CN116234575A

CN116234575A - 激动剂抗cd40抗体

Info

Publication number: CN116234575A
Application number: CN202180057896.5A
Authority: CN
Inventors: D·J·纳尔逊; S·普罗克施; J·T·斯汀
Original assignee: Saier Vaccine Private Ltd
Current assignee: Saier Vaccine Private Ltd
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2023-06-06
Also published as: KR20230020521A; US20230227567A1; AU2021283455A1; WO2021243422A1; JP2023527916A; EP4161968A1; CA3185616A1

Abstract

本申请一般涉及某些激动剂抗CD40抗体的鉴定。基于此，本发明提供新的激动剂抗体及其在治疗中的用途。

Description

激动剂抗CD40抗体

技术领域

背景技术

肿瘤在其进化过程中的某些点会被宿主免疫系统所识别。尽管有识别的证据，但一些肿瘤生长旺盛，这可能是由于它们缺乏危险信号并因此仅诱导弱反应，以及可能由于它们在逐渐提高的免疫压力下形成了免疫逃逸策略。

在肿瘤发展早期接受治疗的肿瘤可能对单一免疫治疗表现出更好的反应。然而，晚期癌症对包括免疫治疗在内的所有治疗形式而言都是更难治的。在这些癌症中危险信号的缺失加上越来越复杂的免疫逃逸机制的获得，都显著妨碍了宿主的适应性免疫反应，所述的适应性免疫反应依赖于抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞(DC)，对肿瘤来源的抗原进行采样、加工、以及在具有适当共刺激标记的正确背景中进行呈递，以由此引发相关T细胞反应。由于必需共刺激分子(如B7家族成员)在肿瘤细胞中的低表达水平，肿瘤细胞常常不呈递其自身的抗原刺激。

由于肿瘤抗原不能被直接呈递，交叉呈递可能是用于肿瘤免疫的唯一一种天然抗原呈递方式。在这一过程中，源自肿瘤细胞的外源性抗原(可溶性抗原、凋亡小体或活的癌细胞)被DC摄取，而且外源性抗原不仅通过经典途径加工和呈递在MHC II类分子中以引发CD4+T细胞辅助，外源性抗原也内化并展示在MHC I类分子中以呈递给CD8+T细胞。然而，除非呈递DC也被适当激活，并且呈递发生在适当的共刺激背景下，否则此过程将导致弱反应或耐受。肿瘤环境内的DC通常处于未成熟状态，并可促进引流肿瘤的淋巴结中调节性T细胞的扩增。它们的功能也会受浸润性抑制细胞(如髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))以及肿瘤和引流淋巴结内的细胞因子抑制。因此，“辅助”DC启动抗原特异性T细胞反应的有效免疫治疗，必须克服这些障碍，并辅助该交叉呈递过程。有效的交叉启动需要“经许可”的DC和高水平的抗原。DC的“许可”或“调节”由抗原特异性CD4+T辅助细胞通过交联CD40进行。这种连接改变了DC表型和功能，抑制其通过细胞因子如IL-6和IL-12的自分泌信号传导而引发耐受性的潜能，从而使其能够激活有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。相反，由未经许可的DC激活的CTL称为“无辅助的”，结果是T细胞失能或缺失，也会诱导调节性T细胞。作为肿瘤坏死因子受体超家族成员的细胞表面分子CD40，因此广泛地调节免疫激活并介导肿瘤凋亡。

CD40是一种跨膜蛋白，是TNF受体超家族的成员。CD40由APC表达，其与T辅助细胞和血小板上的天然配体(CD154或CD40L)的结合将激活APC，包括DC、巨噬细胞和B细胞。

CD40见于大部分黑色素瘤和肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌和头颈癌以及B细胞恶性肿瘤中。

在T细胞介导免疫的小鼠模型中，激动剂抗CD40抗体已显示可以替代CD4+淋巴细胞提供的T细胞辅助。在荷瘤宿主中，CD40激动剂触发针对肿瘤相关抗原的有效免疫反应。例如，可以使用激动剂抗CD40抗体对DC进行“预处理”，使得它们上调其共刺激标记，从而允许其能够在遇到CD8+T细胞时激活CD8+T细胞。因此，激动剂抗CD40抗体可以替代CD4+T细胞辅助，通过在荷载抗原的DC上引发CD40信号传导，导致B7共刺激分子上调和IL-12释放，从而使得DC能够刺激特异性CTL反应。

因此，连接APC表面上的CD40可增强MHC和共刺激分子如CD86、CD80、CD83、PD-L1、HLA-A、B、C或HLA-DR的表达，刺激促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ的产生，并诱导T细胞激活，所有这些都是细胞介导的免疫反应所必需的。

具有CD40或CD40L胚系突变的患者，明显免疫抑制，易受机会性感染，且T细胞依赖性免疫反应(包括IgG产生、生发中心形成和记忆B细胞诱导)存在缺陷。

在T细胞介导免疫的小鼠模型中，激动剂CD40抗体已显示模拟CD40L的信号并替代CD4+淋巴细胞的功能。激动剂CD40抗体还可以克服荷瘤小鼠的T细胞耐受性，引发有效的细胞毒性T细胞反应，并增强抗肿瘤疫苗的有效性。

这些发现与肿瘤细胞表面CD40的连接相反，后者在许多情况下介导直接的细胞毒性作用，导致肿瘤因凋亡和坏死而消退。尽管CD40对肿瘤细胞的确切功能尚不清楚，但CD40的体外结合抑制了实体瘤细胞和高级别B细胞淋巴瘤系的生长。此外，在体内也观察到CD40介导的肿瘤抑制，包括在免疫低下小鼠中抑制乳腺癌或B细胞淋巴瘤异种移植物。

CD40的这些多样的作用提供了这样的机会，即，在荷瘤动物中激活CD40可以导致：(i)对肿瘤产生直接的细胞毒性作用，以及(ii)向同时被CD40激活的APC提供肿瘤抗原。

针对CD40的激动剂单克隆抗体(mAb)已经在一系列临床前模型中显示出治疗活性。这些发现，连同CD40的双重功能，使CD40成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点，并为激动剂抗CD40抗体的临床开发提供了依据。

然而，仍然需要针对人CD40的其他激动剂单克隆抗体。正是在这种背景下开发了本发明。

发明概述

本发明人已经开发了适合用作能够在患者中治疗恶性肿瘤的免疫原性活性剂的新激动剂抗CD40抗体。

本发明的激动剂抗CD40抗体适合用于多种活动，包括但不限于结合：(a)CD40+肿瘤血管，使得它们允许T细胞运输；(b)肿瘤、脾脏和淋巴结中的CD40+B细胞，使得它们分泌提高水平的针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体；和(c)CD40+DC和巨噬细胞，使得它们上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞，并刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性CTL反应。此外，在本发明的抗体与其他免疫增强剂(如局部或全身IL-2、TLR-7激动剂和/或细胞毒性化疗)联合时，可以看到产生有效的抗肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，本发明抗体构成并提供了一种肿瘤治疗领域的新普遍适用原理。

在第一方面，本发明包含分离的激动剂抗CD40抗体或其片段，其包含(i)含有三个CDR的VH链和(ii)含有三个CDR的VL链，其中一个或多个重链互补决定区(CDRH)选自：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；

c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；或

d)包含一个或两个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:1至3中的任何一个。

在本发明第一方面的一个实施方案中，本发明包含分离的激动剂抗CD40抗体或其片段，其包含(i)含有三个CDR的VH链和(ii)含有三个CDR的VL链，其中一个或多个重链互补决定区(CDRH)选自：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；或

c)包含含有一个或两个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:2的CDRH2序列。

在本发明第一方面的一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ IDNO:7的重链可变区。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体还包含一个或多个选自以下的轻链互补决定区(CDRL)：

a)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

b)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；或

c)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

在第二方面，本发明包含分离的激动剂抗CD40抗体或其片段，其包含(i)含有三个CDR的VH链和(ii)含有三个CDR的VL链，其中一个或多个CDRL选自：

a)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

b)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；

c)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列；或

d)包含一个或两个氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:4至6中的任何一个。

在本发明第二方面的一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ IDNO:8的轻链可变区。

在本发明第二方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体还包含一个或多个选自以下的CDRH：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；或

c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列。

在第三方面，本发明是分离的激动剂抗CD40抗体，其包含：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；

c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

d)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

e)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；和

f)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

在本发明第三方面的一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ IDNO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区。

在本发明的上述方面的一个实施方案中，该激动剂抗CD40抗体可以是鼠抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体，或其抗体片段。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv片段、双抗体(diabody)或单链抗体分子。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是人源化抗体。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4型。优选地，该分离的激动剂抗CD40抗体为IgG1型。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体与标记基团偶联。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体增强CD40活性。

在一个实施方案中，本发明包含编码本文所述分离的激动剂抗CD40抗体的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明包含含有本文所述核酸分子的载体。

在一个实施方案中，本发明包含含有本文所述核酸分子的宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明包含分离的激动剂抗CD40抗体，其至少适用于达到以下功能中的至少一种或多种：

a.促进B细胞分泌针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体；

b.上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞，并刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应；

c.增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递；

d.增强MHC和免疫共刺激分子(例如CD86、CD80、CD83、PD-L1、HLA-A、B、C或HLA-DR)的表达；

e.刺激促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ)的产生；或

f.诱导T细胞激活；

g.模拟CD40L的信号并替代CD4+淋巴细胞的功能；

h.克服荷瘤个体的T细胞耐受性；

i.引起有效的细胞毒性T细胞反应；

j.增强抗肿瘤疫苗的有效性；或

k.使得肿瘤血管系统更容易发生免疫浸润。

在一个实施方案中，本发明是包含至少一种本文所述的分离的激动剂抗CD40抗体的药物组合物。优选地，该药物组合物包括可药用赋形剂。

在一个实施方案中，该药物组合物可进一步包含活性剂，如放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗或化疗基团。

在另一方面，本发明涉及制备本文所述的激动剂抗CD40抗体的方法，其包括以下步骤：从分泌该激动剂抗CD40抗体的宿主细胞制备该激动剂抗CD40抗体。

在另一方面，本发明涉及用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括以下步骤：对需要该抗体的患者施用治疗有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括用于在个体中增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中激活抗原呈递细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括增强个体中MHC和/或免疫共刺激分子的表达的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。优选地，该MHC和/或免疫共刺激分子选自CD80、CD86、PD-L1、HLA-A、B、C、HLA-DR和CD83。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中刺激产生促炎细胞因子的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体。优选地，该促炎细胞因子选自IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中诱导T细胞激活的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中模拟CD40L信号并替代CD4+淋巴细胞功能的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括用于在荷瘤动物中克服T细胞耐受性或在个体中引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中促进B细胞分泌针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞并刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体。

肿瘤根除所需事件的复杂协同作用提示，联合治疗方法在某些情况下也可以是有益的。激动剂抗CD40抗体可与用于释放抗原、促进细胞因子释放、增加免疫监视和减少抑制网络的其他活性剂一起使用，以增强此效应。

因此，在一个实施方案中，本发明包括药物制剂，其包含：有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体以及一种或多种其他的免疫增强剂。此类免疫增强剂包括但不限于IL-2、TLR-7激动剂或全身细胞毒性化疗剂。

在另一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体和有效量的至少第二免疫增强剂。

一种治疗选择是改变肿瘤微环境本身，以促进肿瘤作为其自身抗原刺激的来源。这可以通过将IL-2和抗CD40抗体引入肿瘤部位来达到。在直接共注射时，该共同施用可以避免全身施用相关毒性，并成功地导致较大肿瘤以及远端肿瘤的消退，同时保持长期保护性记忆。IL-2和CD40激动剂的共同施用可导致巨噬细胞活性和B细胞激活的增加。因此，IL-2和CD40激动剂的组合可以显示出对多种癌症的显著益处，其中癌症的消退与中性粒细胞显性(dominant)炎症反应相关。

因此，在一个实施方案中，本发明包括含有至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括用于在个体中增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中激活抗原呈递细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中增强MHC和/或免疫共刺激分子的表达的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。优选地，该MHC和/或免疫共刺激分子选自CD80、CD86、PD-L1、HLA-A、B、C、HLA-DR和CD83。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中刺激产生促炎细胞因子的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。优选地，该促炎细胞因子选自IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中诱导T细胞激活的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中模拟CD40L信号并替代CD4+淋巴细胞功能的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括用于荷瘤动物中克服T细胞耐受性或在个体中引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中促进B细胞分泌针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞并刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的最有效方法可能需要联合治疗方法，其中治疗干预随时间推移依次进行。

因此，在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括随时间推移依次对有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体与其他治疗干预。在一些实施方案中，该其他治疗干预选自手术、放疗、化疗、热疗(thermotherapy)和免疫治疗。

一种治疗选择是改变从患者分离的细胞，然后将这些细胞转移回患者体内。这可以通过用抗CD40抗体处理从患者分离的细胞来达到。用抗CD40抗体处理的细胞可以用其他活性剂处理。在一些实施方案中，该活性剂选自肿瘤特异性肽、肿瘤细胞裂解物、细胞因子、激动剂和促分裂原(mitogen)。

因此，在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用以有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体处理的细胞。在一些实施方案中，该细胞已从患者分离，并选自DC、巨噬细胞、B细胞、髓样细胞、淋巴样细胞和造血干细胞。

其他目的、优势和新颖特征将在下面的描述中阐述，或者在检查附图和随后的几个非限制性实施方案的详细描述之后，对本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图简述

