HRP20010839A2 - Adjuvant combination formulations - Google Patents

Adjuvant combination formulations Download PDF

Info

Publication number
HRP20010839A2
HRP20010839A2 HR20010839A HRP20010839A HRP20010839A2 HR P20010839 A2 HRP20010839 A2 HR P20010839A2 HR 20010839 A HR20010839 A HR 20010839A HR P20010839 A HRP20010839 A HR P20010839A HR P20010839 A2 HRP20010839 A2 HR P20010839A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
antigen
mixture according
lys
pro
ile
Prior art date
Application number
HR20010839A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Hagen
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of HRP20010839A2 publication Critical patent/HRP20010839A2/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Beans For Foods Or Fodder (AREA)

Description

Područje izuma
Izum je iz područja imunologije.
Izum se odnosi na uporabu 3-O-deaciliranih monofosforiliranih lipida A ili monofosforiliranih lipida A te njihovih derivata i analoga, u kombinaciji s citokinom ili limfokinom, u određenom stimulirajućem čimbeniku kolonije granulocitnih makrofaga ili interleukinu-12, kao adjuvantna formulacija u antigenskoj smjesi da se pojača imunološki odgovor u kralježnjaka domaćina prema odabranom antigenu.
Stanje tehnike
Imunološki sustav koristi različite mehanizme protiv agresivnih patogena. Međutim, nakon imunizacije nisu svi mehanizmi neophodno aktivirani. Zaštitni imunitet koji je izazvan imunizacijom ovisi o kapacitetu cjepiva da izazove odgovarajući imunološki odgovor da bi se suprostavio patogenima ili ih uklonio. Ovisno o vrsti patogenih, potiče se stanično-upravljan i/ili humoralni imunološki odgovor.
Trenutačno znanje o ulozi pomoćničkih T stanica pri imunološkom odgovoru može se razdvojiti u dvije podskupine temeljem citokina koje proizvode, te različiti citokinski profili koji se analaze u tim stanicama određuju njihovu funkciju. Sukladno tome modelu T-stanica, postoje dvije njihove podskupine: TH-1 stanice proizvode interleukin-2 (IL-2) i interferon gama, koji pojačavaju stanični i humoralni (antitijelo) imunološki odgovor, dok TH-2 stanice proizvode interleukin-4, interleukin-5 i interleukin-10 (IL-4, IL-5, odnosno IL-10), koji pojačavaju humoralne imunološke odgovore (bibliografija, referenca 1).
Često je poželjno pojačati imunogensku snagu antigena da bi se postigao jači imunološki odgovor u organizmu koji je imuniziran i da bi se pojačala otpornost organizma prema sredstvu koje sadrži antigen. U nekim situacijama, poželjno je pomaknuti imuološki odgovor od dominannto humoralnog (TH-2) odgovora prema uravnoteženom staničnom (TH-1) i humoralnom (TH-2) odgovoru.
Stanični odgovor obuhvaća generiranje CD8+CTL (citotoksični T-limfociti) odgovora. Takav odgovor je poželjan za razvijanje cjepiva protiv unutarstaničnih patogena. Zaštita protiv različitih patogena zahtijeva jak mukozni odgovor, visoke titre seruma, izazivanje CTL i snažne stanične odgovore. Ovakvi odgovori se ne mogu postići većinom antigenskih pripravaka, uključujući standardna podjedinična cjepiva. Među takvim patogenima je humani virus imunološke deficijencije (HIV).
Prema tome, postoji potreba da se razviju formulacije antigenskih smjesa koje mogu generirati i humoralni i stanični imuni odgovor u domaćina kralježnjaka.
Sažetak izuma
Sukladno tome, cilj ovog izuma je korištenje formulacija adjuvantnih smjesa u antigenskim smjesama koje sadrže 3-O-deacilirani monofosforilni lipid (MPL™) ili monofosforilirani lipid A te njihove derivate i analoge, kombinirane s citokinom ili limfokinom, u određenom stimulirajućem čimbeniku kolonije granulocitnih makrofaga (GM-CSF) ili interleukinu-12), ili kao agonisti ili antagonisti prema navedenom citokinu ili limfokinu. Adjuvant je tvar koja pojačava imunološki odgovor kada se primijeni zajedno s imunogenom ili antigenom. Formulacija adjuvanta ovog izuma primjenjuje se zajedno s odabranim antigenom u antigenskoj smjesi. Antigenske smjese ovog izuma pojačavaju imunološki odgovor u domaćina kralježnjaka prema tom odabranom antigenu. Odabrani antigen može biti polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden (1) iz patogenog virusa, bakterije, gljivica ili parazita, ili (2) iz stanice karcinoma ili tumorske stanice, ili (3) iz alergena tako da je interferira s proizvodnjom IgE ublažio alergijske odgovore prema laergenu, ili (4) iz amiloidnog peptidnog proteina da bi se spriječila ili tretirala bolest koja je karakterizirana amiloidnim nakupljanjem u domaćina kralježnjaka. U jednoj realizaciji, odabrani antigen je između HIV. Odabrani HIV antigen može biti HIV protein, polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenih proteina. U konkretnoj realizaciji izuma, HIV antigen je specifičan peptid. U drugim realizacijama izuma, odabrani antigen je između Neisseria gonorrhoeae ili respiratornog sincicijskog virusa.
MPL™ može biti u obliku vodene otopine ili stabilne emulzije “ulje u vodi” (stabilna emulzija ili SE). U poželjnoj realizaciji izuma, emulzija “ulje u vodi” sadrži skvalen, glicerol i fosfatidil kolin. U SE formulaciji, MPL™ se miješa s citokinom ili limfokinom tako da nastaje antigenska smjesa prije primjene. Citokin ili limfokin ne moraju ući u emulziju. U poželjnoj realizaciji izuma, MPL™ je u SE obliku. Antigenske smjese mogu također sadržavati razrjeđivač ili nosač.
Ovaj izum također se odnosi na metode za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži antigen odabran (1) između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita da se potakne imunološki odgovor u domaćina kralježnjaka, ili (2) između antigena karcinoma ili tumorski-vezanog antigena iz stanica karcinoma ili tumorskih stanica da bi se potaknuo terapeutski ili profilaktički antikancerogeni učinak u domaćina kralježnjaka, ili (3) između alergena tako da interferira s proizvodnjom IgE da bi se ublažio alergijski odgovor na alergen, ili (4) između amiloidnog proteinskog peptida da bi se spriječila ili tretirala bolest koja je karakterizirana amiloidnim nakupljanjem u domaćina kralježnjaka, uključivanjem učinkovite količine adjuvanta kombinacije citokina ili limfokina, konkretno MPL™ s GM-CSF ili IL-12, ili agonista ili antagonista prema navedenom citokinu ili limfokinu.
Izum se nadalje odnosi na metode za povećanje mogućnosti antigenske smjese da sadrži antigen između patogenog virusa, bakterije, gljivica ili parazita, da bi se potaknuli citotoksični T-limfociti u domaćina kralježnjaka uključivanjem učinkovite količine adjuvanta kombinacije citokina i limfokina, ili određenog MPL™ s GM-CSF ili IL-12, ili agonista ili antagonista prema navedenom citokinu ili limfokinu.
Sažet opis crteža
Slika 1 prikazuje recipročne titre završne točke koji su određeni iz skupina od pet Balb/c ženki miševa koje su imunizirane s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys) , multiepitopa 39 aminokiselinskog peptida, koji je formuliran s CFA ili IFA (trokuti), ili s 50 µg MPL™ 2% stabilnom emulzijom (SE) (kvadrati). Miševi su imunizirani nultog dana i uvedeni 28 dana. ELISA analizom na 42 dan su određeni titri peptid-specifičnog IgG, IgG1 i IgG2a.
Slika 2 prikazuje učinak samo SE, samo MPL™ ili MPL™ SE na adjuvantna svojstva GMCSF na titre anti-T1SP10MN(A) (-Cys) IgG. Skupine od pet ženki Balb/c miševa imunizirane su s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys) na dan 0, te “booster” imunizirane na dan 28 s naznačenom formulacijom adjuvanta. CFA i IFA su emulgirani s vodenom fazom peptida u odnosu 1:1. GMCSF je korišten u dozi 10 µg/dose. MPL™ je dan miševa u ukupnoj koncentraciji od 50 µg kao vodena formulacija, ili 25 µg kao dio stabilne emulzije s 1% SE. Titri su određeni dva tjedna nakon druge imunizacije. Podaci predstavljaju pojedinačne titre koji su određeni iz pet miševa.
Slika 3 prikazuje rezultate analize virusnog neutraliziranja. Združeni serumi (“pool”) koji su uzeti na dan 42 iz miševa koji su imunizirani na dan e 0 i 28 s naznačenim formulacijama su razrijeđeni (1/1600) i dodani razrjeđenjima T-stanično adaptiranom HIVMN prije dodavanja AA5 stanica in vitro. Nakon sedam dana uzgajanja, supernatanti stanične kulture analizirani su na virusnu reverznu transkriptazu kao indikator virusne replikacijue.
Slika 4 prikazuje proliferaciju stanica slezene miša imuniziranog s T1SP10MN(A) (-Cys) i različitim formulacijama adjuvanta. Stranice slezene su stimulirane in vitro tijekom 4 dana s 3,3 µg/ml T1SP10MN(A) (-Cys) . Rezultati su prikazani kao promjena ugradnje obilježenog timidina kao rezultat in vitro stimuliranja s T1SP10MN(A) (-Cys) u odnosu na ugradnju u odsutnosti stimuliranja (delta cpm).
Slika 5 prikazuje CTL aktivnost stanica slezene izoliranih iz miševa sedam dana nakon sekundarne imunizacije. Stanice slezene su sakupljene iz skupina od tri Balb/c miša koji su imunizirani na dane 0 i 21 s 50 µg T1SP10MN(A) (-Cys) formuliranih s 50 µg MPL™ u 1% SE sa ili bez 10 µg GM-CSF. Stanice su uzgajane s HIVMN CTL epitopskim peptidom tijekom sedam dana. IL-2 je dodan kulturama posljednjih pet dana. Efektorske stanice slezene su dodane kromom obilježenim P815 stanicama pulsiranim s HIVMN, drugom soju koji je označen HIVIIIB ili bez peptida za označene odnose. Postotak CTL aktivnosti izračunat je kao:
[image]
“E:T” označuje odnos efektora prema ciljanim stanicama.
Rješenje tehničkog problema s primjerima izvođenja
Adjuvanti, citokini i limfokini su imunološki modulirajući spojevi koji imaju sposobnost da pojačaju ili upravljaju razvojem i profilom imunoloških odgovora prema različitim antigenima koji su sami slabo imunogeni. Odgovarajući izbor adjuvanata, citokina i limfokina može izazvati dobar humoralni ili stanični imunološki odgovor kakav se ne bi mogao razviti bez adjuvanta, citokina ili limfokina. Konkretno, adjuvanti, citokini i limfokini imaju značajan učinak u svezi s pojačanjem imunološkog odgovora na podjedinice i peptidne antigene u cjepivima. Njihova stimulirajuća aktivnost je također blagotvorna u svezi s razvojem antigen-specifičnih imunoloških odgovora koji su usmjereni protiv proteinskih antigena.
Za cijeli niz antigena koji zahtijevaju jake mukozne odgovore, visoke serumske titre, izazivaju CTL i snažne stanične odgovore, adjuvant i kombinacija citokin/limfokin predstavlja stimulans kakav se ne može postići većinom antigenskih pripravaka.
Brojnim istraživanjima ispitane su različite formulacije adjuvanata u životinjskim modelima, ali je alum (aluminijev hidroksid ili aluminijev fosfat) trenutačno jedini adjuvant koji ima dozvolu za široku primjenu u ljudi. Jedna skupina djuvanata, stsbilne emulzije, koje se sastoje od različitih kombinacija “voda u ulju” ili “ulje u vodi”, skrenula je osobitu pozornost zbog sposobnost da pojača imunost. Ove formulacije općenito se sastoje od različitih kombinacija metabolizirajućih ili inertnih ulja, koja djeluju kao stabilizator i odlagatelj antigena na mjestu injiciranja. Jedan takav adjuvant je nepotpun Freundov adjuvant (IFA), koji sadrži mineralno ulje, vodu i sredstvo za emulgiranje. Potpuni Freundov adjuvant (CFA) je IFA plus toplinski uništene mikobakterije. Osobita pozornost pri korištenju ovih tipova adjuvanata je bio nadražaj na mjestu primjene, često kao rezultat infiltriranja mononuklearnih stanica što izaziva granulomatozne lezije. Dakle, kao potencijalni adjuvanti istraženi su ostali spojevi i formulacije.
Jedan takav spoj je 3-O-deacilirani monofosforilni lipid A (MPL™), koji se može nabaviti od Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton, MT). MPL™ je opisan u američkom patentu br. 4,912,094 (2), koji je ovdje uključen kao referenca.
Nedavno, Ribi ImmunoChem Research Inc. formulirao je metabolizirajuću “ulje u vodi” formulaciju koja, kada se kombinira s MPL™, rezultira nastajanjem stabilne emulzije koja se označava MPL™ SE. Stabilna emulzija se dobiva mikrofluidiziranjem MPL™ sa skvalen uljem, glicerolom i fosfatidil kolinom. Trenutačna formulacija je mikrofluidizirana emulzija GMP-kakvoće. Emulzije koje sadrže 1 ili 2% ulja opisane su u eksperimentima niže.
MPL™ SE nije rezultirao prepoznatljivom patologijom tkiva kada je u Balb/c miševe primjenjivan subkutano, odnosno intramuskularno. Za potrebe usporedbe načinjena je stabilizirana emulzija koja sadrži identične komponente, ali bez MPL™. Specifično, subkutana ili intramuskularna imunizacija s 40 aminokiselinskim HIV peptidom T1SP10MN(A) (+Cys) ili s cistein-uklonjenim 39 aminokiselinskim peptidom T1SP10MN(A) (-Cys) (kojemu nedostaje cisteinska rezidua na aminokiselinskom broju 17 u aminokiselinskom peptidu (+Cys)), formulirana s kombinacijom adjuvanata MPL™ SE i GM-CSF rezultira beznačajnom staničnim infiltriranjem ili tkivnim nenormalnostima dva tjedna nakon imunizacije.
Unutar dosega ovog izuma je uporaba monofosforil lipida A, prekursorskog oblika MPL™, koji je također opisan u američkom patentu br. 4,912,094 (2). Također su unutar dosega ovog izuma derivati i analozi MPL™ i monofosforil lipid A.
Ugrađivanje citokina i limfokina u formulacije cjepiva bilo je obećavajuće u svezi sa širenjem i pojačanjem potencijala cjepiva (3). Citokin interleukin-12 (IL-12) pokazalo se da izaziva i pojačava stanični imunitet, pomicanjem širenja podskupa u T-pomoćničkim stanicama prema profilu Th1 citokina (tj. prema IgG2 podklasi u mišjem modelu) (4-6). U miševa, rekombinantni mišji IL-12 pokazalo se da pojačava Th1 dominiran profil imunološkog odgovora (3).
IL-2 proizvode različite antigenske stanice, uglavnom makrofagi i monociti. To je kritičan element pri izazivanju TH1 stanica iz prirodnih T-stanica. Proizvodnja IL-2 ili sposobnost da se odgovori na nju pokazalo se da je kritična u razvoju zaštitnik TH1-sličnih odgovora, primjerice tijekom parazitnih infekcija, poglavito Leishmaniasis (7). Učinci IL-12 su ublaženi većim dijelom pomoću gama-interferona kojega proizvode NK stanice i T-pomoćničke stanice. Gama-interferon je kritičan za izazivanje IgG2a antitijela u odnosu na T-ovisne proteinske antigene (8) i IgG3 odgovore na T-neovisne antigene (9). IL-12, koji je izvorno nazvan prirodni ubojica staničnog stimulirajućeg čimbenika, je heterodimerni citokin (10). Ekspresija i izoliranje IL-12 proteina u rekombinantnim stanicama domaćina opisano je i publicirano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 90/05147 (11).
Drugi citokin koji potencijalno obećava kao adjuvant je GM-CSF. GM-CSF je određeni tip stimulirajućeg čimbenika kolonije (CSF). CSF-ovi su obitelj limfokina koji izazivaju progenitorske stanice koje se nalaze u koštanoj srži da razlikuju specifične tipove zrelih krvnih stanica. Kao što je opisano u američkom patentnu br. 5,078,996 (12), koji je ovdje uključen kao referenca, GM-CSF aktivira makrofage ili prekursorske monocite da upravlja nespecifičnom tumoricidnom aktivnošću. Opisana je nukleotidna sekvencija koja kodira humani GM-CSF gen (12).
Plazmid koji sadrži GM-CSF cDNA bio je transformiran u E. coli i pohranjen je u Američkoj zbirci tipskih kultura (ATTC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, pod pristupnim brojem 39900. Kao što je opisano u američkom patentu br. 5,229,496 (13); koji je ovdje uključen kao referenca, GM-CSF gen također je bio ubačen u kvašćev ekspresijski plazmid i pohranjen s ATTC pod pristupnim brojem 53157. Štoviše, kao što je opisano u američkom patentu br. 5,073,627 (14), koji je ovdje uključen kao referenca, DNA-sekvencija koja kodira GM-CSF s uklonjenim mjestima glikoziliranja pohranjena je s ATTC pod pristupnim brojem 67231.
Za GM-CSF se pokazalo da doregulira proteinske molekule na antigenskim stanicama da bi se pojačao imunološki odgovor (15), te da utječe na Ig izlučivanje u pročišćenim mišjim B stanicama (16).
Za ostale citokine ili limfokine se pokazalo da imaju imunološki modulirajuću aktivnost, uključujući (bez ograničenja) interleukine 1-alfa, 1-beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 i 18, alfa-, beta- i gama-interferone, stimulirajući čimbenik granulocitne kolonije, te alfa i beta čimbenik tumorske nekroze.
U svezi sa sistemskom primjenom nekog citokina i limfokina su biološke posljedice koje su povezane s aktivnošću citokina ili limfokina. Nadalje, učinci citokina i limfokina koji se odnose na razvoj antigen-specifičnih imunoloških odgovora trebaju se pojačati ako su zadržane lokalne koncentracije citokina ili limfokina.
U prethodnim istraživanjima, GM-CSF i IL-12 su bili procijenjeni odvojeno. Uočeno je pojačanje različitih imunoloških odgovora.
Izum koji je ovdje opisan pokazuje da, pomoću kombinacije antigena, odabranog citokinskog ili limfokinskog adjuvanta, te drugog adjuvanta, MPL™ (poželjno kao stabilna metabolizirajuća emulzija), imunološki odgovori koji su specifični za antigen su pojačani.
Antigeni koji su odabrani za stavljanje u antigenske smjese ovog izuma sadrže peptide ili polipeptide koji su izvedeni iz proteina, kao i fragmente sljedećeg: saharida, proteina, poli- i oligonukleotida, ili drugih makromolekularnih komponenata. Kako se ovdje rabi, pojam “peptid” sadrži niz od bar šest aminokiselina i sadrži bar jednu antigensku determinantu, dok je “polipeptid” molekula dulja od peptida, ali ne čini protein pune duljine. Kako se ovdje rabi, “fragment” sadrži dio, ali manji od cjeline saharida, proteina, poli- i oligonukleotida, ili drugih makromolekularnih komponenti. U slučaju HIV, antigenske smjese ovog izuma nadalje obuhvaćaju HIV-proteine pune duljine.
Ovaj izum je prikazan u modelnom sustavu korištenjem petidnih antigena koji su izvedeni iz HIV. Ovi peptidi su opisani u patentnima ili su izvedeni iz američkih patenata br. 5,013,548 (17) i 5,019,387 (18), koji su ovdje uključeni kao referenca, te se sada sažeto prikazuju. Ovi peptidi sadrže sekvencije aminokiselina koje odgovaraju području HIV ovojnog proteina za kojeg se proizvode neutralizirajuća antitijela i T-stanični odgovori.
