CN101951928B - 多聚γ谷氨酸在制备增强细胞免疫性的组合物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于改进细胞免疫性的组合物，其含有有效剂量的多聚γ谷氨酸，具体涉及含有多聚γ谷氨酸的用于改进细胞免疫性的组合物，所述组合物具有诱导TLR介导的Th1细胞免疫性增强并改善抗原递呈活性的效果以保持改善的活性的效果。本发明含有有效剂量的多聚γ谷氨酸的组合物具有非常小的毒性和副作用，并可被加入到疫苗组合物中预防和治疗动物病毒或者细菌感染或者癌症，或者加入到疫苗组合物中预防和治疗人类病毒或细菌感染和癌症，以显示细胞免疫性增强效果。

Description

多聚γ谷氨酸在制备增强细胞免疫性的组合物中的用途

技术领域

本发明涉及用于改进细胞免疫性的组合物，其含有有效剂量的多聚γ谷氨酸(γ-PGA)，具体涉及含有多聚γ谷氨酸的用于改进细胞免疫性的组合物，所述组合物具有诱导TLR介导的Th1细胞免疫性增强并改善抗原递呈活性(antigen presenting activity)的效果以保持改善的活性。 

背景技术

细胞免疫性和体液免疫性的概念是相对而言的，细胞免疫性是由抗原专一性T细胞或者抗原非专一性NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killercell)或者巨噬细胞诱导的免疫应答。 

体液免疫应答通过抗体诱导，其与细胞不相关，因此适于除去与细胞无关独立作用的抗原诸如细菌。但是，在抗原中，有一些不是存在于细胞之外的抗原，而是与宿主细胞相关，或者存在于细胞内部。例如，病毒是在宿主细胞中增殖的代表性例子，以及癌细胞由细胞本身的癌基因转录产生，于是大多数抗原与细胞相关或者存在于细胞内部。在这些情况下，有抗原存在的细胞内部的问题应当通过去除抗原而有效解决，但抗体不能直接穿透细胞，因此抗体难以与细胞中的抗原发生反应。虽然针对细胞表面抗原的抗体显示了其中抗体与细胞表面上的抗原结合的细胞毒性反应诸如ADCC(抗体依赖的细胞毒性，antibody dependentcellular cytotoxicity)，因此细胞由NK细胞或者巨噬细胞吞噬或者补体介导裂解，但需要诱导细胞介导的免疫应答以便有效除去位于细胞内的 抗原。也就是说，能够通过其中含有专一性抗原的细胞被消除的细胞免疫应答有效除去细胞相关抗原。 

根据效应物(effector)的功能，细胞免疫应答被分成两类：效应T细胞功能的抗原专一性免疫应答和抗原非专一性效应细胞的免疫应答，诸如自然杀伤细胞或者巨噬细胞。细胞毒性T细胞(CTL)-介导的应答是其中抗原专一性CTL直接作用于含有抗原的细胞已杀死含有抗原的细胞的免疫应答，其为典型的专一性免疫应答的一种。在T细胞中虽然介导迟发型超敏应答(delayed type hypersensitivity response)的CD4T细胞不能作为细胞介导的免疫应答的效应细胞(CD4效应T细胞)直接杀死细胞，但它们活化巨噬细胞，促进细胞介导的免疫应答。另外，NK细胞或者巨噬细胞还在细胞介导的免疫应答中起重要作用，尽管这些细胞是抗原非专一性细胞，但它们可识别异源细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞以及类似细胞并破坏它们。 

但是，所使用的大多数常规免疫佐剂(immunoadjuvant)没有得到安全保障(secured)，或者常规免疫佐剂对于增强体液免疫来说是有效的，但它们在预防和治疗病毒感染性疾病、肿瘤疾病等方面不是有效的。 

已经报道GlaxoSmithkline的预防性宫颈癌疫苗AS04佐剂显示了增强细胞免疫性的部分效果，但其有限地用于注射疫苗，因此不能经口服途径或者肌肉途径使用。 

大多数病原体透过粘膜表面，并且大多数感染初步发生在粘膜和粘膜下组织。因此，常规注射用疫苗(parenteral vaccine)在诱导粘膜免疫应答方面效率非常低，因此已经付出了相当大的努力来开发最佳粘膜免疫系统。作为这些努力中的一个，在粘膜下组织中改善抗原输送到免疫细胞中的免疫佐剂(脂质体，免疫刺激复合物以及中心体)已经被开发，并且还报道了使用其进行实验(Sjolander等人，J.Leukocyte Biol.64：713，1998)。但是，虽然粘膜下免疫性对于许多情况是有效的，但需要将粘 膜免疫系统与非粘膜(系统性)免疫系统组合以便在许多感染中诱导免疫应答。 

当考虑到上面提到的技术时，所选抗原物质的大量生产以及可将抗原物质的效果最大化并将其安全输送的成本效率高(cost-effective)的佐剂的开发称为所需的先决条件，以便开发具有商业竞争力并且有效的药物组合物。另外需要可经皮、口服、粘膜以及全身给药并调整和针对免疫应答的免疫佐剂。 

因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发更有效且安全的免疫佐剂，结果发现，由杆菌菌株产生的多聚γ谷氨酸具有增强TLR4介导的Th1细胞免疫性，增加抗原递呈活性，并保持增加的活性的效果，确定多聚γ谷氨酸作为CMI(细胞介导的免疫性)佐剂是有用的，并且当口服给药时是安全的，由此完成本发明。 

发明内容

因此，本发明的主要目的是提供增强细胞免疫性的组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

本发明的另一目的是提供预防和治疗人类病毒和细菌感染以及癌症的疫苗组合物，或者预防和治疗动物病毒和细菌感染的疫苗组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸，并具有增强细胞免疫性的效果。 

为了实现上述目的，本发明提供了增强细胞免疫性的组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

另外，本发明提供了通过增强细胞免疫性预防和治疗人类病毒或者细菌感染和癌症的疫苗组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

本发明提供了通过增强细胞免疫性预防和治疗动物病毒或者细菌感染的疫苗组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的上述和其他目的、 特征和实施方式将更加容易理解。 

附图说明

图1是显示多聚γ谷氨酸通过钟状(toll-like)受体4(TLR4)信号转导(signaling)对来自骨膜的巨噬细胞具有活化效果的结果。 

图2是显示多聚γ谷氨酸对树突细胞具有活化效果的结果。 

图3是显示由γ-PGA处理的自野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突变体C3H/HeJ小鼠的骨膜细胞分化而成的树突细胞分泌的IL-12p70的量的测量结果。 

