CN111051333A

CN111051333A - 修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗

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Publication number: CN111051333A
Application number: CN201880055611.2A
Authority: CN
Inventors: 森泰亮; 西村知裕; 清水裕之; 河边昭博; 片山贵裕
Original assignee: Km Biomedical Co Ltd
Current assignee: Km Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: US11357847B2; EP3677592A4; JP7204653B2; CN111051333B; AU2018323502B2; JPWO2019044925A1; AU2018323502A1; US20210205441A1; EP3677592A1; WO2019044925A1; WO2019044925A9; AU2018323502A2

Abstract

本发明的修饰型HSV gD蛋白为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白，其为如下修饰的修饰型HSV gD蛋白：野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、与存在于受体结合结构域(RBD)的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位(诱饵表位)中的至少1个不发挥作为表位的功能。

Description

修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗

技术领域

本发明涉及修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗。

背景技术

人单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus、HSV)为在人类中广泛传播的病原体。作为dsDNA病毒的HSV属于α疱疹病毒亚科，存在HSV-1和HSV-2两种血清型。HSV在人类中会引起脑炎、髓膜炎、口唇疱疹、生殖器疱疹、皮肤病、角膜疱疹、系统性新生儿疱疹等多种疾病。因此HSV在医疗卫生方面为极重要的病毒，实际上已开发了阿昔洛韦、伐昔洛韦等有效的抗病毒剂。

但是，目前所开发的抗HSV剂是在感染细胞内抑制增殖中的病毒DNA的复制的药物，所以对于以DNA状态在神经节内部潜伏感染的HSV不显示效果。即，在已感染HSV的情况下，现有的抗HSV剂不能从潜伏感染部位除去HSV。为了改善这种状况，需要开发对防御首次感染及防御复发均有效的新疫苗。

引起感染症的病原体大致分为：用现有疫苗可得到充分效果的Class I组病原体和用现有疫苗、病原体感染史无法获得充分的保护性免疫的Class II组病原体。有人指出，Class II组病原体的难以防御的原因在于它们所具有的巧妙的免疫逃逸机制。HSV属于Class II组病原体，可以认为这是由于：HSV具有免疫逃逸机制，可巧妙地逃避宿主的免疫反应。关于HSV疫苗的开发，以往一直尝试研究使用减毒活疫苗、佐剂灭活疫苗，任意情况下T细胞免疫应答及B细胞免疫应答都不充分，与自然感染后获得的不充分的免疫应答水平没有什么差别。

HSV通过吸附到细胞表面、与病毒受体结合、细胞膜与病毒包膜进行膜融合等步骤实现对宿主细胞的侵入。该系统通过多个病毒包膜蛋白与宿主细胞膜蛋白结合而引发。截至目前，已知有包膜糖蛋白B(gB)、包膜糖蛋白C(gC)、包膜糖蛋白D(gD)、包膜糖蛋白H(gH)、包膜糖蛋白L(gL)，这些病毒包膜蛋白中，gD首先与作为宿主细胞膜受体的疱疹病毒侵入介体(herpesvirus entry mediator，HVEM)、结合素(Nectin)-1、或结合素-2形成复合体。关于复合体，晶体结构已有报道(非专利文献1、2)。变构的gD与gH/gL进行相互作用，活化的gH/gL进一步活化gB(非专利文献3)。一般认为，gB通过作为受体的3-O-磺化硫酸乙酰肝素(3-O-sulfonated heparan sulfate,3-OS HS)或PILRα而承担膜融合的主要功能(非专利文献4、5)。从而表明了HSV gD与受体的结合触发了病毒的侵入。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:S.A.Connolly等、“Structure-Based Analysis of the HerpesSimplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus EntryMediator HveA(HVEM)”,JOURNAL OF VIROLOGY,Vol.76,No.21,Nov.2002,pages 10894-10904,ISSN:0022-538X

非专利文献2:P.Di Giovine等、“Structure of Herpes Simplex VirusGlycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1”,PLoS Pathogens,Vol.9,No.7,Sep.2011

非专利文献3:S.D.Stampfer等、“Stuck in the middle:structural insightsinto the role of gH/gL heterodimer in herpesvirus entry”,Curr Opin Virol,Vol.3,No.1,Feb.2013,pages 13-19

非专利文献4:E.Trybala等、“Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 Differ inTheir Interaction with Heparan Sulfate”,JOURNAL OF VIROLOGY,Vol.74,No.19,Oct.2000,pages 9106-9114,ISSN:0022-538X

非专利文献5:J.Wang等、“Binding of Herpes Simplex Virus Glycoprotein B(gB)to Paired Immunoglobulin-Like Type 2 ReceptorαDepends on SpecificSialylated O-Linked Glycans on gB”,JOURNAL OF VIROLOGY,Vol.83,No.24,Dec.2009,pages 13042-13045,ISSN:0022-538X

非专利文献6:A.Carfi等、“Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound tothe Human Receptor HveA”,Molecular Cell,Vol.8,No.1,July.2001,pages 169-179

非专利文献7:C.Krummenacher等、“Structure of unliganded HSV gD revealsa mechanism for receptor-mediated activation of virus entry”,The EMBOJournal,Vol.24,2005,pages 4144-4153

非专利文献8:N.Farley等、“Recurrent vaginal shedding of herpes simplextype 2 virus in the mouse and effects of antiviral therapy”,AntiviralRes.2010May；86(2):188-195.

非专利文献9:J.R.Gallagher等、“Displacement of the C terminus of herpessimplex virus gD is sufficient to expose the fusion-activating interfaces ongD”,JOURNAL OF VIROLOGY,Vol.87,No.23,Dec.2013,pages 12656-12666,ISSN:0022-538X

非专利文献10:D.Eggink等、“Guiding the immune response againstinfluenza virus hemagglutinin toward the conserved stalk domain by hyperglycosylation of the globular head domain”,JOURNAL OF VIROLOGY,Vol.88,No.1,Jan.2014,pages 699-704,ISSN:0022-538X

非专利文献11:Lu.G等、“Crystal structure of herpes simplex virus 2 gDbound to Nectin-1 reveals a conserved mode of receptor recognition”,JOURNALOF VIROLOGY,Vol.88,No.23,Dec.2014,pages 13678-13688

非专利文献12:Lee.CC等、“Structural basis for the antibodyneutralization of herpes simplex virus.”,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,Vol.69,Oct.2013,pages 1935-45

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，在HSV的治疗中使用阿昔洛韦等抗病毒药。但是，这些抗病毒药不能完全清除病毒，另外若停止服用则病毒会再次激活。因此，期望开发出防御HSV感染的预防用疫苗或减轻复发症状的治疗用疫苗，目前不存在有效的疫苗，对其需求较高。

本发明的课题在于提供一种修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗，在免疫诱导时，其与野生型HSV gD相比，可以诱导含有高比例的对HSV gD显示高的中和活性的中和抗体的免疫血清，可用于HSV感染症的预防和/或治疗。

用于解决问题的方案

对于已知为HSV的主要防御抗原之一的gD蛋白，本发明人们进行了详尽的B细胞表位分析及T细胞表位分析，尝试将其分为在表现防御活性时有益表位、以及在表现防御活性时无益或有害的表位。然后对无益或有害的表位进行去表位化、并在免疫学上突显有益表位或者附加非种系选择性T细胞表位(promiscuous T cell epitope)等有益表位，从而诱导免疫再聚焦(Immune refocusing)，增强其中和抗体诱导能力、细胞免疫，结果完成了增强了抗感染能力的修饰型HSV gD疫苗。

即，本发明涉及以下的各发明。

(1)一种修饰型HSV gD蛋白，其为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白(修饰型HSV gD蛋白)，其为如下修饰的修饰型HSV gD蛋白：野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、与存在于受体结合结构域(RBD)的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位(诱饵表位)中的至少1个不发挥作为表位的功能。

(2)根据(1)的修饰型HSV gD蛋白，其中，存在于RBD中的B细胞表位为包含下述氨基酸残基的表位，所述氨基酸残基相当于选自由序列号1记载的氨基酸序列中的第134位的精氨酸残基、第139位的天冬氨酸残基及第222位的精氨酸残基组成的组中的至少1个氨基酸残基。

(3)根据(1)或(2)的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位为存在于gD胞外结构域的N末端脯氨酸富集区域(PRR)的B细胞表位。

(4)根据(3)的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位为：

包含野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基的表位、或

包含存在于下述区域的至少1个氨基酸残基的表位，所述区域为在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于上述第50位的脯氨酸残基的氨基酸的距离为1.5nm以下的区域。

(5)根据(1)～(4)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位的修饰通过氨基酸残基的置换、氨基酸残基的缺失、和/或基于氨基酸残基的置换或缺失的糖链导入而进行。

