanolamínu (Sigma, St. Louis, MO). Po solubilizácii sa MPL™ sonikoval podľa návodu výrobcu a získal sa opalescentný/číry roztok, ktorý bol sterilné filtrovaný. MPL™ SE sa získal ako vopred pripravená emulzia olej-vo-vode (1-2% oleja) na báze skvalénu s koncentráciou MPL™ v rozsahu 02500 pg/ml. Fosforečnan hlinitý sa pripravil v laboratóriu. Freundove kompletné adjuvans (CFA) a nekompletné adjuvans (IFA) sa kúpili od Difco Laboratories, Detroit, MI. TISPIOMN(A) peptidy,. a.,Freundove adjuvans sa emulzifikovali v pomere 1:1 s použitím dvoch spojených striekačiek. Rekombinantné exprimovaný myší 1-12 bol získaný z Genetic
Inštitúte (Cambridge, MA). Rekombinantný myší GM-CSF bol získaný od Immunex (Seattle, WA), od RandD Systems (Minneapolis, MN) alebo bol kúpený od Biosource International (Camarillo, CA) vo forme lyofilizovaného prášku bez nosiča.
Imunizácie
Myši sa imunizovali podkožné v oblasti koreňa chvostu a na každú stranu od chvostu sa aplikoval objem 0,2 ml. Imunizácie boli uskutočnené v rôznych časových intervaloch, ako je uvedené ďalej. Antigén a cytokíny sa riedili vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku na vhodné koncentrácie a zmiešali sa s adjuvans menej ako 16 hodín pred imunizáciou v sterilných podmienkach. Vakcíny sa zmiešali jemným trepaním a uskladnili sa pri teplote 4 °C. Prípravky sa premiešali bezprostredne pred imunizáciou.
Odbery vzoriek
Zvieratám sa odoberala krv pred prvou imunizáciou a v uvedených dobách. Sérum sa analyzovalo od jednotlivých myší alebo ako zmes od myší v skupine. Vaginálna laváž sa uskutočnila na utratených myšiach na hodnotenie koncentrácií protilátok. Laváž sa uskutočnila instiláciou 75:1 RPMI-10 do vagíny myší s použitím 200:1 pipety. Vagína sa potom premyla opakovanou aplikáciou a odsatím kvapaliny, ktorá sa potom pridala k 10:1 FBS. Vaginálne laváže sa analyzovali ako zmesi z jednotlivých skupín.
Bunkové prípravky
Na proliferačné testy a in vitro analýzu cytokínov sa bunky sleziny získali od myší v uvedených časoch.
Jednobunkové suspenzie sa pripravili od skupín 3-5 myší, ako je uvedené vo výsledkoch. Na analýzu proliferácie a cytokínov sa bunky suspendovali v 96-jamkových kultivačných platniach s oblým dnom vopred potiahnutých cez noc HIV peptidovými antigénmi, kontrolnými proteínmi alebo len RPMI-10. Bunky sleziny sa pridali v dávke 5xl05 buniek/jamku s použitím kultivačného média obsahujúceho 2x doplnky. Supernatanty bunkovej kultúry sa získali z troch jamiek pre analýzu ná cytokíny 3. alebo 6. deň po iniciácii kultúry. Ihneď po odbere supernatantov sa kultúry pulzovali 3H-tymidínom na 18 až 24 hodín a uskutočnila sa kvantifikácia proliferácie buniek.
Enzýmovo-viazané imunosorbentné testy
Na analýzu protilátok špecifických pre HlV-peptid a distribúcie ich podtried sa peptid suspendoval buď v karbonátovom pufri (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) alebo v PBS v koncentrácii 1 pg/ml a vniesol sa do 96jamkovýsh mikrotitračných platní (Nunc) v objeme 100:1. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa platne premyli a blokovali sa (0,1% želatína/PBS) pri izbovej teplote počas 2-4 hodín. ELISA platne sa potom premyli premývacím pufrom (PBS, 0,1% Tween™20) pred pridaním sériovo riedeného séra (PBS, 0,1% želatína, 0,05% Tween™20, 0,02% azid sodný). Po 4-hodinovej inkubácii sa jamky premyli a pridali sa vhodné riedenia biotinylovaných anti-izotypových/podtriedových protilátok na inkubáciu pri 4 °C cez noc. Jamky sa premyli a inkubovali sa s chrenovou peroxidázou konjugovanou so streptavidínom. Po inkubácii sa jamky premyli a vyvíjali sa s ABTS. Jamky sa odčítali, pri.,.405 nm. Titre sa štandardizovali s použitím kontrolného séra.
Na analýzu cytokínov sa supernatanty bunkovej kultúry pridali do jamiek potiahnutých BVD6-11B11 (pre anti-IL4), alebo R4-6A2 (pre interferón-γ). Po inkubácii a premytí sa jamky vyvíjali s použitím biotinom-značenej BVD6-24G2 (pre IL-4) alebo XMG 1.2 (pre interferón-γ). Koncentrácia cytokínov sa určila s použitím štandardnej krivky pripravenej z rekombinantného myšieho interferónu-γ alebo interleukínu-4. Všetky cytokínové činidlá boli kúpené od Pharmingen (San Diego, CA).
HIV-Imn neutralizačné testy
Neutralizačné testy sa uskutočnili v laboratóriu Dr. Thomasa Matthewsa na Duke University. Stručne, kódované sérum sa dodalo na neutralizáciu laboratórneho ižolátu vírusu HIV-1mn (NIH). Test sa uskutočnil v podstate spôsobom opísaným skôr (25). Stručne, riedenie testovaného séra sa rozdelilo do jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej platne (25:1/jamku). Rovnaký objem sériovo riedenej zásoby vírusu sa pridal do každej jamky. Po inkubácii sa zmes vírus/prcti!átl;a pridala k AA5 cieľovým bunkám. Bunky sa kultivovali v 96jamkových mikrotitračných platniach s pridávaním čerstvého média každý druhý deň. 7 dní po infekcii ss supernatanty hoďnOtiír’na prítomnosť vírusovej reverznej transkriptážy ako známky replikácie vírusu a úspešnej infekcie alebo jej inhibície.
Príklad 2
Recipročné anti-TlSPlOMN(A) IgG konečné titre
Recipročné konečné titre IgG špecifických pre HIV peptid <bo.li merané zo súboru sér (n=5 Balb/c)< v uvedených dobách po primárnej imunizácii. Myši sa imunizovali podkožné v oblasti chvostu 25 pg TI SP 10MN(A)(-Cys), pokiaľ nie je uvedené inak, 0. a 27. deň. Pre príjemcu Freundových adjuvans sa myši primárne imunizovali peptidom emulzifikovaným v CFA, a dosyťovacia imunizácia sa uskutočnila s IFA. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 2% skvalénový olej a 50 pg MPL™ na dávku. SE vehikulum je emulzia olej-vo-vode obsahujúca skvalen, glycerol a emulzifikačné činidlo. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 50 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 pg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Recipročné anti-TlSP10MN(A)(-Cys) IgG konečné titre
Adjuvans pg HIV peptidu ’ Konečné titre
týždeň 4 týždeň 6 týždeň 8
Žiadne 25 <100 <100 <100
CFA/IFA 25 23998 137683 313200
rIL-12 25 <100 <100 <100
GM-CSF 25 <100 17579 12573
SE 25 <100 171923 76479
MPL(tm) SE 25 <100 104331 79021
MPL(tm) SE + rIL-12 25 <100 1313330 631688
MPL(tm) SE + GM-CSF 25 14824 >10000000 3752870
Príklad 3
Reciproční konečné titre podtried anti-TlSPlOMN(A) IgG
Recipročné konečné titre podtried IgG boli merané zo súbbTu sér (n=5 Balb/c) 6 týždňov po primárnéj^'imunizácii, 2 týždne po sekundárnej imunizáčii. Myši sa imunizovali podkožné v oblasti chvostu 25 pg peptidu, pokiaľ nie je uvedené inak. Pre príjemcu Freundových adjuvans sa myši primárne imunizovali peptidom emulzifikovaným v CFA a dosyťovacia imunizácia sa uskutočnila s IFA 4. a 6. týždeň. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 2% skvalénový olej a 50 pg MPL™ na dávku. SE vehikulum je emulzia olej-vo-vode obsahujúca skvalén, glycerol a emulzifikačné činidlo. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 50 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 pg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Recipročné konečné titre podtried anti-TlSP10MN(A)(-Cys)IgG
Adjuvans pg HIV peptidu . Konečné titre
IgGl IgG2a IgG2b
žiadne 25 <100 <100 <100
CFA/IFA 25 29907 143 798
rIL-12 (,05) 25 <100 <100 <100
GM-CSF (10) 25 1,783 <100 <100
SE (2%) . 25 74293 <100 3331
MPL™ (50) SE (2%) 25 11441 10176 5280
MPL™ (50) SE (2%) + rIL-12 (,05) 25 169278 < 27161 2303
MPL™ (50) SE (2%) + GM-CSF (10) 25 3494862 954707 254828
Príklad 4
Titre anti-T 1 SP 10MN(A)(-Cys) IgG a IgA protilátok vo vaginálnej laváži
Titre IgG a IgA protilátok proti peptidu vo vaginálnej laváži sa merali z laváže získanej 2 týždne po poslednej imunizácii. Skupiny 5 Balb/c myší sa imunizovali 25 pg TISP10MN(A)(-Cys) a uvedenými adjuvantnými prostriedkami 0., 28. a 42. deň. Titre vaginálnych protilátok ss stanovili zo zmesi kvapaliny z laváží. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Titre anti-Tl SP10MN(A)(-Cys) IgG a IgA protilátok vo vaginálnej laváži
Adjuvans IgG IgA
žiadne <20 <20
CFA/IFA 20 <20
rIL-12 (,05) <20 <20
GM-CSF (10) <20 <20
MPL™ (50) SE (2%) <20 <20
MPL™ (50) SE (2%) + rIL-12 (,05) 24 <20
MPL™ (50) SE (2%) + GM-CSF (10) 1125 113
SE (2%) <20 <20
Príklad 5
Proliferácia buniek sleziny
Merala sa proliferácia buniek sleziny od myší imunizovaných T1SP1OMN(A)(-Cys) a rôznymi adjuvantnými prípravkami. Skupiny Balb/c myší sa imunizovali 25 pg T1SP1OMN(A)(-Cys) a uvedenými adjuvantnými prostriedkami 0. a 28. deň. Bunky sleziny sa začali kultivovať 56. deň a o 96 hodín neskôr sa hodnotila inkorporácia 3H-tymidínu. Myši sa imunizovali 50 ng IL-12, 10'pg GM-CSÉ'j 50 pg MPL™ vo vodnom prostriedku alebo v stabilnej emulzii s 2% SE. Údaje sú uvedené ako hodnoty delta cpm vzhľadom k hodnotám proliferácie zisteným z buniek kultivovaných v kultúre bez stimulácie. Základné hodnoty stimulácie boli <800 cpm. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Proliferácia buniek sleziny
Adjuvan<; Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml HIV peptid 1 pg/ml ConA 1 pg/ml lyzozým 30 pg/ml Médium 0 pg/ml
v Žiadne 2065 2373 801 50019 628 -
CFA/IFA 1236 878 641 53781 - -
rIL-12 809 692 308 42612 - -
GM-CSF 25821 19784 14249 55578 - -
MPL(tm) SE 46275 41675 40998 45443 413 -
MPL(tm) SE + rIL-12 26560 19907 9600 38989 934 -
MPL(tm) SE + GM-CSF 74909 66257 62798 37775 366 -
ŠE 31327 23396 20480 66949 - -
Príklad 6
Sekrécia IL-4 bunkami sleziny
Meral sa interleukín 4 secernovaný do kultúry bunkami sleziny stimulovanými 25 pg T1SP1OMN(A)(-Cys). Bunky sleziny sa získali zo skupín 5 Balb/c myší a kultivovali sa s uvedenými antigénnymi stimulmi ý50 ng IL-12, 10 pg GMCSF, 50 pg MPL™ ) počas 3 alebo 6 dní. Koncentrácie IL-4 sa určili ELISA a porovnali sa so štandardom majúcim známu koncentráciu. Prázdne jamky ukázali, že test nemohol detekovať interleukín-4 z daných kultúr. Dolný limit pre senzitivitu detekcie je 22 jednotiek/ml. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5.