HIV je humani retrovirus koji je kauzativno sredstvo stečenog sindroma imunološke deficijencije (AIDS, SIDA). HIV zarazi T-limfocite imunološkog sustava vezanjem njegova vanjskog ovojnog glikoproteina za CD4 (T4) molekulu na površini T-limfocita, tako da rabi CD4 (T4) molekulu kao receptor za ulaz i inficiranje T-stanica. Pokušaji da se izazove zaštitni imunološki odgovor koji je specifičan za HIV-infekciju putem imunizacije imali su vrlo ograničeni uspjeh.
Načinjeno je nekoliko pokušaja u nastojanju da se odredi učinkovita i zaštićujuća strategija cijepljenja. Među inima koriste se prigušeni i rekombinantni bakterijski vektori koji vrše ekspresiju antigenskih epitopa iz HIV (19), rekombinantni adenovirus (20) i vaccinia virusni vektori (21), DNA cjepiva (22), te sintetski peptidi koji sadrže različite T i B stanične epitope HIV (23).
HIV vanjski ovojni glikoprotein gp120 pokazalo se da može izazvati neutralizirajuća antijela u čovjeka. Rekombinantni protein PB1, koji kodira približno trećinu cjelokupne gp120 molekule, pokazalo se da uključuje dio ovojnog proteina koji izaziva nastajanje neutralizirajućih antitijela. Međutim, istraživanja s čimpanzama su pokazala da niti intaktni gp120 ni PB1 ne mogu izazvati proizvodnju visokih titara neutralizirajućih antitijela.
Kratki peptidi sintetizirani su standardnim metodama koje odgovaraju antigenskim determinantama gp120 i generiraju odgovor antitijela prema gp120 koji neutralizira virus i izaziva T-pomoćničke i CTL odgovore prema virusu.
Jedan takav peptid je C4/V3 multiepitopski HIV-1MN peptid koji je označen T1SP10MN(A) (+Cys) , te bezcisteinska inačica T1SP10MN(A) (-Cys). Ovi peptidi sadrže Th, TCTL i B epitope, ali ne induciraju antitijela koja interferiraju s CD4 vezanjem. Prethodno je pokazano da su ovi C4/V3 HIV peptidi obećavajući kandidati za izazivanje imunoloških odgovora kada se primjenjuju s CFA ili CFA-sličnim adjuvantima (24-29). Ovi peptidi sadrže epitope za koje se prethodno pokazano da potiču CD4+ Th stanične odgovore u miševa i ljudi, te da sadrže i glavnu neutralizirajuću determinantu i mjesto koje je prepoznato od strane CD8+ CTL u Balb/c miševa i ljudi koji su HLA B7+. Peptid s 39 aminokiselina, pokazalo se, osigurava imunogenost i sigurnost u HIV-zaraženih bolesnika (28).
T1SP10MN(A) (+Cys) ima sljedeću sekvenciju 40 aminokiselina:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:1) (26).
T1SP10MN(A) (-Cys) sintetiziran je bez cisteina na položaju 17 i ima sljedeću sekvenciju 39 aminokiselina:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:2).
Ova cisteinska rezidua je smještena izvan funkcionalnih epitopa koje prepoznaje TH stanice, CTL ili B stanice. Ostali HIV peptidi iz različitih područja virusnog genoma su opisani u američkom patentu br. 5,861,243 (30), američkom patentu br. 5,932,218 (31), američkom patentu br. 5,939,074 (32), američkom patentu br. 5,993,819 (33), američkom patentu br. 6,037,135 (34) i objavljenom europskom patentu br. 671,947 (35), što je također uključeno kao referenca.
HIV antigen može biti protein, polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenog proteina. Protein može biti glikoprotein kao što je gp4l, gp120 ili gp160. Alternativno, protein može biti protein koji je kodiran takvim genima kao što su gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef ili env. Peptidi koji su izvedeni iz takvih proteina će sadržavati bar jednu antigensku determinantu (epitop) duljine bar 6 aminokiselina.
Imunološki odgovor na HIV peptid može se pojačati kovalentnim vezanjem (konjugiranjem) peptida za molekulu farmaceutski prihvatljivog nosača. Primjeri pogodnih molekula nosača uključuju tetanusni toksoid, difterijski toksoid, limpet hemocijanin i druge peptide koji odgovaraju T-staničnim epitopima HIV gp120 glikoproteina.
Vjeruje se da bi za uspješnu strategiju cijepljenja protiv HIV trebalo izazvati mukozni imunitet prema HIV, kao i dobar CTL odgovor. U novijoj studiji s miševima korištenjem T1SP10MN(A) multiepitopskog peptida, te mukozni adjuvant, toksin kolere, pokazalo se da je intranazalna imunizacija izazvala IgG1 antitijela neutralizirajućeg seruma (36). Kasnije istraživanje korištenjem također HIV-V3 petlje peptida pokazalo je indukciju mukozno sintetiziranih IgA antitijela i jak stanično posredovan odgovor, uključujući peptid-specifičan CTL (37). Funkcionalna uloga visokog titra sistemskih i neutralizirajućih antitijela u prevenciji ili stabiliziranju HIV-zaraženih osoba je nepoznato, premda se vjeruje da su visoki titri virus-specifičnih antitijela značajni u sprječavanju virusnog širenja.
U poželjnoj realizaciji ovog izuma, formulirana je stabilna emulzija “ulje u vodi” koja sadrži MPL™, koja se zatim miješa s citokinima IL-12 ili GM-CSF. Podaci koji su dani niže pokazuju da ove kombinacije rezultiraju visokim titrom HIV-neutralizirajućih serumskih antitijela. Kombinacija MPL™ SE i GM-CSF izaziva visoke titre antigen-specifičnih IgG i IgA antitijela u vaginalnom otvoru imuniziranih ženki miševa. Imunizacija miševa s bilo kojim od T1SP10MN(A) peptida formuliranih s MPL™ SE i GM-CSF izaziva jak stanični imunološki odgovor što je određeno pojačanom antigen-specifičnom staničnom proliferacijom i izlučivanjem u kulturu citokina, kao i izazivanjem peptid-specifičnih CTL odgovora. Općenito, antigen/adjuvant formulacija MPL™ ili MPL™ SE kombinirana s GM-CSF ili IL-12 te proteinom ili peptidom od izbora izaziva visoke titre antigen-specifičnih i virus neutralizirajućih antitijela, značajan pomak u odnosu IgG potklase prema većem udjelu komplement-fiksirajućih IgG antitijela (u korist IgG2a u miševa), povećanu proizvodnju citokina i staničnu proliferaciju iz mononuklearnih stanica kao odgovor na antigensko stimuliranje in vitro. Ova svojstva nisu uočena s formulacijama antigena i SE u odsutnosti MPL™, bilo sa ili bez GM-CSF ili IL-12. Formulacije ovog izuma također izazivaju dobre stanične odgovore što je određeno putem indukcije CTL.
Boljitak MPL™ SE je u tome što formulacija ne izaziva granulomatoznu akumulaciju i upalu na mjestu injiciranja, a takve reakcije na mjestu injiciranja javljaju se tipično formulacijama adjuvanata “voda u ulju” ili “ulje u vodi”.
Sposobnost da se izazove pojačani imunološki odgovor putem stimulirajućih učinaka MPL™ u kombinaciji s GM-CSF ili IL-12 u odsutnosti lokalnih granulomatoznih upala nije uočeno s drugim formulacijama adjuvanata koje su trenutačno predložene za tretiranje HIV.
Izvršen je niz istraživanja da se usporedi MPL™ (sa ili bez SE) plus GM-CSF ili IL-12 sa svakim MPL™, SE, GM-CSF, IL-12 ili CFA/IFA pojedinačno ili zajedno s HIV peptidom. Sada će biti prikazan sažetak rezultata, a nakon toga slijedi isrpnije razmatranje.
U prvom eksperimentu, Balb/c miševi koji su imunizirani potkožno s C4/V3 HIV peptidom T1SP10MN(A) (-Cys), formuliranim s MPL™ SE i GM-CSF, proizveli su serum IgG titre veće od 107 nakon samo dvije injekcije. Odgovor antitijela bio je HIV-neutralizirajući, te je pokazao značajno povećanje IgG1, IgG2a i IgG2b peptid-specifičnog titra antitijela.. Stanice slezene koje su stimulirane u peptidnoj kulturi otpustile su povećane razine IL-4, IL-5 i gama-interferona. Zajedno, ovi nalazi su indikativni za izazivanje uravnoteženog odgovora tipa Thl/Th2. IgG i IgA antitijela koja su stvorena su specifična za T1SP10MN(A) (-Cys) u tekućini vaginalnog ispirka miševa koji su imunizirani s MPL™ SE i GM-CSF. Ovi nalazi ukazuju na to da kombinacija MPL™ SE i GM-CSF s HIV-peptidnim antigenom rezultira poželjnim profilom imunološkog odgovora.
U ovom prvom eksperimentu, Balb/c miševi imunizirani s HIV peptidom T1SP10MN(A) (-Cys) i SB adjuvantnom formulacijom, ili GM-CSF, generirali su titre peptid-specifičnih IgG antitijela (Tablica 1). Stabilna emulzija “ulje u vodi” (SE) sadrži skvalen, glicerol, emulgirajuće sredstvo (fosfatidil kolin), pokazala je sposobnost da se pojačaju peptid-specifični IgG titri kada se pomiješa s T1SP10MN(A) (-Cys). IgG titri koji su izazvani putem imunizacije s 25 μg T1SP10MN(A) (-Cys) formuliranim s SE izazvali su titre sekundarnog odgovora koji su bili približno jedna petina onih koji su inducirani u miševa imuniziranih s peptidom i CFA, te “booster” imuniziranih s peptidom u IFA. Primatelji CFA/IFA formuliranih cjepiva rutinski su razvili T1SP10MN(A) (-Cys)-specifična IgG titre kao odgovor na primarnu imunizaciju. Zbog usporedbe, miševi su imunizirani samo s 25 μg T1SP10MN(A) (-Cys) peptida.
Vodene i SE formulacije MPL™ uspoređene su s odgovorima koji su inducirani putem imunizacije miševa Freundovim adjuvantom ili citokina IL-12 i GM-CSF. Primatelji T1SP10MN(A) (-Cys) koji su miješani s IL12 općenito nisu generirali peptid-specifična antitijela u nekoliko ponovljenih istraživanja. Nasuprot tome, primatelji GM-CSF ili MPL™ SE plus T1SP10MN(A) (-Cys) su razvili nizak, ali detektibilan titar IgG antitijela. Dodatak IL-12 ili GM-CSF formulacijama koje sadrže MPL™ SE plus T1SP10MN(A) (-Cys) peptid izazvao je značajno više titre IgG kao odgovor na imunizaciju. Zaista, imunizacija miševa s MPL™ SE i GM-CSF u kombinaciji rezultirala je sekundarnim titrima koji su bili konzistentno viši nego oni koji su određeni u miševa koji su bili imunizirani s bilo kojom drugom ispitanom formulacijom. Peptid-specifični IgG titri bili su viši od onih u miševa koji su bili imunizirani s čak 125 µg T1SP10MN(A) (-Cys) formuliranim s Freundovim adjuvantom.
Poželjna osobina HIV-specifičnog imunološkog odgovora je u tome što je uravnotežen između staničnih i humoralnih komponenata. Određene imunoglobulinske imunotipske podklase korelirane su sa skretanjem podskupa T-pomoćničkih stanica prema bilo Th1 ili Th2 dominacijom. Citokini koji izlučuju svaki od ovih podskupova T-pomoćničkih stanica pokazali su aktivnost u usmjeravanju preklapanja IgG podskupa. Titri završne točke IgG podklase određeni su iz združenih seruma koji su sakupljeni dva tjedna nakon sekundarne imunizacije (tablica 2). Imunizacija miševa samo s T1SP10MN(A) (-Cys), ili formuliranim bilo s GM-CSF ili IL-12, rezultirala je nikakvim ili slabim titrom IgG podklase u nekoliko ponovljenih istraživanja. IgG3 antitijela nisu mogla biti detektirana pomoću ELISA analize. Skupine miševa imuniziranih s T1SP10MN(A) (-Cys) emulgiranim s CFA i “booster” imuniziranih s IFA razvile su dominantno IgG1 odgovor antitijela koji je specifičan za T1SP10MN(A) (-Cys). Formulacije peptida s SE, MPL™ SE, MPL™ SE plus IL-12, ili MPL™ SE plus GM-CSF, također su razvile visok titar IgG1 antitijela. Primatelji SE-formuliranih cjepiva ponovljeno su pokazali značajan IgG1, ali ne značajan titar IgG2a ili IgG2b. Uključivanje MPL™ u SE formulaciju rezultiralo je pojačanim titrima IgG2a i IgG2b T1SP10MN(A) (Cys)-specifičnih antitijela. Uključivanje bilo IL-12 ili GM-CSF s MPL™ SE i T1SP10MN(A) (-Cys) rezultiralo je pomakom titarskog odnosa IgG1:IgG2a antitijela. Bez citokina, MPL™ SE formulirana cjepiva izazvala su slične titre IgGl i IgG2a. I IL-12 i GM-CSF povećali su relativne serumske koncentracije peptid-specifičnog IgG2a. Štoviše, kombinacija MPL™ SE i GM-CSF također je izazvala značajno povišenje titra IgG2b antitijela koja su specifična na T1SP10MN(A) (-Cys) (47-struko u usporedbi s MPL™ SE i 74-struko u usporedbi s SE). Titri koji su se razvili u miševa imuniziranih s MPL™ SE i GM-CSF zajedno s T1SP10MN(A) (-Cys) peptidom bili su konzistentno najviši za bilo koju skupinu primatelja cjepiva.
Da bi se odredilo jesu li visoki titri izmjereni za združene serume miševa imuniziranih s T1SP10MN(A) (-Cys) , MPL™ SE, i GM-CSF reprezentativni za pojedinačne miševe unutar skupine, titri pojedinačnih miševa unutar skupine uspoređeni su s onima miševa imuniziranih s peptidom formuliranim Freundovim adjuvantom (slika 1). Određeno je da je prosjek pojedinačnih serumskih titrova za IgG, IgG1 i IgG2a sličan titrima koji su izmjereni iz združenih seruma (“pool”) (podaci nisu prikazani). Koformuliranje T1SP10MN(A) (-Cys) s MPL™ SE i GM-CSF rezultiralo je titrima IgG, IgG1 i IgG2a koji su bili značajno viši od onih u miševa imuniziranih s CFA/IFA. Svi miševi imunizirani s MPL™ SE i GM-CSF formuliranim peptidom razvili su više titre IgG antitijela od onih koji su izmjereni u miševa imuniziranih s CFA/IFA formulacijom. Ovi rezultati naznačuju naznačuju da je kombinacija MPL™ SE s GM-CSF generirala povoljan profil odgovora antitijela kao što je nađeno kroz visoke titre peptid-specifičnog antitijela, te povoljnom raspodjelom IgG podlase. Ova formulacija rutinski izaziva najviše T1SP10MN(A) (-Cys)-specifične titre bilo koje korištene formulacije cjepiva.
Načinjena je usporedba anti-T1SP10MN(A) (-Cys) IgG titrova miševa imuniziranih s GM-CSF formuliranih zajedno s vodenom fazom MPL™ SE ili MPL™ SE, da se odrede učinci GM-CSF kao dodatka adjuvantu (slika 2). Rezultati navješćuju da je kombinacija MPL™ SE s GM-CSF i peptida jedinstvena u ovoj konkretnoj realizaciji pri izazivanju visokog titra antitijela. MPL™ plus GM-CSF izazvao je titre koji su usporedivi s CFA/IFA. Prema tome, adjuvantna svojstva MPL™ i GM-CSF čine se sinergističkima kada se formulirani zajedno pri čemu je MPL™ bilo u vodenom obliku ili se kao stabilna emulzija.
Zatim, titar T1SP10MN(A) (-Cys)-specifičnih antitijela izmjeren je u združenoj tekućini vaginalnih ispiraka koji su dobiveni u miševa četiri tjedan nakon druge imunizacije (Tablica 3). Miševi imunizirani s MPL™ SE plus GM-CSF razvili su visoki titar za oba IgA i IgG antitijela. Titri antitijela u vaginalnom ispirku koji je dobiven u miševa koji su imunizirani s drugim formulacijama nisu rutinski detektirani. Budući da je odnos IgG prema IgA u vaginalnom ispirku u korist IgG, te budući da slgA nije mjeren, ne može se zaključiti da su IgA antitijela detektirana u tekućini vaginalnog ispirka lokalno sintetizirana u mukoznim tkivima. Zaista, vjerojatno je da su detektirani IgA i IgG titri rezultat transudiranog imunoglobulina koji je izlučen iz plazma stanica koje su smještene distalno u odnosu na vaginalnu mukozu.
Ovi rezultati su pokazali da miševi koji su imunizirani s HIV-peptidom T1SP10MN(A) (-Cys) , formuliranim s MPL™ SE u kombinaciji s bilo IL12 ili GM-CSF imaju visoke titre peptid-specifičnih serumskih antitijela.
Da se procijeni jesu li ti titri antitijela funkcionalno učinkoviti, serumi su analizirani u svezi s njihovom sposobnošću da inhibiraju infekciju stanica in vitro pomoću laboratorijski prilagođenog HIV soja. Analizom je izmjerena aktivnost reverzne transkriptaze virusa koja je dospjela u kulturu supernatanata iz stanica koje su inficirane s odgovarajućim sojem. Serumi miševa imuniziranih s MPL™ SE i GM-CSF, ili MPL™ SE i IL-12, oba izazivaju smanjenu virusnu infektivnost (slika 3).
Maksimalne jedinice virusne reverzne transkriptaze bile su u rasponu od 9,481 do 10,411. Serumi miševa koji su imunizirani s tom formulacijom inhibirali su virusno repliciranje. Čak i virusno razrjeđenje od samo 1/20, seruma miševa koji su imunizirani s MPL™ SE i GM-CSF zajedno s T1SP10MN(A) (-Cys) inhibirali su virusno repliciranje za približno pet posto. Titar serumske neutralizacije za ovu formulaciju određen je kao veći od 1600 u usporedbi sa 71 za serum koji je dobiven iz miševa koji su imunizirani s MPL™ SE, IL-12 i HIV peptidnom formulacijom.
Serumski titri anti-T1SP10MN(A) (-Cys) iz tih skupina bili su slični (premda nešto viši) onima koji su izazvani imunizacijom miševa s CFA i IFA. Serumi miševa koji su imunizirani s T1SP10MN(A) (-Cys) emulgiranim s CFA/IFA nisu pokazali HIV-neutraliziranje u ovoj analizi. Serumi miševa imuniziranih s peptidom i kombinacijom MPL™ SE plus GM-CSF kao adjuvantom, pokazali su veću neutralizacijsku aktivnost nego bilo koji drugi serum. Pri ekvivalentnom razrjeđenju, serum miševa koji su imunizirani s MPL™ SE plus GM-CSF i HIV peptidom neutralizirali su veće koncentracije virusa nego serum primatelja drugih formulacija cjepiva.
Mjerena je proliferacija HIV peptid-specifične stanice slezene u kulturi. Kao mjerenje stanične odgovornosti prema T1SP10MN(A) (-Cys), stanice slezene uzgajanje su in vitro s peptidom ili kontrolnim proteinima. Analizom je mjeren 3H-timidin ugrađen u DNA podijeljenih stanica (Tablica 4). Za razliku od stanica miševa imuniziranih bez adjuvanta, stanice miševa imuniziranih s T1SP10MN(A) (-Cys) formuliranih s SE, snažno su proliferirane kao odgovor na peptid. Stanice slezene primatelja cjepiva nisu odgovarale u kulturi na irelevantan antigen (lizosom) ili na neantigensko stimuliranje. Sve skupine odgovarale su slično na stimuliranje s ConA. Unutar većine skupina, nije bilo indikacije proliferativnog odgovora koji ovisi o antigen-specifičnoj dozi. Za sve tri doze peptida, najveći stupanj proliferacije određen je za skupine miševa koji su imunizirani s GM-CSF koformuliranim s MPL™ SE. Najniži proliferacijski odgovori izmjereni su za stanice slezene skupine miševa imuniziranih s CFA/IFA ili IL-12 plus HIV-peptid formuliranih cjepiva. Stanice slezene miševa imuniziranih s peptidom te ili SE ili GM-CSF, ugradile su slične razine timidina u kulturi. Ovi rezultati pokazuju da koformulacija HIV peptida s MPL™ SE zajedno s GM-CSF, daje mišje stanice slezene s najvećim potencijalom prioliferacije kao odgovor na in vitro prisutnost antigena.
Uzgojene stanice slezene ispitane su u svezi s njihovim potencijalom da izluče u kulturu supernatante citokina (Tablica 5) i gama-interferon (Tablica 6). Ovi citokini mjernei su u kulturi supernatanata koji su sakupljeni nakon tri i šest dana in vitro stimuliranja s antigenom ili mitogenom. Mjerenja IL-4, T-pomoćnički citokin tipa 2, pokazala su da dok sve skupine daju detektibilne razine kao odgovor na stimuliranje s mitogenom ConA s danom 3, samo miševi imunizirani s MPL™ SE ili MPL™ SE plus GMCSF, proizveli su IL-4 kao odgovor na peptidno stimuliranje. Samo miševi imunizirani s MPL™ SE plus GM-CSF i TISP10MN(A) (-Cys) izlučili su u kulturu detektibilne razine IL-4 za sve doze peptida korištenih za stimuliranje stanica slezene.
