JP2023527916A - アゴニスト抗ｃｄ４０抗体 - Google Patents

アゴニスト抗ｃｄ４０抗体 Download PDF

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Abstract

本出願は、一般に、特定のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の同定に関する。それに基づいて、本発明は、新規なアゴニスト抗体、および治療におけるその使用を提供する。本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０＋ＤＣおよびマクロファージへの結合を含むがこれらに限定されない様々な活性での使用に適している。さらに、本発明の抗体を、他の免疫増強剤（例えば、局所的または全身的なＩＬ－２、ＴＬＲ－７アゴニストおよび／または細胞傷害性化学療法など）と組み合わせると、強力な抗腫瘍ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答の発生を認めることができる。

Description

技術分野
本出願は、一般に、特定のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の同定に関する。それに基づいて、本発明は、新規なアゴニスト抗体、および治療におけるその使用を提供する。
背景技術
腫瘍は、その進化中のある時点で、宿主免疫システムによって認識される。認識の証拠があるにもかかわらず一部の腫瘍は成長するが、これはおそらく、危険シグナルが欠如している可能性があり、したがって弱い応答しか誘導しないためであり、そしておそらく、免疫圧力の増加の下で免疫回避戦略を発達させるためである。
発生の初期段階で処置された腫瘍は、単免疫療法に対するより良好な応答を示す可能性が高い。しかしながら、進行癌は、免疫療法を含むすべての形態の治療に対してより抵抗性である。それらの危険シグナルの欠如に加えて、ますます複雑な免疫回避機構の獲得は、関連するＴ細胞応答を引き起こすために適切な共刺激マーカーを用いて正しいコンテキストで腫瘍由来抗原をサンプリング、処理、および提示するために樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に依存する宿主適応免疫応答に重大な障害を与える。腫瘍細胞は、Ｂ７ファミリーメンバーなどの必須共刺激分子の発現レベルが低いため、自身の抗原刺激を提示しないことが多い。
腫瘍抗原を直接提示することはできないので、交差提示は、腫瘍免疫のための天然抗原提示の唯一の様式であり得る。このプロセスの間、腫瘍細胞に由来する外因性抗原（可溶性抗原、アポトーシス小体、または生きている癌細胞）はＤＣによって取り込まれ、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプを誘発するためにＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテキストにおいてプロセシングおよび提示の古典的な経路を単にたどるのではなく、外因性抗原も内在化され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への提示のためにＭＨＣクラスＩ分子のコンテキストにおいて提示される。しかしながら、提示ＤＣも適切に活性化され、提示が適切な共刺激のコンテキストにおいて行われない限り、このプロセスは弱い応答または耐性をもたらす。腫瘍環境内のＤＣは未熟な状態にあることが多く、腫瘍を排出するリンパ節で制御性Ｔ細胞の増殖を促す可能性がある。それらの機能はまた、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの浸潤抑制細胞、ならびに腫瘍および排出リンパ節内のサイトカインによって抑制され得る。したがって、ＤＣが抗原特異的Ｔ細胞応答をプライムするのを「助ける」効果的な免疫療法は、これらの障害を克服し、交差提示プロセスを支援しなければならない。効果的な交差プライミングには、「ライセンスされた（ｌｉｃｅｎｓｅｄ）」ＤＣおよび高レベルの抗原が必要である。ＤＣの「ライセンシング（Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ）」または「コンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）」は、ＣＤ４０の架橋を介して抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞によって行われる。この連結は、ＤＣの表現型および機能を変化させ、ＩＬ－６およびＩＬ－１２などのサイトカインによる自己分泌シグナル伝達を介してそれらの寛容原性の可能性を阻害し、したがってそれらが強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を活性化することを可能にする。対照的に、ライセンスされていないＤＣによって活性化されたＣＴＬは「ヘルプレス（ｈｅｌｐｌｅｓｓ）」と呼ばれており、結果としてＴ細胞アネルギーまたは欠失および制御性Ｔ細胞も誘導され得る。したがって、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである細胞表面分子ＣＤ４０は、免疫活性化を広く調節し、腫瘍アポトーシスを媒介する。
ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである膜貫通タンパク質である。ＣＤ４０はＡＰＣによって発現され、Ｔヘルパー細胞および血小板上のその天然リガンド（ＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌ）の結合は、ＤＣ、マクロファージおよびＢ細胞を含むＡＰＣを活性化する。
ＣＤ４０は、肺、乳房、結腸、前立腺、膵臓、腎臓、卵巣および頭頸部の黒色腫および癌腫ならびにＢ細胞悪性腫瘍の大部分に見られる。
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞媒介性免疫のマウスモデルにおいてＣＤ４＋リンパ球によって提供されるＴ細胞ヘルプを代替することが示されている。腫瘍担持宿主において、ＣＤ４０アゴニストは、腫瘍関連抗原に対する有効な免疫応答を誘発する。例えば、ＤＣは、共刺激マーカーを上方制御し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に遭遇したときにそれらを活性化することを可能にするように、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を使用して「プレコンディショニング」され得る。したがって、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗原負荷ＤＣ上のＣＤ４０をシグナル伝達し、Ｂ７共刺激分子の上方制御およびＩＬ－１２の放出を引き起こし、それによって、それらに特異的ＣＴＬ応答を刺激する能力を付与することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプを代替することができる。
したがって、ＡＰＣの表面上のＣＤ４０の連結は、ＭＨＣならびにＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣまたはＨＬＡ－ＤＲなどの共刺激分子の発現を増強し、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γなどの炎症促進性サイトカインの産生を刺激し、Ｔ細胞活性化を誘導し、これらはすべて細胞媒介免疫応答に不可欠である。
ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌのいずれかに生殖細胞変異を有する患者は、著しく免疫抑制されており、日和見感染症にかかりやすく、ＩｇＧ産生、胚中心形成およびメモリーＢ細胞誘導を含むＴ細胞依存性免疫反応が不十分である。
Ｔ細胞媒介性免疫のマウスモデルにおいて、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替することが示されている。アゴニストＣＤ４０抗体はまた、腫瘍を有するマウスにおけるＴ細胞寛容を克服し、効果的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し、抗腫瘍ワクチンの有効性を高めることができる。
これらの知見は、多くの場合にアポトーシスおよび壊死を介して腫瘍退縮をもたらす直接的な細胞傷害効果を媒介する腫瘍細胞の表面上のＣＤ４０の連結とは反対に区別される。腫瘍細胞に対するＣＤ４０の正確な機能は不明であるが、インビトロでのＣＤ４０の関与は、固形腫瘍細胞および高悪性度Ｂ細胞リンパ腫株の増殖を阻害する。さらに、免疫無防備状態のマウスにおける乳癌腫またはＢ細胞リンパ腫異種移植片の阻害を含む、ＣＤ４０媒介性の腫瘍阻害もインビボで観察されている。
ＣＤ４０に対するこれらの多様な役割は、腫瘍を有する動物におけるＣＤ４０の活性化が、（ｉ）腫瘍に対する直接的な細胞傷害効果、および（ｉｉ）ＣＤ４０によって同時に活性化されるＡＰＣへの腫瘍抗原の提供の可能性を有する機会を提供する。
ＣＤ４０に対するアゴニストのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な前臨床モデルにおいて既に治療活性を示している。これらの知見は、ＣＤ４０の二重機能性と共に、ＣＤ４０を癌治療の魅力的な標的とし、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の臨床開発の理論的根拠を形成した。
しかしながら、ヒトＣＤ４０に対するさらなるアゴニストモノクローナル抗体が依然として必要とされている。この背景に対して、本発明が開発された。
発明の要旨
本発明者らは、患者の悪性腫瘍を処置することができる免疫原性剤としての使用に適した新規アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を開発した。
本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、（ａ）Ｔ細胞輸送を可能にするような、ＣＤ４０＋腫瘍血管；（ｂ）腫瘍細胞上に発現された抗原に対する増加したレベルの自己抗体を分泌するような、腫瘍、脾臓およびリンパ節におけるＣＤ４０＋Ｂ細胞；（ｃ）共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示された腫瘍抗原に対する特異的ＣＴＬ応答を刺激するような、ＣＤ４０＋ＤＣおよびマクロファージへの結合を含むがこれらに限定されない様々な活性での使用に適している。さらに、本発明の抗体を、他の免疫増強剤（例えば、局所的または全身的なＩＬ－２、ＴＬＲ－７アゴニストおよび／または細胞傷害性化学療法など）と組み合わせると、強力な抗腫瘍ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答の発生を認めることができる。したがって、抗体は、新生物治療の分野における一般的な適用の新しい原理を提示し、提供する。
一形態では、本発明は、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖および（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含み、１または複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）は、以下：
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；
ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；または
ｄ）１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含む配列番号１～３のいずれか１つ
からなる群から選択される。
本発明の第１の形態の一実施形態では、本発明は、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖および（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含み、１または複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）は、以下：
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；または
（ｃ）１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含む配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列
からなる群から選択される。
本発明の第１の形態の一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７の重鎖可変領域を含む。
本発明の第１の形態の別の実施形態において、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、以下：
ａ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｂ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
ｃ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
からなる群から選択される１または複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含む。
第２の形態では、本発明は、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖および（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含み、１または複数のＣＤＲＬは、以下：
ａ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｂ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
ｃ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
ｄ）１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含む配列番号４～６のいずれか１つ
からなる群から選択される。
本発明の第２の形態の一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８の軽鎖可変領域を含む。
本発明の第２の形態の別の実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、以下：
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；または
ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択される１または複数のＣＤＲＨをさらに含む。
第３の形態では、本発明は、
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；
ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
を含む単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。
本発明の第３の形態の一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む。
本発明の上記形態の一実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、マウス抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディまたは一本鎖抗体分子である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型である。好ましくは、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１型である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、標識基にカップリングされる。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０活性を増強する。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子を含む。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を含む。
一実施形態では、本発明は、少なくとも１または複数の以下の機能を達成するのに少なくとも適した単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む：
ａ．Ｂ細胞による腫瘍細胞上に発現された抗原に対する自己抗体の分泌を促進すること；
ｂ．共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激すること；
ｃ．ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示の増加；
ｄ．ＭＨＣおよび免疫共刺激分子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣまたはＨＬＡ－ＤＲ）の発現を増強すること；
ｅ．炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γ）の産生の刺激；または
ｆ．Ｔ細胞活性化の誘導；
ｇ．ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替すること；
ｈ．腫瘍を有する対象におけるＴ細胞寛容を克服すること；
ｉ．効果的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発すること；
ｊ．抗腫瘍ワクチンの有効性を増強すること；または
ｋ．腫瘍脈管構造を免疫浸潤に対してより許容性にすること。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む医薬組成物である。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療群または化学療法群などの活性剤をさらに含むことができる。
別の形態では、本発明は、本明細書に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を作製する方法であって、該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を分泌する宿主細胞から該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を調製する工程を含む、方法にある。
さらに別の形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、本明細書に開示される治療有効量の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、該抗体を必要とする患者に投与する工程を含む、方法にある。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における抗原提示細胞を活性化する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法を含む。好ましくは、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８３から選択される。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において炎症促進性サイトカインの産生を刺激する方法を含む。好ましくは、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γのリストから選択される。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＴ細胞活性化を誘導する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において、腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＢ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法を含む。
腫瘍根絶に必要な事象の複雑な調整は、いくつかの状況では併用治療アプローチも有益であり得ることを示唆している。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗原を放出し、サイトカイン放出を促進し、免疫監視を増加させ、抑制ネットワークを減少させてこの効果を増強するための、追加のアームと共に使用することができる。
したがって、一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を１または複数の追加の免疫増強剤と一緒に含む医薬製剤を含む。そのような免疫増強剤には、ＩＬ－２、ＴＬＲ－７アゴニスト、または全身性細胞傷害性化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体および有効量の少なくとも第２の免疫増強剤を投与することを含む、方法を含む。
１つの治療選択肢は、腫瘍微小環境自体を変化させ、腫瘍がそれ自体の抗原性刺激源として作用することを促すことである。これは、抗ＣＤ４０抗体を有するＩＬ－２を腫瘍部位に導入することによって達成することができる。直接同時注射した場合、同時投与は、全身投与に関連する毒性を回避し、長期の保護記憶を維持しながら、より大きな腫瘍ならびに遠位腫瘍の退縮を首尾よく引き起こすことができる。ＩＬ－２およびＣＤ４０アゴニストの同時投与は、マクロファージ活性の増加およびＢ細胞活性化をもたらし得る。したがって、ＩＬ－２とＣＤ４０アゴニストとの組み合わせは、好中球優位の炎症応答に関連する退縮を伴う様々な癌に対して顕著な利益を示すことができる。
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を含む医薬組成物を含む。
一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象における抗原提示細胞を活性化する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。好ましくは、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８３から選択される。
一実施形態では、本発明は、対象において、炎症促進性サイトカインの産生を刺激する方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。好ましくは、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γのリストから選択される。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象においてＴ細胞活性化を誘導する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象においてＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象において、腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象においてＢ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法を含む。
患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための最も効果的な方法は、治療的介入が経時的に順次行われる併用治療アプローチを必要とし得る。
したがって、一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を追加の治療的介入と共に経時的に順次投与することを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、該追加の治療的介入は、外科手術、放射線療法、化学療法、温熱療法および免疫療法からなる群から選択される。
１つの治療選択肢は、患者から単離された細胞を改変し、次いでこれらの細胞を患者に戻すことである。これは、患者から単離された細胞を抗ＣＤ４０抗体で処理することによって達成することができる。抗ＣＤ４０抗体で処理された細胞は、追加の薬剤で処理され得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、腫瘍特異的ペプチド、腫瘍細胞溶解物、サイトカイン、アゴニストおよびマイトジェンからなる群より選択される。