Tabuľka 5
Sekrécia IL-4 bunkami sleziny
3-denné kultúry
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 1 pg/ml lyzozým 30 pg/ml Médium 0 pg/ml
žiadne 149
CFA/IFA 156
IL-12 156
GM-CSF 159
MPL™ SE 297 79 90 134
MPL™ SE + IL12 77
MPL™ SE + GM-CSF 142 151 102 146
SE 197
Tabuľka 5 (pokračovanie) Sekréce IL-4 bunkami sleziny 6-denné kultúry ••Ι,'-ρι· »·
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 1 pg/ml lyzozým 30 pg/ml Médium 0 pg/ml
Žiadne 124
CFA/IFA 204
IL-12 146
GM-CSF 143
MPL(tm) SE 163 96 57 63
MPL(tm) SE + IL12 55 76
MPL(tm) SE + GM-CSF 511 457 204 76 ........
SE 41 36 88
Príklad 7
Sekrécia interferónu-γ bunkami sleziny
Meral sa interferón-γ secernovaný do kultúry bunkami sleziny stimulovanými 25 pg T1SP1OMN(A)(-Cys). Bunky sleziny sa získali zo skupín 5 Balb/c myší a kultivovali sa s uvedenými antigénnymi stimulmi (rovnakými ako v príklade 6) počas 3 alebo 6 dní. Koncentrácie interferónu-γ sa určili ELISA a porovnali sa so štandardom majúcim známu koncentráciu. Prázdne jamky ukázali, že test nemohol detekovať interferón-γ z daných kultúr. Dolný limit pre senzitivitu detekcie je 4 pg/ml. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.
Tabuľka 6
Sekrécia interferónu-γ bunkami sleziny
3-denné kultúry
AdjuvarL? Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 Pg/ml ConA 1 pg/ml lyzozým 30 pg/ml Médium 0 pg/ml
Žiadne 23,0
CFA/IFA 5,0
IL-12 - 5,9
GM-CSF 17,6
MPL(tm) SE 6,6 4,2 4,3 18,2
MPL(tm) SE + IL12 9,2
MPL(tm) SE + GM-CSF 11,5 5-4 5,3 14,6 .. —
SE 8
Tabuľka 6 (pokračovanie)
Sekrécia interferónu-γ bunkami sleziny 6-^denné kultúry
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 1 pg/ml lyzozým 30 pg/ml Médium 0 pg/ml
Žiadne 71,8
CFA/IFA 15,9
IL-12 8,4
GM-CSF 7,3 -
MPL(tm) SE 190,1 51,5 319,0 187,3
MPL(tm) SE + IL12 18,0 15,6 42,0 83,4 12,7
MPL(tm) SE + GM-CSF 62,2 20,2 39,2 134,7 •1 · -t-.
SE 13,3 54,6
Pokus 2
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Príklad 1
Materiály a metódy
Zvieratá
Samice Balb/c myší vo veku 7-9 týždňov boli použité spôsobom podľa pokusu 1.
Peptidy
Použil sa HIV-l-MN peptid TISPIOMN(A) opísaný v príklade 1. Peptid sa rehydratoval v salinickom roztoku na koncentráciu 1 mg/ml.
Adjuvans
Použité adjuvans boli rovnaké ako v príklade 1, okrem toho, že v niektorých prípadoch sa MPL™ použil v vodnom prípravku namiesto vo forme stabilnej emulzie.
Imunizácia
Myši sa imunizovali podkožné v oblasti chvostu celkovým objemom 0,2 ml rovnako rozdeleným na každú stranu chvostu. Imunizácie sa uskutočnili 0. a 21. deň s použitím 25 pg HIV peptidu spoločne s uvedenými dávkami adjuvans. Myši, ktorým bolo aplikované CFA/IFA, dostali CFA 0. deň a IFA 2L. deň. Riedenie a zmesi boli rovnaké ako.je to opísané v príklade 1.
Odber vzoriek
Odbery vzoriek od zvierat sa uskutočnili podľa protokolu z príkladu 1 jeden deň pred každou imunizáciou a 14 dní po druhej imunizácii.
Bunkové prípravky
Bunk’ové prípravky sa pripravili a spracovali podľa protokolu z príkladu 1.
Enzýmovo viazané imunotesty
ELISA sa uskutočnili podľa protokolu z príkladu 1.
HIV-Imn neutralizačné testy
Neutralizačné testy sa opäť uskutočnili v Duke University podľa protokolu z príkladu 1.
Príklad 9
Recipročné anti-TlSPlOMN(A) IgG konečné titre
Recipročné konečné titre IgG špecifických pre HIV peptid sa merali buď z geometrických priemerov od jednotlivých myší (GMT) alebo zo zmesi sér (n=5 Balb/c), ktoré boli získané 14 dní po druhej imunizácii. Zo zmesi sér sa taktiež merali konečné titre IgGl a IgG2a podtried. Pre príjemcu Freundových adjuvans sa myši primárne imunizovali 25 pg peptidu emulzifikovaného v CFA a dosyťovacia imunizácia sa uskutočnila s IFA. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 1% skvalénový olej a 50 pg MPL™ na dávku. Vodný MPL™ sa podal v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 pg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.
Tabuľka 7
Recipročné anti-Tl SP 10MN(A)(-Cys) IgG konečné titre
Adjuvans Konečné titre
IgG (zmes) IgG (GMT) IgGl (zmes) IgG2a(zmes)
žiadne <1000 720 <1000 <1000
CFA/IFA 72387 135740 126433 9023
MPL™ SE 183802 197808 162480 98342
SE 2426 6029 1859 <1000
MPL(,m) SE + GM-CSF 148139 133171 103298 50415
MPL(tm) SE + rIL-12 182852 611076 6610 111662
„GM-CSF 27333 1756 1453,8.. 4684
rIL-12 <1000 500 <1000 <1000
MPL(tm) 219705 241918 134428 7127
MPL(tm) + GM-CSF 946695 1101449 545444 12291
MPL(tm) + rIL-12 . 377972 2378702 204334 12795
Príklad 10
Recipročné konečné titre podtried antiT1SP1OMN(A)(-Cys) IgG
Konečné titre IgG a IgA protilátok špecifických pre HIV peptid vo vaginálnej laváži sa merali zo zmesi séra (n=5 Balb/c myší) 15 dní po sekundárnej imunizácii. Myši sa imunizovali rovnako ako v príklade 9. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 1% skvalénový olej a 50 pg MPL™ na dávku. Vodný MPL™ sa podal v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 pg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 8.
Tabuľka 8
Recipročné konečné titre podtried anti-T!SP10MN(A)(-Cys) IgG
Adjuvans Konečné titre
IgG IgA
Žiadne <10 <10
CFA/IFA <10 <10 . .
MPL(tm) SE 32 <10
SE <10 <10
MPL(tm) SE + GM-CSF 129 <10
MPL(tm) SE + rIL-12 40 <10
GM-CSF 26 <10
rIL-12 <10 <10
MPL(tm) <10 <10
MPL(tm) + GM-CSF <10 <10
MPL(tm) + rIL-12 260 197
Príkladll
Proliferácia buniek sleziny
Merala sa proliferácia buniek sleziny v reakcii na in vitro stimuláciu TI SP10MN(A)(-Cys) a rôznymi adjuvantnými prípravkami (rovnakými ako v príklade 10). Bunky sa kultivovali počas 96 hodín. 3H-tymidín sa pridal ku kultúram na dobu najmenej 18 hodín. Údaje sú uvedené ako proliferačný index normalizovaný na bunky stimulované v kultúre ConA ((priemer cpm pre antigén/priemer cpm pre ConA) x 100). Bunky sa kultivovali v médiu majúcom základnú proliferáciu 0. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9. Hodnoty proliferácie menšie ako proliferácie v nestimulovanej kultúre sú uvedené v zátvorkách.
Tabuľka 9
Proliferácia buniek sleziny
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 5 pg/ml lyzozým 100 pg/ml
Žiadne 0,1 0,2 0,1 98,3 0,4
CFA/IFA 2,0 0,8 0,4 98,0 0,9
MPL(tm)S E 0,7 0,4 (0,2) 99,2 0,4
SE 0,5 0,3 0,1 99,0 0,4
MPL(tm) SE + GM CSF 4,3 2,7 2,3 99,1 0,8
MPL(tra) SE + IL12 6,6 4,9 (1,3) 83,8 17,4
GM-CSF 6,8 2,7 1,6 99,0 0,1
IL-12 0,2 0,2 0,5 99,1 0,2
MPL(tra) 1,0 1,4 0,5 99,2 0,4
MPL(tm)+ GM-CSF 27,5 19,2 13,3 97,5 0,5
MPL(tm) + IL-12 2,3 1,5 1,3 99,4 (0,0)
Príklad 12
Sekrécia IL-4 bunkami sleziny
Meral sa interleukín-4 secernovaný do kultúry bunkami sleziny stimulovanými TI SP10MN(A)(-Cys). Bunky sa kultivovali počas celkom 96 hodín. Supernatanty bunkových kultúr sa analyzovali na IL-4 pomocou ELISA. Všetky hodnoty sú uvedené po odpočte od hodnôt zistených zo supernatantov buniek stimulovaných 10 pg irelevantného proteínu (lyzozýmu).
Výsledky sú uvedené v tabuľke 10 v pg/ml. Výsledky, ktoré boli pod limitom detekcie po odpočítaní zo stimulácie indukovanej lyzozýmom sú uvedené ako bd. Adjuvans boli 40 ng IL-12, 10 pg GM-CSF a 50 pg MPL(tm).
