JPWO2019044925A1 - 改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質及びこれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在するＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープ（デコトープ）の少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質である。

Description

本発明は、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質及びこれを含むワクチンに関する。

ヒト単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）はヒトに広く蔓延している病原体である。ｄｓＤＮＡ ｖｉｒｕｓであるＨＳＶはアルファヘルペスウイルス亜科に属し、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２という二つの血清型が存在する。ＨＳＶはヒトに脳炎、髄膜炎、口唇ヘルペス、性器ヘルペス、皮膚疾患、角膜ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス等多様な疾患を引き起こす。このようにＨＳＶは医療衛生上極めて重要なウイルスであり、実際にアシクロビルやバラシクロビル等の効果的な抗ウイルス剤が開発されている。

しかしながら、これまでに開発されている抗ＨＳＶ剤は感染細胞内で増殖中のウイルスＤＮＡの複製を阻害するものであるため、ＤＮＡの状態で神経節内部に潜伏感染しているＨＳＶには効果を示さない。つまり、ＨＳＶに感染してしまった場合、潜伏感染部位からＨＳＶを除去することは既存の抗ＨＳＶ剤では不可能である。このような状況を打破するためには、初感染防御及び再発防御に共に有効な新規ワクチンの開発が必要である。

感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることができるＣｌａｓｓ Ｉ群病原体と、従来型ワクチンや病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得できないＣｌａｓｓ ＩＩ群病原体とに大別される。Ｃｌａｓｓ ＩＩ群病原体の防御が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている。ＨＳＶはＣｌａｓｓ ＩＩ群病原体に分類されるが、これはＨＳＶが免疫逃避機構を有し、宿主の免疫反応を巧妙にくぐり抜けているからであると考えられている。ＨＳＶワクチン開発に関しては、これまで弱毒生ワクチンやアジュバント不活化ワクチンを用いた検討が試みられてきたが、いずれもＴ細胞免疫、及びＢ細胞免疫共に応答が不十分であり、自然感染後に得られる不十分な免疫応答のレベルと大差無いものであった。

ＨＳＶは細胞表面への吸着、ウイルスレセプターとの会合、細胞膜とウイルスエンベロープの膜融合といったステップを通じて宿主細胞への侵入を達成する。このシステムは複数のウイルスエンベロープタンパク質が宿主細胞膜タンパク質と会合することによって引き起こされる。これまで、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、エンベロープ糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）、エンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、エンベロープ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、エンベロープ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）が知られており、これらのウイルスエンベロープタンパク質のうち、初めにｇＤが宿主細胞膜レセプターであるｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ）、Ｎｅｃｔｉｎ−１、又はＮｅｃｔｉｎ−２と複合体を形成する。複合体については結晶構造が報告されている（非特許文献１、２）。構造変化したｇＤはｇＨ／ｇＬと相互作用し、活性化されたｇＨ／ｇＬはさらにｇＢを活性化させる（非特許文献３）。ｇＢはレセプターである３−Ｏ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ （３−ＯＳ ＨＳ）又はＰＩＬＲαを通じて膜融合の主な機能を担っていると考えられている（非特許文献４、５）。このように、ＨＳＶ ｇＤのレセプターへの結合がウイルス侵入のトリガーとなっていることが示唆されている。

S. A. Connollyら、"Structure-Based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM)", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 76, No. 21, Nov. 2002, pages 10894-10904, ISSN: 0022-538X P. Di Giovineら、"Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1", PLoS Pathogens, Vol. 9, No. 7, Sep. 2011 S. D. Stampferら、"Stuck in the middle: structural insights into the role of gH/gL heterodimer in herpesvirus entry", Curr Opin Virol, Vol. 3, No. 1, Feb. 2013, pages 13-19 E. Trybalaら、"Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 Differ in Their Interaction with Heparan Sulfate", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 74, No. 19, Oct. 2000, pages 9106-9114, ISSN: 0022-538X J. Wangら、"Binding of Herpes Simplex Virus Glycoprotein B (gB) to Paired Immunoglobulin-Like Type 2 Receptor α Depends on Specific Sialylated O-Linked Glycans on gB", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 83, No. 24, Dec. 2009, pages 13042-13045, ISSN: 0022-538X A. Carfiら、"Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor HveA", Molecular Cell, Vol. 8, No. 1, July. 2001, pages 169-179 C. Krummenacherら、"Structure of unliganded HSV gD reveals a mechanism for receptor-mediated activation of virus entry", The EMBO Journal, Vol. 24, 2005, pages 4144-4153 N. Farleyら、"Recurrent vaginal shedding of herpes simplex type 2 virus in the mouse and effects of antiviral therapy", Antiviral Res. 2010 May; 86(2): 188-195. J. R. Gallagherら、"Displacement of the C terminus of herpes simplex virus gD is sufficient to expose the fusion-activating interfaces on gD", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 87, No. 23, Dec. 2013, pages 12656-12666, ISSN: 0022-538X D. Eggink ら、"Guiding the immune response against influenza virus hemagglutinin toward the conserved stalk domain by hyper glycosylation of the globular head domain", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 88, No. 1, Jan. 2014, pages 699-704, ISSN: 0022-538X Lu. Gら、"Crystal structure of herpes simplex virus 2 gD bound to nectin-1 reveals a conserved mode of receptor recognition", JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 88, No. 23, Dec. 2014, pages 13678-13688 Lee. CC ら、"Structural basis for the antibody neutralization of herpes simplex virus.", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, Vol. 69, Oct. 2013, pages 1935-45

上述したように、ＨＳＶの治療にはアシクロビル等の抗ウイルス薬が用いられている。しかし、これらの抗ウイルス薬は、ウイルスを完全に除去することはできず、また服用を中止するとウイルスが再活性化する。そのため、ＨＳＶの感染そのものを防御する予防用ワクチン或いは再発症状を軽減緩和する治療用ワクチンの開発が望まれるが、現在、有効なワクチンは存在せず、そのアンメットニーズは高い。

本発明は、免疫誘導に際して、野生型ＨＳＶ ｇＤに比べて、ＨＳＶ ｇＤに対する高い中和活性を示す中和抗体の含有割合が高い免疫血清を誘導でき、ＨＳＶ感染症の予防及び／又は治療に利用し得る、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質及びこれを含むワクチンを提供することを課題とする。

本発明者らは、ＨＳＶの主要な防御抗原の一つとして知られているｇＤタンパク質に関して、網羅的なＢ細胞エピトープ解析及びＴ細胞エピトープ解析を行い、防御活性発現において有益なエピトープと無益又は有害なエピトープとに分類することを試みた。そして、無益又は有害なエピトープを脱エピトープ化し、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、或いはプロミスキュアスＴ細胞エピトープ等の有益なエピトープを付加することによって、イムノ・リフォーカス（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）を誘導し、その中和抗体誘導能や細胞性免疫を増強させ、その結果として感染防御能を増強させた改変型ＨＳＶ ｇＤワクチンを完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
（１）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在するＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープ（デコトープ）の少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２）ＲＢＤに存在するＢ細胞エピトープが、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３４番目のアルギニン残基、１３９番目のアスパラギン酸残基、及び２２２番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、（１）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（３）デコトープは、ｇＤエクトドメインのＮ末端プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）に存在するＢ細胞エピトープである、（１）又は（２）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（４）デコトープは、
野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、上記５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、（３）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（５）デコトープの改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び／又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、（１）〜（４）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（６）デコトープの改変は、デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、（５）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（７）デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、（５）又は（６）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（８）デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、（５）〜（７）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（９）野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、
デコトープの改変は、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、５１番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、７６番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む、（５）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１０）糖鎖がＮ型糖鎖である、（５）〜（９）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１１）改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端側に少なくとも１つのプロミスキュアスＴ細胞エピトープが連結されている、（１）〜（１０）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１２）プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、（１１）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１３）プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、（１２）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１４）改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、野生型ＨＳＶ ｇＤの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５１〜３１５番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の少なくとも一部の欠損を含む、（１）〜（１３）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１５）改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３１番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されることによって行われる改変を含む、（１）〜（１４）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１６）ＨＳＶが、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である、（１）〜（１５）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１７）（１）〜（１６）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
（１８）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、ｇＤエクトドメインのＮ末端プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）に存在するＢ細胞エピトープの少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（１９）ＰＲＲに存在するＢ細胞エピトープは、
野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、上記５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープ
である、（１８）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２０）改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、（１８）又は（１９）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２１）改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、（２０）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２２）改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、（２０）又は（２１）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２３）改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、（２０）〜（２２）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２４）野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、
改変は、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、５１番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、７６番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む、
（２０）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２５）改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端側に少なくとも１つのプロミスキュアスＴ細胞エピトープが連結されている、（１９）〜（２４）のいずれかの改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２６）プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、（２５）に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
（２７）プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、（２６）の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。

本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質及びこれを含むワクチンによって免疫誘導した場合、野生型ＨＳＶ ｇＤで免疫誘導した場合に比べて、血清中に中和活性の高い中和抗体が相対的に多く含まれ得る。すなわち、本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質及びこれを含むワクチンはイムノ・リフォーカスを誘導し、ＨＳＶに対する強い防御効果をもたらすことが可能である。したがって、ＨＳＶ感染症に対して高い予防・治療効果が期待できる。

ＨＳＶ ｇＤの一次構造の模式図を示す図である。 実施例２の抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２とアラニン置換したｇＤ改変体との反応性を競合ＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。 ＨＳＶ ｇＤ結晶構造上のｇＤレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）周辺領域及びＰ５０周辺領域のＭＯＥ図を示す図である。 実施例５の抗ｇＤ抗体のマウスへの予防的投与後の生存率を示す図である。 実施例５の抗ｇＤ抗体のマウスへの予防的投与後の症状スコアを示す図である。 実施例５の抗ｇＤ抗体のマウスへの治療的投与後の生存率を示す図である。 実施例５の抗ｇＤ抗体のマウスへの治療的投与後の症状スコアを示す図である。 実施例６の抗ｇＤ抗体のモルモットへの予防的投与後の症状スコアを示す図である。 実施例６の抗ｇＤ抗体のモルモットへの治療的投与後の症状スコアを示す図である。 実施例６の抗ｇＤ抗体のモルモットへの治療的投与後の膣拭い液中のＨＳＶ放出量を示す図である。 実施例７の合成ペプチドのマウスのＴ細胞刺激活性解析を示す図であり、（Ａ）はＩＦＮ−γ産生ＥＬＩＳｐｏｔ解析の結果を示し、（Ｂ）はＩＬ−２産生ＥＬＩＳｐｏｔ解析の結果を示す。 改変型ｇＤタンパク質の設計戦略の模式図を示す図である。 実施例９の作出した各種ｇＤ改変体と抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２との反応強度を示す図である。 実施例９の作出した各種ｇＤ改変体とＨＶＥＭとの反応性を示す図である。 実施例９のマウスを用いた中和抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のマウスを用いた中和抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のマウスを用いた中和抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のマウスを用いた中和抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のマウスを用いた中和抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ結合抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ結合抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ結合抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ結合抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９のＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ結合抗体誘導活性の解析結果を示す図である。 実施例９の細胞性免疫（Ｔ細胞免疫）誘導活性の結果を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験１の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験１の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験１の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験２の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験３の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験４の生存率を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤのマウス感染防御試験の実験４の生存率を示す図である。 実施例９の免疫血清中の抗体ポピュレーションの解析結果を示す図である。 実施例９の改変型ｇＤ免疫血清によるｇＤ−ＨＶＥＭ相互作用に対する阻害の結果を示す図である。 ＨＳＶ−１由来ｇＤのアミノ酸配列（配列番号２）及びＨＳＶ−２由来ｇＤのアミノ酸配列（配列番号３）を多重整列した比較結果を示した図であり、斜体部はリーダー配列を示し、下線部はｇＤの５０−５４番目のアミノ酸残基（Ｐ５０−Ｐ５４）を示す。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在するＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープ（デコトープ）の少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変（脱エピトープ）されたタンパク質である。