したがって、一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で処理された細胞を投与することを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、該細胞は患者から単離されたものであり、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、骨髄系細胞、リンパ系細胞および造血幹細胞からなる群から選択される。
さらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の説明に記載されるか、または図面および以下のいくつかの非限定的な実施形態の以下の詳細な説明を検討することによって当業者に明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
本開示は、以下の図面を参照して、好ましい実施形態の以下の説明において詳細を提供する。
図１は、ヒト化アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の重鎖のヌクレオチド配列を示す。
図２は、ヒト化アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の軽鎖のヌクレオチド配列を示す。
図３は、抗体ＳＶＸ－３００１の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
図４は、抗体ＳＶＸ－３００１の軽鎖可変領域（ＶＬ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
図５は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣを産生するためにプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングされた抗体ＳＶＸ－３００１の重鎖をコードする合成遺伝子配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
図６は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣを産生するためにプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングされた抗体ＳＶＸ－３００１の軽鎖をコードする合成遺伝子配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
図７は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣのプラスミドマップを示す。
図８は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣのプラスミドマップを示す。
図９は、産生された抗体がＣＤ４０特異的ＩｇＧであったことを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
図１０は、ＣＤ４０を発現する細胞上のＳＶＸ－３００１の結合を検出するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１０は、ＣＤ４０を発現する細胞上のＳＶＸ－３００１の結合を検出するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１０は、ＣＤ４０を発現する細胞上のＳＶＸ－３００１の結合を検出するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１０は、ＣＤ４０を発現する細胞上のＳＶＸ－３００１の結合を検出するＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図１１は、ＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣにおける細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイの結果を示す。 図１１は、ＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣにおける細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイの結果を示す。 図１１は、ＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣにおける細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイの結果を示す。 図１１は、ＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣにおける細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイの結果を示す。 図１１は、ＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣにおける細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイの結果を示す。
図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。 図１２は、ＩＬ－２と共にまたは伴わずにＳＶＸ－３００１による刺激に応答したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生を検出するためのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイの結果を示す。
図１３は、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１３は、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１３は、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１３は、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１３は、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。 図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。 図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。 図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。 図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。 図１４は、いくつかの異なるＣＤ４０抗体に関するＳＶＸ－３００１のエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを示す。
図１５は、ＳＶＸ－３００１による単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１５は、ＳＶＸ－３００１による単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
図１６は、ＳＶＸ－３００１に対する単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の用量反応を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１６は、ＳＶＸ－３００１に対する単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の用量反応を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１６は、ＳＶＸ－３００１に対する単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の用量反応を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。 図１６は、ＳＶＸ－３００１に対する単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の用量反応を決定するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
図１７は、プラスミド２０ＡＣＧＪＱＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯを産生するためにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯにクローニングされた抗体ＳＶＸ－３００１の重鎖をコードする合成遺伝子配列のヌクレオチド配列を示す。
図１８は、プラスミド２０ＡＣＧＪＲＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯを産生するためにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯにクローニングされた抗体ＳＶＸ－３００１の軽鎖をコードする合成遺伝子配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
図１９は、２０ＡＣＧＪＱＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯのプラスミドマップを示す。
図２０は、２０ＡＣＧＪＲＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯのプラスミドマップを示す。配列表の簡単な説明
Figure 2023527916000001
Figure 2023527916000002
Figure 2023527916000003
Figure 2023527916000004
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させることができる単離されたアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体に関する。特定の実施形態では、抗体は、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法を提供する。それらはまた、炎症促進性サイトカインの産生を刺激し、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。それらは、ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替することによってこれを行う。これを行う際に、本明細書に記載される単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を改善することができ、効果的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し、および／または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強することができる。
便宜上、以下のセクションは、一般に、本明細書で使用される用語の様々な意味を概説する。この議論に続いて、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体に関する一般的な態様が議論され、続いて、抗体の様々な実施形態の特性およびそれらをどのように使用することができるかを示す具体例が議論される。
定義
本発明は、以下の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。この詳細な説明は、例示のみを目的としている。機能的に等価な生成物、組成物および方法は、本明細書に記載の本発明の範囲内である。この立場と一致して、当業者は、本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外の変形および修正を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変形および修正を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書で言及または指示される工程、特徴、組成物および化合物のすべてを個別にまたは集合的に、および、ありとあらゆる組み合わせまたは任意の２つまたはそれを超える工程または特徴を含む。
本出願では、特に明記しない限り、単数形の使用は複数形を含む。本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素および構成要素と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。また、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部（ｐａｒｔ）または部分全体を含むことができる。
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたは標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指し、例えば、キメラ抗体および二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含むが、いくつかの例では、より少ない鎖、例えば重鎖のみを含み得るラクダ科動物に天然に存在する抗体を含み得る。抗体は、単一の供給源のみに由来し得るか、または「キメラ」であり得、すなわち、以下にさらに記載されるように、抗体の異なる部分は２つの異なる抗体に由来し得る。抗体または結合断片は、ハイブリドーマ中で、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。別段示されない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片およびムテインを含み、その例を以下に記載する。さらに、明示的に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）、およびそれらの断片がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態では、この用語は、ペプチボディも包含する。
抗体重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに同様に細分される。完全長の軽鎖および重鎖内で、典型的には、可変領域および定常領域は、約１２個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０個のさらなるアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと（参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれる）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。
可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、これにより、特定のエピトープへの結合を可能にすることができる。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔの定義（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８－８８３（１９８９）に従う。
特定の実施形態では、抗体重鎖は、抗体軽鎖の非存在下でエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体軽鎖は、抗体重鎖の非存在下でエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体軽鎖の非存在下でエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体重鎖の非存在下でエピトープに結合する。特定の実施形態では、個々の可変領域は、他の可変領域の非存在下でエピトープに特異的に結合する。
特定の実施形態では、ＣＤＲの明確な描写および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明することおよび／または抗体－リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶学などの当業者に公知の様々な技術のいずれかによって達成することができる。特定の実施形態では、ＣＤＲ領域を同定または近似するために、様々な分析方法を使用することができる。そのような方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義および接触定義が含まれるが、これらに限定されない。
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は、典型的にはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に連続して番号付けされる。軽鎖中のＣＤＲ領域は、典型的にはＬ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に連続して番号付けされる。
「軽鎖」という用語は、完全長軽鎖、および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。
「重鎖」という用語は、完全長重鎖、および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む任意のアイソタイプであり得る。
二重特異性または二機能性抗体は、典型的には、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むがこれらに限定されない様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５－３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照のこと。
個々の免疫グロブリン鎖は、典型的には、それぞれが約９０～１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを有するいくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。ヒトでは、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４つの重鎖および４つの軽鎖を含み；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２つの重鎖および２つの軽鎖を含み；ＩｇＭアイソタイプは５つの重鎖と５つの軽鎖を含む。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能を担うことができる１または複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有し得る。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の軽鎖および／または重鎖の一部を指し、典型的には、重鎖のアミノ末端のおよそ１２０～１３０アミノ酸および軽鎖の約１００～１１０アミノ末端アミノ酸を含む。一定の実施形態では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえ、アミノ酸配列が大きく異なる。抗体の可変領域は、典型的には、その標的に対する特定の抗体の特異性を決定する。
「エピトープ」という用語は、抗体による結合またはＴ細胞受容体への結合が可能な任意の決定基を含む。エピトープは、抗体またはそのエピトープを標的とするＴ細胞受容体と係合する領域であり、エピトープがタンパク質の一部である場合、抗体またはＴ細胞受容体に直接接触する特異的アミノ酸を含む。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例では、核酸などの他の種類の分子上に存在することができる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的エピトープに特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中の標的上のエピトープを優先的に認識する。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。該修飾としては、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個またはそれ未満のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～６０塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０～４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
「単離された核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部に関連しないか、または自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの何らかの組み合わせを意味する。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加えて、最大１０個、さらには最大２０個の他のタンパク質またはその一部のコード配列を含み得るか、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含み得るか、および／またはベクター配列を含み得る。
別段の指定がない限り、本明細書で論じられる任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含むことができる。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子のための１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、それに作動可能に連結された１または複数の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）指示および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現構築物は、転写、翻訳に影響を及ぼすかまたは制御し、イントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれらの固有の機能を実行することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるように、それに連結される。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されているか、または形質転換することができ、それによって目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態または遺伝的構成が同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を含む。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」という用語は、特に指定されない限り、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方への言及を含む。
