ES2258987T3

ES2258987T3 - Vacuna para reforzar las respuestas inmunitarias al virus del herpes simple.

Info

Publication number: ES2258987T3
Application number: ES00983967T
Authority: ES
Inventors: Eric M. Mishkin; Robert J. Natuk; Michael W. Pride; Maninder K. Sidhu
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2006-09-16
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: WO2001044477A1; AU2065101A; CN1222619C; KR100773390B1; EP1238086B1; EP1238086A1; MXPA02005867A; JP2003517042A; CA2406678A1; DK1238086T3; DE60026588T2; PT1238086E; ATE319833T1; AU783730B2; CY1105604T1; KR20020073348A; BR0016419A; IL149810A0; DE60026588D1; CN1434864A

Abstract

Utilización de una cantidad eficaz de una composición de vacuna de ADN que comprende una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del Virus del herpes simple (VHS) de tipo 1 o de tipo 2, y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica cada subunidad del heterodímero de la interleucina-12; y una cantidad eficaz de una composición de vacuna con proteínas que comprende la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2 y el heterodímero de IL-12, en la preparación de un kit de vacuna de VHS para generar inmunidad protectora en un mamífero contra el virus del herpes simple.

Description

Vacuna para reforzar las respuestas inmunitarias al virus del herpes simple.

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de las vacunas, y más específicamente a una vacuna para generar inmunidad contra el virus del herpes simple, que emplea tanto una vacuna con ácidos nucleicos como una vacuna con proteínas, junto con un adyuvante seleccionado.

Antecedentes de la invención

Existen diversas formulaciones de vacunas para generar respuestas inmunitarias contra ciertos patógenos, tales como el virus del herpes simple (VHS). Las vacunas contra el VHS se han centrado en los genes de la glucoproteína D (gD) del VHS de tipo 1 y del VHS de tipo 2. Véase, G. H. Cohen et al, J. Virol., 62(8): 1932-1940 (1988); H-Y. Chiang et al, J. Virol., 68(4): 2529-2543 (1994); A. V. Nicola et al, J. Virol., 70(6): 3815-3822 (1996); y la patente US nº 5.654.174.

Sin et al. J. Virol., 73, 1999, 501-9, describen vacunas contra el VHS que comprenden una construcción de expresión del ADN de la gD del VHS en combinación con un plásmido con un gen que codifica la IL-12; produciendo dicha vacuna una respuesta inmunitaria de tipo TH1 contra el VHS.

Las formulaciones conocidas para vacunas han empleado diversos vehículos de suministro para presentar antígenos tales como el gen gD al sistema inmunitario de los mamíferos, y provocar así una respuesta inmunitaria protectora contra el patógeno. Dichos "vehículos de suministro" han incluido como agente de la vacuna el virus completo termoinactivado o inactivado por tratamiento químico, partículas proteicas del virus completo, vectores víricos, tales como adenovirus y virus vacunal, entre otros, y vectores o plásmidos de ADN. Un ejemplo de este último tipo de formulación para el gen gD del VHS se describe en la solicitud de patente internacional nº WO98/17820, publicada el 30 de abril de 1998, y en la patente US nº 5.958.895. Como alternativa, otros agentes de suministro pueden ser aditivos para, por ejemplo, vehículos basados en plásmidos, que facilitan el suministro o la presentación del antígeno al sistema inmuni-
tario. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional nº WO98/48780, publicada el 5 de noviembre de 1998.

Otras variaciones sobre vacunas para un amplio número de patógenos comprenden composiciones y formulaciones que contienen otros agentes para el suministro junto con el antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. Dichos otros agentes pueden ser del tipo de los que aumentan o mejoran la respuesta inmunitaria al antígeno debido a su propia bioactividad. Por ejemplo, se ha comprobado que ciertas citocinas e interleucinas son "adyuvantes" deseables para composiciones de vacuna. Entre las más interesantes de éstas se encuentra la interleucina-12. Véase, por ejemplo, las patentes US nº 5.723.127 y nº 5.571.515.

Como medios adicionales para obtener una respuesta inmunitaria protectora adecuada con diversas vacunas contra patógenos se han propuesto varios protocolos de vacunación. Por ejemplo, los estudios previos han demostrado que las vacunas a base de plásmidos pueden emplearse para sensibilizar el sistema inmunitario frente a una segunda inmunización con otra forma del mismo antígeno, tal como un proteína o un virus recombinante [S. W. Barnett et al, Vaccine, 15 (80): 869-873 (1997); N. L. Letvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9378-9383 (1997); R. A. Gramzinski et al, Molecular Med., 4: 109-118 (1998); J. Schneider et al, Nature Med., 4: 397 (1998); and M. Sedeguh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 7648 (1998)].

A pesar de la considerable cantidad de información disponible sobre vacunas y formulaciones de vacunas, sigue existiendo la necesidad de encontrar vacunas eficaces capaces de provocar o conferir a los seres humanos inmunidad protectora adecuada, en particular contra el VHS.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a una vacuna para su utilización en un método para generar inmunidad en mamíferos contra un virus patógeno del herpes simple. El método comprende la etapa siguiente: administrar una cantidad eficaz de una composición de vacuna que consta de una primera vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2, y una segunda molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica las subunidades heterodiméricas p-35 y p40 de la interleucina-12. Preferentemente, la segunda molécula de ácido nucleico comprende una mezcla de cantidades iguales de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica la p35 de la IL-12, y una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica la p40 de la IL-12.

Después de por lo menos una inmunización de un mamífero con esta vacuna de ADN, el método incluye además por lo menos una inmunización del mamífero con una cantidad eficaz de una segunda composición de vacuna que comprende una proteína, en particular, la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2, y las proteínas heterodiméricas de la IL-12 en un excipiente farmacéutico adecuado. En una forma de realización adicional, la primera vacuna se administra en una formulación con un anestésico local en una cantidad que forma uno o más complejos con las moléculas de ácido nucleico de la primera vacuna.

En otro aspecto adicional, la presente invención incluye un kit de vacuna contra el VHS que contiene los diversos componentes mencionados anteriormente en el método de la vacuna, así como instrucciones y aparatos opcionales adecuados para el mezclado y la administración de los componentes de la vacuna.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica que ilustra la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL) en animales experimentales del ensayo descrito en el Ejemplo 2. La gráfica representa el % de lisis específica frente a la relación efector:diana. Los siguientes símbolos representan los siguientes grupos experimentales:

``\circ'': representa animales que recibieron dos inmunizaciones idénticas con la "primera" vacuna que contiene un plásmido de ADN que codifica el gen gD2 del VHS y los plásmidos de ADN que codifican los dos heterodímeros de la IL-12 (gDpl12pl);

``\boxempty'': representa animales que recibieron una inmunización con la "primera" vacuna descrita anteriormente, seguida por una inmunización con el plásmido de ADN que codifica el gen gD2 del VHS solo (gDpl12pl/gDpl);

``\lozenge'': representa animales que recibieron la "primera" vacuna (gDpl12pl), seguida por una inmunización con la "segunda" vacuna que contiene una proteína de la subunidad gD y la proteína heterodimérica IL-12 (gDpr12pr);

``X'': representa animales que recibieron la primera vacuna (gDpl12pl), seguida por una inmunización con la proteína de la subunidad gD sola (gDpr);

``+'': representa animales testigo que recibieron solamente el virus VHS1 vivo; y

``\triangle'': representa animales testigo que recibieron solamente el virus VHS2 vivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una vacuna eficaz para la prevención o tratamiento de la infección por el virus del herpes simple en mamíferos. Dicha vacuna está destinada a su utilización en un método de inmunización por sensibilización-refuerzo, y genera inmunidad protectora y/o terapéutica en un mamífero contra el patógeno, el virus del herpes simple de tipo 1 o de tipo 2. La presente invención demuestra que una pauta de vacuna de sensibilización-refuerzo, en la que se administra la gD del VHS en la etapa de sensibilización con ADN, la etapa opcional de refuerzo con ADN, y la etapa de refuerzo con la proteína IL-12 en la misma forma que la gD, aumenta la inmunidad celular, que se considera crucial para el tratamiento. El amplio espectro de inmunidad demostrada con esta pauta también proporciona una mayor inmunidad protectora y/o terapéutica contra la infección por el VHS. De este modo, la presente invención proporciona una vacuna útil tanto para la profilaxis como para el tratamiento de la infección por el VHS, por ejemplo, para el tratamiento de personas antes de la exposición y después de la exposición.

I. Definiciones

Las expresiones "mamífero" y "de mamífero" se utilizan en su sentido normal. Aunque la invención está destinada preferentemente para ejercer su efecto en los seres humanos, también se engloban en esta definición otros primates, así como especies de animales domésticos, incluidos sin limitarse a, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, ratones, conejos, ratas, etc.

Las expresiones "respuesta inmunitaria" o "inmunidad", que se utilizan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a la generación de una respuesta humoral (es decir, de células B) y/o celular (es decir, de células T). Puede valorarse de forma práctica una respuesta de inmunidad humoral midiendo los anticuerpos específicos del antígeno presentes en el suero de animales inmunizados en respuesta a la introducción del antígeno gD del VHS en el hospedador. En una forma de realización presentada a título de ejemplo más adelante, la respuesta inmunitaria se valora mediante análisis por inmunoabsorción enzimática de sueros de mamíferos inmunizados, o mediante ensayo de de microneutralización de sueros de animales inmunizados, como se explica más adelante en el Ejemplo 2. Puede emplearse un ensayo de CTL para medir la respuesta de células T de linfocitos aislados a partir del bazo de animales inmunizados, como se describe asimismo más adelante.

Las expresiones "sensibilización" y "refuerzo" se utilizan en el sentido que tienen habitualmente en la técnica. La "sensibilización" se refiere a la inmunización con una primera composición, que genera un mayor nivel de respuesta inmunitaria contra el antígeno tras la inmunización subsiguiente ("refuerzo") con la misma, u otra, composición, que el de la respuesta inmunitaria obtenida por inmunización con una única composición de vacuna, por ejemplo, la composición para sensibilización sola o la composición para refuerzo sola.