本発明は、本発明者らが提案する仮説、ＨＳＶ ｇＤ抗原において「デコイ領域」が存在することに基づくものである。「デコイ領域」は、英語の「Ｄｅｃｏｙ（おとり）」に由来し、病原体が宿主の免疫反応から逃れる免疫逃避機構の一つと考えられる。「デコイ領域」は、中和抗体活性の無い又は低い抗体を誘導する抗原領域であり、この欺瞞的刷り込み（Ｄｅｃｅｐｔｉｖｅ Ｉｎｐｒｉｎｔｉｎｇ；「免疫偏向」ともいう）によって、中和抗体が産生しないよう、又は産生量が少ないように、病原体が宿主の免疫反応から逃れる機構であると考えられる。

これまで、ＨＳＶにおいてデコイ領域の存在は確認されておらず、デコイ領域の概念すらなかった。本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗ＨＳＶ ｇＤ抗体の網羅的探索によって得られた抗ｇＤモノクローナル抗体に対して、詳細なエピトープマッピング解析を行った。その結果、ＨＳＶ ｇＤのＢ細胞エピトープを、無益又は有害なエピトープと、中和抗体を誘導できる有益なエピトープとに分類することで、無益又は有害なエピトープが集中しているデコイ領域の存在を明らかにした。そして、デコイ領域の無益又は有害なエピトープを脱エピトープ化し、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、中和活性の高い抗体を誘導できる改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質を得るに到った。

「野生型ＨＳＶ ｇＤ」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＳＶ−１由来のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＨＳＶ−２由来のｇＤ（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＢＵ４５４３３．１）の全長を指し、両者を多重整列して比較した結果、その配列同一性は８４％である（図３５）。ｇＤの立体構造も解析されており、例えば、ＨＳＶ−１由来のｇＤにおいて、３１７−３３９番目のアミノ酸残基を有する膜貫通ドメイン、３４０−３６９番目のアミノ酸残基を有する細胞内ドメイン及び１−３１６番目のアミノ酸残基を有するエクトドメインからなることは知られている。ＨＳＶ−１由来のｇＤの単結晶構造は非特許文献７に、共結晶構造は非特許文献２及び６によって報告されている。一方、ＨＳＶ−２由来のｇＤの結晶構造は非特許文献１１及び１２に報告されている。「野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン」は、可溶性の、抗原性を有する、野生型ＨＳＶ ｇＤの細胞外領域を意味する。野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの一例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２の３３３株由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５である。

「改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質」（「ＨＳＶ ｇＤの改変タンパク質」又は「改変体」ともいう。）とは、野生型ＨＳＶ ｇＤに対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠失又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質等の野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。

「中和抗体誘導活性」とは、抗原タンパク質の中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度（ＮＴ５０）にてその抗体の中和活性の高さを評価する。

野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、高い中和抗体誘導活性を有するＢ細胞エピトープを「有益なエピトープ」という。野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）における有益なエピトープとしては、典型的にレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在するＢ細胞エピトープである。特に、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３４番目のアルギニン残基、１３９番目のアスパラギン酸残基、及び２２２番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。

「デコトープ」とは、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、ＲＢＤに存在するＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープをいい、本明細書において「無益又は有害なエピトープ」と分類する。「デコトープ」は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインにおいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３４番目のアルギニン残基、１３９番目のアスパラギン酸残基、及び２２２番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープであることが好ましい。本実施形態におけるＨＳＶ ｇＤのエクトドメインにおける「デコトープ」としては、ｇＤエクトドメインのＮ末端プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）に存在するエピトープが挙げられる。

デコトープが集中する領域を「デコイ領域」という。本発明者らの解析結果によれば、例えば、ＨＳＶ ｇＤのＰＲＲがデコイ領域である。ＰＲＲは、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造において、ＲＢＤとは反対側に位置している（図３）。ＰＲＲにおけるＰ５０周辺領域は、特に典型的なデコイ領域である。「Ｐ５０周辺領域」とは、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域をいう。ここで「アミノ酸残基からの距離」とは、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面の形状に関わらず、上記５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基からの直線距離をいう。

デコトープの一例は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである。

ここで「相当する」アミノ酸残基とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメインのアミノ酸配列と他の類縁性のあるｇＤのアミノ酸配列とを多重整列（多重配列アラインメント）したときに、整列した配列において、所定の配列番号１に記載のアミノ酸残基に対応する位置にある他の類縁性のあるｇＤのアミノ酸残基を意味する。

デコトープの別の一例は、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が１．５ｎｍ以下の領域（すなわち、Ｐ５０周辺領域）に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープである。該デコトープは、野生型ＨＳＶ ｇＤの結晶構造から特定することができる。上記距離が１ｎｍ以下であることが好ましい。

上記デコトープの脱エピトープによっては、免疫誘導に用いる際、無益又は有害の抗体の産生割合を低減でき、また、有益なエピトープを際立たせることで、中和活性の高い中和抗体の産生割合を増加できる。

「脱エピトープ」とは、野生型ＨＳＶ ｇＤにおいてエピトープとして抗体産生に寄与していた部位をエピトープとして機能しないように改変することをいい、エピトープのマスキングともいう。脱エピトープの方法としては、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へと置換する方法、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を欠損（欠失）させる方法、及びエピトープの部位にあるアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖を導入する方法等が挙げられる。脱エピトープの方法としては、糖鎖を導入する方法、特にＮ型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）を導入する方法が好ましい。これにより、糖鎖を導入した部分のみならず、その嵩高さによって周辺のデコトープをも同時にマスキング可能な点で有効である。ｇＤと相互作用する抗体やレセプター等のタンパク質とのサイズ比を考えると、数アミノ酸程度のごく狭い範囲で結合が形成されるような、点と点の相互作用による可能性が低いと予想される。ｇＤとレセプターとの結合においては、広範囲のアミノ酸が協調的に結合を形成するような面と面での相互作用網が形成されていると考えられる。糖鎖導入は、自身の嵩高さによって周辺残基を広範囲に隠し、同時に結合相手のアクセスを阻害するのに有効な脱エピトープの方法であると考えられる。また、糖鎖は抗糖鎖抗体が誘導され難いという報告（非特許文献１０）もあり、改変による新たな免疫原性の出現可能性を低く抑えることが可能であると考えられる。

アミノ酸残基への糖鎖導入とは、当該アミノ酸残基の位置においてアミノ酸の欠失、置換又は付加によって、当該アミノ酸残基の位置を含む３つの連続したアミノ酸残基への糖鎖導入をいう。糖鎖の導入方法は、通常の方法であればよく特に限定されないが、たとえば、Ｎ型糖鎖を導入する場合、野生型ｇＤタンパク質エクトドメインのアミノ酸配列（配列番号１）をテンプレートとし、Ｎ型糖鎖を導入する目的部位の３つの連続したアミノ酸配列が、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるように、プライマーを設計し、ＰＣＲによって変異を導入する。目的の変異ｇＤタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば６×Ｈｉｓ等のタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによってｇＤ改変体を得ることができる。そして、ｇＤ改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってＮ型糖鎖を付加する。Ｎ型糖鎖としては、たとえばＧｌｃＮＡｃをベースとした高マンノース型、ハイブリッド型、複合型などが挙げられる。

脱エピトープは、すなわち、デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基、７４番目のプロリン、及び１８６番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基のうち、少なくとも１つへの糖鎖導入よって行われる改変を含むことが好ましい。特に、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、デコトープの改変、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、５１番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、７６番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含むことがより好ましい。

改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、野生型ＨＳＶ ｇＤの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５１〜３１５番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の少なくとも一部の欠損を含む。配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５１〜３１５番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインにおけるＣ末端ファンクション領域３（ＦＲ３）を形成している。この部分の少なくとも一部の欠損も、有益なエピトープへのイムノ・リフォーカスを誘導するために有効である。文献報告のあるＨＳＶ ｇＤ１の結晶構造解析（非特許文献７）から、ＦＲ３及びＮ末端側配列であるＦＲ１はｇＤ分子内のコアベータシート構造であるＦＲ２の全く同じ面に、巻き付くように結合し得ることが示唆されている。ＦＲ１及びＦＲ３は互いに干渉し合うため、ＦＲ２に対しどちらか一方しか結合できない。通常ウイルスエンベロープ上ではＦＲ３が結合しており、レセプターとの結合時にはＦＲ３が外れ、ＦＲ１が結合するように構造変化し、レセプター結合領域が露わになると推察されている。本発明者らが独自に得た中和抗体Ｎｏ．８２のエピトープ解析から、抗体Ｎｏ．８２はＮｅｃｔｉｎ−１結合領域と結合すること、ＦＲ１欠損体（ｇＤ３４−３１５）との反応性が低下すること、ｇＤとＨＶＥＭ或いはＮｅｃｔｉｎ−１との結合を阻害することが分かっている。即ち、抗体Ｎｏ．８２のエピトープ、すなわち、ＲＢＤを際立たせ、当該領域に対するイムノ・リフォーカスを誘導するためにはＦＲ３を欠損させるか、又はＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害することが有効であると考えられる。

ＦＲ３の少なくとも一部の欠損は、ＦＲ３の全長の欠失、又はＦＲ３の一部の連続した若しくは非連続の配列の欠失、さらに一部のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換も含まれている。ＦＲ３の一部欠損は、たとえば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５における２７６−３１５番目のアミノ酸残基に相当する部分が欠失することが好ましく、２７６−３１５番目のアミノ酸残基の全体又は一部の欠失であってよい。

改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端に少なくとも１つのプロミスキュアスＴ細胞エピトープが連結されていることが好ましい。膜貫通領域や細胞内領域にもＴ細胞エピトープが存在するが、ワクチンとしての使用を考慮すると、細胞外領域で構成される分泌発現型での設計が好ましいため、膜貫通領域や細胞内領域のＴ細胞エピトープを連結することで、細胞外領域には含まれないＴ細胞エピトープを有効に利用することができるため、好ましい。

本発明者らが、ｇＤ２の細胞内ドメインも含めた全長についてＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性プロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスターを網羅的に探索した結果、下記のＤＰ１−ＤＰ５までの５つのクラスターペプチドが見出された。プロミスキュアスＴ細胞エピトープとしては、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープであることが好ましい。そのうち、実際にマウス及びヒトの両方のＴ細胞に対して共にプロミスキュアスな刺激活性を有するものはＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ５の３ペプチドである。そのうち特に配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＤＰ５が好ましい。プロミスキュアスＴ細胞エピトープを複数連結してもよい。具体的には、例えば、プロミスキュアスＴ細胞エピトープの連結は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープが２つ以上連結されることを含むものであってよい。

一実施形態においては、ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ−２由来の野生型ｇＤエクトドメイン１−３１５における２３１番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基（特にトリプトファン残基）への置換をさらに含む。Ｖ２３１Ｗ変異は、ＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害することが示唆されている（非特許文献９）ため、このさらなる変異を含む改変体は、ＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害するとの観点から好ましい。この変異によって、レセプター結合ドメインに存在するＢ細胞エピトープがより際立ち、免疫誘導に際して、中和抗体の産生割合を増加させることができる。

本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ｇＤタンパク質のｃＤＮＡ（配列番号３３）をテンプレートとし、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、ＰＣＲによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモータと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。また、糖鎖導入による改変体の場合は、上述のとおりに得ることができる。ベクター及びプロモータは特に限定されないが、例えば、ｐＣＡＧベクター及びＣＡＧプロモータがあげられる。

作製された改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィーカラム、及びイオン交換クロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。

ＨＳＶ感染症は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２による感染症を含み、例えば、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、ＨＳＶに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎が挙げられる。

本発明のＨＳＶワクチンは、本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質を含む。

本実施形態のＨＳＶワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。

本実施形態のＨＳＶワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤等が、さらに適宜配合されてもよい。

本実施形態のＨＳＶワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントをさらに含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９等）、ＣｐＧ及び３−Ｏ−脱アシル化−４’−モノホスホリル ｌｉｐｉｄ Ａ（ＭＰＬ）等のＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ−グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリン等の多糖類が挙げられる。

本実施形態のＨＳＶワクチンは、本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質と、必要に応じて、担体、アジュバント等とを混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。