(6)根据(5)的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSVgD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(7)根据(5)或(6)的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(8)根据(5)～(7)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(9)根据(5)的修饰型HSV gD蛋白，其中，野生型HSV gD的胞外结构域包含序列号1记载的氨基酸序列，

诱饵表位的修饰包含选自由下述修饰组成的组中的至少1种修饰：

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第51位的脯氨酸残基置换为脯氨酸残基以外的氨基酸残基而导入糖链来进行的修饰；

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第76位的谷氨酸残基置换为丝氨酸残基而导入糖链来进行的修饰；及

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸残基置换为天冬酰胺残基而导入糖链导入来进行的修饰。

(10)根据(5)～(9)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，糖链为N型糖链。

(11)根据(1)～(10)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰型HSV gD蛋白进一步在HSV gD的胞外结构域的C末端侧连接有至少1个非种系选择性T细胞表位。

(12)根据(11)的修饰型HSV gD蛋白，其中，非种系选择性T细胞表位为包含序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、或序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

(13)根据(12)的修饰型HSV gD蛋白，其中，非种系选择性T细胞表位为包含序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

(14)根据(1)～(13)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰型HSV gD蛋白还包含：野生型HSV gD的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第251～315位的氨基酸残基的氨基酸残基中的至少一部分的缺失。

(15)根据(1)～(14)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰型HSV gD蛋白进一步包含：通过将野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第231位的缬氨酸残基的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基而进行的修饰。

(16)根据(1)～(15)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，HSV为HSV-1或HSV-2。

(17)一种HSV疫苗，其包含(1)～(16)中任一项的修饰型HSV gD蛋白。

(18)一种修饰型HSV gD蛋白，其为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白(修饰型HSV gD蛋白)，其是按照使野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、存在于gD胞外结构域的N末端脯氨酸富集区域(PRR)的B细胞表位中的至少1个表位不发挥表位的功能的方式修饰而得的。

(19)根据(18)的修饰型HSV gD蛋白，其中，存在于PRR的B细胞表位为：

包含存在于下述区域的至少1个氨基酸残基的表位，其中，所述区域为在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于上述第50位的脯氨酸残基的氨基酸的距离为1.5nm以下的区域。

(20)根据(18)或(19)的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰通过基于氨基酸残基的置换或缺失的糖链导入而进行。

(21)根据(20)的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(22)根据(20)或(21)的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(23)根据(20)～(22)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

(24)根据(20)的修饰型HSV gD蛋白，其中，野生型HSV gD的胞外结构域包含序列号1记载的氨基酸序列，

修饰包含选自由下述修饰组成的组中的至少1种修饰：

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第51位的脯氨酸残基置换为脯氨酸残基以外的氨基酸残基而导入糖链而进行的修饰、

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第76位的谷氨酸残基置换为丝氨酸残基而导入糖链而进行的修饰、及

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸残基置换为天冬酰胺残基而导入糖链而进行的修饰。

(25)根据(19)～(24)中任一项的修饰型HSV gD蛋白，其中，修饰型HSV gD蛋白进一步在HSV gD的胞外结构域的C末端侧连接有至少1个非种系选择性T细胞表位。

(26)根据(25)所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，非种系选择性T细胞表位为包含序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、或序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

(27)根据(26)的修饰型HSV gD蛋白，其中，非种系选择性T细胞表位为包含序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

发明的效果

在利用本发明的修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗进行免疫诱导时，与用野生型HSV gD进行免疫诱导时相比，血清中可包含相对多的中和活性高的中和抗体。即，本发明的修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗能够诱导免疫再聚焦、带来对HSV的强防御效果。因此，可以期待对HSV感染症的高预防·治疗效果。

附图说明

图1是示出HSV gD的一级结构的示意图的图。

图2是示出用竞争ELISA分析实施例2的抗gD2抗体No.82与进行了丙氨酸置换的gD修饰体的反应性的结果的图。

图3是示出HSV gD晶体结构上的gD受体结合结构域(RBD)周边区域及P50周边区域的MOE图的图。

图4是示出对小鼠预防性给药实施例5的抗gD抗体后的存活率的图。

图5是示出对小鼠预防性给药实施例5的抗gD抗体后的症状评分的图。

图6是示出对小鼠治疗性给药实施例5的抗gD抗体后的存活率的图。

图7是示出对小鼠治疗性给药实施例5的抗gD抗体后的症状评分的图。

图8是示出对豚鼠预防性给药实施例6的抗gD抗体后的症状评分的图。

图9是示出对豚鼠治疗性给药实施例6的抗gD抗体后的症状评分的图。

图10是示出对豚鼠治疗性给药实施例6的抗gD抗体后阴道拭液中的HSV释放量的图。

图11是示出实施例7的合成肽的小鼠T细胞刺激活性分析的图，(A)示出产生IFN-γ的ELISpot分析结果，(B)示出产生IL-2的ELISpot分析结果。

图12是示出修饰型gD蛋白的设计策略的示意图的图。

图13是示出实施例9所制作的各种gD修饰体与抗gD2抗体No.82的反应强度的图。

图14是示出实施例9所制作的各种gD修饰体与HVEM的反应性的图。

图15是示出实施例9的使用小鼠的中和抗体诱导活性的分析结果的图。

图16是示出实施例9的使用小鼠的中和抗体诱导活性的分析结果的图。

图17是示出实施例9的使用小鼠的中和抗体诱导活性的分析结果的图。

图18是示出实施例9的使用小鼠的中和抗体诱导活性的分析结果的图。

图19是示出实施例9的使用小鼠的中和抗体诱导活性的分析结果的图。

图20是示出实施例9的基于ELISA法的抗gD结合抗体诱导活性的分析结果的图。

图21是示出实施例9的基于ELISA法的抗gD结合抗体诱导活性的分析结果的图。

图22是示出实施例9的基于ELISA法的抗gD结合抗体诱导活性的分析结果的图。

图23是示出实施例9的基于ELISA法的抗gD结合抗体诱导活性的分析结果的图。

图24是示出实施例9的基于ELISA法的抗gD结合抗体诱导活性的分析结果的图。

图25是示出实施例9的细胞免疫(T细胞免疫)诱导活性的结果的图。

图26是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验1的存活率的图。

图27是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验1的存活率的图。

图28是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验1的存活率的图。

图29是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验2的存活率的图。

图30是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验3的存活率的图。

图31是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验4的存活率的图。

图32是示出实施例9的修饰型gD的小鼠抗感染试验的实验4的存活率的图。

图33是示出实施例9的免疫血清中的抗体群体的分析结果的图。

图34是示出实施例9的修饰型gD免疫血清对gD-HVEM相互作用的抑制的结果的图。

图35是示出对HSV-1来源的gD的氨基酸序列(序列号2)及HSV-2来源的gD的氨基酸序列(序列号3)进行多重比对的比较结果的图，斜体部表示前导序列，下划线部表示gD的第50-54位的氨基酸残基(P50-P54)。

具体实施方式

以下详细说明用于实施本发明的方式。但是，本发明不受以下实施方式限定。

本发明的修饰型HSV gD蛋白为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白，其为如下进行了修饰(去表位)的蛋白质，野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、与存在于受体结合结构域(RBD)的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位(诱饵表位)中的至少1个不发挥作为表位的功能。

本发明基于本发明人们所提出的假说、即HSV gD抗原中存在“诱饵区域”。“诱饵区域”来源于英语的“Decoy(诱饵)”，被认为是病原体逃避宿主的免疫反应的免疫逃逸机制之一。“诱饵区域”为诱导无中和抗体活性的抗体或中和抗体活性低的抗体的抗原区域，一般认为机制如下：通过该欺骗性印记(Deceptive Inprinting；也称为“免疫偏离”)而使得不产生中和抗体或产生量少，从而病原体得以逃避宿主的免疫反应。

到目前为止，尚未确认HSV中诱饵区域的存在，也没有诱饵区域的概念。本发明人等对于通过用人抗体文库实施的抗HSV gD抗体的详尽搜索得到的抗gD单克隆抗体，进行了详细的表位作图分析。结果是，通过将HSV gD的B细胞表位分为无益或有害的表位以及可以诱导中和抗体的有益表位，明确了无益或有害的表位集中的诱饵区域的存在。并且，通过对诱饵区域的无益或有害的表位进行去表位化、而使有益表位在免疫学上突显，从而得到了可以诱导中和活性高的抗体的修饰型HSV gD蛋白。