La expresión "homólogo", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la similitud de la secuencia entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando una posición de nucleótido o de aminoácido en ambas moléculas está ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido monomérico, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, las moléculas son homólogas en dicha posición. La homología entre dos secuencias es función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades) de las posiciones en dos secuencias compuestas son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 50%; si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, son coincidentes u homólogas, las dos secuencias comparten una homología del 90%. Como ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC5' y 3'TATGCG5' comparten una homología del 50%. Con la expresión "sustancialmente homólogo", tal como se utiliza en la presente memoria, se hace referencia a ADN o ARN que es homólogo en aproximadamente un 50%, más preferentemente homólogo en aproximadamente 70%, aún más preferentemente homólogo en aproximadamente 80%, y lo más preferentemente homólogo en aproximadamente 90% al ácido nucleico deseado.

Como se describe en la presente memoria, la gD del VHS o la proteína IL-12 y/o las secuencias de ADN se definen por sus porcentajes de homología o identidad con secuencias identificadas; los algoritmos utilizados para calcular los porcentajes de homología o los porcentajes de identidad comprenden los siguientes: el algoritmo de Smith-Waterman [J. F. Collins et al, 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J. F. Collins et al, Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et al, eds.), en Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, Inglaterra, Reino Unido (1987) pág. 417], y los programas BLAST y FASTA [E. G. Shpaer et al, 1996, Genomics, 38: 179-191]. Estas citas se incorporan a la presente memoria en su totalidad como referencia.

II. Sensibilización con ADN de gD y de IL-12

La primera etapa, o etapa de sensibilización, del método supone la inmunización de un mamífero con una cantidad eficaz de una primera vacuna de "sensibilización" que contiene una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2 en combinación con una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica cada una de las subunidades del heterodímero de la interleucina-12. Esta segunda secuencia de ácido nucleico puede comprender una mezcla de dos moléculas de ácido nucleico distintas, que codifica cada una un heterodímero de IL-12 distinto, o puede ser una molécula bicistrónica que contiene ambas subunidades heterodiméricas, o una sola secuencia de las subunidades de la IL-12 o fragmentos biológicamente activos de la misma conectados o fusionados en una única molécula. Las secuencias que codifican las proteínas gD1 y gD2 son conocidas (véase, por ejemplo, Núm. de acceso a GenBank K01408, y las referencias citadas anteriormente en los antecedentes), y las de los heterodímeros de la IL-12 son también conocidas (véase, por ejemplo, la patente US nº 5.457.038).

Preferentemente, se utiliza la secuencia nativa de gD1 o gD2 del VHS en la vacuna de sensibilización; no obstante, la invención contempla la utilización de secuencias modificadas de gD1 y gD2, en los casos en los que dicha modificación de las secuencias de ácido nucleico aumenta la inmunogenicidad, la estabilidad o alguna otra propiedad farmacológica de los genes gD in vivo. Se conocen numerosas modificaciones de la secuencia de nucleótidos, que se examinan de forma general más adelante. Entre dichas modificaciones se incluyen las formas truncadas o deleciones/inserciones para acortar o alargar la secuencia nativa de gD. La secuencia de gD puede truncarse en su extremo 5' para eliminar una secuencia señal o líder. Como alternativa, la secuencia de gD puede truncarse en su extremo 3' para eliminar su dominio transmembranal o su región rica en cisteínas. Otra alternativa adicional es una molécula de gD truncada en ambos extremos 5' y 3' para eliminar tanto el dominio de la señal como el dominio transmembranal. Otro ejemplo adicional del gen gD modificado es una secuencia con la secuencia líder o señal nativa eliminada y sustituida por otra secuencia señal. Por ejemplo, la secuencia puede truncarse en el codón que codifica el aminoácido en el residuo 285 con el residuo 316 de gD, para dar lugar a una secuencia de gD modificada que es útil en la presente invención. Es probable que otras modificaciones adicionales sean útiles (véanse, por ejemplo, los fragmentos descritos en la patente US nº 5.958.895).

La presente invención comprende asimismo secuencias de ácido nucleico que codifican gD y que están fusionadas en el mismo marco de lectura con otra secuencia de polinucleótidos que facilita la expresión y la secreción de un polipéptido a partir de la célula del hospedador inmunizado, o que ayuda a mantener la estabilidad del polipéptido en una célula, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido fuera de la célula.

De forma similar, las secuencias de las subunidades heterodiméricas p35 y p40 de IL-12 de varias especies mamíferos, incluidos roedores y seres humanos, son conocidas en la técnica. Preferentemente, la secuencia seleccionada de la subunidad de la IL-12 que se emplea es una secuencia nativa o alélica de la especie de mamífero al que se administra la vacuna de sensibilización. Por ejemplo, lo más preferido para su utilización en los seres humanos es el heterodímero humano nativo de la IL-12. Además, la invención contempla la utilización de secuencias modificadas de la p35 de IL-12 y de la p40 de IL-12, cuando dichas modificaciones de las secuencias de ácido nucleico aumentan la estabilidad o alguna otra propiedad farmacológica de los genes de las subunidades de la IL-12 in vivo. Por ejemplo, podría diseñarse un solo gen que contiene ambos heterodímeros o los fragmentos biológicamente importantes de ambos heterodímeros unidos. Se conocen numerosas modificaciones de la secuencia de nucleótidos y se examinan de forma general más adelante.

Las secuencias de nucleótidos que codifican la gD del VHS o que codifican el heterodímero de IL-12 que contienen secuencias que son respectivamente homólogas a la secuencia aminoácida del antígeno gD o de la citocina IL-12, en las que el antígeno homólogo provoca una respuesta inmunitaria contra el VHS o una respuesta adecuada contra la IL-12, también son útiles en la vacuna de sensibilización y la vacuna de refuerzo del método de la presente invención. Los genes que son homólogos a la secuencia deseada que codifica gD deberán considerarse incluidos en la invención, a condición de que codifiquen una proteína o polipéptido que sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria protectora contra el VHS sustancialmente similar a la de la gD nativa o de tipo salvaje del VHS.

Métodos para preparar los componentes de la etapa de vacuna de sensibilización de la invención se describen en textos convencionales, tales como Burger et al., J. Gen. Virol., 72: 359-367 (1991), y son bien conocidos en la técnica. Véanse también Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; y Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York. Como alternativa, pueden adquirirse en el mercado plásmidos adecuados que contienen una secuencia de ácido nucleico de gD del VHS o moléculas de ácido nucleico de una subunidad de la IL-12.

Cada secuencia de ácido nucleico que codifica gD, p35 de IL-12, o p40 de IL-12 se encuentra preferentemente bajo control de secuencias reguladoras que dirigen la replicación y la generación del producto de cada secuencia de ácido nucleico en una célula de mamífero. Con la expresión "secuencia del promotor/reguladora" se hace referencia a una secuencia de ADN que es necesaria para la expresión de un ácido nucleico conectado funcionalmente a la secuencia del promotor/reguladora. En algunos casos la secuencia del promotor/reguladora puede funcionar de forma específica de tejido, en el sentido de que la secuencia del promotor/reguladora sólo es capaz de dirigir la expresión en una célula de un tipo de tejido particular. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia principal del promotor, y en otros casos esta secuencia puede incluir también una secuencia de un potenciador y otros elementos reguladores que son necesarios para la expresión de forma específica de tejido.

Cuando se describen dos ADN diciendo que están "conectados funcionalmente", tal y como se utiliza en la presente memoria, se hace referencia a que un ADN monocatenario o bicatenario comprende cada uno de los dos ADN y que los dos ADN están dispuestos en el ADN de tal forma que por lo menos una de las secuencias de ADN es capaz de ejercer un efecto fisiológico característico sobre la otra. Preferentemente, cuando el ácido nucleico que codifica gD o IL-12 comprende también una secuencia del promotor/reguladora, la secuencia del promotor/reguladora está situada en el extremo 5’ de la secuencia codificante de modo que dirige la expresión de gD o IL-12 en una célula.

Dichas secuencias reguladoras comprenden, sin limitarse a, una secuencia del promotor, una secuencia de un potenciador, una secuencia de poliadenilación, una secuencia donadora de corte y empalme y una secuencia receptora de corte y empalme. La técnica proporciona gran cantidad de dichas secuencias a partir de las que es posible diseñar las moléculas de ADN útiles en la presente invención. El experto en la materia puede seleccionar fácilmente de entre dichas secuencias reguladoras conocidas para preparar moléculas de la presente invención, y la selección de dichas secuencias reguladoras no constituye una limitación de la presente invención. Por ejemplo, los promotores empleados en los plásmidos u otras moléculas de ADN que son parte de la vacuna de sensibilización pueden incluir promotores constitutivos que presentan actividad no específica. Dichos promotores comprenden, sin limitarse a, el promotor retrovírico LTR, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor del SV40, el promotor de la dihidrofolato-reductasa, y el promotor de la fosfoglicerol-quinasa (PGK). También pueden emplearse promotores inducibles que están regulados por fármacos aplicados de forma externa. Dichos promotores comprenden, sin limitarse a, el promotor inducible por cinc de la metalotionina (MT) de oveja, y el promotor inducible por dexametasona (Dex) del virus del tumor de mama de ratón (MMTV), entre otros. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son los promotores inducibles que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, la temperatura o la fase aguda, o que funcionan sólo en células en replicación.

Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico que codifican gD o los heterodímeros de IL-12 se administran en un vector o plásmido. Con la expresión "vector", tal como se utiliza en la presente memoria, se hace referencia a una molécula de ADN procedente de una especie vírica o bacteriana que ha sido diseñada para codificar una secuencia de ácido nucleico exógena o heteróloga. Así, la expresión incluye plásmidos bacterianos convencionales. Dichos plásmidos o vectores pueden incluir secuencias de plásmidos de virus o bacteriófagos. Dichos vectores incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores procedentes de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras, y virus, vectores procedentes de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, cósmidos y fagémidos. La expresión incluye asimismo virus que no se replican, que transfieren un gen de una célula a otra. Deberá considerarse asimismo que el término comprende compuestos que no son plásmidos ni virus, que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. Ejemplos de vectores víricos incluyen, sin limitarse a los mismos, vectores adenovíricos, vectores de poxvirus, vectores retrovíricos, y similares. Ejemplos de vectores bacterianos incluyen, sin limitarse a los mismos, secuencias derivadas del bacilo de Calmette-Guérin (BCG), Salmonella, Shigella, y Listeria, entre otras. Así, un ejemplo de vector es un vector de un bacteriófago monocatenario o bicatenario. Otro ejemplo de vector es un vector vírico de ARN o ADN monocatenario o bicatenario.