「免疫共刺激分子」という用語は、抗原またはＭＨＣとの相互作用後にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）からＴ細胞に提供される初期活性化シグナルを増幅または打ち消すように作用する細胞表面分子を含む。そのような分子の例としては、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。そのような技術を使用して、１または複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されている場合に形質転換されている。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入、または他の技術によって新しい遺伝物質を導入することによって、その天然の状態から遺伝子改変されて形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡと再結合することができ、または複製されずにエピソーム要素として一時的に維持されることができ、またはプラスミドとして独立して複製することができる。形質転換ＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、細胞は「安定に形質転換された」と考えられる。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然タンパク質、すなわち天然に存在する非組換え細胞によって産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味するか；または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１または複数のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含む。この用語はまた、１または複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、または抗原結合タンパク質の１または複数のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する配列を特に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長の天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片はまた、天然タンパク質と比較して修飾アミノ酸を含むことができる。特定の実施形態では、断片は約５～５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン、２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはその可変領域のみなどが含まれるが、これらに限定されない。
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、（４）自然界で関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然界で関連していないポリペプチドと（共有結合または非共有結合相互作用によって）作動可能に関連している、または（６）自然界では存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、そのような単離されたタンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的、研究または他の使用を妨げるであろうその自然環境で見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
「アミノ酸」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を含む。
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）の「バリアント」は、１または複数のアミノ酸残基が別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントには、融合タンパク質が含まれる。
「同一性」という用語は、配列をアライメントさせて比較することによって決定される、２つまたはそれを超えるポリペプチド分子または２つまたはそれを超える核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。アライメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが挙げられる。
同一性パーセントを計算する際、比較される配列は、典型的には、配列間の最大一致を与えるようにアライメントされる。同一性パーセントを決定するために使用され得るコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントするために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適なマッチングのためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン」）。ギャップオープニングペナルティ（平均対角の３倍として計算され、「平均対角」は、使用されている比較行列の対角線の平均であり；「対角」は、特定の比較行列によって各完全アミノ酸マッチに割り当てられたスコアまたは数である）、およびギャップ拡張ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較行列がアルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較行列（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照）もアルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定する際に使用することができるパラメータの例は以下の通りである：
ａ．アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３
ｂ．比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（前出）によるＢＬＯＳＵＭ ６２
ｃ．ギャップペナルティ：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ｄ．ギャップ長ペナルティ：４
ｅ．類似度の閾値：０
２つのアミノ酸配列をアライメントするための特定のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらし得、この小さいアライメントされた領域は、２つの完全長の配列間に有意な関係がない場合であっても非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望であれば、標的ポリペプチドの少なくとも５０個または他の数の連続するアミノ酸にわたるアライメントをもたらすように調整することができる。
本明細書で使用される場合、２０個の従来の（例えば、天然に存在する）アミノ酸およびそれらの略語は、従来の使用法に従う。任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば－、－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来のアミノ酸も、本発明のポリペプチドに適した構成要素であり得る。非従来のアミノ酸の例としては、４－ヒドロキシプロリン、－カルボキシグルタメート、－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、－Ｎ－メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な使用法および慣例に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、別段の指定がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は転写方向と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有しておりＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’末端であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有しておりＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’末端であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができ、これは典型的には、生物学的系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の反転形態または逆位形態が含まれる。
本明細書で引用されるすべての刊行物（特許、特許出願、雑誌記事、実験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの参考文献も、先行技術を構成するか、または本発明が関連する分野で働く者の共通の一般知識の一部であることは認められない。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる：
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｅ．鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。そのような置換残基は、例えば、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域に、または分子の非相同領域に導入することができる。
特定の実施形態によれば、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体に変更を加える際に、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられている。それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野で理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５－１３１（１９８２）．特定のアミノ酸は、類似のヒドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用することができ、依然として類似の生物学的活性を保持することができることが知られている。特定の実施形態では、ヒドロパシー指標に基づいて変更を行う際に、ヒドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。
同様のアミノ酸の置換は、特に、それによって作製された生物学的に機能性のタンパク質またはペプチドが、本事例のように免疫学的実施形態における使用を意図している場合、親水性に基づいて効果的に行うことができることも、当技術分野で理解されている。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
これらのアミノ酸残基には、以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）およびトリプトファン（－３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う際に、特定の実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域を「エピトープコア領域」ともいう。
例示的なアミノ酸置換を表２に示す。
Figure 2023527916000005
「誘導体」という用語は、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失、または置換以外の化学修飾を含む分子を指す。特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質、または他の有機もしくは無機部分との化学結合を含むがこれらに限定されない共有結合修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾された抗原結合タンパク質は、化学修飾されていない抗原結合タンパク質よりも大きい循環半減期を有することができる。特定の実施形態では、化学修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織および／または器官に対する改善された標的化能力を有し得る。いくつかの実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない１または複数の水溶性ポリマー付着物を含むように共有結合修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。特定の実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物系ポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにそのようなポリマーの混合物を含むがこれらに限定されない１または複数のポリマーを含む。
特定の実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合修飾される。特定の実施形態では、１または複数の水溶性ポリマーが、誘導体の１または複数の特定の位置、例えばアミノ末端に結合される。特定の実施形態では、１または複数の水溶性ポリマーは、誘導体の１または複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態では、ＰＥＧは、抗原結合タンパク質の治療能力を改善するために使用される。特定の実施形態では、ＰＥＧは、ヒト化抗体の治療能力を改善するために使用される。特定のそのような方法は、例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）（任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。そのような化合物は、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発されることが多い。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物を使用して、類似の治療効果または予防効果をもたらすことができる。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などのパラダイムなポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法によって、－－ＣＨ２ＮＨ－－、－－ＣＨ２Ｓ－－、－－ＣＨ２－ＣＨ２－－、－－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－－ＣＯＣＨ２－－、－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－－、および－－ＣＨ２ＳＯ－－から選択される結合によって必要に応じて置換された１または複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１または複数のアミノ酸の同じタイプのＤ－アミノ酸による体系的な置換（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）を、より安定なペプチドを生成するために特定の実施形態で使用することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドは、当技術分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７（１９９２）、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）によって；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって生成することができる。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的材料に関連して本明細書全体を通して使用される「天然に存在する」という用語は、天然に見出される材料または天然に見出される材料の形態を指す。
「アゴニスト」という用語は、受容体と組み合わせて細胞応答を生成することができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであり得る。あるいは、アゴニストは、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、または（ｂ）他の化合物が受容体に直接結合するように別の化合物の修飾を別の方法で生じさせるによって、受容体と間接的に結合し得る。アゴニストは、特定の受容体または受容体ファミリーのアゴニスト（例えば、ＴＮＦまたはＴＮＦＲアゴニスト）と呼ばれることがある。
抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）抗体の「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、依然としてＣＤ４０のアゴニストとして特異的に機能することができる抗体の一部（その部分がどのようにして得られるかまたは合成されるかにかかわらず）を含む抗体の種である。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、またはインタクトな抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、ダイアボディ（同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された、軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および一本鎖抗体が挙げられ、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギを含む任意の哺乳動物源に由来し得る。本明細書中に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の機能的部分、例えば、１または複数のＣＤＲを、第２のタンパク質または小分子に共有結合させて、体内の特定の標的に対する、二機能性の治療特性を有する、または長い血清半減期を有する治療剤を作製することができるとさらに考えられる。当業者によって理解されるように、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、非タンパク質成分を含むことができる。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）、およびそれらの断片をそれぞれ含むがこれらに限定されない抗体に基づく。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つまたはそれを超えるジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も包含する１つの重鎖の一部とを含み、したがって、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「一本鎖抗体」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが柔軟なリンカーによって連結されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成しているＦｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号に詳細に論じられており、これらの開示は参照により組み込まれる。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つまたはそれを超えるＶＨ領域をペプチドリンカーと共有結合させて、二価ドメイン抗体を作製する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的とすることができる。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、記載された分子種が存在する優勢な種であること、すなわちモル基準で、同じ混合物中の他のいかなる個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、対象種が、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モル基準）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を構成する。他の実施形態では、対象種は本質的な均一性まで精製され、汚染種は従来の検出方法によって組成物中で検出することができず、したがって組成物は単一の検出可能な高分子種からなる。
「薬剤」という用語は、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を示すために使用される。
本明細書で使用される場合、「標識」または「標識された」という用語は、例えば放射性標識アミノ酸の組み込みまたはマーキングされたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン部分のポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の実施形態において、標識またはマーカーはまた、治療的であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。特定の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられる。
「治療有効量」という用語は、哺乳動物（好ましくはヒト）において治療応答を生じると決定されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の量を指す。そのような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。
本明細書で使用される「医薬品組成物」（または薬剤もしくは薬物）という用語は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化学化合物、組成物、薬剤または薬物を指す。それは、必ずしも１種類よりも多くの成分を必要とするものではない。
本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数群を含むが、任意の他の整数または整数群を除外しないことを意味すると理解される。
本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出され、全体を通して適用され得る。他に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載の発明は、１または複数の値の範囲（例えば、サイズ、変位および電界強度など）を含むことができる。値の範囲は、範囲を定義する値、および範囲への境界を定義する値に直接隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値を含む、範囲内のすべての値を含むと理解される。例えば、当業者は、範囲の上限または下限の１０％の変動が完全に適切であり得、本発明に包含されることを理解するであろう。より具体的には、範囲の上限または下限の変動は５％または当技術分野で一般的に認識されているようにいずれか大きい方である。
本明細書を通して、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という単語などの相対語が使用される。この文言は、指定された数または範囲に対して少なくとも１０％の変動性を組み込むことを求める。その変動は、指定された特定の数のプラス１０％またはマイナス１０％であり得る。
実施形態
Ａ．アゴニスト抗ＣＤ４０抗体
本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、有効量で投与された場合、以下の少なくとも１または複数の機能を調節することができる：
ａ．ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示の増加；または
ｂ．ＭＨＣおよび免疫共刺激分子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣまたはＨＬＡ－ＤＲ）の発現を増強すること；または
ｃ．炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γ）の産生の刺激；または
ｄ．Ｔ細胞活性化の誘導；または
ｅ．ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替すること；または
ｆ．腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を克服すること；または
ｇ．効果的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発すること；または
ｈ．抗腫瘍ワクチンの有効性を増強すること；または
ｉ．腫瘍脈管構造を免疫浸潤に対してより許容性にすること。
いくつかの実施形態では、提供されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、本明細書に記載の１または複数のＣＤＲを含むポリペプチドである。いくつかのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体では、ＣＤＲは「フレームワーク」領域に埋め込まれ、ＣＤＲの適切な結合特性が達成されるようにＣＤＲを配向させる。
本明細書中に開示される本発明の抗体は様々な有用性を有する。それらは、本明細書で説明するように、様々な治療用途に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩＬ－２などの他の薬剤と共に投与された場合を含むがこれに限定されない悪性症状を処置するのに有用である。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の他の用途としては、例えば、疾患の状態または症状の診断、およびＣＤ４０の有無を判定するためのスクリーニングアッセイが挙げられる。本明細書中に記載されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体のいくつかはまた、抗原提示の増加に伴う結果、症候および／または病理の処置においても有用である。