本公开将参考以下附图在以下优选实施方案描述中提供细节，其中：

图1显示人源化激动剂抗人CD40抗体重链的核苷酸序列。

图2显示人源化激动剂抗人CD40抗体轻链的核苷酸序列。

图3显示抗体SVX-3001的重链可变区(VH)的核苷酸和氨基酸序列。

图4显示抗体SVX-3001的轻链可变区(VL)的核苷酸和氨基酸序列。

图5显示编码抗体SVX-3001重链的合成基因序列的核苷酸和氨基酸序列，该基因序列被克隆到质粒pcDNA3.1(+)中以产生质粒pcDNA3.1(+)_Selvax01HC。

图6显示编码抗体SVX-3001轻链的合成基因序列的核苷酸和氨基酸序列，该基因序列被克隆到质粒pcDNA3.1(+)中以产生质粒pcDNA3.1(+)_Selvax01LC。

图7显示pcDNA3.1(+)_Selvax01HC的质粒图谱。

图8显示pcDNA3.1(+)_Selvax01LC的质粒图谱。

图9显示ELISA测定的结果，其显示所产生的抗体为CD40特异性IgG。

图10显示检测SVX-3001与表达CD40的细胞结合的FACS分析的结果。

图11显示检测人PBMC响应SVX-3001刺激的细胞分裂的CFSE测定的结果。

图12显示检测响应SVX-3001(与IL-2和不与IL-2)刺激而自人PBMC产生的细胞因子的LEGENDplex测定的结果。

图13显示SVX-3001阻断抗体B-B20和LOB7/6与CD40结合的能力的FACS测定的结果。

图14显示SVX-3001相对于许多不同CD40抗体的表位作图的Biacore T200传感图。

图15显示测定SVX-3001激活单核细胞来源的树突细胞(moDC)的FACS测定的结果。

图16显示测定单核细胞来源的树突细胞(moDC)对SVX-3001的剂量反应的FACS测定的结果。

图17显示编码抗体SVX-3001重链的合成基因序列的核苷酸序列，将其克隆到质粒pcDNA3.4-TOPO中以产生质粒20ACGJQC_Selvax01HC-pcDNA3.4-TOPO。

图18显示编码抗体SVX-3001轻链的合成基因序列的核苷酸和氨基酸序列，将其克隆到质粒pcDNA3.4-TOPO中以产生质粒20ACGJRC_Selvax01LC-pcDNA3.4-TOPO。

图19显示20ACGJQC_Selvax01HC-pcDNA3.4-TOPO的质粒图谱。

图20显示20ACGJRC_Selvax01LC-pcDNA3.4-TOPO的质粒图谱。

序列表简述

表1：序列表

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发明详述

本发明涉及分离的激动剂抗人CD40抗体，其尤其能够：增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递。在某些实施方案中，该抗体提供了增强MHC和/或免疫共刺激分子表达的方法。该抗体还可以刺激诱导T细胞激活的促炎细胞因子的产生。该抗体通过模拟CD40L的信号并替代CD4+淋巴细胞的功能来达到这一点。为此，本文所述的分离的激动剂抗CD40抗体能够改善荷瘤动物的T细胞耐受性，可以引起有效的细胞毒性T细胞反应和/或增强抗肿瘤疫苗的有效性。

为方便起见，以下各节概括介绍了本文所用术语的多种含义。在此之后，讨论了关于激动剂抗CD40抗体的一般方面，随后是具体实施例，其展示了抗体的多种实施方案的性质以及其应用。

定义

本发明的范围不受以下具体实施方案的限制。此详细描述仅用于举例说明的目的。功能等同的产品、组合物和方法在本文所述的本发明范围内。与此一致，本领域技术人员将理解，在本文具体描述之外，本文所述的本发明还可以容易地进行变化和修改。应理解，本发明包括所有这类变化和修改。本发明还包括说明书中单独或集合地提及或指出的各步骤、特征、组合物和化合物、以及这些步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或多个的组合。

在本申请中，除非另有明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式例如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。此外，除非另有明确说明，否则术语“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含一个以上亚单位的元件和组分。此外，术语“部分”的使用可以包括一个结构部分的部分或该整个结构部分。

术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，其可与完整抗体竞争与靶抗原进行特异性结合，并包括例如嵌合和双特异性抗体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下，可以包含更少的链，如骆驼中天然存在的抗体，其可以仅包含重链。抗体可以单独来源于单一来源，也可以是“嵌合”的，也就是说，抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体，如下文所述。抗体或结合片段可在杂交瘤中、通过重组DNA技术或通过酶或化学切割完整抗体产生。除非另有说明，术语“抗体”除包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还涵盖其衍生物、变体、片段和突变蛋白，见下文所述。此外，除非明确排除，否则抗体涵盖单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、抗体融合物(本文有时也称为“抗体缀合物”)及其片段。在一些实施方案中，该术语还涵盖肽体(peptibody)。

抗体重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的亚类。IgA类似地细分为包括但不限于IgA1和IgA2的亚类。在全长轻链和重链中，通常，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.编辑,第2版Raven Press,N.Y.(1989))(为了所有目的以其整体引入作为参考)。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

可变区通常表现出相同一般结构，即，由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的构架区(FR)。来自每对两条链的CDR通常通过构架区对齐，从而使得能够结合特定表位。从N端到C端，轻链和重链可变区通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。典型地，根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest的定义(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等,Nature,342:878-883(1989)的定义，将氨基酸分配到各结构域。

在某些实施方案中，抗体重链在缺乏抗体轻链的情况下与表位结合。在某些实施方案中，抗体轻链在缺乏抗体重链的情况下与表位结合。在某些实施方案中，抗体结合区在缺乏抗体轻链的情况下与表位结合。在某些实施方案中，抗体结合区在缺乏抗体重链的情况下与表位结合。在某些实施方案中，单个可变区在缺乏其他可变区的情况下特异性结合表位。

在某些实施方案中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构，来达到CDR的确定性描绘和包含抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来达到，如X射线晶体学。在某些实施方案中，可以采用多种分析方法来鉴定或近似确定CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和Contact定义。

按照惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2和H3，并按从氨基端到羧基端的方向顺序编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2和L3，并按从氨基端到羧基端的方向顺序编号。

术语“轻链”包括全长轻链及其片段，其具有足够的可变区序列以赋予结合特异性。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基端。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”包括全长重链及其片段，其具有足够的可变区序列以赋予结合特异性。全长重链包括可变区结构域VH以及三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基端，CH结构域位于羧基端，CH3最接近多肽的羧基端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。

双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai等,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等,J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。

每一条免疫球蛋白链通常由几个“免疫球蛋白结构域”组成，每个结构域包含大约90至110个氨基酸，并具有特征性折叠模式。这些结构域是组成抗体多肽的基本单位。在人类中，IgA和IgD同种型包含四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型包含两条重链和两条轻链；IgM同种型包含五条重链和五条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。例如，IgG重链包含三个C区结构域，称为CH1、CH2和CH3。所提供的抗体可以具有这些同种型和亚型中的任何一种。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中的氨基端约120至130个氨基酸和轻链中的氨基端约100至110个氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区甚至在同一物种的抗体之间在氨基酸序列上也有很大差异。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。

术语“表位”包括能够被抗体或T细胞受体结合的任何决定簇。表位是与靶向该表位的抗体或T细胞受体接合的区域，在表位是蛋白质的一部分时，其包括直接接触抗体或T细胞受体的具体氨基酸。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在某些情况下，可以存在于其他种类的分子上，如核酸。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶表位特异的抗体将在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别靶标上的表位。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。多核苷酸中的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该修饰包括碱基修饰，如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰，如2’,3’-双脱氧核糖，以及核苷酸间连接修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代酸磷酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。

术语“寡核苷酸”是指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原性标记。寡核苷酸可以用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。

“分离的核酸分子”是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其组合，该分离多核苷酸不与在自然界中发现的与其连接的多核苷酸的全部或部分发生连接，或该分离多核苷酸与自然界中未与其连接的多核苷酸连接。“包含”指定核酸序列的分离核酸分子，除该指定的序列外，还可以包含至多十个或甚至至多二十个其他蛋白质或其部分的编码序列，或可以包含控制所述的核酸序列的编码区表达的有效连接的调节序列，和/或可以包含载体序列。

除非另有规定，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向；在与RNA转录物具有相同序列的DNA链上，位于该RNA转录物5'末端的5'的序列区域被称为“上游序列”；在与RNA转录物具有相同序列的DNA链上，位于该RNA转录物3'末端的3'的序列区域被“下游序列”。

术语“控制序列”是指可以影响与之连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可取决于宿主生物。在具体实施方案中，用于原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，用于真核生物的控制序列可以包括含有转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。

术语“载体”是指可用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

术语“表达载体”或“表达构建体”是指这样的载体，其适合用于转化宿主细胞，并且包含(结合宿主细胞)能够指导和/或控制与之有效连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列。表达构建体可以包括但不限于影响或控制与之有效连接的编码区的转录、翻译、以及如果存在内含子，影响RNA剪接的序列。

本文所用的“有效连接”是指应用该术语的组分处于允许它们在适宜条件下执行其固有功能的关系中。例如，载体中与蛋白质编码序列“有效连接”的控制序列，将与所述编码序列这样连接，该连接使得该蛋白质编码序列可以在与控制序列的转录活性相容的条件下实现表达。

术语“宿主细胞”是指已经被核酸序列转化或能够被核酸序列转化从而表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，无论子代在形态或遗传组成上是否与原始亲本细胞相同，只要存在目的基因即可。

除非另有规定，本文所用的术语“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子。

术语“免疫共刺激分子”包括细胞表面分子，其发挥作用以放大或抵消T细胞受体(TCR)在与抗原或MHC相互作用后提供给T细胞的初始激活信号。此类分子的实例包括CD86、CD80、CD83、PD-L1、HLA-A、B、C和HLA-DR。

术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已经被引入到细胞膜内侧后，细胞是已被“转染”的。许多转染技术是本领域公知的，并在本文中公开。参见例如Graham等,1973,Virology 52:456；Sambrook等,2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,上引文；Davis等,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等,1981,Gene 13:197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入适宜的宿主细胞。

术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，在细胞已经被修饰以含有新的DNA或RNA时，该细胞是已被转化的。例如，可以通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质，来转化细胞，使细胞从其原始状态发生遗传修饰。在转染或转导之后，转化的DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加体元件暂时保持而不复制或者可以独立地作为质粒复制。在转化的DNA随着细胞的分裂而复制时，认为细胞已“稳定转化”。

术语“多肽”或“蛋白质”是指，具有天然蛋白质(即由天然存在和非重组细胞产生的蛋白质)的氨基酸序列的大分子；或其由遗传改造的或重组的细胞产生，并包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物。术语“多肽”和“蛋白质”特别包括激动剂抗CD40抗体，或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，这种片段还可以含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长约5至500个氨基酸。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段。在激动剂抗CD40抗体的情况下，有用的片段包括但不限于重链和/或轻链的CDR区、可变结构域、包括两个CDR的抗体链的一部分或仅其可变区等。

术语“分离的蛋白质”是指，所述蛋白质：(1)不含至少一些通常与之一起存在的其他蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的在自然界中与之结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离开，(5)与在自然界中不与之结合的多肽有效结合(通过共价或非共价相互作用)，或(6)在自然界中不存在。通常，“分离的蛋白质”占给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA，或其任何组合，可编码这种分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质基本上不含在其自然环境中发现的、会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物。

术语“氨基酸”包括其在本领域中的正常含义。

多肽(例如抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含这样的氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，在该氨基酸序列中插入、缺失和/或取代了一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白。

术语“同一性”是指通过比对和比较序列来确定的两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于所比较的分子中的最小分子的大小进行计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括描述于Computational MolecularBiology,(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编辑),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.编辑),1991,New York:M.Stockton Press；以及Carillo等,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073中的那些。

在计算百分比同一性时，通常以提供序列间最大匹配的方式，比对所比较的序列。可用于确定百分比同一性的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。该计算机算法GAP用于比对待确定其百分比序列同一性的两种多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现其相应氨基酸或核苷酸的最佳匹配(由算法确定的“匹配跨度”)。与该算法结合，使用空位开放罚分(其计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由该具体比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵。在某些实施方案中，该算法也使用标准比较矩阵(PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；BLOSUM62比较矩阵参见Henikoff等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。

使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的百分比同一性时，可使用的参数的实例如下：

a.算法：Needleman等,1970,J.Mol.Biol.48:443-453

b.比较矩阵：来自Henikoff等,1992,上引文的BLOSUM 62

c.空位罚分：12(但末端空位无罚分)

d.空位长度罚分：4

e.相似度阈值：0

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致两个序列中仅一个短区域的匹配，并且即使两个全长序列之间没有显著关系，这个小的对齐区域也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，可以调整所选择的比对方法(GAP程序)，以产生跨越目标多肽的至少50个或其他数量的连续氨基酸的比对。

本文中，二十种常规(例如天然存在)的氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology--A Synthesis(第2版,E.S.Golub and D.R.Gren编辑,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其为了任何目的在此引入作为参考。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如-，-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适宜组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、-羧基谷氨酸、-N,N,N-三甲基赖氨酸、-N-乙酰赖氨酸，O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和-N-甲基精氨酸，以及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。根据标准用法和惯例，在本文使用的多肽注释中，左手方向是氨基端方向，右手方向是羧基端方向。

类似地，除非另有规定，单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向；在与该RNA具有相同序列的DNA链上，位于该RNA转录物5'末端的5'的序列区域称为“上游序列”；在与该RNA具有相同序列的DNA链上，位于该RNA转录物3'末端的3'的序列区域称为“下游序列”。

保守氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸残基，它们通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成而并入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或倒置形式。

