JPWO2019044925A1 - 改変型HSV gDタンパク質及びこれを含むワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
(1)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質D(gD)の改変タンパク質(改変型HSV gDタンパク質)であって、野生型HSV gDのエクトドメイン(ectodomain)において、レセプター結合ドメイン(RBD)に存在するB細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いB細胞エピトープ(デコトープ)の少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gDタンパク質。
(2)RBDに存在するB細胞エピトープが、配列番号1に記載のアミノ酸配列における134番目のアルギニン残基、139番目のアスパラギン酸残基、及び222番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、(1)の改変型HSV gDタンパク質。
(3)デコトープは、gDエクトドメインのN末端プロリン・リッチ領域(PRR)に存在するB細胞エピトープである、(1)又は(2)の改変型HSV gDタンパク質。
(4)デコトープは、
野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型HSV gDのエクトドメインの結晶構造の表面において、上記50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、(3)の改変型HSV gDタンパク質。
(5)デコトープの改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び/又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、(1)〜(4)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(6)デコトープの改変は、デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、(5)の改変型HSV gDタンパク質。
(7)デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、(5)又は(6)の改変型HSV gDタンパク質。
(8)デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、(5)〜(7)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(9)野生型HSV gDのエクトドメインは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、
デコトープの改変は、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、51番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、76番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも1つの改変を含む、(5)の改変型HSV gDタンパク質。
(10)糖鎖がN型糖鎖である、(5)〜(9)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(11)改変型HSV gDタンパク質はさらに、HSV gDのエクトドメインのC末端側に少なくとも1つのプロミスキュアスT細胞エピトープが連結されている、(1)〜(10)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(12)プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、(11)の改変型HSV gDタンパク質。
(13)プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、(12)の改変型HSV gDタンパク質。
(14)改変型HSV gDタンパク質はさらに、野生型HSV gDの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における251〜315番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の少なくとも一部の欠損を含む、(1)〜(13)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(15)改変型HSV gDタンパク質はさらに、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における231番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されることによって行われる改変を含む、(1)〜(14)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(16)HSVが、HSV−1又はHSV−2である、(1)〜(15)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(17)(1)〜(16)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質を含む、HSVワクチン。
(18)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質D(gD)の改変タンパク質(改変型HSV gDタンパク質)であって、野生型HSV gDのエクトドメイン(ectodomain)において、gDエクトドメインのN末端プロリン・リッチ領域(PRR)に存在するB細胞エピトープの少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gDタンパク質。