一形態では、本発明は、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖および（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含み、１または複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）は、以下：
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；または
ｃ）１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含む配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、提供されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１または複数のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、（ａ）ポリペプチド構造と、（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または連結された１または複数のＣＤＲとを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとることができる。例えば、天然に存在する抗体のフレームワークまたはその断片もしくはバリアントであり得るか、もしくはそれらを含み得るか、または本質的に完全に合成であり得る。様々なポリペプチド構造の例を以下にさらに記載する。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）、およびそれぞれの部分または断片を含むがこれらに限定されない抗体であるかまたは抗体に由来する。いくつかの例では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ）である。様々な構造は、本明細書でさらに説明および定義される。
本発明の第１の形態の一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、
ａ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
ｂ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｃ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
ｄ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
をさらに含む。
本発明の第１の形態のさらなる実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、
Ａ：
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；または
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；および
Ｂ：
ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
を含む。
本発明の第１の形態の別の実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、
ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；
ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
を含む。
本発明の第１の形態の別の実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７の重鎖可変領域を含む。本発明の第１の形態のさらなる実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８の軽鎖可変領域を含む。本発明の第１の形態のさらなる実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む。
配列番号７は、配列番号１、配列番号２および配列番号３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む。配列番号８は、配列番号４、配列番号５および配列番号６のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む抗体は、ＳＶＸ－３００１として公知である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはそれらの抗体断片である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディまたは一本鎖抗体分子である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ヒト化抗ヒト抗体である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型である。好ましくは、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１型である。
特に好ましい実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１９の重鎖配列および／または配列番号２０の軽鎖配列を含む。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、標識基にカップリングされる。
提供される他の抗体は、配列番号７および８に示される可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせまたはサブ部分によって形成される上記のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体のバリアントであり、それぞれが配列番号７および８における配列のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５０～６０、６０～７０、７０～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～９９％、または９９％を超える同一性を有する可変軽鎖および／または可変重鎖を含む（配列全体または配列のサブ部分のいずれか、例えば１または複数のＣＤＲ）。いくつかの例では、そのような抗体は少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含むが、他の例では、バリアントは２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖（またはそのサブ部分）を含む。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１～３および４～６の配列の少なくとも１つにおいて、ＣＤＲ由来の１または複数のＣＤＲと少なくとも９０％、９０～９５％および／または９５～９９％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ（それぞれが、上記の配列と少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である）が存在する。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号２０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、配列番号２０と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一実施形態では、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０活性を増強する。
Ｂ．アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の製造
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を作製する方法であって、該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を分泌する宿主細胞から該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を調製する工程を含む、方法を含む。
一般に、ＣＤ４０に対する完全なモノクローナルアゴニスト抗体は、以下のようにして製造することができる。免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスを目的のＣＤ４０で免疫すると、抗体を発現するマウス由来のリンパ球（Ｂ細胞など）が得られる。そのような回収された細胞を骨髄系細胞株と融合させて不死性ハイブリドーマ細胞株を調製し、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。特定の実施形態では、ＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の産生が提供される。
特定の実施形態では、ファージディスプレイ技術を使用してモノクローナル抗体を作製する。特定の実施形態では、そのような技術はモノクローナル抗体を産生する。特定の実施形態では、単一のＦａｂまたはＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドがファージ粒子の表面に発現される。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１（１９９１）；米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこと。特定の実施形態では、ファージを「スクリーニング」して、標的に対して親和性を有する抗体断片を同定する。したがって、特定のそのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体断片レパートリーのディスプレイによる免疫選択、およびその後の標的への結合によるファージの選択を模倣する。特定のそのような手順では、高親和性機能性抗体断片が単離される。特定のそのような実施形態では、抗体遺伝子の完全なレパートリーは、末梢血リンパ球から天然に再編成されたＶ遺伝子をクローニングすることによって作製される。例えば、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８７：８０９５－８０９９（１９９０）を参照のこと。
特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、挿入されたゲノムを産生する抗体のかなりの部分を有するが、内因性マウス抗体の産生が不足しているトランスジェニックマウスの利用によって調製される。そのようなマウスは、免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生が欠損している。この結果を達成するために利用される技術は、本明細書に開示されている特許、出願および参考文献に開示されている。特定の実施形態では、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ ９８／２４８９３またはＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７）に開示されているような方法を使用することができ、これらは任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、ＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体は、脾細胞（Ｂ細胞またはＴ細胞）をインビトロで抗原に曝露し、次いで、その曝露された細胞を、免疫無防備状態のマウス、例えば ＳＣＩＤまたはｎｏｄ／ＳＣＩＤにおいて再構成させることによって産生される。例えば、Ｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１－２０５８（１９９８）；Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：１０３－１０６（２０００）を参照のこと。特定のこのようなアプローチでは、ＳＣＩＤマウスへの胎児組織の生着（ＳＣＩＤ－ｈｕ）は、長期の造血およびヒトＴ細胞発生をもたらす。例えば、ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１５３２－１６３９（１９８８）；Ｉｆｖｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２４３－２４８（１９９６）を参照のこと。特定の例では、そのようなキメラマウスにおける体液性免疫応答は、動物におけるＴ細胞の共発生に依存する。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８３：１２７１－１７９（１９９４）を参照のこと。特定のアプローチでは、末梢血リンパ球をＳＣＩＤマウスに移植する。例えば、Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２５６－２５９（１９８８）を参照のこと。特定のこのような実施形態では、このような移植細胞を、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）などのプライミング剤のいずれかで処理すると、より高いレベルのＢ細胞産生が検出される。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：２２４－２３０（１９９５）；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：１９４６－１９５３（１９９５）を参照のこと。
理解されるように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現され得る。特定の抗体をコードする配列を使用して、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）にパッケージングし、ウイルス（またはベクター）を宿主細胞に形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によるか、または米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号（これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）によって例示されるような当技術分野で公知のトランスフェクション手順によるものであり得る。使用される形質転換の手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられ、これらには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞およびいくつかの他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。どの細胞株が高い発現レベルを有し、ＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体を産生するかを決定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。
特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭアイソタイプの少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトカッパ軽鎖および／またはヒト重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭアイソタイプの重鎖である。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローン化されている。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭアイソタイプの定常領域のいずれか以外の定常領域を含む。
特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ重鎖を含む。他の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ重鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの定常領域でもＩｇＧ４アイソタイプの定常領域でもない定常領域に連結された抗体の可変領域を含む。好ましくは、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖および軽鎖を含む。特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローン化されている。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される少なくとも１つのハイブリドーマ株の由来する抗体の重鎖および軽鎖に対する保存的修飾は、ハイブリドーマ株に由来する抗体と類似する機能的特徴および化学的特徴を有するアゴニストＣＤ４０抗体を産生する。対照的に、特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体の機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）置換の領域における分子骨格の構造、例えば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないように、ネイティブアミノ酸残基を非ネイティブ残基で置換することを含み得る。さらに、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。
所望のアミノ酸置換は（保存的であろうと非保存的であろうと）、そのような置換が所望される時点で当業者によって決定され得る。特定の実施形態では、アミノ酸置換を使用して、アゴニストＣＤ４０抗体の重要な残基を同定するか、または本明細書に記載のアゴニストＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を増加もしくは減少させることができる。
特定の実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、１または複数のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、様々な発現ベクター／宿主系のいずれかを利用して、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させることができる。そのような系には、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトした、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドは、酵母において組換え発現される。特定のこのような実施形態は、市販の発現系、例えば、ピキア発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を製造者の説明書に従って使用する。特定の実施形態において、そのような系は、分泌を指令するためのプレ－プロ－アルファ配列に依存する。特定の実施形態では、インサートの転写は、メタノールによる誘導時にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含む分泌ポリペプチドを酵母増殖培地から精製する。特定の実施形態では、酵母増殖培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌および哺乳動物細胞の上清からポリペプチドを精製するために使用される方法と同じである。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドをコードする核酸を、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのバキュロウイルス発現ベクターにクローニングする。特定の実施形態では、そのようなベクターを製造者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の指示に従って使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞をｓＦ９タンパク質非含有培地中で感染させ、組換えポリペプチドを産生することができる。特定の実施形態では、ヘパリン－セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、かかる培地からポリペプチドを精製および濃縮する。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドは、昆虫系において発現される。ポリペプチド発現のための特定の昆虫系は、当業者に周知である。そのような系の１つでは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。特定の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸分子を、ウイルスの非必須遺伝子、例えばポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子のプロモーターの制御下に置くことができる。特定の実施形態では、核酸分子の挿入が成功すると、非必須遺伝子は不活性になる。特定の実施形態では、その不活性化は、検出可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活性化は、コートタンパク質を欠くウイルスの産生をもたらす。
特定の実施形態では、組換えウイルスを使用して、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させることができる。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９１：３２２４－７（１９９４）を参照のこと。
特定の実施形態では、細菌細胞内で作製された１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドは、細菌内の不溶性封入体として産生される。特定の実施形態では、そのような封入体を含む宿主細胞は、遠心分離によって回収され；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で洗浄され；０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で室温にて１５分間処理される。特定の実施形態では、溶解物を超音波処理によって清澄化し、細胞デブリを１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。特定の実施形態では、ポリペプチド含有ペレットは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）および１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁され；５０％グリセロール上に層化され；６０００×ｇで３０分間遠心分離される。特定の実施形態では、そのペレットを、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁することができる。特定の実施形態では、ポリペプチドを、再懸濁したペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）に分画することによってさらに精製する。特定の実施形態では、そのようなゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸漬してタンパク質を可視化することができ、これを切り出し、ＳＤＳを欠くゲルランニングバッファーで電気溶出することができる。特定の実施形態によれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、可溶性タンパク質として細菌において産生される。特定の実施形態では、そのようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製される。