本文引用的所有出版物(包括专利、专利申请、期刊文章、实验室手册、书籍或其他文件)的全部公开内容在此引入作为参考。不承认任何参考文献构成现有技术或构成本发明所属领域技术人员的公知常识的一部分。

天然存在的残基可基于共同的侧链性质分为几类：

a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

c.酸性：Asp、Glu；

d.碱性：His、Lys、Arg；

e.影响链取向的残基：Gly、Pro；和

f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守取代可以涉及将这些种类之一的成员交换为另一种类的成员。这种取代的残基可以引入例如人抗体中与非人抗体同源的区域，或者引入分子的非同源区域。

根据某些实施方案，在改变激动剂抗CD40抗体时，可以考虑氨基酸的亲水指数。每种氨基酸已经根据其疏水性和电荷特征分配了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性在本领域中是已知的。Kyte等,J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被取代为具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在某些实施方案中，基于亲水指数进行改变时，包括亲水指数在±2以内的氨基酸的替代。在某些实施方案中，包括亲水指数在±1内的氨基酸的替代，而在某些实施方案中，包括亲水指数±0.5内的氨基酸的替代。

本领域也理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代，尤其是在由此产生的生物性功能蛋白或肽预期用于免疫学实施方案的情况下，如在本情况中。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。

为这些氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代；在某些实施方案中，包括±1内的那些，而在某些实施方案中，包括±0.5内的那些。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区域”。

示例性氨基酸取代列于表2中。

表2：氨基酸取代

术语“衍生物”是指包含化学修饰而不是氨基酸(或核酸)插入、缺失或取代的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可以比未经化学修饰的抗原结合蛋白具有更大的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可具有改善的对所希望的细胞、组织和/或器官的靶向能力。在一些实施方案中，衍生物抗原结合蛋白经共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物附着物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。参见例如美国专利号：4640835、4496689、4301144、4670417、4791192和4179337。在某些实施方案中，衍生物抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括但不限于，单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及此类聚合物的混合物。

在某些实施方案中，衍生物用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物键合在衍生物的一个或多个特定位置，例如氨基端。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物随机附着到衍生物的一个或多个侧链上。在某些实施方案中，PEG用于改善抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于改善人源化抗体的治疗能力。例如，在美国专利号6133426中讨论了某些此类方法，其在此为了任何目地引入作为参考。

肽类似物通常在制药工业中用作与模板肽具有类似性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或“肽模拟物(peptidomimetics)”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber&Freidinger,TINS,392页(1985)；以及Evans等,J.Med.Chem.,30:1229(1987)，其在此为了所有目的引入作为参考。这类化合物通常借助计算机化分子建模开发。结构上类似于治疗用肽的肽模拟物可用于产生类似的治疗或预防效果。通常，肽模拟物在结构上类似于范例多肽(即，具有生物化学性质或药理活性的多肽)，如人抗体，但一个或多个肽键可选地通过本领域公知的方法替代为选自以下的键：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-。在某些实施方案中，可以用相同类型的D-氨基酸系统地取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替换L-赖氨酸)以产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽可以通过本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)，在此为了所有目的引入作为参考)；例如通过添加能够形成环化该肽的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。

说明书通篇中与诸如多肽、核酸、宿主细胞等生物材料结合使用的术语“天然存在的”是指，见于自然界中的材料或见于自然界中的材料形式。

术语“激动剂”是指，与受体结合时可引起细胞反应的化合物。激动剂可以是直接与受体结合的配体。备选地，激动剂可以通过例如以下方式间接与受体结合：(a)与另一个直接与受体结合的分子形成复合物，或(b)以其他方式导致另一化合物的修饰，由此使得该另一化合物直接与受体结合。激动剂可称为特定受体或受体家族的激动剂(例如TNF或TNFR激动剂)。

抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗体的术语“免疫功能性片段”(或简称“片段”)是指一种抗体，其包含抗体的一部分(无论该部分是如何获得或合成的)，其中该部分至少缺乏全长链中存在的一些氨基酸，但仍能够特异性地作为CD40的激动剂发挥作用。这些生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过酶或化学切割抗原结合蛋白(包括完整抗体)产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体(其中重链可变结构与轻链可变结构域位于同一多肽上，通过短肽接头连接，并且该短肽接头太短从而不允许在同一链上的这两个结构域之间配对)、Fab’、F(ab’)₂、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以源自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、驼科动物或兔。还可以想到，本文公开的激动剂抗CD40抗体的功能性部分，例如一个或多个CDR，可以共价结合到第二蛋白质或小分子，以产生针对体内特定靶标的治疗剂，从而具有双功能治疗性质，或具有延长的血清半衰期。本领域技术人员将理解，激动剂抗CD40抗体可包括非蛋白质组分。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。

“Fc”区包含两个含有抗体CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或多个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。

“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。

“Fab’片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，该部分包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，由此使得两个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab’)₂分子。

“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。

“单链抗体”是Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接，形成单条多肽链，其形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开号WO 88/01649以及美国专利号4946778和5260203中详细讨论，其公开内容引入作为参考。

“结构域抗体”是一种免疫功能性免疫球蛋白片段，仅包含重链的可变区或轻链的可变区。在一些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。

本文所用的“基本上纯的”是指所描述的分子种类是存在的主要种类，也就是说，在摩尔基础上，它比同一混合物中的任何其他分子种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是这样的组合物，其中目标分子占所有存在的大分子物质的至少50％(基于摩尔)。在其他实施方案中，基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子物质的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，目标分子被纯化至基本上均一的，其中通过常规检测方法无法在组合物中检测到污染分子，因此该组合物由单种可检测到的大分子组成。

术语“活性剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。

本文所用的术语“标记”或“标记的”是指可检测标记物的掺入，例如掺入放射性标记的氨基酸；或将生物素部分附着到多肽，其中生物素部分可通过标记的亲和素(例如，含有荧光标记的链霉亲和素)检测；或掺入可通过光学或比色法检测的酶活性。在某些实施方案中，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的，并且可以使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告分子识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在某些实施方案中，标记物通过各种长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间位阻。

术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物(优选人)中产生治疗反应的激动剂抗CD40抗体的量。这种治疗有效量很容易由本领域普通技术人员确定。

本文中所用的术语“药物组合物”(或活性剂或药物)是指在适当地对患者施用时能够诱导所希望的治疗效果的化合物、组合物、活性剂或药物。它不一定需要一种以上的成分。

在本说明书通篇中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或诸如“包括”或“含有”的变形将理解为包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文中使用的术语的其他定义可在本发明的详细描述中找到并通篇适用。除非另有定义，否则本文中使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本文描述的本发明可以包括一个或多个数值范围(例如尺寸、位移和场强等)。数值范围将理解为包括该范围内的所有值，包括定义该范围的值、以及与该范围相邻的值，该相邻值导致与定义该范围边界的值紧邻的值相同或基本相同的结果。例如，本领域技术人员将理解，范围的上限或下限的10％变化是完全合适的，并且为本发明所涵盖。更特别地，范围的上限或下限的变化为5％，或为本领域所公认的变化，并且以较大者为准。

在本说明书通篇中，使用了相对性语言，如“约”和“大约”。该语言试图将至少10％的变异性纳入指定的数量或范围。该变异性可以是所指定的具体数量的+10％或-10％。

实施方案

A.激动剂抗CD40抗体

在以有效量施用时，本发明的激动剂抗CD40抗体可以调节至少一种或多种以下功能：

a.增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递；或

b.增强MHC和/或免疫共刺激分子(如CD86、CD80、CD83、PD-L1、HLA-A、B、C或HLA-DR)的表达；或

c.刺激促炎细胞因子(如IL-12、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ)的产生；或

d.诱导T细胞激活；或

e.模拟CD40L的信号并替代CD4+淋巴细胞的功能；或

f.克服荷瘤动物的T细胞耐受性；或

g.引起有效的细胞毒性T细胞反应；或

h.增强抗肿瘤疫苗的有效性；或

i.使得肿瘤血管系统更容易发生免疫浸润。

在一些实施方案中，所提供的激动剂抗CD40抗体是包含本文所述的一个或多个CDR的多肽。在一些激动剂抗CD40抗体中，CDR嵌入“构架”区，所述构架区使CDR定向，由此实现所述CDR的适当结合特性。

本文公开的本发明抗体具有多种用途。如本文所述，它们可用于多种治疗应用。例如，在一些实施方案中，激动剂抗CD40抗体可用于治疗恶性病症，包括但不限于与其他活性剂如IL-2一起施用。激动剂抗CD40抗体的其他用途包括，例如，疾病状态或状况的诊断以及用于确定CD40的存在或缺乏的筛选测定。本文中描述的一些激动剂抗CD40抗体也可用于治疗与抗原呈递增加相关的后果、症状和/或病理。

在一方面，本发明包括分离的激动剂抗CD40抗体或其片段，其包含(i)含有三个CDR的VH链和(ii)含有三个CDR的VL链，其中一个或多个重链互补决定区(CDRH)选自：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；或

在一些实施方案中，所提供的激动剂抗CD40抗体包含一个或多个CDR(例如1、2、3、4、5或6个CDR)。在一些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含(a)多肽结构和(b)插入和/或连接到该多肽结构的一个或多个CDR。所述多肽结构可以采取多种不同的形式。例如，它可以是或包含天然存在的抗体的构架或其片段或变体，或者可以是完全合成的。下面进一步描述各种多肽结构的实例。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体的多肽结构是抗体或源自抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)、以及所述每一者的部分或片段。在某些情况下，激动剂抗CD40抗体是抗体的免疫学片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂或scFv)。本文进一步描述和定义了多种结构。

在本发明第一方面的一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体还包含：

a)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

b)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

c)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；或

d)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含：

A：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；或

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；和

B：

c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

d)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

e)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；或

f)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；

c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

d)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

e)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；和

f)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ IDNO:7的重链可变区。在本发明第一方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。在本发明第一方面的另一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区。

SEQ ID NO:7包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。SEQ ID NO:8包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施方案中，将包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的抗体称为SVX-3001。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体是人源化抗人抗体。

在一个实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。优选地，该分离的激动剂抗CD40抗体为IgG1型。

在尤其优选的实施方案中，该分离的激动剂抗CD40抗体包含SEQ ID NO:19的重链序列和/或SEQ ID NO:20的轻链序列。

所提供的其他抗体是由SEQ ID NO:7和8中所示的可变重链和可变轻链的组合或子部分形成的上述激动剂抗CD40抗体的变体，其包含分别与SEQ ID NO:7和8中的序列(整个序列或序列的子部分，例如一个或多个CDR)的氨基酸序列具有至少50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或99％以上同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，这样的抗体包含至少一条重链和一条轻链，而在其他情况下，所述变体形式包含两条相同的轻链和两条相同重链(或其子部分)。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的重链，该可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的重链，该可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的重链，该可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQID NO:19的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列的重链。

在一些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含与如下的一个或多个CDR具有至少90％、90-95％和/或95-99％同一性的序列，其中所述的一个或多个CDR来自SEQ ID NO:1至3和4至6的至少一个序列中的CDR。在一些实施方案中，存在1、2、3、4、5或6个CDR(各自与上述序列至少90％、90-95％和/或95-99％同一性)。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的轻链，该可变区包含与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的轻链，该可变区包含与SEQ ID NO:8至少95％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有可变区的轻链，该可变区包含与SEQ ID NO:8至少99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQ ID NO:20至少90％相同的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQ ID NO:20至少95％相同的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体包含含有与SEQ IDNO:20至少99％相同的氨基酸序列的轻链。

在一个实施方案中，分离的激动剂抗CD40抗体增强CD40活性。

B.激动剂抗CD40抗体的制备

在一个实施方案中，本发明包括制备本文所述的激动剂抗CD40抗体的方法，其包括从分泌该激动剂抗CD40抗体的宿主细胞制备该激动剂抗CD40抗体的步骤。

通常，CD40的完全单克隆激动剂抗体可以如下产生。用目的CD40免疫含有免疫球蛋白基因的小鼠，自小鼠获得表达抗体的淋巴细胞(如B细胞)。将这种回收的细胞与髓样细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系，筛选和选择这些杂交瘤细胞系以鉴定产生对目的抗原特异的抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供产生对CD40特异的激动剂抗体的杂交瘤细胞系的制备。

在某些实施方案中，用噬菌体展示技术来产生单克隆抗体。在某些实施方案中，这种技术产生单克隆抗体。在某些实施方案中，编码单个Fab或Fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体颗粒的表面上表达。参见例如Hoogenboom等,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,JMol Biol222:581(1991)；美国专利号5885793。在某些实施方案中，“筛选”噬菌体以鉴定那些对靶标具有亲和力的抗体片段。因此，某些这种方法模拟免疫选择，通过在丝状噬菌体表面展示抗体片段库，随后通过其与靶标的结合来选择噬菌体。在某些这种方法中，分离高亲和力功能性抗体片段。在某些这种实施方案中，通过从外周血淋巴细胞克隆自然重排的V基因来创建完整的抗体基因库。参见例如Mullinax等,Proc Natl Acad Sci(USA),87:8095-8099(1990)。

根据某些实施方案，本发明的抗体是通过利用转基因小鼠制备的，该转基因小鼠具有插入的实质性部分的抗体产生基因组，但在内源性鼠抗体产生方面具有缺陷。因此，这种小鼠能够产生免疫球蛋白分子和抗体，并且缺乏小鼠免疫球蛋白和抗体的产生。用于达到此结果的技术公开在本文说明书中引用的专利、申请和参考文献中。在某些实施方案中，可以采用诸如PCT公开申请号WO 98/24493或Mendez等,Nature Genetics,15:146-156(1997)中公开的方法，其在此为了所有目的引入作为参考。