(19)PRRに存在するB細胞エピトープは、
野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型HSV gDのエクトドメインの結晶構造の表面において、上記50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、(18)の改変型HSV gDタンパク質。
(20)改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、(18)又は(19)の改変型HSV gDタンパク質。
(21)改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、(20)の改変型HSV gDタンパク質。
(22)改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、(20)又は(21)の改変型HSV gDタンパク質。
(23)改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、(20)〜(22)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(24)野生型HSV gDのエクトドメインは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、
改変は、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、51番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、76番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも1つの改変を含む、
(20)の改変型HSV gDタンパク質。
(25)改変型HSV gDタンパク質はさらに、HSV gDのエクトドメインのC末端側に少なくとも1つのプロミスキュアスT細胞エピトープが連結されている、(19)〜(24)のいずれかの改変型HSV gDタンパク質。
(26)プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、(25)に記載の改変型HSV gDタンパク質。
(27)プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、(26)の改変型HSV gDタンパク質。
<scFv−phageの取得>
HSV−2 gD(gD2)の網羅的エピトープ解析を実施するため、gD2を対象としたバイオパンニングによってgD2上の様々なエピトープと結合する様々な抗体を取得した。gD2としては、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する、HSV−2の333株に由来する野生型の可溶性エクトドメイン(ectodomain)であるgD1−315タンパク質を用いた。gD1−315タンパク質は宿主細胞にて発現させ、精製した。ライブラリーとしてはヒトB細胞由来のmRNAから作製されたヒトVH及びVL cDNAを使用して調製されたscFv−phageディスプレイライブラリーを用いた。scFv−phageディスプレイライブラリーは、ヒトB細胞由来のmRNAからヒトVH及びVL cDNAを使用して調製されたscFv−phageディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、HSV−2 gDへの反応性を有するscFv−phageを得た。
パンニング実施後、単離したscFv−phageを発現させた。各scFv遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌TG1株を2×YTCG培地(37℃)で培養し、M13K07ヘルパーファージをmoi=20で感染させた後、2×YTCK培地(25℃)、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたscFv−phageは20%−PEG−2.5M塩酸ナトリウムによる濃縮を行った。
取得された7種類のscFv−phageを基にscFv−hFcを作製した。単離したscFv遺伝子の可変領域をヒトFc遺伝子と連結し、pCAGベクターにクローニングし、scFv−hFc発現プラスミドを構築した。各発現用プラスミドはExpi293発現システム(Life technology)を用いて発現した。4〜6日間の培養の後、その上清をProtain A アフィニティクロマトグラフィーカラム(HiTrap Protein A HP Columns、GE Healthcare)によって精製し、PBSで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 5/150 GL、GE Healthcare)とSDS−PAGEによって確認した。
作製したscFv−hFcについて、gDのレセプターであるNectin−1を使用した競合阻害試験を実施した。
結果を表2に示す。競合のパターンにより7種類のscFv−phageを3つのグループに分類した。グループAに属する抗体No.82はNectin−1と強く競合したため、Nectin−1結合領域にエピトープが存在すると示唆された。グループBにはNo.1のみ属し、他の抗体及びレセプターNectin−1と競合しなかった。グループCは残りの5クローン(No.5、No.13、No.72、No.75、No.78)から成り、互いに競合する一方で、レセプターNectin−1とは競合しなかった。
重鎖CDR1:GYAIN (配列番号9)
重鎖CDR2:GIMPIFGTSNYAQKFQ (配列番号10)
重鎖CDR3:DWGAPLEKGAGSPFDV (配列番号11)
軽鎖CDR1:RASQSVSSSYLA (配列番号12)
軽鎖CDR2:GASSRAT (配列番号13)
軽鎖CDR3:QQYGSSPRS (配列番号14)
<変性によるエピトープ解析>