特定の実施形態では、特定のポリペプチド、例えば、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドを「リフォールディング」することが望ましい。特定の実施形態では、そのようなポリペプチドは、本明細書中で論じられるある特定の組換え系を使用して産生される。特定の実施形態では、ポリペプチドを「リフォールディング」および／または酸化して、所望の三次構造を形成し、および／またはジスルフィド結合を生成する。特定の実施形態では、そのような構造および／または連結は、ポリペプチドのある特定の生物学的活性に関連する。特定の実施形態では、リフォールディングは、当技術分野で公知のいくつかの手順のいずれかを使用して達成される。例示的な方法は、限定されないが、カオトロピック剤の存在下で可溶化されたポリペプチド剤を典型的には７を超えるｐＨに曝露することを含む。例示的なカオトロピック剤はグアニジンである。特定の実施形態では、リフォールディング／酸化溶液は、還元剤およびその還元剤の酸化形態も含む。特定の実施形態では、還元剤およびその酸化型は、ジスルフィドシャッフリングが起こることを可能にする特定の酸化還元電位を生成する比で存在する。特定の実施形態において、そのようなシャッフリングは、システイン架橋の形成を可能にする。例示的なレドックス対としては、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２－メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ－ｂＭＥが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、共溶媒が、リフォールディングの効率を高めるために使用される。例示的な共溶媒としては、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドを実質的に精製する。特定のタンパク質精製技術は、当業者に公知である。特定の実施形態では、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からのポリペプチド画分の粗分画を含む。特定の実施形態では、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術を使用してポリペプチドを精製する。例示的な精製方法としては、限定されないが、硫酸アンモニウムによる沈殿；ＰＥＧによる沈殿；免疫沈降；熱変性後の遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ－セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されないクロマトグラフィー；ゲル濾過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；およびそのような技術と他の技術との組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。特定の実施形態では、精製工程を変更することができ、または特定の工程を省略することができ、それでもなお実質的に精製されたポリペプチドを調製するための適切な方法をもたらす。
特定の実施形態では、ポリペプチド調製物の精製度を定量する。精製度を定量するための特定の方法は、当業者に公知である。特定の例示的な方法には、調製物の特異的結合活性を決定すること、およびＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの量を評価することが含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製量を評価するための特定の例示的な方法は、調製物の結合活性を計算すること、およびそれを初期抽出物の結合活性と比較することを含む。特定の実施形態では、そのような計算の結果は、「精製倍率」として表される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施される特定のアッセイに依存する。
特定の実施形態では、１または複数のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体成分またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体自体を含むポリペプチドは、部分的に精製される。特定の実施形態では、部分精製は、より少ない精製工程を使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって達成することができる。例えば、特定の実施形態では、ＨＰＬＣ装置を利用して行われるカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも大きな「精製倍率」をもたらす。特定の実施形態では、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの全回収率またはポリペプチドの結合活性の維持において利点を有し得る。
特定の場合において、ポリペプチドの電気泳動による移動は、異なる条件のＳＤＳ／ＰＡＧＥで、時には有意に変化し得る。例えば、Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）を参照のこと。異なる電気泳動条件下では、精製または部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得ることが理解されよう。
Ｃ．アゴニスト抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子を含む。
当業者は、上記の議論が、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を同定、評価および／または作製するために、ならびにそれらの抗体をコードし得る核酸配列のためにも使用され得ることを理解するであろう。したがって、それらの抗体をコードする核酸配列が企図される。例えば、抗体は、配列番号９もしくは１０に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号９もしくは１０の核酸配列によってコードされるＣＤＲの少なくとも１～６個（およびそれらの様々な組み合わせ）と少なくとも８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～９７、９７～９９％またはそれを超える同一性を有することができる。
いくつかの実施形態では、抗体（またはそれをコードする核酸配列）は、特定の抗体をコードする核酸配列（または核酸配列自体）がストリンジェントな条件下で配列番号７および８のタンパク質をコードする核酸配列のいずれかに選択的にハイブリダイズすることができる場合、本発明内で企図される。１つの実施形態において、適切な中程度にストリンジェントな条件には、５ＸＳＳＣ；０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８：０）の溶液における予備洗浄；５０°Ｃ、－６５°Ｃ、５ｘＳＳＣで一晩、または異種間相同性の場合、４５°Ｃ、０．５ｘＳＳＣでのハイブリダイズ；その後、０．１％ ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれで、６５°Ｃで２０分間、２回洗浄が含まれる。そのようなハイブリダイズするＤＮＡ配列もまた、コード縮重のために、ハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる抗体ポリペプチドおよびこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同様に、本発明の範囲内である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲのバリアントは、上記の配列内の１または複数のＣＤＲハイブリダイズする核酸配列およびそれらの配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
この文脈において言及される「選択的にハイブリダイズする」という語句は、検出可能かつ選択的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的核酸に対する検出可能な結合の認識可能な量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を使用して、当該分野で公知であり、本明細書で論じられるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および断片と目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の相同性の増加が好ましい。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合、相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大マッチングのために整列された場合、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（マッチングされる２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、マッチングを最大化する際に許容され；ギャップ長は５またはそれ未満が好ましく、２またはそれ未満がより好ましい。代替的および好ましくは、２つのタンパク質配列（またはそれらに由来する少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）は、それらが、突然変異データマトリクスおよび６またはそれを超えるギャップペナルティを伴うプログラムＡＬＩＧＮを使用して（標準偏差単位で）５を超えるアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書で使用されるように相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１－１１０（第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻に対する補足２の１～１０頁を参照のこと。２つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適にアラインメントされたときに５０％以上同一である場合、より好ましくは相同である。「対応する」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相同（すなわち、進化的に厳密に関連するのではなく、同一であること）であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。対照的に、「相補的」という用語は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味するために本明細書で使用される。説明のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を含む。
Ｄ．少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む組成物を含む。好ましくは、組成物は医薬組成物である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物を含む。
代替の実施形態では、本発明は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体と、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤とを、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。
組成物が少なくとも１つの追加の治療剤を含む場合、薬剤は、好ましくは、放射性同位体、放射性核種、毒素、または治療群および化学療法群からなる群から選択される。したがって、好ましい形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を少なくとも第２の免疫増強剤と一緒に含む医薬製剤を含む。薬剤としては、限定されないが、インビトロで合成的に調製された化学組成物、抗体、抗原結合領域、ならびにそれらの組み合わせおよびコンジュゲートが挙げられる。特定の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターまたは毒素として作用し得る。特定の実施形態では、薬剤は、その標的を阻害または刺激し、それにより、悪性腫瘍に対する免疫応答を促進するように作用し得る。そのような免疫増強剤には、ＩＬ－２、ＴＬＲ－７アゴニスト、または全身性細胞傷害性化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、許容され得る製剤材料は、好ましくは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。いくつかの実施形態では、製剤材料は、ｓ．ｃ．および／または腫瘍内投与用である。特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着または浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含むことができる。特定の実施形態では、適切な製剤材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌剤；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）；増量剤（マンニトール、グリシン等）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニクス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；等張化剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）。いくつかの実施形態では、製剤はＰＢＳ；２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ；および／または１０ｍＭ ＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。
特定の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体および／または治療分子は、当技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。そのようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、ＡＢＰのグリコシル化）およびデキストランが含まれるが、これらに限定されない。そのようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号、現在は米国特許第６，６６０，８４３号、および公開されているＰＣＴ出願番号ＷＯ ９９／２５０４４に記載されており、これらは任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式および所望の投与量に応じて当業者によって決定される。例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
特定の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、特定の実施形態では、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物に一般的な他の材料が補充されていてもよい。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。特定の実施形態では、血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水または生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これはソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含むことができる。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することによって、貯蔵のために調製することができる。さらに、特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。そのような薬学的に許容され得る組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。
特定の実施形態では、製剤成分は、投与部位に許容され得る濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持する。
特定の実施形態では、非経口投与（好ましくは腫瘍内投与または腫瘍周囲投与）が企図される場合、治療組成物は、追加の治療剤の有無にかかわらず、薬学的に許容され得るビヒクル中に所望のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含むパイロジェンフリーの非経口的に許容され得る水溶液の形態であり得る。特定の実施形態では、非経口注射用のビヒクルは、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体が適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化された滅菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、生成物の制御放出または持続放出を提供することができる、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤での所望の分子の製剤化を含むことができ、その結果、デポー注射を介して送達することができる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物中に、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、有効量のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含むことができる。特定の実施形態では、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液を単位用量形態で調製することができる。特定の実施形態では、適切な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；または、デンプン、ゼラチンもしくはアカシアなどの結合剤；または、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。
持続送達製剤または制御送達製剤における、少なくとも１つの追加の治療剤を伴うまたは伴わない、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む製剤を含む追加の医薬組成物は、当業者には明らかであろう。特定の実施形態では、リポソーム単体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射などの様々な他の持続または制御された送達手段を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ ９３／００８２９を参照されたい。特定の実施形態では、持続放出調製物は、成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９およびＥＰ ０５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７－５５６（１９８３））、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が含まれ得る。特定の実施形態では、持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含むことができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８－３６９２（１９８５）；ＥＰ ０３６，６７６；ＥＰ ０８８，０４６およびＥＰ １４３，９４９を参照のこと。
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には無菌である。特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかで行うことができる。特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
特定の実施形態では、単回投与単位を生産するためのキットが提供される。特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。特定の実施形態では、単室および多室のプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
特定の実施形態では、治療的に使用される、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む有効量の医薬組成物は、例えば、治療の状況および目的に依存する。したがって、処置のための適切な投薬量レベルは、特定の実施形態によれば、送達される分子、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらずアゴニスト抗ＣＤ４０抗体が使用される適応症、投与経路、ならびに対象の大きさ（体重、体表面腫瘍サイズまたは器官サイズ）および／または条件（年齢および全般的な健康状態）に部分的に依存して変化するであろうことが当業者には理解されよう。特定の実施形態では、臨床医は、投与量を滴定し、投与経路を変更して、最適な治療効果を得ることができる。特定の実施形態では、典型的な投与量は、上記の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれを超える範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、有効用量は、好ましくは２０μｇ／ｋｇ～２００μｇ／ｋｇである。したがって、患者が６回の用量を受ける場合、２週間にわたる対応する総用量は１２０μｇ／ｋｇ～１．２ｍｇ／ｋｇである。
特定の実施形態では、投与頻度は、使用される製剤中のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体および／または任意の追加の治療剤の薬物動態パラメータを考慮に入れる。特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。したがって、特定の実施形態では、組成物は、単回用量として、または経時的に２回またはそれを超える用量（所望の分子を同量含有してもしなくてもよい）として、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として投与することができる。適切な投与量のさらなる改良は、当業者によって日常的に行われ、当業者によって日常的に行われる作業の範囲内である。特定の実施形態では、適切な用量は、適切な用量反応データの使用によって確認することができる。
特定の実施形態では、医薬組成物の投与経路は、既知の方法に従う。好ましくは腫瘍内注射または腫瘍周囲注射によるが、組成物が部位特異的送達のために製剤化される場合、他の投与経路が適切であり得る。そのような投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、動脈内、門脈内、または病巣内経路；持続放出システムによるもの、または移植デバイスによるものが含まれ得る。特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または埋め込みデバイスによって投与することができる。
特定の実施形態では、組成物は、所望の分子が吸収または封入された膜、スポンジまたは別の適切な材料の埋め込みを介して局所的に投与することができる。特定の実施形態では、埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与によることができる。
Ｅ．症状を処置または予防するための方法
一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における抗原提示細胞を活性化する方法を含む。
対象における抗原提示細胞の活性化は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象由来の活性化された抗原提示細胞による抗原提示は、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）に以前曝露されたヒトドナー由来のＰＢＭＣにアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でＥＢＶ抗原を用いてチャレンジするウイルス抗原リコールアッセイを用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における樹状細胞を活性化する方法を含む。