“野生型HSV gD”是指：具有序列号2记载的氨基酸序列的HSV-1来源的包膜糖蛋白D(gD)、或具有序列号3记载的氨基酸序列的HSV-2来源的gD(GenBank登录号：ABU45433.1)的全长序列，对两者进行多重比对，比较结果是其序列同源性为84％(图35)。对gD的立体结构也进行了分析，例如，获知HSV-1来源的gD包括：具有第317-339位的氨基酸残基的跨膜结构域、具有第340-369位的氨基酸残基的细胞内结构域及具有第1-316位的氨基酸残基的胞外结构域。非专利文献7报道了HSV-1来源的gD的单晶结构，非专利文献2及6报道了其共晶结构。另一方面，非专利文献11及12报道了HSV-2来源的gD的晶体结构。“野生型HSV gD的胞外结构域”是指可溶性的、具有抗原性的、野生型HSV gD的细胞外区域。野生型HSV gD的胞外结构域的一例为由序列号1记载的氨基酸序列构成的、HSV-2的333株来源的野生型gD胞外结构域1-315。

“修饰型HSV gD蛋白”(也称为“HSV gD的修饰蛋白”或“修饰体”。)是指：相对于野生型HSV gD，至少一个氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域发生了置换、缺损或添加的蛋白质，也包括基于氨基酸残基的置换或缺失而导入了糖链的蛋白质等进行了野生型中不存在的蛋白质修饰而得到的蛋白质。

“中和抗体诱导活性”是指：能够诱导抗原蛋白的中和抗体的能力，可以用将抗原蛋白接种于被检动物而得到的免疫血清中的中和抗体效价(neutralizing antibodytiter)来评价。“中和抗体”是指：可以使病毒粒子失去感染性的抗体，例如通过使被检病毒的噬斑数减少50％所需要的抗体浓度(NT50)来评价该抗体的中和活性的高低。

将野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的具有高的中和抗体诱导活性的B细胞表位称为“有益表位”。作为野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的有益表位，典型例子为存在于受体结合结构域(RBD)的B细胞表位。特别列举包含下述氨基酸残基的表位，所述氨基酸残基相当于选自由序列号1记载的氨基酸序列中的第134位的精氨酸残基、第139位的天冬氨酸残基及第222位的精氨酸残基组成的组中的至少1个氨基酸残基。

“诱饵表位”是指：野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、与存在于RBD中的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位，本说明书中归类为“无益或有害的表位”。“诱饵表位”优选为：野生型HSV gD的胞外结构域中的、与包含下述氨基酸残基的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位，所述氨基酸残基相当于选自由序列号1记载的氨基酸序列中的第134位的精氨酸残基、第139位的天冬氨酸残基及第222位的精氨酸残基组成的组中的至少1个氨基酸残基。作为本实施方式的HSV gD的胞外结构域中的“诱饵表位”，可列举存在于gD胞外结构域的N末端脯氨酸富集区域(PRR)的表位。

将诱饵表位集中的区域称为“诱饵区域”。根据本发明人们的分析结果，例如HSVgD的PRR为诱饵区域。PRR在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构中位于RBD的相反侧(图3)。PRR的P50周边区域为特别典型的诱饵区域。“P50周边区域”是指：在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于由序列号1记载的氨基酸序列构成的、HSV-2来源的野生型gD胞外结构域1-315中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基的距离为1.5nm以下的区域。这里，不论野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面形状如何，“与……氨基酸残基的距离”均是指与相当于上述第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基的直线距离。

诱饵表位的一例为：包含野生型HSV gD的胞外结构域中的、相当于由序列号1记载的氨基酸序列构成的HSV-2来源的野生型gD胞外结构域1-315中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基的表位。

这里“相当于……的”氨基酸残基是指：将由序列号1记载的氨基酸序列构成的HSV-2来源的野生型gD胞外结构域的氨基酸序列与其它具有类似性的gD的氨基酸序列进行多重比对(多重序列比对)时，在对齐后的序列中，位于规定的与序列号1所记载的氨基酸残基对应的位置的、其它具有类似性的gD的氨基酸残基。

诱饵表位的另一例为包含存在于下述区域的至少1个氨基酸残基的表位，所述区域为：在HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于由序列号1记载的氨基酸序列构成的HSV-2来源的野生型gD胞外结构域1-315中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸的距离为1.5nm以下的区域(即，P50周边区域)。该诱饵表位可以由野生型HSV gD的晶体结构来确定。上述距离优选为1nm以下。

通过上述诱饵表位的去表位，在用于免疫诱导时可以减少无益或有害的抗体的产生比例，另外可以使有益表位突显，从而可以增加中和活性高的中和抗体的产生比例。

“去表位”是指：按照使野生型HSV gD中的、作为表位来帮助抗体产生的部位不发挥表位的功能的方式进行修饰，也称为表位的屏蔽。作为去表位的方法，可列举：将位于表位的位点的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基的方法；使位于表位的位点的氨基酸残基缺失(缺损)的方法及基于位于表位的位点的氨基酸残基的置换或缺失而导入糖链的方法等。作为去表位的方法，优选导入糖链的方法、特别是导入N型糖链(N-糖苷键合糖链)的方法。由此，不仅导入了糖链的部分，其庞大的体积使得周边的诱饵表位也同时被屏蔽，因此是有效的。考虑到gD与相互作用的抗体、受体等蛋白质的尺寸比，可以推测利用以数个氨基酸左右的极狭窄的范围形成键合那样的、发生点对点的相互作用的可能性低。可以认为，在gD与受体结合时，是大范围的氨基酸协同地形成键合那样的通过面与面形成相互作用网来。可以认为，糖链导入是利用自身体积庞大而广泛地遮挡周边残基、同时抑制结合对象靠近(access)的有效的去表位方法。另外，有报道指出糖链不易诱导抗糖链抗体(非专利文献10)，认为可将由于修饰而产生新的免疫原性的可能性抑制为较低。

向氨基酸残基导入糖链是指：该氨基酸残基位置基于氨基酸的缺损、置换或添加，向包括该氨基酸残基的位置在内的3个连续的氨基酸残基导入糖链。糖链的导入方法为常规方法即可，没有特别限定，例如，在导入N型糖链时，以野生型gD蛋白胞外结构域的氨基酸序列(序列号1)为模板，按照使要导入N型糖链的目标部位的3个连续氨基酸序列成为N-X-S/T(X为脯氨酸以外的任意氨基酸)的方式设计引物，利用PCR导入突变。将目标突变gD蛋白的核酸序列、以及必要时连接有6×His等标签的核酸序列克隆到合适的载体中并使其表达，可以得到gD修饰体。然后利用常规方法在gD修饰体的目标部位的天冬酰胺上添加N型糖链。作为N型糖链，可列举例如以GlcNAc为基础的高甘露糖型、杂合型、复杂型等。

去表位即诱饵表位的修饰优选包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基、第74位的脯氨酸及第186位的精氨酸的氨基酸残基中的至少1者导入糖链而进行的修饰。特别地，更优选野生型HSV gD的胞外结构域由序列号1记载的氨基酸序列构成、且包含选自由下述修饰组成的组中的至少1种修饰：诱饵表位的修饰；通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第51位的脯氨酸残基置换为脯氨酸残基以外的氨基酸残基而导入糖链来进行的修饰；通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第76位的谷氨酸残基置换为丝氨酸残基而导入糖链来进行的修饰；及、基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸残基置换为天冬酰胺残基而导入糖链来进行的修饰。

修饰型HSV gD蛋白还包含：野生型HSV gD的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第251～315位的氨基酸残基的氨基酸残基中的至少一部分的缺失。相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第251～315位的氨基酸残基的氨基酸残基形成野生型HSV gD的胞外结构域中的C末端功能区域3(FR3)。使该部分中的至少一部分缺失对于诱导免疫再聚焦于有益表位也是有效的。文献报道的某HSV gD1的晶体结构分析(非专利文献7)启示了：FR3及作为N末端侧序列的FR1可以以卷绕方式结合在gD分子内的作为核心β折叠结构的FR2的同一面。FR1与FR3彼此妨碍，因此仅其中的一者能够与FR2结合。据推测，通常FR3结合在病毒包膜上，在与受体结合时，按照FR3脱离、FR1进行结合的方式变构而使受体结合区域露出。在本发明人等独立得到的中和抗体No.82的表位分析中获知，抗体No.82与结合素-1结合区域进行结合、与FR1缺失体(gD34-315)的反应性降低、抑制gD与HVEM或结合素-1的结合。即，可以认为：为了使抗体No.82的表位、即RBD突显、诱导针对该区域的免疫再聚焦而言，使FR3缺失或抑制FR3与FR2的结合的方法是有效的。

使FR3的至少一部分缺失还包括：使整个FR3缺损或者使FR3的部分连续或非连续的序列缺损、以及将部分氨基酸残基置换为其它氨基酸残基。使FR3的一部分缺失优选例如：使相当于由序列号1记载的氨基酸序列构成的HSV-2来源的野生型gD胞外结构域1-315中的第276-315位的氨基酸残基的部分缺损，也可以是第276-315位的氨基酸残基全部缺损或一部分缺损。