本実施形態のＨＳＶワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。

本実施形態のＨＳＶワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１ 抗ＨＳＶ ｇＤモノクローナル抗体の取得
＜ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅの取得＞
ＨＳＶ−２ ｇＤ（ｇＤ２）の網羅的エピトープ解析を実施するため、ｇＤ２を対象としたバイオパンニングによってｇＤ２上の様々なエピトープと結合する様々な抗体を取得した。ｇＤ２としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、ＨＳＶ−２の３３３株に由来する野生型の可溶性エクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）であるｇＤ１−３１５タンパク質を用いた。ｇＤ１−３１５タンパク質は宿主細胞にて発現させ、精製した。ライブラリーとしてはヒトＢ細胞由来のｍＲＮＡから作製されたヒトＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを使用して調製されたｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅディスプレイライブラリーを用いた。ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅディスプレイライブラリーは、ヒトＢ細胞由来のｍＲＮＡからヒトＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを使用して調製されたｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、ＨＳＶ−２ ｇＤへの反応性を有するｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを得た。

＜ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ＞
パンニング実施後、単離したｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを発現させた。各ｓｃＦｖ遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌ＴＧ１株を２×ＹＴＣＧ培地（３７℃）で培養し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージをｍｏｉ＝２０で感染させた後、２×ＹＴＣＫ培地（２５℃）、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅは２０％−ＰＥＧ−２．５Ｍ塩酸ナトリウムによる濃縮を行った。

発現させたｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅについて、ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡによってｇＤ１−３１５に対する反応性を確認した。１００μＬのｇＤ２（２μｇ／ｍＬ ＰＢＳ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ、ＮＵＮＣ）に、４℃にて一晩固相化した後、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、室温にて１時間ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）で３回洗浄し、ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０倍希釈し、１００μＬで加え、３７℃にて一時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ標識抗体（１％ＢＳＡ ＰＢＳで希釈したＨＲＰ付加抗Ｍ１３抗体：ａｎｔｉ−Ｍ１３／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、酵素基質（ＴＭＢ）で、室温にて３０分発色させ、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（発色値）を測定した。

クローン毎のｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅのｇＤ１−３１５に対する反応性を解析したところ、回収した１８８クローン中１０１クローンが抗原との特異的な結合を示した。さらにこの１０１クローンについてＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子配列を解析したところ、配列のユニークな７種類のクローンを取得した。

＜ｓｃＦｖ−ｈＦｃの作製＞
取得された７種類のｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを基にｓｃＦｖ−ｈＦｃを作製した。単離したｓｃＦｖ遺伝子の可変領域をヒトＦｃ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ−ｈＦｃ発現プラスミドを構築した。各発現用プラスミドはＥｘｐｉ２９３発現システム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて発現した。４〜６日間の培養の後、その上清をＰｒｏｔａｉｎ Ａ アフィニティクロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製し、ＰＢＳで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

＜Ｎｅｃｔｉｎ−１を使用した競合阻害試験＞
作製したｓｃＦｖ−ｈＦｃについて、ｇＤのレセプターであるＮｅｃｔｉｎ−１を使用した競合阻害試験を実施した。

競合阻害試験は以下の競合ＥＬＩＳＡによって実施した。１００μＬのｇＤ２（２μｇ／ｍＬＰＢＳ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ、ＮＵＮＣ）に、室温にて２時間かけて固相化した。その後、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬの１％ＢＳＡ ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ）で５回洗浄し、２０μｇ／ｍＬのｓｃＦｖ−ｈＦｃを１％ＢＳＡ ＰＢＳに任意の希釈倍率で希釈し、１００μＬで加え、３７℃にて１時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ若しくはＮｅｃｔｉｎ−１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｃｔｉｎ−１ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）を１％ＢＳＡ ＰＢＳに任意の希釈倍率で希釈し、１００μＬで加え、３７℃にて一時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ標識抗体（ａｎｔｉ−Ｍ１３／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ、若しくは１％ＢＳＡ ＰＢＳで希釈したＨＲＰ付加抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体：ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ）を加え、３７℃にて一時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＴＭＢで室温にて３０分発色させ、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ値）を測定した。ｓｃＦｖ−ｈＦｃ非存在下でのＯＤ値に対し、５０％以上のＯＤ値の低下を示した場合に競合有りとみなした。

＜結果＞
結果を表２に示す。競合のパターンにより７種類のｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを３つのグループに分類した。グループＡに属する抗体Ｎｏ．８２はＮｅｃｔｉｎ−１と強く競合したため、Ｎｅｃｔｉｎ−１結合領域にエピトープが存在すると示唆された。グループＢにはＮｏ．１のみ属し、他の抗体及びレセプターＮｅｃｔｉｎ−１と競合しなかった。グループＣは残りの５クローン（Ｎｏ．５、Ｎｏ．１３、Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７５、Ｎｏ．７８）から成り、互いに競合する一方で、レセプターＮｅｃｔｉｎ−１とは競合しなかった。
各ｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した結果、抗体Ｎｏ．８２は、配列番号９〜１１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１〜重鎖ＣＤＲ３を有し、配列番号１２〜１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１〜軽鎖ＣＤＲ３を有する。
重鎖ＣＤＲ１：GYAIN （配列番号９）
重鎖ＣＤＲ２：GIMPIFGTSNYAQKFQ （配列番号１０）
重鎖ＣＤＲ３：DWGAPLEKGAGSPFDV （配列番号１１）
軽鎖ＣＤＲ１：RASQSVSSSYLA （配列番号１２）
軽鎖ＣＤＲ２：GASSRAT （配列番号１３）
軽鎖ＣＤＲ３：QQYGSSPRS （配列番号１４）

実施例２ 抗ｇＤ２結合抗体のエピトープマッピング
＜変性によるエピトープ解析＞
変性状態のｇＤ１−３１５を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによって、各抗体のエピトープがコンフォメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープであるかリニア（ｌｉｎｅａｒ）エピトープであるかを解析した。

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇは、以下のように行われた。５００ｎｇの変性又は未変性のｇＤ１−３１５を８−１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥへＬｏａｄし電気泳動した。変性状態のｇＤ１−３１５は、ｇＤ１−３１５に２％ ２−メルカプトエタノールを加え、９６℃で５分間煮沸することで得た。非変性状態のｇＤ１−３１５はこれらの操作を行わず、直接Ｌｏａｄした。泳動完了後、ゲルをニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ転写し、２％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔを用いてブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、膜を１μｇ／ｍＬ ２％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔの濃度の各ｓｃＦｖ−ｈＦｃと室温にて３０分反応させた。再度の洗浄の後、ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ／２％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔと反応させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発色させた。

その結果、変性剤及びヒートショックによって変性されたｇＤ１−３１５と反応を示した抗体はＮｏ．１、及びＮｏ．１３の２つであり、これらのエピトープはｌｉｎｅａｒであることが示唆された。他の抗体はすべて非変性状態のｇＤ１−３１５とのみ反応性を示したため、ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌなエピトープであることが示唆された。

＜糖鎖の導入によるｇＤ改変体を用いた抗体のエピトープマッピング＞
Ｎ−結合型糖鎖の導入によるｇＤ改変体を用いたエピトープマスキング法を検討した。糖鎖の導入部位の選定にあたっては既に報告されている結晶構造（非特許文献１、２及び６）に基づき、結晶構造表面に露出しており、二次構造を取っていないループ部位を対象とした。図１にｇＤの一次構造の模式図を示しており、ＦＲ１（Ｋ１〜Ｈ３９）、ＦＲ２（Ｉ５５〜Ｒ１８４）、ＦＲ３（Ｔ２５１〜Ｇ３１５）がそれぞれ示されている。また、本来ｇＤに付加されている糖鎖は、Ｎ９４、Ｎ１２１及びＮ２６２に結合している。糖鎖導入部位として、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）、Ｐ５４（ＳＣ−Ｋ）、Ｐ７４（ＳＣ−Ｄ）、Ｓ８５（ＳＣ−Ｌ）、Ｇ１０３（ＳＣ−Ｅ）、Ｄ１７２（ＳＣ−Ｍ）、Ｒ１８６（ＳＣ−Ａ）、Ｌ１９５（ＳＣ−Ｈ）、及びＨ２４２（ＳＣ−Ｂ）の９つを選定した。

ｇＤ改変体の発現プラスミドを構築するにあたって、ＨＳＶ−２の３３３株に由来する野生型ｇＤタンパク質のｃＤＮＡ（配列番号３３）をテンプレートとした。Ｎ−結合型糖鎖は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）のアスパラギンに結合するため、糖鎖を導入する際、以下のプライマーを使用し、目的部位のアミノ酸配列がＮＸＴ又はＮＸＳ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるようにＰＣＲによって変異させた。ＦｗはＦｏｒｗａｒｄ、ＲｅはＲｅｖｅｒｓｅを表す。下線は変異させた部分。シグナル配列に続き、目的の変異ｇＤタンパク質の核酸配列、さらに６×Ｈｉｓの核酸配列となるように設計したＤＮＡを遺伝子合成し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。
SC-A-Fw: 5’-CGGGCCAATGCCTCCTGCAAGTACGCT-3’（配列番号１５）
SC-A-Re: 5’-GGAGGCATTGGCCCGGTGCTCCAGGAT-3’（配列番号１６）
SC-B-Fw: 5’-GGGTGGAATGGCACCAAGCCCCCGTACACCAGC-3’（配列番号１７）
SC-B-Re: 5’-GGGCTTGGTGCCATTCCACCCGGCGATTTTTAA-3’（配列番号１８）
SC-D-Fw: 5’-CATGCCAATTCGACCGCCCCCCAGATCGTGCGC-3’（配列番号１９）
SC-D-Re: 5’-GGGGGCGGTCGAATTGGCATGTAGGAGCACGCT-3’（配列番号２０）
SC-E-Fw: 5’-CGCATGAATGACACCTGCGCTATCCCCATCACG-3’（配列番号２１）
SC-E-Re: 5’-AGCGCAGGTGTCATTCATGCGATACCAGGCGAT-3’（配列番号２２）
SC-F-Fw: 5’-TTCCAGAATGCAAGCATCCCGATCACTGTGTAC-3’（配列番号２３）
SC-F-Re: 5’-CGGGATGCTTGCATTCTGGAACGGGTCCTCCAG-3’（配列番号２４）
SC-H-Fw: 5’-CTCCCCAATCGCACGCCCCCGGCAGCGTGCCTC-3’（配列番号２５）
SC-H-Re: 5’-CGGGGGCGTGCGATTGGGGAGAGCGTACTTGCA-3’（配列番号２６）
SC-K-Fw: 5’-AGCATCAATATCACTGTGTACTACGCA-3’（配列番号２７）
SC-K-Re: 5’-AGTGATATTGATGCTGGGGGGCTGGAA-3’（配列番号２８）
SC-L-Fw: 5’-GGGGCTAATGACACCGCCCGAAAGCACACGTAC-3’（配列番号２９）
SC-L-Re: 5’-TCGGGCGGTGTCATTAGCCCCGCGCACGATCTG-3’（配列番号３０）
SC-M-Fw: 5’-ATAAACAATTGGACGGAGATCACACAA-3’（配列番号３１）
SC-M-Re: 5’-CGTCCAATTGTTTATCTTCACTAGCCG-3’（配列番号３２）

完成した改変体配列をｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏベクターにクローニングし、発現用プラスミドを得た。各発現用プラスミドはＥｘｐｉ２９３発現システムを用いて発現した。４〜６日間の培養の後、その上清をＮｉ−ＮＴＡ アフィニティクロマトグラフィーカラム（ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ、ＴａＫａＲａ）によって精製し、ＰＢＳで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィーとＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

これら糖鎖導入変異体に対して各抗体の反応性解析を競合ＥＬＩＳＡで実施した。１００μＬのｇＤ改変体（２μｇ／ｍＬＰＢＳ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ、ＮＵＮＣ）に、４℃にて一晩かけて固相化した。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬの１％ＢＳＡ ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ）で３回洗浄し、各ｓｃＦｖ−ｈＦｃを１％ＢＳＡ ＰＢＳに任意の希釈倍率で希釈し、１００μＬで加え、３７℃にて一時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ標識抗体（１％ＢＳＡ ＰＢＳで希釈したＨＲＰ付加抗ｈＦｃ抗体：ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ）を加え、３７℃にて一時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＴＭＢで室温にて３０分発色させ、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ値）を測定した。野生型のｇＤ１−３１５の吸光度に対し、３０％未満で阻害（−）、３０％以上７０％未満でパーシャル阻害（±）、７０％以上（＋）で阻害せずとみなした。結果を表３に示す。

＜欠損によるｇＤ改変体を用いた抗体のエピトープマッピング＞
ｇＤ１−２７５、ｇＤ２５−２５３、ｇＤ３４−３１５という３種類の欠損改変体を全合成によって作製した（図１）。