変性状態のgD1−315を用いたWestern blottingによって、各抗体のエピトープがコンフォメーション(conformational)エピトープであるかリニア(linear)エピトープであるかを解析した。
N−結合型糖鎖の導入によるgD改変体を用いたエピトープマスキング法を検討した。糖鎖の導入部位の選定にあたっては既に報告されている結晶構造(非特許文献1、2及び6)に基づき、結晶構造表面に露出しており、二次構造を取っていないループ部位を対象とした。図1にgDの一次構造の模式図を示しており、FR1(K1〜H39)、FR2(I55〜R184)、FR3(T251〜G315)がそれぞれ示されている。また、本来gDに付加されている糖鎖は、N94、N121及びN262に結合している。糖鎖導入部位として、P50(SC−F)、P54(SC−K)、P74(SC−D)、S85(SC−L)、G103(SC−E)、D172(SC−M)、R186(SC−A)、L195(SC−H)、及びH242(SC−B)の9つを選定した。
SC-A-Fw: 5’-CGGGCCAATGCCTCCTGCAAGTACGCT-3’(配列番号15)
SC-A-Re: 5’-GGAGGCATTGGCCCGGTGCTCCAGGAT-3’(配列番号16)
SC-B-Fw: 5’-GGGTGGAATGGCACCAAGCCCCCGTACACCAGC-3’(配列番号17)
SC-B-Re: 5’-GGGCTTGGTGCCATTCCACCCGGCGATTTTTAA-3’(配列番号18)
SC-D-Fw: 5’-CATGCCAATTCGACCGCCCCCCAGATCGTGCGC-3’(配列番号19)
SC-D-Re: 5’-GGGGGCGGTCGAATTGGCATGTAGGAGCACGCT-3’(配列番号20)
SC-E-Fw: 5’-CGCATGAATGACACCTGCGCTATCCCCATCACG-3’(配列番号21)
SC-E-Re: 5’-AGCGCAGGTGTCATTCATGCGATACCAGGCGAT-3’(配列番号22)
SC-F-Fw: 5’-TTCCAGAATGCAAGCATCCCGATCACTGTGTAC-3’(配列番号23)
SC-F-Re: 5’-CGGGATGCTTGCATTCTGGAACGGGTCCTCCAG-3’(配列番号24)
SC-H-Fw: 5’-CTCCCCAATCGCACGCCCCCGGCAGCGTGCCTC-3’(配列番号25)
SC-H-Re: 5’-CGGGGGCGTGCGATTGGGGAGAGCGTACTTGCA-3’(配列番号26)
SC-K-Fw: 5’-AGCATCAATATCACTGTGTACTACGCA-3’(配列番号27)
SC-K-Re: 5’-AGTGATATTGATGCTGGGGGGCTGGAA-3’(配列番号28)
SC-L-Fw: 5’-GGGGCTAATGACACCGCCCGAAAGCACACGTAC-3’(配列番号29)
SC-L-Re: 5’-TCGGGCGGTGTCATTAGCCCCGCGCACGATCTG-3’(配列番号30)
SC-M-Fw: 5’-ATAAACAATTGGACGGAGATCACACAA-3’(配列番号31)
SC-M-Re: 5’-CGTCCAATTGTTTATCTTCACTAGCCG-3’(配列番号32)
gD1−275、gD25−253、gD34−315という3種類の欠損改変体を全合成によって作製した(図1)。
上記で得られた情報を基に、アラニン置換体を用いて、抗体No.82のエピトープが存在すると予測されたNectin−1結合領域であるレセプター結合ドメイン(RBD)、及びP50(SC−F)の周辺領域をアラニンスキャニングした。構造上表面に露出していると考えられるアミノ酸を中心に選出し、アミノ酸をアラニンに置換した変異体14個、中和抗体LP2のブロッキング変異体であるT213M、S216Nを作製した。各アラニンに改変した遺伝子をPCRによって構築し、pCAGGS1−dhfr−neoにクローニングした。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。
7つの抗体クローンのin vitroでのHSV中和活性解析を、プラーク数減少(プラークリダクション)試験及びCell to cell感染拡大抑制試験にて実施した。
対象とするウイルスはATCCから購入した、Human herpesvirus 2(HSV−2) MS株(VR−540)及びHuman herpesvirus 1(HSV−1)KOS株(VR−1493)の2種を用いた。ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはATCCから購入したVero細胞(CCL.81)を使用した。Vero細胞は、37℃、5%CO2条件下で培養する。拡張、維持、解析プレート作製時は、10%FBS含有MEM培地を使用し、感染価測定及び中和抗体価測定時は、2%FBS含有MEM培地を使用した。中和試験及び後述の感染防御能解析に用いるウイルスバンクは、以下の方法によって調製した。HSV−2 MS株及びHSV−1 KOS株をm.o.i=0.01〜1でフルシートのVero細胞に接種し、2〜3日間2%FBS含有MEM培地で培養した。回収した感染細胞培養ボトルを3回凍結融解して細胞を破砕後、TOMY遠心器で室温にて3500rpmで10分遠心し、上清をHSV−2ウイルスバンク及びHSV−1ウイルスバンクとした。
(プラーク数減少試験)
プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約100PFUのHSV−2 MS株又はHSV−1 KOS株と混合後、37℃にて1時間反応させた。48ウェルプレートにフルシートになったVero細胞に反応液を播種し、30℃にて1時間吸着後に1%メチルセルロース含有MEM(2%FBS)培地で24時間培養後、メタノールとエタノールを1対1で混合した50%メタノール/50%エタノール(−20℃)で、−20℃にて30分間不活化及び固定を行った。その後、抗HSV gDモノクローナル抗体を37℃にて1時間反応させ、抗マウスIgG−HRP(Dako P0447)とTMBHで免疫染色し、ELISPOTアナライザー(ImmunoSpot S6 Analyzer、CTL社)で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフト(BioSpot CTL社)でプラーク数をカウントした。