在某些实施方案中，通过在体外使脾细胞(B或T细胞)暴露于抗原，然后在免疫受损的小鼠(例如SCID或nod/SCID)中重建该暴露的细胞，来产生对CD40特异的激动剂抗体。参见例如Brams等,J.Immunol.160:2051-2058(1998)；Carballido等,Nat.Med.,6:103-106(2000)。在某些此类方法中，将胎儿组织植入SCID小鼠(SCID-hu)导致长期血细胞生成和人T细胞发育。参见例如McCune等,Science,241:1532-1639(1988)；Ifversen等,Sem.Immunol.,8:243-248(1996)。在某些情况下，这种嵌合小鼠中的体液免疫反应依赖于动物体内T细胞的共同发育。参见例如Martensson等,Immunol.,83:1271-179(1994)。在某些方法中，将外周血淋巴细胞移植到SCID小鼠体内。参见例如Mosier等,Nature,335:256-259(1988)。在某些这种实施方案中，在用引发剂如葡萄球菌肠毒素A(SEA)处理这种移植细胞时，检测到更高水平的B细胞产生。参见例如Martensson等,Immunol.,84:224-230(1995)；Murphy等,Blood,86:1946-1953(1995)。

如将理解的，抗体可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适宜的哺乳动物宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法进行，包括例如将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体)中并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者通过本领域已知的转染方法进行，如美国专利号4399216、4912040、4740461和4959455(这些专利在此引入作为参考)所举例。所使用的转化方法取决于要转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法为本领域公知，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中、以及将DNA直接显微注射到细胞核中。

可用作表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域公知，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平并且产生对CD40特异的激动剂抗体来选择尤其优选的细胞系。

在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型中的至少一种的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人κ轻链和/或人重链。在某些实施方案中，重链为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些实施方案中，克隆激动剂CD40抗体用于在哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的任何恒定区之外的恒定区。

在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人λ轻链和人IgG2重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人λ轻链和人IgG4重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人λ轻链和人IgG1重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人λ轻链和人IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在其他实施方案中，激动剂CD40抗体包含人κ轻链和人IgG2重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人κ轻链和人IgG4重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人κ轻链和人IgG1重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含人κ轻链和人IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含连接到恒定区的抗体可变区，其中所述恒定区既不是IgG2同种型的恒定区也不是IgG4同种型的恒定区。优选地，激动剂CD40抗体包含人IgG1重链和轻链。在某些实施方案中，克隆激动剂CD40抗体用于在哺乳动物细胞中表达。

在某些实施方案中，对来自本文所述杂交瘤系中至少一个的抗体的重链和轻链的保守修饰，将产生激动剂CD40抗体，其具有与来自杂交瘤系的抗体相似的功能和化学特性。相反，在某些实施方案中，可以通过重链和轻链氨基酸序列中选择性取代来达到激动剂CD40抗体的功能和/或化学特性的实质性改变，其中所述取代在维持(a)取代区域中分子骨架的结构(例如片层或螺旋构象)、(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链的体积方面具有显著不同的影响。

例如，“保守氨基酸取代”可以涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。此外，也可以用丙氨酸取代多肽中的任何天然残基，如先前针对“丙氨酸扫描诱变”所描述的。

期望的氨基酸取代(无论是保守取代还是非保守取代)可以由本领域技术人员在需要这样的取代时确定。在某些实施方案中，氨基酸取代可用于鉴定激动剂CD40抗体的重要残基，或提高或降低激动剂CD4抗体的激动剂活性，如本文所述。

在某些实施方案中，激动剂CD40抗体包含一个或多个多肽。在某些实施方案中，多种表达载体/宿主系统中的任何一种均可用于表达编码多肽的多核苷酸分子，所述多肽包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或该激动剂抗CD40抗体本身。此类系统包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

在某些实施方案中，包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽，在酵母中重组表达。某些这种实施方案使用市售表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen,San Diego,CA)，按照制造商的说明进行。在某些实施方案中，这种系统依赖于前原α(pre-pro-alpha)序列来指导分泌。在某些实施方案中，插入片段的转录在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。

在某些实施方案中，从酵母生长培养基纯化包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的分泌多肽。在某些实施方案中，用于从酵母生长培养基纯化多肽的方法，与用于从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化多肽的方法相同。

在某些实施方案中，将编码包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽的核酸，克隆到杆状病毒表达载体如pVL1393(PharMingen,SanDiego,CA)中。在某些实施方案中，这种载体可根据制造商的说明(PharMingen)用于在无sF9蛋白质培养基中感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞并产生重组多肽。在某些实施方案中，使用肝素-琼脂糖柱(Pharmacia)从这种培养基纯化和浓缩多肽。

在某些实施方案中，包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽，在昆虫系统中表达。用于多肽表达的某些昆虫系统为本领域技术人员公知。在一个这种系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)用作载体，在草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾属(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。在某些实施方案中，编码多肽的核酸分子可以插入病毒的非必需基因中，例如，多角体蛋白基因内，并置于该基因的启动子的控制下。在某些实施方案中，核酸分子的成功插入将使该非必需基因失活。在某些实施方案中，该失活导致可检测的特性。例如，多角体蛋白基因的失活导致产生缺乏衣壳蛋白的病毒。

在某些实施方案中，重组病毒可用于感染草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾属幼虫。参见例如Smith等,J.Virol.,46:584(1983)；Engelhard等,Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),91:3224-7(1994)。

在某些实施方案中，包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽在细菌细胞中制备，并作为不溶性包涵体在细菌中产生。在某些实施方案中，通过离心收集包含这种包涵体的宿主细胞；在0.15M NaCl、10mM Tris,pH 8、1mM EDTA中洗涤；并在室温下用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma,St.Louis,MO)处理15分钟。在某些实施方案中，通过超声处理澄清裂解物，并通过在12000X g下离心10分钟沉淀细胞碎片。在某些实施方案中，将含有多肽的沉淀重悬在50mM Tris,pH 8和10mM EDTA中；置于50％甘油上；在6000Xg下离心30分钟。在某些实施方案中，可以将沉淀重悬在不含Mg⁺⁺和Ca⁺⁺的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。在某些实施方案中，通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离重悬的沉淀来进一步纯化多肽(参见例如Sambrook等,上引文)。在某些实施方案中，可以将这种凝胶浸泡在0.4M KCl中以显示蛋白质，可以切出该蛋白质并在无SDS的凝胶运行缓冲液中电洗脱。根据某些实施方案，作为可溶性蛋白在细菌中产生谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。在某些实施方案中，使用GST纯化模块(Pharmacia)纯化这种GST融合蛋白。

在某些实施方案中，期望“重折叠”某些多肽，例如包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽。在某些实施方案中，使用本文所讨论的某些重组系统产生此类多肽。在某些实施方案中，“重折叠”和/或氧化多肽以形成所希望的三级结构和/或产生二硫键。在某些实施方案中，这种结构和/或连接与多肽的某些生物活性有关。在某些实施方案中，使用本领域已知的许多方法中的任何一种来实现重折叠。示例性方法包括但不限于，在离液剂的存在下使溶解的多肽活性剂暴露于通常高于7的pH。一种示例性离液剂是胍。在某些实施方案中，重折叠/氧化溶液还含有还原剂和该还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以一定比例存在，该比例将产生允许发生二硫键改组的特定氧化还原电位。在某些实施方案中，这种改组允许形成半胱氨酸桥。示例性氧化还原对包括但不限于，半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代二GSH、亚铜离子/氯离子、二硫苏糖醇DTT/氧化DTT(dithiane)、和2-巯基乙醇(bME)/二硫代bME。在某些实施方案中，使用共溶剂来提高重折叠的效率。示例性共溶剂包括但不限于甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。

在某些实施方案中，基本上纯化包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽。某些蛋白质纯化技术是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，蛋白质纯化涉及从非多肽级分粗分离多肽级分。在某些实施方案中，使用层析和/或电泳技术纯化多肽。示例性纯化方法包括但不限于硫酸铵沉淀；PEG沉淀；免疫沉淀；热变性后离心；层析，包括但不限于亲和层析(例如蛋白质A-琼脂糖)、离子交换层析、排阻层析和反相层析；凝胶过滤；羟基磷灰石层析；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；以及这些技术和其他技术的组合。在某些实施方案中，多肽通过快速蛋白质液相层析或高压液相层析(HPLC)纯化。在某些实施方案中，可以改变纯化步骤或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的多肽的适宜方法。

在某些实施方案中，定量多肽制备物的纯化程度。本领域技术人员已知用于定量纯化程度的某些方法。某些示例性方法包括但不限于，测定制备物的特异性结合活性，以及通过SDS/PAGE分析评估制备物中多肽的量。用于评估多肽制备物的纯化量的某些示例性方法包括，计算制备物的结合活性并将其与初始提取物的结合活性进行比较。在某些实施方案中，这种计算的结果表示为“纯化倍数”。用于表示结合活性量的单位取决于所进行的具体测定。

在某些实施方案中，部分纯化包含一种或多种激动剂抗CD40抗体组分或激动剂抗CD40抗体本身的多肽。在某些实施方案中，可以通过使用更少的纯化步骤或通过使用不同形式的相同通用纯化方案来达到部分纯化。例如，在某些实施方案中，使用HPLC设备进行的阳离子交换柱层析通常会比使用低压层析系统的相同技术产生更大的“纯化倍数”。在某些实施方案中，导致较低纯化程度的方法可在多肽的总回收率或维持多肽的结合活性方面具有优势。

在某些情况下，多肽的电泳迁移会随着SDS/PAGE的不同条件而变化，有时会显著变化。参见例如Capaldi等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,76:425(1977)。应理解，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的多肽的表观分子量可以不同。

C.编码激动剂抗CD40抗体的核酸分子

在一个实施方案中，本发明包括编码本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体的核酸分子。

本领域技术人员将认识到，上述讨论可用于鉴定、评价和/或产生激动剂抗CD40抗体，也可用于可编码这些抗体的核酸序列。因此，考虑编码这些抗体的核酸序列。例如，抗体可与SEQ ID NO:9或10中所述的至少一个核酸序列或与SEQ ID NO:9或10的核酸序列编码的至少1个至6个CDR(及其各种组合)具有至少80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或更大的同一性。

在一些实施方案中，在本发明内考虑这样的抗体(或编码它的核酸序列)，其中编码该特定抗体的核酸序列(或该核酸序列本身)能够在严格条件下选择性地与编码蛋白质SEQ ID NO:7和8的任何核酸序列杂交。在一个实施方案中，适宜的中等严格性条件包括在5×SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃在5xSSC中或在交叉物种同源性的情况下在45℃在0.5xSSC中过夜杂交；然后在65℃洗涤两次20分钟，每次用含有0.1％SDS的2x、0.5x和0.2xSSC进行。这种杂交DNA序列也在本发明的范围内，基于密码简并性而编码由杂交DNA序列编码的抗体多肽的核苷酸序列和由这些核酸序列编码的氨基酸序列也在本发明的范围内。在一些实施方案中，CDR的变体包括与上述序列内的一个或多个CDR杂交的核酸序列和由这些序列编码的氨基酸序列。

本文中提到的短语“选择性杂交”是指可检测的选择性结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段可以在如下杂交和洗涤条件下选择性地与核酸链杂交，所述条件使可检测到的与非特异性核酸的结合量最小化。高严格性条件可用于达到本领域已知和本文讨论的选择性杂交条件。通常，本发明的多核苷酸、寡核苷酸和片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80％，更通常具有至少85％、90％、95％、99％和100％的优选递增的同源性。如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则它们是同源的。例如，85％同源性意味着在两个序列为了最大匹配而比对时，85％的氨基酸是相同的。允许(在两个匹配的序列中的任何一个序列中)有空位以使匹配最大化；空位长度优选为5或更小，更优选为2或更小。备选地且优选地，如果使用程序ALIGN以及突变数据矩阵和6或更大的空位罚分，两个蛋白质序列(或源自它们的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)的比对得分大于5(以标准差单位计)，则两个蛋白质序列(或源自它们的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)是同源的，如本文中所使用的此术语。参见Dayhoff,M.O.,in Atlas of Protein Sequence andStructure,101-110页(5卷,National Biomedical Research Foundation(1972))和本卷附录2，1-10页。更优选地，如果两个序列或其部分的氨基酸在使用ALIGN程序最佳比对后大于或等于50％相同，则它们是同源的。本文中，术语“对应于”用于指，一个多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即相同，非严格进化相关)、或一个多肽序列与参考多肽序列相同。相反，本文中，术语“互补”用于指，互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATA”，并与参考序列“GTATA”互补。

在一个实施方案中，本发明包括包含本文所述核酸分子的载体。

在一个实施方案中，本发明包括包含本文所述核酸分子的宿主细胞。

D.包含至少一种激动剂抗CD40抗体的组合物

在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体的组合物。优选地，该组合物是药物组合物。因此，在本发明的一个优选实施方案中，涵盖含有至少一种本文所述的分离的激动剂抗CD40抗体和可药用赋形剂的药物组合物。

在一个备选实施方案中，本发明提供包含激动剂抗CD40抗体以及可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。

在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含激动剂抗CD40抗体和治疗有效量的至少一种其他治疗剂，以及可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