これらの欠損改変体と各抗体との反応性解析を、上記と同様に競合ＥＬＩＳＡを用いて実施し、その結果を表３に示す。

表３の結果から、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）及びＰ５４（ＳＣ−Ｋ）に糖鎖を導入したｇＤ１−３１５では、競合阻害試験において同一のグループに分類された抗体Ｎｏ．５、Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７５、Ｎｏ．７８との反応性が完全に阻害された。また、Ｈ２４２（ＳＣ−Ｂ）ではＮｏ．７５、Ｎｏ．８２との反応がパーシャルに阻害された。Ｈ２４２（ＳＣ−Ｂ）は抗体Ｎｏ．８２が構造的に直接アクセスできない部位であると考えられるが、アミノ酸配列上では近傍であり、構造変化による影響を受けたものだと推察される。また、Ｈ２４２（ＳＣ−Ｂ）の導入位置はＰ５０（ＳＣ−Ｆ）ともかなり離れた位置であるため、抗体Ｎｏ．７５の反応性低下は何らかの間接的な影響によるものであると推察された。一方、ＳＣ−Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｍへの糖鎖導入による各抗体の結合性への影響はなかった。

欠損体に関しては、Ｃ末端（ＦＲ３）欠損体であるｇＤ１−２７５とｇＤ２５−２５３では抗体Ｎｏ．１の反応性が消失した。先の解析から抗体Ｎｏ．１はｌｉｎｅａｒエピトープを有することが示唆されているため、２７５〜３１５の間に抗体Ｎｏ．１のエピトープが存在すると考えられた。

またｇＤ１−２７５との反応性に変化が見られなかった抗体Ｎｏ．７２と抗体Ｎｏ．７５に関しては、ｇＤ２５−２５３を使用すると抗体Ｎｏ．７２との反応は低下し、抗体Ｎｏ．７５との反応は消失した。このことから抗体Ｎｏ．７２と抗体Ｎｏ．７５のエピトープの少なくとも一部がｇＤ２５４−２７５の間に存在していることが示唆された。結晶構造において、ｇＤ２５４−２７５はＰ５０（ＳＣ−Ｆ）の近傍に存在しており、これらの抗体がその両方を認識する可能性も考えられる。特にＨ２４２（ＳＣ−Ｂ）でも反応性が低下した抗体Ｎｏ．７５については、ｇＤ２５４−２７５中のエピトープへの結合依存度が高いため、ＦＲ３近傍に存在するＨ２４２（ＳＣ−Ｂ）による影響を大きく受けた可能性があると推察される。

一方、Ｎ末端（ＦＲ１）欠損体であるｇＤ３４−３１５を使用した場合も抗体Ｎｏ．７２との反応性が低下した。しかし、ここまでの解析から抗体Ｎｏ．７２のエピトープがＦＲ１に存在するとは構造上考え難く、ＦＲ１を欠損させたことによるＦＲ３への影響を考慮すべきと考えられた。結晶構造解析から、ＦＲ１及びＦＲ３はｇＤのコアベータシート構造であるＦＲ２の同じ面に、巻き付くように結合しうることが示唆されている（非特許文献６）。ＦＲ１及びＦＲ３は互いに干渉しあうため、ＦＲ２に対しどちらか片方しか結合することはできない。ｇＤ２５４−２７５はＦＲ３の「付け根」にあたるフレキシブルな領域であることから、ＦＲ３全体の構造に依存して抗体Ｎｏ．７２と抗体Ｎｏ．７５の結合の強さが変化すると推察される。つまり、ＦＲ１欠損体であるｇＤ３４−３１５ではＦＲ３がＦＲ２へ結合しており、その結果Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）付近のエピトープとｇＤ２５４−２７５中のエピトープが遠ざかってしまうことにより反応性が低下したのではないかと考えられる。同様に抗体Ｎｏ．７５もＰ５０（ＳＣ−Ｆ）付近のエピトープとｇＤ２５４−２７５中のエピトープが遠ざかる影響を受けるはずだが、抗体Ｎｏ．７５はｇＤ２５４−２７５と強く結合するため、この影響を受けにくかったのではないかと推察される。

Ｎ末端（ＦＲ１）欠損体であるｇＤ３４−３１５を使用した場合、抗体Ｎｏ．８２の反応性も低下することが分かった。このことから１−３３アミノ酸の間に抗体Ｎｏ．８２のエピトープが存在している可能性と、ＦＲ３のＦＲ２への結合が抗体Ｎｏ．８２のアクセスを阻害している可能性が考えられた。また、ｇＤ２５−２５３でも反応性の低下が見られなかったことから、２５−３３の間に抗体Ｎｏ．８２のエピトープが存在していると考えるのが妥当である。

＜アラニン置換体を用いたアラニンスキャニング＞
上記で得られた情報を基に、アラニン置換体を用いて、抗体Ｎｏ．８２のエピトープが存在すると予測されたＮｅｃｔｉｎ−１結合領域であるレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）、及びＰ５０（ＳＣ−Ｆ）の周辺領域をアラニンスキャニングした。構造上表面に露出していると考えられるアミノ酸を中心に選出し、アミノ酸をアラニンに置換した変異体１４個、中和抗体ＬＰ２のブロッキング変異体であるＴ２１３Ｍ、Ｓ２１６Ｎを作製した。各アラニンに改変した遺伝子をＰＣＲによって構築し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。

抗体Ｎｏ．８２抗体とアラニン置換したｇＤ改変体との反応性を競合ＥＬＩＳＡで解析した。その結果を図２に示した。抗体Ｎｏ．８２の反応性解析では、Ｒ１３４Ａ、Ｄ１３９Ａ、Ｔ２１３Ｍ、Ｓ２１６Ｎ、Ｒ２２２Ａの５つの変異体で顕著に反応性が低下し、Ｒ１９６Ａで反応性が低下した。これらのアミノ酸はすべて同じ界面の、非常に近傍に位置するアミノ酸であり、特にＳ２１６、Ｒ２２２についてはＮｅｃｔｉｎ−１の結合部位であることが報告されている。このことから、抗体Ｎｏ．８２がＮｅｃｔｉｎ−１結合領域に結合することが改めて示唆された。

一方、ＦＲ１のアラニン置換体ではＤ３０Ａにおいて反応性の低下が見られた。Ｄ３０は２５−３３アミノ酸に存在するエピトープの一部であると考えられるが、Ｒ２２２周辺とＤ３０周辺はＦＲ１がＦＲ２へと結合している状態では、ＦＲ１が邪魔となって同じ界面上に存在することができない。このため、抗体Ｎｏ．８２が結合する際にはＦＲ１とＦＲ２の結合を解除しながら反応が進行すると考えられる。

さらに抗体Ｎｏ．８２以外の抗体に関しても、ＳＣ−Ｆ周辺アラニン置換体を用いた反応性解析において、表３に示した各種抗ｇＤ２抗体と各種ｇＤ変異体との反応性の結果とほぼ一致する傾向が見られた。抗体Ｎｏ．７８についてはＰ５１ＡとＩ５５Ａにて反応性が低下した。抗体Ｎｏ．７２ではＶ５７ＡとＥ２５６Ａ、抗体Ｎｏ．７５ではこの２つに加えてＩ５５ＡとＤ２５９Ａで反応性の低下が見られた。ＳＣ−Ｆとこれら全ての残基は同じ界面上の近傍に位置しており、特に抗体Ｎｏ．７２と抗体Ｎｏ．７５のエピトープの一部が２５４−２７５の間に存在するという仮説を支持する結果となった。抗体Ｎｏ．５については、抗体Ｎｏ．５との反応性が低下したアラニン置換体はＩ５５、Ｅ７６、Ｉ８０の３つであり、抗体Ｎｏ．７２、抗体Ｎｏ．７５、抗体Ｎｏ．７８の結合領域とはＩ５５を中心として約１２０°程異なる方向に散在していた。抗体Ｎｏ．１３についてはエピトープが不明であった。抗体Ｎｏ．１３のエピトープはＬｉｎｅａｒであることが示唆されており、ここまでの変異体ではそのエピトープをダイレクトに変異させることができなかったためであると考えられる。

エピトープマッピングの結果、７つの抗体クローンのエピトープは表４に示されたように推定される。図３には、ＨＳＶ ｇＤ構造上のｇＤレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）周辺領域及びＰ５０周辺領域のＭＯＥ図が示されている。図３では、抗体Ｎｏ．８２のエピトープ（Ｒ１３４、Ｄ１３９、及びＲ２２２）はＲＢＤ領域に存在することが確認できる。

実施例３ 抗ｇＤ２抗体の中和活性
７つの抗体クローンのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳＶ中和活性解析を、プラーク数減少（プラークリダクション）試験及びＣｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ感染拡大抑制試験にて実施した。

＜細胞及びウイルスの培養＞
対象とするウイルスはＡＴＣＣから購入した、Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２（ＨＳＶ−２） ＭＳ株（ＶＲ−５４０）及びＨｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １（ＨＳＶ−１）ＫＯＳ株（ＶＲ−１４９３）の２種を用いた。ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはＡＴＣＣから購入したＶｅｒｏ細胞（ＣＣＬ．８１）を使用した。Ｖｅｒｏ細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養する。拡張、維持、解析プレート作製時は、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を使用し、感染価測定及び中和抗体価測定時は、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を使用した。中和試験及び後述の感染防御能解析に用いるウイルスバンクは、以下の方法によって調製した。ＨＳＶ−２ ＭＳ株及びＨＳＶ−１ ＫＯＳ株をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１〜１でフルシートのＶｅｒｏ細胞に接種し、２〜３日間２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で培養した。回収した感染細胞培養ボトルを３回凍結融解して細胞を破砕後、ＴＯＭＹ遠心器で室温にて３５００ｒｐｍで１０分遠心し、上清をＨＳＶ−２ウイルスバンク及びＨＳＶ−１ウイルスバンクとした。

＜中和試験＞
（プラーク数減少試験）
プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約１００ＰＦＵのＨＳＶ−２ ＭＳ株又はＨＳＶ−１ ＫＯＳ株と混合後、３７℃にて１時間反応させた。４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に反応液を播種し、３０℃にて１時間吸着後に１％メチルセルロース含有ＭＥＭ（２％ＦＢＳ）培地で２４時間培養後、メタノールとエタノールを１対１で混合した５０％メタノール／５０％エタノール（−２０℃）で、−２０℃にて３０分間不活化及び固定を行った。その後、抗ＨＳＶ ｇＤモノクローナル抗体を３７℃にて１時間反応させ、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ Ｐ０４４７）とＴＭＢＨで免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＣＴＬ社）で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフト（ＢｉｏＳｐｏｔ ＣＴＬ社）でプラーク数をカウントした。

（Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｃｅｌｌ感染拡大抑制試験）
Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性測定は、４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に約１００ＰＦＵのＨＳＶ−２ ＭＳ株又はＨＳＶ−１ ＫＯＳ株を接種し、３０℃で１時間吸着した。その後、所定濃度の被験抗体を含有した１％メチルセルロース含有ＭＥＭ（２％ＦＢＳ）培地（抗体濃度は５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ及び１２５μｇ／ｍＬ）を添加し、ＨＳＶ−２ ＭＳ株は約４０時間培養後、ＨＳＶ−１ ＫＯＳ株は約４８時間培養後、５０％メタノール／５０％エタノール（−２０℃）で、−２０℃にて３０分間不活化及び固定を行った。その後、自家調製した抗ＨＳＶ ｇＤモノクローナル抗体を３７℃にて１時間反応させ、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰとＴＭＢＨで免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラークサイズの平均値を解析した。