Cell to Cell感染拡大抑制活性測定は、48ウェルプレートにフルシートになったVero細胞に約100PFUのHSV−2 MS株又はHSV−1 KOS株を接種し、30℃で1時間吸着した。その後、所定濃度の被験抗体を含有した1%メチルセルロース含有MEM(2%FBS)培地(抗体濃度は5μg/mL、25μg/mL及び125μg/mL)を添加し、HSV−2 MS株は約40時間培養後、HSV−1 KOS株は約48時間培養後、50%メタノール/50%エタノール(−20℃)で、−20℃にて30分間不活化及び固定を行った。その後、自家調製した抗HSV gDモノクローナル抗体を37℃にて1時間反応させ、抗マウスIgG−HRPとTMBHで免疫染色し、ELISPOTアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラークサイズの平均値を解析した。
実験結果を表5に示す。プラーク数減少活性については、MS株(HSV−2)及びKOS株(HSV−1)のそれぞれに対して各抗体の最終濃度を50μg/mL、10μg/mL及び2μg/mLに設定し、各濃度における測定は2ウェルずつ検出して平均値を取った。その結果、Aグループに分類されgDレセプター結合ドメイン(RBD)上(及びFR1上)にエピトープ領域を有する抗体No.82が、HSV−1及びHSV−2の両株に対して最も顕著なプラーク数減少活性を示した。これに対して、Bグループに分類されFR3にエピトープ領域を有する抗体No.1は両株に対するプラーク数減少活性を全く示さなかった。また、C1グループに分類されP50周辺或いはその他の不明な部分にエピトープ領域を有する抗体No.5及び抗体No.13のHSV−1及びHSV−2に対する中和活性はいずれも相対的に弱く、HSV−1に対してはパーシャル阻害のパターンを示した。ここで、「パーシャル阻害」とは、中和活性が相対的に弱く、また用量依存的な低下が明確に確認されていない場合をいう。さらに、C2グループに分類されP50周辺(及びFR3)にエピトープ領域を有する抗体No.72及び抗体No.75はいずれもHSV−1よりもHSV−2に対する中和活性が顕著に弱く、抗体No.72はHSV―2に対してはパーシャル阻害のパターンを示した。また同じくC2グループに分類される抗体No.78の両株に対する中和活性に然程偏りは認められないが、その強度は抗体No.82に比して見劣りのするものであった。抗体No.78は、用量依存的に阻害するが5倍段階希釈の傾きに対し、阻害効果の傾きがほかのものと比べて、緩やかなパターンを示した。
抗gD2抗体No.82のヒト型抗体scFv−hFcに加えて、Fc領域をマウス型にしたヒト−マウスキメラIgG、及びFc領域をモルモット型にしたヒト−モルモットキメラIgGを調製し、それぞれのHSV−2(MS株)及びHSV−1(KOS株)に対する中和活性(プラーク数減少活性)を検討した。
単離したscFv 遺伝子のVH領域をマウスIgG2aに由来するH鎖定常領域遺伝子(CH1−CH2−CH3)と連結し、pCAGベクターにクローニングし、H鎖発現プラスミドを構築した。また、scFv遺伝子のVL領域をマウスCL遺伝子と連結し、pCAGベクターにクローニングし、L鎖発現プラスミドを構築した。発現には、Expi293発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4〜6日で培養上清を回収した。培養上清をHi Trap ProteinA HP Column(GEヘルスケア)を用いて精製し、PBSで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィーとSDS−PAGEによって確認した。以上の方法によりヒト−マウスキメラIgG2aを得た。
単離したscFv遺伝子のVH領域をモルモットIgG2に由来するH鎖定常領域遺伝子(CH1−CH2−CH3)と連結し、pCAGベクターにクローニングした。また、同様にscFv 遺伝子のVL領域をモルモットCK遺伝子と連結し、pCAGベクターにクローニングした。次に、クローニングされた抗体遺伝子をPCRにより増幅し、pXCベクター(ロンザ社)にクローニングし、H鎖及びL鎖の発現プラスミドを構築した。その後、両プラスミドを連結して、1つの発現プラスミドとした。発現にはCHO細胞を使用した。発現プラスミドをCHO細胞に安定導入させ、GS Xceed expression system(ロンザ社)を利用して、抗体高発現CHO細胞を取得した。高発現細胞を12日間Fed−Batch培養し、培養上清を回収した。培養上清をrProteinA sepharose Fast Flow(Cat#17127903/GEヘルスケア)を用いて精製し、ヒト‐モルモットキメラIgG2κ抗体を得た。
抗gD2抗体No.82のscFv−hFc、ヒト−マウスキメラIgG、及びヒト−モルモットキメラIgGを用いて、実施例4と同様にウイルス中和活性(プラーク数減少活性)について解析した。その結果を表6に示した。抗体No.82のscFv−hFc、ヒト−マウスキメラIgG、及びヒト−モルモットキメラIgGのいずれも、MS(HSV−2)及びKOS(HSV−1)の両株に対して0.05μg/mL又はそれ以上の濃度では50%プラーク数減少活性を示した。
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗gD2抗体No.82の予防的投与及び治療的投与における感染防御能を評価した。