图4显示了通过FACS分析得到的分泌IFN-γ的CD8+T细胞，以便检查根据树突细胞与T细胞之间的比例的T细胞活化。 

图5是显示通过分析根据树突细胞与T细胞之间的比例的T细胞活化的抗原递呈活性。 

图6是显示通过由siRNA的TLR4表达抑制的γ-PGA治疗对TLR4依赖性信号转导抑制的结果。 

图7是显示使用多聚γ谷氨酸作为细胞免疫性增强剂的包含乳酸菌(Lactobacillus)表面上表达的E7的疫苗组合物的抗癌效果的结果。 

图8是显示针对人CEA的体液免疫应答在小鼠中通过在其表面上表达CEA的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和含有γ-PGA的组合物诱导的结果。 

图9是显示针对人类CEA的细胞免疫应答通过在其表面上表达CEA的干酪乳杆菌和含有γ-PGA的组合物诱导的ELISPOT测定结果。 

图10是显示针对人类CEA的细胞免疫应答通过在其表面上表达CEA的干酪乳杆菌和含有γ-PGA的组合物诱导的FACS测定结果。 

图11是显示通过在其表面上表达CEA的干酪乳杆菌和含有γ-PGA的组合物给药的抗癌效果(肿瘤尺寸减小)的结果。 

图12是显示通过在其表面上表达CEA的干酪乳杆菌和含有γ-PGA的组合物给药的抗癌效果(存活率增加)的结果。 

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及改善细胞免疫性的组合物，其含有有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

在本发明中，用于改善细胞免疫性组合物的多聚γ谷氨酸的分子量优选为100kDa～15,000kDa，更优选1,000kDa～15,000kDa。 

在本发明中，确定多聚γ谷氨酸通过来自骨膜的巨噬细胞和树突细胞诱导了TLR介导的Th1细胞免疫性的增强，并提高了树突细胞的抗原递呈活性，由此保持了改善的活性。 

在本发明中，用于改善免疫性的组合物优选被加入到疫苗中以便预防和治疗人类病毒和细菌感染或者动物病毒和细菌感染，显示免疫增强效果。 

根据本发明，包括多聚γ谷氨酸作为有效成分的增强免疫性的组合物可根据常规制备方法制成口服剂型诸如粉末、颗粒，药片、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等，外用制剂，栓剂和用于注射的灭菌液。 

可包含在用于增强免疫性的组合物中的载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、白明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸、羟丙基苯甲酸、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。 

本发明的组合物可与常规稀释剂或者赋形剂诸如填料、膨胀剂、结合剂、湿润剂、分解质和表面活性剂制成制剂形式。用于口服给药的固体制剂包括片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊等，并且固体制剂通过将至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、白明胶等混合到药物组 合物中制成制剂。而且，润滑剂诸如硬脂酸镁和滑石粉也可加入到赋形剂中使用。用于口服给药的液体制剂包括悬浮剂，齐培丙醇(zipeprol)，乳液，糖浆等，并且除常规稀释剂诸如水和液体石蜡之外，各种赋形剂例如湿润剂、增甜剂、矫臭剂、防腐剂等可包含在其中。用于注射给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、冻干剂(lyophilizedpreparation)和栓剂。非水溶液和悬浮液包括菜油诸如丙二醇和聚乙二醇和橄榄油以及可注射酯诸如油酸乙酯等。栓剂的基本材料包括半合成脂肪酸酯(witepsol)、硬聚乙二醇(macrogol)、吐温(Tween)61、可可油、月桂脂(laurin butter)、甘油、白明胶等。 

在本发明的含有多聚γ谷氨酸作为有效成分的用于增强免疫性的药物组合物中，给予患者状况和体重、待治疗的疾病状态、剂量、给药途径和时间，γ-PGA可以不同剂量水平加入，但本领域技术人员可优化剂量水平，优选地，其可以0.001～10gPGA/kg个体重量的剂量给药，更优选以0.01～2gPGA/kg个体重量的剂量给药。 

如果γ-PGA以低于0.001gPGA/kg个体重量的剂量加入，免疫增强效果不能被预期，如果γ-PGA以超过10gPGA/kg个体重量的剂量加入，则由于粘度增加而难以以注射形式给药，并且当剂量增加时免疫增强效果保持不变，因此是不经济的。 

本发明的药物组合物可经各种途径给药到包括大鼠、小鼠的哺乳动物、家畜、人类等。例如，给药模式可包括口服和直肠给药，或者静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或者侧脑室(intracerebroventicular)给药途径。 

包括本发明的含有多聚γ谷氨酸作为有效成分的用于增强免疫性的组合物的功能食品和饲料添加剂可根据常规方法被制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、液体悬浮液等，并且本领域技术人员可确定优选剂量。 

在另一方面，本发明涉及通过增强细胞免疫性来预防和治疗疾病的疫苗组合物，其包括有效剂量的多聚γ谷氨酸。 

根据本发明的多聚γ谷氨酸诱导了TLR介导的Th1细胞免疫性的增强，并改善了抗原递呈活性以保持改善的活性，因此可预期其起到改善预防和治疗细胞内病毒感染、细菌疾病以及由细胞突变引起的肿瘤的作用。 

虽然报道的具有增强细胞免疫性的HPV/AS04疫苗(Giannini S.L.等人，Vaccine.14：5937，2006)仅仅可以注射形式得到，本发明的疫苗组合物具有的优点在于，其可经多种途径给药，诸如口服给药、鼻腔喷洒给药等等以及可注射形式给药。 

本发明的发明人提交了公开了含有多聚γ谷氨酸的佐剂组合物的专利申请(韩国专利注册号10-0517114)，该申请涉及通过所公开的佐剂组合物的体液免疫应答的诱导增加针对抗原的免疫应答，从而诱导高抗体滴度的组合物，即便在与组合物一起使用的抗原的免疫原性很低的情况下也是如此。 

本发明提供了用于增强细胞免疫性的组合物，其包括具有高分子量的有效剂量的多聚γ谷氨酸，并可诱导针对抗原的更有效的细胞免疫应答，所述抗原与宿主细胞相关或者存在于细胞内并且诱导的体液免疫应答抗体对其没有效果。虽然诱导体液免疫的抗体不能直接渗透到细胞内，因此难以与细胞内部的抗原发生反应，但根据本发明的用于增强细胞免疫性的组合物可实现细胞免疫的增强，与宿主细胞相关或者存在于细胞内的抗原例如病源诸如在宿主细胞中增殖的代表性的例子病毒，以及通过细胞本身转录产生的癌细胞可通过所述细胞免疫的增强被有效消除。由于这些性质，使用具有低细胞免疫原性诸如灭活疫苗和亚单位疫苗的抗原将组合物加入到疫苗组合物中，由此使疫苗组合物能够具有增强的免疫效果。 