対象における樹状細胞の活性化は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象からの活性化樹状細胞によるＴ細胞の刺激は、混合リンパ球反応を用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法を含む。好ましくは、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８３から選択される。
対象におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象からの細胞におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現は、蛍光活性化細胞選別アッセイを使用して測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくともアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において炎症促進性サイトカインの産生を刺激する方法を含む。好ましくは、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γから選択される。
対象における炎症促進性サイトカインの発現は、当該分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象由来の細胞における炎症促進性サイトカインの発現は、ＥＬＩＳＡまたはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイを用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＴ細胞活性化を誘導する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において、腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象においてＢ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法を含む。
腫瘍根絶に必要な事象の複雑な調整は、いくつかの状況では併用治療アプローチも有益であり得ることを示唆している。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗原を放出し、サイトカイン放出を促進し、免疫監視を増加させ、抑制ネットワークを減少させてこの効果を増強するための、追加のアームと共に投与することができる。
別の実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体および有効量の少なくとも第２の免疫増強剤を投与することを含む、方法を含む。
ＩＬ－２とＣＤ４０アゴニストの同時投与
１つの治療選択肢は、腫瘍微小環境自体を変化させ、腫瘍がそれ自体の抗原性刺激源として作用することを促すことである。これは、抗ＣＤ４０抗体を有するＩＬ－２を腫瘍部位内またはその付近に導入することによって達成することができる。直接同時注射した場合、同時投与は、全身投与に関連する毒性を回避し、長期の保護記憶を維持しながら、より大きな腫瘍ならびに遠位腫瘍の退縮を首尾よく引き起こす。ＩＬ－２およびＣＤ４０アゴニストの同時投与は、マクロファージ活性の増加ならびにＴ細胞およびＢ細胞の活性化をもたらし得る。ＩＬ－２とＣＤ４０アゴニストとの組み合わせは、好中球およびＴ細胞共優位の炎症応答に関連する退縮を伴う様々な癌に対して顕著な利益を示すことができる。
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を含む医薬組成物を含む。
一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象における抗原提示細胞を活性化する方法を含む。
対象における抗原提示細胞の活性化は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象由来の活性化された抗原提示細胞による抗原提示は、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）に以前曝露されたヒトドナー由来のＰＢＭＣにアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でＥＢＶ抗原を用いてチャレンジするウイルス抗原リコールアッセイを用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象における樹状細胞を活性化する方法を含む。
対象における樹状細胞の活性化は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象からの活性化樹状細胞によるＴ細胞の刺激は、混合リンパ球反応を用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。好ましくは、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８３から選択される。
対象におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現は、当技術分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象からの細胞におけるＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現は、蛍光活性化細胞選別アッセイを使用して測定され得る。
一実施形態では、本発明は、対象において、炎症促進性サイトカインの産生を刺激する方法であって、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法を含む。好ましくは、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３およびＩＦＮ－γから選択される。
対象における炎症促進性サイトカインの発現は、当該分野で公知のアッセイによって測定することができる。例えば、対象由来の細胞における炎症促進性サイトカインの発現は、ＥＬＩＳＡまたはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイを用いて測定され得る。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象においてＴ細胞活性化を誘導する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象においてＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、対象において、腫瘍を有する動物におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象においてＢ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量の本明細書に開示されるアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法を含む。
患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための最も効果的な方法は、治療的介入が経時的に順次行われる併用治療アプローチを必要とし得る。
したがって、一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を追加の治療的介入と共に経時的に順次投与することを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、該追加の治療的介入は、外科手術、放射線療法、化学療法、温熱療法および免疫療法からなる群から選択される。
１つの治療選択肢は、患者から単離された細胞を改変し、次いでこれらの細胞を患者に戻すことである。これは、患者から単離された細胞を抗ＣＤ４０抗体で処理することによって達成することができる。抗ＣＤ４０抗体で処理された細胞は、追加の薬剤で処理され得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、腫瘍特異的ペプチド、腫瘍細胞溶解物、サイトカイン、アゴニストおよびマイトジェンからなる群より選択される。
したがって、一実施形態では、本発明は、患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示される少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で処理された細胞を投与することを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、該細胞は患者から単離されたものであり、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、骨髄系細胞、リンパ系細胞および造血幹細胞からなる群から選択される。
本発明のさらなる特徴は、以下の実施例においてより完全に説明される。しかしながら、この詳細な説明は、単に本発明を例示する目的で含まれており、上記の本発明の広範な説明に対する制限として決して理解されるべきではないことを理解されたい。
実施例１－ＳＶＸ－３００１抗体の産生
配列データ
ヒト化アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の重鎖（配列番号１３、図１）およびヒト化アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の軽鎖（配列番号１４、図２）のヌクレオチド配列は、Ｎｏｒｔｈ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手した。図１および図２では、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を太字で示し、重鎖および軽鎖のコード配列に下線を引いている。ヒト化アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体をＳＶＸ－３００１と命名した。相補性決定領域のアミノ酸配列；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とともに、ＳＶＸ－３００１の重鎖可変領域（配列番号９および配列番号７、図３）およびＳＶＸ－３００１の軽鎖可変領域（配列番号１０および配列番号８、図４）のコード配列およびアミノ酸配列を同定した。図３および図４では、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）のアミノ酸配列を太字で示す。
遺伝子合成およびクローニング
クローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を有するＳＶＸ－３００１の重鎖（配列番号１５、図５）およびＳＶＸ－３００１の軽鎖（配列番号１７、図６）をコードするＤＮＡ配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＨＫによって合成し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングして、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ（図７）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ（図８）をそれぞれ生成した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＨＫは、ＴＥバッファー中、１００μｇの各プラスミド、トランスフェクショングレード（≧９０％のスーパーコイル状、≦０．０１ ＥＵ／ｕｇのエンドトキシン）を供給した。図５および図６では、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を太字で示し、コード配列に下線を引いている。重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列をプレーンテキストで示し、シグナルペプチド配列を太字で示し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域／ヒトκ軽鎖定常領域に下線を引いている。
ＳＶＸ－３００１抗体含有上清の産生
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中４ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。培地をトランスフェクションの３時間前に除去し、１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ＋１％ ＦＣＳと交換した。３００μｌのＤＭＥＭ（添加剤なし）を含む滅菌チューブに１．５μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ ＤＮＡおよび１．５μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ ＤＮＡを添加した後、６μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、２５ｋＤ、線状（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１μｇ／ｍｌで添加し、ボルテックスによって混合することによって、トランスフェクションミックスを作製した。トランスフェクションミックスを室温で１０分間インキュベートした後、細胞に添加した。細胞を３７°Ｃで３時間インキュベートした後、１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを添加した。次いで、細胞を５％ ＣＯ２で３７°Ｃの培養に戻した。
一過性トランスフェクト細胞からのＳＶＸ－３００１抗体含有上清を、トランスフェクションの１８時間後およびトランスフェクションの２日後に収集し、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳと交換した。トランスフェクション後７日目に培養上清を最終的に回収した。すべての培養上清を遠心分離して細胞デブリを除去し、４°Ｃで保存した。
精製ＳＶＸ－３００１抗体の産生
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％ ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中４ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。培地をトランスフェクションの３時間前に除去し、１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ＋１％ ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＣＳと交換した。３００μｌのＤＭＥＭ（添加剤なし）を含む滅菌チューブに１．５μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣおよび１．５μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣを添加した後、６μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、２５ｋＤ、線状（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１μｇ／ｍｌで添加し、ボルテックスによって混合することによって、トランスフェクションミックスを作製した。トランスフェクションミックスを室温で１０分間インキュベートした後、細胞に添加した。細胞を３７°Ｃで３時間インキュベートした後、１．５ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ＋１０％ ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＣＳを添加した。次いで、細胞を５％ ＣＯ２で３７°Ｃの培養に戻した。
一過性トランスフェクト細胞からのＳＶＸ－３００１抗体含有上清を、トランスフェクションの２日後およびトランスフェクションの５日後に収集し、ＤＭＥＭ＋１０％ ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＣＳと交換した。トランスフェクション後７日目に培養上清を最終的に回収した。異なる時点からの培養上清をプールし、０．２２μｍフィルターに通して濾過し、４°Ｃで保存した。Ｈａｒｒｙ Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＦａｃｉｌｉｔｙのプロテインＧを使用して、プールされた上清からＳＶＸ－３００１抗体を精製した。精製ＳＶＸ－３００１抗体をＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌで供給した。
実施例２－ヒトＣＤ４０に対する特異性を有するヒトＩｇＧを検出するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを、ＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ）Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ）のウェルを、推奨濃度の１００μｌ／ウェル精製抗ヒトＩｇＧモノクローナル捕捉抗体または１μｇ／ｍｌのＣ末端６Ｈｉｓタグ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を有する組換えヒトＣＤ４０細胞外ドメインでコーティングした。プレートを４°Ｃで一晩インキュベートした。ウェルを４００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で２回洗浄した後、２５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。ウェルを４００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で２回洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌ～１．５６ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩｇＧ標準の１００μｌ／ウェルの連続１／２希釈物、約１００ｎｇ／ｍｌ～１．５６ｎｇ／ｍｌの対照抗ＣＤ４０抗体Ｌｏｂ ７／４ ＩｇＧ１（サウサンプトン大学）の連続１／２希釈物、および１／１０～１／１０，０００のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞からの上清の連続１／１０希釈物を添加した。プレートを、４００ｒｐｍに設定したマイクロプレート振盪機上で室温にて２時間インキュベートした。ウェルを４００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で４回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する１００μｌ／ウェルの基質溶液を添加した。プレートを室温で１５分間インキュベートした。１００μｌの停止溶液（１Ｍ Ｈ３ＰＯ４）を各ウェルに添加した。試験には、希釈剤のみの対照（抗体なし）、組換えヒトＩｇＧ標準（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＶＸ－３００１抗体（２７．３ｎｇ／ｍｌと推定）およびＬｏｂ ７／４ ＩｇＧ１抗体（４２．２ｎｇ／ｍｌと推定）が含まれた。捕捉した抗体を、ＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。ＥｎＳｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
結果：組換えヒトＩｇＧ標準は、精製抗ヒトＩｇＧモノクローナル捕捉抗体で被覆されたウェルでは検出できたが、組換えＣＤ４０タンパク質で被覆されたウェルでは検出できなかった（図９）。抗ＣＤ４０抗体ＳＶＸ－３００１およびＬｏｂ ７／４ ＩｇＧ１は、精製抗ヒトＩｇＧモノクローナル捕捉抗体で被覆されたウェルおよび組換えＣＤ４０タンパク質で被覆されたウェルで検出することができた（図９）。
結論：プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞由来の上清が、ヒトＣＤ４０タンパク質に対する特異性を有するヒトＩｇＧタンパク質（すなわち、抗体ＳＶＸ－３００１）を含有することが確認された。
実施例３－細胞上の抗原への抗体の結合を検出するためのＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を行って、ＳＶＸ－３００１がヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の表面に発現したＣＤ４０に結合するかどうかを判定した。ＰＭＢＣを、ＰＥで標識した抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した。細胞表面に結合したＳＶＸ－３００１抗体は、ＢＶ４２１で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。リンパ球をＦＳＣ－ＡおよびＳＳＣ－Ａシグナルに基づいてゲートした。
方法：ヒトバフィーコート試料をオーストラリア赤十字血液サービス（倫理承認：ＲＤＨＳ－２４３－１５、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒトバフィーコート試料から単離した。
ＦＡＣＳ染色を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）で行った。すべてのインキュベーションを暗所で氷上で行った。洗浄工程および抗体を希釈するために使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および０．０１％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳからなった。染色試薬は、ＳＶＸ－３００１抗体含有上清、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＥ抗ヒトＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。
ＦＡＣＳ染色を、ウェルあたり１０６個のヒトＰＢＭＣに対して行った。細胞をペレット化し、２０μｌのＳＶＸ－３００１抗体含有上清に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０μｌのＢＶ４２１抗マウスＩｇに再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０μｌのＰＥ抗ヒトＣＤ１９に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回およびＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド１００μｌに再懸濁し、２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ＦＡＣＳ染色対照には、非染色対照、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９およびＢＶ４２１マウス抗ヒトＩｇ単一染色対照ならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照が含まれた。細胞染色を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析した。分析のためのＰＭＴ電圧およびゲートを、ＦＡＣＳ染色対照を使用して設定した。
結果：ＳＶＸ－３００１抗体含有上清は、ＣＤ１９＋末梢血リンパ球の表面上のＣＤ４０に結合した（図１０）。図１０（Ａ）は、細胞表面上のＣＤ１９を発現する細胞の染色によるＰＥ蛍光を示すＰＥ抗ＣＤ１９対照を示す。図１０（Ｂ）は、細胞表面上にＩｇＧを発現するＣＤ１９＋細胞のサブセットへの抗ヒトＩｇＧ抗体の結合に起因するバックグラウンドＢＶ４２１蛍光を示すＢＶ４２１抗ヒトＩｇＧ対照を示す。図１０（Ｃ）は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照による染色を示す。図１０（Ｄ）は、ＳＶＸ－３００１抗体含有上清による試験染色を示し、Ｂ細胞の表面上のＣＤ４０に結合したＳＶＸ－３００１抗体の存在に起因するＢＶ４２１蛍光を示す。
結論：ＳＶＸ－３００１抗体は、ヒト免疫細胞の表面上に発現される天然のＣＤ４０タンパク質に対する特異性を有する。
実施例４－刺激に応答した細胞分裂を検出するためのＣＦＳＥアッセイ