在该组合物包含至少一种其他治疗剂时，该治疗剂优选选自放射性同位素、放射性核素、毒素或治疗和化疗基团。因此，在优选的形式中，本发明包括药物制剂，该药物制剂包含：有效量的本文公开的至少一种激动剂抗CD40抗体以及至少一种第二免疫增强剂。治疗剂包括但不限于体外合成制备的化学组合物、抗体、抗原结合区，及其组合和缀合物。在某些实施方案中，治疗剂可充当激动剂、拮抗剂、变构调节剂或毒素。在某些实施方案中，治疗剂可以发挥作用来抑制或刺激其靶标，从而促进对恶性肿瘤的免疫反应。此类免疫增强剂包括但不限于IL-2、TLR-7激动剂或全身细胞毒性化疗剂。

在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所使用的剂量和浓度下对受体无毒性。在一些实施方案中，制剂材料用于皮下注射和/或肿瘤内施用。在某些实施方案中，药物组合物可包含用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在某些实施方案中，适宜的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其他糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如pluronics、PEG、失水山梨醇酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露醇，山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company(1995)。在一些实施方案中，制剂包含PBS；20mM NaOAC，pH5.2，50mM NaCl；和/或10mM NAOAC，pH 5.2，9％蔗糖。

在某些实施方案中，激动剂抗CD40抗体和/或治疗分子与本领域已知的半衰期延长载体连接。此类载体包括但不限于聚乙二醇、糖原(例如ABP的糖基化)和葡聚糖。例如，在美国申请序列号09/428082(现在的美国专利号6660843)和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述了此类载体，在此为了所有目的引入作为参考。

在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的给药途径、递送形式和期望的剂量来确定。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,上引文。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在某些实施方案中，药物组合物中的主要溶媒或载体可以是水性或非水性的。例如，在某些实施方案中，适宜的溶媒或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有胃肠外施用组合物中常见的其他材料。在一些实施方案中，盐水包括等渗磷酸缓冲盐溶液。在某些实施方案中，中性缓冲盐溶液或与血清白蛋白混合的盐溶液是其他示例性溶媒。在某些实施方案中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，因此其可进一步包含山梨醇或适宜的替代物。在某些实施方案中，可通过将具有所希望纯度的所选组合物与可选的配制剂(Remington's PharmaceuticalSciences,上引文)混合，以冻干饼或水溶液形式，制备含有激动剂抗CD40抗体(加上或不加上至少一种其他治疗剂)的组合物，用于储存。此外，在某些实施方案中，包含激动剂抗CD40抗体(加上或不加上至少一种其他治疗剂)的组合物可以使用适宜的赋形剂如蔗糖配制成冻干物。

在某些实施方案中，可以选择药物组合物用于胃肠外递送。这种可药用组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。

在某些实施方案中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，使用缓冲液将组合物保持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

在某些实施方案中，在考虑胃肠外(优选肿瘤内或肿瘤周围)施用时，治疗组合物可以是无热原、胃肠外可接受的水溶液的形式，其在可药用溶媒中包含所希望的激动剂抗CD40抗体(加上或不加上其他治疗剂)。在某些实施方案中，用于胃肠外注射的溶媒是无菌蒸馏水，其中将具有或不具有至少一种其他治疗剂的激动剂抗CD40抗体配制成无菌等渗溶液，并适当保存。在某些实施方案中，该制备可涉及用如下物质配制所需分子，其中所述物质为例如可注射微球、生物可蚀颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、小球或脂质体，其可提供产品的受控或持续释放，该产品随后可通过储库(depot)注射来递送。

在某些实施方案中，药物组合物可涉及将有效量的激动剂抗CD40抗体，组合或不组合至少一种其他治疗剂，与适合用于制备片剂的无毒赋形剂混合。在某些实施方案中，通过将片剂溶解在无菌水中或另一种适宜的溶媒中，可以制备单位剂量形式溶液。在某些实施方案中，适宜的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

对本领域技术人员而言，其他药物组合物是显而易见的，包括涉及激动剂抗CD40抗体、具有或不具有至少一种其他治疗剂、在持续或控制递送制剂中的制剂。在某些实施方案中，本领域技术人员还已知用于配制各种其他持续或受控递送手段的技术，如脂质体载体、生物可蚀微粒或多孔小球和储库型注射液。参见例如PCT申请号PCT/US93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。在某些实施方案中，持续释放制剂可以包括成形制品形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(U.S.3,773,919和EP 058481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等,Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等,上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133988)。在某些实施方案中，持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任一种制备。参见例如Eppstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可以通过无菌过滤膜过滤来达到。在某些实施方案中，在将组合物冷冻干燥时，使用该方法的除菌可以在冻干和复溶之前或之后进行。在某些实施方案中，用于胃肠外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中，胃肠外组合物通常放置在具有无菌出入口的容器中，例如具有可通过皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

在某些实施方案中，一旦配制了药物组合物，它可以作为溶液、悬液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉储存在无菌瓶中。在某些实施方案中，此类制剂可以以即用形式或以在施用前复溶的形式(例如冻干形式)储存。

在某些实施方案中，提供用于产生单剂量施用单位的药盒。在某些实施方案中，药盒可以包含具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，包括包含单室和多室预充注射器(例如液体注射器和lyosyringe)的药盒。

在某些实施方案中，待治疗用的包含激动剂抗CD40抗体(组合或不组合至少一种其他治疗剂)的药物组合物的有效量将例如取决于治疗背景和目标。本领域技术人员将认识到，根据某些实施方案，用于治疗的适当剂量水平因此将部分地取决于所递送的分子、使用激动剂抗CD40抗体(组合或不组合至少一种其他治疗剂)的适应症、给药途径、个体的体型大小(体重、体表、肿瘤大小或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康)而变。在某些实施方案中，临床医生可以滴定剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。在某些实施方案中，取决于上述因素，典型剂量可以在约0.1μg/kg至至多约100mg/kg或更高的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在0.1μg/kg至约100mg/kg、或1μg/kg至约100mg/kg、或5μg/kg至约100mg/kg的范围内。例如，有效剂量优选在20μg/kg和200μg/kg之间。因此，在患者接受6个剂量时，2周内相应的总剂量在120μg/kg至1.2mg/kg之间。

在某些实施方案中，给药频率将考虑所用制剂中激动剂抗CD40抗体和/或任何其他治疗剂的药代动力学参数。在某些实施方案中，临床医生将施用该组合物，直到达到实现期望效果的剂量。因此，在某些实施方案中，组合物可作为单个剂量或作为两个或多个剂量(其可包含或不包含相同量的期望分子)在一段时间施用，或经由植入装置或导管进行连续输注施用。适当剂量的进一步细化由本领域普通技术人员常规地进行，并且属于其常规工作范畴。在某些实施方案中，可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当的剂量。

在某些实施方案中，药物组合物的给药途径符合已知方法。优选通过瘤内或瘤周注射，然而，在配制组合物用于部位特异性递送的情况下，其他给药途径可以是合适的。此类给药途径可包括静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、动脉内、门静脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可以通过推注或连续输注或通过植入装置施用。

在某些实施方案中，组合物可通过植入已吸收或包封所希望的分子的膜、海绵或其他合适材料来局部施用。在使用植入装置的某些实施方案中，该装置可以植入任何合适的组织或器官，并且所希望的分子的递送可以通过扩散、定时释放药团(bolus)或连续给药进行。

E.用于治疗或预防病症的方法

在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。

个体中抗原呈递细胞的激活可通过本领域已知的测定方法来测量。例如，来自该个体的激活的抗原呈递细胞的抗原呈递，可使用病毒抗原回忆测定试验(antigen recallassay)来测量，其中在激动剂抗CD40抗体的存在下，用EBV抗原攻击来自先前暴露过EB病毒(EBV)的人供体的PBMC。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中激活树突细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。

个体中树突细胞的激活可通过本领域已知的测定试验来测量。例如，来自该个体的激活的树突细胞对T细胞的刺激作用，可使用混合淋巴细胞反应来测量。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中增强MHC和/或免疫共刺激分子的表达的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体。优选地，该MHC和/或免疫共刺激分子选自CD80、CD86、PD-L1、HLA-A、B、C、HLA-DR和CD83。

个体中MHC和/或免疫共刺激分子的表达可通过本领域已知的测定试验来测量。例如，在来自该个体的细胞中MHC和/或免疫共刺激分子的表达可使用荧光激活细胞分选测定来测量。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中刺激产生促炎细胞因子的方法，其包括施用有效量的至少本文公开的激动剂抗CD40抗体。优选地，该促炎细胞因子选自IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23和IFN-γ。

个体中促炎细胞因子的表达可通过本领域已知的测定试验来测量。例如，来自该个体的细胞中促炎细胞因子的表达可使用ELISA或LEGENDplex测定来测量。

在一个实施方案中，本发明包括用于在个体中克服荷瘤动物中的T细胞耐受性或引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞以及刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体。

肿瘤根除所需事件的复杂协作关系提示，联合治疗方法在某些情况下也可以是有益的。激动剂抗CD40抗体可与用于释放抗原、促进细胞因子释放、增加免疫监视和减少抑制网络的附加药物一起施用以增强此效应。

IL-2和CD40激动剂的共施用

一种治疗选择是改变肿瘤微环境本身，促进肿瘤作为其自身抗原刺激的来源。这可以通过将IL-2组合抗CD40抗体引入肿瘤部位或其附近来达到。在直接共注射时，该共同施用可以避免全身施用相关毒性，并成功地导致较大肿瘤以及远端肿瘤的消退，同时保持长期保护性记忆。IL-2和CD40激动剂的共同施用可导致巨噬细胞活性和B细胞激活的增加。IL-2和CD40激动剂的组合可以显示出对多种癌症的显著益处，癌症的消退与中性粒细胞和T细胞共显性(co-dominant)炎症反应相关。

因此，在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括用于在个体中增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中激活抗原呈递细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

个体中抗原呈递细胞的激活可通过本领域已知的测定试验来测量。例如，来自该个体的激活的抗原呈递细胞的抗原呈递，可使用病毒抗原回忆测定试验来测量，其中在激动剂抗CD40抗体的存在下用EBV抗原攻击来自先前暴露于EB病毒(EBV)的人供体的PBMC。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中激活树突细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

个体中MHC和/或免疫共刺激分子的表达可通过本领域已知的测定来测量。例如，来自该个体的细胞中MHC和/或免疫共刺激分子的表达可使用荧光激活细胞分选测定来测量。

个体中促炎细胞因子的表达可通过本领域已知的测定来测量。例如，来自该个体的细胞中促炎细胞因子的表达可使用ELISA或LEGENDplex测定来测量。

在一个实施方案中，本发明包括用于在个体中克服荷瘤动物中的T细胞耐受性或引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种本文所述的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

在一个实施方案中，本发明包括在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞以及刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的本文公开的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

因此，在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括随时间推移依次对有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体以及其他治疗干预。在一些实施方案中，所述其他治疗干预选自手术、放疗、化疗、热疗和免疫治疗。

一种治疗选择是改变从患者分离的细胞，然后将这些细胞转移回患者体内。这可以通过用抗CD40抗体处理从患者分离的细胞来达到。用抗CD40抗体处理的细胞可以用其他活性剂处理。在一些实施方案中，该活性剂选自肿瘤特异性肽、肿瘤细胞裂解物、细胞因子、激动剂和促分裂原。

因此，在一个实施方案中，本发明包括用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用经有效量的至少一种本文公开的分离的激动剂抗CD40抗体处理的细胞。在一些实施方案中，该细胞已从患者分离，并选自DC、巨噬细胞、B细胞、髓样细胞、淋巴样细胞和造血干细胞。

本发明的其他特征在以下实施例中更充分地描述。然而，应理解，包括此详细描述仅仅是为了示例本发明的目的，并且不应以任何方式理解为对上文本发明的广泛描述构成限制。

实施例

实施例1-SVX-3001抗体的产生

序列数据

人源化激动剂抗人CD40抗体的重链(SEQ ID NO 13，图1)和人源化激动剂抗人CD40抗体的轻链(SEQID NO 14，图2)的核苷酸序列从North Coast Biologics获得。在图1和图2中，HindIII和XbaI位点用粗体显示，重链和轻链的编码序列用下划线表示。将该人源化激动剂抗人CD40抗体命名为SVX-3001。标识出SVX-3001的重链可变区(SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 7，图3)和SVX-3001的轻链可变区(SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 8，图4)的编码序列和氨基酸序列以及互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。在图3和图4中，互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的氨基酸序列以粗体显示。

基因合成和克隆

带有用于克隆的HindIII和XbaI限制酶位点的编码SVX-3001重链(SEQ ID NO 15，图5)和SVX-3001轻链(SEQ IDNO 17，图6)的DNA序列由GenScript HK合成，并克隆到载体pcDNA3.1(+)中，以分别产生质粒pcDNA3.1(+)_Selvax01HC(图7)和pcDNA3.1(+)_Selvax01LC(图8)。Genscript HK提供了TE缓冲液中的各100μg转染级(≥90％超螺旋，≤0.01EU/ug内毒素)质粒。在图5和图6中，HindIII和XbaI位点用粗体显示，编码序列用下划线表示。重/轻链可变区的氨基酸序列以纯文本显示，信号肽序列以粗体显示，人IgG1重链恒定区/人κ轻链恒定区以下划线显示。

含SVX-3001抗体的上清液的产生

转染前一天，将HEK 293T细胞于含有10％ FCS(Hyclone)的DMEM(Gibco)中以4x10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔组织培养板(Corning Falcon)中。转染前3小时取出培养基，用1.5ml/孔DMEM+1％FCS替换。通过在含有300μl DMEM(无添加剂)的无菌管中加入1.5μgpcDNA3.1(+)_Selvax01HC DNA和1.5μg pcDNA3.1(+)_Selvax01LC DNA，然后加入6μl 1μg/ml的25kD线性聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)并涡旋混匀，制备转染混合物。将转染混合物在室温下孵育10分钟，然后加入细胞。细胞在37℃下孵育3小时，然后加入1.5ml/孔DMEM+10％FCS。然后将细胞返回到37℃、5％CO2培养。