实施例 

此后，将通过是实力更为详细地对本发明进行描述。但是应当理解的是，这些是实力仅仅用于说明的目的，而不解释为限制本发明的范围。 

实施例1：γ-PGA的生产及其分子量的测定 

在含有用于γ-PGA生产的3L基本培养基(GS培养基，含有5％L-谷氨酸：5％葡萄糖，1％(NH₄)₂SO₄，0.27％KH₂PO₄，0.42％Na₂HPO₄·12H₂O，0.05％NaCl，0.3％MgSO₄·7H₂O，维生素溶液1ml/L，pH 6.8)的5L发酵罐中接种1％的Bacillus subtilis var chungkookjang(KCTC 0697BP)培养液，然后在150rpm的搅拌速度、1vvm的空气注入率和37℃的温度下培养72小时。在培养完成后使用滤纸从培养液中除去细胞，由此得到含有γ-PGA的样品液。 

将2N的硫酸溶液加入到含有γ-PGA的样品液中并在10℃静置12小时以收集γ-PGA沉淀。使用Nutsche过滤器以过量的蒸馏水洗涤沉淀以得到γ-PGA。将得到的多聚γ谷氨酸使用合适的方法切割以得到具有均一分子量的γ-PGA待用，或者根据分子量分离PGA待用，并使用GPC(凝胶渗透柱，gel permeation column)测定其分子量，在以下实施例中使用具有平均分子量为10kDa和2000kDa的多聚γ谷氨酸进行实验。 

实施例2：γ-PGA口服给药时的毒性检测结果 

为了检查γ-PGA口服给药的安全性，使用小鼠进行多聚-γ-谷氨酸单独口服给药的毒性检测由GLP(Good Laboratory Practice)认可的Biotoxtech公司根据Biotoxtech Standard Operating Procedures(SOPs)，Good Laboratory Practice(GLP)规则和检测指南来进行。 

使用10只6周龄的雄鼠(159.76～177.27g)和10只雌鼠(121.60～138.80g)，并且给药到单个小鼠的γ-PGA的剂量以给药当天禁食后测定的体重为基础进行计算。给药前所有小鼠被禁食16小时但可自由接近饮用水，然后使用单剂量的γ-PGA通过使用连接有用于口服给 药的导管的一次性注射器(5ml)的胃管对它们进行强制口服给药，接着在给药后喂养饲料4小时。 

作为初步实验，将100mg/ml的γ-PGA分别以20ml/kg的单剂量口服给药到2只雄鼠和2只雌鼠，结果没有观察到死鼠，因此使用2000mg/20ml/kg作为单剂量。与给药到实验组的实验材料相同剂量的赋形剂给药到对照组，待给药的剂量被设定为20ml/kg。 

结果，如表1中所示，在观察阶段没有观察到由γ-PGA口服给药引起的死亡和一般症状。在观察阶段，观察到对照组和实验材料被给药的实验组中雄鼠和雌鼠的体重增加。在对照组和实验材料被给药的实验组的雄鼠和雌鼠中尸体解剖结果没有揭示任何肉眼可见的异常发现。通过单次γ-PGA口服给药到小鼠的结果，由实验材料引起的一般症状和死亡没有被观察到，因此可以确定在雌鼠和雄鼠中γ-PGA的致死计量超过2000mg/kg。 

表1 

实施例3：由TLR4信号转导介导的γ-PGA对来自骨膜的巨噬细胞中的细胞因子TNF-α和IP-10的诱导效果 

为了检查多聚-γ-谷氨酸通过TLR4(Toll Like Receptor 4)对来自骨膜的巨噬细胞(BMDM)活化的影响，使用分离自正常野生型小鼠 (C3H/HeN，Japan SLC，Inc.)和TLR4-突变小鼠(C3H/HeJ，Japan SLC，Inc.)的巨噬细胞，使用ELISA试剂盒测定了γ-PGA对诱导细胞因子TNF-α和IP-10(INF-γ-可诱导蛋白)的分泌的能力，所述细胞因子由活化巨噬细胞分泌的。 

首先，为了培养来自骨膜的巨噬细胞，将六到八周龄C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠的长骨和短骨取出，切割骨接头的两侧，然后使用具有27G针的5ml注射器使用RPMI1640(Gibco，USA)从其中提取骨膜。然后，使用TAC缓冲液(8.3g/L氯化铵，10mM Tris-HCl，pH 7.4)除去红细胞，并将500μl细胞悬液以5x10⁵个细胞/孔的密度分散到24孔板中，接着将RPMI 1640(加入了100U/ml盘尼西林-链霉素，10％FBS)和M-CSF(20ng/ml，peprotech，USA)加入到其中，在CO₂培养箱中37℃下将细胞培养6天以便分化成巨噬细胞。在培养的第三天，进一步加入相同量的M-CSF并培养。 

培养6天后，使用RPMI 1640以各种浓度稀释1mg/ml的多聚γ谷氨酸(10kDa和2000kDa)并加入到分化的巨噬细胞中培养24小时。此时，将阳性对照组使用100ng/ml的已知促进TNF-α和IP-10诱导的LPS(脂多糖)处理。 

培养完成之后，收集每个孔的上清液，然后使用Mouse TNF-αELISA试剂盒(BD Bioscience，USA)测定培养液中存在的TNF-α的浓度，并使用Mouse IP-10ELISA试剂盒(R&D，USA)测定IP-10的浓度。 

特别是，测定按照如下方式进行：将100μl的TNF-α或者IP-10标准溶液和100μl上清液加入到使用抗鼠TNF-α或者IP-10单克隆抗体包被的96孔板中并允许在室温下反应1小时，然后使用缓冲液(300μl/孔)洗涤5次，接着加入100μl初级抗体、生物素化的抗鼠TNF-α或者IP-10抗体，此后，得到的细胞悬液在室温下反应1小时，并使用洗涤缓冲液洗涤5次。然后，将100μl次级抗体，抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结 合体加入到其中并允许在室温下反应30分钟，洗涤5次，然后与显色剂TMB溶液反应20分钟，接着使用50μl终止液使显色终止，使用ELISA阅读仪在450nm处测定吸收，由此通过使用标准溶液得到的结果绘出的标准曲线分析TNF-α或者IP-10的浓度。图1中的A是通过测定分泌的TNF-α的量得到的结果，图1中的B是通过测定分泌的IP-10的量得到的结果。 