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗HSV gD2モノクローナル抗体の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。BALB/cマウス(5週齢、メス)を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水(saline)に溶解し、予防的投与の場合にはウイルス接種24時間前に、また治療的投与の場合にはウイルス接種48時間後に、いずれも200μL/匹の容量にて腹腔内投与した。1群あたりN=10の例数を設定した。ウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種6日前にDepo−Proveraを2mg/匹で皮下接種した。麻酔下で5×105PFU/20μLのHSV−2 MS株を経腟接種し、21日間経過観察を行った。生存日数(生存率)及び症状スコアを指標に感染防御能を評価した。症状スコアは、膣病変症状の有無及び程度によってスコアを定義し各群における平均値を示した。スコアの付け方として、0:変化なし、1:部分的な紅斑・腫脹、2:広範囲の腫脹・浮腫、3:潰瘍・出血、4:死亡、とした。回復の見込みのない重篤な全身症状(立毛、麻痺、震戦、痙攣等)が認められた場合、その日はスコアを3.5とし、犠牲死させ、次の日に死亡として扱いスコアを4とした。
予防的投与における、投与量別の生存日数を表7に、生存率を図4に、症状スコアを図5にそれぞれ示す。治療的投与における、投与量別の生存日数を表8に、生存率を図6に、症状スコアを図7にそれぞれ示す。
モルモット性器ヘルペス感染モデル(急性期)を用いて、抗gD2抗体No.82の予防的投与及び治療的投与における感染防御能を評価した。
モルモット性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗gD2抗体No.82(ヒト−モルモットキメラIgG2κ)の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。SLC社から購入したHartleyモルモット(3〜5週齢、メス)を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水(saline)に溶解し、予防的投与の場合にはウイルス接種24時間前に、また治療的投与の場合にはウイルス接種4日間後に、いずれも1mg〜30mg/kg/匹の容量にて腹腔内投与した。治療的投与の場合は、投与前に症状観察を行い、膣症状を呈している個体を選別し、各群の平均スコアに偏りが生じないようにランダマイズした。1群あたりN=10〜15の例数を設定した。ウイルス接種は麻酔下で5×105PFU/50μLのHSV−2 MS株を経腟接種し、急性期症状を接種後2〜3週間観察した。症状スコアは、0:明確な病変なし、0.5−1:紅斑、1.5−2:限局的な水泡、2.5−3:限局的な潰瘍又は痂皮、3−5:広範に及ぶ水泡・潰瘍又は痂皮、3−7:失禁を伴う広範な潰瘍又は痂皮、7.5:重篤な症状による安楽殺、8:死亡とした。また、ウイルス接種後7日目において、膣拭い液(膣swab)を採取し、プラーク法によってウイルス放出量を測定した。膣Swabは、MEM培地で湿潤させた綿棒を膣内に挿入後、膣内壁の粘膜を拭い取るようにして採取した。採取した膣swabは、シリコナイズドチューブに1mLずつ分注したMEM培地にて懸濁し、使用時まで凍結保存した。膣swabを原液、10倍、100倍、1000倍希釈し、100uL/ウェルで96ウェル又は48ウェルにフルシートになったVero細胞に接種した。膣Swab接種後37℃で1時間ウイルス吸着を行い、1%メチルセルロース含有2%FBS MEM培地で24〜72時間培養した後に、所定の方法でプラーク数を計測した。
予防的投与における症状スコアを図8に示す。治療的投与の結果における、症状スコアを図9に、膣拭い液中のHSV放出量を図10にそれぞれ示す。
<HSV gD2上に存在するHLA Class II拘束性プロミスキュアスT細胞エピトープクラスター配列の探索>
GenBankに公開されているHSV−2 333株のgD2全長アミノ酸配列(ABU45433.1;配列番号3)に関して、EpiVax社のアルゴリズム(EpiMatrix)を用いて、HLA Class II拘束性プロミスキュアスT細胞エピトープクラスター配列を探索した。当該クラスター配列は、EpiMatrixが解析対象とする8種類の主要なHLA DR super type(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)のうちの大部分に対して結合する可能性が高い(Z−Score≧1.64)と予測される15〜25アミノ酸からなるペプチド配列である。
C.T.L社から販売されているヒトPBMC提供者の血清を抗HSV IgG抗体検出ELISA kit(デンカ生研)を用いてスクリーニングし、HSV既感染(抗体陽性)ドナー由来のPBMCを購入した。EpiVax社のアルゴリズムに組み込まれている8種類の主要なHLA DR super type(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)遺伝子のいずれかのホモ接合体又はヘテロ接合体を有し、HSV暴露歴の有るドナーのPBMCの凍結サンプルを購入した。また、非特異的な応答を解析するために、抗HSV抗体陰性ドナー由来PBMCも購入した(Donor 14、67)。
T細胞刺激活性解析は、合成ペプチドのマウス免疫原性試験によって行われた。合成ペプチドをDMSOにて10mMに溶解又は懸濁したstock solutionを調製した。また投与用の溶媒として、NIKKOL HCO−60(日光ケミカルズ株式会社製)を用いて10%HCO−60/saline(注射用生理食塩水)を調製した。合成ペプチド100μgをCpG10μg及びMPLA10μgと共に溶媒に混合し210μL/匹の容量に調製して、マウス(4〜5週齢、雌)の背部皮下に投与した。マウスはBALB/c(I−Ad/I−Ed)、C57BL/6(I−Ab)、C3H/HeN(I−Ak/IEk)の3系統を用いた。初回免疫から21日後に追加免疫を行い、その2週間後に脾臓を回収し脾細胞を調製して、以下のサイトカイン産生応答解析(ELISpot解析)に供した。調製した脾細胞を1×106細胞/ウェルになるようにPVDF膜96ウェル(MSIPS4W10 Millipore)に播種し、各種ペプチド10μMと20時間培養した。培養は、RPMI1640培地を用いて10%FBS存在下で、37℃かつCO2濃度5%に設定したインキュベーターにて実施した。陽性対照としてCon A添加群を設定した。IFN−γ産生細胞の検出はmouse IFN gamma ELISPOT Ready−SET−Go!(登録商標、ebioscience 88−7384−88)を用いて行なった。ELISpot analyzer(CTL Immunospot S5 versa analyzer)で画像を取り込み、スポット数をimmunospot softwareでカウントした。