Tabuľka 10
Sekrécia IL-4 bunkami sleziny
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 5 pg/ml
Žiadne bd bd bd 336
CFA/IFA bd bd bd 117
MPL(tm)S E bd bd....... bd 187
SE bd bd bd 450
MPL(tm) SE ' + GM CSF 40 42 24 214
MPL(tm) SE + IL12 5 bd bd 266
GM-CSF bd 9 36 226
IL-12 bd bd 15 411
MPL(tm) 5 bd 17 286
MPL(tm)+ GM-CSF bd bd bd 241
MPL(tm) + IL-12 bd bd bd 665
Príklad 13
Sekrécia interferónu-γ bunkami sleziny
Meral sa interferón-γ secernovaný do kultúry bunkami sleziny stimulovanými TI SP 10MN(A)(-Cys). Bunky sa kultivovali počas celkom 96 hodín. Supernatanty bunkových kultúr sa analyzovali na interferón-γ pomocou ELISA. Všetky hodnoty sú uvedené po odpočte od hodnôt zistených zo supernatantov buniek stimulovaných 10 pg lyzozýmu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 10 v jednotkách/ml. Výsledky, ktoré boli pod limitom detekcie po odpočítaní zo stimulácie indukované lyzozýmom, sú uvedené ako bd. Adjuvans boli rovnaké ako v príklade 12.
Tabuľka 11
Sekrécia interferónu-γ bunkami sleziny
Adjuvans Antigén
HIV peptid 10 pg/ml HIV peptid 3,3 pg/ml HIV peptid 1,1 pg/ml ConA 5 pg/ml
Žiadne bd bd 1 189
CFA/IFA bd bd 3 193
MPL(tm)S E 2 bd bd 170
S E bd b4 L>d 130
MPL(tm) SE + GM CSF 12 3 5 138
MPL(tm) SE + IL12 23 8 9 168
GM-CSF 2 3 4 167
IL-12 4 2 41 179
MPL(tra) 5 bd bd 203
MPL(tm)+ GM-CSF bd 20 19 31
MPL(tra) + IL-12 10 4 3 51
Pokus 3
Imunizácia Swiss-Webster myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Bol použitý protokol podľa príkladu 2 s použitím SwissWebster myší namiesto Balb/c myší. V tomto pokuse sa merali len recipročné konečné titre anti-peptidových IgG a recipročné konečné titre vaginálnych protilátok IgG a IgA.
Príklad 14
Recipročné anti-HIV peptid IgG konečné titre
Recipročné konečné titre IgG špecifických pre T1SP1OMN(A)(-Cys) sa merali z geometrických priemerov od jednotlivých Swiss-Webster myší (GMT) 14 dní po druhej imunizácii. Zo zmesi sér sa taktiež merali konečné titre IgGl a IgG2a podtried. Pre príjemcu Freundových adjuvans sa myši primárne imunizovali 25 pg peptidu emulzifikovaného v CFA a dosyťovacia imunizácia sa uskutočnila s IFA. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 1% skvalénový olej a 50 pg MPL™ na dávku. Vodný MPL™ sa podal v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 pg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 12.
Tabuľka 12
Recipročné konečné titre IgG proti HIV peptidu
Adjuvans Konečné titre
IgG (GMT) IgGl (zmes) IgG2a (zmes)
v Žiadne 500 <1000 <1000
CFA/IFA 9038 62358 54053
MPL™ S E 1583Γ 3835 8872
SE 625 <1000 <1000
MPL™ SE + GM-CSF 1374 <1000 1328
MPL™ SE + rIL-12 6142 <1000 2170
GM-CSF 500 <1000 <ιθθο
rIL-12 500 <1000 <1000
MPL™ 1960 <1000 <1000
MPL™ + GM-CSF 58211 35724 37959
MPL™ + rIL-12 5489 8535 17769
Príklad 15
Recipročné konečné titre podtried IgG proti HIV peptidu
Konečné titre IgG a IgA protilátok špecifických pre HIV peptid vo vaginálnej laváži sa merali zo zmesi séra (n=5 SwissWebster) 15 dní po sekundárnej imunizácii. Myši sa imunizovali rovnako ako v príklade 14. MPL™ SE sa použil vo forme emulzie obsahujúcej 1% skvalénový olej a 50 gg MPL™ na dávku. Vodný MPL™ sa podal v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší IL-12 bol aplikovaný v dávke 40 ng/myš. Rekombinantný myší GM-CSF bol aplikovaný v dávke 10 gg/myš. Výsledky sú uvedené v tabuľke 13.
Tabuľka 13
Recipročné konečné titre podtried IgG proti HIV peptidu
Adjuvans Konečné titre
IgG IgA
žiadne <10 <10
CFA/IFA 118 <10
MPL™ S E <10 <10 . ;·,
SE <10 <10
MPL™ SE + GM-CSF <10 <10
MPL™ SE + IL-12 <10 <10
GM-CSF <10 <10
IL-12 <10 <10
MPL™ .... <10 <10 . .
MPL™ + GM-CSF 25 <10
MPL™ + IL-12 <10 <10
Pokus 4
Imunizácie Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Postupovalo sa podľa príkladu 2 s tou výnimkou, že myši boli imunizované 0. a 28. deň a krv na serologické vyšetrenie sa odoberala 0., 27. a 41. deň. CFA/IFA imunizácia sa uskutočnila s CFA 0. deň a s IFA 28. deň. MPL™ SE sa formulovala s 50 pg MPL™ a 2% SE a použilo sa 50 ng IL-12 a 10 pg GM-CSF.
Príklad 16
Recipročné konečné titre IgG proti HIV peptidu
Recipročné konečné titre IgG špecifických pre TISP10MN(A)(-Cys) sa merali od jednotlivých myší a z ich geometrických priemerov (n=5 Balb/c) 41 dní po. primárnej imunizácii, 13 dní po sekundárnej imunizácii. Výsledky sú uvedené v tabuľke 14. 0. deň boli všetky jednotlivé titre menšie ako 50. Výraz „žiadne údaje“ znamená, že zviere zahynulo pred dokončením protokolu. „SD“ je štandardná odchýlka.
Jednotlivé titre a geometrické priemery titrov sérových IgG špecifických pre TISPIOMN(A) (-Cys)
Príklad 17
Recipročné konečné titre podtried IgG proti HIV peptidu
Konečné titre podried IgG protilátok špecifických pre HIV sa merali zo zmesi sér (n=5 Balb/c) 41 dní po primárnej imunizácii, 13 dní po sekundárnej imunizácii. Výsledky sú uvedené v tabuľke 15.
Tabuľka 15
Recipročné konečné titre podtried IgG proti T1SP1OMN(A)(-Cys)
Adjuvans Konečné titre
IgGl IgG2a IgG2b...
CFA/IFA 359238 122107 155877
IL-12 <100 <100 <100
GM-CSF 5514 <100 <100
SE 5011 <100 <100
SE + IL-12 7331 <100 <100
SE + GM-CSF 67111 <100 <100
MPL™ 33544 212 <100
MPL™ + IL-12 608163 6019 <100
MPL™ + GM-CSF 114959 800 <100
MPL™ SE 142404 29141 1564
MPL™ SE + IL-12 164866 34439 558
MPL(tm) SE + GMCSF 274241 33843 29965
Príklad 18
Titre IgA a IgG proti HIV peptidu vo vaginálnej laváži
Titre IgA a IgG proti HIV peptidu vo vaginálnej laváži sa merali z laváži 41 dní po primárnej imunizácii, 13 dní po sekundárnej imunizácii. Výsledky sú uvedené v tabuľke 16.
Tabuľka 16
Titre IgA a IgG proti TI SP 10MN(A)(-Cys) vo vaginálnej laváži
Adjuvans IgG IgA
CFA/IFA 464 13
IL-12 <10 <10
GM-CSF <10 <10
SE <10 <10
SE +IL-12 <10 <10
SE + GM-CSF 32 14
MPL(tm) 12 <10
MPL(tm) + IL-12 643 44
MPL(tm) + GM-CSF 211 65
MPL(tm) SE 153 16
MPL(tm) SE + IL-12 88 30
MPL(tm) S E + GMCSF Í90 53
Príklad 19
Proliferácia buniek sleziny
Merala sa proliferácia buniek sleziny od myší imunizovaných TISP10MN(A)(-Cys) a rôznymi adjuvantnými prípravkami. Bunky sleziny sa stimulovali in vitro počas 4 dní 3,3 pg/ml T1SP1OMN(A)(-Cys). Výsledky sú uvedené na obr. 4 ako zmena inkorporácie značeného tymidínu v dôsledku in vitro stimulácie 3,3 pg/ml TI SP10MN(A)(-Cys) vzhľadom k inkorporácii pri absencii stimulácie.
Pokus 5
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Postupovalo sa podľa príkladu 2 s tou výnimkou, že myši boli imunizované podkožné 0. a 22. deň a krv na serologické vyšetrenie sa odobrala 42. deň. MPL™ SE sa formulovala s 50 pg MPL™ a 1% SE a použilo sa 10 pg GM-CSF.
Príklad 20
Recipročné konečné titre IgG proti HIV peptidu
Recipročné konečné titre podtried IgG špecifických pre peptid sa merali zo zmesi sér (n=5 Balb/c) 42 dní po primárnej imunizácii, 13 dní po sekundárnej imunizácii. Taktiež sa merali geometrické priemery so štandardnou odchýlkou pre IgG. Výsledky sú uvedené v tabuľke 17.
z s
o . <x,
CO
H o
U,
CX
O ejj
H—I
4) r-o
G >o u
c o
kl)
G >o
O t-c cx o
u rt
cú
Έ»
X) rt
H
Pokus 6
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Postupovalo sa podľa príkladu 2 s tou výnimkou, že HIV peptid obsahoval cysteín v aminokyselinovej pozícii 17 a myši (n=3, Balb/c) boli imunizované podkožné 0. a 22. deň a krv na serologické vyšetrenie sa odoberala v -1. deň (deň pred prvou imunizáciou), 13., 20. a 28. deň. MPL™ SE sa formulovala s 50 pg MPL™ a 1% SE a použilo sa 10 pg GM-CSF. HIV peptid TI SP10MN(A)(+Cys) (26) obsahoval cysteín r
v aminokyselinovej pozícii 17 a mal dĺžku 40 aminokyselín. TISP10MN(A)(+Cys) bol kúpený od Genosys Biotechnologies (The Woodlands, TX).
Príklad 21
Recipročné konečné titre IgG proti TISPIOMN(A)
Recipročné konečné titre IgG proti TISPIOMN(A) sa merali u jednotlivých myší a z geometrických priemerov (n=3 Balb/c) 28 dní po primárnej imunizáčii. Výsledky sú uvedené v tabuľke 18.
Efekt MPL™ SE + GM-CSF na odpoveď IgG na HIV peptid (+Cys)
Pokus 7
Imunizácia Balb/c myší HIV peptidom a rôznymi adjuvans
Postupovalo sa podľa príkladu 6 s tou výnimkou, že myši (n=3, Balb/c) boli imunizované podkožné 0. a 32. deň a krv na serologické vyšetrenie sa odoberala 38. deň. MPL SE sa formulovala s 50pg MPL™ a 1% SE a použilo sa 10 pg GMCSF.
Príklad 22
Recipročné konečné titre IgG proti HIV peptidu
Recipročné konečné titre IgG proti T1SP1OMN(A)(+Cys) sa merali u jednotlivých myší a z geometrických priemerov (n=3 Balb/c) 3 8 dní po primárnej imunizácii. Výsledky sú uvedené v tabuľke 19.