如图1所示，当使用具有10kDa低分子量的多聚-γ-谷氨酸处理来自野生型小鼠(C3H/HeN)骨膜的巨噬细胞时，不分泌细胞因子，但当使用具有2000kDa分子量的多聚-γ-谷氨酸和LPS处理来自骨膜的巨噬细胞时，观察到TNF-α和IP-10分泌的增加，并且TNF-α和IP-10的分泌量取决于具有2000kDa分子量的多聚-γ-谷氨酸的浓度。TNF-α分泌的增加表明最初感染免疫性的增强被TLR4介导所诱导。 

但是，当使用多聚-γ-谷氨酸(2000kDa)处理来自TLR4(钟状受体4)突变C3H/HeJ小鼠骨膜的巨噬细胞时，观察到与野生型小鼠(C3H/HeN)相比分泌的细胞因子的量有所降低。该结果表明，多聚-γ-谷氨酸通过TLR4信号转导活化了来自骨膜的巨噬细胞。 

实施例4：γ-PGA通过TLR4对来自骨膜的树突细胞活化的影响 

由于树突细胞在初级免疫应答以及T淋巴细胞的分化与活化中与巨噬细胞一起起重要作用，检查了多聚-γ-谷氨酸对树突细胞的活化的影响。另外，为了检查TLR4通过多聚-γ-谷氨酸对来自骨膜的树突细胞(BMDC)活化的诱导的影响，将分离自TLR4野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突变C3H/HeJ小鼠的骨膜细胞分化成树突细胞，然后使用。 

为了分化成树突细胞，将骨膜细胞以1x10⁶个细胞/孔的密度分散到12孔板中，在含有GM-CSF(Granulocyte巨噬细胞克隆-刺激因子，20ng/ml)和白介素(IL)-4(10ng/ml)的RPMI 1640(加入了100U/ml盘尼西林-链霉素和10％FBS)培养基中培养7天，然后使用。 

将培养的来自骨膜的树突细胞悬液使用多聚-γ-谷氨酸(多聚-γ-谷氨酸：10kDa，2000kDa)稀释至浓度为0.1％，分别培养12小时。此时，将阳性对照组加入1μg/ml的LPS(脂多糖)。培养完成后，收集每孔中的树突细胞，检查细胞表面上的成熟表面标记物的表达。 

为了检查成熟表面标记物的表达，在细胞使用标记有荧光染料的抗体(抗-CD40-FITC，抗-CD80-PE和抗-CD86-PE)4℃染色1小时之后，CD40、CD80和CD86的表达使用FACSCalibur^TM流式细胞仪检查。 

结果，如图2所示，通过使用来自TLR4野生型C3H/HeN小鼠骨膜的树突细胞的实验结果，观察到成熟表面标记物在使用LPS处理的阳性对照组和使用具有2000kDa高分子量的γ-PGA处理的组中高表达。但是，可以确定在使用来自TLR4野生型C3H/HeN小鼠骨膜的树突细胞的实验中成熟表面标记物的表达水平显著下降。 

实施例5：γ-PGA通过TLR4对来自骨膜的树突细胞中的IL-12分泌的影响 

如在实施例3中描述的样，从TLR4野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突变C3H/HeJ小鼠中分离的骨膜细胞被分化成树突细胞，然后使用多聚-γ-谷氨酸(多聚-γ-谷氨酸：10kDa，2000kDa)将细胞悬液稀释到浓度为0.1％，分别培养24小时，然后，收集每种培养的上清液以便使用鼠IL-12p70 ELISA试剂盒(BD biosciences，USA)测定培养上清液中IL-12p70的浓度。 

将100μl的IL-12p70标准溶液和100μl培养上清液加入到施用抗鼠IL-12p70单克隆抗体包被的96孔板中并在室温下反应2小时，使用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤3次。然后，将得到的细胞悬液加入100μl初级抗体-生物素化的抗鼠IL-12p70多克隆抗体并在室温下反应2小时，使用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤3次。此后，将100μl次级抗体-链霉素-辣根过氧化物酶结合物加入到其中并在室温下反应1小时，洗涤5次， 然后与显色剂TMB溶液反应30分钟，接着使用50μl终止液终止颜色形成，使用ELISA阅读仪在450nm处测定吸收，由此分析IL-12p70的量。 

结果，如图3所示，多聚-γ-谷氨酸(2000kDa)在来自TLR4野生型C3H/HeN小鼠的骨膜的树突细胞中诱导了高水平的IL-12p70分泌，与使用LPS处理的阳性对照组相同。但是发现，IL-12p70的分泌水平在来自TLR4突变C3H/HeJ小鼠的骨膜的树突细胞中显著降低。 

如图2和图3所示，可以确定多聚-γ-谷氨酸可活化树突细胞并诱导在细胞免疫性增强中涉及的IL-12细胞因子，并如同在巨噬细胞中看到的那样，树突细胞活化是分子量依赖性的。此外，通过在野生型小鼠中显著增加的树突细胞活化因子在TLR4突变小鼠中显著降低的事实可以看出，多聚-γ-谷氨酸以在阳性对照组中使用的LPS相同的方式通过TLR4信号转导活化树突细胞。 

实施例6：γ-PGA在树突细胞中对抗原递呈活性增强的作用 

作为专一性抗原递呈细胞的树突细胞通过细胞表面MHC分子将抗原递呈给T细胞活化T细胞。为了检查多聚-γ-谷氨酸是否增加树突细胞中的抗原递呈活性，进行了混合的淋巴细胞反应。 

将由小鼠骨膜细胞分化的树突细胞接种至密度为1x10⁶个细胞/ml，并使用LPS(1μg/ml)或者2000kDa的多聚-γ-谷氨酸(1mg/ml)刺激12小时，然后使用1μg/ml的MHC族I-限制的E7肽(aa 49-57，AniGen，Korea)处理1小时，使用RPMI-1640培养基洗涤2次。将由此得到的树突细胞与HPV16 E7aa 49-57肽专一性T细胞以在图4中示出的比例在含有1μg/ml GolgiPlug的培养基中37℃混合培养过夜。 

为了检查活化的T细胞，通过FACS分析了分泌IFN-γ的CD8+T细胞的分布。具体说来，在对细胞进行洗涤之后，然后使用对T细胞表面分子CD8(PE-结合的抗鼠CD8)专一的抗体在4℃染色1小时，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Bioscience，USA)使用对IFN-γ(FITC 结合的抗鼠IFN-γ)专一的抗体对IFN-γ进行染色。 

如图4所示，可以确定当树突细胞与T细胞之间的比例增大时，没有刺激的细胞不能增加T细胞活性，而当树突细胞与T细胞之间的比例增大时，使用多聚-γ-谷氨酸(2000kDa)处理的树突细胞显著增加了T细胞活性。特别是，当树突细胞和T细胞以1∶100的比例混合培养时，结果显示活化的T细胞为8.68±0.4％，这是比较高的值，并类似于由使用LPS处理的阳性对照组得到的8.39±0.6％。因此确定多聚-γ-谷氨酸增加了树突细胞中的抗原递呈活性以诱导T细胞的活性(图5)。 