Šestim danom uzgajanja, stanice slezene miševa imuniziranih zajedno s MPL™ SE plus GM- CSF izlučile su veće razine IL-4 nego one koje su detektirane u miševa imuniziranih s peptidom zajedno s MPL™ SE, MPL™ SE plus IL-12 ili SE. Razine IL-4 bile su veće čak od onih induciranih pomoću stimuliranja takvih stanica u kulturi s ConA. Stanice slezene uzgojene u miševa imuniziranih s s MPL™ SE plus GM-CSF također su izlučile u kulturu detektibilne razine IL-5 (drugi tip 2 T-pomoćničkog citokina (nije prikazano)) kao odgovor na šest dana stimuliranja s T1SP10MN(A) (-Cys). Ni iz jedne druge skupine stanice slezene nisu proizvele detektibilni IL-5 u tim kulturama.
Kao odgovor na trodnevno stimuliranje u kulturi s ConA, stanice slezene iz svih skupine miševa izlučile su detektibilne razine gama-interferona u kulturu (Tablica 6). Samo stanice iz miševa imuniziranih s MPL™ SE ili MPL™ SE plus GM-CSF proizvele su detektibilne razine gama-interferona kao odgovor na trodnevno stimuliranje s HIV peptidom. Na kraju šest dana stimuliranja kulture, uočene su više koncentracije gama-interferona kao odgovor na ConA i peptid. On interesa su bile razine gama-interferona koje su izmjerene u kulturi supernatanata slezena koje su imunizirane s MPL™ SE ili MPL™ SE plus GM-CSF. Stanice slezene tih dviju skupina primatelja izlučile su značajno veće koncentracije gama-interferona u kulturu supernatanata nego stanice slezene miševa koji su imunizirani peptidom zajedno s MPL™ SE plus IL-12 ili SE.
Rezultati prvog eksperimenta pokazuju da uključivanje MPL™ u stabilnu emulziju “ulje u vodi”, pa zatim kombiniranje emulzije s HIV peptidom T1SP10MN(A) (-Cys) i GM-CSF, rezultira izazivanjem neutralizirajućih antitijela. Štoviše, koformulacija GM-CSF s MPL™ SE i antigenom cjepiva rezultira povećanim razinama IL-4, IL-5 i gama-interferona izlučenih u kulturu supernatanata te pojačanim proliferacijskim odgovorom stanica slezene stimuliranih u kulturi s imunizirajućim antigenom. Ta formulacija također je izazvala najveće IgG, IgG2a i IgG2b titre bilo koje formulacije cjepiva. Samo skupine miševa imuniziranih s kombinacijom MPL™ SE i GM-CSF zajedno s peptidom imale su detektibilne IgG i IgA titre u vaginalnom ispirku konzistentno tijekom određenog broja ponovljenih istraživanja. Kombinacija MPL™ SE, IL-12 i peptida također je rezultirala povećanim razinama IgG1 i IgG2a titra, povećanom virusnom neutralizacijom, povećanom proliferacijom stanica slezene te izlučivanjem IL-4 i gama-interferona.
Imunizacija miševa s bilo kojim samostalnim adjuvantom formuliranim s HIV peptidom nije dala imunološki odgovor sa svojstvom izazivanja neutralizirajućeg antitijela.
Često je uočeno da imuniziranje miševa s T1SP10MN(A) ( -Cys) , zajedno s MPL™ SE ili MPL™ kao vodena formulacija, izaziva povoljan titar antitijela. Ove formulacije nisu, međutim, konzistentno izazivale imunološki odgovor s titrom vaginalnih antitijela, titrom neutralizirajućih antitijela (ili jakim CTL odgovorima kao što je opisano u eksperimentu 8) . Povremeno, MPL™ ili MPL™ SE kombiniran s peptidom izazvanih mjerljivim titrima IgA i IgG u tekućini vaginalnog ispirka. U nekim istraživanjima, dodatak bilo IL-12, ili GM-CSF na MPL™ u formulacji cjepiva rezultira titrima koji su bili slični onima proizvedenim u miševa imuniziranih s CFA/IFA, ili nekoj od MPL™ SE formulacija sa ili bez citokina.
Ovo opažanje ukazuje na to da SE oblik MPL™ nije potreban za visoki titar antiseruma specifičnog za HIV-peptid. Dodatak GM-CSF SE nosača donosi povećanje peptid-specifičnog titra u usporedbi s miševima imuniziranim samo s SE, ili s SE i IL-12. Općenito, međutim, izazivanje dobrih titara IgG2a i IgG2b antitijela nije ovisno o formulaciji peptida s MPL™ SE i GM-CSF. Zanimljivo je naglasiti da ova formulacija izaziva IgG titre koji su bili slični onima koji su izazvani imunizacijom s drugim formulaicjama kao što su CFA/IFA i peptid. Kombinacija MPL™ SE s GM-CSF i peptidom bila je jedina formulacija da bi se pokazalo induciranje i visoki titar neutralizirajućih antitijela i CTL (vidi eksperiment 8). Uključivanje IL-12 s MPL™ SE i peptidom nije izazvalo povoljan profil imunološkog odgovora. Rezultati navode na to da MPL™ SE koformuliran s citokinima GM-CSF ili IL-12 doprinosi kvalitativnoj razlici odgovora antitijela u usporedbi s imunizacijom s CFA i IFA. Ta razlika, vjeruje se, može se pripisati povećanim razinama IgG2a i IgG2b.
U drugom eksperimentu, slijedio se protokol prvog eksperimenta Balb/c-HIV peptid, s manjim izmjenama. MPL™ je također primijenjen u vodenom obliku, sa ili bez citokina.
Imunizacija Balb/c miševa s HIV peptidom T1SP10MN(A) (-Cys) bez adjuvanta nije izazvala značajne titre antitijela. Nasuprot tome, formulacija peptidnog antigena s različitim kombinacijama adjuvant/citokin rezultirala je izazivanjem visokog titra antitijela nakon dvije imunizacije.
Imunizacija s peptidom i IL-12, ili samo SE, rezultirala je titrima koji se ne mogu različiti od onih koji su izazvani bez adjuvanta (Tablica 7). Primatelji peptida koformuliranog s GM-CSF su umjereno povećali titar. Uspoređujući s primateljima cjepiva koje sadrži CFA/IFA, mikrofluidizirani MPL™ SE pokazao je sličan razvoj peptid-specifičnog titra.
Uspoređujući s primateljima CFA/IFA cjepiva, MPL™ SE izazvao je veće razine peptid-specifičnog IgG2a. Raspored imunizacije koji je primijenjen može djelovati na nađeni titar antitijela. Međutim, imunizacija miševa s MPL™ (voda) formuliranim peptidom izaziva visoke titre peptid-specifičnog antitijela. Dodatak GM-CSF ili IL-12 ovoj formulaciji rezultira povećanjem titra za više od 106. Dakle, kombinacija HIV peptida s MPL™ i citokinima IL-12 ili GM-CSF izazvala je visoki titar antitijela specifičnih za peptid.
Samo je skupina miševa imuniziranih bilo s MPL™ i IL-12, ili MPL™ SE i GM-CSF, razvila razmjerno visoke titre antitijela koji su nađeni u tekućini vaginalnog ispirka (Tablica 8).
Zaista, samo ona skupina miševa imuniziranih s MPL™ i IL-12 s peptidom dala je peptid-specifičan IgA.
Proliferacijski kapacitet stanica slezene u kulturi određen je putem ugrađivanja timidina kao odgovor na in vitro stimuliranje s peptidom. Podaci u tablici 9 navedeni su na takav način da normaliziraju proliferaciju, standardiziranjem prema maksimalnoj proliferaciji kao što je određeno kroz stimuliranje s ConA. Stanice slezene miševa imuniziranih s MPL™ SE zajedno s bilo GM-CSF ili IL-12, kao i onih miševa imuniziranih samo s GM-CSF, pokazale su niske razine peptid-povezane proliferacije. Nasuprot tome, stanice slezene miševa imuniziranih s peptidom kombinacijom s MPL™ i GM-CSF pokazale su značajnu proliferaciju.
Također je mjerena proizvodnja citokina iz stanica slezene uzgojenih in vitro. Za IL-4, samo miševi imunizirani s MPL™ SE kombinirani s GM-CSF i T1SP10MN(A) (-Cys) izlučili su dobre razine IL-4 kao odgovor na stimuliranje s peptidom (Tablica 10). Za gama-interferon, miševi imunizirani s MPL™ SE te bilo GM-CSF ili TL-12, ili vodena faza MPL™ s GM-CSF ili IL-12, dali su detektibilne razine ovog citokina u kulturi supernatanata (Tablica 11).
Prema tome, kombinacija citokina GM-CSF ili IL-12 s MPL™ ili MPL™ SE izazvala je visoke titre antitijela specifičnih za peptidni antigen. Titri su bili slični onima koji su izazvani putem imunizacije miševa peptidom i CFA/IFA. Podaci pokazuju da su ove kombinacije također izazvale najveće proliferacijske odgovore stanica slezene koje su stavljene u kulturu, te uspostavile populacije stanica slezene koje su izlučile najveće razine gama-interferona kao odgovor na stimulaciju peptida.
Rezultati ovog drugog eksperimenta navode na to da koformulacija T1SP10MN(A) (-Cys) s MPL™ i citokina GM-CSF ili IL-12 izaziva profil imunološkog odgovora koji j sličan, ako ne i bolji od onog u miševa imuniziranih s peptidom i CFA, i “booster”-injiciranih s peptidom i IFA.
Histološko evaluiranje (nije prikazano) injekcijskog mjesta dva tjedna nakon druge imunizacije pokazalo je da miševi imunizirani s mikrofluidiziranim MPL™ SE nisu razvili ili zadržali infiltriranje mononuklearnih stanica u dermis. Tkiva obojena hematoksilinom/eozinom izgledaju kao ona koja su priređena od primatelja bez adjuvanta. Nasuprot tome, Balb/c miševi imunizirani s CFA i IFA kao adjuvantima (emulzija “voda u ulju”) imali su veliku akumulaciju mononuklearnih stanica u ovom području. Primatelji MPL™ SE zajedno s GM-CSF i peptidom pokazali su uočljivo, ali marginalno povećanje mononuklearnih stanica u usporedbi s MPL™ SE primateljima bez GM-CSF. Tkiva miševa koji su imunizirani samo s GM-CSF i peptidom nisu ispitana.
Protokoli drugog eksperimenta slijeđeni su u trećem eksperimentu, sa Swiss-Webster miševima koji su korišteni umjesto Balb/c miševa. Swiss-Webster miševi su korišteni da se odredi učinak adjuvanata s HIV peptidnim antigenom pri čemu MHC-ograničeni pomoćnički T-stanični epitop nije utjecao na imunološki odgovor. Swiss-Webster miševi su soj miševa, pa citološka istraživanja nisu provedena. U ovom eksperimentu mjereni su samo recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida i recipročni titri antitijela IgG i IgA završne točke vaginalnog ispirka. Kao što se može vidjeti iz tablica 12 i 13, profil odgovora može se usporediti s onim koji se dobiva s Balb/c miševima izmjerenim u prvom i drugom eksperimentu.
U četvrtom eksperimentu, slijedili su se protokoli iz drugog eksperimenta s manjim promjenama korištenjem Balb/c miševa. Kao što je prikazano u tablici 14, formulacije adjuvanta MPL™ zajedno s bilo GM-CSF ili IL12 izazvale su uočljivo veći IgG GMT odgovor nego sam MPL™. Kao što je prikazano u tablici 15, formulacija adjuvanta MPL™ SE zajedno s GM-CSF izazvala je značajan odgovor IgG2b potklase. Formulacije adjuvanta MPL™ zajedno s bilo GM-CSF ili IL12 izazvale su značajno veći odgovor IgG2a podklase nego sam MPL™, dok su formulacije MPL™ SE zajedno s bilo GM-CSF ili IL-12 izazvale značajno veći odgovor IgG2a podklase nego sam MPL. Kao što je prikazano u tablici 16, formulacije adjuvanta MPL™ zajedno s bilo GM-CSF ili IL-12 izazvale su značajno veće titre IgG u tekućinama vaginalnih ispiraka nego sam MPL™. Najzad, kao što je prikazano na slici 4, formulacije adjuvanta MPL™ zajedno s bilo GM-CSF ili IL12, kao i formulacije MPL™ SE zajedno s bilo GM-CSF ili IL-12, iskazale su veću proliferaciju stanica slezene nego sam MPL™, odnosno sam MPL™ SE.
U petom eksperimentu, slijedili su se protokoli iz drugog eksperimenta s manjim promjenama korištenjem Balb/c miševa; IL-12 nije bio uključen u formulacijama adjuvanta. Kao što je prikazano u tablici 17, formulacije adjuvanta koje sadrže i MPL™ i GM-CSF izazvale su uočljivo veće odgovore IgG2a i IgG2b nego sam MPL™. Štoviše, formulacije adjuvanta koje sadrže i MPL™ i GM-CSF izazvale su značajno veće odgovore za sve IgG podklase nego sam MPL™.
U šestom eksperimentu, slijedili su se protokoli iz drugog eksperimenta s manjim promjenama korištenjem Balb/c miševa; IL-12 nije bio uključen u formulacijama adjuvanta. HIV peptid bio je duljine 40 aminokiselina, zbog nazočnosti cisteina u aminokiselinskom položaju 17. Kao što je prikazano u tablici 18, formulacije adjuvanta koje sadrže i MPL™ SE i GMCSF izazvale su značajno veće odgovore za sve IgG podklase nego sam MPL™, te uočljivo veće odgovore za sve podklase nego sam MPL™ SE.
U sedmom eksperimentu, slijedili su se protokoli šestog eksperimenta s manjim promjenama korištenjem Balb/c miševa; IL-12 nije bio uključen u formulacijama adjuvanata. Kao što je prikazano u tablici 19, formulacije adjuvanta koje sadrže MPL™ SE i GM-CSF izazvale su uočljivo veće odgovore za sve IgG podklase nego MPL™ SE, te formulacije adjuvanata koje sadrže i MPL™ i GM-CSF izazvale su uočljivo veće odgovore za sve IgG podklase nego sam MPL™.
U osmom eksperimentu, kao mjera funkcionalne stanično posredovane imunosti, procijenjena je sposobnost stanica slezene miševa koji su imunizirani s MPL™ SE ili MPL™ SE plus GM-CSF formuliranim zajedno s multiepitopskim peptidom T1SP10MN(A) (+Cys) da generiraju HIVMN-specifične CTL odgovore.
Kao što se vidi na slici 5, stanice slezene miševa koji su imunizirani s MPL™ SE ili MPL™ SE plus GM-CSF pokazali su slabu aktivnost prema ciljanim stanicama koje su bile bilo neobilježene ili pulsno-obilježene s IIIB CTL epitopom. Stanice slezene miševa koji su imunizirani s T1SP10MN(A) (+Cys) formuliranim s MPL™ SE i GM-CSF zajedno izazivaju dobru HIVMN-specifičnu CTL aktivnost nakon jedne imunizacije. HIVMN-specifične CTL-posredovane ciljane lizne stanice bile su značajno pojačane kada su mjerene sedam dana nakon sekundarne imunizacije (slika 5). U odvojenim eksperimentima, miševi koji su imunizirani bez adjuvanta nisu izazvali CTL odgovor. Miševi imunizirani s vodenom fazom MPL™ i peptidom proizveli su slabe (<30%) peptid-specifične CTL odgovore.
Jedna poteškoća pri procjeni potencijalne učinkovitosti imunogenih smjesa prema HIV je da primati koji nisu čovjek, koji su inficirani s HIV, ne razvijaju simptome koji odgovaraju AIDS-u. Prema tome, potencijalni model za životinje ne oponaša simptomatologiju čovjeka koju izaziva HIV. Srećom, primati koji nisu čovjek koji su zaraženi Simian-ovim virusom imunodeficijencije (SIV), koji je u srodnom odnosu s HIV, razvijaju simptome koji odgovaraju AIDS-u.
Time je omogućen pristup SIV antigenima u primatima koji nisu čovjek. SIV antigen može biti protein, polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenog proteina. Protein može biti glikoprotein kao što je gp41, gp120 ili gp160. Alternativno, protein može biti protein koji je kodiran takvim genima kao što su gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef ili env. Peptidi koji su izvedeni iz takvih proteina sadržavat će bar jednu antigensku determinantu (epitop) koja je duljine bar šest aminokiselina.
Analogno kao HIV, multiepitopski SIV peptidi koriste se za primate koji nisu čovjek. Provedeno je istraživanje mogu li različiti peptidi u kombinaciji s MPL™ SE i GM-CSF izazvati CTL odgovor. Rhesus macaques imuniziran je potkožno u tjednima 0, 4, 8 i 18 s MPL™ SE i GM-CSF zajedno s bilo kojim iz sljedeća tri skupa peptida (vidi tablicu 20):
(1) Svaki peptid koji sadrži Mamu A*01 ograničeni CTL epitop, kao što slijedi:
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:3) (gag) (38, 39)
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:4) (pol) (40)
Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:5) (env) (40)
(2) Alternativno, svaki od ova tri peptida bio je povezan s promiskuitetnim T-pomoćničkim epitopom koji ima sljedeću sekvenciju:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID No:6) (prilagođena iz 41).
Prema tome, tri peptida imala su sljedeće sekvencije:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:7)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:8)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:9).
Heparinizirana krv uzimana je svaka dva tjedna i mononuklearne stanice periferne krvi analizirane su na CTL analizom otpuštanja 51Cr, tetramernim bojenjem mononuklearnih stanica svježe periferne krvi (PBMC) i tetramernim bojenjem uzgojenih PBMC. Tetramerno bojenje svježih PBMC i citolitičko uništavanje pomoću 51Cr otpuštanja nije pokazalo bilo kakvu aktivnost. Međutim, imunizacija Rhesus macaques s Mamu A*01 ograničenim Th/CTL peptidnim koktelom formulranim s MPL™ SE i GM-CSF rezultirala je detekcijom tetramer pozitivnih CD( pozitivnih T-stanica. Rezultati su prikazani u tablicama 21-24 kao postotak pozitivnih, tetramer pozitivnih CD8+ (tablice 21-23) ili CD4+ (tablica 24) T-stanica koje su detektirane u PBMC koje su uzgajanje s odgovarajućim peptidom tijekom 11 dana.
Sumarno, sve četiri Mamu A*01 pozitivne životinje koje su imunizirane s CTL epitopima bilo s (Rh 55, Rh 142) ili bez (Rh 73, Rh 80) Th epitopa pokazale su CD8 pozitivne tetramer pozitivne stanice specifične bilo za gag, pol ili env. Kao što se očekivalo, nije bilo tetramer pozitivnih CD8 stanica koje su detektirane u Mamu A*01 negativnim životinjama (Rh 41, Rh47). SIV gag i env specifični imuni odgovori uočeni su nakon primarne imunizacije, dok su pol specifični opaženi nakon “booster” imunizacije. Budući da je konačna “booster” doza u 18 tjednu nije naknadno povisila odgovor, podaci nakon 14 tjedana nisu prikazani u tablicama 21-24.
Sumarno, imunizacija Rhesus macaques s Mamu*A01 ograničenim Th/SIV gag, pol i env CTL epitopnim peptidnim koktelima kojima su dodani adjuvanti s MPL™ SE i humanim GM-CSF izazvali su stanične odgovore koji su dokazani osjetljivom i specifičnom tetramernom analizom.
Porin B protein Neisseria gonorrhoeae, koji je također poznat kao PIB protein, također je rekombinantne ekspresije (42, što je ovdje uključeno kao referenca), te je antigenski kandidat za prevenciju ili tretiranje infekcija koje izaziva Neisseria gonorrhoeae.
Proveden je niz istraživanja da se usporedi MPL™ (sa ili bez SE) plus GM-CSF ili IL-12, sa samim MPL™ (sa ili bez SE), zajedno s modificiranom inačicom Porin B proteina Neisseria gonorrhoeae, u kojem je 16 aminokiselina na amino-kraju iz faga, iza kojega slijedi zreli oblik Porin B proteina. Sada će biti prikazani rezultati.
U prvom eksperimentu, Swiss-Webster miševi imunizirani su potkožno u trticu s rekombinantnim Porin B proteinom koji generira titar antigen-specifičnih antitijela, što pokazuje da je Porin B protein viabilni antigenski kandidat. Dodatak GM-CSF uz MPL™ i Porin H protein rezultira povišenim titrom serumskih antitijela IgG i IgG2a u usporedbi s primateljima MPL™ i Porin B proteina (vidi tablice 25 i 26).
U drugom eksperimentu, Swiss-Webster miševi imunizirani potkožno u trticu s Porin B proteinom plus IL-12 i MPL™ ili MPL™ SE izazvali su jača antigen-specifična antitijela (poglavito IgG) u odnosu na primatelje Porin B proteina plus MPL™ ili MPL™ SE. Viši titri uočeni su nakon primarne i sekundarne imunizacije. Uključivanje IL-2 u formulacije rezultiralo je približno deseterostrukim povećanjem IgG titra, mjereno u tekućini vaginalnog ispirka (vidi tablicu 27).
Pročišćeni nativnu fuzijski (F) protein humanog respiratornog sincicijskog virusa (RSV) u prirodnom dimernom obliku je kandidatski antigen za sprječavanje infekcija izazvanih pomoću RSV (43, što je ovdje uključeno kao referenca).