Además de las secuencias reguladoras mencionadas anteriormente, los plásmidos pueden contener sitios para la iniciación y la terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma, para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá un codón de iniciación de la traducción al principio y un codón de terminación situado de forma adecuada al final del polipéptido que se va a traducir.

Todos los componentes de los plásmidos o vectores mencionados anteriormente pueden seleccionarse fácilmente de entre materiales conocidos en la técnica y comercializados por la industria farmacéutica. La secreción de la cadena principal y las secuencias reguladoras del plásmido no se consideran una limitación de la presente invención.

Preferentemente, para su utilización en la etapa de vacuna de sensibilización de la presente invención, el gen gD y cada subunidad de la IL-12 estarán presentes en un plásmido distinto. Como alternativa, dos o más de dichas secuencias de ácido nucleico pueden estar comprendidas en un transcrito policistrónico, es decir, una sola molécula que está diseñada para expresar dos de los tres, o los tres, productos génicos.

La vacuna de sensibilización contiene por lo tanto una o más de las secuencias de ácido nucleico que codifican la gD del VHS y el heterodímero de IL-12 en un excipiente adecuado desde el punto vista farmacéutico o fisiológico, tal como solución salina isotónica o solución de sales isotónica. El excipiente adecuado será evidente para los expertos en la materia y dependerá en buena medida de la vía de administración. Como alternativa, dichas vacunas de sensibilización compuestas de moléculas de polinucleótidos contienen ventajosamente agentes de facilitación de polinucleótidos opcionales o "coagentes", tales como un anestésico local, un péptido, un lípido, incluidos lípidos catiónicos, un liposoma o partícula lipídica, un policatión tal como polilisina, un policatión ramificado tridimensional tal como un dendrímero, un carbohidrato, un anfífilo catiónico, un detergente, un tensioactivo de bencilamonio, u otro compuesto que facilite la transferencia del polinucleótido a las células. Ejemplos no exclusivos de dichos agentes de facilitación o coagentes útiles en la presente invención se describen en las patentes US nº 5.593.972, nº 5.703.055, nº 5.739.118, nº 5.837.533, la solicitud de patente internacional nº WO96/10038, publicada el 4 de abril de 1996, y la solicitud de patente internacional nº WO94/16737, publicada el 8 de agosto de 1994, que se incorporan a la presente memoria en su totalidad como referencia.

Lo más preferible es que el anestésico local esté presente en una cantidad que forme uno o más complejos con las moléculas de ácido nucleico. Cuando el anestésico local está mezclado con los plásmidos de ADN, forma diversos complejos pequeños o partículas que empaquetan el ADN y son homogéneos. Así, en una forma de realización de las composiciones de vacuna para sensibilización de la presente invención, los complejos se forman mezclando el anestésico local y de uno a tres de los plásmidos de ADN (los dos plásmidos que contienen las subunidades de la IL-12, o el plásmido que contiene la gD y uno o ambos de los plásmidos que contienen las subunidades de la IL-12, o el plásmido que contiene la gD y un plásmido bicistrónico que contiene ambas subunidades de la IL-12, o un único plásmido policistrónico que contiene la secuencia de gD y ambas secuencias de las subunidades de la IL-12). Cualquier complejo único resultante de esta mezcla puede contener diversas combinaciones de diferentes plásmidos. Como alternativa, en otra forma de realización de las composiciones para sensibilización de la presente invención, el anestésico local puede mezclarse previamente por separado con cada uno de los plásmidos de gD y de la subunidad de la IL-12, y pueden después combinarse las mezclas separadas en una sola composición para sensibilización, con el objetivo de garantizar el mantenimiento de la relación deseada de los plásmidos en una sola composición de vacuna, si se van a administrar todos los plásmidos en una sola inyección.

Como alternativa, puede mezclarse por separado el anestésico local y cada plásmido y administrarse por separado, para obtener la relación deseada. Cuando se utiliza en lo sucesivo la expresión "complejo" o "uno o más complejos" o "complejos" para definir la presente realización de la composición de vacuna para sensibilización, deberá entenderse que el término engloba uno o más complejos que contienen, cada uno de ellos, una mezcla de los plásmidos que contienen gD y la subunidad de la IL-12, o una mezcla de complejos formados por separado, en la que cada complejo contiene sólo un tipo de plásmido, o un complejo o una mezcla de complejos en la que cada complejo contiene un ADN policistrónico.

Preferentemente, los complejos tienen un diámetro entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 nm. Cuando el agente facilitador utilizado es un anestésico local, preferentemente bupivacaína, es preferible una cantidad desde aproximadamente 0,1 por ciento en peso hasta aproximadamente 1,0 por ciento en peso, sobre la base del peso total de la composición polinucleotídica. Véase asimismo la solicitud de patente internacional nº PCT/US98/22841, que se incorpora a la presente memoria a título de referencia, y que describe la incorporación de tensioactivos de bencilamonio como coagentes, preferentemente administrados en una cantidad entre aproximadamente 0,001-0,03% en peso. Según la presente invención, la cantidad de anestésico local está presente en una relación a dichas moléculas de ácido nucleico de 0,01-2,5% p/v de anestésico local a 1-10 \mug/ml de ácido nucleico. Otro intervalo similar es 0,05-1,25% p/v de anestésico local a 100 \mug/ml hasta 1 mg/ml de ácido nucleico.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener asimismo otros aditivos adecuados para la vía seleccionada de administración de la composición. La composición de la invención también puede incorporar polinucleótidos liofilizados, que pueden utilizarse con otros excipientes, farmacéuticamente aceptables, para la preparación de formas farmacéuticas en polvo, líquido o suspensión. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19ª edición (1995), por ejemplo, Capítulo 95: Aerosoles; y la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/05547, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia. Las vías de administración para estas composiciones pueden combinarse, si se desea, o ajustarse.

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De este modo, dichas composiciones de vacuna para sensibilización/refuerzo con ADN pueden contener aditivos adecuados para la administración a través de cualquier vía de administración convencional. En algunas formas de realización preferidas, la composición para sensibilización y la composición opcional para refuerzo con ADN de la invención se preparan para su administración a mamíferos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico, o supositorios. Las vías de administración incluyen, sin limitarse a, administración parenteral, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intradérmica, administración oral, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar, administración rectal, administración vaginal, y similares. Todas estas vías son adecuadas para la administración de dichas composiciones, y pueden ser seleccionadas por el médico encargado en función del paciente, el trastorno que se va a tratar, y factores similares.

En general, la selección de la dosis apropiada de las composiciones para sensibilización de la presente invención se basará en el estado físico del mamífero, incluidos especialmente el estado de salud y el peso del mamífero inmunizado. Tanto dicha selección como el ajuste para aumentar o disminuir la dosis concreta forman parte de la técnica.

En los métodos de los ejemplos presentados a continuación, los componentes de las vacunas de sensibilización se administraron conjuntamente al mamífero. Las moléculas de ácido nucleico que contenían el gen gD y cada una de las subunidades de la IL-12 se mezclaron primero con un excipiente farmacéutico aceptable, y después se administraron juntas en una sola inyección.

Como alternativa, se contempla que cada plásmido pueda administrarse por separado y de forma secuencial. Como ilustración de una etapa de vacuna de sensibilización, los siguientes ejemplos describen el suministro de tres plásmidos bacterianos, pMVgD2, pMVp35 y pMVp40, mezclados y administrados en solución salina por vía intramuscular. También pueden emplearse otras formas de administración.

III. Refuerzo opcional con ácido nucleico

La invención contempla además una vacuna opcional de refuerzo que comprende los mismos componentes y formulación descritos anteriormente para el caso de la "vacuna de sensibilización". Dicho refuerzo con ácido nucleico se administra preferentemente al paciente de aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 32 semanas después de la administración de la vacuna de sensibilización. Es deseable que el refuerzo con ácido nucleico se administre por la misma vía y utilizando las mismas dosis empleadas en el caso de la etapa de vacuna de sensibilización descrita anteriormente.

IV. Refuerzo con proteínas gD del VHS y heterodímero de la IL-12

La invención proporciona asimismo una etapa de vacuna de refuerzo con proteínas. Dicha etapa implica preferentemente la inmunización del mamífero con una cantidad eficaz de una composición de vacuna con proteínas, que comprende la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2 o un análogo de las mismas, y el heterodímero de la IL-12 o un análogo del mismo, entre aproximadamente 2 semanas y 32 semanas después de la inmunización con la "vacuna de sensibilización" descrita anteriormente, o tras la inmunización con uno o más refuerzos opcionales con ácido nucleico descritos anteriormente.

Como se menciona anteriormente, las secuencias de ADN y de proteína de la gD del gD del VHS, tipos 1 y 2, y de las subunidades heterodiméricas murinas y humanas de la IL-12 son bien conocidas en la técnica. El término "análogo", cuando se refiere al polipéptido de gD o de IL-12 útil en la presente invención, significa un polipéptido completo o un fragmento del mismo que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho polipéptido, es decir, funciona como inmunógeno. El análogo del polipéptido de gD y/o del heterodímero de IL-12 puede ser (i) un análogo en el que uno o más de los residuos aminoácidos están sustituidos con un residuo aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo aminoácido conservado) y dicho residuo aminoácido sustituido puede ser, o no, un residuo codificado por el código genético; (ii) un análogo en el que uno o más de los residuos aminoácidos incluye un grupo sustituyente; (iii) un análogo en el que el polipéptido está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto que aumenta la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); o (iv) un análogo en el que otros aminoácidos están fusionados con el polipéptido, tales como una secuencia líder o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido. Se considera que dichos análogos se encuentran dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las descripciones de la presente memoria. Los análogos de gD del VHS o de los heterodímeros de IL-12 descritos en la presente memoria pueden diferir de las proteínas o péptidos naturales debido a diferencias conservativas en la secuencia aminoácida, o debido a modificaciones que no afectan a la secuencia, o por ambos motivos. Por ejemplo, pueden realizarse cambios conservativos de aminoácidos que, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o del péptido, no alteran normalmente su función.