实施例7：通过使用siRNA抑制的TLR4基因表达的γ-PGA对TLR4-依赖型信号转导降低的检查 

将对照siRNA(分类号.D-001210-0，Dharmacon，USA)和siTLR4(分类号.M-047487-00，Dharmacon，USA)分别在500μl的5x siRNA缓冲液中稀释，并将50μl稀释液分散并在-20℃下储存。为了瞬时转染，将RAW 264.7细胞(KCLB 40071)在100 

培养板上培养至密度为2x10⁵个细胞/ml。使用0.5％Trypsin-EDTA收集培养的细胞并使用PBS洗涤3次。将得到的细胞使用siTLR4或者对照siRNA通过电转化瞬时转染(transient transfection)。将细胞悬浮在20μl电转缓冲液中，并将每10μl悬浮液分散到两个管中，然后分别加入10μl对照siRNA和siTLR4并在冰上放置5分钟。在置于冰上5分钟之后，进行电穿孔(2脉冲，1230V电压)。将瞬时转染的细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM培养液中。 

首先，通过siTLR4的TLR4 mRNA表达的抑制使用RT-PCR进行检查。使用对照siRNA和siTLR4将RAW264.7细胞进行瞬时转染，培养48小时，并收集细胞。使用PBS将收集的细胞洗涤2次，并使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)得到总RNA。使用2μg得到的总RNA，通过M-MLV逆转录酶(Promega，USA)合成cDNA。使用下列引物对合成的cDNA进行扩增：专一性识别TLR4的有义链：5′-GCA TGG CTT ACA CCA CCT CT-3′(序列号：1)，反义链：5‘-GTG CTG AAA ATC CAG GTG CT-3′(序列号：2))，并且PCR扩增条件包括30个循环：95℃下60秒，65℃下60秒以及72℃下80秒。作为阳性对照，下列引物：识别β-肌动蛋白的有义链：5′-GCT ACA GCT TCA CCA CCA CA-3′(序列号：3)，反义链：5′-CTA CGT ACT CCT GCT TGC TG-3′(序列号：4)在下列PCR条件下被用于扩增cDNA，包括30个循环：94℃下45秒，56℃下45秒以及72℃下45秒。扩增的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳以检查TLR4(950bp)和β-肌动蛋白(450bp)的表达。 

结果可以看出，TLR4mRNA的表达在siTRL4-转染的细胞中显著降低，而TLR4mRNA在使用对照siRNA转染的细胞中正常表达(图6)。 

为了检查蛋白质表达的抑制，进行了使用FACSCaliber的免疫荧光测定和流式细胞分析(flow cytometric analysis)。为了进行免疫荧光测定，将RAW 264.7细胞使用对照siRNA和siTLR4瞬时转染，培养48小时并收集细胞。将收集的细胞附着在盖玻片上至密度为2x10⁴个细胞/ml。使用PBS对附着到盖玻片上的细胞洗涤2次，加入溶解在TBS-T(缓冲液，含有0.05％Tween-20的TBS)的2％BSA稀释液，然后在室温下静置1小时。将抗-TLR4抗体(Santa cruz，USA)在2％BSA稀释液中稀释至1∶100并允许在室温下反应2小时，使用TBS-T缓冲液洗涤3次。洗涤之后，将FITC(异硫氰酸荧光素)-结合IgG抗体(Sigma，USA)在2％BSA稀释液中以1∶200稀释并在室温下静置30分钟，使用TBS-T缓冲液洗涤3次，然后使用Axioskop荧光倒置显微镜(Carl Zeiss，German)观察细胞的荧光。作为免疫荧光测定的结果，可以看到在siTRL4-转染的细胞中荧光显著降低，然而在显微镜下观察的所有对照siRNA-转染的细胞的表面上探检测到荧光。因此，可以确定siTLR4抑制了TLR4蛋白的表达(图6)。 

为了进行FACS分析，使用对照siRNA和siTLR4对RAW264.7细 胞进行瞬时转染，培养48小时以收集细胞。使用PBS将收集的细胞洗涤2次，并加入溶解在TBS-T(缓冲液，含有0.05％Tween-20的TBS)的2％BSA稀释液，然后在室温下静置1小时。将抗-TLR4抗体在2％BSA稀释液中稀释至1∶100并允许在4℃室温下反应1小时，使用TBS-T缓冲液洗涤3次。洗涤之后，将FITC-结合IgG抗体在2％BSA稀释液中以1∶200稀释并在4℃下静置30分钟，使用TBS-T缓冲液洗涤3次，然后通过FACS Caliber(BD Bioscience，USA)分析荧光密度。结果可以确定，与荧光显微镜分析类似，siTLR4抑制了TLR4受体的表达(图6)。 

为了检查多聚-γ-谷氨酸是否诱导了细胞内TLR4信号转导，使用siRNA对TLR4基因表达进行抑制以测定TLR4-依赖型细胞因子TNF-α的细胞内分泌。 

使用对照siRNA和siTLR4对RAW264.7细胞进行瞬时转染，培养48小时，并使用LPS(100ng/ml)、10kDa的多聚-γ-谷氨酸(1mg/ml)和2000kDa的多聚-γ-谷氨酸(1mg/ml)刺激，培养24小时。刺激24小时之后，收集培养液，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience，USA)测定分泌的TNF-α。 

首先，将TNF-α捕获抗体在96孔板中以1∶250稀释，并在4℃下静置16小时。测定稀释液加入到包被有TNF-α捕获抗体的板上并在室温下静置1小时以抑制非专一性反应。非专一性反应抑制后，使用洗涤液洗涤抗体包被的板3次，每孔中分别加入100μl培养液，然后37℃下静置2小时。加入细胞培养液后，将100μl TNF-α测定抗体和抗生物素蛋白HRP(辣根过氧化物酶结合)抗体(1/250稀释)的混合溶液加入到每个孔中并在37℃下静置2小时，洗涤3次。洗涤后，将100μl TMB底物(显色剂)加入到每个孔中，在室温下静置30分钟以产生颜色，由此测定450nm处的吸收。 