Proveden je niz istraživanja da se usporedi MPL™ (sa ili bez SE) plus GM-CSF ili IL-12 sa svakim od MPL™ (sa ili bez SE), aluminijevim fosfatom ili ili Stimulon™ QS-21 pojedinačno, zajedno s pročišćenim prirodnim F proteinom RSV. Sada će biti prikazan sažetak rezultata.
U prvom eksperimentu, Balb/c miševi imunizirani intramuskularno s prirodnim RSV F proteinom generirali u tittar antigen-specifičnih antitijela, što pokazuje da je F protein viabilni kandidatski antigen. Dodatak GM-CSF na MPL™ izazvao je veći titar završne točke nego sam MPL™ prema F proteinu nakon primarne i sekundarne imunizacije (vidi tablicu 28), te također izaziva pojačani stanični odgovor na in vitro stimuliranje stanica slezene nego sam MPL™ (vidi tablicu 29). Dodatak GM-CSF na MPL™ SE rezultira povišenim primarnim IgG odgovorom na F protein nego sam MPL™ SE (vidi tablicu 28).
Drugi eksperiment slijedi protokol prvog eksperimenta. Dodatak GM-CSF na MPL™ izazvao je više titre završne točke nego sam MPL™ prema F proteinu nakon primarne i sekundarne imunizacije (vidi tablicu 30). Dodatak GM-CSF na MPL™ SE također je izazvao više titre završne točke nego MPL™ SE prema F proteinu nakon primarne imunizacije (vidi tablicu 30). Dodatak GM-CSF na formulacije F proteina plus MPL™ ili MPL™ SE izazvao je većim postotkom RSV-specifine CTL aktivnosti slezene nego što je ona izazvana formulacijama u kojima nema GM-CSF, kao što je izmjereno sa stanicama slezene imuniziranih miševa (vidi tablicu 31).
Treći eksperiment zamijenio je IL-2 za GM-CSF. Koformulacija IL-12 s MPL™ izazvala je povišene titre IgG nakon prve imunizacije, u usporedbi s uvođenjem F proteina samo s MPL™ (vidi tablicu 32). Međutim, dodatak IL-12 na MPL™ ili MPL™ SE nije imao učinka na RSV-specifičnu CTL aktivnost koja je izmjerena nakon in vitro stimuliranja efektorskih stanica (vidi tablicu 33).
Jedno istraživanje je provedeno da se usporedi MPL™ (sa ili bez SE) plus GM-CSF to MPL™ (sa ili bez SE) pojedinačno, zajedno s NP (nukleokapsid) proteinom virusa influence. Nije bilo dovoljno NP da bi se proveli eksperimenti i izmjerio titar antitijela. Miševi imunizirani s NP peptidom sa ili bez adjuvanata su analizirani na odgovor stanica slezene na antigensko stimuliranje 14 dana nakon konačne imunizacije. Uključivanje GM-CSF u formulacije koje sadrže MPL™ ili MPL™ SE rezultiralo je značajnim smanjenjem CTL aktivnosti (podaci nisu prikazani).
Nije jasno zašto je dobiven ovakav anomalni rezultat. Možda je bilo tehničkih poteškoća pri provedbi eksperimenta.
Antigenske smjese ovog izuma ublažavaju imunološki odgovor poboljšavanjem odgovora antitijela domaćina kralježnjaka i stanične imunosti nakon primjene antigenske smjese koja sadrži odabran antigen između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita, te učinkovitu količinu adjuvanta MPL™ (kao vodena faza ili stabilna emulzija) kombinirani s citokinom ili limfokinom, konkretno s GM-CSF ili IL-12. Otsali citokini i limfokini za koje se pokazalo da imaju aktivnost imunološkog ublažavanja uključuju, ali nisu ograničeni na interleukine 1-alfa, 1-beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 i 18, interferone alfa, beta i gama, stimulirajući čimbenik granulocitne kolonije te čimbenike tumorske nekroze alfa i beta.
Agonisti ili antagonisti prema navedenim citokinima ili limfokinima također su unutar dosega ovog izuma. Kako se ovdje rabi, pojam “agonist” označava molekulu koja pojačava aktivnost ili funkciju navedneih citokina ili limfokina. Primjer takvog agonista je imitacija navedenih citokina ili limfokina. Kako s eovdje rabi, pojam “antagonist” označava molekulu koja inhibira ili spriječava aktivnost navedenih citokina ili limfokina. Primjeri takvih antagonista su topljivi IL-4 receptori i topljivi TNF receptor.
Kako se ovdje rabi, pojam “učinkovita količina adjuvanta” označuje dozu kombinacije adjuvanata koja je ovdje opisana, koja je pogodna za izazivanje povećani imuni odgovor u domaćina kralježnjaka. Konkretna doza ovisi djelomično o starosti, težini i zdravstvenom stanju domaćina, kao i o metodi primjene te antigenu. U poželjnoj realizaciji, kombinacija adjuvanata će koristiti MPL™ u rasponu 1-100 µg/doza. Odgovarajuće doze može lako odrediti osoba koja poznaje ovo područje. Antigenske smjese ovog izuma mogu se također miješati s imunološki prihvatljivim razrjeđivačima ili nosačima na standardni način da se prirede otopine ili suspenzije koje su namijenjene injiciranju.
Antigenske smjese ovog izuma primjenjuju se ljudima ili kralježnjacima koji nisu čovjek različitim putovima uključujući (bez ograničenja) intranazalni, oralni, vaginalni, rektalni, parenteralni, intradermalni, transdermalni (vidi npr. međunarodnu prijavu WO 98/20734 (44), koja je ovdje uključena kao referenca), intramuskularni, intraperitonealni, subkutani, intravenski i intraarterijski. Količina antigenske komponente ili komponenata antigenske smjese će varirati, ovisno djelomično o vrsti antigena, kao i o starosti, težini i zdravstvenom stanju domaćina, kao i o metodi primjene. Ponovimo, odgovarajuće doze može lako odrediti osoba koja poznaje ovo područje. Poželjno je, premda to nije uvjet, da se antigen i kombinacija adjuvanata primijene istovremeno. Broj doza i režim davanja doza za antigensku smjesu također može lako odrediti osoba koja poznaje ovo područje. U nekim slučajevima, adjuvantna svojstva kombinacije adjuvanata moguće smanjiti broj potrebnih doza ili vrijeme tijekom kojega se primjenjuje režim doza.
Kombinacije adjuvanata ovog izuma pogodne su za uporabu u antigenskim smjesama koje sadrže cijeli niz patogenih mikooorganizama, uključujući (bez ograničenja) viruse, bakterije, gljivice ili parazitne mikroorganizme kojima se mogu zaraziti ljudi i kralježnjaci koji nisu čovjek, te stanice karcinoma i tumorske stanice. Antigen može sadržavati peptide ili polipeptide koji su izvedeni iz proteina, kao i fragmenti bilo kojeg od sljedećih saharida, proteina, poli- i oligonukleotida, te stanice karcinoma ili tumorske stanice, alergeni, amiloidni peptidni proteini ili druge makromolekularne komponente. U nekim slučajevima, u antigenskoj smjesi nalazi se više od jednog antigena.
Poželjna virusna cjepiva koja sadrže kombinaciju adjuvanata ovog izuma obuhvaćaju ona koja su namijenjena za prevenciju i/ili tretman bolesti koji su izazvani, bez ograničenja, humanim virusom imunološke deficijencije, simian vorusom imunološke deficijencije, respiratornim sincicijskim virusom, parainfluenca virusom tipova 1-3, virusom influence, herpes simpex virusom, humanim citomegalovirusom, hepatitis A virusom, hepatitis B virusom, humanim papillomavirusom, poliovirusom, rotavirusom, calicivirusom, virusom ospica, virusom mumsa, virusom rubeole, adenovirusom, rabies virusom, pasjim distempter virusom, rinderpest virusom, koronavirusom, parvovirusom, infektivnim rhinotracheitis virusima, virusom leukemije, infektivnim peritonitis virusom, avian infektivnim burzalnim virusom, virusom Newcastle bolesti, virusom Marekove bolesti, virusom respiratornog i reproduktivnog sindroma, arteitis virusom i različitim encefalitis virusima.
Poželjna bakterijska cjepiva sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma, uključujući ona koja se odnose na prevenciju i/ili tretiranje bolesti koje su izazvane (bez ograničenja) od Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catnrrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typlhi, Salmonella typhimurjum, Salmonella choleraesuis, Escherichia col3, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex, Proteus mirabiljs, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobaci11us pleuropneumoniae i Mycoplasma gallisepticum.
Poželjna cjepiva protiv gljivičnih patogena sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma, uključujući ona koja se odnose na prevenciju i/ili tretiranje bolesti koje su izazvane (bez ograničenja) od Aspergillis, Blestomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus i Histoplasma.
Poželjna cjepiva protiv parazita sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma, uključujući ona koja se odnose na prevenciju i/ili tretiranje bolesti koje su izazvane (bez ograničenja) od Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii i Pneumocystis carinii.
Poželjna cjepiva za izazivanje terapeutskog ili profilaktičkog protivtumorskog učinka u domaćina kralježnjaka, koja sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma, uključuju ona koja koriste antigen karcinoma ili tumorski antigen uključujući, bez ograničenja, specifični antigen prostate, karcino-embrionski antigen, MUC-1, Her2, CA-125 i MAGE-3.
Poželjna cjepiva za ublažavanje odgovora na alergene u domaćina kralježnjaka, koja sadrže kombinacije adjuvanata ovog izuma, uključuju ona koja sadrže alergen ili njegov fragment. Primjeri takvih alergena opisani su u američkom patentnu br. 5,830,877 (45) i objavljenoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 99/51259 (46), što je ovdje uključeno kao referenca, te uključuju pelud, zmijske otrove, životinjsku dlaku, gljivične spore i lijekove (kao što je penicilin). Cjepiva interferiraju s proizvodnjom IgE antitijela, što je poznati uzrok alergijskih reakcija.
Poželjna cjepiva za prevenciju ili tretiranje bolesti karakterizirana su amiloidnim nakupljanjem u domaćina kralježnjaka, a sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma, uključujući one koji sadrže dijelove amiloidnog peptidnog proteina (APP). Ova bolest se navodi različito kao Alzheimerova bolest, amiloidoza ili amiloidogenska bolest. β-amiloidni peptid (koji se također označava kao Aβ peptid) je 42 aminokiselinski fragment APP, koji je generiran obradom APP pomoću β i γ secretaza enzima, te ima sljedeću sekvenciju:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala ( SEQ ID No:10).
U nekih bolesnika, amiloidna nakupina ima oblik agregiranih Aβ peptida. Iznenađujuće, nađeno je da primjena izoliranih Aβ peptida izaziva imuni odgovor prema Aβ peptidnoj komponenti amiloidnog nakupljanja u domaćina kralježnjaka (47). Prema tome, cjepiva ovog izuma sadrže adjuvantne kombinacije ovog izuma plus Aβ peptid, kao i fragmente Aβ peptida i antitijela na Aβ peptid ili njegove fragmente. Jedan takav fragment Aβ peptida je 28 aminokiselinski peptid koja ima sljedeću sekvenciju
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID No:11).
U slučaju HIV i SIV, antigenske smjese sadrže bar jedan protein, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenog proteina. U nekim slučajevima, višestruki HIV ili SIV proteini, polipeptidi, peptidi i/ili fragmenti uključeni su u antigensku smjesu.
Formulacije kombinacije adjuvanata ovog izuma također su pogodne da se uključe u polinukleotidna cjepiva kao adjuvanti (poznato kao DNA cjepiva). Takva cjepiva mogu nadalje sadržavati sredstva za pospješenje kao što je bupivikain (vidi američki patent br. 5.593,972 (49), koji je ovdje uključen kao referenca).
Da bi se bolje razumio ovaj izum, navedeni su sljedeći primjeri. Primjeri su samo kao ilustracija, te ih ne treba smatrati ograničenjem ovog izuma.
Primjeri
Experiment 1
Imunizacija Balb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Primjer 1
Materijali i metode
Životinje
Ženke Balb/c miševa, starosti 7-9 tjedana, nabavljene su od Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY). Sve životinje su držane u nastambama koje je odobrilo American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Miševi su aklimatizirani na nastambe jedan tjedan prije početka istraživanja.
Peptidi
Sekvencija multiepitopskog HIV-1-MN peptida T1SP10MN(A) (-Cys) je sljedeća:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:2). Ovaj peptid je prethodno opisan (28, 29), te sadrži sekvencije iz HIV-1 gp120MN koje izazivaju CD4' Th stanični odgovor u miševa i ljudi, glavnu staničnu determinantu, te mjesto koje prepoznaje CD8` CTL u Balb/c miševa. Peptid je osiguran od Dr. R. Scearce (Duke University, Durham, NC). Za CTL analizu, peptidi koji odgovaraju CTL epitopu unutar V3 petlje HIV-1-IIIB (Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile (SEQ ID N0:12), H-2Dd ograničeni) ili HIV-1-MN (Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr (SEQ ID No:13), Fi-2Dd ograničeni), nabavljen je od Genosys Biotechnologies Inc. (The Woodlands, TX). Peptidi su otopljeni u sterilnoj vodi, te prije uporabe razrijeđeni u odgovarajućim puferima ili staničnom mediju kulture.
Adjuvanti
Svi pripravci adjuvanata koji sadrže MPL™ dobiveni su od Ribi ImmunoCherm Research, Inc. (Hamilton, MT). MPL™ je priređen kao vodena formulacija korištenjem trietanolamina (Sigma, St. Louis, MO). Nakon otapanja, MPL™ je sonificiran sukladno uputama proizvođača da se dobije opalescentna/bistra otopina koja je sterilno filtrirana. MPL™ SE dobiven je kao preformulirana emulzija “ulje u vodi” (1-2% ulja) na osnovi skvalena, za koju su koncentracije MPL™ u rasponu 0-2500 µg/ml. Aluminijev fosfat je kućno priređen. Freundov potpuni adjuvant (CFA) i nepotpuni adjuvant (IFA) nabavljeni su od Difco Laboratories, Detroit, MI. T1SP10MN(A) peptidi i Freundovi adjuvanti su emulgirani u odnosu 1:1 pomoću dvije spojene štrcaljke. Mišji rekombinantno izražen IL-12 nabavljen je iz Genetics Institute (Cambridge, MA). Rekombinantni mišji GM-CSF dobiven je od Immunex (Seattle, WA), od R&D Systems (Minneapolis, MN) ili kupljen od Hiosource International (Camarillo, CA) kao liofilizirani prah bez nosača.
Imunizacije
Miševi su imunizirani potkožno u trticu, s ukupnim volumenom od 0,2 ml koji je jednako podijeljen sa svake strane repa. Imunizacije su primijenjene u različitim intervalima, kao što je niže naznačeno. Antigen i citokini su razrijeđeni u fosfatno puferiranoj slanoj otopini do odgovarajućih koncentracija te formulirane s adjuvantima manje od 16 sati prije imunizacije, u sterilnim uvjetima. Cjepiva su miješana laganim potresivanjem, te pohranjena na 4°C. Formulacije su pomiješane vortex mješalicama neposredno prije imunizacije.
Sakupljanje uzoraka
Životinjama je uzeta krv prije početne imunizacije, te u naznačenim vremenima. Serum je analiziran iz pojedinačnih miševa, te iz sjedinjenih seruma unutar skupina. Vaginalno ispiranje je izvršeno na eutanaziranim miševima da se proicijeni razina antitijela. To je izvršeno instaliranjem 75:1 RPMI-10 u vaginalni kanal ženke miševa pomoću 200:1 pipete. Kanal je ispran ubacivanjem i izbacivanjem tekućine, kojoj je zatim dodan 10:1 FBS. Vaginalni ispirak je analiziran kao sjedinjeni uzorak.
Priređivanje stanica
Za analizu proliferacije i in vitro analizu citokina, stanice slezene su dobivene od miševa u naznačenim vremenskim točkama. Jednostanične suspenzije su priređene iz sjedinjenih uzoraka 3-5 miševa kao što je navedeno u rezultatima. Za analizu proliferacije i analizu citokina, stanice su suspendirane u pločama s 96 jažica okruglog dna koje su prethodno prevučene preko noći s HIV peptidnim antigenima, kontrolnim proteinima ili samo s RPMI-10. Stanice slezene su dodane s 5×105 stanica/jažica korištenjem medija kulture koji ima 2× dodataka. Supernatanti stanične kulture sakupljeni su iz triplikatnih jažica za analizu citokina tri ili šest dana nakon početka uzgajanja.
Neposredno nakon sakupljanja supernatanta, kulture su pulsirane s 3H-timidinom tijekom 18-24 h, te su sakupljene da se kvantificira proliferacija stanica.
Enzim-vezane imunosorpcijske analize
Za analizu HIV peptid-specifičnog antitijela i raspodjelu podklasa, peptid je suspendiran ili u karbonatnom puferu (15 mM Na2CO3, 35 mM Na2CO3, pH 9,6) ili PBS, pri koncentraciji od l µg/ml te nanesen na mikrotitarske ploče s 96 jažica (Nunc) u volumenu 100:1. Nakon inkubiranja preko noći na 37°C, ploče su isprane i blokirane (0,1% želatina/PBS) na sobnoj temperaturi tijekom 2-4 h. ELISA ploče isprane su puferom za ispiranje (PBS, 0,1% Tween™20) prije dodavanja serijski razrijeđenog seruma (PHS, 0,1% želatina, 0,05% Tween™20, 0,02% natrijev azid) . Nakon inkubiranja četiri sata, jažice su isprane i dodana su odgovarajuća razrjeđenja biotiniranih anti-izotip/podklasa antitijela za inkubiranje na 4°C preko noći. Jažice su isprane i inkubirane sa streptavidin-konjugiranom peroksidazom hrena. Jažice su očitane na 405 nm. Titri su standardizirani korištenjem kontrolnih seruma.
Za analizu citokina, stanična kultura supernatanata dodana je jažicama koje su prevučene s BVD6-11B11 (za anti-IL4), ili R4-6A2 (za gama-interferon). Nakon inkubiranja i ispiranja, jažice su razvijene korištenjem biotin-obilježenog BVD6-24G2 (za IL4) ili XMG 1.2 (za gama-interferon). Koncentracija citokina je određena korištenjem standardne krivulje koja je priređena iz rekombinantnog mišjeg gama-interferona ili interleukina-4. Svi citokinski reagensi nabavljeni su od Pharmingen (San Diego, CA).
HIV-1MN neutralizacijske analize
Neutralizacijske analize izvršene su u laboratoriju Dr. Thomas Matthews na Duke University. Ukratko, načinjen je kodiran serum za neutraliziranje laboratorijskog virusnog izolata HIV-1MN (NIH). Analiza je načinjena suštinski kao što je prije opisano (25). Ukratko, razrjeđenja ispitivanog seruma su podijeljena u jažice mikrotitarske ploče s 96 jažica (25:1/jažica). Jednaki volumen serijski razrijeđenog virusnog “stock”-a je dodano u svaku jažicu. Nakon inkubiranja, smjesa virus/antitijelo dodana je u AA5 ciljne stanice. Stanice su uzgojene u mikrotitarskim pločama s 96 jažica dodatkom svježeg medija svakog drugog dana. Sedam dana nakon infekcije, supernatanti su ispitani na prisutnost virusne reverzne transkriptaze kao mjere virusne replikacije, te njegove uspješne infekcije ili inhibiranja.
Primjer 2
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A)