Las modificaciones (que no alteran normalmente la secuencia primaria) incluyen la derivatización química de polipéptidos in vivo o in vitro, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen como análogos de gD o IL-12 estas mismas proteínas modificadas por glucosilación, por ejemplo: las obtenidas por modificación de las pautas de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o por etapas adicionales de procesamiento, por ejemplo: por exposición del polipéptido a enzimas que afectan a la glucosilación, por ejemplo, enzimas de glucosilación o de desglucosilación de mamífero. También se engloban como análogos según la presente invención las secuencias de gD del VHS o de IL-12 que tienen residuos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. También se incluyen como análogos los polipéptidos de gD o de IL-12 que se han modificado utilizando técnicas habituales de biología molecular con el objeto de mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o de optimizar sus propiedades de solubilidad. Los análogos de dichos polipéptidos incluyen los que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos naturales, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos no naturales. Otras modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención son, sin limitarse a, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente a flavina, unión covalente a un grupo hemo, unión covalente a un nucleótido o a un derivado de nucleótido, unión covalente a un lípido o derivado de lípido, unión covalente a fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, formación de un ancla con GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición, mediada por ARN de transferencia, de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación.

Otras modificaciones adicionales, particularmente de la proteína gD, incluyen la eliminación, mencionada anteriormente, de la secuencia señal o líder en el extremo N-terminal de gD, y/o la eliminación del dominio transmembranal y/o la región rica en cisteínas del extremo C-terminal de gD, o ambas. De forma similar, una modificación podría incluir la sustitución de la secuencia señal o líder con otra secuencia señal o líder. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.958.895.

Los métodos para llevar a cabo dichas modificaciones son bien conocidos por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993; Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", págs. 1-12, en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol., 182: 626-646 (1990), y Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 663: 48-62 (1992).

Además de polipéptidos de longitud sustancialmente completa, las proteínas gD y/o IL-12 útiles en la presente invención incluyen fragmentos inmunológicamente activos de dichos polipéptidos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento", cuando se aplica a un polipéptido, tendrá generalmente una longitud de por lo menos aproximadamente seis aminoácidos contiguos, típicamente por lo menos aproximadamente 15, o aproximadamente 25, aminoácidos contiguos, más típicamente por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos contiguos, habitualmente por lo menos aproximadamente 45 aminoácidos contiguos, y preferentemente por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos. Véanse, por ejemplo, los polipéptidos de gD descritos en la patente US nº 4.709.011, que se incorpora a la presente memoria como referencia. La proteína gD, análogo o fragmento de la misma es útil para el presente método si provoca una respuesta inmunitaria protectora contra el VHS de tipo 1 o de tipo 2 en el mamífero. Por ejemplo, una proteína gD truncada aproximadamente en el residuo 285 es un fragmento deseable. De forma similar, una proteína gD truncada aproximadamente en el residuo 316 es un fragmento deseable. Pueden seleccionarse otros fragmentos adicionales de gD. La proteína IL-12, análogo o fragmento de la misma es útil para el presente método si aumenta la respuesta inmunitaria provocada por la proteína gD.

La proteína gD y el heterodímero de IL-12 utilizados en la vacuna de refuerzo con proteínas de la invención no se limitan a productos de cualquiera de los procesos específicos mencionados en la presente memoria. De hecho, la proteína gD y las proteínas heterodiméricas de la IL-12 pueden prepararse siguiendo los métodos expuestos en los textos citados anteriormente o siguiendo los métodos de los textos citados en la sección anterior referente a la vacuna de sensibilización. Es parte de la técnica el aislamiento y la producción de composiciones de proteínas para su utilización en vacunas. No obstante, como alternativa, las proteínas gD e IL-12 pueden adquirirse en el
mercado.

Las composiciones para refuerzo con proteínas se formulan preferentemente en forma de composiciones farmacéuticas. Dichas formulaciones comprenden la proteína gD y el heterodímero de IL-12 combinados con un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. El excipiente adecuado será evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran medida de la vía de administración. Las formulaciones incluyen, sin limitarse a las mismas, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, pastas, y dispositivos implantables para la liberación sostenida o formulaciones biodegradables. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales, incluidos, sin limitarse a los mismos, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una forma de realización de una formulación para administración parenteral se proporciona el principio activo en forma seca (es decir, en polvo o granulado) para su reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones útiles que pueden administrarse por vía parenteral incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación con liposomas, o en forma de componente de un sistema de polímero biodegradable. Las composiciones para la liberación sostenida o la implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina intercambiadora de iones, un polímero poco soluble, o una sal poco soluble.

Otros componentes adicionales que puede estar presentes en las composiciones para refuerzo con proteínas son adyuvantes, conservantes, estabilizantes químicos, u otras proteínas antigénicas. Típicamente, los estabilizantes, adyuvantes y conservantes se optimizan para determinar la mejor formulación en términos de eficacia para el ser humano o animal al que se destina. Ejemplos adecuados de conservantes incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil-vainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los ingredientes estabilizantes adecuados que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, casaminoácidos, sacarosa, gelatina, rojo fenol, N-Z-amina, difosfato de monopotasio, lactosa, hidrolizado de lactalbúmina, y leche en polvo. Se utiliza un adyuvante convencional para atraer leucocitos o para aumentar la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, MPL™ (monofosforil-lípido A 3-O-desacetilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, Amphigen, avridina, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glucósido, polioles de Pluronic, muramil-dipéptido, células muertas de Bordetella, saponinas, tales como Quil A o Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA.) y toxina colérica (bien en forma de tipo salvaje o mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición aminoácida 29 está sustituido por otro aminoácido, preferentemente una histidina, según la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/22520, que se incorpora a la presente memoria como referencia).

En algunas formas de realización preferidas, la composición para refuerzo de la invención se prepara para su administración a mamíferos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico, o supositorios. Las vías de administración incluyen, sin limitarse a, administración parenteral, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intradérmica, administración oral, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar, administración rectal, administración vaginal, y similares. Todas las vías anteriores son adecuadas para la administración de dichas composiciones, y pueden ser seleccionadas por el médico encargado en función del paciente, el trastorno que se va a tratar y factores similares.

En general, la selección de la dosis adecuada de la composición para refuerzo con proteínas de la presente invención se basará en el estado físico del mamífero, incluido muy especialmente el estado general de salud y el peso del mamífero inmunizado. Dicha selección de las dosis adecuadas para el paciente forma parte de la técnica.

En los métodos de los ejemplos presentados más adelante, los componentes de las vacunas preferidas para refuerzo con proteínas se mezclaron y administraron por vía intramuscular en una sola inyección. También sería posible administrar la proteína gD separada del heterodímero de IL-12, cada uno en un excipiente farmacéutico adecuado.

V. Kit de la invención

También se incluye en la invención un kit para generar una respuesta inmunitaria protectora y/o terapéutica mejorada contra el VHS. Dicho kit comprende preferentemente los componentes de una vacuna de sensibilización, es decir, una o más moléculas de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, que comprenden una secuencia de ADN que codifica el gen gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2, y una secuencia de ADN que codifica la subunidades p-35 y p40 de la interleucina-12, en la que la secuencia de ADN que codifica el gen gD y la secuencia de ADN que codifica dichos heterodímeros de IL-12 están cada una de ellas bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión de las mismas en una célula de mamífero. Opcionalmente, el kit contiene un anestésico local en una cantidad que forma uno o más complejos con dichas moléculas de ácido nucleico. Opcionalmente, el kit contiene los componentes de la vacuna de refuerzo con ADN, como se ha descrito anteriormente. El kit contiene también los componentes de la vacuna de refuerzo con proteínas, es decir, la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2 y el heterodímero de IL-12 en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, como se ha descrito anteriormente.

Otros componentes del kit incluyen aplicadores para la administración de cada composición. Con el término "aplicador", tal y como se utiliza el término en la presente memoria, se hace referencia a cualquier dispositivo, incluidos sin limitarse a los mismos, jeringa hipodérmica, pistola génica, nebulizador, cuentagotas, broncoscopio, supositorio, entre los muchos tipos bien conocidos para la administración de composiciones farmacéuticas útiles para administrar los componentes de la vacuna con ADN y/o los componentes de la vacuna con proteínas a través de cualquier vía adecuada para el paciente humano o animal. Otro componente incluye las instrucciones para la utilización del kit.

VI. Ejemplos

La invención se describe con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Dichos ejemplos se proporcionan únicamente a efectos ilustrativos, y no limitativos, a no ser que se especifique lo contrario. No debe considerarse que la invención se limita a la utilización del plásmido de ADN particular y de los componentes del plásmido particulares, tales como promotores, empleados como vacunas de sensibilización con ADN, ni al anestésico local particular descrito en la presente memoria. Así, la invención comprende todas y cada una de las variaciones que pueden apreciarse como resultado de la descripción proporcionada en la presente memoria.

Ejemplo 1 Componentes de vacuna del VHS A. Vacunas de sensibilización

El plásmido PMV fue obtenido a partir del pCMV-\beta [Clontech, Inc.], eliminando los sitios de la beta-galactosidasa y de poliadenilación del SV40, y sustituyendo las secuencias eliminadas con el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (bGH), aislado a partir del pcDNA3.1 [Invitrogen, Inc.]. Otras características del plásmido PMV incluyen un origen de replicación de pUC, un intrón que contiene el donador/aceptor de corte y empalme del SV40, y un gen de resistencia a la ampicilina. El plásmido PMVgD se construyó de la siguiente manera: un fragmento HindIII-BstX1 de 1,5 kb que contenía el gen gD del VHS de tipo 2 (VHS-2), cepa 186, fue aislado a partir del plásmido pww65 [Eisenberg et al, J. Virol., 64: 8 (1990)]. Los salientes 5' fueron rellenados con el fragmento de Klenow, seguido por la clonación en el sitio SmaI del plásmido PMV. El plásmido resultante expresa gD2 a partir del promotor del CMV, y está poliadenilado gracias al sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.

Los plásmidos que contenían el heterodímero de IL-12 eran PMVp35 y PMVp40, y fueron construidos de la siguiente manera: se aislaron los ADNc de la IL-12 de ratón correspondientes a p35 (650 pb) y p40 (1,0 kb) en forma de fragmentos SalI-XhoI individuales a partir de los plásmidos pEDIL12p35 y pEDIL-12p40 [ambos obtenidos del Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA, véase asimismo: S. A. Wolf et al, J. Immunol., 146: 3074-3081 (1991)]. Dichos fragmentos fueron clonados en el sitio SalI-XhoI de plásmidos PMV individuales, descritos anteriormente, para dar lugar a PMVp35 y PMVp40, cada plásmido expresaba p35 o p40 del heterodímero de IL-12 a partir del promotor del citomegalovirus y contenía el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.