结果，如图6所示，可以确定，与对照组相比(使用PBS处理的细 胞)，在对照siRNA转染后使用LPS和2000kDa的多聚-γ-谷氨酸处理的细胞培养液中TNF-α的浓度显著增加，而与使用对照siRNA转染的细胞培养液相比，在使用siTLR4转染后使用LPS和2000kDa的多聚-γ-谷氨酸处理的细胞培养液中TNF-α的浓度显著降低。但是，在对照siRNA转染后，与对照组相比使用10kDa的多聚-γ-谷氨酸处理的细胞培养液中TNF-α的浓度增加，但在siTLR4转染的情况下显示TNF-α的浓度没有差别。因此，在其中TLR4基因表达受到siTLR4抑制的细胞中检查已知为TLR4配体的LPS和2000kDa的多聚-γ-谷氨酸对TLR4-依赖型细胞因子TNF-α的分泌的影响时得到了类似结果，表明2000kDa的多聚-γ-谷氨酸诱导了TLR4-依赖型信号转导。 

实施例8：通过多聚-γ-谷氨酸对具有在其表面上表达HPV抗原蛋白的乳酸菌的癌症疗效改善的检查 

使用在表面上表达抗原蛋白的微生物作为疫苗的情况下，检查了具有高分子量的多聚-γ-谷氨酸作为细胞介导的免疫应答(CMI-辅助)的佐剂是否起作用以改善抗原专一性抗癌效果。 

使用用于人类乳头瘤病毒(HPV)诱导的宫颈癌的动物模型，将具有在其表面上表达的抗原蛋白质E7的乳酸菌用作治疗性疫苗的主要抗原成分，并使用根据使用或不使用多聚-γ-谷氨酸的具有在其表面上表达的抗原蛋白质E7的乳酸菌给药的两个实验组比较细胞介导的免疫性增强效果。 

使用来自Bacillus sp.的在多聚-γ-谷氨酸合成中涉及的膜外蛋白基因(pgsA，pgsB and pgsC)中的pgsA基因，将革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物用作宿主来构建能够表达HPV专一性抗原E7的载体pHCE2LB：pgsA-HPV-E7，由此通过将构建的载体转化到干酪乳杆菌中得到在其表面上具有表达的E7的乳酸菌。 

按照如下方式制备构建的表面表达抗原蛋白E7的pHCE2LB： pgsA-HPV-E7。使用在人类乳头瘤病毒基因组DNA(GenBank accessionNo.K02718)中编码HPV-E7的DNA片段作为模板(序列号：5)，以引物序列号：6(5′-cgcggatccatgcatggagatacacc-3′)和序列号：7(5′-cgctctagattatggtttctgagaacag-3′)进行PCR反应，得到315bp的片段，并使用BamHI和XbaI限制酶消化得到的DNA片段以得到插入片段。将插入片段插入到使用BamHI和XbaI限制酶消化的pHCE2LB：pgsA-HPVL1(KCTC 10349BP：转化为pHCE2LB：pgsA-HPVL1的Escherichia coli)的HPVL1中，构建pHCE2LB：pgsA-HPV-E7。 

为了在细胞表面上表达E7蛋白质，将表面表达载体pHCE2LB：pgsA-HPV-E7转化到干酪乳杆菌中构建在其表面上表达E7的转化体，然后将转化体在37℃下在MRS培养基(Lactobacillus MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中静止培养，以诱导表面表达。 

使用注射了表达E7，TC-1(ATCC CRL-2785)的癌细胞的C57BL/6小鼠(Dae Han Biolink Co.，Ltd.，韩国)，检查以构建的表达E7抗原的乳酸菌和多聚-γ-谷氨酸口服给药的注射了癌细胞的小鼠的存活率和仅以表达E7抗原的乳酸菌给药的注射了癌细胞的小鼠的存活率。 

首先，对于每组准备十只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并将2x10⁴TC-1癌细胞皮下注射(s.c.)到左侧股的内侧以诱导肿瘤。在癌细胞注射3天后，具有在其表面上表达E7抗原的乳酸菌(2x10⁹)以及乳酸菌和400μg的2000kDa多聚-γ-谷氨酸的混合物每周口服给药5次，给药两周，在一周的休息阶段之后给以第一次增强(boost)，并一周的另一个休息阶段之后给以第二次增强。 

结果，如图7所示，确定在仅仅使用在其表面上具有表达的E7抗原的乳酸菌口服给药的实验组中在癌细胞注射之后所有小鼠在90天内死亡，而在以乳酸菌和γ-PGA的混合物口服给药的实验组中在注射癌细胞 之后所有小鼠在150天内都死亡，表明γ-PGA增加了存活率。因此，可以确定多聚-γ-谷氨酸作为口服疫苗的细胞介导的免疫应答的佐剂(CMI-佐剂)起作用，改善了针对专一性抗原的抗肿瘤效果。 

实施例9：含有多聚-γ-谷氨酸和在其表面上具有表达的癌胚抗原CEA的乳酸菌组合物的癌症治疗效果 

在作为疫苗的主要抗原成分的在其表面上表达CEA(癌胚抗原)的乳酸菌中加入作为用于细胞介导的免疫应答佐剂(CMI-佐剂)的具有高分子量的多聚-γ-谷氨酸以检查抗癌效果。 

为了得到能够在其表面上表达CEA的构建体，使用含有人类CEA基因的1683bp DNA(序列号：8)作为模板，以引物序列号：9(5′-cgcagatctccggagctgcccaagccc-3′)和序列号：10(5′-cgctctagatcatatcagagcaaccccaacc-3′)进行PCR反应，以得到1704bpDNA片段，并使用BglII和XbaI限制酶消化得到的片段，以得到插入片段。将插入片段插入到使用BamHI和XbaI限制酶消化的pHCE2LB：pgsA-HPVL1(KCTC 10349BP：转化为pHCE2LB：pgsA-HPVL1的Escherichia coli)的HPVL1中，如在实施例8中描述的那样构建pHCE2LB：pgsA-HPV-hCEA。 

为了在细胞表面上表达CEA蛋白质，将表面表达载体pHCE2LB：pgsA-HPV-E7转化到干酪乳杆菌中构建在其表面上表达hCEA的转化体，然后将转化体在37℃下在MRS培养基(Lactobacillus MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中静止培养，诱导表面表达。 

1)体液免疫应答 

将在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和多聚-γ-谷氨酸口服和鼻腔给药到小鼠给定时间段，然后在过表达CEA的细胞皮下注射之前检查小鼠血液中针对CEA的体液免疫应答。 

准备2组每组包括十五只5周龄雌性C57BL/6小鼠(Dae Han BiolinkCo.，Ltd.，Korea)作为实验组和对照组，并将在其表面上具有表达的CEA的1x10¹¹个干酪乳杆菌和100μl 1％的多聚-γ-谷氨酸(分子量7000kDa)的混合物作为单日剂量在第一周对实验组小鼠口服给药5天，在第二周口服给药5天(共10天)，并在第四周和第六周分别给以5天的强化。在鼻腔给药的情况下，将在其表面上具有表达的CEA的1x10¹⁰个干酪乳杆菌和10μl 1％的多聚-γ-谷氨酸(分子量7000kDa)的混合物作为单日剂量在第一周和第二周以两天为间隔对实验动物给药(共四天)，并分别在第四周和第六周给以两天强化。 