＜結果＞
実験結果を表５に示す。プラーク数減少活性については、ＭＳ株（ＨＳＶ−２）及びＫＯＳ株（ＨＳＶ−１）のそれぞれに対して各抗体の最終濃度を５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬに設定し、各濃度における測定は２ウェルずつ検出して平均値を取った。その結果、Ａグループに分類されｇＤレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）上（及びＦＲ１上）にエピトープ領域を有する抗体Ｎｏ．８２が、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両株に対して最も顕著なプラーク数減少活性を示した。これに対して、Ｂグループに分類されＦＲ３にエピトープ領域を有する抗体Ｎｏ．１は両株に対するプラーク数減少活性を全く示さなかった。また、Ｃ１グループに分類されＰ５０周辺或いはその他の不明な部分にエピトープ領域を有する抗体Ｎｏ．５及び抗体Ｎｏ．１３のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する中和活性はいずれも相対的に弱く、ＨＳＶ−１に対してはパーシャル阻害のパターンを示した。ここで、「パーシャル阻害」とは、中和活性が相対的に弱く、また用量依存的な低下が明確に確認されていない場合をいう。さらに、Ｃ２グループに分類されＰ５０周辺（及びＦＲ３）にエピトープ領域を有する抗体Ｎｏ．７２及び抗体Ｎｏ．７５はいずれもＨＳＶ−１よりもＨＳＶ−２に対する中和活性が顕著に弱く、抗体Ｎｏ．７２はＨＳＶ―２に対してはパーシャル阻害のパターンを示した。また同じくＣ２グループに分類される抗体Ｎｏ．７８の両株に対する中和活性に然程偏りは認められないが、その強度は抗体Ｎｏ．８２に比して見劣りのするものであった。抗体Ｎｏ．７８は、用量依存的に阻害するが5倍段階希釈の傾きに対し、阻害効果の傾きがほかのものと比べて、緩やかなパターンを示した。

Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性については、ＭＳ株（ＨＳＶ−２）に対して各抗体の最終濃度を２０μｇ／ｍＬに設定してｄｕｐｌｉｃａｔｅで検討した結果、唯一抗体Ｎｏ．８２が明確な抑制活性を示したが、それ以外の６抗体は明確な活性を示さなかった。本活性は、生体において既にウイルス感染が成立している状況下での治療的投与における感染拡大抑制効果、或いは再発症状に対する抑制効果にも繋がり得る重要な活性であると考えられる。

以上から、抗体Ｎｏ．８２はＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両株に対して強力なプラーク数減少活性を有するのみならず、治療効果にも繋がり得るＣｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性をも有している点において、その他の抗ｇＤ結合抗体とは本質的に異なる優れた特徴を有するユニークな抗体であると考えられ、その優越性はエピトープ領域がｇＤレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）上に存在していることと関連が有るものと考えられた。

実施例４ 抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のウイルス中和活性詳細解析
抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のヒト型抗体ｓｃＦｖ−ｈＦｃに加えて、Ｆｃ領域をマウス型にしたヒト−マウスキメラＩｇＧ、及びＦｃ領域をモルモット型にしたヒト−モルモットキメラＩｇＧを調製し、それぞれのＨＳＶ−２（ＭＳ株）及びＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）に対する中和活性（プラーク数減少活性）を検討した。

＜ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ＞
単離したｓｃＦｖ 遺伝子のＶＨ領域をマウスＩｇＧ２ａに由来するＨ鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｈ鎖発現プラスミドを構築した。また、ｓｃＦｖ遺伝子のＶＬ領域をマウスＣＬ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｌ鎖発現プラスミドを構築した。発現には、Ｅｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。培養上清をＨｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、ＰＢＳで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィーとＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。以上の方法によりヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａを得た。

＜ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ＞
単離したｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ領域をモルモットＩｇＧ２に由来するＨ鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングした。また、同様にｓｃＦｖ 遺伝子のＶＬ領域をモルモットＣＫ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングした。次に、クローニングされた抗体遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｐＸＣベクター（ロンザ社）にクローニングし、Ｈ鎖及びＬ鎖の発現プラスミドを構築した。その後、両プラスミドを連結して、１つの発現プラスミドとした。発現にはＣＨＯ細胞を使用した。発現プラスミドをＣＨＯ細胞に安定導入させ、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ロンザ社）を利用して、抗体高発現ＣＨＯ細胞を取得した。高発現細胞を１２日間Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養し、培養上清を回収した。培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃａｔ＃１７１２７９０３／ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、ヒト‐モルモットキメラＩｇＧ２κ抗体を得た。

＜結果＞
抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のｓｃＦｖ−ｈＦｃ、ヒト−マウスキメラＩｇＧ、及びヒト−モルモットキメラＩｇＧを用いて、実施例４と同様にウイルス中和活性（プラーク数減少活性）について解析した。その結果を表６に示した。抗体Ｎｏ．８２のｓｃＦｖ−ｈＦｃ、ヒト−マウスキメラＩｇＧ、及びヒト−モルモットキメラＩｇＧのいずれも、ＭＳ（ＨＳＶ−２）及びＫＯＳ（ＨＳＶ−１）の両株に対して０．０５μｇ／ｍＬ又はそれ以上の濃度では５０％プラーク数減少活性を示した。

実施例５ 抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のマウス感染防御能評価
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２の予防的投与及び治療的投与における感染防御能を評価した。

＜マウス感染防御試験＞
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗ＨＳＶ ｇＤ２モノクローナル抗体の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、メス）を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、予防的投与の場合にはウイルス接種２４時間前に、また治療的投与の場合にはウイルス接種４８時間後に、いずれも２００μＬ／匹の容量にて腹腔内投与した。１群あたりＮ＝１０の例数を設定した。ウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種６日前にＤｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａを２ｍｇ／匹で皮下接種した。麻酔下で５×１０^５ＰＦＵ／２０μＬのＨＳＶ−２ ＭＳ株を経腟接種し、２１日間経過観察を行った。生存日数（生存率）及び症状スコアを指標に感染防御能を評価した。症状スコアは、膣病変症状の有無及び程度によってスコアを定義し各群における平均値を示した。スコアの付け方として、０：変化なし、１：部分的な紅斑・腫脹、２：広範囲の腫脹・浮腫、３：潰瘍・出血、４：死亡、とした。回復の見込みのない重篤な全身症状（立毛、麻痺、震戦、痙攣等）が認められた場合、その日はスコアを３．５とし、犠牲死させ、次の日に死亡として扱いスコアを４とした。

＜結果＞
予防的投与における、投与量別の生存日数を表７に、生存率を図４に、症状スコアを図５にそれぞれ示す。治療的投与における、投与量別の生存日数を表８に、生存率を図６に、症状スコアを図７にそれぞれ示す。

予防的投与において、設定した全ての投与量（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ）において、陰性対照群として設定したｓａｌｉｎｅ投与群に比して有意な生存日数延長効果を示した。特に高用量域である１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２用量において、顕著な生存率及び症状スコアの改善効果を示した。

治療的投与において、ＨＳＶは感染局所から体内に侵入後４８時間以内に神経節に移行するという報告（非特許文献８）がある。しかし、感染後４８時間時点において抗体Ｎｏ．８２を治療的投与した場合も、予防的投与の場合とほぼ同様に１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２用量において顕著な生存率及び症状スコアの改善効果を示した。以上から、抗体Ｎｏ．８２は予防的投与のみならず治療的投与においても強力な感染防御効果を示すことが確認された。

実施例６ 抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のモルモット感染防御能評価
モルモット性器ヘルペス感染モデル（急性期）を用いて、抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２の予防的投与及び治療的投与における感染防御能を評価した。

＜モルモット感染防御試験＞
モルモット性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２（ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ）の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。ＳＬＣ社から購入したＨａｒｔｌｅｙモルモット（３〜５週齢、メス）を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、予防的投与の場合にはウイルス接種２４時間前に、また治療的投与の場合にはウイルス接種４日間後に、いずれも１ｍｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ／匹の容量にて腹腔内投与した。治療的投与の場合は、投与前に症状観察を行い、膣症状を呈している個体を選別し、各群の平均スコアに偏りが生じないようにランダマイズした。１群あたりＮ＝１０〜１５の例数を設定した。ウイルス接種は麻酔下で５×１０^５ＰＦＵ／５０μＬのＨＳＶ−２ ＭＳ株を経腟接種し、急性期症状を接種後２〜３週間観察した。症状スコアは、０：明確な病変なし、０．５−１：紅斑、１．５−２：限局的な水泡、２．５−３：限局的な潰瘍又は痂皮、３−５：広範に及ぶ水泡・潰瘍又は痂皮、３−７：失禁を伴う広範な潰瘍又は痂皮、７．５：重篤な症状による安楽殺、８：死亡とした。また、ウイルス接種後７日目において、膣拭い液（膣ｓｗａｂ）を採取し、プラーク法によってウイルス放出量を測定した。膣Ｓｗａｂは、ＭＥＭ培地で湿潤させた綿棒を膣内に挿入後、膣内壁の粘膜を拭い取るようにして採取した。採取した膣ｓｗａｂは、シリコナイズドチューブに１ｍＬずつ分注したＭＥＭ培地にて懸濁し、使用時まで凍結保存した。膣ｓｗａｂを原液、１０倍、１００倍、１０００倍希釈し、１００ｕＬ／ウェルで９６ウェル又は４８ウェルにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に接種した。膣Ｓｗａｂ接種後３７℃で１時間ウイルス吸着を行い、１％メチルセルロース含有２％ＦＢＳ ＭＥＭ培地で２４〜７２時間培養した後に、所定の方法でプラーク数を計測した。

＜結果＞
予防的投与における症状スコアを図８に示す。治療的投与の結果における、症状スコアを図９に、膣拭い液中のＨＳＶ放出量を図１０にそれぞれ示す。

予防的投与では、設定した投与量（３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）のうち３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇにおいて、陰性対照群として設定したｓａｌｉｎｅ投与群に比して有意な症状スコアの改善効果を示した。

治療的投与において、感染後４日時点において既に膣症状を呈しているモルモットに対して抗体Ｎｏ．８２を３０ｍｇ／ｋｇにて治療的に投与した結果、陰性対照群として設定したｓａｌｉｎｅ投与群に比して有意な症状スコアの軽減効果を示した。また、ウイルス接種後７日時点において膣ｓｗａｂを採取し、プラーク法によってウイルス放出量を測定した結果、陰性対照群に比して有意なウイルス放出量の減少が認められた。

以上から、抗体Ｎｏ．８２は予防的投与のみならず治療的投与においても有意な感染防御効果を示すことが確認された。

実施例７ ＨＳＶ ｇＤ上に存在するＴ細胞エピトープの網羅的解析
＜ＨＳＶ ｇＤ２上に存在するＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性プロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスター配列の探索＞
ＧｅｎＢａｎｋに公開されているＨＳＶ−２ ３３３株のｇＤ２全長アミノ酸配列（ＡＢＵ４５４３３．１；配列番号３）に関して、ＥｐｉＶａｘ社のアルゴリズム（ＥｐｉＭａｔｒｉｘ）を用いて、ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性プロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスター配列を探索した。当該クラスター配列は、ＥｐｉＭａｔｒｉｘが解析対象とする８種類の主要なＨＬＡ ＤＲ ｓｕｐｅｒ ｔｙｐｅ（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）のうちの大部分に対して結合する可能性が高い（Ｚ−Ｓｃｏｒｅ≧１．６４）と予測される１５〜２５アミノ酸からなるペプチド配列である。

ＥｐｉＶａｘ社のアルゴリズム（ＥｐｉＭａｔｒｉｘ）を用いて探索した結果、表９に示す通り５箇所のクラスター配列が見出された。そのうち、ＥｐｉＶａｘ社のクライテリアを満たし陽性と判定されたものは星印の付いている３配列（ＤＰ１、ＤＰ３、ＤＰ４）であり、それ以外の２配列（ＤＰ２、ＤＰ５）は僅かにクライテリアを満たさないものの十分に可能性有りと判断された。

この５配列についてペプチド合成を行った。ペプチドは安定性を高めるために、Ｎ末端側にアセチル化修飾、Ｃ末端側にアミド化修飾を付加した。合成純度を９５％以上として２．５ｍｇ／チューブに分注し、凍結乾燥したペプチドを−２０℃で保存した。凍結乾燥したペプチドの使用時にＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｄ２６５０）で１０ｍＭになるように溶解又は懸濁した。合成したペプチドは、ヒト及びマウスのＴ細胞刺激活性解析に供した。

＜合成ペプチドのヒトＰＢＭＣを用いたＴ細胞刺激活性解析＞
Ｃ．Ｔ．Ｌ社から販売されているヒトＰＢＭＣ提供者の血清を抗ＨＳＶ ＩｇＧ抗体検出ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（デンカ生研）を用いてスクリーニングし、ＨＳＶ既感染（抗体陽性）ドナー由来のＰＢＭＣを購入した。ＥｐｉＶａｘ社のアルゴリズムに組み込まれている８種類の主要なＨＬＡ ＤＲ ｓｕｐｅｒ ｔｙｐｅ（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）遺伝子のいずれかのホモ接合体又はヘテロ接合体を有し、ＨＳＶ暴露歴の有るドナーのＰＢＭＣの凍結サンプルを購入した。また、非特異的な応答を解析するために、抗ＨＳＶ抗体陰性ドナー由来ＰＢＭＣも購入した（Ｄｏｎｏｒ １４、６７）。