Pokus 8
Analýza CTL u Balb/c myší
Imunizácia myší sa uskutočnila podľa príkladu 6. Hodnotila sa CTL aktivita buniek sleziny izolovaných od myší sedem dní po sekundárnej imunizácii. MPL™ SE sa formulovala s 50 pg MPL™ v 1% SE s alebo bez 10 pg GM-CSF, plus 50 pg TI SP10MN(A)(+Cys).
Príklad 23
Analýza CTL u Balb/c myší
Na CTL analýzu sa bunky sleziny odobraly od imunizovaných myší 14 dní po primárnej a 7 dní po sekundárnej imunizácii. Postupovalo sa v podstate podľa protokolu opísaného skôr (34). Stručne, bunky sleziny zbavené erytrocytov od troch myší sa zmiešali. Efektorové bunky sleziny (4 x 106/ml) sa restimulovali v 24-jamkových kultivačných platniach v objeme 1,5 až 2,0 ml počas siedmych dní 1 pg/ml buď „MN“ alebo „IIIB“ 10-mérovými peptidmi obsahujúcimi CTL epitópy. Obidva CTL epitópy boli restrihované H-2Dd. Kultúry boli doplnené 10 U/ml rekombinantného myšieho IL-2 (Biosource) na dobu aspoň posledných 5 dní kultivácie. Na analýzu cytotoxickej aktivity sa P815 bunky značily Cr51 a pulzovali sa 5 pg/ml peptidu (IIIB alebo MN) počas 4 hodín a pridali sa ku kultivovaným efektorovým bunkám sleziny. Použili sa 3-násobné riedenia efektorových a cieľových buniek v pomere od 100:1 do 3,7:1. Percento CTL aktivity sa vypočítalo ako percento uvoľňovania chrómu s použitím vzorca ((špecifické uvoľňovanie chrómu - spontánne uvoľňovanie chrómu)/maximálne uvoľňovanie chrómu - spontánne uvoľňovanie chrómu)) x 100. Uvolňovanie chrómu sa hodnotilo po 6 hodinovej inkubácii. Priemerné spontánne uvoľňovanie chrómu bolo vždy menšie ako 15% maximálneho uvoľňovania. Výsledky získané z 28. dňa sú uvedené na obr. 5.
Pokus 9
Imunizácia opíc makak rhesus rôznymi SIV peptidmi a adjuvans
MPL™ SE a GM-CSF adjuvantný prostriedok bol testovaný na opiciach makak rhesus (Macaca mulatta) na jeho schopnosť indukovať CTL špecifické pre antigén. V tomto pokuse bol adjuvantný prostriedok testovaný s trivalentným peptidovým imunogénom skladajúcim sa z troch samostatných mamu A*01 restrihovaných CTL epitópov (jednotlivo z gag, pol a env), ktoré boli syntetizované chemicky s alebo bez promiskuitným Th-epitópom zo SIV env v laboratóriu Dr. Bartona Haynese, Duke University.
Peptidy obsahujúce Mamu A*01 restrihovaný CTL epitop mali nasledujúce sekvencie:
Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO: 3) (gag);
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 4) (pol);
Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:5) (env).
Každý z týchto epitópov obsahujúcich CTL bol taktiež naviazaný na Th-epitóp majúci nasledujúcu sekvenciu:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu
Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID NO: 6).
Tak mali tieto tri multiepitópové peptidy nasledujúce sekvencie:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO 7);
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 8);
...... Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu
Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:9).
CTL analýza bola uskutočnená pomocou Mamu A*01 restrihovaného tetramérového farbenia v laboratóriu Dr. Normana Letvina, Harvard Medical School.
Zvieratá, dávky a imunogény
Opice makak rhesus exprimujúce , HLA-A homológiu Mamu A*01 a subtyp DRp0201 boli identifikované PCR a správali sa v skupine v New Iberia, LA.
V pokuse sa použili tri skupiny po dvoch mladých opiciach makak rhesus (Macaca mulatta), ktoré sú opísané v tabuľke 20. Skupina 1 obsahovala dve Mamu A*01 pozitívne, DRPO2O1 negatívne zvieratá Rh73 a Rh80. Týmto zvieratám sa podali trivalentný Mamu A*01 restrihovaný SIV gag, env a pol CTL epitópové peptidy (zmes krátkych peptidov), spoločne s MPL™ SE a GM-CSF. Skupina 2 obsahovala dve Mamu A*01 pozitívne, DR.p0201 pozitívne zvieratá, ktorým sa podali Th/SIVCTL gag, env a pol CTL epitópové peptidy (zmes krátkych peptidov), spoločne s MPL™ SE a GM-CSF. Skupina 3 obsahovala dve Mamu A*01 negatívne, DRp0201 pozitívne zvieratá, ktorým sa podali Th/SIVCTL gag, env a pol CTL epitópové peptidy (zmes krátkych peptidov). Tabuľka 20 ukazuje skupiny a ich HLA typ a použité imunogény.
Tabuľka 20
Zvieratá, dávky a imunogény
Skupina Zviera v c. HLA typ Peptidové imunogény
1 Rh 73 Rh 80 Mamu A*01 + DR*PO2O1- CTL/SIV gag pllC (SEQ ID NO:3) CTL/SIV pol p68A (SEQ ID NO:4) CTL/SIV env p41A (SEQ ID NO:5) 0,75 mg každého peptidu
2 Rh 55 Rh 142 Mamu A*01 + DR*p0201 + Thl/CTL/SIV gag pllC (SEQ ID NO:7) Thl/CTL/SIV pol p68A (SEQ ID NO:8) Thl/CTL/SIV env p41A (SEQ ID NQ:9) 2,4 mg každého peptidu
3 Rh 41 Rh 47 Mamu A*01- DR*p0201 + Thl/CTL/SIV gag pllC (SEQ ID NO:7) Thl/CTL/SIV pol p68A (SEQ ID NO:8) Thl/CTL/SIV env p41A (SEQ ID NO:9) 2,4 mg každého peptidu
Všetky skupiny boli imunizované podkožné 1 ml príslušnej zmesi peptidov pripravených v 50 pg MPL™ SE v 1% oleji a 250 pg ľudského GM-CSF v 0., 4. a 8. týždni. Dávka MPL™ SE sa zvýšila na 125 pg v 1% oleji na imunizáciu v 18 týždni. Pre všetky skupiny sa 2,4 mg krátkych peptidov rozpustilo v 900 pl destilovanej, deionizovanej vody. Peptidový roztok sa potom použil pre rekonštitúciu ľudského GM-CSF a potom sa pridalo 100 μΐ prípravku MPL™ SE.
Príklad 24
Analýza CTL u opíc makak rhesus
Zvieratám sa odobrala krv každé dva týždne a heparinizovaná krv sa analyzovala na Mamu A*01 restrihovanej CTL pomocou tetramérového farbenia čerstvých a kultivovaných mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) (50). PBMC sa stimulovali buď pllc, p68A, p41A alebo p46 0. deň a potom sa kultivovali v prítomnosti IL-2 a analyzovali sa na 11. deň. Štandardný test uvoľňovania 51Cr sa taktiež uskutočnil na kultivovaných PBMC (50).
Tetramérový test sa uskutočnil nasledujúcim spôsobom: Epitópové peptidy pllc z gag, p68A z pol alebo p68A z pol alebo p41A z env sa inkubovali s prečisteným biotinylovaným Mamu A*01 v prítomnosti β2 mikroglobulínu, potom sa naviazali na avidín a konjugovali sa na PE (fykoerytrín). Tento tetramér sa potom použil na farbenie CD8+ T-lymfocytov makakov s T-lymfocytárnymi receptormi rozpoznávajúcimi pllC, p68A alebo p41A epitópy. Rôzna skladba DRP0201 okolo dominantného env p46 epitópu umožnila farbenie na CD4+ Tlymfocyty, ktoré špecificky rozpoznávajú p46 Th epitóp. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 21 až 24.
Tabuľka 21
Percento Pllc/SIVgag tetramér pozitívnych CD8+ T-lymfocytov
τη f v J v Týždeň 0 2 4 6 8 9 10 14
Skupina 1 Rh 73 0,1 3,9 5,1 4,2 2,7 2,6 0,1 2,7
Rh 80 0,1 0,4 0,1 0,6 0,2 0,2 1,4 0,2
Skupina 2 Rh 55 0,1 3,1 4,5 5,9 4,0 4,0 4,1 2,7
Rh 142 0,2 4,7 2,5 5,4 3,9 3,9 2,5 4,1
Skupina 3 Rh 41 0 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1
Rh 47 0,1 0,3 0,1 0,2 0,1 0,1 0,0 0,1
Tabuľka 22
Percento p68A/SIV CTL gag tetramér pozitívnych CD8+ Tlymfocytov
Týždeň 0 2 4 6 8 9 10 14
Skupina 1 Rh 73 0,1 0,4 0,1 10,1 2,5 0,5 1,8 1,5
Rh 80 0,2 0,2 0,6 2,3 0,5 0,1 0,1 0,1
Skupina 2 Rh 55 0,1 1,1 1,1 5,5 5,6 1,5 11,7 6,4
Rh 142 0,2 0,6 0,2 1,0 1,8 0,3 2,3 1,2
-
Skupina 3 Rh 41 0,1 0,2 o,i 0,3 0,1 0,1 0,1 0,3
Rh 47 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,1 0,1
Tabuľka 23
Percento P41A/SIV env tetramér pozitívnych CD8+ Tlymfocytov
Týždeň 0 2 4 6 8 9 10 14
Skupina 1 Rh 73 0,8 3,5 2,5 2,0 3,5 1,7 1,5 1,6
Rh 80 0,2 0,2 3,4 0,5 0,1 0,0 0,2 0,2
Skupina 2 Rh 55 0,2 1,1 0,4 0,6 0,4 0,2 0,1 0,6
Rh 142 0,3 0,5 0,4 0,6 0,3 0,3 0,2 0,4
Skupina 3 Rh 41 0 0,2 0,1 0,3 0,0 0,0 0,2
Rh 47 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,0 0,2
Tabuľka 24
Percento p46/SIV Th DR3O2O1 tetramér pozitívnych CD4+ Tlymfocytov
Týždeň 0 2 4 6 8 9 10 14
Skupina 1 Rh 73 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Rh 80 0,2 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0
Skupina 2 Rh 55 0,2 0,5 0,7 0,4 0,3 0,3
Rh 142 0,2 0,9 0,6 1,0 0,6 0,5
Skupina 3 Rh 41 0,6 0,4 0,3 0,3
Rh 47 1,2 0,8 1,6 1,2
Pokus 10
Imunizácia Swiss-Webster myší proteínom Porin B Neisseria gonorrhoeae a ruznými adjuvans
Kríženci Swiss-Webster myší sa rozdelili do 5 skupín po 10 myšiach. Každej skupine sa podal 1 pg rekombinantného
Porinu B (z kmeňa FA1090 so 16 aminokyselinami na aminokonci z fágu, po ktorých nasledovala zrelá forma Porinu B). Prvnej skupine sa nepodalo adjuvans; druhej skupine sa podalo 50 pg MPL™; tretej skupine sa podal MPL™ plus 5 pg GMCSF; štvrtej skupine sa podalo 25 pg MPL™ SE; piatej skupine sa podal MPL™ SE plus 5 pg GM-CSF. Myši sa imunizovali podkožné v oblasti stehna celkovým objemom 0,2 ml, ktorý sa rozdelil na dva rovnaké diely aplikované do oblasti koreňa chvostu/stehna. Imunizácie sa uskutočnili v 0. a 4. týždni.