将在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌给药之前从每只小鼠获取预先免疫(Preimmune)的血清，并在第三周(初级血清)、第五周(次级血清)和第七周(三级血清)从每只小鼠获取血清，分析体液免疫效果。将对照组的小鼠以在其表面上没有表达CEA的干酪乳杆菌以与实验组相同的时间段以1x10¹¹/天的剂量给药给药。 

在实验组小鼠和对照组小鼠中对于CEA的体液免疫是否被诱导使用ELISA方法检查。首先，将96孔Nunc-免疫板包被CEA抗原(Fitzgerald，USA)。将在0.1M碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中稀释至100ng/100μl的浓度的抗原加入到每个孔中并在4℃静置过夜，由此使用CEA包被每个孔。使用PBST将CEA-包被的板洗涤3次，使用10％的溶解在PBS(封闭液)中的脱脂奶封闭2小时，允许其在37℃下与初级抗体(小鼠血清)反应2小时，并允许其与过氧化物酶结合的次级抗体反应1小时。在每个步骤中，使用PBS-T将板洗涤5次。然后将TMB底物溶液(BDBiosciences，USA)加入到每个孔中并允许在室温下反应20分钟，使用0.2N H₂SO₄终止液终止反应，然后使用ELISA阅读仪测定450nm处的吸收，以测定小鼠血清中IgG抗体对AFP的滴度(图8)。 

结果，如图8所示，可以确定对照组血清中对CEA的IgG抗体滴度 在给药期间没有明显变化，而实验组血清中对CEA的IgG抗体滴度在给药期间增加。通过上述结果可以确定，针对人类CEA的体液免疫应答通过含有在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和多聚-γ-谷氨酸的组合物在小鼠中被诱导。 

2)细胞介导的免疫应答 

将在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和多聚-γ-谷氨酸口服和鼻腔给药到小鼠给定时间段，然后检查针对CEA的小鼠脾脏T细胞免疫应答。 

为了检查对在干酪乳杆菌的表面上表达的CEA的细胞免疫应答，首先，从上述1)中的组的15只小鼠中选择5只小鼠，然后取出每只小鼠的脾脏并将其置于含有15ml RPMI培养基(Gibco BRL，USA)的管中。将脾脏转移到无菌培养皿中，并通过在两片载玻片之间挤压器官得到脾脏和胸腺细胞悬液。将培养皿中的细胞悬液转移到含有RPMI培养基的50ml管中，将含有细胞悬液的管置于冰上15-20分钟，然后将40-45ml上清液转移到新的50ml管中。将每个管在1600-2000rpm下离心10分钟，并将除去了上清液的小球添加10ml事先加热的TAC缓冲液[10mMNH4Cl，Tris-Cl(pH7.4)]使细胞悬浮，然后在保持37℃的水浴中静置10分钟使红细胞溶血。通过使用玻璃管对细胞进行搅拌将它们附着到吸管上除去溶血的红细胞，然后加满RPMI培养基。将管中的细胞使用RPMI培养基洗涤2次并悬浮在RPMI 1640培养基中以分离脾细胞。 

通过下列两种方法使用从使用在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和γ-PGA免疫的小鼠和未处理小鼠中分离的脾细胞检查对CEA的细胞介导的免疫应答。 

ELISPOT测定 

ELISPOT测定首先在细胞免疫应答的测定方法中进行。将ELISPOT板(BD ELISPOT Mouse IFN-γSet，USA)使用PBS(pH 7.2)中1∶200 稀释的IFN-γ专一性抗体包被，然后静置过夜。将100μl分离的脾细胞和胸腺细胞以2x10⁶个细胞/ml的密度分散到每个孔中，并允许反应2小时，然后将7μl/ml的CEA肽[EAQNTTYL](AnyGen，Korea)加入到每个孔中并允许在5％CO₂的条件下37℃下反应48小时。反应后，使用PBS-T将每个孔洗涤5次，将以1∶250稀释的100μl生物素化的次级抗体(BDBiosciences，USA)分散到每个孔中，然后允许在室温下反应2小时。然后，使用PBS-T将每个孔洗涤5次，并将1∶200稀释的100μl酶结合试剂(链霉素-HRP)试剂(BD Biosciences，USA)加入到每个孔中，然后允许反应1小时，接着再次使用PBS-T和PBS洗涤5次，在底物溶液(BD AEC Substrate Reagent Set，USA)颜色形成之后使用ELISPOT板阅读仪(BD Biosciences，USA)分析出现的斑点的数量(图9)。 

结果，如图9所示，观察到在实验组中斑点的数目与对照组相比显著增加。通过该结果可以确定，对CEA的脾T细胞免疫性在使用在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和PGA给药的小鼠中被活化。 

细胞内细胞因子染色(IFN-γ染色) 

将分离的脾细胞分散到24孔板中至密度为3x10⁶个细胞/孔，并允许在5％CO₂的条件下37℃下反应48小时，然后将7μg/ml的CEA肽[EAQNTTYL](AnyGen，Korea)分散到每个孔中并允许反应2小时。反应后，将4μl的Golgi终止液(BD Golgi STOP，USA)加入到每个孔中，并允许在5％CO₂的条件下37℃下反应9小时。将使用肽刺激的每个孔中的细胞1600rpm离心5分钟，并将CD8-PE抗体(Phycoerythrin；BD Biosciences，USA)在FACS染色缓冲液中(DPBS，1％FBS，0.09％sodium azide)稀释至1∶200以便与细胞混合，然后允许在4℃下反应30分钟。使用FACS染色缓冲液将每个孔洗涤2次并加入200μl的Fixation/Permeablization试剂盒(BD Cytofix/Cytoperm，USA)，然后允许在4℃下反应20分钟，此后，使用BD perm洗涤缓冲液(BD Cytofix/Cytoperm，USA)将每个孔洗涤2次，并将IFN-γ-FITC抗体(BDBiosciences，USA)在BD perm洗涤缓冲液中以1∶200稀释以与细胞混合，然后允许4℃下反应30分钟，洗涤2次，接着将细胞悬浮在300μl FACS染色缓冲液中，使用FACS Caliber(Becton Dickinson and company)进行分析(图10)。 