修饰型HSV gD蛋白优选进一步在HSV gD的胞外结构域的C末端连接有至少1个非种系选择性T细胞表位。跨膜区域、细胞内区域也存在T细胞表位，但考虑到作为疫苗使用，优选设计为由细胞外区域构成的分泌表达型，因此通过连接跨膜区域或细胞内区域的T细胞表位，从而可以有效地利用细胞外区域所不含的T细胞表位，因此是优选的。

本发明人等针对包括gD2的细胞内结构域在内的全长详尽地搜索了HLA Class II限制性非种系选择性T细胞表位簇，结果发现了下述的DP1-DP5这5个簇肽。作为非种系选择性T细胞表位，优选由序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、或序列号8记载的氨基酸序列构成的非种系选择性T细胞表位。其中，实际上对小鼠及人两者的T细胞均具有非种系选择性的刺激活性的是DP2、DP3、DP5这3种肽。其中，特别优选由序列号8记载的氨基酸序列构成的DP5。也可以将多个非种系选择性T细胞表位连接。具体而言，例如非种系选择性T细胞表位的连接可以包括以下方式：在野生型HSV gD的胞外结构域的C末端连接2个以上的由序列号8记载的氨基酸序列构成的非种系选择性T细胞表位。

[表1]

表1.推定的HSV gD上的非种系选择性T细胞表位簇序列

	序列	氨基酸序列	长度	序列号
					DP1	gD2 35-49	KRVYHIQPSLEDPFQ	15	4
DP2	gD2 55-71	ITVYYAVLERACRSVLL	17	5
					DP3	gD2 170-191	INDWTEITQFILEHRARASCKY	22	6
DP4	gD2 314-329	PGLIIGALAGSTLAVL	16	7
					DP5	gD2 334-350	IAFWVRRRAQMAPKPLR	17	8

一实施方式中，HSV gD蛋白还包含：将相当于由序列号1记载的氨基酸序列构成的HSV-2来源的野生型gD胞外结构域1-315中的第231位的缬氨酸残基的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基(特别是色氨酸残基)。由于已明确V231W突变可抑制FR3与FR2的结合(非专利文献9)，因此从抑制FR3与FR2结合的观点出发，优选包含该进一步突变的修饰体。通过该突变，可以进一步突显存在于受体结合结构域的B细胞表位，在免疫诱导时可以增加中和抗体的产生比例。

本发明的修饰型HSV gD蛋白可通过基因工程手法来制作。制作方法没有特别限定，例如可以如下得到：以野生型gD蛋白的cDNA(序列号33)为模板，设计用于导入目标突变的引物，通过PCR得到导入了突变的核酸，与表达启动子功能地连接，根据情况也连接标签，导入合适的表达载体并使其表达。另外，在为利用糖链导入的修饰体的情况下，可以如上所述地得到。载体及启动子没有特别限定，可列举例如pCAG载体及CAG启动子。

制作的修饰型HSV gD蛋白可根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举利用亲和色谱柱、凝胶过滤色谱柱及离子交换色谱柱等进行的纯化。

HSV感染症包括由HSV-1及HSV-2引起的感染症，可列举例如口唇疱疹、角膜疱疹、生殖器疱疹、系统性新生儿疱疹、以及起因于HSV的口腔炎、皮肤病、脑炎、髓膜炎及脊髓炎。

本发明的HSV疫苗包含本发明的修饰型HSV gD蛋白。

本实施方式的HSV疫苗的剂形可以为例如液状、粉末状(冻干粉末、干燥粉末)、胶囊状、片剂、冷冻状态。

本实施方式的HSV疫苗可包含药学上允许的载体。作为上述载体，可以无限制地使用疫苗制造中通常使用的载体，具体可列举食盐水、缓冲食盐水、葡聚糖、水、甘油、等渗水性缓冲液及它们的组合。疫苗可以进一步适宜配合乳化剂、防腐剂(例如硫柳汞)、等渗化剂、pH调节剂等。

为了进一步提高本实施方式的HSV疫苗的免疫原性，还可以进一步包含佐剂。作为佐剂，可列举例如铝佐剂或含角鲨烯的水包油型乳浊佐剂(AS03、MF59等)、CpG及3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂质A(MPL)等Toll样受体的配体、皂甙系佐剂、聚γ-谷氨酸等聚合物系佐剂、脱乙酰壳多糖及菊粉等多糖类。

本实施方式的HSV疫苗可通过将本发明的修饰型HSV gD蛋白与根据需要的载体、佐剂等混合而得到。佐剂可以是临用时混合的类型。

本实施方式的HSV疫苗的给药途径可以为例如经皮给药、舌下给药、滴眼给药、皮内给药、肌肉内给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、从口向肺的吸入给药。

本实施方式的HSV疫苗的给药方法例如可以为通过注射器、经皮贴片、微针、可转移的缓释性设备、带微针的注射器、无针装置、喷雾给药的方法。

实施例

以下利用实施例来详细说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。

实施例1抗HSV gD单克隆抗体的取得

＜单链抗体噬菌体(scFv-phage)的取得＞

为了实施HSV-2 gD(gD2)的详尽表位分析，通过以gD2为对象的生物淘选(biopanning)取得了与gD2上的各种表位结合的各种抗体。作为gD2，使用具有序列号1记载的氨基酸序列的、来自HSV-2的333株的野生型的作为可溶性胞外结构域(ectodomain)的gD1-315蛋白。使宿主细胞表达gD1-315蛋白并对其进行纯化。作为文库应用单链抗体噬菌体展示文库，所述单链抗体噬菌体展示文库是使用由人B细胞来源的mRNA制作的人VH及VLcDNA而制备的。-单链抗体噬菌体展示文库通过对由人B细胞来源的mRNA、使用人VH及VLcDNA而制备的-单链抗体噬菌体展示文库进行筛选，得到对HSV-2 gD有反应性的-单链抗体噬菌体。

＜噬菌体ELISA＞

实施淘选之后，使所分离的-单链抗体噬菌体表达。将具有克隆有各scFv基因的噬菌粒载体的大肠菌TG1株用2×YTCG培养基(37℃)进行培养，以moi＝20感染M13K07辅助噬菌体后，用2×YTCK培养基(25℃)进行一整晚的噬菌体表达。将得到的单链抗体噬菌体用20％-PEG-2.5M氯化钠进行浓缩。

对于表达后的-单链抗体噬菌体，利用噬菌体ELISA确认对gD1-315的反应性。在4℃下用一整晚将100μL的gD2(2μg/mL PBS)固相化到96孔微量滴定板(MaxiSorp plate、NUNC)后，将各孔用PBS洗涤3次，用300μL的1％BSA/PBS在室温下封闭1小时。将各孔用PBS-T(0.05％Tween/PBS)洗涤3次，将-单链抗体噬菌体用1％BSA/PBS稀释10倍，加入100μL，在37℃下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，加入HRP标记抗体(用1％BSA PBS稀释的带有HRP的抗M13抗体：抗M13/HRP/1％BSA PBS)，在37℃下反应1小时。用PBS-T洗涤各孔，用酶底物(TMB)在室温下显色30分钟，用1N硫酸停止反应后，测定450nm/650nm的吸光度(显色值)。

分析单链抗体噬菌体的每个克隆对gD1-315的反应性的结果是，所回收的188个克隆中，101个克隆与抗原显示特异性结合。进一步对该101个克隆进行VH链及VL链基因序列分析，结果取得了7种序列独特的克隆。

＜scFv-hFc的制作＞

以取得的7种-单链抗体噬菌体为基础制作scFv-hFc。将分离出的scFv基因的可变区与人Fc基因连接，克隆到pCAG载体中，从而构建scFv-hFc表达质粒。用Expi293表达系统(Life technology)进行各表达用质粒的表达。培养4～6天后，将其上清用蛋白A亲和色谱柱(HiTrap Protein AHP Columns、GE Healthcare)纯化，用PBS进行透析。利用尺寸排阻色谱(Superdex 200 5/150 GL、GE Healthcare)和SDS-PAGE确认其纯度。