実際のヒト血清中に含まれる抗HSV gD抗体のポピュレーションを解析するために、ヒトガンマグロブリンカクテルであるベニロン(献血ベニロン(登録商標)−I静注用、一般財団法人化学及血清療法研究所)を用いて、取得された抗体との競合試験を行った。競合試験としてgD1−315とベニロンを反応させた後にモノクローナル抗体を反応させた。この系では、ベニロンに含まれる競合抗体の量が多いほど当該モノクローナル抗体(被検抗体)の結合量が少なくなり、競合率は高くなると考えられる。競合試験にはSPR(Biacore)を用いた。
競合試験はBiacore 3000(GE Healthcare)を使用して行われた。すべての実験においてHBS−EP buffer(GE Healthcare)を使用し、温度は25℃、流速は10μL/分に設定した。Sensor chipはNTA(GE Healthcare)を使用した。推奨されたプロトコルに基づき、0.5mM NiCl2を10秒反応させた。次に、gD1−315−Hisを3μg/mLで60秒反応させ、約300 resonance units(RU)固相化した。Biacoreを表面プラズモン共鳴センサーとして用いて解析を行った場合、得られるシグナル値である「RU」は、1mm2あたり物質が1pg結合したときの単位として表される。また、chipの再生については350mM EDTAで10秒、2回、chip表面を処理し、Bufferで10秒洗浄した。新たな検体を測定するたびに固相化及び再生を同様の方法で実施した。競合率は次のように算出された。濃度20μg/mLの検討する抗体を流速20μL/分で120秒アプライし、増加したRUを(1)とし、濃度150μg/mLのベニロンを流速20μL/分で120秒アプライし続けて、その後、濃度20μg/mL抗体120秒アプライし、増加したRUを(2)とした時、(1−(2)/(1))×100の計算式によって競合率を計算した。すべてのサンプルは一回のみ測定した。
ベニロン競合試験の解析結果を表11に示す。最も高い競合率を示したのは弱中和抗体である抗体No.5であり、次いで抗体No.13、抗体No.75、抗体No.78、抗体No.72とP50周辺領域にエピトープを有する抗体群が上位を占めた。一方、抗体No.82は7クローン中、6番目であり相対的に低い競合率を示し、最も低いものは抗体No.1であった。
本発明者らは、中和抗体のエピトープが存在するRBDが有益なエピトープ領域とし、有益性の低い抗体群のエピトープが存在するP50周辺領域及びFR3をデコイ領域とし、中和抗体をより多く誘導できるgDタンパク質改変体の設計にあたって、有益なエピトープを際立たせること、デコイ領域中のエピトープを糖鎖導入や欠損変異等によって脱エピトープ化すること、さらに、プロミスキュアスT細胞エピトープクラスターペプチドを連結することによって、液性免疫応答、細胞性免疫応答の双方を効率的・効果的に惹起できること、の3つの観点から、以下のようにgD改変体を設計し、その中和抗体の誘導活性を調べた。
野生型HSV gD抗原上に存在する有益なエピトープとして、抗gD2抗体No.82のエピトープであるgDレセプター結合ドメイン(RBD)、及びT細胞エピトープ解析より予測されたプロミスキュアスT細胞エピトープクラスターDP5(gD2 334−350;配列番号8)を想定し、また相対的に有益性の低い抗体群のエピトープが集中しているデコイ領域としてP50周辺領域を想定した。
以上の三つの方針に基づき、gD2の改変を進め、計16種類の改変体を得た(表12)。改変体の作製は、以下に示す方法に従って行った。
gD1−275、gD1−315のプラスミド構築、糖鎖を導入する際に使用したプライマーに関しては、前述の通りである。T細胞エピトープペプチドを導入する場合には、目的のgD配列のC末端残基(D275又はG315)に続けてリンカー(GPGPG)、各T細胞エピトープペプチド、6×His−tagの順で連結するようにDNAを設計し、全長を人工遺伝子合成し、pUC19ベクターにクローニングした。完成した改変体配列をpCAGGS1−dhfr−neoベクターにクローニングし、発現用プラスミドを得た。
(抗体及びgD改変体の発現、精製)
各抗gD2モノクローナル抗体及び各gD改変体はExpi293発現システムを用いて発現した。4〜6日間の培養の後、その上清をProtain A アフィニティクロマトグラフィーカラム又はNi−NTA アフィニティクロマトグラフィーカラムによって精製し、PBSで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィーとSDS−PAGEによって確認した。
リン酸緩衝生理食塩水で濃度2μg/mLに調整した100μLのgD改変体を96ウェルマイクロタイタープレートに、4℃にて一晩かけて固相化した。各ウェルをPBSで3回洗浄し、300μLの1%BSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。各ウェルをPBS−T(0.05%Tween PBS)で3回洗浄し、各抗gD2抗体を1%BSA PBSに任意の希釈倍率で希釈し、100μLで加え、37℃にて一時間反応させた。再度各ウェルをPBS−Tで洗浄し、HRP標識抗体(anti−hFc/HRP/1%BSA PBS)を加え、37℃にて一時間反応させた。各ウェルをPBS−Tで洗浄し、TMBで室温にて30分発色させ、1N硫酸で反応を停止させた後、450nm/650nmの吸光度を測定した。
(マウス免疫原性試験)