结果，如图10所示，确定与对照组相比，作为在抗癌活性中涉及的细胞因子的IFN-γ在实验组的细胞介导的免疫性中涉及的小鼠脾脏CD8+T细胞中高水平表达。 

如上所述，通过上述ELISPOT测定和细胞内细胞因子染色(IFN-γ染色)两种方法确定，在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和多聚-γ-谷氨酸的混合组合物通过刺激小鼠脾脏T细胞诱导了对CEA的细胞免疫应答。 

3)在其表面上具有表达的CEA的微生物和多聚-γ-谷氨酸的混合组合物对皮下结肠癌模型的保护性抗癌免疫性的影响 

在癌细胞注射8周后，使用30计量针(gauge needle)将过表达CEA的5x10⁶个MC38 CEA2细胞(Robbins PF等人，Cancer research 51：3657，1991)皮下注射到在上述1)中描述的实验组和对照组小鼠左股区，检查小鼠肿瘤形成和死亡率(图11和图12)。 

结果，如图11所示，发现在癌细胞注射之后第五周，对照组中的小鼠显示了超过3500mm³的癌细胞增殖区，而在使用在其表面上具有表达的CEA的干酪乳杆菌和PGA给药的实验组中显示大约1500mm³的癌细胞增殖区。 

另外，如图12所示，在癌细胞注射之后超过50天测定死亡率的结果，发现对照组中的小鼠在癌细胞注射之后第30天开始死亡，之后观察到快速死亡，而实验组中的小鼠在第40天开始死亡，并且观察到与对照组相比死亡相对较慢。此外，在第43天，对照组的小鼠显示100％的死 亡率，而实验组的小鼠显示超过40％的存活率。上述结果表明小鼠中的癌细胞增殖受到包括在其表面上具有CEA的乳酸菌和多聚γ谷氨酸的混合物的的疫苗组合物的抑制。 

工业实用性 

如上面详细描述和说明的那样，本发明的包括有效剂量的多聚γ谷氨酸的组合物具有非常小的毒性和副作用，并可被加入到疫苗组合物中预防和治疗动物病毒或者细菌感染或者癌症，或者加入到疫苗组合物中预防和治疗人类病毒或细菌感染和癌症，显示细胞免疫性增强效果。 

虽然已经参照特别说明的实施方式对本发明进行了详细描述，但本发明不由这些实施方式限定，而是仅由随附的权利要求书限定。对本领域技术人员来说应当理解的是可对这些实施方式进行改变或修改，都不偏离本发明的范围和精神。 

FP10KR1000-序列表

<110>生物领先公司

     韩国生命工学研究院

<120>含有多聚γ谷氨酸的用于改进TLR介导的细胞免疫的组合物

<130>FP10KR1000

<140>PCT/KR2007/005027

<141>2007-10-15

<150>10-2007-0103161

<151>2007-10-12

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>1

gcatggctta caccacctct                                                20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>2

gtgctgaaaa tccaggtgct                                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>3

gctacagctt caccaccaca                                                 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>4

ctacgtactc ctgcttgctg                                                 20

<210>5

<211>297

<212>DNA

<213>Human papillomavirus

<400>5

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact     60

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt    120

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag    180

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa    240

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa       297

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>6

cgcggatcca tgcatggaga tacacc                                          26

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>7

cgctctagat tatggtttct gagaacag                                        28

<210>8

<211>1683

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

ccggagctgc ccaagccctc catctccagc aacaactcca aacccgtgga ggacaaggat     60

gctgtggcct tcacctgtga acctgagact caggacgcaa cctacctgtg gtgggtaaac    120

aatcagagcc tcccggtcag tcccaggctg cagctgtcca atggcaacag gaccctcact    180

ctattcaatg tcacaagaaa tgacacagca agctacaaat gtgaaaccca gaacccagtg    240

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atttcccctc taaacacatc ttacagatca ggggaaaatc tgaacctctc ctgccatgca    360

gcctctaacc cacctgcaca gtactcttgg tttgtcaatg ggactttcca gcaatccacc    420

caagagctct ttatccccaa catcactgtg aataatagtg gatcctatac gtgccaagcc    480

cataactcag acactggcct caataggacc acagtcacga cgatcacagt ctatgcagag    540

ccacccaaac ccttcatcac cagcaacaac tccaaccccg tggaggatga ggatgctgta    600

gccttaacct gtgaacctga gattcagaac acaacctacc tgtggtgggt aaataatcag    660

agcctcccgg tcagtcccag gctgcagctg tccaatgaca acaggaccct cactctactc    720

agtgtcacaa ggaatgatgt aggaccctat gagtgtggaa tccagaacga attaagtgtt    780

gaccacagcg acccagtcat cctgaatgtc ctctatggcc cagacgaccc caccatttcc    840

ccctcataca cctattaccg tccaggggtg aacctcagcc tctcctgcca tgcagcctct    900

aacccacctg cacagtattc ttggctgatt gatgggaaca tccagcaaca cacacaagag    960

ctctttatct ccaacatcac tgagaagaac agcggactct atacctgcca ggccaataac   1020

tcagccagtg gccacagcag gactacagtc aagacaatca cagtctctgc ggagctgccc   1080

aagccctcca tctccagcaa caactccaaa cccgtggagg acaaggatgc tgtggccttc   1140

acctgtgaac ctgaggctca gaacacaacc tacctgtggt gggtaaatgg tcagagcctc   1200

ccagtcagtc ccaggctgca gctgtccaat ggcaacagga ccctcactct attcaatgtc   1260

acaagaaatg acgcaagagc ctatgtatgt ggaatccaga actcagtgag tgcaaaccgc   1320

agtgacccag tcaccctgga tgtcctctat gggccggaca cccccatcat ttccccccca   1380

gactcgtctt acctttcggg agcgaacctc aacctctcct gccactcggc ctctaaccca   1440

tccccgcagt attcttggcg tatcaatggg ataccgcagc aacacacaca agttctcttt   1500

atcgccaaaa tcacgccaaa taataacggg acctatgcct gttttgtctc taacttggct   1560

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<210>9

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<213>Artificial

<220>

<223>primer

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<223>primer

<400>10

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Claims (6)

1.一种有效剂量的多聚γ谷氨酸在制备增强细胞免疫性的组合物中的用途，其特征在于，所述增强细胞免疫性是通过TLR(钟状受体)介导。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多聚γ谷氨酸的平均分子量为100kDa～15,000kDa。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述增强细胞免疫性的组合物包括药学上可接受的载体。

4.一种有效剂量的多聚γ谷氨酸在制备预防和治疗病毒或细菌感染的疫苗组合物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述病毒或细菌感染为人或者动物感染。

6.一种有效剂量的多聚γ谷氨酸在制备预防或治疗癌症的疫苗组合物中的用途。

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