＜使用结合素-1的竞争抑制试验＞

对于制作的scFv-hFc，使用作为gD受体的结合素-1实施竞争抑制试验。

竞争抑制试验通过以下的竞争ELISA来实施。在室温下用2小时将100μL的gD2(2μg/mLPBS)固相化于96孔微量滴定板(MaxiSorp plate、NUNC)。然后，将各孔用PBS洗涤3次，用300μL的1％BSA PBS在室温下封闭1小时。将各孔用PBS-T(0.05％Tween PBS)洗涤5次，将20μg/mL的scFv-hFc用1％BSA PBS以任意的稀释倍率稀释，加入100μL，在37℃下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，将-单链抗体噬菌体或结合素-1(重组人结合素-1蛋白(Recombinant Human Nectin-1 Protein)、R&D SYSTEMS)用1％BSA PBS以任意的稀释倍率稀释，加入100μL，在37℃下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，加入HRP标记抗体(抗M13/HRP/1％BSA PBS或用1％BSA PBS稀释的带有HRP的抗His-标签抗体：抗His-标签/HRP/1％BSA PBS)，在37℃下反应1小时。用PBS-T洗涤各孔，用TMB在室温下显色30分钟，用1N硫酸停止反应后，测定450nm/650nm的吸光度(OD值)。在相对于scFv-hFc不存在下的OD值显示50％以上的OD值下降的情况下，视为有竞争。

＜结果＞

将结果示于表2。根据竞争模式将7种-单链抗体噬菌体分为3组。属于组A的抗体No.82与结合素-1发生强烈竞争，因此表明表位存在于结合素-1结合区域。仅No.1属于组B，其不与其它抗体及受体结合素-1竞争。组C由剩余的5个克隆(No.5、No.13、No.72、No.75、No.78)构成，一方面相互间发生竞争，另一方面则不与受体结合素-1竞争。

[表2]

表2. 7种抗HSV-2 gD抗体

对于各scFv基因的VH链及VL链基因的DNA碱基序列，使用Big DyeTerminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)进行测定，结果抗体No.82具有由序列号9～11记载的氨基酸序列构成的重链CDR1～重链CDR3、且具有由序列号12～14记载的氨基酸序列构成的轻链CDR1～轻链CDR3。

重链CDR1：GYAIN(序列号9)

重链CDR2：GIMPIFGTSNYAQKFQ(序列号10)

重链CDR3：DWGAPLEKGAGSPFDV(序列号11)

轻链CDR1：RASQSVSSSYLA(序列号12)

轻链CDR2：GASSRAT(序列号13)

轻链CDR3：QQYGSSPRS(序列号14)

实施例2抗gD2结合抗体的表位作图

＜利用变性的表位分析＞

通过使用变性状态的gD1-315的蛋白质印迹，分析各抗体的表位是构象(conformational)表位还是线性(linear)表位。

蛋白质印迹如下进行。将500ng的变性或未变性的gD1-315上样到8-16％SDS-PAGE中进行电泳。变性状态的gD1-315是向gD1-315中加入2％2-巯基乙醇并在96℃煮沸5分钟而得到的。非变性状态的gD1-315则不进行这些操作，而是直接上样。电泳结束后，将凝胶转印到硝酸纤维素膜(Immobilon-P、MILLIPORE)上，用2％脱脂乳-PBS-T进行封闭。利用PBS-T进行洗涤，然后使膜与1μg/mL 2％脱脂乳-PBS-T浓度的各scFv-hFc在室温下反应30分钟。再次进行洗涤，然后与抗hFc/HRP/2％脱脂乳-PBS-T反应，通过Immobilon WesternDetection Regent(Millipore)进行显色。

其结果是，与利用变性剂及热激(heat shock)而变性后的gD1-315显示出反应性的抗体为No.1及No.13这两者，表明这些的表位为线性表位。其它抗体均仅与非变性状态的gD1-315显示出反应性，因此表明为构象表位。

＜使用利用糖链导入的gD修饰体的抗体的表位作图＞

研究了使用利用N-结合型糖链导入的gD修饰体的表位屏蔽(epitope masking)法。在选择糖链的导入部位时，基于已报道的晶体结构(非专利文献1、2及6),以在晶体结构表面露出且不形成二级结构的环部位为对象。图1示出gD的一级结构的示意图，分别示出FR1(K1～H39)、FR2(I55～R184)、FR3(T251～G315)。另外，本来就添加到gD上的糖链结合在N94、N121及N262上。作为糖链导入部位，选择了P50(SC-F)、P54(SC-K)、P74(SC-D)、S85(SC-L)、G103(SC-E)、D172(SC-M)、R186(SC-A)、L195(SC-H)及H242(SC-B)这9个。

在构建gD修饰体的表达质粒时，以来自HSV-2的333株的野生型gD蛋白的cDNA(序列号33)为模板。N-结合型糖链结合在N-X-S/T(X为脯氨酸以外的任意氨基酸)的天冬酰胺上，因此，在导入糖链时，使用以下的引物利用PCR使其突变，使得目标部位的氨基酸序列为NXT或NXS(X为脯氨酸以外的任意氨基酸)。Fw表示正向，Re表示反向。下划线为突变的部分。基因合成设计成为信号序列后接着是目标突变gD蛋白的核酸序列、然后为6×His的核酸序列的DNA，并克隆到pUC19载体中。

SC-A-Fw:5’-CGGGCCAATGCCTCCTGCAAGTACGCT-3’(序列号15)

SC-A-Re:5’-GGAGGCATTGGCCCGGTGCTCCAGGAT-3’(序列号16)

SC-B-Fw:5’-GGGTGGAATGGCACCAAGCCCCCGTACACCAGC-3’(序列号17)

SC-B-Re:5’-GGGCTTGGTGCC ATTCCACCCGGCGATTTTTAA-3’(序列号18)

SC-D-Fw:5’-CATGCCAATTCGACCGCCCCCCAGATCGTGCGC-3’(序列号19)

SC-D-Re:5’-GGGGGCGGTCGAATTGGCATGTAGGAGCACGCT-3’(序列号20)

SC-E-Fw:5’-CGCATGAATGACACCTGCGCTATCCCCATCACG-3’(序列号21)

SC-E-Re:5’-AGCGCA GGTGTCATTCATGCGATACCAGGCGAT-3’(序列号22)

SC-F-Fw:5’-TTCCAG AATGCAAGCATCCCGATCACTGTGTAC-3’(序列号23)

SC-F-Re:5’-CGGGATGCTTGCATTCTGGAACGGGTCCTCCAG-3’(序列号24)

SC-H-Fw:5’-CTCCCCAATCGCACGCCCCCGGCAGCGTGCCTC-3’(序列号25)

SC-H-Re:5’-CGGGGGCGTGCGATTGGGGAGAGCGTACTTGCA-3’(序列号26)

SC-K-Fw:5’-AGCATC AATATCACTGTGTACTACGCA-3’(序列号27)

SC-K-Re:5’-AGTGAT ATTGATGCTGGGGGGCTGGAA-3’(序列号28)

SC-L-Fw:5’-GGGGCTAATGACACCGCCCGAAAGCACACGTAC-3’(序列号29)

SC-L-Re:5’-TCGGGCGGTGTCATTAGCCCCGCGCACGATCTG-3’(序列号30)

SC-M-Fw:5’-ATAAACAATTGGACGGAGATCACACAA-3’(序列号31)

SC-M-Re:5’-CGTCCA ATTGTTTATCTTCACTAGCCG-3’(序列号32)

将完成的修饰体序列克隆到pCAGGS1-dhfr-neo载体中，得到表达用质粒。使用Expi293表达系统表达各表达用质粒。培养4～6天后，将其上清用Ni-NTA亲和色谱柱(TALONsuperflow Metal Affinity Resin、TaKaRa)纯化、用PBS进行透析。利用尺寸排阻色谱和SDS-PAGE确认其纯度。

对于这些糖链导入突变体，通过竞争ELISA实施各抗体的反应性分析。在4℃下用一晚将100μL的gD修饰体(2μg/mLPBS)固相化于96孔微量滴定板(MaxiSorp plate、NUNC)。将各孔用PBS洗涤3次，用300μL的1％BSA PBS在室温下封闭1小时。将各孔用PBS-T(0.05％Tween PBS)洗涤3次，将各scFv-hFc用1％BSA PBS以任意的稀释倍率稀释，加入100μL，在37℃下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，加入HRP标记抗体(用1％BSA PBS稀释的带有HRP的抗hFc抗体：抗hFc/HRP/1％BSA PBS)，在37℃下反应1小时。用PBS-T洗涤各孔，用TMB在室温下显色30分钟，用1N硫酸停止反应后，测定450nm/650nm的吸光度(OD值)。相对于野生型的gD1-315的吸光度，为低于30％者视为抑制(-)，为30％以上且低于70％者视为部分抑制(±)，为70％以上(+)者视为不抑制。将结果示于表3。

＜使用利用缺失的gD修饰体的抗体的表位作图＞

通过全合成制作gD1-275、gD25-253、gD34-315这3种缺失修饰体(图1)。

与上述同样地，使用竞争ELISA实施这些缺失修饰体与各抗体的反应性分析，将其结果示于表3。

[表3]