野生型gD抗原gD1−315(WT)を陽性対照、salineを陰性対照として、改変型gD抗原の免疫原性試験を実施した。MPLA(10μg/匹)及びCpG(1μg/匹)と共に、所定量の抗原を注射用生理食塩水(saline)に溶解し、200μL/匹の容量でマウスに免疫した。試験には、BALB/cマウス(5週齢、メス)を用い、2週間間隔で合計3回、背部皮下に免疫した(1群あたりN=4の例数で実施)。最終免疫(3回目)から2週間後に、個体毎に採血し血清を調製した。調製した血清を段階希釈し、HSV−2に対する中和抗体誘導活性(プラーク数50%減少活性)を評価した。
(マウス感染防御試験)
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、改変型gD抗原の予防的投与における感染防御試験を実施した。前述のマウス免疫原性試験と同様にして、1群あたりN=10の例数にてマウスを免疫した。最終免疫(3回目)から2週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種6日前にDepo−Proveraを2mg/匹で皮下接種した。麻酔下で5×105PFU/20μLのHSV−2 MS株を経腟接種し、21日間経過観察を行った。生存日数(生存率)を指標に感染防御能を評価した。
マウス免疫原性試験及びマウス感染防御試験において野生型gD(gD1−315)に比して優越性が認められた一連の改変型gDのうち、gD1−315v3−55及びgD1−315v5−55について、そのメカニズムを調べるために免疫血清の解析を行った。目的とする抗体No.82様抗体の効率的な誘導が実際に引き起こされているのか否かについて調べた。抗体量を揃えるために、血清からIgGを精製し、SPR(Biacore)を用いた競合法により解析した。
抗gD2抗体競合試験は、Biacore 3000(GE Healthcare)を使用して行い、すべての実験においてHBS−EP buffer (GE Healthcare)を使用し、温度は25℃、流速は20μL分に設定した。Sensor chipはCM5 sensor chip(GE Healthcare)を使用し、推奨されたプロトコルに基づいて実験を行った。chip表面にはgD1−315−Hisを約300 RU固相化し、chipの再生には0.1MかつpH2.0のグリシン−塩酸緩衝液を用い、流速30μL/分で30秒、2回洗浄した。競合の手順、競合率の算出は次のように行った。各種抗gD2抗体10μg/mL又はbufferをchipに結合1分、解離2.5分の条件でアプライし、その後IgG精製した各種免疫血清20μg/mLを結合1分、解離5分の条件でアプライする。bufferアプライ後、免疫血清をアプライしたときに検出されたRUを100%とし、抗gD2抗体アプライによる免疫血清のレスポンスの低下を競合率として算出した。
さらに、改変型gD免疫血清によるgD−HVEM相互作用に対する阻害についても解析した。具体的には、リン酸緩衝生理食塩水で濃度5μg/mLに調整した100μLのgD1−305−cys−strep dimerを96ウェルマイクロタイタープレートに、4℃にて一晩かけて固相化した。その後、上記競合ELISAの方法と同様にブロッキング、洗浄を行い、各免疫血清から精製したIgGを任意の濃度で100μL添加し、室温にて一時間反応させた。その後、1μg/mLのHVEM(Recombinant Human HVEM/TNFRSF14 Fc Chimera Protein、R&D SYSTEMS)を1%BSA PBSに任意の希釈倍率で希釈し、100μLでそれぞれ添加し、さらに室温にて1時間反応させた。再度各ウェルをPBS−Tで洗浄し、HRP標識抗体(anti−hFc/HRP/1%BSA PBS)を反応させた。各ウェルをPBS−Tで洗浄し、発色させ、1N硫酸で反応を停止させた後、450nm/650nmの吸光度を測定した。
Claims (27)
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質D(gD)の改変タンパク質(改変型HSV gDタンパク質)であって、野生型HSV gDのエクトドメイン(ectodomain)において、レセプター結合ドメイン(RBD)に存在するB細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いB細胞エピトープ(デコトープ)の少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gDタンパク質。
- 前記RBDに存在するB細胞エピトープが、配列番号1に記載のアミノ酸配列における134番目のアルギニン残基、139番目のアスパラギン酸残基、及び222番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項1に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記デコトープは、gDエクトドメインのN末端プロリン・リッチ領域(PRR)に存在するB細胞エピトープである、請求項1又は2に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記デコトープは、
野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型HSV gDのエクトドメインの結晶構造の表面において、前記50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、請求項3に記載の改変型HSV gDタンパク質。 - 前記デコトープの改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び/又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、請求項5に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項5又は6に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記デコトープの改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記野生型HSV gDのエクトドメインは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、