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida mjereni su iz sjedinjenog seruma (n=5 Balb/c) u naznačenim vremenskim točkama nakon početne imunizacije. Miševi su imunizirani potkožno u trticu s s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys), ako nije drukčije navedeno, na dan 0 te na dan 27. Za primatelje Freundova adjuvanta, miševi su primarno imunizirani s peptidom koji je emulgiran u CPA, te su “booster” imunizirani s IFA. MPL™ SE načinjen je u obliku emulzije koja sadrži 2% skvalen ulje i 50 µg MPL™ po dozi. SE je pokretačka emulzija “ulje u vodi” koja sadrži skvalen, glicerol i sredstvo za emulgiranje. Rekombinantni mišji IL-12 unesen je s 50 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF je unesen sa 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 1.
Tablica 1
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1AP10MN(A) (-Cys)
[image]
Primjer 3
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1AP10MN(A) (-Cys) podklase
Recipročni titri IgG potklase mjereni su u združenom serumu (“pool”) (n=5 Balb/c) šest tjedana nakon početne imunizacije, dva tjedna nakon sekundarne imunizacije. Miševi su imunizirani potkožno u trticu s 25 µg peptida, ako nije drugačije naznačeno. Za primatelje Freundova adjuvanta, miševi su primarno imunizirani s peptidom koji je emulgiran u cjelovitom Freundovom adjuvantu, te “booster” imunizirani s nepotpunim Freundovim adjuvantom u tjednima četiri i šest. MPL™ SE je načinjen kao emulzija koja sadrži 2% skvalen ulja i 50 µg MPL™ po dozi. SE je emulzija “ulje u vodi” nosač koji sadrži skvalen, glicerol i sredstvo za emugiranje. Rekombinannti mišji Il-2 korišten je s 50 ng/miš. Rekombinannti mišji GM-CSF korišten je s 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 2.
Tablica 2
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys) podklase
[image]
Primjer 4
Titri antitijela IgG i IgA anti-T1SP10MN(A) (-Cys) vaginalnog ispirka
Titri IgG i IgA antipeptidnih antitijela vaginalnog ispirka mjereni su nakon 2 tjedna nakon završne imunizacije. Skupine od 5 ženki Balb/c miševa imunizirane su s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys) i navedene formulacije adjuvanata na dane 0, 28 i 42. Titri vaginalnih antitijela određeni su iz združene tekućine vaginalnih ispiraka. Rezultati su prikazani u tablici 3.
Tablica 3
Titri antitijela IgG i IgA anti-T1SP10MN(A) (-Cys) vaginalnog ispirka
[image]
Primjer 5
Proliferacija stanica slezene
Mjerena je proliferacija stanica slezene miševa koji su imunizirani s T1SP10MN(A) (-Cys) i različitim formulacijama adjuvanata. Skupine od pet ženskih Balb/c miševa imunizirana je s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys) i naznačenima adjuvantima u dane 0 i 28. Stanice slezene su položene na kulturu na dan 56, te su sakupljene za mjerenje ugradnje 3H-timidina nakon 96 h. Miševi su imunizirani s 50 ng IL-12, 10 µg GM-CSF, 50 µg MPL™ u vodenoj formulaciji ili kao stabilna emulzija s 2% SE. Podaci su prikazani kao delta cpm vrijednosti u odnosu na proliferacijske vrijednosti koje su izmjerene za stanice uzgojene u kulturi bez stimulacije. Osnovna razina stimulacije bila je <800 cpm. Rezultati su prikazani u tablici 4.
Tablica 4
Proliferacija stanica slezene
[image]
Primjer 6
Izlučivanje IL-4 iz stanica slezene
Mjeren je interleukin-4 kojega u kulturu izlučuju stanice slezene koje su stimulirane s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys). Stanice slezene sakupljene su iz skupa od pet Balb/c ženki miševa i uzgajane su naznačenim antigenskim stimulansima (50 ng IL-12, 10 µg GM-CSF, 50 µg MPL™ kao što je naznačeno) bilo tri ili šest dana.
Razina interleukina-4 određena je pomoću ELISA analize, te uspoređena sa standardom koji je poznate koncentracije. Prazne jažice ukazuju na to da analiza nije mogla detektirati interleukin-4 u tim uvjetima uzgajanja. Donja granica osjetljivosti detekcije bila je 22 U/ml. Rezultati su prikazani u tablici 5.
Tablica 5
Izlučivanje IL-4 stanica slezene
[image]
Tablica 5 (nastavak)
Izlučivanje IL-4 stanica slezene
[image]
Primjer 7
Izlučivanje gama-interferona iz stanica slezene
Mjeren je interleukin-4 kojega u kulturu izlučuju stanice slezene koje su stimulirane s 25 µg T1SP10MN(A) (-Cys). Stanice slezene sakupljene su iz skupa od pet Balb/c ženki miševa i uzgajane su naznačenim antigenskim stimulansima (isto kao u primjeru 6) bilo tri ili šest dana.
Razina Interleukina-4 određena je pomoću ELISA analize, te uspoređena sa standardom koji je poznate koncentracije. Prazne jažice ukazuju na to da analiza nije mogla detektirati interleukin-4 u tim uvjetima uzgajanja. Donja granica osjetljivosti detekcije bila je 4 pg/ml. Rezultati su prikazani u tablici 6.
Tablica 6
Izlučivanje gama-interferona iz stanica slezene
[image]
Tablica 6 (nastavak)
Izlučivanje gama-interferona iz stanica slezene
[image]
Eksperiment 2
Imunizacija Balb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Primjer 8
Materijali i metode
Životinje
Korištene su ženke Balb/c miševa, starosti 7-9 tjedana, sukladno gore navedenom primjeru 1.
Peptidi
Korišten je HIV-1-MN peptid T1SP10MN(A) koji je opisan u primjeru 1. Peptid je rehidriran u slanoj otopini koncentracije 1 mg/ml.
Adjuvanti
Korišteni su adjuvanti koji su opisani u primjeru 1, osim što je u nekim slučajevima zadržana vodena formulacija MPL™ umjesto korištenja stabilnog oblika emulzije.
Imunizacije
Miševi su imunizirani potkožno u trticu, s ukupnim volumenom od 0,2 ml koji je podijeljen jednako na svaku stranu repa. Imunizacije su primijenjene u dane 0 i 21 s 25µg HIV peptida, zajedno s naznačenom količinom adjuvan(a)ta. Miševi koji su primili CFA/IFA primili su CFA na dan 0 i IFA na dan 21. Razrjeđenja i miješanje su načinjeni kao što je opisano u primjeru 1.
Sakupljanje uzoraka
Sakupljanje uzoraka s životinjama provedeno je sukladno protokolu primjera 1, jedan dan prije svake imunizacije i 14 dana nakon druge imunizacije.
Priređivanje stanica
Rukovanje stanicama i pripravci načinjeni su sukladno protokolu primjera 1.
Enzim-vezana imunosorbentna analiza (ELISA)
ELISA analize provedene su na način sukladno protokolu primjera 1.
Analiza HIV-1MN neutraliziranja
Analiza neutraliziranja izvršena je na Duke University sukladno protokolu primjera 1.
Primjer 9
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys)
Recipročni titri IgG završne točke anti-peptida izmjereni su kao geometrijska sredina iz pojedinačnih vrijednosti (GMT) ili iz združenog seruma (n=5 Balb/c), 14 dana nakon druge imunizacije. Završne točke IgG1 i IgG2a podklase izmjerene su iz združenog seruma (“pool”). Za primatelje Freundova adjuvanta, miševi su primarno imunizirani peptidom koji je emulgiran u CFA, te “booster” imunizirani s IFA. MPL™ SE je korišten kao emulzija koja sadrži 1% skvalen ulje i 50 µg MPL™ po dozi. Vodena faza MPL™ primijenjena je kao 50 µg po dozi. Rekombinantni mišji IL-12 primijenjen je kao 40 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF primijenjen je kao 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 12.
SE je korišten kao emulzija koja sadrži 1% skvalen ulje i 50 µg MPL™ po dozi. Vodena faza MPL™ primijenjena je kao 50 µg po dozi. Rekombinantni mišji IL-12 primijenjen je kao 40 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF primijenjen je kao 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 7.
Tablica 7
Recipročni titri IgG završne točke anti- T1SP10MN(A) (-Cys)
[image]
Primjer 10
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys)
Recipročni titri specifičnih antitijela IgG i IgA završne točke HIV peptida vaginalnog ispirka mjereni su u združenom serumu (n=5 Balb/c) 15 dana nakon sekundarne imunizacije. Miševi su imunizirani kao u primjeru 9. MPL™ korišten je kao emulzija koja sadrži 1% skvalen ulje i 50 μg MPL™ po dozi. Vodena faza MPL™ primijenjena je kao 50 µg po dozi. Rekombinantni mišji IL-12 primijenjen je kao 40 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF primijenjen je kao 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 8.
Tablica 8
Recipročni titri IgG i IgA završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys)
[image]
Primjer 11
Proliferacija stanica slezene
Mjerena je proliferacija stanica slezene kao odgovor na in vitro stimuliranje s T1SP10MN(A) (-Cys) i različitim formulacijama adjuvanata (isto kao u primjeru 10). Stanice su uzgajane ukupno 96 h. 3H-timidin je dodan kulturi tijekom posljednjih 18 sati. Podaci su prikazani kao proliferacijski indeks koji je normaliziran prema stanicama koje su stimulirane u kulturi s ConA ([prosječni cpm medija/prosječni cpm ConA] - [prosječni cpm medija/prosječni cpm ConA]) × 100. Kao rezultat, stanice koje su uzgojene u mediju imale su osnovnu proliferaciju 0. Rezultati su prikazani u tablici 9. Vrijednosti proliferacije koje su manje od onih za stanice koje su uzgojene nestimulirane u kulturi su u zagradama.
Tablica 9
Proliferacija stanica slezene
[image]
Primjer 12
Izlučivanje IL-4 iz stanica slezene
Mjeren je interleukin-4 koji je izlučen u kulturu iz stanica slezene koje su stimulirane s T1SP10MN(A) (-Cys). Stanice su uzgajane ukupno 96 sati. Supernatanti stanične kulture su analizirani na IL-4 pomoću ELISA analize. Sve vrijednosti su dobivene oduzimanjem onih koje su određene iz supernatanta stanica koje su stimulirane s 10 µg nebitnog proteina (lisozim). Rezultati su prikazani u tablici 10 u pg/ml. Rezultati koji su bili ispod granice detekcije, nakon oduzimanja za stimuliranje koje je izvršeno lisozimom, označene su kao “bd”. Adjuvanti su bili ng IL-12, 10 µg GM-CSF i 50 µg MPL™.
Tablica 10
Izlučivanje IL-4 iz stanica slezene
[image]
Primjer 13
Izlučivanje gama-interferona iz stanica slezene
Mjeren je gama-interferon koji je izlučen u kulturu iz stanica slezene koje su stimulirane s T1SP10MN(A) (-Cys). Stanice su uzgajane ukupno 96 sati. Stanična kultura supernatanata analizirana je na gama-interferon pomoću ELISA analize. Sve dane vrijednosti su nakon oduzimanja onih koje su dobivene iz supernatanata stanica koje su stimulirane s 10 µg lisozima. Rezultati su prikazani u tablici 11 u U/ml. Rezultati koji su bili ispod granice detekcije, nakon oduzimanja za stimuliranje koje je izvršeno lisozimom, označene su kao “bd”. Adjuvanti su bili isti kao u primjeru 12.
Tablica 11
Izlučivanje gama-interferona iz stanica slezene
[image]
Eksperiment 3
Imunizacija Swiss-Webster miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Slijedio se protokol eksperimenta 2, pri čemu su korišteni Swiss-Webster miševi umjesto Balb/c miševa. U ovom eksperimentu mjereni su samo recipročni titri IgG završne točke anti-peptida i recipročni titar antitijela IgG i IgA završne točke vaginalnog ispirka.
Primjer 14
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys) izmjereni su kao geometrijska sredina iz pojedinačnih vrijednosti Swiss-Webster miševa (GMT), 14 dana nakon sekundarne imunizacije. Završne točke IgG1 i IgG2a podklase izmjerene su iz združenog seruma (“pool”). Za primatelje Freundova adjuvanta, miševi su primarno imunizirani peptidom koji je emulgiran u CFA, te “booster” imunizirani s IFA. MPL™ SE je korišten kao emulzija koja sadrži 1% skvalen ulje i 50 µg MPL™ po dozi. Vodena faza MPL™ primijenjena je kao 50 µg po dozi. Rekombinantni mišji IL-12 primijenjen je kao 40 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF primijenjen je kao 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 12.
Tablica 12
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida
[image]
Primjer 15
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida podklase
Recipročni titri specifičnih antitijela IgG i IgA zavšne točke HIV-peptida vaginalnog ispirka mjereni su u združenom serumu (n=5 Swiss-Webster) 15 dana nakon sekundarne imunizacije. Miševi su imunizirani kao u primjeru 14. MPL™ SE je korišten kao emulzija koja sadrži 1% skvalen ulje i 50 µg MPL™ po dozi. Vodena faza MPL™ primijenjena je kao 50 µg po dozi. Rekombinantni mišji IL-12 primijenjen je kao 40 ng/miš. Rekombinantni mišji GM-CSF primijenjen je kao 10 µg/miš. Rezultati su prikazani u tablici 13.
Tablica 13
Recipročni titri IgG i IgA završne točke anti-HIV peptida
[image]
Eksperiment 4
Imunizacija Balb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Slijedio se protokol eksperimenta 2, osim što su miševi imunizirani na dane 0 i 28, te im je uzeta krv za serološku analizu na dane 0, 27 i 41. CFA/IFA je formuliran s CFA na dan 0, IFA na dan 28. MPL™ SE je formuliran s 50 µg MPL™ i 2% SE, pri čemu je korišteno 50 ng IL-12 i 10 µg GM-CSF.
Primjer 16
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (-Cys) mjereni su iz pojedinačnih vrijednosti i kao geometrijaske sredine (n=5 Balb/c) 41 dan nakon početne imunizacije, 13 dana nakon sekundarne imunizacije. Rezultati su prikazani u tablici 14. Pojedinačni titri nultog dana bili su manji od 50. Oznaka “[no data]” znači da je životinja preminula prije završetka cijelog protokola. “SD” označava standardno odstupanje.
Tablica 14
Pojedinačne vrijednosti i geometrijska sredina titra IgG seruma specifičnih za T1SP10MN(A) (-Cys)
[image]
Primjer 17
Recipročni titri igg završne točke anti-hiv peptida podklase
Recipročni titri završne točke anti-peptid IgG podklase mjereni su iz združenog seruma (“pool”) (n=5 Balb/c) 41 dan nakon početne imunizacije, 13 dana nakon sekundarne imunizacije. Rezultati su prikazani u tablici 15.
Tablica 15
Recipročni titri igg završne točke anti-t1sp10mn(a) (-cys) podklase
[image]
Primjer 18
Titri anttijela IgG i IgA anti-HIV peptida u vaginalnom ispirku
Titri anti-pupetidnih antitijela IgG i IgA mjereni su u vaginalnom ispirku 41 dan nakon početne imunizacije, 13 dana nakon sekundarne imunizacije. Rezultati su prikazani u tablici 16.
Tablica 16
Titar antitijela IgG i IgA anti-T1SP10MN(A) (-Cys) u vaginalnom ispirku
[image]
Primjer 19
Proliferacija stanica slezene
Mjerena je proliferacija stanica slezene miševa koji su imunizirani s T1SP10MN(A) (-Cys) i različitim formulacijama adjuvanata. Stanice slezene su stimulirane in vitro tijekom četiri dana s 3,3 µg/ml T1SP10MN(A) (-Cys). Rezultati su prikazani na slici 4 kao promjena ugradnje obilježenog timidina kao rezultat in vitro stimuliranja s 3,3 µg/ml T1SP10MN(A) (-Cys) u odnosu na ugradnju uz odsutnost stimuliranja (delta cpm).
Eksperiment 5
Imunizacija Halb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Slijedio se protokol eksperimenta 2, osim što su miševi imunizirani potkožno na dan 0 i 22, te im je uzeta krv za serološku analizu na dan 42. MPL™ SE je formuliran s 50 µg MPL™ i 1% SE, pri čemu je korišteno 10 µg GM-CSF.
Primjer 20
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV peptida
Recipročni titri IgG završne točke anti-peptida mjereni su iz združenog seruma (“pool”) (n=5 Balb/c) 42 dana nakon početne imunizacije, 13 dana nakon sekundarne imunizacije. Također su izmjerene geometrijske sredine i standardno odstupanje za IgG. Rezultati su prikazani u tablici 17.
Tablica 17
Recipročni titri igg završne točke anti-t1sp10mn(a)
[image]
Eksperiment 6
Imunizacija Balb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Slijedio se protokol eksperimenta 2, osim što je HIV peptid sadržavao cistein u aminokiselinskom položaju 17, te su miševi (n=3 Balb/c) imunizirani potkožno na dane 0 i 21, pa im je uzeta krv za serološku analizu na dan –1 (dan prije prve imunizacije), te na dane 13, 20 i 28. MPL™ SE je formuliran s 50 µg MPL™ i 1% SE, pri čemu je korišteno 10 µg GM-CSF. HIV peptid T1SP10MN(A) (+Cys) (26) sadrži cistein u aminokiselinskom položaju 17 te je dugačak 40 rezidua. T1SP10MN(A) (+Cys) nabavljen je od Genosys Biotechnologies (The Woodlands, TX).
Primjer 21
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A)
28 dana nakon početne imunizacije mjereni su pojedinačni recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) miševa i njhihova geometrijska sredina (n=3 Balb/c). Rezultati su prikazani u tablici 18.
Tablica 18
Učinak MPL™ SE + GM-CSF na IgG odgovor prema HIV peptidu (+Cys)
[image]
Eksperiment 7
Imunizacija Halb/c miševa s HIV peptidom i različitim adjuvantima
Slijedio se protokol eksperimenta 2, osim što su miševi (n=3 Balb/c) imunizirani potkožno na dane 0 i 32, te im je uzeta krv za serološku analizu na dan 38. MPL™ SE je formuliran s 50 µg MPL™ i 1% SE, pri čemu je korišteno 10 µg GM-CSF.
Primjer 22
Recipročni titri IgG završne točke anti-HIV pepetida
Recipročni titri IgG završne točke anti-T1SP10MN(A) (+Cys) mjereni su s pojedinačnim miševima i nađena je njihova geometrijska sredina (n=3 Balb/c) 38 dana nakon početne imunizacije. Rezultati su prikazani u tablici 19.
Tablica 19
Učinak MPL™ SE + GM-CSF na IgG odgovor prema HIV peptidu (+Cys)
[image]
Eksperiment 8
CTL analiza u Balb/c miševa
Slijedio se protokol eksperimenta 6 u svezi s imuniziranjem miševa. Procijenjena je CTL aktivnost stanica slezene koje su izolirane iz miševa sedam dana nakon sekundarne imunizacije. MPL™ SE je formuliran s 50 µg MPL™ u 1% SE, sa ili bez 10 µg GM-CSF, plus 50 µg T1SP10MN(A) (+Cys).
Primjer 23
CTL analiza u Balb/c miševa
Za CTL analizu, stanice slezene izvađene su iz imuniziranih miševa 14 dana nakon primarne, te sedam dana nakon sekundarne imunizacije. Slijedio se protokol koji je prethodno opisan (34). Ukratko, sakupljene su eritrocit-xx stanice slezene iz tri miša skupine. Stanice efektora slezene (4×106/ml) ponovo su stimulirane na pločama za uzgajanje s 24 jažice u volumenu 1,5-2 ml tijekom sedam dana s 1 µg/ml bilo “MN” ili “IIIB” 10-mernim peptidima CTL epitopa. Oba CTL epitopa ograničeni su na H-2Dd. Kulture su dopunjene s 10 U/ml rekombinanntim mišjim IL-2 (Biosource) tijekom posljednjim pet dana uzgajanja. Za analizu citotoksične aktivnosti, P815 stanice obilježene su s Cr51 i pulsirane s 5 µg/ml peptida (IIIB ili MN) tijekom četiri sata, te su dodane uzgojenim stanicama efektora slezene. Korišteno je trostruko razrjeđenje efektora u odnosu na ciljane stanice, od 100:1 do 3,7:1. Postotak CTL aktivnosti izračunat je kao postotak otpuštanja kroma korištenjem ((specifično otpuštanje kroma – spontano otpuštanje kroma) / (maksimalno otpuštanje kroma – spontano otpuštanje kroma)) × 100. Otpuštanje kroma procijenjeno je nakon inkubiranja od šest sati. Prosječno spontano otpuštanje kroma bilo je uvijek manje od 15% najvećeg otpuštanja. Podaci o rezultatima za dan 28 prikazani su na slici 5.