Tal y como se ilustra más adelante en los protocolos de los Ejemplos 2 y 3, una vacuna de sensibilización preferida comprende 35 microgramos de cada uno de los plásmidos pMVgD, pMVp35 y pMVp40 en 0,06 ml de solución salina tamponada con fosfato. Como alternativa, en algunas formas de realización de los ejemplos presentados más adelante, las vacunas de sensibilización contenían sólo el pMVgD, sólo los plásmidos con IL-12, o el VHS de tipo salvaje. El plásmido que contenía gD y los plásmidos que contenían el heterodímero de IL-12 se administran preferentemente en una única composición por vía intramuscular (i.m.). Sin embargo, como alternativa, los plásmidos pueden coadministrarse de forma secuencial o administrarse a través de una vía diferente a la mostrada en los protocolos presentados más adelante.

B. Vacunas de refuerzo

Las vacunas de refuerzo preferidas utilizadas en los experimentos mostrados más adelante fueron formuladas para contener la proteína gD del VHS de tipo 2, cepa 186. La proteína gD fue producida en un baculovirus y después purificada como se describe en V. Landolfi et al, Vaccine, 11: 407-414 (1993). La proteína heterodimérica IL-12 recombinante murina fue obtenida del Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA. Como alternativa, la proteína IL-12 puede prepararse como se describe en la patente US nº 5.457.038, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Preferentemente, se mezclaban dosis adecuadas de proteína gD y proteína IL-12 y se aplicaban en un solo sitio para la inmunización. Como alternativa, las proteínas gD e IL-12 pueden coadministrarse de forma secuencial o administrarse por vías y sitios diferentes a los ilustrados más adelante en los protocolos de los Ejemplos 2 y 3.

Una forma de realización de la vacuna de refuerzo contenía 50 \mug de proteína gD/ml de solución salina tamponada con fosfato (3 \mug/dosis), pH 7,4. Otra forma de realización de la vacuna de refuerzo contenía 50 \mug de proteína gD/ml de solución salina tamponada con fosfato (3 \mug/dosis), y 200 microgramos de fosfato de aluminio (Wyeth-Lederle Vaccines) por dosis. Otra forma de realización adicional de la vacuna de refuerzo contenía 50 \mug de proteína gD/ml de solución salina tamponada con fosfato (3 \mug/dosis), 200 microgramos de fosfato de aluminio por dosis, y 1 \mug/dosis de proteína IL-12 murina [Genetics Institute, Inc.] en solución salina tamponada con fosfato, pH 7, 4.

Ejemplo 2 Comparación de los protocolos de vacuna A. Protocolos

Se utilizaron catorce grupos (n=5/grupo) de ratones Balb/c hembras de siete semanas de edad (Charles River Laboratories) en este experimento. En el día 0, se administraron a los grupos las siguientes formulaciones de sensibilización:

: Los grupos 1-5 fueron inmunizados en el día 0 por vía intramuscular (i.m.) Con el plásmido pMVgD descrito en el Ejemplo 1 a una dosis de 25 \mug y con los dos plásmidos de IL-12 descritos anteriormente en el Ejemplo 1 por vía intramuscular a una dosis de 35 \mug/plásmido.

: Los grupos 6-10 y 12 no recibieron inmunización en el día 0.

: El grupo 11 recibió solamente los dos plásmidos de IL-12 descritos anteriormente en el Ejemplo 1 por vía i.m. a una dosis de 35 \mug/plásmido en el día 0.

: El grupo 13 recibió 1 x 10^{5} UFP de virus VHS1 de tipo salvaje, vivo, infeccioso, cepa NS (obtenida del Dr. H. Friedman, Hospital Infantil de Filadelfia) en un volumen de 0,03 ml mediante inyección en la almohadilla plantar realizada en el día 0.

: El grupo 14 recibió 2 x 10^{3} UFP de virus VHS2 de tipo salvaje, vivo, infeccioso, cepa 186 (American Type Culture Collection), administrado en un volumen de 0,03 ml mediante inyección en la almohadilla plantar realizada en el día 0.

Después de cuatro semanas, los grupos de animales recibieron los siguientes "refuerzos":

: Los grupos 1 y 6 recibieron una segunda administración (por la misma vía y a la misma dosis) de los plásmidos que contenían gD2 y IL-12.

: Los grupos 2 y 7 recibieron una segunda administración (por la misma vía y a la misma dosis) del plásmido de gD2 solamente.

: Los grupos 3 y 8, sin embargo, recibieron los componentes de la segunda vacuna. La proteína gD2 de longitud completa, producida y aislada a partir de un baculovirus como se ha descrito en el Ejemplo 1, se administró por vía i.m. a una dosis de 3 \mug, y la proteína heterodimérica IL-12 murina recombinante (rmIL-12) en PBS se administró a una dosis de 1 \mug/dímero por vía i.m.

: Los grupos 4 y 9 recibieron sólo la proteína gD2 de longitud completa a una dosis de 3 \mug en PBS por vía i.m.

: Los grupos 5, 10, 13 y 14 no recibieron segunda administración.

: El grupo 11 recibió una segunda administración solamente con los plásmidos que contenían la IL-12 heterodimérica por la misma vía y a la misma dosis utilizada en las primeras administraciones; y el grupo 12 recibió solamente la rmIL-12 por la misma vía y a la misma dosis especificadas anteriormente.

A las cuatro semanas posteriores a la última inmunización se tomaron muestras de sangre y se extrajeron los bazos de los animales, y se sometieron a ensayos ELISA y de linfoproliferación, como se describe en York et al, Vaccine, 13: 1706-1712 (1995). Se realizaron ensayos de CTL como se describe en York, citado anteriormente, con las siguientes modificaciones: se infectaron células A20 con virus VHS2 (MDI: 4 UFP/célula) durante 4 horas a 37°C, con CO_{2} al 5%, y se inactivaron con luz UV. Estas células fueron empleadas como células estimuladoras en una relación 1:20 (células A20 infectadas con VHS2 e inactivadas con luz UV: células del bazo).

Además, se realizó un ensayo colorimétrico de microneutralización del suero para detectar VHS-1 y VHS2 utilizando la línea celular comercial ELVIS™ HSV [Biowhittaker, Inc.]. Brevemente, el ensayo implicaba la incubación de una cantidad predeterminada del virus con varias diluciones de muestras de suero termoinactivado o testigos que sólo contenían medio de cultivo (testigos del virus) durante 1 hora a 37°C, con CO_{2} al 5%, con o sin complemento de cobayas, seguido por el sembrado en monocapas confluentes de células ELVIS HSV. Tras incubar en las mismos condiciones, se añadió a las monocapas medio de sustitución ELVIS y se incubaron durante otras 18 horas. El medio se eliminó y se añadió NP40-MEM al 1,5% (0,05 ml/pocillo) y se mantuvo cada una de las placas de microvaloración a -70°C durante por lo menos 4 horas. Una vez descongelados los lisados a 37°C, se añadió un volumen igual de un sustrato de \beta-galactosidasa y las placas se incubaron a 37°C durante 40 minutos. Se determinó la DO a 570 nm. El título de neutralización se definió como la dilución del suero que disminuía la DO del virus testigo en un 50%.

Se realizó una tinción interna de citocinas, esencialmente según She et al, Intern'l. Immunol., 110:845-957 (1999), con las siguientes modificaciones. Se incubaron células del bazo a 37°C, con CO_{2} al 5%, durante 3 días con VHS2 (10^{6} UFP/2 x 10^{6} células del bazo) termoinactivado (56°C/30 minutos). Los antígenos de referencia fueron los marcadores de linfocitos (CD3, CD4 o CD8), el antígeno de activación CD25, y la citocina (IFN-\gamma o IL-10).

B. Resultados de los análisis

Las respuestas humorales presentadas en los ensayos ELISA y de neutralización se ilustran más adelante en la Tabla 1 en forma de media geométrica de los títulos (GMT) de IgG_{1}, IgG_{2} y GMT de neut., que es la media geométrica del título de actividad de neutralización del suero. Se trata de una expresión de transformación logarítmica de la capacidad del suero de prueba para neutralizar la infectividad vírica in vitro. "IC del 95% superior e inferior" son expresiones estadísticas de la variabilidad de las mediciones que engloban el intervalo alrededor de la media en el que deberían situarse el 95% de las observaciones.

Brevemente, los títulos máximos de IgG_{1} se obtuvieron en sueros procedentes de ratones sensibilizados con plásmidos de gD y de IL-12, y reforzados con la subunidad gD sin adyuvantes. También se apreció un aumento en el título de IgG_{1} en ratones que recibieron un refuerzo con proteínas gD e IL-12. Los ratones sensibilizados con el plásmido de gD y el plásmido de IL-12 que recibieron refuerzo con la proteína de la subunidad gD y la proteína IL-12 presentaron títulos extremadamente elevados de anticuerpos de IgG_{2a}. También se observaron títulos elevados de IgG_{2a} en ratones que había recibido refuerzo con la subunidad gD sola. Esta observación sugiere que la sensibilización con plásmido de una respuesta de anticuerpos dominante Th1 se mantiene y aumenta cuando se refuerza con la subunidad. Los títulos de neutralización del suero eran paralelos a los de ELISA, observándose elevados títulos en los ratones inmunizados con plásmido y reforzados con la subunidad, o con la subunidad gD y la proteína IL-12.

En el caso de los grupos de ratones que recibieron la subunidad gD sin adyuvante (es decir, una formulación tradicional), la subunidad gD, administrada como se ha descrito anteriormente, dio lugar a elevados títulos de anticuerpos de IgG_{1} en ELISA y niveles moderados a elevados de anticuerpos de neutralización del suero. La subunidad formulada de forma tradicional fue invariablemente incapaz de provocar anticuerpos de IgG_{2a} en ELISA o respuestas de inmunidad celular (CMI). En contraposición, en la forma de realización de la invención, la coformulación con IL-12 amplió la respuesta hasta incluir IgG_{2a} y CMI. Este perfil de respuesta (denominado perfil de respuesta de tipo 1) aumentó al máximo con la sensibilización con ADN y el refuerzo con subunidades. Véanse los resultados del Ejemplo 3 a efectos de comparación.