在转染后18小时和转染后2天收集来自瞬时转染细胞的含有SVX-3001抗体的上清液，并用DMEM+10％FCS替换。在转染后7天最后一次收集培养上清液。离心所有培养上清液以去除细胞碎片，并在4℃下储存。

纯化的SVX-3001抗体的产生

转染前一天，将HEK 293T细胞于含有10％超低IgG FCS(Gibco)的DMEM(Gibco)中以4x 10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔组织培养板(Corning Falcon)中。转染前3小时取出培养基，用1.5ml/孔DMEM+1％超低IgG FCS替换。通过在含有300μl DMEM(无添加剂)的无菌管中加入1.5μg pcDNA3.1(+)_Selvax01HC和1.5μg p pcDNA3.1(+)_Selvax01LC，然后加入6μl 1μg/ml的25kD线性聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)并涡旋混匀，制备转染混合物。将转染混合物在室温下孵育10分钟，然后加入细胞。细胞在37℃下孵育3小时，然后加入1.5ml/孔DMEM+10％超低IgG FCS。然后将细胞返回到37℃、5％CO2培养。

在转染后2天和转染后5天收集来自瞬时转染细胞的含有SVX-3001抗体的上清液，并用DMEM+10％超低IgG FCS替换。在转染后7天最后一次收集培养上清液。合并不同时间点的培养上清液，通过0.22μm滤器过滤，并在4℃下储存。在Harry Perkins医学研究所单克隆抗体机构，使用蛋白G从合并的上清液纯化SVX-3001抗体。纯化的SVX-3001抗体在PBS中以1mg/ml提供。

实施例2-ELISA检测对人CD40具有特异性的人IgG

使用带有平板的IgG(总)人ELISA试剂盒(Invitrogen)进行ELISA。用100μl/孔推荐浓度的纯化抗人IgG单克隆捕获抗体或1μg/ml具有C端6His标签的重组人CD40胞外结构域(Novoprotein)包被ELISA平板(Corning Costar)的孔。将平板在4℃下孵育过夜。用400μl/孔洗涤缓冲液洗涤孔两次，然后加入250μl/孔封闭缓冲液。将平板在室温下孵育2小时。用400μl/孔洗涤缓冲液洗涤孔两次，然后加入100μl/孔从100ng/ml至1.56ng/ml系列1/2稀释的重组人IgG标准品、从约100ng/ml至1.56ng/ml系列1/2稀释的对照抗CD40抗体Lob 7/4IgG1(南安普顿大学)以及从1/10至1/10000系列1/10稀释的来自用质粒pcDNA3.1(+)_Selvax01HC和pcDNA3.1(+)_Selvax01LC瞬时转染的HEK 293T细胞的上清液。将平板在设置为400rpm的微孔板振荡器上室温孵育2小时。用400μl/孔洗涤缓冲液洗涤孔四次，然后加入100μl/孔含有四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液。将平板在室温下孵育15分钟。向每个孔中加入100μl终止溶液(1M H3PO4)。测试包括仅稀释液对照(无抗体)、重组人IgG标准品(25ng/ml)、SVX-3001抗体(估计为27.3ng/ml)和Lob 7/4IgG1抗体(估计为42.2ng/ml)。使用HRP抗人IgG抗体检测捕获的抗体。使用EnSpire多模式酶标仪(Perkin Elmer)测量450nm吸光度。

结果：在用纯化抗人IgG单克隆捕获抗体包被的孔中可以检测到重组人IgG标准品，但在用重组CD40蛋白包被的孔中不能检测到(图9)。在用纯化抗人IgG单克隆捕获抗体包被的孔中和用重组CD40蛋白包被的孔中可以检测到抗CD40抗体SVX-3001和Lob 7/4IgG1(图9)。

结论：确认来自用质粒pcDNA3.1(+)_Selvax01HC和pcDNA3.1(+)_Selvax01LC瞬时转染的HEK 293T细胞的上清液包含对人CD40蛋白具有特异性的人IgG蛋白(即抗体SVX-3001)。

实施例3-检测抗体与细胞上的抗原结合的FACS分析

进行FACS分析以确定SVX-3001是否与人外周血单核细胞(PBMC)表面表达的CD40结合。PMBC用PE标记的抗人CD19抗体染色。用BV421标记的抗人IgG抗体检测与细胞表面结合的SVX-3001抗体。基于FSC-A和SSC-A信号，门控淋巴细胞。

方法：从澳大利亚红十字会血液服务处获得人血沉棕黄层样品(伦理批准：RDHS-243-15，科廷大学人类研究伦理办公室)。使用Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare LifeSciences)通过密度离心从人血沉棕黄层样品分离外周血单核细胞(PBMC)。

FACS染色在96孔U形底平板(Corning Falcon)中进行。所有孵育都在冰上避光进行。用于洗涤步骤和稀释抗体的FACS缓冲液由含有1％ BSA(Sigma)、1％ FCS(Hyclone)和0.01％w/v叠氮化钠(Sigma)的PBS组成。染色试剂为含有SVX-3001抗体的上清液、人IgG1同种型对照(BioLegend)、BV421抗小鼠Ig(BD Biosciences)和PE抗人CD19(BioLegends)。

对10⁶个人PBMC/孔进行FACS染色。将细胞沉淀并重悬在20μl含有SVX-3001抗体的上清液中，并孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在20μl稀释在FACS缓冲液中的BV421抗小鼠Ig中，并孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在20μl稀释在FACS缓冲液中的PE抗人CD19中，并孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞一次，用PBS洗涤一次，重悬在100μl含1％甲醛的PBS中，并孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在200μl FACS缓冲溶液中进行分析。

FACS染色对照包括未染色对照、PE抗人CD19和BV421小鼠抗人Ig单染色对照以及人IgG1同种型对照。使用FACS Canto II流式细胞仪(BD)分析细胞染色。使用FACS染色对照设置用于分析的PMT电压和门。

结果：含有SVX-3001抗体的上清液与CD19+外周血淋巴细胞表面的CD40结合(图10)。图10(A)显示PE抗CD19对照，由于细胞表面表达CD19的细胞的染色而显示PE荧光。图10(B)显示BV421抗人IgG对照，由于该抗人IgG抗体与细胞表面表达IgG的CD19+细胞亚群结合而显示背景BV421荧光。图10(C)显示人IgG1同种型对照的染色。图10(D)显示含有SVX-3001抗体的上清液的测试染色，其由于存在与B细胞表面CD40结合的SVX-3001抗体而显示BV421荧光。

结论：SVX-3001抗体对人免疫细胞表面表达的天然CD40蛋白具有特异性。

实施例4-检测响应刺激的细胞分裂的CFSE测定

使用CFSE测量了SVX-3001刺激PMBC的细胞分裂率的能力。将CFSE标记的人PBMC与1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml的SVX-3001抗体或人IgG1同种型对照抗体孵育7天，然后用Zombie Aqua和PE抗CD19染色。

将人PBMC以2x 10⁷个细胞/ml悬浮在PBS中，并用CFSE(Life TechnologiesAustralia)染色，每1ml细胞使用25μl 100μM CFSE。通过轻轻颠倒10分钟将细胞与CFSE混合，然后加入至少4倍体积的RPMI(Gibco)+10％ FCS(Hyclone)。细胞用RPMI+10％ FCS洗涤两次，然后重悬在RPMI+10％ FCS中培养。

细胞在96孔板(Nunc)中以5x 10⁵个细胞/孔在终体积200μl/孔RPMI+10％FCS中培养。用含有SVX-3001抗体的上清液或人IgG1同种型对照抗体(BioLegend)以抗体浓度1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml和0.01mg/ml刺激细胞。细胞在37℃、5％ CO2下培养7天，然后收获用于FACS染色。

FACS染色在96孔U形底平板(Corning Falcon)中进行。所有孵育都在冰上避光进行。用于洗涤步骤和稀释抗体的FACS缓冲液由含有1％BSA(Sigma)、1％FCS(Hyclone)和0.01％w/v叠氮化钠(Sigma)的PBS组成。染色试剂为Zombie Aqua(BioLegend)和PE抗人CD19(BioLegends)。

将用于FACS染色的细胞沉淀并重悬在20μl稀释在FACS缓冲液中的PE抗人CD19中，并孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次，并重悬在100μl稀释在PBS中的Zombie Aqua中，并孵育15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞一次，用PBS洗涤一次，并重悬在100μl含1％甲醛的PBS中，并孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在200μl FACS缓冲溶液中进行分析。

FACS染色对照包括未染色对照、单染色对照和FMO对照。使用FACS Canto II流式细胞仪(BD)分析细胞染色。使用FACS染色对照设置用于分析的PMT电压和门。

结果：在高于0.01mg/ml的浓度下，SVX-3001抗体在人PBMC中刺激的细胞分裂，高于在用人IgG1同种型对照抗体刺激的人PBMC中观察到的细胞分裂背景水平(图11)。图11(A)显示用FSC-A与SSC-A的PBMC门控来排除碎片。图11(B)显示用FSC-A与FSC-H的单细胞门控来排除细胞团。图11(C)显示用Zombie Aqua与SSC-A的活细胞门控来排除死细胞。图11(D)显示，通过CFSE对比PE-抗CD19，基于CFSE荧光减少，鉴定出分裂的细胞。图11(E)显示用不同浓度的人IgG1抗体刺激的PBMC培养物中分裂细胞的百分比图。

结论：SVX-3001抗体具有可在人免疫细胞中导致细胞分裂增加的刺激(激动剂)活性。

实施例5-检测PMBC响应SVX-3001刺激的细胞因子反应的LEGENDplex测定

进行LEGENDplex测定，以测定响应SVX-3001对PMBC的刺激而产生的细胞因子的水平。

方法：从健康志愿者获得人血样品(伦理批准：HRE2017-0767，科廷大学人类研究伦理办公室)。使用Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare Life Sciences)通过密度离心从人血样品分离外周血单核细胞(PBMC)，并在含10％ DMSO(Sigma)的FCS(Hyclone)中-80℃储存。将人PBMC解冻，并在37℃下在RPMI(Gibco)+10％FCS和5％FCS中培养过夜，以使细胞从冷冻中恢复。使用Cell Trace Violet增殖试剂盒(Life Technologies Australia)标记细胞。

细胞在96孔板(Nunc)中以5x 10⁵个细胞/孔在终体积200μl/孔RPMI+10％FCS中培养。在无刺激、1μg/ml纯化SVX-3001抗体、10ng/ml重组人IL-2(Peprotech)或1μg/ml纯化SVX-3001抗体和10ng/ml重组人IL-2的条件下培养细胞。在37℃、5％CO2下培养细胞3天，然后收获上清液。使用基于LEGENDplex珠的免疫测定法(BioLegend)测定上清液中的可溶性分析物。使用LSRFortessa细胞分析仪(BD)获取LEGENDplex数据。

结果：用纯化的SVX-3001抗体刺激人PBMC导致培养3天后培养基中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70和IL-23增加以及IL-13和TNF-β减少(图12)。用SVX-3001和IL-2的组合刺激人PBMC，而不是单独使用SVX-3001或IL-2，导致培养3天后IFN-γ释放到培养基中(图12)。在培养基对照(RPMI+10％FCS+10ng/ml IL-2)中测得的细胞因子浓度在图12中以虚线表示。

结论：SVX-3001抗体具有导致细胞因子从人免疫细胞中差异释放的刺激(激动剂)活性。

实施例6-FACS抗体竞争研究

进行FACS测定，以测定SVX-3001阻断抗体B-B20和LOB7/6与CD40结合的能力。在存在或不存在1μg/ml SVX-3001抗体的情况下，用小鼠抗人CD40抗体B-B20和LOB7/6对人PBMC进行染色。使用BV421标记的抗小鼠Ig抗体检测小鼠抗人CD40抗体与人PBMC的结合。

FACS染色在96孔U形底平板(Corning Falcon)中进行。所有孵育都在冰上避光进行。用于洗涤步骤和稀释抗体的FACS缓冲液由含有1％BSA(Sigma)、1％FCS(Hyclone)和0.01％w/v叠氮化钠(Sigma)的PBS组成。封闭试剂为含有SVX-3001抗体的上清液。染色试剂为抗CD40抗体LOB7/6(LSBio)、抗CD40抗体B-B20(Abcam)和BV421抗小鼠Ig(BDBiosciences)。

对每个孔5×10⁵个人PBMC进行FACS染色。将细胞沉淀并重悬在200μl含有1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml或0.001μg/ml SVX-3001抗体的上清液中，并孵育30分钟。将细胞沉淀(不洗涤)，然后重悬在20μl稀释在FACS缓冲液中的LOB7/6或稀释在FACS缓冲剂中的B-B20中，并孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在20μl稀释在FACS缓冲液中的BV421抗小鼠Ig中，并孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次，并重悬在100μl含1％甲醛的PBS中，并孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬在200μl FACS缓冲溶液中进行分析。

FACS染色对照包括未染色对照、无封闭对照和无一抗对照。使用FACS Canto II流式细胞仪(BD)分析细胞染色。使用FACS染色对照设置用于分析的PMT电压和门。

结果：抗CD40抗体B-B20对人PBMC的染色被SVX-3001阻断，而抗CD40抗体LOB7/6的染色未被SVX-3001阻断(图13)。(A)无染色对照。(B)LOB7/6染色。(C)1μg/ml SVX-3001存在下的LOB7/6染色。(D)B-B20染色。(E)1μg/ml SVX-3001存在下的B-B20染色。