Eksperiment 9
Imunizacija Rhesus Macaques s različitim SIV peptidima i adjuvantima
MPL™ SE i GM-CSF adjuvantne formulacije su ispitane u Rhesus macaques (Macaca mulatta) u svezi sa sposobnošću induciranja antigen-specifičnog CTL. U ovom eksperimentu, formulacija adjuvanata ispitana je s trivalentnim peptidnim imunogenom koji sadrži tri odvojena Mamu A*01 ograničene CTL epitop (jedan iz gag, pol i env), a svaki je sintetiziran kemijski sa ili bez promiskuitetnog T-pomoćničkog epitopa iz SIV env u laboratoriju Dr. Harton Haynes, Duke University.
Peptidi koji sadrže Mamu A*01 ograničeni CTL epitop su sljedeći:
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:3) (gag)
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:4) (pol)
Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:5) (env)
Svaki od ovih epitopa koji sadrže CTL povezani su s T-pomoćničkim epitopom koji ima sljedeću sekvenciju:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID No:6)
Prema tome, tri višeepitopna peptida imaju sljedeće sekvencije:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:7)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:8)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:9)
CTL analiza izvršena je pomoću analize Mamu A*01 ograničenog tetramernog soja u laboratoriju Dr. Norman Letvin, Harvard Medical School.
Životinje, doze i imunogeni
Rhesus macaques koji vrši ekspresiju HLA-A homologne molecule Mamu A*01 podtipa DRβ0201 identificiran je pomoću PCR i smješten je na koloniju u New Iberia, LA.
Studija je obuhvatila tri skupine od dva mlada Rhesus macaques (Macaca mulatta) koji su opisani u tablici 20. Skupina 1 sastojala se od dvije Mamu A*01 pozitivne, DRβ0201 negativne životinje Rh 73 i Rh 80. Tim životinjama primijenjeni su trivalentni Mamu A*0l ograničeni SIV gag, env i pol CTL epitopni peptidi (koktel kratkih peptida), zajedno s MPL™ SE i GM-CSF. Skupina 2 sastojala se od dvije Mamu A*01 pozitivne, DRβ���� pozitivne životinje koje su primile Th/SIVCTL gag, pol i env epitopne peptide (koktel dugolančanih peptida), zajedno s MPL™ SE i GM-CSF. Skupina 3 sastojala se od dvije Mamu A*01 negativne, DRβ0201 positivne životinje koje su inokulirane s Th/SIVCTL gag, pol i env peptidima (koktel dugolančanih peptida). Tablica 20 sadrži podatke o skupinama u svezi s korištenim HLA tipovima i peptidnim imunogenima.
Tablica 20
Životinje, doze i imunogeni
[image]
Sve skupine su potkožno imunizirane s 1 ml ogovarajućeg peptidnog koktela koji je formuliran u 50 µg MPL™ SE u 1% ulju i 250 µg humanog GM-CSF u tjednima 0, 4 i 8. Doza MPL™ SE povećana je na 125 µg u 1% ulju tijekom 18. tjedna imunizacije. Za sve skupine, 2,4 mg svakog od dugih peptida i 0,75 mg svakog od kratkih peptida otopljeno je u 900 μl destilirane, deionizirane vode. Peptidna otopina zatim je korištena za rekonstituiranj humanog GM-CSF te je dodano 100 μl MPL™ SE formulacije.
Primjer 24
CTL analiza u Rhesus Macaques
Životinjama je uzimana krv scaka dva tjedna i heparinizirana krv analizirana je za Mamu A*01 ograničeni CTL pomoću tetramera koji je bojen na svježim i uzgojenim mononuklearnim stanicama periferne krvi (PBMC) (50). PHMC su stimulirane bilo s p11c, p68A, p4lA ili p46 nultog dana i zatim su uzgajane u prisutnosti Il-2 i analizirane jedanaestog dana. Standardna analiza 51Cr otpuštanja atakođer je izvršena na uzgojenim PBMC (50).
Analiza tetramera izvršena je na sljedeći način: Epotopski petidi p11c iz gag, p68A iz pol ili p68A iz pol ili p41A iz env su inkubirani s pročišćenim biotiniliranim Mamu A*01 u prisutnosti β2 mikroglobulina, zatim su dodani avidinu i konjugirani na PE (fikoeritrin). Tetramer je zatim korišten za xx stanica macaque CD8+ cells s T-staničnim receptorima koji prepoznaju p11C, p68A ili p4lA epitope. Drukčiji DRβ0201 tetramer koji je savijen oko dominantnog env p46 epitopa omogućuje xx CD4+ stanica koje specifično prepoznaju p46 Th epitop. Rezultati su prikazani u tablicama 21-24.
Tablica 21
Postotak P11c/SIVgag tetramer pozitivnih CD8+ stanica
[image]
Tablica 22
Postotak P68a/SIV STL pol tetramer pozitivnih CD8+ stanica
[image]
Tablica 23
Postotak P4aA/SIV env tetramer pozitivnih CD8+ stanica
[image]
Tablica 24
Postotak P46/SIV T-pomoćničkih DRβ0201 tetramer pozitivnih CD4+ stanica
[image]
Eksperiment 10
Imunizacija Swiss-Webster miševa s Neisseria gonorrhoeae Porin B proteinom i različitim adjuvantima
Swiss-Webester miševi podijeljeni su u pet skupina – po deset miševa u svakoj. Svaka skupina primila je 1 μg rekombinantnog Porin B proteina (iz soja FA1090 s 16 aminokiselina na amino-terminalima iz faga, nakon čega je slijedio zreli oblik Porin B proteina). Prva skupina nije primila adjuvant (protein je bio formuliran u PBS); druga skupina je primila 50 µg MPL™; treća skupina je primila MPL™ plus 5 µg GM-CSF; četvrta skupina je primila 25 µg MPL™ SE; peta skupina je primila MPL™ SE plus 5 µg GMCSF. Miševi su imunizirani s ukupno 0,2 ml u trticu, koja je dana jednako u dvije doze sa svake strane repa. Imunizacije su primijenjene u tjednu 0 i tjednu 4.
Primjer 25
Recipročni titri IgG završne točke anti-Porin B proteina poklase
Miševima je uzeta krv prije svakog imuniziranja i 13 dana nakon završnog imuniziranja. Serum je analiziran iz skupa (“pool”) miševa unutar svake skupine. Recipročni titri završne točke anti-Porin B proteina IgG potklase mjereni su iz združenog seruma (n=10 Swiss-Webster) za vaginalni ispirak, u trećem i u šestom tjednu. Rezultati su prikazani u tablici 25. Svi preimunizacijski titri nultog dana bili su manji od 50.
Tablica 25
Recipročni titri IgG završne točke NTI-Porin B proteina podklase
[image]
Također su određeni geometrijski prosjeci pojedinačnih IgG titrova prema rekombinantnom Porin B proteinu. Rezultati su prikazani u tablici 26.
Tablica 26
Pojedinačni IgG titri
[image]
Eksperiment 11
Imunizacija Swiss-Webster miševa s Neisseria gonorrhoeae Porin B proteinom i različitim adjuvantima
Outbred Swiss-Webster mice podijeljeni su u šest skupina – po pet u svakom skupu. Svaka skupina primila je 1 µg rekombinantnog Porin B proteina (iz soja FA1090 s 16 aminokiselina na amino-terminalima iz faga, nakon čega je slijedio zreli oblik Porin B proteina). Prva skupina nije primila adjuvant (protein je formuliran u PBS); druga skupina je primila 40 ng IL-12; treća skupina je primila 50 µg MPL™; četvrta skupina je primila MPL™ plus 40 ng IL-12; peta skupina je primila 25 µg MPL™ SE; šesta skupina MPL™ SE plus 40 ng IL-12. Miševi su imunizirani potkožno u trticu s ukupnim volumenom 0,2 ml. Imunizacije su primijenjene u tjednu 0 i u tjednu 4.
Primjer 26
Recipročni titri igg završne točke anti-porin b proteina podklase i igg i iga titri vaginalnog ispiranja
Miševima je uzeta krv prije svakog imuniziranja i 13 dana nakon završnog imuniziranja. Serum je analiziran iz skupa (“pool”) miševa unutar svake skupine. Recipročni titri završne točke anti-Porin B proteina IgG potklase mjereni su iz združenog seruma (n=5 Swiss-Webster) vaginalnog ispirka, te su izmjereni titri IgG i IgA vaginalnog ispiranja, u trećem i u šestom tjednu. Rezultati su prikazani u tablici 27. Svi preimunizacijski titri nultog dana bili su manji od 50. Početna razrjeđenja za analizu vaginalnog ispirka bilo je 1/5.
Tablica 27
Recipročni titri igg završne točke anti-porin b proteina podklase i igg i iga titri vaginalnog iscjedka
[image]
Eksperiment 12
Imunizacija Balb/c miševa s proteinom respiratornog sincicijskog virusa i različitim adjuvantima
Balb/c miševi podijeljeni su u sedam skupina - u svakoj po pet miševa. Svaka skupina primila je 3 µg pročišćenog nativnog RSV F proteina (u dimernom obliku). Prva skupina nije primila adjuvant (protein je bio formuliran u PBS); druga skupina je primila 100 µg aluminijeva fosfata (alum); treća skupina je primila 20 µg Stimulon™-a QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA); četvrta skupina je primila 50 µg MPL™; peta skupina je primila MPL™ plus 5 µg GM-CSF; šesta skupina je primila 25 µg MPL™ SE; sedma skupina primila je MPL™ SE plus 5 µg GM-CSF. Miševi su imunizirani s ukupnim volumenom 0,2 ml u gornje bedro.
Imunizacije su primijenje u tjednu 0 i u tjednu 4.
Primjer 27
Recipročni titri igg završne točke anti-rsv f proteina podklase
Miševima je uzeta krv jedan dan prije svake imunizacije, te 13 dana nakon završne imunizacije. Serum je analiziran iz skupa (“pool”) miševa unutar svake skupine. Recipročni titri IgG završne točke anti-RSV F proteina podklase mjereni su iz združenog seruma (n=5 Balb/c). Rezultati su prikazani u tablici 28. Svi preimunizacijski titri nultog dana bili su manji od 50.
Tablica 28
Recipročni titri IgG završne točke anti-rsv f proteina podklase
[image]
Primjer 28
Proliferacija stanica slezene
Mjerena je proliferacija stanica slezene kao odgovor na in vitro stimulaciju s 2,5 µg/ml RSV F proteina i različitim formulacijama adjuvanata (isto kao u primjeru 27). Stanice slezene su ubrane 14 dana nakon imunizacije i postavljanaj u kulturu s gustoćom 5×105 stanica. Stanice su uzgajane ukupno 96 sati. Tijekom posljednjim 18 sati kulturi je dodan 3H-timidin. Podaci predstavljaju indeks proliferacije koji je normaliziran prema stanicama koje su stimulirane u kulturi s ConA ([prosječni cpm antigen/prosječni cpm ConA] - [prosječni cpm medij/prosječni cpm ConA]) × 100. Kao rezultat, stanice koje su uzgajane u mediju imaju osnovnu razinu proliferacije nula. Rezultati su prikazani u tablici 29.
Tablica 29
Proliferacija stanica slezene
[image]
Eksperiment 13
Imunizacija Balb/c miševa s proteinom respiratornog sincicijskog virusa i različitim adjuvantima
Ponovljen je protokol eksperimenta 12 (imunizacije u tjednu 0 i tjednu 4 s RSV F proteinom sa ili bez različitih adjuvanata).
Primjer 29
Recipročni titri IgG završne točke anti-RSV F proteina podklase
Miševima je uzeta krv jedan dan prije svake imunizacije, te 13 dana nakon završne imunizacije. Serum je analiziran iz skupa (“pool”) miševa unutar svake skupine. Recipročni titri IgG završne točke anti-RSV F proteina podklase mjereni su iz združenog seruma (n=5 Balb/c). Rezultati su prikazani u tablici 30. Svi preimunizacijski titri nultog dana bili su manji od 50.
Tablica 30
Recipročni titri IgG završne točke anti-RSV F proteina podklase
[image]
Primjer 30
CTL aktivnost stanica slezene
CTL (citotoksični T-limfocit) aktivnost stanica slezene kao posljedica imunizacije s RSV F proteinom i naznačenim adjuvantom procijenjena je dva tjedna nakon završne imunizacije. Podaci predstavljaju postotak specifične CTL aktivnosti stanica slezene koje su uzgajane s RSV-inficiranim ciljanim stanicama pri čemu je odnos stanica efektora prema meti bio 33:1. Postotak specifične CTL aktivnosti određen je kao u primjeru 24, oduzimanjem CTL aktivnosti neinficiranih meta od aktivnosti koja je specifična za RSV-inficirane ciljane stanice. Stanice slezene inficirane su s RSV za MOI od 1,5 tijekom dva h kao izvor in vitro stimulatorskih stanica. Responderske stanice slezene imuniziranih miševa dodane su stimulatorskim stanicama u odnosu 5:1, te uzgajane tijekom šest dana.Petog dana, ciljane stanice (Balb/C MHC-H-2d stanična linija) inficirane su s RSV za MOI od 10 tijekom dva h i inkubirane preko noći. Šestog dana, inficirane i neinficirane ciljane stanice su ubrane i pulsirane s 51Cr. In vitro efektorske stanice zatim su dodane ciljanim stanicama za E.T odnos u rasponu od 100:1 do 3:1, Otpuštanje kroma mjereno je nakon četiri sata od inkubiranja. Rezultati su prikazani u tablici 31.
Tablica 31
CTL aktivnost stanica slezene
[image]
Eksperiment 14
Imunizacija Balb/c miševa s proteinom respiratornog sincicijskog virusa i različitim adjuvantima
Balb/c miševi podijeljeni su u šest skupina - u svakoj po pet miševa. Svaka skupina primila je 3 µg čistog nativnog RSV F proteina (u dimernom obliku). Prva skupina nije primila adjuvant (protein je bio formuliran u PBS); druga skupina je primila 40 ng IL-12; treća skupina je primila 50 µg MPL™; četvrta skupina je primila MPL™ plus 40 ng IL-12; peta skupina je primila 25 µg MPL™ SE; šesta skupina primila je MPL™ SE plus 40 ng IL-12. Miševi su imunizirani s ukupno 0,1 ml u trticu, koja je dana jednako u dvije doze sa svake strane repa. Imunizacije su primijenjene u tjednu 0 i tjednu 4.
Primjer 31
Recipročni titri završne točke anti-RSV F proteina podklase
Miševima je uzeta krv jedan dan prije svake imunizacije, te 13 dana nakon završne imunizacije. Serum je analiziran iz skupa (“pool”) miševa unutar svake skupine. Recipročni titri završne točke anti-RSV F proteina podklase mjereni su iz združenog seruma (n=5 Balb/c). Rezultati su prikazani u tablici 32. Svi preimunizacijski titri nultog dana bili su manji od 50.
Tablica 32
Recipročni titri završne točke anti-RSV F proteina podklase
[image]
Primjer 32
CTL aktivnost stanica slezene
CTL aktivnost stanica slezene kao posljedica imunizacije s RSV F proteinom i naznačenim adjuvantom procijenjena je dva tjedna nakon završne imunizacije. Podaci predstavljaju postotak specifične CTL aktivnosti stanica slezene koje su uzgajane s RSV-inficiranim ciljanim stanicama pri čemu je odnos stanica efektora prema meti bio 33:1. Postotak specifične CTL aktivnosti određen je kao u primjeru 24, oduzimanjem CTL aktivnosti neinficiranih meta od aktivnosti koja je specifična za RSV-inficirane ciljane stanice. Stanice slezene inficirane su s RSV za MOI od 1,5 tijekom dva h kao izvor in vitro stimulatorskih stanica. Responderske stanice slezene imuniziranih miševa dodane su stimulatorskim stanicama u odnosu 5:1, te uzgajane tijekom šest dana. Petog dana, ciljane stanice (Balb/C MHC-H-2d stanična linija) inficirane su s RSV za MOI od 10 tijekom dva h i inkubirane preko noći. Šestog dana, inficirane i neinficirane ciljane stanice su ubrane i pulsirane s 51Cr. In vitro efektorske stanice zatim su dodane ciljanim stanicama za E.T odnos u rasponu od 100:1 do 3:1. Otpuštanje kroma mjereno je nakon četiri sata od inkubiranja. Rezultati su prikazani u tablici 33.
Tablica 33
CTL aktivnost stanica slezene
[image]
Eksperiment 15
Imunizacija Balb/c miševa nukleokapsidnim proteinom virusa influence i različitim adjuvantima
Balb/c miševi podijeljeni su u šest skupina - u svakoj po pet miševa. Svaka skupina primila je l µg NP (nuklekpasidnog) proteina virusa influence iz A/dorn/307/72 soja. [provjeri skupine] Prva skupina nije primila adjuvant (peptid nije formuliran u PBS); druga skupina je primila 100 µg aluminijeva fosfata (alum); treća skupina je primila 50 µg MPL™; četvrta skupina je primila MPL™ plus 5 µg GM-CSF; peta skupina je primila 25 µg MPL™ SE; šest skupina primila je MPL™ SE plus 5 µg GM-CSF. Miševi su imunizirani potkožno u trticu s ukupnim volumenom od 0,2 ml. Imunizacije su primijenjene u tjednu 0 i tjednu 4.
Primjer 33
CTL aktivnst stanica slezene
CTL aktivnost stanica slezene kao posljedica imunizacije s NP peptidom influence i naznačenim adjuvantom procijenjena je dva tjedna nakon završne imunizacije. Procjena je ozvršena postupkom primjera 32 korištenjem p815 stanica peptid-pulsne mete (peptid koji odgovara aminokiselinama 147-155 MP i ima sekvenciju: Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val (SEQ ID br : 14). Uključivanje GM-CSF u formulacijama koje sadrže MPL™ ili MPL™ SE rezultiralo je značajnim smanjenjem CT aktivnosti (podaci nisu prikazani).
Bibliografija
1. Mosmann, T.R., et al., J. Immunol., 136, 2348-2357 (1986).
2. Američki patent br. 4,912,094.
3. Ahlers, J.D., et al., J. Immunol., 158, 3947-3958 (1997).
4. Scharton-Rersten, T., et al., J. Immunol. 154, 5320-5330 (1995).
5. Ghalib, H.W., et al., J. Iumiunol., 154, 4623-4629 (1995).
6. Murray, H.W., i Hariprashad, J.,. J. Exu. Med., 181, 387-391 (1995).
7. Američki patent br. 5,571,515.
8. Finkelman, F.D., i Holmes, J., Ann. Rev. Immunol., 8, 303-333 (1990).
9. Snapper, C.M., et al., J. Exp. Med., 175, 1367-1371 (1992).
10. Robayashi, M., et al., J. Exp. Med., 170, 827-845 (1989) .
11. Međunarodni patent br. WO 90/05147.
12. Američki patent br. 5,078,996.
13. Američki patent br. 5,229,496.
14. Američki patent br. 5,073,627.
15. Alderson, M.R., et al., J. Exp. Med., 178, 669-674 (1993).
16. Snapper, C.M., et al., J. Inmtunol., 154, 5842-5850 (1995) .
17. Američki patent br. 5,013,548.
18. Američki patent br. 5,019,387.
19. Charbit, A., et al., Vaccine, 11, 1221-1228 (1993) .
20. Natuk, R.J., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 9,~ 395-404 (1993).
21. Johnson, R.P., et al., J. Virol., 68, 3145-3153 (1994) .
22. Fuller, D.H., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10, 1433-1441 (1994).
23. Berzofsky, J.A., et al., J. Clin. Invest., 88, 876-884 (1991).
24. Palker, T.J., et al., J. Iuununol., 142, 3612-3619 (1989).
25. Hart, M.R., et al., J. Immunol., 145, 2677-2685 (1990).
26. Haynes, B.F., et al., J. Immunol., 151, 1646-1653 (1993).
27. Hart, M.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 9448-9452 (1991).
28. Bartlett, J.A., et al., AIDS, 12, 12911300 (1998).
29. Haynes, B.F., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 11, 211-221 (1998) .
30. Američki patent br. 5,861,243.
31. Američki patent br. 5,932,218.
32. Američki patent br. 5,939,074.
33. Američki patent br. 5,993,819.
34. Američki patent br. 6,037,135.
35. Europski patent br. 671,947.
36. Staats, H.F., et al., J. Immunol., 157, 462-472 (1996) .
37. Porgador, A., et al., J. Immunol., 158, 834-841 (1997).
38. Allen, T.M., et al., J. Immunol., 160, 6062-6071 (1998).
39. Miller, M.D., et al., J. Immunol., 147, 320-329 (1991).
40. Egan, M.A., et al., J. Virol., 73, 5466 (1999) .
41. Hart, M.K., J. Immunol., 145, 2677-2685 (1990) .
42. Američki patent br. 5,736,361.
43. Američki patent br. 5,223,254.
44. Međunarodni patent br. WO 98/20734.
45. Američki patent br. 5,830,877.
46. Međunarodni patent br. WO 99/51259.
47. Međunarodni patent br. WO 99/27944.
48. Američki patent br. 4,666,829.
49. Američki patent br. 5,593,972.
50. Kuroda, M.J., et al., J. Exr~. Med., 187, 1373-1381 (1998) .