El análisis estadístico (ANOVA) de los datos serológicos indicó que el grupo sensibilizado con el ADN de gD y el ADN de la IL-12 y reforzado con la subunidad gD/IL-12 (Grupo 3) era claramente el grupo que presentaba la mejor respuesta en el Ejemplo 2. Este grupo presentaba asimismo los segundos máximos títulos séricos de IgG_{1} contra la gD y era a este respecto estadísticamente superior al resto de los grupos, con la excepción del grupo 4, sensibilizado con el ADN de gD y el ADN de IL-12, y reforzado con la subunidad gD. El grupo 4, sensibilizado con el ADN de gD y el ADN de IL-12, y reforzado con la subunidad gD fue el grupo que presentaba la segunda mejor respuesta en términos de títulos séricos neutralizantes contra el VHS y de IgG_{2a} contra la gD. La única diferencia entre el grupo 4 y el grupo 3, el grupo que presentaba la mejor respuesta, fue la ausencia de la IL-12 en la porción de refuerzo con subunidades de la pauta de inmunización, que dio lugar a menores títulos de IgG_{2a} contra la gD y títulos séricos neutralizantes contra el VHS. El análisis estadístico de todos los títulos de neutralización con sus correspondientes títulos de anticuerpos de IgG_{1} o de IgG_{2a} contra la gD indicó la existencia de una correlación positiva (P=0,0001) entre los títulos de anticuerpos de IgG_{2a} contra la gD y una actividad neutralizante contra el VHS, sin que se observase correlación entre el título de IgG_{1} y los títulos neutralizantes.

TABLA 1A Títulos de IgG_{1} en ELISA

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	IgG_{1}	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	1161	9772	138
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD	2004	23933	168
	ADN de IL12
3	ADN de gD +	subunidad gD +	14825	45082	4875
	ADN de IL12	proteína IL-12
4	ADN de gD +	subunidad gD	21627	78705	5943
	ADN de IL12
5	ADN de gD +	ninguno	916	13122	64
	ADN de IL12
6	ninguna	ADN de gD +	214	2917	16
		ADN de IL12
7	ninguna	ADN de gD	3155	7145	1396
8	ninguna	subunidad gD +	6152	6982	5433
		proteína IL-12
9	ninguna	subunidad gD	2786	3556	2183
10	ninguna	ninguno	25	25	25
11	ADN de IL12	ADN de IL12	25	25	25
12	ninguna	proteína IL-12	25	25	25
13	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	2518	10000	632
	UFP
14	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	126	2388	7
	UFP

TABLA 1B Títulos de IgG_{2} en ELISA

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	IgG_{2a}	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	6412	11298	3639
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD	14125	42073	4742
	ADN de IL12
3	ADN de gD +	subunidad gD +	114551	199986	65615
	ADN de IL12	proteína IL-12
4	ADN de gD +	subunidad gD	65766	205116	21135
	ADN de IL12
5	ADN de gD +	ninguno	1213	18923	78
	ADN de IL12
6	ninguna	ADN de gD +	181	1824	18
		ADN de IL12
7	ninguna	ADN de gD	2018	3614	1127
8	ninguna	subunidad gD +	3069	3890	2427
		proteína IL-12
9	ninguna	subunidad gD	158	1337	19
10	ninguna	ninguno	25	25	25
11	ADN de IL12	ADN de IL12	25	25	25
12	ninguna	proteína IL-12	25	25	25
13	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	4285	5420	3388
	UFP
14	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	14488	69502	3027
	UFP

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TABLA 1C Títulos de neutralización

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	Neut.	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	70	398	12
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD	243	1230	48
	ADN de IL12
3	ADN de gD +	subunidad gD +	2594	4256	1581
	ADN de IL12	proteína IL-12

TABLA 1C (continuación)

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	Neut.	al 95%	al 95%
4	ADN de gD +	subunidad gD	1236	21577	71
	ADN de IL12
5	ADN de gD +	ninguno	17	70	4
	ADN de IL12
6	ninguna	ADN de gD +	5	6	5
		ADN de IL12
7	ninguna	ADN de gD	9	23	3
8	ninguna	subunidad gD +	35	101	12
		proteína IL-12
9	ninguna	subunidad gD	5	5	5
10	ninguna	ninguno	5	5	5
11	ADN de IL12	ADN de IL12	5	5	5
12	ninguna	proteína IL-12	5	5	5
13	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	618	1358	281
	UFP
14	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	145	205	103
	UFP

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados de las respuestas celulares en el ensayo de linfoproliferación se ilustran en la Tabla 2. Este ensayo permitía la enumeración de la blastogénesis de inmunocitos específica de antígenos y servía como aproximación de primer grado a las respuestas celulares. El ensayo implicaba la reestimulación de células del bazo (o de los ganglios linfáticos) durante aproximadamente 5 días en presencia del antígeno de prueba. Las células se incubaron a continuación con timidina tritiada y después se recogieron y se utilizaron en un ensayo para determinar la captación de isótopo, que es un correlato de la síntesis de ADN y de la división celular. Las unidades en las que se expresaban los resultados de este ensayo eran cuentas por minuto (CPM), un correlato directo de la captación de isótopo. Se incluyeron las CPM del testigo con medio en la tabla para poner de manifiesto toda actividad no específica observada en una población de células dada (es decir, la población con VHS1 presentaba niveles relativamente elevados de actividad de fondo, que podrían afectar a la magnitud aparente de la respuesta a los antígenos de prueba).

Los resultados se expresan como índices de simulación en los casos en los que la actividad de las células del bazo de los ratones a los que se administró un inmunógeno dado y se reestimuló con antígeno de prueba se dividió por la actividad de una población de células "idéntica" reestimuladas con testigos, que incluían el medio, sobrenadante (Sob.) de cultivo de células Vero, o un virus distinto (A/Tx, una cepa del virus de la gripe). El efecto del sobrenadante de células Vero fue que todos los resultados fuesen aproximadamente 1,0, sin diferencias entre el sobrenadante de células testigo y la reestimulación con medio. Las columnas de especial interés fueron las columnas en las que las células fueron estimuladas con gD, VHS1 o VHS2 (antígenos específicos). En consonancia con las respuestas humorales, la máxima actividad proliferativa se observó en ratones que recibieron vacunas de sensibilización con plásmidos de gD y IL-12 con refuerzos de proteínas gD y IL-12.

TABLA 2 Linfoproliferación

Grupos	Sensibilización	Refuerzo	gD	VHS1	VHS2	A/Tx	Sob. de Vero	Media (CPM)
1	ADN de gD/ADN	ADN de gD/ADN	4,9	5,0	5,0	1,3	1,0	5540
	de IL12	de IL12
2	ADN de gD/ADN	ADN de gD	4,0	4,0	3,2	1,4	0,9	3515
	de IL12
3	ADN de gD/ADN	gD/IL-12	8,1	7,2	11,0	1,4	1,0	3576
	de IL12
4	ADN de gD/ADN	gD	4,7	4,9	7,5	1,7	1,0	5744
	de IL12
5	ADN de gD/ADN	Ninguno	3,0	4,1	4,5	1,4	0,9	5070
	de IL12
6	Ninguna	ADN de gD/ADN	1,9	2,1	3,1	1,1	0,8	7551
		de IL12
7	Ninguna	ADN de gD	2,9	3,4	4,1	1,6	0,7	3452
8	Ninguna	gD/IL-12	2,3	2,0	3,4	2,0	0,8	3873
9	Ninguna	gD	2,8	2,3	1,2	1,2	0,9	5780
10	Ninguna	Ninguno	0,6	1,5	1,7	1,3	0,8	4491
11	ADN de IL12	ADN de IL12	0,7	1,5	1,8	1,7	0,8	2491
12	Ninguna	IL-12	0,8	1,5	1,3	1,4	0,7	2802
13	VHS1	Ninguno	0,9	4,6	3,4	0,8	0,9	20025 \;
14	VHS2	Ninguno	1,7	7,1	9,8	1,2	0,8	9050

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Los resultados de los ensayos de CTL y del ensayo de tinción de citocinas internas se presentan más adelante en la Fig. 1 y las Tablas 3 y 4. No se realizaron análisis estadísticos con estos datos debido a que se utilizó una muestra mezclada sin mediciones repetidas. Sin embargo, el experto en la materia apreciará que la elevación relativa de la magnitud de la respuesta y los niveles de actividad observados en una amplia gama de relaciones de células efectoras:dianas son indicativos de resultados positivos, como se explica más adelante.

La Fig. 1 ilustra en forma gráfica la actividad CTL del grupo 1 (gDpl12pl/(2)), grupo 2 (gDpl12pl/gDpl), grupo 3 (gDpl12pl/gDpr12pr), grupo 4 (gDpl12pl/gDpr), grupo 13 (VHS1 vivo) y grupo 14 (VHS2 vivo). Todos estos grupos presentaron actividad CTL detectable, a diferencia de otros grupos. Sin embargo, la sensibilización con plásmidos de gD y IL-12, seguido por un refuerzo con la subunidad gD y la proteína IL-12 dio lugar a mayores niveles de actividad CTL, comparables, en los casos de elevadas relaciones efector:diana, a la actividad citotóxica observada en los animales testigo con virus.

Las Tablas 3 y 4 ilustran la tinción de citocinas internas para interferón-\gamma e interleucina 4. Los datos de citocinas internas hacían referencia a la frecuencia relativa de células que presentaban de forma simultánea marcadores fenotípicos específicos (CD3= todas las células T; CD4= células T facilitadoras; CD8= células T citotóxicas), un marcador de la activación celular (CD25) y la expresión interna del interferón gamma (IFN-\gamma, un correlato de la respuesta de tipo 1) o IL-4 (un correlato de la respuesta de tipo 2). Estos ensayos se realizaron para definir mejor el estado de activación y el fenotipo de las células secretoras de citocinas atribuible a la pauta de inmunización, y sirvieron como datos para corroborar los resultados de CTL de la Fig. 1. Las referencias en la columna del antígeno (Ag) son virus VHS2 termoinactivado (VHS2) y células A20 infectadas con el virus VHS (A20). La tinción coordinada de citocinas internas IFN-\gamma, CD4 o correceptor CD y el marcador de activación de células T CD24 indicaba que la inmunización con ADN de gD y ADN de IL-12, seguido por el refuerzo con la subunidad gD y la proteína IL-12 generaba niveles elevados de células productoras de IFN-\gamma. Dichas células fueron observadas a niveles comparables a los de los testigos con virus, y seguían un patrón similar, caracterizado por un perfil fenotípico CD4+. La actividad de IL-4 detectada fue escasa o inexistente en todos los grupos de tratamiento. En general, un aumento de aproximadamente dos veces en la frecuencia de células, en relación con los testigos, es indicativo de una alteración importante desde el punto de vista biológico.