ＰＭＢＣの細胞分裂速度を刺激するＳＶＸ－３００１の能力を、ＣＦＳＥを使用して測定した。ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、ＳＶＸ－３００１抗体またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共に１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌで７日間培養し、次いでＺｏｍｂｉｅ ＡｑｕａおよびＰＥ抗ＣＤ１９で染色した。
方法：ヒトバフィーコート試料をオーストラリア赤十字血液サービス（倫理承認：ＲＤＨＳ－２４３－１５、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒトバフィーコート試料から単離した。
ヒトＰＢＭＣをＰＢＳ中に２ｘ１０７細胞／ｍｌで懸濁し、細胞１ｍｌごとに２５μｌの１００μＭ ＣＦＳＥを使用してＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で染色した。細胞を１０分間穏やかに反転させることによってＣＦＳＥと混合した後、少なくとも４体積のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳで２回洗浄した後、培養のためにＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ中に再懸濁した。
細胞を、２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳの最終容量で５ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で培養した。細胞を、１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で、ＳＶＸ－３００１抗体含有上清またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で刺激した。細胞を５％ ＣＯ２で３７°Ｃにて７日間培養し、次いでＦＡＣＳ染色のために回収した。
ＦＡＣＳ染色を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）で行った。すべてのインキュベーションを暗所で氷上で行った。洗浄工程および抗体を希釈するために使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および０．０１％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳからなった。染色試薬は、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥ抗ヒトＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。
ＦＡＣＳ染色のための細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０μｌのＰＥ抗ヒトＣＤ１９に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１００μｌのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａに再懸濁し、１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回およびＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド１００μｌに再懸濁し、２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ＦＡＣＳ染色対照には、非染色対照、単一染色対照およびＦＭＯ対照が含まれた。細胞染色を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析した。分析のためのＰＭＴ電圧およびゲートを、ＦＡＣＳ染色対照を使用して設定した。
結果：ＳＶＸ－３００１抗体は、０．０１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で刺激したヒトＰＢＭＣで見られる細胞分裂のバックグラウンドレベルを超えて、ヒトＰＢＭＣの細胞分裂を刺激した（図１１）。図１１（Ａ）は、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－ＡでのＰＢＭＣゲートを使用してデブリを除外したことを示す。図１１（Ｂ）は、ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈでの単一細胞ゲートを使用して細胞塊を除外したことを示す。図１１（Ｃ）は、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ対ＳＳＣ－Ａでの生細胞ゲートを使用して死細胞を除外したことを示す。図１１（Ｄ）は、分裂細胞が、ＣＦＳＥ対ＰＥ－抗ＣＤ１９でのＣＦＳＥ蛍光の減少に基づいて同定されたことを示す。図１１（Ｅ）は、異なる濃度のヒトＩｇＧ１抗体で刺激したＰＢＭＣ培養物中の分裂細胞パーセントのグラフを示す。
結論：ＳＶＸ－３００１抗体は、細胞分裂ヒト免疫細胞の増加をもたらす刺激（アゴニスト）活性を有する。
実施例５－ＳＶＸ－３００１によるＰＭＢＣの刺激に対するサイトカイン応答を検出するＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイ
ＳＶＸ－３００１によるＰＭＢＣの刺激に応答したサイトカイン産生のレベルを決定するためにＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイを行った。
方法：ヒト血液試料を健常志願者（倫理承認：ＨＲＥ ２０１７－０７６７、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒト血液試料から単離し、１０％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含むＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中－８０°Ｃで保存した。ヒトＰＢＭＣを解凍し、５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ ＦＣＳ中、３７°Ｃで一晩培養して、細胞を凍結から回復させた。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて細胞を標識した。
細胞を、２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳの最終容量で５ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中で培養した。細胞を、刺激なし、１μｇ／ｍｌの精製ＳＶＸ－３００１抗体、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）または１μｇ／ｍｌの精製ＳＶＸ－３００１抗体および１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２とともに培養した。細胞を５％ ＣＯ２で３７°Ｃにて３日間培養し、次いで上清を回収した。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘビーズベースのイムノアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、可溶性分析物について上清をアッセイした。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘデータは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＢＤ）を用いて取得した。
結果：精製ＳＶＸ－３００１抗体によるヒトＰＢＭＣの刺激は、培養３日後の培地中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－２３の増加ならびにＩＬ－１３およびＴＮＦβの減少をもたらした（図１２）。ＳＶＸ－３００１およびＩＬ－２の組み合わせでヒトＰＢＭＣを刺激すると、培養３日後に培地中にＩＦＮγが放出されたが、ＳＶＸ－３００１またはＩＬ－２単独では放出されなかった（図１２）。培養培地対照（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２）で測定したサイトカイン濃度を点線として図１２に示す。
結論：ＳＶＸ－３００１抗体は、ヒト免疫細胞からのサイトカインの示差的放出をもたらす刺激（アゴニスト）活性を有する。
実施例６－ＦＡＣＳによる抗体競合試験
ＦＡＣＳアッセイを行なって、抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６のＣＤ４０への結合を遮断するＳＶＸ－３００１の能力を決定した。ヒトＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＳＶＸ－３００１抗体の存在下または非存在下で、マウス抗ヒトＣＤ４０抗体Ｂ－Ｂ２０およびＬＯＢ７／６で染色した。ヒトＰＢＭＣに対するマウス抗ヒトＣＤ４０抗体の結合を、ＢＶ４２１で標識した抗マウスＩｇ抗体を用いて検出した。
方法：ヒトバフィーコート試料をオーストラリア赤十字血液サービス（倫理承認：ＲＤＨＳ－２４３－１５、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒトバフィーコート試料から単離した。
ＦＡＣＳ染色を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）で行った。すべてのインキュベーションを暗所で氷上で行った。洗浄工程および抗体を希釈するために使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および０．０１％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳからなった。ブロッキング試薬はＳＶＸ－３００１抗体含有上清であった。染色試薬は、抗ＣＤ４０抗体ＬＯＢ７／６（ＬＳＢｉｏ）、抗ＣＤ４０抗体Ｂ－Ｂ２０（Ａｂｃａｍ）およびＢＶ４２１抗マウスＩｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。
ＦＡＣＳ染色を、ウェルあたり５ｘ１０５個のヒトＰＢＭＣに対して行った。細胞をペレット化し、２００μｌのＳＶＸ－３００１抗体含有上清に１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌで再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し（洗浄せず）、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０μｌのＬＯＢ７／６またはＦＡＣＳ緩衝液に希釈したＢ－Ｂ２０に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０μｌのＢＶ４２１抗マウスＩｇに再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド１００μｌに再懸濁し、２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ＦＡＣＳ染色対照には、非染色対照、ブロッキングなし対照および一次抗体なし対照が含まれた。細胞染色を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析した。分析のためのＰＭＴ電圧およびゲートを、ＦＡＣＳ染色対照を使用して設定した。
結果：抗ＣＤ４０抗体Ｂ－Ｂ２０によるヒトＰＢＭＣの染色はＳＶＸ－３００１によってブロックされ、抗ＣＤ４０抗体ＬＯＢ７／６による染色はＳＶＸ－３００１によってブロックされなかった（図１３）。（Ａ）染色なし対照。（Ｂ）ＬＯＢ７／６による染色。（Ｃ）１μｇ／ｍｌのＳＶＸ－３００１の存在下でのＬＯＢ７／６による染色。（Ｄ）Ｂ－Ｂ２０による染色。（Ｅ）１μｇ／ｍｌのＳＶＸ－３００１の存在下でのＢ－Ｂ２０による染色。
結論：抗体ＳＶＸ－３００１およびＢ－Ｂ２０は、ヒトＣＤ４０分子上の同一または重複エピトープに結合する。抗体ＳＶＸ－３００１およびＬＯＢ７／６は、ヒトＣＤ４０分子上の異なるエピトープに結合する。
実施例７－表面プラズモン共鳴による抗体競合試験
ＳＶＸ－３００１がある範囲の抗ＣＤ４０抗体と競合する能力を、表面プラズモン共鳴によって測定した。
方法：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるペアワイズ結合分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。全体を通して、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液をランニング緩衝液として使用した。
Ｃ末端ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインおよび６Ｈｉｓタグを有する組換えヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（ＣＤ４０－Ｆｃ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に固定化した。固定化のために、ＣＤ４０－Ｆｃを１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中、２５μｇ／ｍｌに希釈した。目標固定化レベル：１０００ＲＵ。洗浄液：エタノールアミン。
競合試験に使用した試薬は、精製ＳＶＸ－３００１抗体、組換えＣＤ４０Ｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および精製抗ＣＤ４０抗体Ｌｏｂ ７／４ ＩｇＧ１（サウサンプトン大学）、ＣＰ－８７０，８９３ ＩｇＧ１（サウサンプトン大学）、Ｓ２Ｃ６（Ｍａｂｔｅｃｈ）、Ｇ２８．５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）およびＬＯＢ７／６（ＬＳＢｉｏ）であった。
ペアワイズ結合分析を、１０μｌ／分で１８０秒間の注入後に表面上の固定化ＣＤ４０－Ｆｃを飽和させるのに十分な濃度で第１の試料（試料１）を結合させることによって行った。この濃度は、試験している試薬について１２．５～２００μｇ／ｍｌの範囲であった。次いで、第２の試料（試料２）を１０μｌ／分で１８０秒間注入した。再生は、グリシン－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．５を使用して、次のペアを試験する前に５秒間安定化しながら１０μｌ／分で３０秒間注入して行った。試料１と試料２が同一であるペアを使用して、飽和を確認し、ベースライン応答を設定した。
結果：ＳＶＸ－３００１、Ｌｏｂ ７／４ ＩｇＧ１およびＬＯＢ７／６についてのペアワイズ結合によるエピトープマッピングについてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００センソグラムを図１４に示す。試験したすべてのペアの結果を表３に要約する。
Figure 2023527916000006
Figure 2023527916000007
結論：ＳＶＸ－３００１は、抗体Ｌｏｂ ７／４ ＩｇＧ１、ＣＰ－８７０，８９３ ＩｇＧ１、Ｓ２Ｃ６およびＧ２８．５のエピトープと同一または重複するヒトＣＤ４０上のエピトープに結合する。ＳＶＸ－３００１は、抗体ＬＯＢ７／６のエピトープと重複しない異なるエピトープに結合する。ＳＶＸ－３００１のエピトープは、ＣＤ４０ Ｌの結合部位と重複しない。
抗体Ｌｏｂ ７／４、ＳＧＮ４０（抗体Ｓ２Ｃ６から得た）およびＣＰ－８７０，８９３はすべて、ヒトＣＤ４０のＣＲＤ１領域内のエピトープに結合することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３３，６６４－６７５，Ａｐｒｉｌ ９，２０１８）。ＳＰＲデータから推測すると、ＳＶＸ－３００１はヒトＣＤ４０のＣＲＤ１領域内のエピトープにも結合する（Ｐ２５９４２；Ｃｙｓ２６－Ｃｙｓ５９）。
実施例８－表面プラズモン共鳴による抗体親和性試験
ＣＤ４０の細胞外ドメインに対するＳＶＸ－３００１の親和性を、表面プラズモン参照を使用して測定した。
方法：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による速度論的分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。全体を通して、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液をランニング緩衝液として使用した。
精製したＳＶＸ－３００１を、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に固定化した。固定化のために、ＳＶＸ－３００１を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、２５μｇ／ｍｌに希釈した。目標固定化レベル：６００ＲＵ。洗浄液：エタノールアミン。分析のための参照表面は、未処理か、またはＳＶＸ－３００１に使用したのと同じプロセスによって表面に固定化されたヒトＩｇＧ１アイソタイプ参照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を有していた。
速度論的試験に使用した試薬は、Ｃ末端６Ｈｉｓタグを有する組換えヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（ＣＤ４０－６Ｈｉｓ；Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびＣ末端ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインおよび６Ｈｉｓタグを有する組換えヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（ＣＤ４０－Ｆｃ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。
試料の注入パラメータは、接触時間：１２０秒、流速：３０μｌ／分、解離時間：３００秒であった。再生のための注入パラメータは、接触時間：３０秒、流量：３０μｌ／分、安定化期間：０秒であった。再生溶液は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．５または５０ｍＭ ＮａＯＨのいずれかであった。速度論的分析に使用したＣＤ４０－ＨｉｓおよびＣＤ４０－Ｆｃの濃度は、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ（２連）、１６ｍＭおよび３２ｍＭであった。モデル１：１結合をカーブフィッティングに使用した。
結果：分析物としてＣＤ４０－Ｆｃを用いた３つの実験および分析物としてＣＤ４０－Ｆｃを用いた３つの実験からのＳＶＸ－３００１の反応速度定数および親和定数を表４に示す。
Figure 2023527916000008
結論：分析物としてＣＤ４０－６Ｈｉｓを使用したＳＶＸ－３００１の計算された平衡解離定数（ＫＤ）は６．１１１ｘ１０－９Ｍ（６．１１１ｎＭ）であり、分析物としてＣＤ４０－Ｆｃを使用したＳＶＸ－３００１の計算されたＫＤは５．８２６ｘ１０－１０Ｍ（０．５８２６ｎＭ）であった。両方の分析物を使用して計算された会合速度定数（ｋａ）は類似していたため、ＫＤの差は、２つの分析物の解離速度定数（ｋｄ）の差に起因するようである。
実施例９－抗ＣＤ４０抗体による単球由来樹状細胞の活性化
ＳＶＸ－３００１、ＣＤ４０Ｌ、またはＩＦＮ－γを含むＬＰＳの存在下での単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の刺激を、共刺激分子の発現を参照して測定した。
方法：ヒトバフィーコート試料をオーストラリア赤十字血液サービス（倫理承認：ＲＤＨＳ－２４３－１５、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒトバフィーコート試料から単離した。ヒトＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、５ｘ１０６細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７°Ｃで２時間インキュベートして単球をプラスチックに接着させた。次いで、非接着細胞を含む培地を除去した。
接着性単球を、８０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ中で７日間培養することによって、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）に分化させた。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびポリミキシンＢを含有する培地を４日目に交換した。
細胞を、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含みポリミキシンＢを含まない培地中で７日目に刺激した。刺激条件には、培地対照（刺激なし）、１μｇ／ｍｌのＳＶＸ－３００１、１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、０．６７ｍｇ／ｍｌの組換えＣＤ４０Ｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ－γ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれた。９日目に、細胞を１×ブレフェルジンＡ溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４時間処理した後、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析のために染色した（４８時間の刺激）。
ＦＡＣＳ染色を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）で行った。洗浄工程および抗体を希釈するために使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および０．０１％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳからなった。染色試薬には、ＢＵＶ８０５抗ＣＤ３（ＢＤ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００抗ＣＤ１４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６０５抗ＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ７１１抗ＣＤ１１ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ抗ＣＤ１ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－Ｈ７抗ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ８３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＵＶ３９５抗ＣＤ８６（ＢＤ）、ＢＶ５１０抗ＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１抗ＩＬ－１２（ＢＤ）、およびＺｏｍｂｉｅ ＵＶ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）．が含まれた。
各染色試料は、細胞培養および刺激に使用される６ウェルプレートの１ウェルからのｍｏＤＣを含有していた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１００μｌのＺｏｍｂｉｅ ＵＶに再懸濁し、１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）およびＦＡＣＳ緩衝液に希釈した細胞表面マーカーに対する５０μｌの抗体を含む１００μｌの染色混合液に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌの固定／透過処理溶液（ＢＤ）に再懸濁し、２０分間インキュベートした。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ）で２回洗浄し、５０μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ緩衝液およびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に希釈した細胞内マーカーに対する５０μｌの抗体を含有する１００μｌの染色混合物に再懸濁した。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、分析のために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ＦＡＣＳ染色対照には、非染色対照および単一染色対照が含まれた。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＢＤ）を用いて細胞染色を分析した。ＰＭＴ電圧および補償値を、ＦＡＣＳ染色対照を使用して設定した。ｍｏＤＣの分析のためのゲートは、サイズ（ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ）、シングレット（ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈ）、生（Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ陰性）、ＣＤ３－ＣＤ１４－細胞（ＣＤ３対ＣＤ１４）およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＣＤ１１ｂ対ＣＤ１１ｃ）であった。細胞表面マーカーの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、全ｍｏＤＣ集団について決定した。