Ｃ．Ｔ．Ｌ社のプロトコルに従い、Ｔｈａｗｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＴＬ ＷａｓｈＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ）にて凍結細胞を融解・洗浄後、培地（ＣＴＬ ＴｅｓｔＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ）にて所定濃度に調製し、ヒトＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ解析に供した。細胞をＥＬＩＳｐｏｔ専用９６ウェルプレートに０．５及び１×１０^７細胞／ｍＬの濃度で１００μＬずつ播種し、２０μＭに調製した各ペプチド溶液を１００μＬずつ添加（終濃度：１０μＭ／０．１％ＤＭＳＯ入り培地）して、３７℃でＣＯ_２インキュベーターにて５日間培養した。その後、所定のプロトコルに従い発色させ、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーにて各ウェルの陽性細胞数（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を計測した。不活化ＨＳＶ−１（１０ＰＦＵ／細胞）、Ｃｏｎ Ａ（終濃度：２μｇ／ｍＬ）を陰性対照（Ｎｏｎｅ）として０．１％ＤＭＳＯ入り培養培地で評価した。ＩＦＮ−γ産生細胞数の検出はＨｕｍａｎ ＩＦＮ ｇａｍｍａ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（登録商標、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ８８−７３８６−８８）を用いて、ＥＬＩＳｐｏｔ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ５ ｖｅｒｓａ ａｎａｌｙｚｅｒ）にて画像を取り込み、スポット数をｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ｓｏｆｔｗａｒｅでカウントした。

各サンプルの測定は全て３ウェルずつで実施した。実験結果を表１０に示す。表１０（Ａ）はＩＦＮ−γ産生細胞数の平均スポット数を示し、グレーの網掛けはスポット数が少なすぎて判定不能であったことを示す。また、表１０（Ｂ）はＴ細胞刺激活性の有無の判定を陰性対照（Ｎｏｎｅ）に対する刺激指数（ＳＩ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）を指標として行なったものである。ＳＩが３をＰｏｓｉｔｉｖｅ、ＳＩが２以上３未満をＭａｒｇｉｎａｌ、Ｓｉが２未満をＮｅｇａｔｉｖｅと判定したその結果、５ペプチド全てがヒトＴ細胞刺激活性を有し、そのうち４ペプチドがＨＬＡ型の異なる複数のヒトＰＢＭＣのＴ細胞を刺激できることが明らかになった。

＜合成ペプチドのマウスのＴ細胞刺激活性解析＞
Ｔ細胞刺激活性解析は、合成ペプチドのマウス免疫原性試験によって行われた。合成ペプチドをＤＭＳＯにて１０ｍＭに溶解又は懸濁したｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。また投与用の溶媒として、ＮＩＫＫＯＬ ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ株式会社製）を用いて１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ（注射用生理食塩水）を調製した。合成ペプチド１００μｇをＣｐＧ１０μｇ及びＭＰＬＡ１０μｇと共に溶媒に混合し２１０μＬ／匹の容量に調製して、マウス（４〜５週齢、雌）の背部皮下に投与した。マウスはＢＡＬＢ／ｃ（Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｉ−Ａｂ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｉ−Ａｋ／ＩＥｋ）の３系統を用いた。初回免疫から２１日後に追加免疫を行い、その２週間後に脾臓を回収し脾細胞を調製して、以下のサイトカイン産生応答解析（ＥＬＩＳｐｏｔ解析）に供した。調製した脾細胞を１×１０^６細胞／ウェルになるようにＰＶＤＦ膜９６ウェル（ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に播種し、各種ペプチド１０μＭと２０時間培養した。培養は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１０％ＦＢＳ存在下で、３７℃かつＣＯ_２濃度５％に設定したインキュベーターにて実施した。陽性対照としてＣｏｎ Ａ添加群を設定した。ＩＦＮ−γ産生細胞の検出はｍｏｕｓｅ ＩＦＮ ｇａｍｍａ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（登録商標、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ８８−７３８４−８８）を用いて行なった。ＥＬＩＳｐｏｔ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ５ ｖｅｒｓａ ａｎａｌｙｚｅｒ）で画像を取り込み、スポット数をｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ｓｏｆｔｗａｒｅでカウントした。

ＤＰ１〜ＤＰ５の５ペプチドのそれぞれをＢＡＬＢ／ｃ（Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｉ−Ａｂ）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｉ−Ａｋ／ＩＥｋ）の３系統のマウス（各群ｎ＝２）に免疫した後に、脾臓を採取し脾細胞を調製して、各ペプチドに対するＴ細胞応答性（ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２産生刺激活性）をＥＬＩＳｐｏｔ解析した。各サンプルの測定は全て２ウェルずつで実施した。実験結果を図１１に示す。ＩＦＮ−γ産生ＥＬＩＳｐｏｔ解析（図１１（Ａ））及びＩＬ−２産生ＥＬＩＳｐｏｔ解析（図１１（Ｂ））のいずれにおいても、ＤＰ１以外の４ペプチドが２系統以上のマウス脾臓Ｔ細胞を刺激できることが確認された。

実施例８ ヒト血清画分（免疫グロブリン）中に含まれる抗ｇＤ２抗体のポピュレーション解析
実際のヒト血清中に含まれる抗ＨＳＶ ｇＤ抗体のポピュレーションを解析するために、ヒトガンマグロブリンカクテルであるベニロン（献血ベニロン（登録商標）−I静注用、一般財団法人化学及血清療法研究所）を用いて、取得された抗体との競合試験を行った。競合試験としてｇＤ１−３１５とベニロンを反応させた後にモノクローナル抗体を反応させた。この系では、ベニロンに含まれる競合抗体の量が多いほど当該モノクローナル抗体（被検抗体）の結合量が少なくなり、競合率は高くなると考えられる。競合試験にはＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた。

（ＳＰＲを用いたベニロン競合試験）
競合試験はＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行われた。すべての実験においてＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、温度は２５℃、流速は１０μＬ／分に設定した。Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐはＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。推奨されたプロトコルに基づき、０．５ｍＭ ＮｉＣｌ_２を１０秒反応させた。次に、ｇＤ１−３１５−Ｈｉｓを３μｇ／ｍＬで６０秒反応させ、約３００ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）固相化した。Ｂｉａｃｏｒｅを表面プラズモン共鳴センサーとして用いて解析を行った場合、得られるシグナル値である「ＲＵ」は、１ｍｍ^２あたり物質が１ｐｇ結合したときの単位として表される。また、ｃｈｉｐの再生については３５０ｍＭ ＥＤＴＡで１０秒、２回、ｃｈｉｐ表面を処理し、Ｂｕｆｆｅｒで１０秒洗浄した。新たな検体を測定するたびに固相化及び再生を同様の方法で実施した。競合率は次のように算出された。濃度２０μｇ／ｍＬの検討する抗体を流速２０μＬ／分で１２０秒アプライし、増加したＲＵを（１）とし、濃度１５０μｇ／ｍＬのベニロンを流速２０μＬ／分で１２０秒アプライし続けて、その後、濃度２０μｇ／ｍＬ抗体１２０秒アプライし、増加したＲＵを（２）とした時、（１−（２）／（１））×１００の計算式によって競合率を計算した。すべてのサンプルは一回のみ測定した。
ベニロン競合試験の解析結果を表１１に示す。最も高い競合率を示したのは弱中和抗体である抗体Ｎｏ．５であり、次いで抗体Ｎｏ．１３、抗体Ｎｏ．７５、抗体Ｎｏ．７８、抗体Ｎｏ．７２とＰ５０周辺領域にエピトープを有する抗体群が上位を占めた。一方、抗体Ｎｏ．８２は７クローン中、６番目であり相対的に低い競合率を示し、最も低いものは抗体Ｎｏ．１であった。

以上の結果から、ヒト血清中に含まれる抗ｇＤ２抗体の中で、野生型ｇＤ抗原上のＰ５０周辺領域のエピトープを認識する抗体の数は、ＲＢＤ上又はその周辺のエピトープを認識する抗体の数よりも多いことが分かった。Ｐ５０周辺領域は高い抗体誘導能を有するが、有益性の低い抗体を多く誘導し得るデコイ領域であると考えられた。

実施例９ ワクチン抗原のためのＨＳＶ ｇＤ改変体の設計
本発明者らは、中和抗体のエピトープが存在するＲＢＤが有益なエピトープ領域とし、有益性の低い抗体群のエピトープが存在するＰ５０周辺領域及びＦＲ３をデコイ領域とし、中和抗体をより多く誘導できるｇＤタンパク質改変体の設計にあたって、有益なエピトープを際立たせること、デコイ領域中のエピトープを糖鎖導入や欠損変異等によって脱エピトープ化すること、さらに、プロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスターペプチドを連結することによって、液性免疫応答、細胞性免疫応答の双方を効率的・効果的に惹起できること、の３つの観点から、以下のようにｇＤ改変体を設計し、その中和抗体の誘導活性を調べた。

＜改変型ｇＤの設計方針＞
野生型ＨＳＶ ｇＤ抗原上に存在する有益なエピトープとして、抗ｇＤ２抗体Ｎｏ．８２のエピトープであるｇＤレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）、及びＴ細胞エピトープ解析より予測されたプロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスターＤＰ５（ｇＤ２ ３３４−３５０；配列番号８）を想定し、また相対的に有益性の低い抗体群のエピトープが集中しているデコイ領域としてＰ５０周辺領域を想定した。

前述の３つの観点に基づく改変型ｇＤの設計において、（１）糖鎖導入による非中和エピトープのマスキング、（２）ｇＤ１−３１５のＣ末端側配列ＦＲ３の改変、（３）Ｔ細胞エピトープペプチドの連結、という３つの方針とした。

（１）の糖鎖導入に当たっては、Ｒ１８６（ＳＣ−Ａ）、Ｐ７４（ＳＣ−Ｄ）、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）の三箇所を改変部位候補とした。特にＳＣ−Ｆは非中和抗体群であるグループＣ１の結合を阻害するという結果が示されており、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）を中心とした糖鎖導入を実施した。

（２）のｇＤ１−３１５のＣ末端側配列ＦＲ３の改変に関しては、文献報告のあるＨＳＶ ｇＤ１の結晶構造解析（非特許文献７）から、ＦＲ３及びＮ末端側配列であるＦＲ１はｇＤ分子内のコアベータシート構造であるＦＲ２の全く同じ面に、巻き付くように結合し得ることが示唆されている。ＦＲ１及びＦＲ３は互いに干渉し合うため、ＦＲ２に対しどちらか一方しか結合できない。通常ウイルスエンベロープ上ではＦＲ３が結合しており、レセプターとの結合時にはＦＲ３が外れ、ＦＲ１が結合するように構造変化し、レセプター結合領域が露わになると推察されている。抗体Ｎｏ．８２のエピトープ解析から、抗体Ｎｏ．８２はＮｅｃｔｉｎ−１結合領域と結合すること、ＦＲ１欠損体（ｇＤ３４−３１５）との反応性が低下すること、ｇＤとＨＶＥＭ或いはＮｅｃｔｉｎ−１との結合を阻害することが分かっている。即ち、抗体Ｎｏ．８２のエピトープを際立たせ、当該領域に対するイムノ・リフォーカスを誘導するためにはＦＲ３を欠損させるか、又はＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害することが有効であると考えられた。ＦＲ３欠損体としては文献報告のあるｇＤ１−２７５をベースとした（非特許文献１２）。また、ＦＲ３上には抗体Ｎｏ．１のエピトープが存在することから、ＦＲ３の欠損によって一部の非中和抗体の誘導が抑制されるのではないかと期待された。またＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害するという観点からは、同様に文献報告のあるｇＤ１−３１５ Ｖ２３１Ｗ変異体（ｇＤ１−３１５Ｖ）をベースとした（非特許文献９）。Ｖ２３１Ｗ変異はＦＲ３のＦＲ２への結合を阻害することが示唆されている。こちらの改変体では抗体Ｎｏ．１等の非中和抗体の誘導を抑制することまでは期待できないが、抗体Ｎｏ．８２のエピトープを際立たせることは可能であると考えられた。