表3.抗gD2抗体对各种gD突变体的反应性

L：线性表位 c：构象表位

[相对于野生型gD1-315的吸光度的OD值]-：小于30％，±：30％以上且小于70％，+：70％以上

根据表3的结果，向P50(SC-F)及P54(SC-K)导入了糖链的gD1-315在竞争抑制试验中与被分为同一组的抗体No.5、No.72、No.75、No.78的反应性被完全抑制。另外，H242(SC-B)与No.75、No.82的反应被部分抑制。一般认为H242(SC-B)是抗体No.82在结构上无法直接靠近的部位，但我们推测在氨基酸序列上靠近而容易受到变构的影响。另外，H242(SC-B)的导入位置是与P50(SC-F)的距离相当远的位置，推测抗体No.75的反应性下降是由某种间接影响导致的。另一方面，对SC-A、D、E、H、L、M导入糖链则不影响与各抗体的结合性。

关于缺失体，作为C末端(FR3)缺失体的gD1-275和gD25-253与抗体No.1的反应性消失。此前的分析表明抗体No.1具有线性表位，因此认为抗体No.1的表位存在于275～315之间。

另外，关于与gD1-275的反应性没有变化的抗体No.72和抗体No.75，使用gD25-253时与抗体No.72的反应下降，与抗体No.75的反应则消失。这表明抗体No.72和抗体No.75的至少部分表位存在于gD254-275之间。晶体结构上，gD254-275存在于P50(SC-F)附近，可以认为这些抗体可能识别这两者。特别是关于在H242(SC-B)的情况下反应性也下降的抗体No.75，对gD254-275中的表位的结合依赖度高，因此推测可能受到存在于FR3附近的H242(SC-B)的大幅影响。

另一方面，使用作为N末端(FR1)缺失体的gD34-315时，与抗体No.72的反应性下降。但是，根据此前的分析从结构角度难以认为抗体No.72的表位存在于FR1，认为应考虑FR1缺失对FR3的影响。晶体结构分析表明：FR1及FR3可以以卷绕方式结合在gD的核心β折叠结构即FR2的同一面上(非专利文献6)。FR1与FR3彼此妨碍，因此仅其中的一者能够与FR2结合。推测gD254-275为处于FR3的“根部”的柔性区域，所以与抗体No.72和抗体No.75的结合强度根据FR3的整体结构而变化。即，可以认为：作为FR1缺失体的gD34-315中，FR3与FR2结合，其结果是P50(SC-F)附近的表位与gD254-275中的表位越来越远，从而反应性下降。同样，抗体No.75也应该会受P50(SC-F)附近的表位与gD254-275中的表位远离的影响，但是抗体No.75与gD254-275强烈结合，因此推测不易受到该影响。

获知在使用作为N末端(FR1)缺失体的gD34-315的情况下与抗体No.82的反应性也下降。由此认为，抗体No.82的表位可能存在于1-33氨基酸之间、以及FR3结合于FR2可能抑制抗体No.82的靠近。另外，在gD25-253的情况下也未观察到反应性下降，因此认为抗体No.82的表位存在于25-33之间的想法是合理的。

＜使用了丙氨酸置换体的丙氨酸扫描＞

以上述得到的信息为基础，使用丙氨酸置换体对预测存在抗体No.82的表位的结合素-1结合区域即受体结合结构域(RBD)、及P50(SC-F)的周边区域进行丙氨酸扫描。选择被认为在结构上会露出表面的氨基酸作为中心、制作将氨基酸置换为丙氨酸的突变体14个、作为中和抗体LP2的封闭突变体(blocking mutant)的T213M、S216N。通过PCR构建各修饰为丙氨酸的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。表达时，使用FreeStyle293或Expi293表达系统。

通过竞争ELISA分析抗体No.82抗体与进行了丙氨酸置换的gD修饰体的反应性。将其结果示于图2。在抗体No.82的反应性分析中，R134A、D139A、T213M、S216N、R222A这5个突变体的反应性显著下降，R196A的反应性下降。这些氨基酸均为位于同一界面的、非常靠近的位置的氨基酸，特别是S216、R222，据报道为结合素-1的结合部位。这再一次表明，抗体No.82是结合在结合素-1结合区域的。

另一方面，在FR1的丙氨酸置换体中，D30A时观察到反应性下降。D30被认为是存在于25-33氨基酸的表位的一部分，在FR1结合于FR2的状态下，由于FR1的阻挡，R222周边与D30周边不能存在于同一界面上。因此可以认为，在抗体No.82进行结合时是一边解除FR1与FR2的结合一边进行反应的。

另外，对于抗体No.82以外的抗体而言，在使用SC-F周边丙氨酸置换体的反应性分析中，可见同表3所示的各种抗gD2抗体与各种gD突变体的反应性结果几乎一致的倾向。关于抗体No.78，在P51A和I55A的情况下反应性下降。抗体No.72则在V57A和E256A的情况下观察到反应性下降，抗体No.75则除了V57A和E256A以外还在I55A和D259A的情况下观察到反应性下降。结果支持了SC-F与所有的这些残基均位于同一界面上的邻近位置、特别是抗体No.72和抗体No.75的表位的一部分存在于254-275之间的这一假说。关于抗体No.5，与抗体No.5的反应性下降的丙氨酸置换体为I55、E76、I80这3个，与抗体No.72、抗体No.75、抗体No.78的结合区域则分散在以I55为中心的、约120°左右的不同方向上。抗体No.13的表位未知。认为原因是：明确了抗体No.13的表位为线性表位，但现有的突变体不能对其表位直接进行突变。

根据表位作图的结果，推定7个抗体克隆的表位如表4所示。图3示出了HSV gD结构上的gD受体结合结构域(RBD)周边区域及P50周边区域的MOE图。图3中可以确认抗体No.82的表位(R134、D139、及R222)存在于RBD区域。

[表4]

表4.各种抗gD2抗体的推定表位区域

实施例3抗gD2抗体的中和活性

通过噬斑数减少(Plaque Reduction)试验及细胞间感染扩散抑制试验，实施7个抗体克隆的体外HSV中和活性分析。

＜细胞及病毒的培养＞

关于作为对象的病毒，使用购自ATCC的II型人类疱疹病毒(HSV-2)MS株(VR-540)及I型人类疱疹病毒(HSV-1)KOS株(VR-1493)这2种。在病毒的培养、感染效价测定、中和抗体效价测定中，使用购自ATCC的Vero细胞(CCL.81)。在37℃、5％CO₂条件下培养Vero细胞。在扩大培养、维持、分析平板制作中，使用含有10％FBS的MEM培养基，在感染效价测定及中和抗体效价测定中，使用含有2％FBS的MEM培养基。通过以下的方法来制备用于中和试验及后述的抗感染能力分析的病毒库(virus bank)。以m.o.i＝0.01～1将HSV-2 MS株及HSV-1KOS株接种于整片(full sheet)的Vero细胞，用含有2％FBS的MEM培养基培养2～3天。将回收的感染细胞培养瓶冻融3次而破碎细胞后，用TOMY离心器在室温下以3500rpm离心10分钟，将上清作为HSV-2病毒库及HSV-1病毒库。

＜中和试验＞

(噬斑数减少试验)

关于噬斑减少活性测定，将受试抗体调整为规定浓度，与约100PFU的HSV-2 MS株或HSV-1 KOS株混合后，在37℃下反应1小时。在48孔平板中，向整片的Vero细胞接种反应液，在30℃下吸附1小时后，用含有1％甲基纤维素的MEM(2％FBS)培养基培养24小时后，用将甲醇和乙醇以1比1混合而成的50％甲醇/50％乙醇(-20℃)在-20℃下进行30分钟的失活及固定。然后，使抗HSV gD单克隆抗体在37℃下反应1小时，用抗小鼠IgG-HRP(Dako P0447)和TMBH进行免疫染色，用ELISPOT分析仪(ImmunoSpot S6 Analyzer、CTL公司)捕获各孔的图像，用分析软件(BioSpot CTL公司)统计噬斑数。

(细胞间感染扩散抑制试验)

关于细胞间感染扩散抑制活性测定，在48孔平板中，向整片的Vero细胞接种约100PFU的HSV-2 MS株或HSV-1 KOS株，在30℃下吸附1小时。然后，添加含有规定浓度的受试抗体的含有1％甲基纤维素的MEM(2％FBS)培养基(抗体浓度为5μg/mL、25μg/mL及125μg/mL)，HSV-2 MS株的情况下培养约40小时，HSV-1 KOS株的情况下培养约48小时，然后用50％甲醇/50％乙醇(-20℃)在-20℃下进行30分钟的失活及固定。然后，使自制的抗HSV gD单克隆抗体在37℃下反应1小时，用抗小鼠IgG-HRP和TMBH进行免疫染色，用ELISPOT分析仪捕获各孔的图像，用分析软件分析噬斑尺寸的平均值。