結果：図１５に示すように、ＳＶＸ－３００１、ＣＤ４０Ｌ、またはＩＦＮ－γを含むＬＰＳによる４８時間のｍｏＤＣ刺激は、細胞表面マーカーＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３ ＣＤ８６およびＰＤ－Ｌ１の上方制御およびＩＬ－１２の発現増加をもたらした。これらのマーカーは、刺激されていないｍｏＤＣまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で刺激されたｍｏＤＣでは上方制御されなかった。
結論：抗ＣＤ４０抗体ＳＶＸ－３００１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の一例であるヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）に対してアゴニスト活性を有し、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ８３および炎症促進性サイトカインＩＬ－１２とともに、共刺激分子Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）およびＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）の発現増加をもたらす。この応答は、同じＦｃドメインを共有するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体には見られないので、このアゴニスト活性は、抗体の抗原結合ドメインに依存する。
実施例１０－抗ＣＤ４０抗体による単球由来樹状細胞の活性化－用量応答
ＳＶＸ－３００１の存在下での単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の刺激を、共刺激分子の発現を参照して測定した。ＳＶＸ－３００１の刺激効果の用量応答も測定した。
方法：ヒトバフィーコート試料をオーストラリア赤十字血液サービス（倫理承認：ＲＤＨＳ－２４３－１５、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｃｕｒｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する密度遠心分離によってヒトバフィーコート試料から単離した。ヒトＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、５ｘ１０６細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７°Ｃで２時間インキュベートして単球をプラスチックに接着させた。次いで、非接着細胞を含む培地を除去した。
接着性単球を、８０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ中で７日間培養することによって、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）に分化させた。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびポリミキシンＢを含有する培地を４日目に交換した。
細胞を、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含みポリミキシンＢを含まない培地中で７日目に刺激した。刺激条件には、１μｇ／ｍｌ、０．３１６μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０３１６μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０抗体ＳＶＸ－３００１が含まれた。対照には、培地のみ（刺激なし）、１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ－γ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれた。９日目に、細胞を１×ブレフェルジンＡ溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４時間処理した後、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析のために染色した（４８時間の刺激）。
ＦＡＣＳ染色を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｆａｌｃｏｎ）で行った。洗浄工程および抗体を希釈するために使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および０．０１％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳからなった。染色試薬には、ＢＵＶ８０５抗ＣＤ３（ＢＤ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００抗ＣＤ１４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６０５抗ＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ７１１抗ＣＤ１１ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ抗ＣＤ１ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－Ｈ７抗ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ８３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＵＶ３９５抗ＣＤ８６（ＢＤ）、ＢＶ５１０抗ＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１抗ＩＬ－１２（ＢＤ）、およびＺｏｍｂｉｅ ＵＶ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）．が含まれた。
各染色試料は、細胞培養および刺激に使用される６ウェルプレートの１ウェルからのｍｏＤＣを含有していた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１００μｌのＺｏｍｂｉｅ ＵＶに再懸濁し、１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）およびＦＡＣＳ緩衝液に希釈した細胞表面マーカーに対する５０μｌの抗体を含む１００μｌの染色混合液に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌの固定／透過処理溶液（ＢＤ）に再懸濁し、２０分間インキュベートした。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ）で２回洗浄し、５０μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ緩衝液およびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に希釈した細胞内マーカーに対する５０μｌの抗体を含有する１００μｌの染色混合物に再懸濁した。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、分析のために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ＦＡＣＳ染色対照には、非染色対照および単一染色対照が含まれた。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＢＤ）を用いて細胞染色を分析した。ＰＭＴ電圧および補償値を、ＦＡＣＳ染色対照を使用して設定した。ｍｏＤＣの分析のためのゲートは、サイズ（ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ）、シングレット（ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈ）、生（Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ対ＳＳＣ－Ａ）、ＣＤ３－ＣＤ１４－細胞（ＣＤ３対ＣＤ１４）、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＣＤ１１ｂ対ＣＤ１１ｃ）およびＣＤ１ａ＋細胞（ＣＤ１ａ対ＳＳＣ－Ａ）であった。細胞表面マーカーの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、全ｍｏＤＣ集団について決定した。
結果：抗ＣＤ４０抗体ＳＶＸ－３００１、ＡＰＸ００５ ＭおよびＣＰ－８７０，８９３で４８時間ヒトｍｏＤＣを刺激すると、細胞表面マーカーＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＰＤ－Ｌ１ならびにサイトカインＩＬ－１２が用量依存的に上方制御された。図１６は、異なる濃度で４８時間ＳＶＸ－３００１で刺激したｍｏＤＣのＦＡＣＳ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。刺激されていないｍｏＤＣのＭＦＩを点線で示す。
結論：抗ＣＤ４０抗体ＳＶＸ－３００１は、細胞表面細胞表面マーカーＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＰＤ－Ｌ１ならびにサイトカインＩＬ－１２の上方制御をもたらす用量依存的アゴニストシグナルをヒトｍｏＤＣに提供する。
実施例１１－ＳＶＸ－３００１のコドン最適化配列の遺伝子合成
ＳＶＸ－３００１の重鎖およびＳＶＸ－３００１の軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）を使用してホモサピエンスにおける発現のために最適化し、遺伝子配列２０ＡＣＧＪＱＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ（配列番号２１、図１７）および２０ＡＣＧＪＲＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ（配列番号２２、図１８）を得た。図１７および図１８では、コザック配列を太字で示し、重鎖および軽鎖のコード配列に下線を引いている。
遺伝子配列２０ＡＣＧＪＱＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣおよび２０ＡＣＧＪＲＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣをＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって合成し、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯに挿入して、２０ＡＣＧＪＱＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＨＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ（図１９）および２０ＡＣＧＪＲＣ＿Ｓｅｌｖａｘ０１ＬＣ－ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ（図２０）を作製した。

Claims (49)

  1. （ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖および（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含み、１または複数の重鎖相補的決定領域（ＣＤＲＨ）が、以下：
    （ｄ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
    （ｅ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；または
    （ｆ）１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含む配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列
    からなる群から選択される、単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片。
  2. （ａ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
    （ｂ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
    （ｃ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
    （ｄ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
    をさらに含む、請求項１に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  3. Ａ：
    （ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；または
    （ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；および
    Ｂ：
    （ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
    （ｄ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
    （ｅ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；または
    （ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
    を含む、請求項１または２に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  4. （ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１配列；
    （ｂ）配列番号２を含むＣＤＲＨ２配列；
    （ｃ）配列番号３を含むＣＤＲＨ３配列；
    （ｄ）配列番号４を含むＣＤＲＬ１配列；
    （ｅ）配列番号５を含むＣＤＲＬ２配列；および
    （ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３配列
    を含む、請求項１～３に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  5. 配列番号７の重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  6. 配列番号８の軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  7. 配列番号１９の重鎖または配列番号２０の軽鎖を含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  8. 配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  9. ヒトＣＤ４０に対するヒト化抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  10. モノクローナル抗体である、請求項８に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  11. ＩｇＧ抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  12. 配列番号１９の重鎖と配列番号２０の軽鎖とを含む、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む医薬組成物。
  14. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物。
  15. 追加の活性剤をさらに含む、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記追加の活性剤が、放射性同位体、放射性核種、毒素、または治療群および化学療法群からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を作製する方法であって、前記アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を分泌する宿主細胞から前記アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を調製する工程を含む、方法。
  18. 患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  19. 対象において、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  20. 対象において、抗原提示細胞を活性化する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  21. 対象において、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  22. 対象において、炎症促進性サイトカインの産生を刺激する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくともアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  23. 対象において、Ｔ細胞活性化を誘導する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  24. 対象において、ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  25. 対象において、腫瘍を有する対象におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  26. 対象において、Ｂ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  27. 対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む、方法。
  28. 有効量の少なくとも１つの請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、少なくとも第２の免疫増強剤と一緒に含む医薬組成物。
  29. 前記免疫増強剤が、ＩＬ－２、ＴＬＲ－７アゴニスト、または全身性細胞傷害性化学療法剤から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体および有効量の少なくとも第２の免疫増強剤を投与することを含む、方法。
  31. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を含む医薬組成物。
  32. 患者の悪性腫瘍に関連する症状を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  33. 対象において、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、方法。
  34. 有効量の少なくとも１つの請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、対象における抗原提示細胞を活性化する方法。
  35. 対象において、Ｂ細胞による腫瘍細胞上に発現される抗原に対する自己抗体の分泌を促進する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、方法。
  36. 対象において、共刺激マーカーを上方制御し、ＩＬ－１２を放出してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、交差提示腫瘍抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２を投与することを含む、方法。
  37. 対象において、ＡＰＣ（マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞を含む）による抗原提示を増加させるための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  38. 対象において、ＭＨＣおよび／または免疫共刺激分子の発現を増強する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  39. 対象において、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）の産生を刺激する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  40. 対象において、Ｔ細胞活性化を誘導する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  41. 対象において、ＣＤ４０Ｌのシグナルを模倣し、ＣＤ４＋リンパ球の機能を代替する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  42. 対象において、腫瘍を有する対象におけるＴ細胞寛容を克服するか、または有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、または抗腫瘍ワクチンの有効性を増強するための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびＩＬ－２の各々を投与することを含む、方法。
  43. 請求項１～１２のいずれか１項に記載のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子。
  44. 配列番号９を含むアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の重鎖をコードする核酸分子。
  45. 前記分子が、配列番号９と少なくとも８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～９７、９７～９９またはそれを超える同一性を有する、請求項４３に記載の核酸分子。
  46. 配列番号１０を含むアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の軽鎖をさらに含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の核酸分子。
  47. 配列番号２１を含むアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の重鎖をコードする核酸分子。
  48. 前記分子が、配列番号２１と少なくとも８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～９７、９７～９９またはそれを超える同一性を有する、請求項４３に記載の核酸分子。
  49. 配列番号２２を含むアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の軽鎖をさらに含む、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の核酸分子。
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