（３）のＴ細胞エピトープペプチドの連結に関しては、予測されたＴ細胞エピトープの配列を改変体のＣ末端等に連結することによりＴ細胞免疫応答を誘導することができる。膜貫通領域や細胞内領域にもＴ細胞エピトープが存在するが、ワクチンとしての使用を考慮すると、細胞外領域で構成される分泌発現型での設計が必要となるため、膜貫通領域や細胞内領域に存在するＴ細胞エピトープを連結することで、細胞外領域には含まれないＴ細胞エピトープを有効に利用することができる。ｇＤ２ エクトドメイン配列中には予測された５ペプチドのうちＤＰ１−３までの３つの配列しか含まれていないため、細胞内領域のエピトープ配列であるＤＰ５を連結する効果は大きいものと考えられた。よって、このＤＰ５の二連結体を中心に改変を進めた。

以上の改変型ｇＤの設計戦略の模式図を図１２に示した。また、ＨＳＶ ｇＤ２単量体の立体構造モデルに糖鎖導入箇所や予想される抗体Ｎｏ．８２エピトープ等を加えたものが図３に示されている。

＜改変型ｇＤの設計、発現、反応性解析＞
以上の三つの方針に基づき、ｇＤ２の改変を進め、計１６種類の改変体を得た（表１２）。改変体の作製は、以下に示す方法に従って行った。

（プラスミドコンストラクト）
ｇＤ１−２７５、ｇＤ１−３１５のプラスミド構築、糖鎖を導入する際に使用したプライマーに関しては、前述の通りである。Ｔ細胞エピトープペプチドを導入する場合には、目的のｇＤ配列のＣ末端残基（Ｄ２７５又はＧ３１５）に続けてリンカー（ＧＰＧＰＧ）、各Ｔ細胞エピトープペプチド、６×Ｈｉｓ−ｔａｇの順で連結するようにＤＮＡを設計し、全長を人工遺伝子合成し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。完成した改変体配列をｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏベクターにクローニングし、発現用プラスミドを得た。

ｇＤ１−２７５をベースとした改変体は４種類作製した。これらはＦＲ３を欠損した改変体であるので、ＦＲ３に影響を及ぼすＶ２３１Ｗ変異は検討しなかった。糖鎖の導入のみ（ｇＤ１−２７５ｖ３、ｇＤ１−２７５ｖ５）では性状に変化は見られなかったが、さらにＤＰ５を連結した改変体のうちｇＤ１−２７５ｖ３−５５で凝集体の存在を確認した。性状が良好であったｇＤ１−２７５ｖ５−５５との違いはＲ１８６（ＳＣ−Ａ）を導入したか否かであったため、構造上２７５ａａの近傍に存在するＲ１８６（ＳＣ−Ａ）の立体構造がＤＰ５の本体部分への吸着等、凝集の引き金となる構造変化を阻止したのではないかと推察される。一方ｇＤ１−３１５をベースとした改変体は８種類作製され、全ての改変体で性状・発現量共に原体であるｇＤ１−３１５を下回るものはなかった。

＜改変体と各種抗ｇＤ２モノクローナル抗体との反応性の解析＞
（抗体及びｇＤ改変体の発現、精製）
各抗ｇＤ２モノクローナル抗体及び各ｇＤ改変体はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いて発現した。４〜６日間の培養の後、その上清をＰｒｏｔａｉｎ Ａ アフィニティクロマトグラフィーカラム又はＮｉ−ＮＴＡ アフィニティクロマトグラフィーカラムによって精製し、ＰＢＳで透析を行った。その純度についてはサイズ排除クロマトグラフィーとＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

（抗ｇＤ２抗体との競合ＥＬＩＳＡ）
リン酸緩衝生理食塩水で濃度２μｇ／ｍＬに調整した１００μＬのｇＤ改変体を９６ウェルマイクロタイタープレートに、４℃にて一晩かけて固相化した。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬの１％ＢＳＡ ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ）で３回洗浄し、各抗ｇＤ２抗体を１％ＢＳＡ ＰＢＳに任意の希釈倍率で希釈し、１００μＬで加え、３７℃にて一時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ標識抗体（ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ）を加え、３７℃にて一時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＴＭＢで室温にて３０分発色させ、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度を測定した。

その結果を表１２に示す。全ての改変体で抗体Ｎｏ．８２との反応性を確認できたため、３つの方針による抗体Ｎｏ．８２エピトープへの悪影響は無いものと判断された。一方、予想された通り、ＦＲ３上にエピトープが存在する抗体Ｎｏ．１はｇＤ１−２７５ベースの改変体と反応性を示さなかった。また、これまでエピトープが不明であった抗体Ｎｏ．１３に関しては、ｇＤ１−２７５ベースにＰ５０（ＳＣ−Ｆ）を導入することで反応性が消失する（マスキングが可能である）ことが判明した。ＦＲ３の欠損若しくはＰ５０（ＳＣ−Ｆ）の導入のどちらか片方のみの改変では抗体Ｎｏ．１３の反応性は残存したままであった結果を考えると、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）とＦＲ３が何らかの立体構造を協調的に形成しているのではないかと考えられるが、詳細なエピトープは不明のままである。他のＣグループの抗体群については概ね想定通りの反応性を示した。Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）の導入により抗体Ｎｏ．５、抗体Ｎｏ．７８の結合は完全にブロックされ、ＦＲ３に一部エピトープが存在することが示唆されていた抗体Ｎｏ．７２．及び抗体Ｎｏ．７５は一部の改変体で弱い反応性を示した。弱中和抗体である抗体Ｎｏ．７２、抗体Ｎｏ．７５の反応性を残存させることができたことは、ワクチン抗原として望ましい結果であった。

抗体Ｎｏ．８２との反応性についてはさらに詳細な解析を実施した（図１３）。図１３は、ｇＤ１−３１５（野生型）との反応性を「１」としたときの、各ｇＤ改変体の抗体Ｎｏ．８２との反応性の相対値を示す。抗体Ｎｏ．８２は作出した全てのｇＤ改変体と結合したが、その反応性の強さは様々であった。ｇＤ１−３１５に対する抗体Ｎｏ．８２の反応性を基準とすると、大半の改変体において抗体Ｎｏ．８２との反応性が増強していた。糖鎖導入の観点からは、Ｐ５０（ＳＣ−Ｆ）単体の導入よりもＲ１８６（ＳＣ−Ａ）をも同時に導入した方がより効果が高かった（ｇＤ１−３１５ｖ５−５５、ｇＤ１−３１５ｖ５−５５Ｖ）。前述の通り、抗体Ｎｏ．８２はｇＤレセプター結合領域とＦＲ１の一部にエピトープが存在する。ｇＤ１−２７５ｖ３−５５の凝集体形成において言及した理由と同様に、Ｒ１８６（ＳＣ−Ａ）がＦＲ３のフレキシビリティを奪い、ＦＲ１がｇＤレセプター結合領域へより結合し易い状況が生み出されたのではないかと考えられる。また、ＤＰ５を連結した改変体においても顕著に抗体Ｎｏ．８２との反応性が増強されており、特にｇＤ１−３１５ｖ５−５５ではｇＤ１−３１５原体に比して約１２倍もの反応性を示した。Ｃ末端へのＤＰ５のタンデム連結は、ＤＰ５の配列そのものがＦＲ３のｇＤレセプター結合領域への結合を阻害する役割を果たすものと考えられる。Ｖ２３１Ｗ変異体（ｇＤ１−３１５ｖ３−５５Ｖ、ｇＤ１−３１５ｖ５−５５Ｖ）については変異のない改変体（ｇＤ１−３１５ｖ３−５５、ｇＤ１−３１５ｖ５−５５）と比較して抗体Ｎｏ．８２の反応性がやや低下するという結果となった。Ｖ２３１Ｗが紹介された文献（非特許文献９）ではＦＲ３の結合を阻害する効果があるとの報告であったが、実際にはその嵩高さによってＦＲ１の結合をやや阻害するか、本来の結合構造を変化させてしまう効果があるのではないかと考えられる。

以上の考察から、各改変体はＦＲ１がレセプター結合領域へ結合している構造を取っているものと強く推察できる。そこでＨＶＥＭと各改変体の反応性を競合ＥＬＩＳＡによって測定した。

結果を図１４に示す。ＨＶＥＭはＦＲ１がレセプター結合領域へ結合し、特徴的なヘアピン構造を取った時に初めてｇＤに結合することができる。ＨＶＥＭの相互作用サイトは全てＦＲ１に存在することが示されており、ＨＶＥＭとの反応性向上は前述の推察のとおりであった。原体であるｇＤ１−３１５と比較して、最もＨＶＥＭとの反応性が高かったのはｇＤ１−３１５ｖ５−５５であり、次いでｇＤ１−３１５ｖ５−５５Ｖ或いはｇＤ１−２７５ｖ５−５５、さらにはｇＤ１−３１５ｖ３−５５の順でＨＶＥＭと反応しｇＤ１−３１５及びｇＤ１−３１５ｖ５は殆ど反応が認められなかった。ＦＲ３を欠損させたｇＤ１−２７５ｖ５−５５はＦＲ３が存在する他のｇＤ１−３１５ベースの改変体よりもＦＲ１の結合、続いてＨＶＥＭの結合を推進した。抗体Ｎｏ．８２の反応性解析において１−２７５ｖ５と１−３１５ｖ５はほぼ同様の反応性を示したことから、ＦＲ３欠損による効果はＲ１８６（ＳＣ−Ａ）導入による効果とほぼ同程度であると推察できる。

＜改変型ｇＤのマウス免疫原性試験＞
（マウス免疫原性試験）
野生型ｇＤ抗原ｇＤ１−３１５（ＷＴ）を陽性対照、ｓａｌｉｎｅを陰性対照として、改変型ｇＤ抗原の免疫原性試験を実施した。ＭＰＬＡ（１０μｇ／匹）及びＣｐＧ（１μｇ／匹）と共に、所定量の抗原を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、２００μＬ／匹の容量でマウスに免疫した。試験には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、メス）を用い、２週間間隔で合計３回、背部皮下に免疫した（１群あたりＮ＝４の例数で実施）。最終免疫（３回目）から２週間後に、個体毎に採血し血清を調製した。調製した血清を段階希釈し、ＨＳＶ−２に対する中和抗体誘導活性（プラーク数５０％減少活性）を評価した。

中和抗体誘導活性に関する解析結果を図１５〜図１９に示す。各グラフ中、改変型ｇＤのデータを黒色実線、野生型ｇＤのデータを灰色点線で示し、高用量投与群（３μｇ／匹）を黒丸、中用量投与群（０．３μｇ／匹）を黒三角、また低用量投与群（０．１μｇ／匹）を黒四角で示した。各群の動物例数をｎ＝４として実験を行い、それらの平均値をプロットし±ＳＥエラーバーを付記した。評価に供した１３種類の改変型ｇＤのうち（Ｅ）のｇＤ１−３１５ Ｖ以外の１２種類の免疫血清は、野生型ｇＤ（ｇＤ１−３１５）の免疫血清に比して概ね高い中和抗体活性を示した。即ち、同一投与量における同一希釈倍率のプラーク数減少率を比較すると、野生型ｇＤよりも改変型ｇＤの方が高い減少率を示す傾向にあった。

次にＥＬＩＳＡ法による抗ｇＤ抗体誘導活性に関する解析結果を図２０〜２４に示す。各グラフ中のシンボルや折れ線に関する表記は前出の中和抗体誘導活性グラフと同様とした。中和抗体活性に関する結果とは逆に、評価に供した１４種類の改変型ｇＤのうち（Ｃ）のｇＤ１−３１５ｖ５、（Ｆ）のｇＤ１−３１５Ｖ、（Ｊ）のｇＤ１−２７５以外の１１種類の免疫血清中の抗ｇＤ結合抗体活性は野生型ｇＤのそれに比して、相対的に低い値を示す傾向にあった。即ち、改変型ｇＤは野生型ｇＤよりも少ない結合抗体価（抗体量）で高い中和抗体活性を誘導することが分かった。