＜结果＞

将实验结果示于表5。关于噬斑数减少活性，对MS株(HSV-2)及KOS株(HSV-1)分别将各抗体的最终浓度设为50μg/mL、10μg/mL及2μg/mL，各浓度下的测定均检测2个孔并取平均值。其结果是，被分类在A组且在gD受体结合结构域(RBD)上(及FR1上)具有表位区域的抗体No.82对HSV-1及HSV-2这两株均显示出最显著的噬斑数减少活性。与此相对地，被分类在B组且在FR3具有表位区域的抗体No.1对两株完全不显示噬斑数减少活性。另外，被分类在C1组且在P50周边或其它未知的部分具有表位区域的抗体No.5及抗体No.13对HSV-1及HSV-2的中和活性均相对较弱，对HSV-1显示出部分抑制模式。在此，“部分抑制”是指中和活性相对弱、尚未明确确认到用量依赖性下降的情况。另外，被分类在C2组且在P50周边(及FR3)具有表位区域的抗体No.72及抗体No.75对HSV-2的中和活性均显著弱于对HSV-1的中和活性，抗体No.72对HSV―2显示出部分抑制模式。另外，同样分类在C2组的抗体No.78对两株的中和活性几乎看不到偏差，其强度比抗体No.82弱。抗体No.78呈用量依赖性地抑制，相对于5倍梯度稀释的斜率，显示出抑制效果的斜率与其它相比平缓的模式。

关于细胞间感染扩散抑制活性，对于MS株(HSV-2)，将各抗体的最终浓度设定为20μg/mL以重复试验(duplicate)进行了研究，结果仅抗体No.82显示出明确的抑制活性，此外的6个抗体不显示明确的活性。可以认为，该活性很重要，可能关系到生物体中已感染病毒的情况下的治疗性给药时的感染扩散抑制效果、或对复发症状的抑制效果。

根据以上结果，抗体No.82不仅对HSV-1及HSV-2两者具有强噬斑数减少活性，而且也具有可能关系到治疗效果的细胞间感染扩散抑制活性，从这点来看，是与其它抗gD结合抗体具有本质上的不同的、优异特征的独特抗体，可以认为其优越性与表位区域存在于gD受体结合结构域(RBD)上有关。

[表5]

表5抗gD抗体的HSV中和活性分析

[噬斑数减少活性强度分类]

+++：n＜＝5％/++：5％＜n＜＝10％/+：10％＜n＜＝50％/-：50％＜n

(n为将阴性对照孔的噬斑数设为100时的百分率)

[细胞间感染扩散抑制活性强度分类]++：有明确的活性/-：无明确的活性

实施例4抗gD2抗体No.82的病毒中和活性的详细分析

除了抗gD2抗体No.82的人抗体scFv-hFc以外，还制备了以Fc区域为小鼠型的人-小鼠嵌合IgG及以Fc区域为豚鼠型的人-豚鼠嵌合IgG，并研究了各自对HSV-2(MS株)及HSV-1(KOS株)的中和活性(噬斑数减少活性)。

<人-小鼠嵌合IgG2a>

将分离出的scFv基因的VH区与来自小鼠IgG2a的H链恒定区基因(CH1-CH2-CH3)连接，克隆到pCAG载体中而构建H链表达质粒。另外，将scFv基因的VL区与小鼠CL基因连接，克隆到pCAG载体中而构建L链表达质粒。表达时，使用Expi293表达系统。使表达质粒转染细胞，回收培养4～6天的培养上清。将培养上清用Hi Trap ProteinA HP Column(GEHealthcare)进行纯化，用PBS进行透析。用尺寸排阻色谱和SDS-PAGE确认其纯度。利用以上的方法得到人-小鼠嵌合IgG2a。

＜人-豚鼠嵌合IgG2κ＞

将分离出的scFv基因的VH区与来自豚鼠IgG2的H链恒定区基因(CH1-CH2-CH3)连接，克隆到pCAG载体中。另外，同样将scFv基因的VL区与豚鼠CK基因连接，克隆到pCAG载体中。然后，将克隆的抗体基因用PCR扩增，克隆到pXC载体(Lonza公司)中而构建H链及L链的表达质粒。然后，将两质粒连接成1个表达质粒。表达时，使用CHO细胞。将表达质粒稳定导入CHO细胞，利用GS Xceed expression system(Lonza公司)取得抗体高表达CHO细胞。将高表达细胞进行12天Fed-Batch培养，回收培养上清。将培养上清用rProteinA sepharose FastFlow(Cat#17127903/GE Healthcare)纯化，得到人-豚鼠嵌合IgG2κ抗体。

＜结果＞

使用抗gD2抗体No.82的scFv-hFc、人-小鼠嵌合IgG及人-豚鼠嵌合IgG，与实施例4同样地分析病毒中和活性(噬斑数减少活性)。将其结果示于表6。抗体No.82的scFv-hFc、人-小鼠嵌合IgG及人-豚鼠嵌合IgG均在0.05μg/mL或其以上的浓度下对MS(HSV-2)及KOS(HSV-1)两者显示50％噬斑数减少活性。

[表6]

表6:抗gD抗体No.82的病毒中和活性(详细分析)

实施例5抗gD2抗体No.82的小鼠抗感染能力评价

使用小鼠生殖器疱疹感染模型，评价抗gD2抗体No.82的预防性给药及治疗性给药时的抗感染能力。

＜小鼠抗感染试验＞

使用小鼠生殖器疱疹感染模型，实施抗HSV gD2单克隆抗体的预防性给药及治疗性给药时的抗感染试验。使用BALB/c小鼠(5周龄、雌性)。将规定量的抗体溶解于注射用生理盐水(saline)，在预防性给药的情况下，在接种病毒24小时前、另外在治疗性给药的情况下在接种病毒48小时后，均以200μL/只的体积进行腹腔内给药。每组设定N＝10的样本数。为了提高病毒接种时的感染效率，在接种病毒6天前以2mg/只皮下接种Depo-Provera。在麻醉下经阴道接种5×10⁵PFU/20μL的HSV-2 MS株，进行21天追踪观察。以存活天数(存活率)及症状评分为指标评价抗感染能力。关于症状评分，根据有无阴道病变症状及程度来给出评分，表示出各组的平均值。作为打分的方法，设为0：无变化、1：局部性的红斑和肿胀、2：大范围的肿胀和浮肿、3：溃疡和出血、4：死亡。在观察到预计无法恢复的严重的全身症状(竖毛、麻痹、震颤、痉挛等)时，当天将评分设为3.5，处死，按照次日死亡来处理，评分设为4。

＜结果＞

将预防性给药时的、各给药量下的存活天数示于表7，将存活率示于图4，将症状评分示于图5。将治疗性给药时的、各给药量下的存活天数示于表8，将存活率示于图6，将症状评分示于图7。

在预防性给药中，在设定的所有给药量(10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.3mg/kg)下，与作为阴性对照组而设定的盐水给药组相比，均显示显著的存活天数延长效果。特别是高用量范围的10mg/kg及3mg/kg这两种用量下，显示显著的存活率及症状评分的改善效果。

[表7]

表7.抗体No.82的IgG2a对小鼠的预防性给药的存活天数

***：p＜0.0001/**：0.0001＜p＜0.001/*：0.001＜p＜0.05(Kaplan-Meier法)

就治疗性给药而言，有报道指出HSV从感染局部侵入体内后在48小时以内转移到神经节(非专利文献8)。但是，即使在感染后48小时的时刻治疗性给药抗体No.82时，也与预防性给药时几乎同样地在10mg/kg及3mg/kg的两种用量下显示显著的存活率及症状评分的改善效果。由以上可确认，抗体No.82不仅在预防性给药时、在治疗性给药时也显示强的抗感染效果。

[表8]