Príklad 25
Recipročné konečné titre podtried IgG proti porinu B
Myšiam sa odoberala krv deň pred každou imunizáciou a 13. deň po poslednej imunizácii. Sérum sa analyzovalo ako zmes od myší v skupine. Recipročné konečné titre podtried IgG proti porinu B sa merali z kombinovaného séra (n=10 Šwiss Webster) v 3. a 6. týždni. Výsledky sú uvedené v tabuľke 25. 0. deň boli všetky preimunizačné titre menšie ako 50.
Tabuľka 25
Adjuvan . s Týždeň 3 Týždeň 6
IgG IgGl IgG2a IgG IgGl IgG2a
žiadne 4146 531 293 157203 4467 9782
MPL™ 3381 171 318 431529 23465 20422
MPL™ + GM-CSF 7895 50 980 790193 2478 82690
MPL™ SE 135016 297 13339 3945614 10805 342322
MPL™ SE + GM-CSF 106008 725 8772 3304231 31920 201787
Taktiež sa určili jednotlivé geometrické priemery titrov IgG proti rekombinantnému porinu B v 6. týždni. Výsledky sú uvedené v tabuľke 26.
Tabuľka 26
Jednotlivé titre IgG
Adjuvans Geometrický priemer Štandardná odchýlka
žiadne 100089 63467
MPL™ 217114 451611
MPL™ + GM-CSF 649801 353863
MPL™ SE 1917908 1478357
MPL™ SE + GM-CSF 2144567 858184
Pokus 11
Imunizácia Swiss-Webster myší proteínom Porin B Neisseria gonorrhoeae a rôznymi adjuvans
Kríženci Swiss-Webster myší sa rozdelili do 6 skupín po 5 myšiach. Každej skupine sa podal 1 pg rekombinantného Porinu B (z kmeňa FA1090 so 16 aminokyselinami na aminokonci z fágu, po ktorých nasledovala zrelá forma Porinu B). Prvnej skupine sa nepodalo adjuvans (proteín bol pripravený v PBS); druhej skupine sa podalo 40 ng IL-12; tretej skupine sa podalo 50 pg MPL(tm); štvrtej skupine sa podal MPL™ plus 40 ng IL-15; piatej skupine sa podalo 25 pg MPL™ SE; šiestej skupine sa podal MPL™ SE plus 40 ng IL-12. Myši sa imunizovali podkožné v oblasti stehna celkovým objemom 0,2 ml. Imunizácie sa uskutočnili v 0. a 4. týždni.
Príklad 26
Recipročné konečné titre podtried IgG proti porinu
B a titre IgG a IgA vo vaginálnej laváži
Myšiam sa odoberala krv deň pred každou imunizáciou a 13. deň po poslednej imunizácii. Sérum sa analyzovalo ako zmes od myší v skupine. Recipročné konečné titre podtried IgG proti porinu B sa merali z kombinovaného séra (n=5 Swiss Webster) a taktiež sa merali titre IgA a IgG vo vaginálnej laváži, obidve v 3. a v 6. týždni. Výsledky sú uvedené v tabuľke 27. 0. deň boli všetky preimunizačné titre menšie ako 50. Východiskové riedenie na analýzu vaginálnej laváže bolo 1/5. ..........
Tabuľka 27
Recipročné konečné titre podtried IgG proti porinu B a titre IgG a IgA vo vaginálnej laváži
Adjuvans Týždeň 3 Týždeň 6 Vaginálna laváž
IgG IgGi IgG2a IgG IgGi IgG2a IgG IgA
žiadne 9084 1872 2872 408944 8314 64500 80 5
IL-12 7266 2578 2071 571325 6278 58552 93 5
MPL™ 5656 500 1925 265127 76640 60910 54 5
MPL™ + IL12 28274 1442 11348 3747987 120112 44997 88 5
MPL(tnO SE 53056 8543 17550 5133154 513236 622514 338 5
MPL(,m) SE+ IL12 757133 5622 33259 10935000 210478 471552 3036 5
PoJcus 12 .
Imunizácia Balb/c myší proteínom F respiračné syncytiálneho vírusu a rôznymi adjuvans
Balb/c myši sa rozdelili do 7 skupín po 5 myšiach. Každej skupine sa podali 3 pg prečisteného proteínu F natívneho ľudského respiračné syncytiálneho vírusu (RSV) (vo forme diméru). Prvej skupine sa nepodalo adjuvans (proteín bol pripravený v PBS); druhej skupine sa podalo 100 pg fosforečnanu hlinitého (kamenec); tretej skupine sa podalo gg Stimulo(tm) QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA); štvrtej skupine sa podalo 50 pg MPL(tm); piatej skupine sa podal MPL plus 5pg GM-CSF; šiestej skupine sa podalo 25 pg MPL™ SE; siedmej skupine sa podal MPL™ SE plus 5 pg GM-CSF. Myši sa imunizovali intramuskulárne celkovým objemom 0,2 ml v oblasti stehna. Imunizácie sa uskutočnili v 0. a v 4. týždni.
Príklad 27
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu
RSV
Myšiam sa odoberala krv deň pred každou imunizáciou a 13. deň po poslednej imunizácii. Sérum sa analyzovalo ako zmes od myší v skupine. Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV sa merali z kombinovaného séra (n=5 Balb/c) Výsledky sú uvedené v tabuľke 28. 0. deň boli všetky preimunizačné titre menšie ako 50.
Tabuľka 28
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV
Adjuvans . a Týždeň 3 Týždeň 6
IgG IgGl IgG2a IgG IgGl IgG2a
žiadne 18452 3698 319 539156 3119905 80855
Kamenec 66710 35839 4321 5417001 3226833 291474
Stimulon(t m) QS-21 313665 150988 176080 12113156 2902521 4324004
MPL™ 124197 28134 11882 3310838 900863 1057108
MPL™ + GM-CSF 419873 91649 65453 10343803 753890 688554
MPL™ SE, 374992 44115 147366 19333.189 1493284 . 6314264
MPL™ SE + GM- CSF 1748272 51966 267265 30816193 1716850 2641258
Príklad 28
Proliferácia buniek sleziny
Merala sa proliferácia buniek sleziny v reakcii na in vitro stimuláciu 2,5 pg/ml F proteínu RSV a rôznymi adjuvantnými prostriedkami (rovnakými ako v príklade 27). Bunky sleziny sa odobrali 14 dní po sekundárnej imunizáčii a pripravili sa kultúry v hustote 5xl05 buniek. Bunky sa kultivovali počas 96 hodín. Do kultúry sa pridal 3H tymidín na dobu aspoň 18 hodín. Údaje sú uvedené ako proliferačný index normalizovaný vzhľadom na bunky stimulované v kultúre ConA ((priemer cpm antigénu/priemer cpm ConA)-(priemer cpm média/priemer cpm ConA)) x 100. Bunky boli kultivované v médiu majúcom základnú proliferáciu 0. Výsledky sú uvedené v tabuľke 29.
Tabuľka 29
Proliferácia buniek sleziny
Adjuvans Normalizovaný proliferačný index
žiadne 18,1
Kamenec 13,1
Stimulon(tm) QS-21 0,8
MPL™ 0,4
MPL™ + GM-CSF 20,0
MPL™ SE 17,8
MPL™ SE + GM-CSF 16,3
Pokus 13
Imunizácie Balb/c myší proteínom F respiračné syncytiálneho vírusu a rôznymi adjuvans ···’ ·' · -Λ ií. '
Opakoval sa protokol z pokusu 12 (imunizácie F proteínom RSV s alebo bez adjuvans v 0. a v 4. týždni).
Príklad 29
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu
RSV
Myšiam sa odoberala krv deň pred každou imunizáciou a 13. deň po poslednej imunizácii. Sérum sa analyzovalo ako zmes od myší v skupine. Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV sa merali z kombinovaného séra (n=5 Balb/c) Výsledky sú uvedené v tabuľke 30. 0. deň boli všetky preimunizačné titre menšie ako 50.
Tabuľka 30
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV
Adjuvans Týždeň 3 Týždeň 6
IgG IgGl IgG2a IgG IgGl IgG2a
žiadne 6442 2808 713 5195059 963203 38791
Kamenec 128695. 36841 1975 4285993 567972 ,27668
Stimulon^tm) QS-21 528036 296292 176703 37221721 1823402 1724319
MPL™ 104702 21930 61253 6153833 1384927 955685
MPL™ + GM-CSF 262.128- 79888 55249 21054796 3412710 2070305
MPL™ SE 184246 47194 180932 31731335 4376601 6406591
MPL™ SE + GM-CSF 375575 70422 289542 27079086 · · t A.**. 2124043 6341497
Príklad 30
CTL aktivita buniek sleziny
CTL aktivita (cytotoxická T-lymfocytárna) buniek sleziny ako dôsledok imunizácie RSV F proteínom a uvedenými adjuvans sa hodnotila dva týždne po prvej imunizácii. Údaje predstavujú percento špecifickej CTL aktivity buniek sleziny kultivovaných s cieľovými bunkami infikovanými RSV v pomere efektorových a cieľových buniek 33:1. Percento špecifickej CTL aktivity sa určilo rovnako ako v príklade 24, pomocou odčítania CTL aktivity proti neinfikovaným cieľovým bunkám od aktivity špecifickej pre cieľové bunky infikované RSV. Naivné bunky sleziny sa infikovali RSV vMOI (množstvo infekcie) 1,5 po dobu 2 hodín so ziskom stimulačných buniek na stimuláciu in vitro. Reaktívne bunky zo sleziny imunizovaných myší sa pridali k stimulačným bunkám v pomere 1:5 a uskutočnila sa kultivácia trvajúca počas 6 dní. 5. deň sa cieľové bunky (Balb/c MHC-H2d bunková línia) infikovali RSV v MOI 10 po dobu 2 hodín a uskutočnila sa inkubácia cez noc. Na 6. deň sa infikované a neinfikované cieľové bunky odobrali a pulzovali sa 51Cr. In vitro efektorové bunky sa potom pridali k cieľovým bunkám v E:T pomere od 100:1 do 3:ľ. Uvoľňovanie chrómu sa meralo po 4 hodinách inkubácie. Výsledky sú uvedené v tabuľke 31.
Tabuľka 31
CTL aktivita buniek sleziny
Adjuvans Percento CTL aktivity
žiadne 1
Kamenec 4 /
Stimulon(tm)QS-21 53...........