Claims (87)

1. Antigenska smjesa, naznačena time što sadrži odabrani antigen između patogenog virusa, bakterije, gljivice ili parazita, ili između stanice karcinoma ili tumorske stanice, ili između alergena, ili između amiloidnog peptidnog proteina, te učinkovitu količinu adjuvanta kombinacije: (1) 3-O-deacilirani monofosoforil lipid A ili monofosforil lipid A te njegovi derivati i analozi, i (2) citokin ili limfokin, ili agonist ili antagonist za navedeni citokin ili limfokin, pri čemu kombinacija djuvanata pojačava imunološki odgovor u domaćina kralježnjaka prema navedenom antigenu.
2. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što je odabrani antigen polipeptid, peptid ili fragment izveden iz proteina.
3. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
4. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što su citokin ili limfokin odabrani iz skupa kojega sačinjavaju stimulirajući čimbenik kolonije granulcitnih makrofaga.
5. Antigenska smjesa prema zahtjevu 4, naznačena time što su citokin ili limfokin stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
6. Antigenska smjesa prema zahtjevu 5, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilen emulzije “ulje u vodi”.
7. Antigenska smjesa prema zahtjevu 6, naznačena time što su citokin ili limfokin interleukin-12.
8. Antigenska smjesa prema zahtjevu 7, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
9. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što također sadrži razrjeđivač ili nosač.
10. Antigenska smjesa prema zahtjevu 9, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
11. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani antigen između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese iz zahtjeva 1.
12. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani antigen između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese iz zahtjeva 9.
13. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani antigen između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese iz zahtjeva 1.
14. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani antigen između patogenih virusa, bakterija, gljivica ili parazita da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese iz zahtjeva 9.
15. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani antigen karcinoma ili tumor-pridruženi antigen iz stanice karcinoma ili tumorske stanice da se izazove terapeutski ili profilaktički anti-kancerogeni učinak u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese koja sadrži navedeni odabrani antigen karcinoma ili tumor-pridruženi antigen iz stanice karcinoma ili tumorske stanice, te učinkovitu količinu adjuvanta kombinacije: (1) 3-O-deacilirani monofosoforil lipid A ili monofosforil lipid A te njegovi derivati i analozi, i (2) citokin ili limfokin, ili agonist ili antagonist za navedeni citokin ili limfokin.
16. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži odabrani alergen da se ublaži alergijski odgovor u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese koja sadrži navedeni alergen, te učinkovitu količinu adjuvanta kombinacije: (1) 3-O-deacilirani monofosoforil lipid A ili monofosforil lipid A te njegovi derivati i analozi, i (2) citokin ili limfokin, ili agonist ili antagonist za navedeni citokin ili limfokin.
17. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese da se spriječi ili tretira bolest koja je karakterizirana amiloidnim nakupljanjem u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu polipeptida, peptida ili fragmenta koji je izveden iz amiloidnog peptidnog proteina ili njegova antitijela, te učinkovitu količinu adjuvanta kombinacije: (1) 3-O-deacilirani monofosoforil lipid A ili monofosforil lipid A te njegovi derivati i analozi, i (2) citokin ili limfokin, ili agonist ili antagonist za navedeni citokin ili limfokin.
18. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što je odabrani antigen iz humanog virusa imunodeficijencije (HIV).
19. Antigenska smjesa prema zahtjevu 18, naznačena time što je odabrani HIV antigen HIV protein, polipeptid, peptid ili fragment izveden iz navedenog proteina.
20. Antigenska smjesa prema zahtjevu 19, naznačena time što su odabrani antigeni HIV peptidi koji imaju sljedeću sekvenciju aminokiselina: Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:1), ili Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:2) .
21. Antigenska smjesa prema zahtjevu 18, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
22. Antigenska smjesa prema zahtjevu 18, naznačena time što su citokin ili limfokin odabrani iz skupa kojega sačinjavaju stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
23. Antigenska smjesa prema zahtjevu 22, naznačena time što su citokin ili limfokin stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
24. Antigenska smjesa prema zahtjevu 23, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilen emulzije “ulje u vodi”.
25. Antigenska smjesa prema zahtjevu 22, naznačena time što su citokin ili limfokin interleukin-12.
26. Antigenska smjesa prema zahtjevu 25, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
27. Antigenska smjesa prema zahtjevu 18, naznačena time što također sadrži razrjeđivač ili nosač.
28. Antigenska smjesa prema zahtjevu 27, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
29. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što je odabrani antigen simian virus imunodeficijencije (SIV).
30. Antigenska smjesa prema zahtjevu 29, naznačena time što je odabrani SIV antigen SIV protein, polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenog proteina.
31. Antigenska smjesa prema zahtjevu 30, naznačena time što je odabrani antigen SIV peptid odabran među peptidima koji se sastoje iz sljedeće sekvencije aminokiselina: Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:4), Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:5), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID No:6), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:7), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:9).
32. Antigenska smjesa prema zahtjevu 29, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
33. Antigenska smjesa prema zahtjevu 29, naznačena time što su citokin ili limfokin odabrani iz skupa kojega sačinjavaju stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
34. Antigenska smjesa prema zahtjevu 33, naznačena time što su citokin ili limfokin stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
35. Antigenska smjesa prema zahtjevu 34, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilen emulzije “ulje u vodi”.
36. Antigenska smjesa prema zahtjevu 33, naznačena time što su citokin ili limfokin interleukin-12.
37. Antigenska smjesa prema zahtjevu 36, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
38. Antigenska smjesa prema zahtjevu 29, naznačena time što također sadrži razrjeđivač ili nosač.
39. Antigenska smjesa prema zahtjevu 38, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
40. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što je odabrani antigen od Neisseria gonorrhoeae.
41. Antigenska smjesa prema zahtjevu 40, nznačena time što je odabrani antigen Neisseria gonorrhoeae protein Neisseria gonorrhoeae, polipeptid, peptid ili fragment izveden iz navedenog proteina.
42. Antigenska smjesa prema zahtjevu 41, naznačena time što je odabrani antigen Neisseria gonorrhoeae Porin B protein.
43. Antigenska smjesa prema zahtjevu 40, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
44. Antigenska smjesa prema zahtjevu 40, naznačena time što su citokin ili limfokin odabrani iz skupa kojega sačinjavaju stimulirajući čimbenik kolonije granulcitnih makrofaga.
45. Antigenska smjesa prema zahtjevu 44, naznačena time što su citokin ili limfokin stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
46. Antigenska smjesa prema zahtjevu 45, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilen emulzije “ulje u vodi”.
47. Antigenska smjesa prema zahtjevu 44, naznačena time što su citokin ili limfokin interleukin-12.
48. Antigenska smjesa prema zahtjevu 47, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
49. Antigenska smjesa prema zahtjevu 40, naznačena time što također sadrži razrjeđivač ili nosač.
50. Antigenska smjesa prema zahtjevu 49, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
51. Antigenska smjesa prema zahtjevu 1, naznačena time što je odabrani antigen humani respiratorni sincicijski virus (RSV).
52. Antigenska smjesa prema zahtjevu 51, naznačena time što je odabrani RSV antigen RSV protein, polipeptid, peptid ili fragment koji je izveden iz navedenog proteina.
53. Antigenska smjesa prema zahtjevu 52, naznačena time što je odabrani antigen RSV fuzijski (F) protein.
54. Antigenska smjesa prema zahtjevu 51, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
55. Antigenska smjesa prema zahtjevu 51, naznačena time što su citokin ili limfokin odabrani iz skupa kojega sačinjavaju stimulirajući čimbenik kolonije granulcitnih makrofaga.
56. Antigenska smjesa prema zahtjevu 55, naznačena time što su citokin ili limfokin stimulirajući čimbenik kolonije granulocitnih makrofaga.
57. Antigenska smjesa prema zahtjevu 56, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilen emulzije “ulje u vodi”.
58. Antigenska smjesa prema zahtjevu 55, naznačena time što su citokin ili limfokin interleukin-12.
59. Antigenska smjesa prema zahtjevu 58, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
60. Antigenska smjesa prema zahtjevu 51, naznačena time što također sadrži razrjeđivač ili nosač.
61. Antigenska smjesa prema zahtjevu 60, naznačena time što se 3-O-deacilirani monofosforil lipid A koristi u obliku stabilne emulzije “ulje u vodi”.
62. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži HIV protein da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 18.
63. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži HIV protein da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 27.
64. Metoda prema zahtjevu 63, naznačena time što je HIV antigen HIV peptid koji sadrži sljedeću sekvenciju aminokiselina: Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:1).
65. Metoda prema zahtjevu 63, naznačena time što je HIV antigen HIV peptid koji sadrži sljedeću sekvenciju aminokiselina: Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:2) .
66. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži HIV protein da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 18.
67. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži HIV protein da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 27.
68. Metoda prema zahtjevu 67, naznačena time što je HIV antigen HIV peptid koji je sljedeće sekvencije aminokiselina: Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:1).
69. Metoda prema zahtjevu 67, naznačena time što je HIV antigen HIV peptid koji je sljedeće sekvencije aminokiselina: Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID No:2) .
70. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži SIV antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 29.
71. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži SIV antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 38.
72. Metoda prema zahtjevu 71, naznačena time što je SIV peptid odabran između peptida koji se sastoje iz sljedeće sekvencije aminokiselina: Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:4), Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:5), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID No:6), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:7), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:9).
73. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži SIV protein da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 29.
74. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži SIV protein da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 38.
75. Metoda prema zahtjevu 74, naznačena time što je SIV peptid odabran između peptida koji se sastoje iz sljedeće sekvencije aminokiselina: Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:3), Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:4), Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:5), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID No:6), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID No:7), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ ID No:8), Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID No:9).
76. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži Neisseria gonorrheae antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 40.
77. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži Neisseria gonorrheae antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 49.
78. Metoda prema zahtjevu 77, naznačena time što je Neisseria gonorrheae antigen je Neisseria gonorrheae Porin B protein.
79. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži Neisseria gonorrheae antigen da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 40.
80. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži Neisseria gonorrheae antigen da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 49.
81. Metoda prema zahtjevu 80, naznačena time što je Neisseria gonorrheae antigen je Neisseria gonorrheae Porin B protein.
82. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži humani respiratorni sincicijski virus (RSV) antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 51.
83. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži humani respiratorni sincicijski virus (RSV) antigen da izazove imunološki odgovor domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 60.
84. Metoda prema zahtjevu 83, naznačena time što je RSV antigen RSV fuzijski (F) protein.
85. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži RSV antigen da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 51.
86. Metoda za povećanje sposobnosti antigenske smjese koja sadrži RSV antigen da izazove citotoksične T-limfocite u domaćina kralježnjaka, naznačena time što uključuje primjenu navedenom domaćinu antigenske smjese prema zahtjevu 60.
87. Metoda prema zahtjevu 83, naznačena time što je RSV antigen RSV fuzijski (F) protein.
HR20010839A 1999-05-13 2001-11-12 Adjuvant combination formulations HRP20010839A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13396399P 1999-05-13 1999-05-13
PCT/US2000/013156 WO2000069456A2 (en) 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvant combination formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20010839A2 true HRP20010839A2 (en) 2003-02-28