结论：抗体SVX-3001和B-B20与人CD40分子上相同或重叠的表位结合。抗体SVX-3001和LOB7/6与人CD40分子上的不同表位结合。

实施例7-表面等离子体共振抗体竞争研究

通过表面等离子体共振测量了SVX-3001与一系列抗CD40抗体竞争的能力。

方法：使用Biacore T200(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)进行了成对结合分析。始终用HBS-EP+缓冲液作为运行缓冲液。

使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将具有C端人IgG1 Fc结构域和6His标签的重组人CD40胞外结构域(CD40-Fc；BioLegend)固定到S系列传感器芯片CM5(GE Healthcar)的表面。将CD40 Fc在pH 5.0的10mM乙酸钠缓冲液中稀释至25μg/ml用于固定。目标固定水平：1000RU。洗涤溶液：乙醇胺。

用于竞争研究的试剂是纯化的SVX-3001抗体、重组CD40L(BioLegend)和纯化的抗CD40抗体Lob 7/4IgG1(南安普顿大学)、CP-870893IgG1(南安普顿大学)、S2C6(Mabtech)、G28.5(BioXCell)和LOB7/6(LSBio)。

以10μl/min注射180秒后，以足以饱和表面固定的CD40-Fc的浓度结合第一样品(样品1)，进行成对结合分析。对于所测试的试剂，此浓度在12.5至200μg/ml的范围内。然后以10μl/min注射第二样品(样品2)180秒。使用pH 1.5的甘氨酸-HCl缓冲液进行再生，以10μl/min的速度注射30秒，稳定5秒，然后测试下一对。使用样品1和样品2相同的配对来确认饱和并设置基线反应。

结果：图14中显示通过SVX-3001、Lob 7/4IgG1和LOB7/6的成对结合进行表位作图的Biacore T200传感图。表3中总结了所有测试对的结果。

表3：使用固定的CD40-Fc时样品1对样品2的阻断

结论：SVX-3001和抗体Lob 7/4IgG1、CP-870893IgG1、S2C6及G28.5，与人CD40上相同或重叠的表位结合。SVX-3001与抗体LOB7/6结合不重叠的不同表位。SVX-3001的表位与CD40L的结合位点不重叠。

据报道，抗体Lob 7/4、SGN40(源自抗体S2C6)和CP-870893都与人CD40的CRD1区中的表位结合(Cancer Cell 33,664-675,2018年4月9日)。从SPR数据推断，SVX-3001也与人CD40的CRD1区(P25942；Cys26-Cys59)中的表位结合。

实施例8-表面等离子体共振抗体亲和力研究

使用表面等离子体共振测量了SVX-3001对CD40胞外结构域的亲和力。

方法：使用Biacore T200(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)进行动力学分析。始终用HBS-EP+缓冲液作为运行缓冲液。

使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将纯化的SVX-3001固定到S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)的表面。将SVX-3001在pH 5.0的10mM乙酸钠缓冲液中稀释至25μg/ml用于固定。目标固定水平：600RU。洗涤溶液：乙醇胺。用于分析的参考表面未经处理或通过用于SVX-3001的相同方法将人IgG1同种型对照(BioLegend)固定到表面。

用于动力学研究的试剂是具有C端6His标签的重组人CD40胞外结构域(CD40-6His；Novoprotein)和具有C端人IgG1 Fc结构域和6His标签的重组人CD40胞外结构域(CD40-Fc；BioLegend)。

样品的注射参数为接触时间：120秒，流速：30μl/min，解离时间：300秒。用于再生的注射参数为接触时间：30秒，流速：30μl/min，稳定时间：0秒。再生溶液为pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl缓冲液或50mM NaOH。用于动力学分析的CD40-His和CD40-Fc的浓度为2mM、4mM、8mM(一式两份)、16mM和32mM。用1:1结合模型进行曲线拟合。

结果：表4显示用CD40-6His作为分析物的三个实验和用CD40-F_C作为分析物的三个试验中SVX-3001的动力学和亲和力常数。

表4：SVX-3001的动力学和亲和力常数

结论：使用CD40-6His作为分析物计算的SVX-3001的平衡解离常数(K_D)为6.111x10^-9M(6.111nM)，使用CD40-Fc作为分析物计算的SVX-3001的K_D为5.826x 10^-10M(0.5826nM)。使用两种分析物计算的结合速率常数(k_a)相似，因此K_D的差异看起来是由于两种分析物的解离速率常数(K_d)的差异所致。

实施例9-用抗CD40抗体激活单核细胞来源的树突细胞

通过参考共刺激分子的表达，测量了IFN-γ在SVX-3001、CD40L或LPS存在下对单核细胞来源的树突细胞(moDC)的刺激。

方法：从澳大利亚红十字会血液服务处获得人血沉棕黄层样品(伦理批准：RDHS-243-15，科廷大学人类研究伦理办公室)。使用Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare LifeSciences)通过密度离心从人血沉棕黄层样品分离外周血单核细胞(PBMC)。将人PBMC于RPMI(Gibco)+10％ FCS(Hyclone)中以5x 10⁶细胞/孔的密度接种在6孔板(CorningFalcon)中，并在37℃下孵育2小时，以使单核细胞黏附在塑料上。然后去除含有未贴壁的细胞的培养基。

通过在含80ng/ml重组人GM-CSF(Shenandoh Biotechnology)、10ng/ml重组人IL-4(Shenandah Biotechnology)和10μg/ml多黏菌素B(Sigma-Aldrich)的RPMI+10％FCS中培养7天，使贴壁的单核细胞分化为单核细胞来源的树突细胞(moDC)。在第4天更换含有GM-CSF、IL-4和多黏菌素B的培养基。

第7天，在含GM-CSF和IL-4而不含多黏菌素B的培养基中刺激细胞。刺激条件包括培养基对照(无刺激)、1μg/ml SVX-3001、1μg/ml人IgG1同种型对照(BioLegend)、0.67mg/ml重组CD40L(BioLegends)和1μg/ml LPS(Sigma-Aldrich)与20ng/ml重组人IFN-γ(Shenandoah Biotechnology)。在第9天，用1X Brefeldin A溶液(BioLegend)处理细胞4小时，然后收获细胞并染色用于FACS分析(48小时刺激)。

FACS染色在96孔U形底平板(Corning Falcon)中进行。用于洗涤步骤和稀释抗体的FACS缓冲液由含有1％ BSA(Sigma)、1％ FCS(Hyclone)和0.01％w/v叠氮化钠(Sigma)的PBS组成。染色试剂包括BUV805抗CD3(BD)、Alexafluor700抗CD14(BioLegend)、BV605抗CD11b(BioLegend)、BV711抗CD11c(BioLegend)、APC抗CD1a(BioLegend)、PerCP-Cy5.5抗HLA-A,B,C(BioLegend)、APC-H7抗HLA-DR(BD)、FITC抗CD80(BioLegend)、PE-Cy7抗CD83(BioLeged)、BUV395抗CD86(BD)和BV510抗PD-L1(BioLegend)、BV421抗IL-12(BD)以及Zombie UV(BioLegent)。

每个染色样品含有来自用于细胞培养和刺激的6孔板的1个孔的moDC。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，重悬在100μl稀释在PBS中的Zombie UV中，孵育15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬在100μl染色混合物(含有50μl Brilliant Stain缓冲液(BD)和50μl稀释在FACS缓冲液中抗细胞表面标记的抗体)中，并孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次，重悬在100μl固定/通透溶液(BD)中，并孵育20分钟。用Perm/Wash缓冲液(BD)洗涤细胞两次，重悬在100μl染色混合物(含有50μl Brilliant Stain缓冲液和50μl稀释在Perm/Was缓冲液中抗细胞内标记的抗体)中。用Perm/Wash缓冲液洗涤细胞两次，重悬在200μlFACS缓冲液中进行分析。

FACS染色对照包括未染色对照和单染色对照。使用LSRFortessa细胞分析仪(BD)分析细胞染色。使用FACS染色对照设置PMT电压和补偿值。用于moDC分析的门控是大小(FSC-A vs.SSC-A)、单细胞(FSC-Avs.FSC-H)、活细胞(Zombie UV阴性)、CD3^-CD14^-细胞(CD3vs.CD14)和CD11b⁺CD11c⁺细胞(CD11b vs.CD11c)。针对整个moDC群体，确定了细胞表面标记的中位荧光强度(MFI)。

结果：SVX-3001、CD40L或LPS与IFN-γ刺激moDC 48小时，导致细胞表面标记HLA-A,B,C、HLA-DR、CD80、CD83、CD86和PD-L1的上调以及增加的IL-12表达，如图15所示。这些标记在未刺激的moDC或用人IgG1同种型对照抗体刺激的moDC中未上调。

结论：抗CD40抗体SVX-3001对人单核细胞来源的树突细胞(moDC)(抗原呈递细胞(APC)的实例)具有激动剂活性，导致共刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和PD-L1(CD274)以及HLA-A,B,C(MHC I类)、HLA-DR(MHC II类)、CD83和促炎细胞因子IL-12的表达增加。这种激动剂活性取决于抗体的抗原结合结构域，因为对具有相同Fc结构域的人IgG1同种型对照抗体未见这种反应。

实施例10-用抗CD40抗体激活单核细胞来源的树突细胞——剂量反应

通过参考共刺激分子的表达，测量SVX-3001存在下的单核细胞来源的树突细胞(moDC)的刺激。还测量了SVX-3001的刺激作用的剂量反应。

方法：从澳大利亚红十字会血液服务处获得人血沉棕黄层样品(伦理批准：RDHS-243-15，科廷大学人类研究伦理办公室)。使用Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare LifeSciences)通过密度离心从人血沉棕黄层样品分离外周血单核细胞(PBMC)。将人PBMC于RPMI(Gibco)+10％FCS(Hyclone)中以5x 10⁶细胞/孔的密度接种在6孔板(CorningFalcon)中，并在37℃下孵育2小时，以使单核细胞贴附在塑料上。然后去除含有未贴壁的细胞的培养基。

第7天，在含GM-CSF和IL-4而不含多黏菌素B的培养基中刺激细胞。刺激条件包括1μg/ml、0.316μg/ml、0.1μg/ml、0.0316μg/ml和0.01μg/ml的抗CD40抗体SVX-3001。对照包括单独培养基(未刺激)、1μg/ml人IgG1同种型对照(BioLegend)和1μg/ml LPS(SigmaAldrich)与20ng/ml重组人IFN-γ(Shenandoah Biotechnology)。在第9天，用1XBrefeldin A溶液(BioLegend)处理细胞4小时，然后收获细胞并染色用于FACS分析(48小时刺激)。

每个染色样品含有来自用于细胞培养和刺激的6孔板的1个孔的moDC。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，重悬在100μl稀释在PBS中的Zombie UV中，孵育15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬在100μl染色混合物(含有50μl Brilliant Stain缓冲液(BD)和50μl稀释在FACS缓冲液中抗细胞表面标记的抗体)中，并孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次，重悬在100μl固定/通透溶液(BD)中，并孵育20分钟。用Perm/Wash缓冲液(BD)洗涤细胞两次，重悬在100μl染色混合物(含有50μl Brilliant Stain缓冲液和50μl稀释在Perm/Was缓冲液中抗细胞内标记的抗体)中。用Perm/Wash缓冲液洗涤细胞两次，重悬在200μl FACS缓冲液中进行分析。

FACS染色对照包括未染色对照和单染色对照。使用LSRFortessa细胞分析仪(BD)分析细胞染色。使用FACS染色对照设置PMT电压和补偿值。用于moDC分析的门控是大小(FSC-Avs.SSC-A)、单细胞(FSC-Avs.FSC-H)、活细胞(Zombie UV vs.SSC-A)、CD3^-CD14^-细胞(CD3 vs.CD14)、CD11b⁺CD11c⁺细胞(CD11b vs.CD11c)和CD1a⁺细胞(CD1a vs.SSC-A)。针对整个moDC群体，确定了细胞表面标记的中位荧光强度(MFI)。

结果：用抗CD40抗体SVX-3001、APX005M和CP-870893刺激人moDC 48小时，导致细胞表面标记HLA-A,B,C(MHC I类)、HLA-DR(MHC II类)、CD80、CD83、CD86和PD-L1以及细胞因子IL-12以剂量依赖的方式上调。图16显示了在不同浓度下用SVX-3001刺激48小时的moDC的FACS染色的平均荧光强度(MFI)。未刺激的moDC的MFI显示为虚线。

结论：抗CD40抗体SVX-3001向人moDC提供剂量依赖性激动剂信号，导致细胞表面标记HLA-A,B,C、HLA-DR、CD80、CD83、CD86和PD-L1以及细胞因子IL-12的上调。

实施例11-SVX-3001密码子优化序列的基因合成

使用GeneArt,Thermo Fisher Scientific的GeneOptimizer^TM，针对在人类中表达，优化了编码SVX-3001重链和SVX-3001轻链的DNA序列，产生了基因序列20ACGJQC_Selvax01HC(SEQ ID NO 21，图17)和20ACGJRC_Selvax01LC(SEQ ID NO 22，图18)。在图17和18中，Kozak序列以粗体显示，重链和轻链的编码序列用下划线表示。

基因序列20ACGJQC_Selvax01HC和20ACGJRC_Selvax01LC由GeneArt,ThermoFisher Scientific合成，并插入pcDNA3.4-TOPO中，以产生质粒20ACGJQC_Selvax01HC-pcDNA3.4-TOPO(图19)和20ACGJRC_Selvax01LC-pcDNA3.4-TOPO(图20)。