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TABLA 3 Tinción de citocinas internas en poblaciones de linfocitos activadas correspondiente a IFN\gamma

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	Antígeno	% de tinción
				CD3/IFN\gamma/	CD4/IFN\gamma/	CD8/IFN\gamma/
				CD25	CD25	CD25
1	ADN de gD/ADN	ADN de gD/ADN	VHS2	13,9	14,0	9,3
	de IL12	de IL12
2	ADN de gD/ADN	ADN de gD	VHS2	11,1	11,7	7,5
	de IL12
3	ADN de gD/ADN	gD/IL-12	VHS2	17,3	24,7	7,9
	de IL12
4	ADN de gD/ADN	gD	VHS2	10,9	13,9	5,7
	de IL12
5	ADN de gD/ADN	Ninguno	VHS2	9,5	14,2	6,2
	de IL12
6	Ninguna	ADN de gD/ADN	VHS2	10,0	7,9	6,0
		de IL12
7	Ninguna	ADN de gD	VHS2	8,2	11,8	6,8
8	Ninguna	gD/IL-12	VHS2	5,7	7,6	9,8
9	Ninguna	gD	VHS2	2,0	1,3	5,3
10	Ninguna	Ninguno	VHS2	4,1	3,5	7,0
11	ADN de IL12	ADN de IL12	VHS2	2,8	3,0	8,2
12	Ninguna	IL-12	VHS2	2,3	2,2	6,1
13	VHS1	Ninguno	VHS2	16,6	19,5	7,2
14	VHS2	Ninguno	VHS2	22,6	27,5	9,8
3a	ADN de gD/ADN	gD/IL-12	A20	17,3	25,6	5,0
	de IL12
Testigo	VHS1	Ninguno	A20	16,4	20,5	6,5
Testigo	Ninguna	Ninguno	A20	6,5	9,4	3,2

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TABLA 4 Tinción de citocinas internas en poblaciones de linfocitos activadas correspondiente a IL-4

Grupo	Sensibilización	Refuerzo	Antígeno	% de tinción
				CD3/IFN\gamma/	CD4/IFN\gamma/	CD8/IFN\gamma/
				CD25	CD25	CD25
1	ADN de gD/ADN	ADN de gD/ADN	VHS2	1,5	2,7	2,1
	de IL12	de IL12
2	ADN de gD/ADN	ADN de gD	VHS2	1,3	3,0	3,4
	de IL12
3	ADN de gD/ADN	gD/IL-12	VHS2	2,0	1,7	2,7
	de IL12
4	ADN de gD/ADN	gD	VHS2	1,9	3,4	1,1
	de IL12
5	ADN de gD/ADN	Ninguno	VHS2	1,5	2,4	3,2
	de IL12
6	Ninguna	ADN de gD/ADN	VHS2	1,5	2,4	1,9
		de IL12
7	Ninguna	ADN de gD	VHS2	1,1	1,8	3,7
8	Ninguna	gD/IL-12	VHS2	1,8	3,1	3,6
9	Ninguna	gD	VHS2	1,6	2,2	3,3
10	Ninguna	Ninguno	VHS2	0,5	2,1	1,5
11	ADN de IL12	ADN de IL12	VHS2	0,9	1,7	2,4
12	Ninguna	IL-12	VHS2	0,7	1,6	2,0
13	VHS1	Ninguno	VHS2	0,6	0,2	1,8
14	VHS2	Ninguno	VHS2	0,2	1,6	0,2
3a	ADN de gD/ADN	gD/IL-12	A20	0,1	0,6	0,5
	de IL12
Testigo	VHS1	Ninguno	A20	0,8	0,4	0,0
Testigo	Ninguna	Ninguno	A20	0,0	nd	nd

Ejemplo 3 Comparación de protocolos de vacunas A. Protocolos

Se utilizaron quince grupos (n=5/grupo) de ratones Balb/C en este experimento. Los grupos 1-5 fueron inmunizados en el día 0 por vía intramuscular (i.m.) con el plásmido pMVgD descrito en el Ejemplo 1 a una dosis de 25 \mug y con los dos plásmidos de IL-12 descritos anteriormente en el Ejemplo 1 por vía i.m. a una dosis de 35 \mug/plásmido. Los grupos 6-7 recibieron sólo los dos plásmidos de IL-12 descritos anteriormente en el Ejemplo 1 por vía i.m. a una dosis de 35 \mug/plásmido en el día 0. Los grupos 8-15 no recibieron inmunización en el día 0.

Después de cuatro semanas, los grupos de animales recibieron los siguientes "refuerzos": Los grupos 1-5 recibieron una administración repetida utilizando las mismas dosis y vías de los plásmidos gD2 y de IL-12. Los grupos 6-7 también recibieron una dosis repetida de la primera composición para sensibilización. El grupo 8 recibió 1 x 10^{5} UFP del virus VHS1, cepa NS, vivo, infeccioso, de tipo salvaje, administrado en un volumen de 0,03 ml mediante inyección en la almohadilla plantar. El grupo 9 recibió 2 x 10^{3} UFP del virus VHS2, cepa 186, vivo, infeccioso, de tipo salvaje, en un volumen de 0,03 ml mediante inyección en la almohadilla plantar. El grupo 10 no recibió ninguna administración a las cuatro semanas. El grupo 11 recibió la proteína gD2 de longitud completa, administrada por vía i.m. a una dosis de 3 \mug. El grupo 12 recibió por vía i.m. la proteína gD2 de longitud completa (3 \mug/dosis) junto con 200 \mug/dosis de fosfato de aluminio como adyuvante. El grupo 13 recibió la proteína gD2 de longitud completa a una dosis de 3 \mug y la proteína heterodimérica rmIL-12 en PBS administrada por vía i.m. a una dosis de 1 \mug/dímero mezclada en PBS y administrada por vía i.m. El grupo 14 recibió la proteína gD2 (0,3 \mug/dosis) junto con fosfato de aluminio como adyuvante y la proteína heterodimérica mIL-12 (1,0 \mug/dosis) mezclada en PBS y administrada por vía i.m. El grupo 15 recibió sólo la proteína mIL-12 por vía i.m. a una dosis de 1 \mug/dímero.

\global\parskip0.990000\baselineskip

En el punto temporal correspondiente a la octava semana, se trataron los mismos grupos de animales experimentales de la siguiente manera:

Los grupos 1 y 8-10 no recibieron nada. El grupo 2 recibió una tercera dosis de los plásmidos de gD2/IL-12 que comprendía las dosis primera y segunda. El grupo 3 recibió otra dosis solamente con el plásmido de gD. Los grupos 4 y 13 recibieron la proteína gD2 de longitud completa administrada por vía i.m. a una dosis de de 3 \mug y la proteína heterodimérica rmIL-12 administrada a una dosis de 1 \mug/dímero mezclada en PBS y administrada por vía i.m. Los grupos 5 y 11 recibieron sólo la subunidad gD2 de longitud completa. El grupo 6 recibió sólo los plásmidos con IL-12. El grupo 7 recibió sólo la proteína IL-12. El grupo 12 recibió una segunda dosis de la subunidad gD con adyuvante de aluminio. El grupo 14 recibió una segunda dosis, con adyuvante de aluminio, de la subunidad gD con las proteínas heterodiméricas mIL-12. El grupo 15 recibió solamente una segunda dosis de las proteínas heterodiméricas mIL-12.

En la semana 12, se extrajo sangre de los animales y se utilizó para los ensayos ELISA, de neutralización y de linfoproliferación descritos anteriormente en el Ejemplo 2.

B. Resultados de los ensayos

Los títulos en los ensayos ELISA y de neutralización para los grupos de este experimento se ilustran más adelante en la Tabla 5. Los resultados de este experimento contrastan con los resultados del Ejemplo 2 anterior. El contraste es especialmente llamativo en el grupo que recibió dos inmunizaciones con los plásmidos de gD y de IL-12, seguido por un refuerzo, con adyuvante, con la subunidad gD (Grupo 3). Los títulos de ELISA y de neutralización no fueron significativamente diferentes de los generados por dos dosis de los plásmidos de gD y los plásmidos de IL-12 sin refuerzo con proteínas. Este tipo de observación ha sido previamente comprobada con inmunizaciones repetidas utilizando plásmidos de gD y de IL-12. En contraposición, dos inmunizaciones con plásmidos de gD y de IL-12, seguido por un refuerzo con proteínas gD e IL-12 (Grupo 4) dio lugar a títulos extremadamente elevados de IgG_{2a} en ELISA y de neutralización, incluso en comparación con dos inóculos de la subunidad gD formulada con la proteína IL-12, con adyuvante de fosfato de aluminio (Grupo 14). Véase la explicación que sigue a la Tabla 1.

El análisis estadístico (ANOVA) de los datos serológicos indicó que el grupo 4, que había recibido dos inmunizaciones con ADN de gD y ADN de IL-12 y había sido reforzado con proteínas gD/IL-12, era, con mucho, superior a todos los demás grupos en lo relativo a títulos séricos máximos de anticuerpos neutralizantes contra el VHS y de IgG_{2a} contra la gD.