MPL™ 6
MPL™ + GM-CSF 15
MPL™ SE 30
MPL™ SE + GM-CSF 36
Pokus 14
Imunizácie Balb/c myší proteínom F respiračné syncytiálneho vírusu a rôznymi adjuvans
Balb/c myši sa rozdelili do 6 skupín po 5 myšiach. Každej skupine sa podali 3 pg prečisteného proteínu F natívneho ľudského respiračné syncytiálneho vírusu (RSV) (vo forme diméru). Prvej skupine sa nepodalo adjuvans (protein bol pripravený v PBS); druhej skupine sa podalo 40 ng IL-12; tretej skupine sa podalo 30 pg MPL(tm); štvrtej skupine sa podalo MPL™ plus 40 ng IL-12; piatej skupine sa podalo 25 pg MPL(tm) SE; šiestej skupine sa podal MPL™ SE plus 40 ng IL12. Myši sa imunizovali podkožné celkovým objemom 0,2 ml v oblasti stehna, kde táto dávka sa rozdelila na rovnaké dávky na obe strany chvostu. Imunizácie sa uskutočnili v 0. a v 4. týždni
Príklad 31
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu
RSV
Myšiam sa odoberala krv deň pred každou imunizáciou a
13. deň po poslednej imunizácii. Sérum sa analyzovalo ako zmes od myší v skupine. Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV sa merali z kombinovaného séra (n=5 Balb/c) Výsledky sú uvedené v tabuľke 32. 0. deň boli všetky preimunizačné titre menšie ako 50.
Tabuľka 32
Recipročné konečné titre podtried IgG proti F proteínu RSV
Adjuvans Týždeň 3 Týždeň 6
IgG IgGl IgG2a IgG IgGl IgG2a
žiadne 5332 12925 500 2381899 977782 76226
IL-12 13557 3442 500 4459059 1345099 6595 1
MPL™ 26179 55767 8397 3467097 402128 170252
MPL™ + IL-12 186516 22321 10800 1546443 420322 253465
MPL™ SE 1708358 53608 144876 9075480 565403 1000459
MPL™ SE + IL-12 329050 15788 69794 10935000 386639 1284274
Príklad 32
CTL aktivita buniek sleziny
CTL aktivita (cytotoxická T-lymfocytárna) buniek sleziny ako dôsledek imunizácie RSV F proteínom a uvedenými r
adjuvans sa hodnotila dva týždne po prvej imunizácii. Údaje predstavujú percento špecifickej CTL aktivity buniek sleziny kultivovaných s cieľovými bunkami infikovanými RSV v pomere efektorových a cieľových buniek 33:1. Percento špecifickej CTL aktivity sa určilo rovnako ako v príklade 24 pomocou odčítania CTL aktivity proti neinfikovaným cieľovým bunkám od aktivity špecifickej pre cieľové bunky infikované RSV. Naivné bunky sleziny sa infikovali RSV v MOI (množstvo infekcie) 1,5 počas 2 hodín za zisku stimulačných buniek pre stimuláciu in vitro. Reaktívne bunky zo sleziny imunizovaných myší sa pridali k stimulačným bunkám v pomere 1:5 a uskutočnila sa kultivácia trvajúca 6 dní. Na 5. deň sa cieľové bunky (Balb/c MHC-H-2d bunková línia) infikovali RSV v MOI 10 počas 2 hodín a uskutočnila sa inkubácia cez noc. Na 6. deň sa infikované a neinfikované cieľové bunky odobrali a pulzovaly sa 51Cr. In vitro efektorové bunky sa potom pridali k cieľovým bunkám v E:T pomere od 100:1 do 3:1. Uvoľňovanie chrómu sa meralo po 4 hodinách inkubácie. Výsledky sú uvedené v tabuľke 33.
Tabuľka 33
CTL aktivita buniek sleziny
Adjuvans Percento CTL aktivity
'· · t žiadne 6
IL-12 22
MPL™ 15
MPL™ + IL-12 13
MPL™ SE 33
MPL™ SE + IL-12 28
Pokus 15
Imunizácie Balb/c myší nukleokapsidovým proteínom chrípkového vírusu a rôznymi adjuvans
Balb/c myši sa rozdelili do 6 skupín po 5 myšiach. Každej skupine sa podal 1 pg NP (nukleokapsidového) proteínu chrípkového vírusu kmeňa A/dorn/307/72 (kontrolná skupina). Prvej skupine sa nepodalo adjuvans (peptid bol pripravený v PBS); druhej skupine sa podalo 100 pg fosforečnanu hlinitého (kamenca); tretej skupine sa podalo 50 pg MPL^tmQ štvrtej skupine sa podalo MPL™ plus 5 pg GM-CSF; piatej skupine sa podalo 25 pg MPL(tm) SE; šiestej skupine sa podal MPL™ SE plus 5 pg GM-CSF. Myši sa imunizovali podkožné celkovým objemom 0,2 ml. Imunizácie sa uskutočnili v 0. a v 4. týždni
Príklad 33
CTL aktivita buniek sleziny
CTL aktivita (cytotoxická T-lymfocytárna) buniek sleziny ako dôsledok imunizácie chrípkovým NP peptidom a uvedenými adjuvans sa hodnotila dva týdne po prvej imunizácii. Hodnotenie sa uskutočnilo spôsobom opísaným v príklade 32 s použitím peptidom pulzovaných cieľových p815 buniek (peptid zodpovedá aminokyselinám 147-155 NP a má sekvenciu: Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val (SEQ ID NO: 14). Použitie GM-CSF v prostriedkoch obsahujúcich MPL™ alebo MPL™ SE viedlo k značnej redukcii CTL aktivity (údaje nie sú uvedené).
Odkazy
1. Mosmann, T.R., et al., J. Immnnol. . 13 6, ^2348-2357 (1986).
2. U.S. Patent Number 4,912,094.
3. Ahlera, «7.D., et al., J. Immunol., 158, 3947-3958 (1997).
4. Scharton-Kersten, T., et al., J.
Immunol^. 154. 5320-5330 (1995) .
5. Ghalib, H.W., et al., J. Innnunol.. 154, 4623-4629 (1995).
6. Murray, H.W., and Hariprashad, J.,. J. Exp. Med.. 181. 387-391 (1995) .
7. U.S. Patent Number 5,571,515.
8. Finkelman, F.D., and Holmes, J., Ann. Rev. Immunol.. 8, 303-333 (1990) .
9. Snapper, C.M., et al., J. Exp. Med..
175. 1367-1371 (1992).
10. Kobayasbi, M., et al., J. Exp. Med..
170, 827-845 (1989).
11. Published International Patent
Application Number WO 90/05147.
12. U.S. Patent Number 5,078,996.
13. U.S. Patent Number 5,229,496.
14. TJ.S. Patent Number 5,073,627.
15. Alderson, M.R., et al., J. Exp. Med.,
178. 669-674 (1993).
16. Snapper, C. M., e t al., J. Immunol.,
154. 5842-5850 (1995).
17. U.S. Patent Number 5,013,548.
18. U.S. Patent Number 5,019,387.
19. Charbit, A., et al., Vaccine, 11. 12211228 (1993).
20. Naťuk, R. «J., e t al., AIDS Res. Hmn.
RetroviruBee, 9.,
395-404 (1993).
21. Johnson, R.P., et al.. J, Virol., 68, 3145-3153 (1994) .
22. Fuller, D.H., et al., AIDS Res. Hum.
\Retroviruses. 10, 1433-1441 (1994).
23. Berzofsky, J.A., et al., J. Clin.
Invest.. 88, 87S-884 (1991).
24. Palker, T.J., et al., J. Immunol., 142, 3612-3619 (1989).
25. Hart, M.R., et al., J. Immunol.. 145, 2677-2685 (1990).
26. Haynes, B.F., et al., J. Immimol., 151, 1646-1653 (1993).
27. Hart, M.K., et al., Proc. Natl♦ Acad. Sci., USA. 88, 9448-9452 (1991).
28. Bartlett, J.A., et al.. AIDS, 12, 1291-
1300 (1998).
29. Havnes. B.F., et al., AIDS Res. Bum.
Retroviruses. 11, 211-221 (1998).
30. U.S. Patent Number 5,861,243.
31. U.S. Patent Number 5,932,218.
32. U.S. Patent Number 5,939,074.
33. U.S. Patent Number 5,993,819.
34. U.S. Patent Number 6,037,135.
35. Published European Patent Application
Number 671,947.
36. Staats, H.F., et al., J. Iramunol., 157, 462-472 (1996) .
37. Porgador, A., et al., J. Immunol., 158, 834-841 (1997).
38. Alien, T.M., et al., J. Iramunol., 130, 6062-6071 (1998) .
39. Miller, M.D., et al., J. Impmnol., 1^7/ 320-329 (1991).
40. Egan, M.A. , et al - , J. Viyol. , 7J3, $/466 (1999)
41. Hart, M.K., J. Immunol.. 145, 2677-2685 (1990).
42. U.S. Patent Number 5,736,361.
43. U.S. Patent Number 5,223,254.
44. Published International Patent Application Number WO 98/20734.
45. U.S. Patent Number 5,830,877.
46. Published International Patent Application Number WO 99/51259.
47. Published International Patent
Application Number WO 99/27944.
48. U.S. Patent Number 4,666,829.
49. U.S. Patent Number 5,593,972.
50. Kuroda, M.J., et al., J. Exp. Med.,
187,
1373-1381 (1998).
Zoznam sekvencii <110> American Cyanamid Company <120> Adjuvantné kombinované prostriedky <130> 33482-00/PCT <140>
<141>
<160> 14 <170> Patentln verzia 2.1 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> vírus ľudskej imunodeficiencie <400> 1
Lys Gin íle íle Asn Met Txp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15
Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro 20 25 30
Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> vírus ľudskej imunodeficiencie <400> 2
Lys GLn íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly
20 25 30
Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys
35
_<210>3 <211> 9 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 3
Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 4
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val l 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 5
Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle 1 5 <210> 6 <211>20 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 6
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 i
Pro Thr Lys Ala 20 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 7
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Glý Val Ála 1 5 10 15
Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met 20 25 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400> 8
Glu Leu Tyr Lys 1
Pro Thr Lys Ala 20
Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala 5 10 15
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val 25 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> vírus opičej imunodeficiencie <400>9
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala 15 10 15
Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle 20 25 <210> 10 <211> 42 <212> PRT <213> neznámy organizmus <220>
<223> opis neznámeho organizmu: ľudský amyloidový proteín <400> 10
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala íle íle 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val íle Ala 35 40 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> neznámy organizmus <220>
<223> opis neznámeho organizmu: ľudský amyloidový proteín <400> 11
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> vírus ľudskej imunodeficiencie <400> 12
Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr íle 1.5 10
100 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> vírus ľudskej imunodeficiencie <400> 13 íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 15 10 <210> 14 <211>9 <212> PRT <213> chrípkový vírus <400> 14
Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val 1 5
101

Claims (85)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, ž e obsahuje vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita alebo z nádorových buniek alebo z alergénu alebo z peptidu amyloidového proteínu a účinné adjuvantné množstvo kombinácie:
    (1) 3-O-deacylovaného monofosforyl lipidu A alebo monofosforyl lipidu A a jeho derivátov a analógií; a (2) cytokín alebo lymfokín alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu, kde kombinácia adjuvans zosilňuje imunitnú odpoveď na uvedený antigén u stavovca.