以上の結果は、野生型ｇＤ抗原上のＰ５０周辺領域に多く存在する有害・無益なエピトープをＮ型糖鎖導入によって脱エピトープ化することによって、残存している有益性の高い中和エピトープに対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することができた結果であると考えられる。言い換えれば、野生型ｇＤ抗原に対する偏った免疫応答（免疫偏向）を、本発明者らのイムノ・リフォーカス戦略によって理想的な形に矯正（免疫矯正）することができたものと言える。

さらに細胞性免疫（Ｔ細胞免疫）誘導活性に関して、改変型ｇＤ抗原の一例としてｇＤ１−３１５ｖ３−５５と野生型ｇＤ（ｇＤ１−３１５）のそれぞれを免疫したマウス（３μｇ／匹投与群）から調製した脾細胞（４例分を纏めたプールサンプル）のＩＦＮ−γ産生応答活性（リコール活性）を比較解析した。具体的には、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに３μｇの抗原を背部皮下に２週間間隔で３回免疫し、最終免疫の２週間後に脾臓細胞を回収した。底面がＰＶＤＦ膜になっている９６ウェルプレートに抗ＩＦＮ−γを固相化し、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルで細胞を播種。刺激物質として免疫抗原を１０ｍＭ添加し、２０時間３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。上清を除去し、抗マウスＩＦＮγ−ＨＲＰ抗体を反応させた後に、ＡＥＣ試薬によりＨＲＰを染色することで、ＩＦＮγ産生細胞数を、Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ社）を用い、カウントした。結果を図２５に示す。ｇＤ１−３１５ｖ３−５５免疫群の方が野生型ｇＤ免疫群も高い応答活性を示すことが分かった。改変型ｇＤ抗原のＣ末端にＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性プロミスキュアスＴ細胞エピトープクラスターＤＰ５を２連結させることによって、細胞性免疫（Ｔ細胞免疫）誘導活性を増強させ得ることが分かった。

＜改変型ｇＤのマウス感染防御試験＞
（マウス感染防御試験）
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、改変型ｇＤ抗原の予防的投与における感染防御試験を実施した。前述のマウス免疫原性試験と同様にして、１群あたりＮ＝１０の例数にてマウスを免疫した。最終免疫（３回目）から２週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種６日前にＤｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａを２ｍｇ／匹で皮下接種した。麻酔下で５×１０^５ＰＦＵ／２０μＬのＨＳＶ−２ ＭＳ株を経腟接種し、２１日間経過観察を行った。生存日数（生存率）を指標に感染防御能を評価した。

マウス性器ヘルペス感染モデル感染モデルを用いて、各種改変型ｇＤの感染防御能を予防的投与にて評価した。各群の動物例数をｎ＝１０として、陽性対照として野生型ｇＤ（ｇＤ１−３１５）、陰性対照としてｓａｌｉｎｅを用いた。実験は計４回実施（実験１〜４）し、陽性対照、陰性対照、及び被検改変型ｇＤ抗原については全て０．１μｇ／匹／回、０．０３μｇ／匹／回、０．０１μｇ／匹／回及び０．００３μｇ／匹／回の４用量を設定した。最終免疫（３回目）から２週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種６日前にＤｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａを２ｍｇ／匹で皮下接種した。麻酔下で５×１０^５ＰＦＵ／２０μＬのＨＳＶ−２ ＭＳ株を経腟接種し、２１日間経過観察を行った。生存日数（生存率）を指標に感染防御能を評価した。グラフ中にはそれらの平均値をプロットした。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により陰性対照群に対する有意差検定を行うと共に、検定結果に基づく最小有効用量が野生型ｇＤに比して３倍公比で２用量以上強いものを「＋＋」、１用量強いものを「＋」、同等のものを「±」と判定した。

実験１の結果を表１３、及び図２６〜図２８に示す。評価した６種類全ての改変型ｇＤは、野生型ｇＤに対する優越性を示し、そのうち「＋＋」と判定されたものはｇＤ１−３１５ｖ３−５５、ｇＤ１−３１５ｖ５−５５Ｖ、ｇＤ１−２７５ｖ５−５５の３種類であり、「＋」と判定されたものはｇＤ１−３１５ｖ５、ｇＤ１−３１５ｖ４Ｖ、ｇＤ１−３１５ｖ４−５５Ｖの３種類であった。

実験２の結果を表１４、及び図２９に示す。評価した２種類の改変体ｇＤ１−３１５ｖ３−５５、ｇＤ１−３１５ｖ３−５５Ｖ共に「＋」と判定され、野生型ｇＤに対する優越性を示した。

実験３の結果を表１５、及び図３０に示す。評価した改変体ｇＤ１−３１５ｖ３Ｖの判定は「±」であり、野生型ｇＤに対する明確な優越性は認められなかった。

実験４の結果を表１６、及び図３１〜図３２に示す。評価した５種類全ての改変型ｇＤが野生型ｇＤに対する優越性を示し、そのうち「＋＋」と判定されたものはｇＤ１−３１５ｖ４−５５Ｖ、ｇＤ１−３１５ｖ５−５５Ｖの２種類であり、「＋」と判定されたものはｇＤ１−２７５ｖ３−５５、ｇＤ１−２７５ｖ４−５５、ｇＤ１−２７５ｖ５−５５の３種類であった。

以上、ｇＤ１−３１５ｖ３Ｖ以外のほぼ全ての改変型ｇＤに関して、中和抗体誘導能と同様に感染防御能においても野生型ｇＤに対する優越性が確認された。

＜改変型ｇＤ免疫血清中の抗体ポピュレーション解析＞
マウス免疫原性試験及びマウス感染防御試験において野生型ｇＤ（ｇＤ１−３１５）に比して優越性が認められた一連の改変型ｇＤのうち、ｇＤ１−３１５ｖ３−５５及びｇＤ１−３１５ｖ５−５５について、そのメカニズムを調べるために免疫血清の解析を行った。目的とする抗体Ｎｏ．８２様抗体の効率的な誘導が実際に引き起こされているのか否かについて調べた。抗体量を揃えるために、血清からＩｇＧを精製し、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた競合法により解析した。

（ＳＰＲを用いた抗ｇＤ２抗体競合試験）
抗ｇＤ２抗体競合試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行い、すべての実験においてＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、温度は２５℃、流速は２０μＬ分に設定した。Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐはＣＭ５ ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、推奨されたプロトコルに基づいて実験を行った。ｃｈｉｐ表面にはｇＤ１−３１５−Ｈｉｓを約３００ ＲＵ固相化し、ｃｈｉｐの再生には０．１ＭかつｐＨ２．０のグリシン−塩酸緩衝液を用い、流速３０μＬ／分で３０秒、２回洗浄した。競合の手順、競合率の算出は次のように行った。各種抗ｇＤ２抗体１０μｇ／ｍＬ又はｂｕｆｆｅｒをｃｈｉｐに結合１分、解離２．５分の条件でアプライし、その後ＩｇＧ精製した各種免疫血清２０μｇ／ｍＬを結合１分、解離５分の条件でアプライする。ｂｕｆｆｅｒアプライ後、免疫血清をアプライしたときに検出されたＲＵを１００％とし、抗ｇＤ２抗体アプライによる免疫血清のレスポンスの低下を競合率として算出した。

解析結果を図３３に示す。ｇＤ１−３１５ｖ３−５５免疫血清及びｇＤ１−３１５ｖ５−５５免疫血清はいずれも、野生型ｇＤ免疫血清と比較して抗体Ｎｏ．８２と競合する抗体の割合が上昇していることが確認できた。その一方で、Ｎ型糖鎖導入によってマスキングを受けたＰ５０周辺領域にエピトープを有する抗体Ｎｏ．７２と競合する抗体の割合は減少傾向にあることが確認された。また、エピトープが残存している非中和抗体Ｎｏ．１と競合する抗体の割合には殆ど変化が認められなかった。以上の結果から、野生型ｇＤ免疫血清に比して改変型ｇＤ免疫血清中には、良質な中和抗体である抗体Ｎｏ．８２様抗体が相対的に多く存在しており、目的としたイムノ・リフォーカスを誘導できていることが示唆された。

（ｇＤ レセプターとの競合ＥＬＩＳＡ）
さらに、改変型ｇＤ免疫血清によるｇＤ−ＨＶＥＭ相互作用に対する阻害についても解析した。具体的には、リン酸緩衝生理食塩水で濃度５μｇ／ｍＬに調整した１００μＬのｇＤ１−３０５−ｃｙｓ−ｓｔｒｅｐ ｄｉｍｅｒを９６ウェルマイクロタイタープレートに、４℃にて一晩かけて固相化した。その後、上記競合ＥＬＩＳＡの方法と同様にブロッキング、洗浄を行い、各免疫血清から精製したＩｇＧを任意の濃度で１００μＬ添加し、室温にて一時間反応させた。その後、１μｇ／ｍＬのＨＶＥＭ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）を１％ＢＳＡ ＰＢＳに任意の希釈倍率で希釈し、１００μＬでそれぞれ添加し、さらに室温にて１時間反応させた。再度各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ標識抗体（ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ／１％ＢＳＡ ＰＢＳ）を反応させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、発色させ、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度を測定した。

結果を図３４に示す。ｇＤ−ＨＶＥＭ相互作用を阻害する抗体は野生型ｇＤ免疫血清中よりも改変型ｇＤ免疫血清中により多く含まれており、特にｇＤ１−３１５ｖ５−５５免疫血清は強い阻害作用を示した。以上の結果から、改変型ｇＤはｇＤとＨＶＥＭの相互作用を阻害できる良質の抗体を野生型ｇＤよりも効率良く誘導させることによって、より強い防御効果をもたらしている可能性が示唆された。

本発明の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質は、ＨＳＶ感染症の予防及び治療に効果的なワクチンの作製に使用できる。

Claims (27)

1. 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在するＢ細胞エピトープと比較して、中和抗体誘導活性が低い又は無いＢ細胞エピトープ（デコトープ）の少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
2. 前記ＲＢＤに存在するＢ細胞エピトープが、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３４番目のアルギニン残基、１３９番目のアスパラギン酸残基、及び２２２番目のアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項１に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
3. 前記デコトープは、ｇＤエクトドメインのＮ末端プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）に存在するＢ細胞エピトープである、請求項１又は２に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
4. 前記デコトープは、
   野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
   野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、前記５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープ
   である、請求項３に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
5. 前記デコトープの改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び／又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
6. 前記デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、請求項５に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
7. 前記デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項５又は６に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
8. 前記デコトープの改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
9. 前記野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、
   前記デコトープの改変は、
   配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、５１番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
   配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、７６番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
   配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
   からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む、
   請求項５に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
10. 前記糖鎖がＮ型糖鎖である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
11. 前記改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端側に少なくとも１つのプロミスキュアスＴ細胞エピトープが連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
12. 前記プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、請求項１１に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
13. 前記プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、請求項１２に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
14. 前記改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、前記野生型ＨＳＶ ｇＤの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５１〜３１５番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の少なくとも一部の欠損を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
15. 前記改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３１番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されることによって行われる改変を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
16. 前記ＨＳＶが、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
18. 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）において、ｇＤエクトドメインのＮ末端プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）に存在するＢ細胞エピトープの少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
19. 前記ＰＲＲに存在するＢ細胞エピトープは、
    野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基を含むエピトープ、又は、
    野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの結晶構造の表面において、前記５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープ
    である、請求項１８に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
20. 前記改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる、請求項１８又は１９に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
21. 前記改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入よって行われる改変を含む、請求項２０に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
22. 前記改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基に相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項２０又は２１に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
23. 前記改変は、野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインの、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基への糖鎖導入によって行われる改変を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
24. 前記野生型ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、
    前記改変は、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における５０番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、５１番目のプロリン残基をプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における７４番目のプロリン残基をアスパラギン残基に置換し、７６番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、及び
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における１８６番目のアルギニン残基をアスパラギン残基に置換することによって糖鎖導入されることによって行われる改変、
    からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む、
    請求項２０に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
25. 前記改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質はさらに、ＨＳＶ ｇＤのエクトドメインのＣ末端側に少なくとも１つのプロミスキュアスＴ細胞エピトープが連結されている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
26. 前記プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、請求項２５に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。
27. 前記プロミスキュアスＴ細胞エピトープは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるプロミスキュアスＴ細胞エピトープである、請求項２６に記載の改変型ＨＳＶ ｇＤタンパク質。