TABLA 5A Títulos de IgG_{1} en ELISA

Grupo	Sensibilización	1.^{er} refuerzo	2.º refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	= semana 8	IgG_{1}	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	ninguno	2636	9419	736
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD +	2851	21979	370
	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12
3	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD	1374	7780	243
	ADN de IL12	ADN de IL12
4	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD +	4395	5395	3589
	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12
5	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD	2173	3311	1426
	ADN de IL12	ADN de IL12

TABLA 5A (continuación)

Grupo	Sensibilización	1.^{er} refuerzo	2.º refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	= semana 8	IgG_{1}	al 95%	al 95%
6	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12	101	161	64
7	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12	94	139	64
8	ninguna	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	499	2323	107
		UFP
9	ninguna	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	769	1710	347
		UFP
10	ninguna	ninguno	ninguno	70	126	39
11	ninguna	subunidad gD	subunidad gD	5572	7079	4375
12	ninguna	gD/AlPO_{4}	gD/AlPO_{4}	58479	122462	27990
13	ninguna	gD + IL12	gD + IL12	9162	11668	7194
14	ninguna	gD/AlPO_{4} + IL12	gD/AlPO_{4} + IL12	12162	16181	9120
15	ninguna	IL12	IL12	99	416	24

TABLA 5B Títulos de IgG_{2} en ELISA

Grupo	Sensibilización	1.^{er} refuerzo	2.º refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	= semana 8	IgG_{1}	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	ninguno	2642	4775	1462
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD +	2399	3162	1824
	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12
3	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD	3548	7745	1626
	ADN de IL12	ADN de IL12
4	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD +	92045	121619	69823
	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12
5	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD	3899	18793	809
	ADN de IL12	ADN de IL12
6	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12	73	249	21
7	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12	25	25	25
8	ninguna	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	3155	56494	176
		UFP
9	ninguna	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	1986	7211	547
		UFP
10	ninguna	ninguno	ninguno	47	97	23
11	ninguna	subunidad gD	subunidad gD	44	115	17

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TABLA 5B (continuación)

Grupo	Sensibilización	1.^{er} refuerzo	2.º refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	= semana 8	IgG_{1}	al 95%	al 95%
12	ninguna	gD/AlPO_{4}	gD/AlPO_{4}	78	312	19
13	ninguna	gD + IL12	gD + IL12	2891	4667	1795
14	ninguna	gD/AlPO_{4} +	gD/AlPO_{4} + IL12	22387	39355	12764
		IL12
15	ninguna	IL12	IL12	40	93	17

TABLA 5C Títulos de neutralización

Grupo	Sensibilización	1.^{er} refuerzo	2.º refuerzo	GMT de	IC superior	IC inferior
	= semana 0	= semana 4	= semana 8	Neut.	al 95%	al 95%
1	ADN de gD +	ADN de gD +	ninguno	21	105	4
	ADN de IL12	ADN de IL12
2	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD +	80	473	14
	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12
3	ADN de gD +	ADN de gD +	ADN de gD	102	242	43
	ADN de IL12	ADN de IL12
4	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD +	4955	9162	2679
	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12
5	ADN de gD +	ADN de gD +	subunidad gD	266	1919	37
	ADN de IL12	ADN de IL12
6	ADN de IL12	ADN de IL12	ADN de IL12	5	5	5
7	ADN de IL12	ADN de IL12	proteína IL12	5	5	5
8	ninguna	VHS1 1 x 10^{5}	ninguno	708	1462	344
		UFP
9	ninguna	VHS2 2 x 10^{3}	ninguno	136	617	30
		UFP
10	ninguna	ninguno	ninguno	5	5	5
11	ninguna	subunidad gD	subunidad gD	163	558	48
12	ninguna	gD/AlPO_{4}	gD/AlPO_{4}	365	1778	75
13	ninguna	gD + IL12	gD + IL12	875	3133	244
14	ninguna	gD/AlPO_{4} + IL12	gD/AlPO_{4} + IL12	2037	3199	1297
15	ninguna	IL12	IL12	5	5	5

Los resultados del ensayo de linfoproliferación de los mismos grupos se ilustran en la Tabla 6. Estas respuestas fueron similares a las de los grupos del Ejemplo 2. Sin embargo, tras la inmunización adicional, los grupos 2, 3, 4, y 5, que había recibido todos 3 inmunizaciones con vacunas de gD, mostraron respuestas linfoproliferativas superiores a los índices de estimulación del grupo 14. Estas respuestas se deben al efecto de la pauta mixta de sensibilización/refuerzo, en comparación con el esquema tradicional de inmunización con subunidad/AlPO_{4}.

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La actividad CTL de estos grupos se ilustra en la Tabla 7. La enumeración de la actividad CTL de estos grupos experimentales incluía un análisis de la población total, así como la reducción selectiva de las células CD4+ o CD8+. La Tabla 7 indica que la máxima actividad tuvo lugar en células procedentes de ratones inmunizados dos veces con plásmidos de gD y de IL-12, y que recibieron refuerzos con la subunidad gD y la proteína IL-12. El análisis de reducción indicó que la citólisis era casi exclusivamente atribuible a las poblaciones CD4+ en todos los grupos excepto en los testigos con VHS2, en los que se observó un fenotipo mixto. La abreviatura "nd" significa no determinado.

El significado biológico de estos datos radica en la relativa elevación de la actividad presentada por los animales sujetos a la pauta mixta de sensibilización-refuerzo, en comparación con los tratamientos tradicionales. Además, el hecho de que en el modelo de ratón Balb/C prácticamente toda la actividad CTL se refiere a la población de células CD4+ correlaciona estrechamente con los datos de citocinas internas descritos anteriormente. De este modo, la pauta de sensibilización-refuerzo da lugar a aumentos, debidos al tratamiento, en la frecuencia de células CD4/CD25/IFN\gamma.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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Los resultados descritos anteriormente para los Ejemplos 2 y 3 indican las ventajas de una pauta de sensibilización-refuerzo para el protocolo de vacuna de VHS, en el que se utilizan plásmidos que expresan el gen gD2 y la citocina IL-12 para la sensibilización de la respuesta inmunitaria, seguido por una formulación de refuerzo que consta de una subunidad gD2 y de las proteínas IL-12. Esta pauta parece que promueve la sensibilización de un perfil de respuesta Th1 dominante, que aumenta significativamente con el refuerzo con proteínas. Además, se incrementan los efectos cualitativos y cuantitativos de este tipo de pauta tanto en las respuestas humorales como celulares.

El atractivo de la formulación de la vacuna contra la subunidad gD del VHS con IL-12 radica en la capacidad de esta citocina para modular un cambio en el perfil de la respuesta, asociado típicamente a vacunas con subunidades, desde una respuesta dominante de tipo 2 (caracterizada por la presencia de IL-4, IL-5, IL-10 y la inducción predominante de respuestas humorales) a un perfil dominante de tipo 1 (con elevados niveles de IL-2 y IFN-\gamma, asociado a la inducción de respuestas celulares así como a subtipos IgG fijadores de complemento). El perfil de respuesta de tipo 1 ha sido estrechamente asociado a la inmunidad protectora contra diversos patógenos intracelulares, y se considera un elemento importante en la indicación terapéutica para la infección por VHS. La presente invención aprovecha la capacidad del ADN (antígeno gD del VHS + IL-12) para sensibilizar de forma eficaz el sistema inmunitario, que se refuerza después de forma significativa mediante la administración de la glucoproteína gD del VHS y la IL-12.

Claims

1. Utilización de una cantidad eficaz de una composición de vacuna de ADN que comprende una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del Virus del herpes simple (VHS) de tipo 1 o de tipo 2, y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica cada subunidad del heterodímero de la interleucina-12; y una cantidad eficaz de una composición de vacuna con proteínas que comprende la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2 y el heterodímero de IL-12, en la preparación de un kit de vacuna de VHS para generar inmunidad protectora en un mamífero contra el virus del herpes simple.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que existen dos inmunizaciones con la composición de vacuna de ADN.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición de vacuna de ADN comprende además un anestésico local en una cantidad que forma un complejo con dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS en la composición de vacuna de ADN es una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 2, y en la que dicha proteína gD del VHS en la composición de vacuna con proteínas es la proteína gD del VHS de tipo 2.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS en la composición de vacuna de ADN es una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 1, y en la que dicha proteína gD del VHS en la composición de vacuna con proteínas es la proteína gD del VHS de tipo 1.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende un primer plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la p35 de IL-12 unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína p35 en una célula de mamífero, y un segundo plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la p40 de IL-12 unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína p40 en una célula de mamífero.

7. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha primera molécula de ácido nucleico comprende dicha secuencia de ADN que codifica gD unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína gD en una célula de mamífero.

8. Utilización según la reivindicación 3, en la que dicho complejo tiene un diámetro de entre aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm.

9. Utilización según la reivindicación 3, en la que dicho anestésico local es la bupivacaína.

10. Utilización según la reivindicación 3, en la que dicha composición de vacuna de ADN comprende además uno o más compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos neutros, tensioactivos aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes neutros, y detergentes aniónicos.

11. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichas subunidades del heterodímero de IL-12 comprenden la subunidad p35 y la subunidad p40.

12. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha vacuna de ADN se administra 2 a 32 semanas antes de la administración de dicha vacuna con proteínas.

13. Kit de vacuna contra el Virus del Herpes Simple (VHS) que comprende:

(a): una composición de vacuna de ADN que comprende:

(i): una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2, y

(ii): una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica cada subunidad del heterodímero de la interleucina-12; y

(b): una composición de vacuna con proteínas que comprende:

(i): la proteína gD del VHS de tipo 1 o de tipo 2; y

(ii): el heterodímero de IL-12.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que dicha composición de vacuna de ADN comprende además un anestésico local en una cantidad que forma un complejo con dichas moléculas de ácido nucleico (i) y (ii).

15. Kit según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS en la composición de vacuna de ADN es una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 2, y en el que dicha proteína gD del VHS en la composición de vacuna con proteínas es la proteína gD del VHS de tipo 2.

16. Kit según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS en la composición de vacuna de ADN es una secuencia de ADN que codifica la proteína gD del VHS de tipo 1, y en el que dicha proteína gD del VHS en la composición de vacuna con proteínas es la proteína gD del VHS de tipo 1.

17. Kit según la reivindicación 13, en el que dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende un primer plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la p35 de IL-12 unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína p35 en una célula de mamífero, y un segundo plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la p40 de IL-12 unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína p40 en una célula de mamífero.

18. Kit según la reivindicación 13, en el que dicha primera molécula de ácido nucleico comprende dicha secuencia de ADN que codifica gD unida funcionalmente a un promotor adecuado que dirige la expresión de dicha proteína gD en una célula de mamífero.

19. Kit según la reivindicación 14, en el que dicho complejo tiene un diámetro de entre aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm.

20. Kit según la reivindicación 14, en el que dicho anestésico local es la bupivacaína.

21. Kit según la reivindicación 13, en el que dichas subunidades del heterodímero de IL-12 comprenden la subunidad p35 y la subunidad p40.