  2. 2. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že vybraným antigenem je polypeptid, peptid nebo fragment získaný z proteínu.
  3. 3. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  4. 4. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že cytokín alebo lymfokín je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej faktor stimulujúci kolónie makrofágov a interleukín-12.
  5. 5. Antigénny prostriedok podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že cytokínom alebo
    102 lymfokínom je faktor stimulujúci kolónie makrofágov.
  6. 6. Antigénny prostriedok podľa nároku 5 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  7. 7. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, lymfokínom je interleukín-12.
    podľa nároku 6 ž e cytokínom alebo
  8. 8. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
    podľa nároku 7 ž e 3-O-deacylovaný
  9. 9. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že obsahuje riedidlo alebo nosič.
  10. 10. Antigénny prostriedok podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  11. 11. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 1 uvedenému stavovcovi.
    103
  12. 12. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 9 uvedenému stavovcovi.
  13. 13. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu; baktérie, huby alebo parazita indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 1 uvedenému stavovcovi.
  14. 14/Spôsob -na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný antigén z patogénneho vírusu, baktérie, huby alebo parazita indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 9 uvedenému stavovcovi.
  15. 15. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný nádorový alebo s nádoromasociovaný antigén vyvolať terapeutický alebo profylaktický protinádorový účinok u stavovca vyznačujúci sa tým, ž e zahŕňa podanie antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný nádorový alebo s nádorom-asociovaný antigén z nádorových buniek a účinné adjuvantné množstvo kombinácie:
    (1) 3-O-deacylovaného monofosforyl lipidu A alebo monofosforyl lipidu A a jeho derivátov a analógii; a (2) cytokínu alebo lymfokínu alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu.
    104
  16. 16. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho vybraný alergén zmierniť alergickú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku obsahujícího vybraný alergén a účinné adjuvantné množstvo kombinácie:
    (1) 3-O-deacylovaného monofosforyl lipidu A alebo '-'•monofosforyl lipidu A a jeho derivátov a analóg#; a (2) cytokínu alebo lymfokínu alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu.
  17. 17. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho . prostriedku , zabrániť alebo liečiť onchorenie charakterizované ukladaním amyloidu u stavovca vyznačujúci sa tým, ž e zahŕňa podanie polypeptidu, peptidu alebo fragmentu z amyloidového proteínu alebo protilátky k takémuto peptidu a účinného adjuvantného množstva kombinácie:
    (1) 3-O-deacylovaného monofosforyl lipidu A alebo monofosforyl lipidu A a jeho derivátov a analógií; a (2) cytokínu alebo lymfokínu alebo agonistu alebo antagonistu uvedeného cytokínu alebo lymfokínu uvedenému stavovcovi.
  18. 18. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že vybraný antigén je z vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV).
  19. 19? Antigénny prostriedok podľa nároku - 18 vyznačujúci sa tým, že vybraným HIV antigénom je HIV protein, polypeptid, peptid alebo fragment uvedeného
    105 proteínu.
  20. 20. Antigénny prostriedok podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že vybrané antigény sú HIV peptidy majúce aminokyselinové sekvencie:
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala MeHLyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg^Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 1) alebo
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Ly&_(SEQ IJD-NO: 2).
  21. 21. Antigénny prostriedok podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  22. 22. Antigénny prostriedok podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že cytokín alebo lymfokín je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej faktor stimulujúci kolónie makrofágov a interleukín-12.
  23. 23. Antigénny prostriedok podľa nároku 22 vyznačujúci sa tým, že cytokínom alebo lymfokínom je faktor stimulujúci kolónie makrofágov.
  24. 24. Antigénny prostriedok podľa nároku 23 v yvz n ačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
    106
  25. 25. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, lymfokínom je interleukín-12.
    podľa nároku 22 ž e cytokínom alebo
  26. 26. Antigénny prostriedok podľa nároku 25 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejVO-VOde. νη·Λ'·'
    27. Antigénny prostriedok podľa nároku 18 v y z n nosič. a čuj ú c i sa tým, že obsahuje riedidlo alebo .ÄV·».·,........ 28. Antigénny prostriedok .... .. „podľa^-- nároku 27 v y z n a č u j ú c i sa tým, ž e 3- O-deacylovaný
    monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  27. 29. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačuj ú c i sa tým, že vybraný antigén je z vírusu opičej imunodeficiencie (SIV).
  28. 30. Antigénny prostriedok podľa nároku 30 vyznačujúci sa tým, že vybraným SIV antigénom je SIV protein, polypeptid, peptid alebo fragment uvedeného proteínu.
  29. 31. Antigénny prostriedok podľa nároku 30 vyznačujúci sa tým, že vybraný antigén je SIV peptid vybraný z peptidov skladajúcich sa z aminokyselinových ''sekvencií: Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Meť (SEQ ID NO: 3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 4), Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:5), Glu Leu Tyr
    107
    Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO 7), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:9).
  30. 32. Antigénny prostriedok podľa nároku 29 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid Aje použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  31. 33. Antigénny prostriedok·· ’ podľa nároku 29 vyznačujúci sa tým, že cytokín alebo lymfokín je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej faktor stimulujúci kolónie makrofágov a interleukín-12.
  32. 34. Antigénny prostriedok podľa nároku 33 vyznačujúci sa tým, že cytokínom alebo lymfokínom jé faktor stimulujúci kolónie makrofágov.
  33. 35. Antigénny prostriedok podľa nároku 34 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid Aje použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  34. 36. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, lymfokínom je interleukín-12.
    podľa nároku 33 ž e cytokínom alebo
  35. 37. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, podľa nároku 36 ž e 3-O-deacylovaný
    108 monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  36. 38. Antigénny prostriedok podľa nároku 29 vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje riedidlo alebo nosič.
  37. 39. Antigénny prostriedok <-;^podľa nároku 38 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  38. 40. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým.,-......ž«e.- . vybraný antigén je z Neisseria gonorrhoeae.
  39. 41. Antigénny prostriedok podľa nároku 40 vyznačujúci sa tým, že vybraný antigén Neisseria gonorrhoeae je proteín, polypeptid, peptid alebo fragment proteínu Neisseria gonorrhoeae.
  40. 42. Antigénny prostriedok podľa nároku 41 vyznačujúci sa tým, že vybraným antigénom je Porin B Neisseria gonorrhoeae.
  41. 43. Antigénny prostriedok podľa nároku 40 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  42. 44. Antigénny prostriedok podľa nároku 40 vyznačujúci sa tým, že cytokín alebo lymfokín je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej faktor stimulujúci kolónie
    109 makrofágov a interleukín-12.
  43. 45. Antigénny prostriedok podľa nároku 44 vyznačujúci sa tým, že cytokínom alebo lymfokínom je faktor stimulujúci kolónie makrofágov.
  44. 46. Antigénny prostriedok podľa nároku 45 vyznačujúci sa t ý my že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid Aje použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  45. 47. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, lymfokínom je interleukín-12.
    podľa nároku 44 ž e cytokínom alebo
  46. 48. Antigénny prostriedok podľa nároku 47 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  47. 49. Antigénny prostriedok podľa nároku 40 vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje riedidlo alebo nosič.
  48. 50. Antigénny prostriedok podľa nároku 49 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid Aje použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  49. 51. Antigénny prostriedok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tý mM,' ž e vybraný antigén je z ľudského respiračné syncytiálneho vírusu (RSV).
    110
  50. 52. Antigénny prostriedok podľa nároku 51 vyznačujúci sa tým, že vybraný RSV antigén je RSV proteín, polypeptid, peptid alebo fragment RSV proteínu.
  51. 53. Antigénny prostriedok podľa nároku 52 vyznačujúci sa tým, že vybraným antigénom je
    RSV fúzny proteín.
    . .. ....
  52. 54. Antigénny prostriedok podľa nároku 51 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  53. 55. Antigénny... .. prostriedok podľa nároku . 51. vyznačujúci sa tým, že cytokín alebo lymfokín je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej faktor stimulujúci kolónie makrofágov a interleukín-12.
  54. 56. Antigénny prostriedok podľa nároku 55 vyznačujúci sa tým, že cytokínom alebo lymfokínom je faktor stimulujúci kolónie makrofágov.
  55. 57. Antigénny prostriedok podľa nároku 56 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  56. 58. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, lymfokínom je interleukín-12.
  57. 59. Antigénny prostriedok vyznačujúci sa tým, podľa nároku 55 ž e cytokínom alebo podľa nároku 58 ž e 3-O-deacylovaný
    111 monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  58. 60. Antigénny prostriedok podľa nároku 51 vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje riedidlo alebo nosič.
  59. 61. Antigénny '^prostriedok podľa nároku 60 vyznačujúci sa tým, že 3-O-deacylovaný monofosforyl lipid A je použitý vo forme stabilnej emulzie olejvo-vode.
  60. 62. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho HIV antigén vyvolať imunitnú reakciu.......
    u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 18 uvedenému stavovcovi.
  61. 63. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho HIV antigén vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 27 uvedenému stavovcovi.
  62. 64. Spôsob podľa nároku 63 vyznačujúci sa tým, že HIV antigénom je HIV peptid majúci aminokyselinové sekvencie:
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Äŕg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 1).
    112
  63. 65. Spôsob podľa nároku 63 vyznačujúci sa tým, že HIV antigénom je HIV peptid majúci aminokyselinové sekvencie:
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 2).
    '•'í-iT/p.,
  64. 66. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho HIV antigén indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 18 uvedenému stavovcovi.
  65. 67. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho HIV antigén indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 27 uvedenému stavovcovi.
  66. 68. Spôsob podľa nároku 67 vyznačujúci sa tým, že HIV antigénom je HIV peptid majúci aminokyselinové sekvencie:
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 1)·
  67. 69. Spôsob podľa nároku 67 vyznačujúci sa tým, že HIV antigénom je HIV peptid majúci aminokyselinové sekvencie:
    113
    Lys Gin íle íle Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg íle His íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 2).
  68. 70. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho SIV antigén vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 29 uvedenému' stavovcovi.
  69. 71. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho SIV antigén vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho ^prostriedku podľa nároku 38 uvedenému stavovcovi.
  70. 72. Spôsob podľa nároku 71 vyznačujúci sa tým, že SIV antigénom je SIV peptid vybraný z peptidov majúcich nasledujúce aminokyselinové sekvencie:
    Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO: 3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 4), Tyr Ala
    Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:5), Glu Leu Tyr Lys
    Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys
    Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO 7), Glu
    Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:9).
  71. 73. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho SIV indukovať cytotoxické T114 lymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 29 uvedenému stavovcovi.
  72. 74. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho SIV indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 38 uvedenému stavovcovi.