前記デコトープの改変は、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、51番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、76番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも1つの改変を含む、
請求項5に記載の改変型HSV gDタンパク質。 - 前記糖鎖がN型糖鎖である、請求項5〜9のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変型HSV gDタンパク質はさらに、HSV gDのエクトドメインのC末端側に少なくとも1つのプロミスキュアスT細胞エピトープが連結されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、請求項11に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、請求項12に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変型HSV gDタンパク質はさらに、前記野生型HSV gDの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における251〜315番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の少なくとも一部の欠損を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変型HSV gDタンパク質はさらに、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における231番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されることによって行われる改変を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記HSVが、HSV−1又はHSV−2である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質を含む、HSVワクチン。
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質D(gD)の改変タンパク質(改変型HSV gDタンパク質)であって、野生型HSV gDのエクトドメイン(ectodomain)において、gDエクトドメインのN末端プロリン・リッチ領域(PRR)に存在するB細胞エピトープの少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gDタンパク質。
- 前記PRRに存在するB細胞エピトープは、
野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型HSV gDのエクトドメインの結晶構造の表面において、前記50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、請求項18に記載の改変型HSV gDタンパク質。 - 前記改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、請求項18又は19に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、請求項20に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項20又は21に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記改変は、野生型HSV gDのエクトドメインの、配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項20〜22のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記野生型HSV gDのエクトドメインは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、
前記改変は、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における50番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、51番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号1に記載のアミノ酸配列における74番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、76番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号1に記載のアミノ酸配列における186番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも1つの改変を含む、
請求項20に記載の改変型HSV gDタンパク質。 - 前記改変型HSV gDタンパク質はさらに、HSV gDのエクトドメインのC末端側に少なくとも1つのプロミスキュアスT細胞エピトープが連結されている、請求項19〜24のいずれか一項に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、請求項25に記載の改変型HSV gDタンパク質。
- 前記プロミスキュアスT細胞エピトープは、配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスT細胞エピトープである、請求項26に記載の改変型HSV gDタンパク質。
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