Family

ID=22461127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20010839A HRP20010839A2 (en) 1999-05-13 2001-11-12 Adjuvant combination formulations

Country Status (28)

Country Link
US (2) US7611721B1 (hr)
EP (1) EP1178825B1 (hr)
JP (2) JP4974414B2 (hr)
KR (1) KR100863367B1 (hr)
CN (1) CN1192799C (hr)
AT (1) ATE516046T1 (hr)
AU (1) AU781469B2 (hr)
BG (1) BG106094A (hr)
BR (1) BR0010539A (hr)
CA (2) CA2767116A1 (hr)
CZ (1) CZ20013916A3 (hr)
EA (1) EA006233B1 (hr)
EE (1) EE200100597A (hr)
ES (1) ES2367625T3 (hr)
GE (1) GEP20053446B (hr)
HR (1) HRP20010839A2 (hr)
HU (1) HUP0201220A3 (hr)
ID (1) ID30407A (hr)
IL (2) IL146382A0 (hr)
IS (1) IS6156A (hr)
MX (1) MXPA01011499A (hr)
NO (1) NO20015523L (hr)
NZ (1) NZ515322A (hr)
PL (1) PL352312A1 (hr)
SK (1) SK16022001A3 (hr)
TR (1) TR200103266T2 (hr)
UA (1) UA76406C2 (hr)
WO (1) WO2000069456A2 (hr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
JP4974414B2 (ja) 1999-05-13 2012-07-11 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション アジュバント混合製剤
EP1333858B8 (en) 2000-11-07 2006-06-14 Immunovaccine Technologies Inc. Vaccines with enhanced immune response and methods for their preparation
WO2002038177A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 Wyeth Holdings Corporation Adjuvant combination formulations
CN101827613A (zh) 2007-09-27 2010-09-08 免疫疫苗技术有限公司 在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用
RU2484132C2 (ru) * 2007-10-08 2013-06-10 Интрексон Корпорейшн Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей
EP2296696B1 (en) 2008-06-05 2014-08-27 ImmunoVaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2012321022B2 (en) 2011-10-06 2017-03-23 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of TLR2 and uses thereof
RU2496149C1 (ru) * 2012-06-19 2013-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US20190119642A1 (en) 2016-03-15 2019-04-25 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5391485A (en) 1985-08-06 1995-02-21 Immunex Corporation DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6294322B1 (en) 1988-01-26 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptides that elicit helper T-lymphocyte cytotoxic T-lymphocyte and neutralizing antibody responses against HIV-1
US5939074A (en) 1986-12-30 1999-08-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptide antigens
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5013548A (en) 1987-09-08 1991-05-07 Duke University Production of antibodies to HIV
US5993819A (en) 1987-09-08 1999-11-30 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
US5019387A (en) 1987-09-08 1991-05-28 Duke University Production of antibodies to HIV
US5223254A (en) 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
CA1340506C (en) * 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
ATE140483T1 (de) 1988-11-10 1996-08-15 Genetics Inst Natürlicher killerzellen-stimulationsfaktor
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE3934366A1 (de) 1989-10-14 1991-04-18 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum
JP2980677B2 (ja) 1990-04-27 1999-11-22 マクマイケル，ジョン 不正常なアミロイドβタンパク質と関連する中枢神経系疾患状態の治療のための方法および組成物
SE502569C2 (sv) * 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
AU666160B2 (en) 1991-12-02 1996-02-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions for eliciting cytotoxic T-lymphocyte responses against viruses
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
EP0651656A1 (en) 1992-07-08 1995-05-10 Schering Corporation Use of gm-csf as a vaccine adjuvant
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
DK0812593T4 (da) * 1993-03-23 2008-05-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparater indeholdende 3-O-deacyleret monophosphoryllipid-A
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
CA2163550A1 (en) * 1993-05-25 1994-12-08 Gerald E. Hancock Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
WO1995029700A1 (en) 1994-04-29 1995-11-09 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
AUPM543894A0 (en) 1994-05-04 1994-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation An adjuvant
WO1996010423A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Ludwig Institute For Cancer Research COMPOSITIONS CONTAINING A p53 DERIVED PROTEIN OR PEPTIDE, AN ADJUVANT, AND INTERLEUKIN-12 AND USES THEREOF
ATE322289T1 (de) 1994-10-05 2006-04-15 Univ Vanderbilt Interleukin-12 als adjuvans für paramyoxviridae impfstoffe
JP3958360B2 (ja) * 1995-02-24 2007-08-15 キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法
US6613337B1 (en) 1997-02-12 2003-09-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
HUP9901039A2 (hu) 1996-02-01 1999-07-28 North American Vaccine, Inc. Neisseria meningitidis B-csoportba tartozó külső-membrán-fehérjéjének (MB3) expressziója élesztőben, továbbá vakcinák
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US5762943A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Ribi Immunochem Research, Inc. Methods of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
ATE325621T1 (de) 1996-05-31 2006-06-15 Nat Univ Ireland Maynooth Il-12 als adjuvanz für bordetella pertussis impfstoffe
US6024965A (en) 1996-10-18 2000-02-15 Erasums University Rotterdam Induction of REV and TAT specific cytotoxic T-cells for prevention and treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection
CA2745736C (en) 1996-10-23 2016-11-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6350456B1 (en) * 1997-03-13 2002-02-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) * 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP0988053A1 (en) * 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
GB9712347D0 (en) * 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2295740A1 (en) * 1997-07-08 1999-01-21 Chiron Corporation Use of submicron oil-in-water emulsions with dna vaccines
IS4518A (is) 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
GB9717953D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6488936B1 (en) 1998-02-12 2002-12-03 Wyeth Immunogenic composition of interleukin-12 (IL-12), alum, herpes simplex viral (HSV) antigen, and method thereof
WO1999040937A2 (en) 1998-02-12 1999-08-19 American Cyanamid Company Vaccines comprising interleukin-12 and respiratory syncytial viral antigens
JP2002510644A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
GB9907860D0 (en) 1999-04-07 1999-06-02 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
JP4974414B2 (ja) 1999-05-13 2012-07-11 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション アジュバント混合製剤

Also Published As

Publication number Publication date
JP5230780B2 (ja) 2013-07-10
ATE516046T1 (de) 2011-07-15
JP2012006949A (ja) 2012-01-12
TR200103266T2 (tr) 2002-01-21
IL146382A (en) 2007-07-04
US7611721B1 (en) 2009-11-03
ID30407A (id) 2001-11-29
JP2004504260A (ja) 2004-02-12
EP1178825A2 (en) 2002-02-13
HUP0201220A2 (en) 2002-08-28
IL146382A0 (en) 2002-07-25
GEP20053446B (en) 2005-02-25
WO2000069456A2 (en) 2000-11-23
EA006233B1 (ru) 2005-10-27
NO20015523D0 (no) 2001-11-12
EA200101198A1 (ru) 2002-04-25
CZ20013916A3 (cs) 2002-06-12
US20100233117A1 (en) 2010-09-16
SK16022001A3 (sk) 2002-09-10
CA2372181A1 (en) 2000-11-23
KR20020001873A (ko) 2002-01-09
AU781469B2 (en) 2005-05-26
AU4847300A (en) 2000-12-05
UA76406C2 (en) 2006-08-15
BG106094A (en) 2002-05-31
MXPA01011499A (es) 2002-06-04
EE200100597A (et) 2003-02-17
HUP0201220A3 (en) 2004-07-28
CN1354675A (zh) 2002-06-19
CN1192799C (zh) 2005-03-16
CA2372181C (en) 2012-04-17
NZ515322A (en) 2004-03-26
ES2367625T3 (es) 2011-11-07
EP1178825B1 (en) 2011-07-13
BR0010539A (pt) 2002-02-19
JP4974414B2 (ja) 2012-07-11
CA2767116A1 (en) 2000-11-23
PL352312A1 (en) 2003-08-11
WO2000069456A3 (en) 2001-02-08
NO20015523L (no) 2002-01-02
KR100863367B1 (ko) 2008-10-13
IS6156A (is) 2001-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5230780B2 (ja) アジュバント混合製剤
CA2102918C (en) Genetic vaccine for immunodeficiency viruses
CZ174197A3 (en) Pharmaceutical composition indicating cytotoxic response of t-lymphocytes
Nardelli et al. Oral administration of an antigenic synthetic lipopeptide (MAP-P3C) evokes salivary antibodies and systemic humoral and cellular responses
Dotsika et al. Influence of Quillaja saponaria triterpenoid content on the immunomodulatory capacity of Epstein–Barr virus Iscoms
US20070025959A1 (en) Adjuvant combination formulations
AU2002225972A1 (en) Adjuvant combination formulations
KR101059721B1 (ko) 면역원성 조성물 및 의약
AU2596699A (en) Vaccines comprising interleukin-12 and respiratory syncytial viral antigens
ZA200304479B (en) Adjuvant combination formulations.
Becker et al. The immune modulator adamantylamide dipeptide stimulates efficient MHC class I restricted responses in mice
UA79426C2 (en) Combined adjuvant compositions

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
PNAN Change of the applicant name, address/residence

Owner name: WYETH HOLDINGS CORPORATION, US

ODBI Application refused