  73. 75. Spôsob podľa nároku 74 vyznačujúci sa tým, že SIV antigénom je SIV peptid vybraný z peptidov majúcich nasledujúce aminokyselinové sekvencie:
    Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO: 3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 4), Tyr Ala
    Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:5), Glu Leu Tyr Lys
    Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys
    Ala Cys Thr Pro Tyr Asp íle Asn Gin Met (SEQ ID NO 7), Glu
    Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO: 8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys íle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro íle Ser Gly Gin íle (SEQ ID NO:9).
  74. 76. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén Neisseria gonorrhoeae vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 40 uvedenému stavovcovi.
  75. 77. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén Neisseria gonorrhoeae vyvolať
    115 imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 49 uvedenému stavovcovi.
  76. 78. Spôsob podľa nároku 77 vyznačujúci sa tým, že vybraným antigénom je Porin B Neisseria gonorrhoeae.
    »«-?***
  77. 79. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén Neisseria gonorrhoeae indukovať cytotoxické T-lymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 40 uvedenému stavovcovi.
  78. 80. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén Neisseria gonorrhoeae indukovať cytotoxické T-lymfocyty u stavovca vyznač u j ú ci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 49 uvedenému stavovcovi.
  79. 81. Spôsob podľa nároku 80 vyznačujúci sa tým, že vybraným antigénom je Porin B Neisseria gonorrhoeae.
  80. 82. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén respiračné syncytiálneho vírusu (RSV) vyvolať imunitnú reakciu u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 51 uvedenému stavovcovi.
    ’'
  81. 83. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho prostriedku obsahujúceho antigén respiračné syncytiálneho vírusu (RSV) vyvolať imunitnú reakciu u stavovca
    116 vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 60 uvedenému stavovcovi.
  82. 84. Spôsob podľa nároku 83 vyznačujúci sa tým, že RSV antigénom je RSV fúzny (F) proteín.
  83. 85. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho 'prostriedku obsahujúceho RSV antigén indukovať-cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 51 uvedenému stavovcovi.
  84. 86. Spôsob na zlepšenie schopnosti antigénneho ^prostriedku obsahujúceho RSV antigén indukovať cytotoxické Tlymfocyty u stavovca vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie antigénneho prostriedku podľa nároku 60 uvedenému stavovcovi.
  85. 87. Spôsob podľa nároku 86 vyznačujúci sa tým, že RSV antigénom je RSV fúzny (F) proteín.
SK1602-2001A 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvantné kombinované prostriedky SK16022001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13396399P 1999-05-13 1999-05-13
PCT/US2000/013156 WO2000069456A2 (en) 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvant combination formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK16022001A3 true SK16022001A3 (sk) 2002-09-10

Family

ID=22461127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1602-2001A SK16022001A3 (sk) 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvantné kombinované prostriedky

Country Status (28)

Country Link
US (2) US7611721B1 (sk)
EP (1) EP1178825B1 (sk)
JP (2) JP4974414B2 (sk)
KR (1) KR100863367B1 (sk)
CN (1) CN1192799C (sk)
AT (1) ATE516046T1 (sk)
AU (1) AU781469B2 (sk)
BG (1) BG106094A (sk)
BR (1) BR0010539A (sk)
CA (2) CA2767116A1 (sk)
CZ (1) CZ20013916A3 (sk)
EA (1) EA006233B1 (sk)
EE (1) EE200100597A (sk)
ES (1) ES2367625T3 (sk)
GE (1) GEP20053446B (sk)
HR (1) HRP20010839A2 (sk)
HU (1) HUP0201220A3 (sk)
ID (1) ID30407A (sk)
IL (2) IL146382A0 (sk)
IS (1) IS6156A (sk)
MX (1) MXPA01011499A (sk)
NO (1) NO20015523L (sk)
NZ (1) NZ515322A (sk)
PL (1) PL352312A1 (sk)
SK (1) SK16022001A3 (sk)
TR (1) TR200103266T2 (sk)
UA (1) UA76406C2 (sk)
WO (1) WO2000069456A2 (sk)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
GEP20053446B (en) 1999-05-13 2005-02-25 Wyeth Corp Adjuvant Combination Formulations
ES2258108T3 (es) * 2000-11-07 2006-08-16 Immunovaccine Technologies Inc. Vacunas con respuesta inmune mejorada y procedimientos de preparacion de las mismas.
EP1343527A2 (en) 2000-11-10 2003-09-17 American Cyanamid Company Adjuvant combination formulations
JP5731198B2 (ja) 2007-09-27 2015-06-10 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用
EP2207874B1 (en) * 2007-10-08 2014-12-03 Intrexon Corporation Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer
WO2009146523A1 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PT2691530T (pt) 2011-06-10 2018-05-10 Univ Oregon Health & Science Glicoproteínas e vectores recombinantes cmv
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
BR112014007927B1 (pt) 2011-10-06 2021-04-13 Immunovaccine Technologies Inc Composições de lipossoma compreendendo um adjuvante e usos das referidas composições e usos das referidas composições
RU2496149C1 (ru) * 2012-06-19 2013-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
AU2017235461B2 (en) 2016-03-15 2023-02-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5391485A (en) 1985-08-06 1995-02-21 Immunex Corporation DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5939074A (en) 1986-12-30 1999-08-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptide antigens
US6294322B1 (en) 1988-01-26 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptides that elicit helper T-lymphocyte cytotoxic T-lymphocyte and neutralizing antibody responses against HIV-1
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5013548A (en) 1987-09-08 1991-05-07 Duke University Production of antibodies to HIV
US5993819A (en) 1987-09-08 1999-11-30 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
US5019387A (en) 1987-09-08 1991-05-28 Duke University Production of antibodies to HIV
US5223254A (en) 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
CA1340506C (en) 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE68926859T2 (de) 1988-11-10 1997-02-13 Genetics Inst Natürlicher killerzellen-stimulationsfaktor
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE3934366A1 (de) 1989-10-14 1991-04-18 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum
JP2980677B2 (ja) * 1990-04-27 1999-11-22 マクマイケル，ジョン 不正常なアミロイドβタンパク質と関連する中枢神経系疾患状態の治療のための方法および組成物
SE502569C2 (sv) * 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
CA2124691A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Jagannadha K. Sastry Compositions for eliciting cytotoxic t-lymphocyte responses against viruses
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
WO1994001133A1 (en) 1992-07-08 1994-01-20 Schering Corporation Use of gm-csf as a vaccine adjuvant
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
EP1175912A1 (en) * 1993-03-23 2002-01-30 SmithKline Beecham Biologics SA Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
AU676340B2 (en) 1993-05-25 1997-03-06 Wyeth Holdings Corporation Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
EP0762895B1 (en) 1994-04-29 2002-08-07 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
AUPM543894A0 (en) 1994-05-04 1994-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation An adjuvant
AU3735095A (en) 1994-09-30 1996-04-26 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing a p53 derived protein or peptide, an adjuvant, and interleukin-12 and uses thereof
JP3939752B2 (ja) 1994-10-05 2007-07-04 バンダービルト ユニバーシティー パラミクソウイルスワクチン用アジュバントとしてのインターロイキン−１２
AU4727296A (en) * 1995-02-24 1996-09-11 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US6613337B1 (en) 1997-02-12 2003-09-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
AU2115897A (en) * 1996-02-01 1997-08-22 North American Vaccine, Inc. Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US5762943A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Ribi Immunochem Research, Inc. Methods of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
AU724743B2 (en) 1996-05-31 2000-09-28 Genetics Institute, Llc IL-12 as an adjuvant for Bordetella Pertussis vaccines
US6024965A (en) 1996-10-18 2000-02-15 Erasums University Rotterdam Induction of REV and TAT specific cytotoxic T-cells for prevention and treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection
AU729579B2 (en) * 1996-10-23 2001-02-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Immunotherapy and improved vaccines
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6350456B1 (en) * 1997-03-13 2002-02-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
EP0988053A1 (en) 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
GB9711990D0 (en) * 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9712347D0 (en) * 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2295740A1 (en) 1997-07-08 1999-01-21 Chiron Corporation Use of submicron oil-in-water emulsions with dna vaccines
IS4518A (is) 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
GB9717953D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
DK1053017T3 (da) 1998-02-12 2004-11-22 Wyeth Corp Vacciner omfattende interleukin-12 og herpes simplex virusantigen
IL137810A0 (en) * 1998-02-12 2001-10-31 American Cyanamid Co Vaccines comprising interleukin-12 and respiratory syncytial viral antigens
ATE356630T1 (de) 1998-04-03 2007-04-15 Univ Iowa Res Found Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
GB9907860D0 (en) 1999-04-07 1999-06-02 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GEP20053446B (en) 1999-05-13 2005-02-25 Wyeth Corp Adjuvant Combination Formulations

Also Published As

Publication number Publication date
AU781469B2 (en) 2005-05-26
HUP0201220A2 (en) 2002-08-28
ES2367625T3 (es) 2011-11-07
US7611721B1 (en) 2009-11-03
NO20015523D0 (no) 2001-11-12
ATE516046T1 (de) 2011-07-15
NO20015523L (no) 2002-01-02
CN1354675A (zh) 2002-06-19
TR200103266T2 (tr) 2002-01-21
GEP20053446B (en) 2005-02-25
WO2000069456A3 (en) 2001-02-08
EA006233B1 (ru) 2005-10-27
MXPA01011499A (es) 2002-06-04
PL352312A1 (en) 2003-08-11
WO2000069456A2 (en) 2000-11-23
CZ20013916A3 (cs) 2002-06-12
BR0010539A (pt) 2002-02-19
UA76406C2 (en) 2006-08-15
EE200100597A (et) 2003-02-17
EP1178825B1 (en) 2011-07-13
KR100863367B1 (ko) 2008-10-13
AU4847300A (en) 2000-12-05
CA2372181C (en) 2012-04-17
IL146382A (en) 2007-07-04
JP4974414B2 (ja) 2012-07-11
JP2012006949A (ja) 2012-01-12
IL146382A0 (en) 2002-07-25
JP2004504260A (ja) 2004-02-12
EP1178825A2 (en) 2002-02-13
KR20020001873A (ko) 2002-01-09
HUP0201220A3 (en) 2004-07-28
BG106094A (en) 2002-05-31
ID30407A (id) 2001-11-29
IS6156A (is) 2001-11-12
CN1192799C (zh) 2005-03-16
US20100233117A1 (en) 2010-09-16
NZ515322A (en) 2004-03-26
CA2372181A1 (en) 2000-11-23
EA200101198A1 (ru) 2002-04-25
HRP20010839A2 (en) 2003-02-28
CA2767116A1 (en) 2000-11-23
JP5230780B2 (ja) 2013-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5230780B2 (ja) アジュバント混合製剤
CA2309003C (en) Insect cells or fractions as adjuvant for antigens
McElrath Selection of potent immunological adjuvants for vaccine construction
SK8994A3 (en) Agent for inducing of cytotoxic t-lymphocyte answers
US20070025959A1 (en) Adjuvant combination formulations
AU2002225972A1 (en) Adjuvant combination formulations
ZA200304479B (en) Adjuvant combination formulations.
Herrera et al. Effect of different adjuvants and immunomodulators on the humoral immune response of rabbits and mice against HIV-1 derived multi-epitope polypeptides
UA79426C2 (en) Combined adjuvant compositions

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application