序列表

<110> 赛尔疫苗私人有限公司(Selvax Pty Ltd)

<120> 激动剂抗CD40抗体

<130> 288168

<160> 22

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH1

<400> 1

Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn Tyr Tyr Trp Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH2

<400> 2

Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH3

<400> 3

Leu Asp Tyr

1

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL2

<400> 5

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL3

<400> 6

Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区序列

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 9

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区核苷酸序列

<400> 9

caggtgcaac tgcagcagag cggccccggg ctggtgaagc ctagccagtc actgtccctc 60

acctgcgccg ttagcggcta tagcattacc accaactact actggaattg gatccggcag 120

gcccccggta agggcctgga gtgggtcggg tacatccggt atgacggcac aacctactat 180

gccccctctt tgaaaggcag attcagtatc acccgggaca ctagcaagaa ccaattcttt 240

ctgcagctga cctctgtgac tccagaggac acagctactt actactgcgc acggcttgat 300

tattggggac agggaacgct ggtgacagtc tcgagt 336

<210> 10

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区核苷酸序列

<400> 10

gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgtcagtta gcctggggga tagggccagc 60

atcagttgcc ggtcttcaca aagtctggaa aacagcaacg gcaatacctt tcttaactgg 120

ttccagcaga agcctggcca gtctccccag ctgctgattt acagagtgtc caatcggttt 180

tccggcgtgc ccgaccggtt ctccgggagc ggctctggta ccgactttac actcaaaatc 240

agccgcgtcg aggccgagga tgaaggcgtg tacttctgct tgcaggtgac ccacgtgcca 300

tatactttcg gaggaggcac caagctggag atcaagcgt 339

<210> 11

<211> 277

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu

50 55 60

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His

65 70 75 80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr

85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr

100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys

145 150 155 160

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln

165 170 175

Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu

180 185 190

Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile

195 200 205

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn

210 215 220

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp

225 230 235 240

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His

245 250 255

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser

260 265 270

Val Gln Glu Arg Gln

275

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多组氨酸标签

<400> 12

His His His His His His

1 5

<210> 13

<211> 1417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链核苷酸序列

<400> 13

aagcttgcca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60

gataccaccg gacaggtgca actgcagcag agcggccccg ggctggtgaa gcctagccag 120

tcactgtccc tcacctgcgc cgttagcggc tatagcatta ccaccaacta ctactggaat 180

tggatccggc aggcccccgg taagggcctg gagtgggtcg ggtacatccg gtatgacggc 240

acaacctact atgccccctc tttgaaaggc agattcagta tcacccggga cactagcaag 300

aaccaattct ttctgcagct gacctctgtg actccagagg acacagctac ttactactgc 360

gcacggcttg attattgggg acagggaacg ctggtgacag tctcgagtgc tagcaccaag 420

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtctc cgggtaaatg agtcctagct gtctaga 1417

<210> 14

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链核苷酸序列

<400> 14

aagcttgcca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60

gataccaccg gtgacatcgt gatgacccag agccccctga gcctgtcagt tagcctgggg 120

gatagggcca gcatcagttg ccggtcttca caaagtctgg aaaacagcaa cggcaatacc 180

tttcttaact ggttccagca gaagcctggc cagtctcccc agctgctgat ttacagagtg 240

tccaatcggt tttccggcgt gcccgaccgg ttctccggga gcggctctgg taccgacttt 300

acactcaaaa tcagccgcgt cgaggccgag gatgaaggcg tgtacttctg cttgcaggtg 360

acccacgtgc catatacttt cggaggaggc accaagctgg agatcaagcg tacggtagcg 420

gccccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480

gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540

aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600

acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 660

tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720

ggagagtgtt agtaatctag a 741

<210> 15

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Selvax01HC 核苷酸序列

<400> 15

aagcttgcca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60

gataccaccg gacaggtgca actgcagcag agcggccccg ggctggtgaa gcctagccag 120

tcactgtccc tcacctgcgc cgttagcggc tatagcatta ccaccaacta ctactggaat 180

tggatccggc aggcccccgg taagggcctg gagtgggtcg ggtacatccg gtatgacggc 240

acaacctact atgccccctc tttgaaaggc agattcagta tcacccggga cactagcaag 300

aaccaattct ttctgcagct gacctctgtg actccagagg acacagctac ttactactgc 360

gcacggcttg attattgggg acagggaacg ctggtgacag tctcgagtgc tagcaccaag 420

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtctc cgggtaaatg ataatctaga 1410

<210> 16

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Selvax01HC 氨基酸序列

<400> 16

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val

20 25 30

Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser

35 40 45

Ile Thr Thr Asn Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Pro Ser Leu Lys Gly Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 17

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Selvax01LC 核苷酸序列

<400> 17

aagcttgcca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60

gataccaccg gtgacatcgt gatgacccag agccccctga gcctgtcagt tagcctgggg 120

gatagggcca gcatcagttg ccggtcttca caaagtctgg aaaacagcaa cggcaatacc 180

tttcttaact ggttccagca gaagcctggc cagtctcccc agctgctgat ttacagagtg 240

tccaatcggt tttccggcgt gcccgaccgg ttctccggga gcggctctgg taccgacttt 300

acactcaaaa tcagccgcgt cgaggccgag gatgaaggcg tgtacttctg cttgcaggtg 360

acccacgtgc catatacttt cggaggaggc accaagctgg agatcaagcg tacggtagcg 420

gccccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480

gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540

aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600

acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 660

tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720

ggagagtgtt agtaatctag a 741

<210> 18

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Selvax01LC 氨基酸序列

<400> 18

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Leu Gly Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe

100 105 110

Cys Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 19

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链氨基酸序列

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 20

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链氨基酸序列

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20ACGJQC_Selvax01HC 核苷酸序列

<400> 21

aagcttgcca ccatggaaac ccctgctcag ctgctgtttc tgctgctgct gtggctgcct 60

gatacaacag gacaggtcca gctccagcag tctggccctg gacttgtgaa gcctagccag 120

agcctgtctc tgacatgtgc cgtgtctggc tacagcatca ccaccaacta ctactggaac 180

tggatccggc aggcccctgg caaaggactg gaatgggtcg gatatatcag atacgacggc 240

accacctact acgcccctag cctgaagggc agattctcca tcaccagaga caccagcaag 300

aaccagttct tcctgcagct gaccagcgtg acccctgagg ataccgccac ctattactgc 360

gccagactgg attattgggg ccagggcaca ctggtcacag tgtctagcgc ctctacaaag 420

ggccctagcg ttttcccact ggctcctagc agcaagagca catctggtgg aacagccgct 480

ctgggctgcc tggtcaagga ttactttcct gagcctgtga ccgtgtcctg gaattctggt 540

gctctgacaa gcggcgtgca cacctttcca gccgtgctgc aaagcagcgg cctgtactct 600

ctgtctagcg tcgtgacagt gcctagcagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaaccaca agcctagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gagctgcgac 720

aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct ccagaactgc tcggcggacc ctccgttttc 780

ctgtttccac ctaagcctaa ggacaccctg atgatcagca gaacccctga agtgacctgc 840

gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaacag cacctacaga 960

gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020

aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc 1080

cagccaagag aaccccaggt ttacaccctg cctccaagcc gggaagagat gaccaagaat 1140

caggtgtccc tgacctgcct cgtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg 1200

gagagcaatg gccagcctga gaacaactac aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac 1260

ggctcattct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt ctaggtggca gcagggcaac 1320

gtgttcagct gttctgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaaatctctg 1380

agtctgagcc ccggcaagtg atgatctaga 1410

<210> 22

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 20ACGJRC_Selvax01LC 核苷酸序列

<400> 22

aagcttgcca ccatggaaac ccctgctcag ctgctgtttc tgctgctgct gtggctgcct 60

gataccaccg gcgatatcgt gatgacacag agccctctga gcctgtccgt gtctctgggc 120

gatagagcca gcatcagctg tagaagcagc cagagcctgg aaaacagcaa cggcaacacc 180

ttcctgaact ggttccagca gaagcccgga cagtctcccc agctgctgat ctacagagtg 240

tccaacagat tcagcggcgt gcccgataga ttttctggca gcggctctgg caccgacttc 300

accctgaaga ttagcagagt ggaagccgag gacgagggcg tgtacttctg tctgcaagtg 360

acccacgtgc catacacctt tggcggaggc accaagctgg aaatcaagag aacagtggcc 420

gctccgagcg tgttcatctt tccaccaagc gacgagcagc tgaaaagcgg cacagcctct 480

gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc agagaagcca aggtgcagtg gaaggtggac 540

aatgccctgc agagcggcaa tagccaagag agcgtgaccg agcaggacag caaggatagc 600

acatacagcc tgagcagcac cctgacactg agcaaggccg actacgagaa gcacaaagtg 660

tacgcctgcg aagtgacaca ccagggcctg tctagccctg tgaccaagag cttcaaccgg 720

ggcgagtgct gatgatctag a 741

Claims

1.分离的激动剂抗CD40抗体或其片段，其包含(i)含有三个CDR的VH链和(ii)含有三个CDR的VL链，其中一个或多个重链互补决定区(CDRH)选自：

a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；或

2.权利要求1的分离的激动剂抗CD40抗体，其还包含：

(a)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

(b)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

(c)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；或

(d)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

3.权利要求1或2的分离的激动剂抗CD40抗体，其包含：

A：

(a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；或

(b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；和

B：

(c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

(d)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

(e)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；或

(f)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

4.权利要求1至3的分离的激动剂抗CD40抗体，其包含：

(a)包含SEQ ID NO:1的CDRH1序列；

(b)包含SEQ ID NO:2的CDRH2序列；

(c)包含SEQ ID NO:3的CDRH3序列；

(d)包含SEQ ID NO:4的CDRL1序列；

(e)包含SEQ ID NO:5的CDRL2序列；和

(f)包含SEQ ID NO:6的CDRL3序列。

5.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区。

6.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:8的轻链可变区。

7.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:19的重链或SEQ ID NO:20的轻链。

8.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区。

9.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其中该分离的激动剂抗CD40抗体是针对人CD40的人源化抗体。

10.权利要求8的分离的激动剂抗CD40抗体，其中该分离的激动剂抗CD40抗体是单克隆抗体。

11.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其中该抗体是IgG抗体。

12.前述权利要求中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体，其中该抗体包含SEQ IDNO:19的重链和SEQ ID NO:20的轻链。

13.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

14.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体和可药用赋形剂。

15.权利要求13或14的药物组合物，其中该组合物还包含其他活性剂。

16.权利要求15的药物组合物，其中该其他活性剂选自放射性同位素、放射性核素、毒素或治疗和化疗基团。

17.制备权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体的方法，其包括从分泌所述激动剂抗CD40抗体的宿主细胞制备所述激动剂抗CD40抗体的步骤。

18.用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体。

19.用于在个体中增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体。

20.用于在个体中激活抗原呈递细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体。

21.在个体中增强MHC和/或免疫共刺激分子的表达的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体。

22.在个体中刺激产生促炎细胞因子的方法，其包括施用有效量的至少权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

23.在个体中诱导T细胞激活的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

24.在个体中模拟CD40L信号并替代CD4+淋巴细胞功能的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

25.用于在荷瘤个体中克服T细胞耐受性或在个体中引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

26.在个体中促进B细胞分泌针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

27.在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞以及刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

28.药物组合物，其包含有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体以及至少第二免疫增强剂。

29.权利要求28的药物组合物，其中该免疫增强剂选自IL-2、TLR-7激动剂或全身细胞毒性化疗剂。

30.用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体和有效量的至少第二免疫增强剂。

31.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

32.用于在患者中治疗或预防恶性肿瘤相关病症的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

33.用于增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

34.在个体中激活抗原呈递细胞的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

35.在个体中促进B细胞分泌针对肿瘤细胞上表达的抗原的自身抗体的方法，其包括施用有效量的权利要求1至12中任一项的分离的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

36.在个体中上调共刺激标记并释放IL-12以激活CD8+T细胞以及刺激针对交叉呈递的肿瘤抗原的特异性细胞毒性T细胞反应的方法，其包括施用有效量的权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2。

37.用于在个体中增加APC(包括巨噬细胞、DC和B细胞)的抗原呈递的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

38.在个体中增强MHC和/或免疫共刺激分子的表达的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

39.在个体中刺激产生促炎细胞因子(如IL-12)的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

40.在个体中诱导T细胞激活的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

41.在个体中模拟CD40L信号并替代CD4+淋巴细胞功能的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

42.用于在荷瘤个体中克服T细胞耐受性或在个体中引发有效的细胞毒性T细胞反应或增强抗肿瘤疫苗的有效性的方法，其包括施用有效量的至少一种权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体和IL-2中的每一种。

43.核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项的激动剂抗CD40抗体。

44.编码激动剂抗CD40抗体重链的核酸分子，其包含SEQ ID NO 9。

45.权利要求43的核酸分子，其中该分子与SEQ ID NO 9具有至少80、80-85、85-90、90-95、95-97、97-99或更大的同一性。

46.权利要求43至45中任一项的核酸分子，其还包含含有SEQ ID NO 10的激动剂抗CD40抗体轻链。

47.编码激动剂抗CD40抗体重链的核酸分子，其包含SEQ ID NO 21。

48.权利要求43的核酸分子，其中该分子与SEQ ID NO 21具有至少80、80-85、85-90、90-95、95-97、97-99或更大的同一性。

49.权利要求46至48中任一项的核酸分子，其还包含含有SEQ ID NO 22的激动剂抗CD40抗体轻链。