表8.抗体No.82的IgG2a对小鼠的治疗性给药的存活天数

***：p＜0.0001/**：0.0001＜p＜0.001/*：0.001＜p＜0.05(Kaplan-Meier法)

实施例6抗gD2抗体No.82的豚鼠抗感染能力评价

使用豚鼠生殖器疱疹感染模型(急性期)评价抗gD2抗体No.82的预防性给药及治疗性给药时的抗感染能力。

<豚鼠抗感染试验>

使用豚鼠生殖器疱疹感染模型，实施抗gD2抗体No.82(人-豚鼠嵌合IgG2κ)的预防性给药及治疗性给药时的抗感染试验。使用购自SLC公司的Hartley豚鼠(3～5周龄、雌性)。将规定量的抗体溶解于注射用生理盐水(saline)，在预防性给药的情况下在接种病毒24小时前、另外在治疗性给药的情况下在接种病毒4天后，均以1mg～30mg/kg/只的体积进行腹腔内给药。在治疗性给药的情况下，在给药前进行症状观察，筛选呈现出阴道症状的个体，按照各组的平均评分无偏差的方式随机分组。设定为每组N＝10～15的样本数。关于病毒接种，在麻醉下经阴道接种5×10⁵PFU/50μL的HSV-2 MS株，在接种后2～3周观察急性期症状。关于症状评分，设为0：无明确的病变、0.5-1：红斑、1.5-2：局部性的水泡、2.5-3：局部性的溃疡或痂皮、3-5：广泛的水泡·溃疡或痂皮、3-7：伴有失禁的广泛的溃疡或痂皮、7.5：由于症状严重而安乐死、8：死亡。另外，在接种病毒后第7天，收集阴道拭液(Vaginal Swab)，利用噬斑法测定病毒释放量。阴道拭液通过将用MEM培养基润湿的棉棒插入阴道内、然后擦拭阴道内壁的粘膜的方式来收集。将收集的阴道拭液悬浮于各以1mL分注到硅化管中的MEM培养基，冷冻保存直至使用。将阴道拭液设为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释，以100uL/孔接种于96孔或48孔的整片的Vero细胞。接种阴道拭液后，在37℃下进行1小时的病毒吸附，用含有1％甲基纤维素的2％FBS MEM培养基培养24～72小时后，通过规定方法计测噬斑数。

＜结果＞

将预防性给药时的症状评分示于图8。将治疗性给药的结果中的症状评分示于图9，将阴道拭液中的HSV释放量示于图10。

在预防性给药的情况下，在设定的给药量(30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg)中的30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg下，与作为阴性对照组而设定的盐水给药组相比，显示出显著的症状评分的改善效果。

在治疗性给药的情况下，对于在感染后4天的时刻已呈现阴道症状的豚鼠，将抗体No.82以30mg/kg进行治疗性给药，结果与作为阴性对照组而设定的盐水给药组相比，显示出显著的症状评分的减轻效果。另外，在接种病毒7天后的时刻收集阴道拭液，利用噬斑法测定病毒释放量，结果，与阴性对照组相比可见病毒释放量显著减少。

由以上可确认，抗体No.82不仅在预防性给药时、在治疗性给药中也显示显著的抗感染效果。

实施例7存在于HSV gD上的T细胞表位的详尽分析

＜存在于HSV gD2上的HLA Class II限制性非种系选择性T细胞表位簇序列的搜索＞

对于GenBank公开的HSV-2 333株的gD2全长氨基酸序列(ABU45433.1；序列号3)，使用EpiVax公司的算法(EpiMatrix)搜索HLA Class II限制性非种系选择性T细胞表位簇序列。该簇序列为预测与EpiMatrix的分析对象即8种主要的HLA DR super type(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)中的大部分的结合可能性高的(Z-Score≧1.64)、由15～25氨基酸构成的肽序列。

使用EpiVax公司的算法(EpiMatrix)搜索的结果是，发现表9所示的5个位置的簇序列。其中，满足EpiVax公司的判别式而判定为阳性的是带有星号的3个序列(DP1、DP3、DP4)，此外的2个序列(DP2、DP5)被判断为仅不满足判别式、但有充分的可能性。

对这5个序列进行了肽合成。为了提高稳定性，在肽的N末端侧添加乙酰基化修饰、在C末端侧添加酰胺化修饰。将合成纯度设为95％以上、以2.5mg/管进行分注冻干后的肽保存于-20℃。在使用冻干肽时，用DMSO(Sigma D2650)以10mM进行溶解或悬浮。将合成的肽供于人及小鼠的T细胞刺激活性分析。

[表9]

表9.预测的HSV gD上的非种系选择性T细胞表位簇序列

＜合成肽的使用人PBMC的T细胞刺激活性分析＞

使用抗HSV IgG抗体检测ELISA试剂盒(电化生研)对C.T.L公司销售的人PBMC提供者的血清进行筛选，购买已感染HSV(抗体阳性)供体来源的PBMC。购买具有在EpiVax公司的算法中组入的8种主要的HLA DR super type(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)基因中的任一纯合体或杂合体且具有HSV暴露史的供体的PBMC的冷冻样品。另外，为了分析非特异性应答，还购买了抗HSV抗体阴性供体来源的PBMC(Donor 14、67)。

按照C.T.L公司的规程用Thawing Medium(CTL WashTM Medium)进行冷冻细胞的解冻、洗涤后，用培养基(CTL TestTM Medium)调整为规定浓度，供于人IFN-γELISpot分析。将细胞以0.5及1×10⁷细胞/mL的浓度在ELISpot专用96孔平板中各接种100μL，各添加调整为20μM的各肽溶液100μL(终浓度：加入了10μM/0.1％DMSO的培养基)，在37℃下用CO₂培养箱培养5天。然后，按照规定规程进行显色，用ELISpot读板仪计测各孔的阳性细胞数(IFN-γ产生细胞数)。将失活HSV-1(10PFU/细胞)、Con A(终浓度：2μg/mL)作为阴性对照(None)，用加入了0.1％DMSO的培养基进行评价。关于IFN-γ产生细胞数的检测，使用HumanIFN gamma ELISPOT Ready-SET-Go！(注册商标、ebioscience 88-7386-88)，由ELISpotanalyzer(CTL Immunospot S5 versa analyzer)捕获图像，用immunospot software统计斑点数。

均以各3个孔来实施各样品的测定。将实验结果示于表10。表10的(A)示出IFN-γ产生细胞数的平均斑点数，灰色的阴影表示斑点数过少、不能判定。另外，表10的(B)是将相对于阴性对照(None)的刺激指数(SI：Stimulation Index)作为指标来进行有无T细胞刺激活性的判定的。将SI为3判定为阳性，将SI为2以上且小于3判定为临界，将Si小于2判定为阴性，其结果是，获知5种肽都具有人T细胞刺激活性，其中的4种肽可以刺激HLA型不同的多种的人PBMC的T细胞。

[表10]

表10.来自HSV gD2序列的合成肽的、使用人PBMC的细胞刺激活性分析(A)IFN-γ产生细胞数(平均斑点数)

(B)基于刺激指数(SI)的判定

阳性(P)：3≤SI，临界(M)：2≤SI＜3，阴性(N)：SI＜2

<合成肽的、小鼠的T细胞刺激活性分析>

通过合成肽的小鼠免疫原性试验来进行T细胞刺激活性分析。制备用DMSO将合成肽溶解或悬浮成10mM的储备溶液。另外，作为给药用的溶剂，使用NIKKOL HCO-60(日光化学株式会社制)制备10％HCO-60/saline(注射用生理盐水)。将合成肽100μg与CpG10μg及MPLA10μg一起混合在溶剂中，调节成210μL/只的体积，给药于小鼠(4～5周龄、雌)的背部皮下。小鼠使用BALB/c(I-Ad/I-Ed)、C57BL/6(I-Ab)、C3H/HeN(I-Ak/IEk)这3个品系。在首次免疫起的21天后进行追加免疫，在其2周后回收脾脏并制备脾细胞，供于以下的细胞因子产生应答分析(ELISpot分析)。将制备的脾细胞以1×10⁶细胞/孔接种于96孔PVDF膜(MSIPS4W10 Millipore)，与各种肽10μM培养20小时。使用RPMI1640培养基，在10％FBS存在下，用设定为37℃且CO₂浓度5％的培养箱实施培养。作为阳性对照，设定Con A添加组。IFN-γ产生细胞的检测使用mouse IFN gamma ELISPOT Ready-SET-Go！(注册商标、ebioscience 88-7384-88)来进行。用ELISpot analyzer(CTL Immunospot S5 versaanalyzer)捕获图像，用immunospot software统计斑点数。

在用DP1～DP5这5种肽分别免疫BALB/c(I-Ad/I-Ed)、C57BL/6(I-Ab)、C3H/HeN(I-Ak/IEk)这3个品系的小鼠(各组n＝2)后，收集脾脏并制备脾细胞，进行针对各肽的T细胞应答性(IFN-γ及IL-2产生刺激活性)的ELISpot分析。均以各2孔来实施各样品的测定。将实验结果示于图11。在IFN-γ产生ELISpot分析(图11的(A))及IL-2产生ELISpot分析(图11的(B))任一者中，均可确认DP1以外的4种肽可以刺激2种品系以上的小鼠脾脏T细胞。

实施例8人血清级分(免疫球蛋白)中所含的抗gD2抗体群体分析

为了分析人血清中实际包含的抗HSV gD抗体群体，使用作为人γ球蛋白混合物的Venilon(Kenketsu Venilon(注册商标)-I静注用、一般财团法人化学及血清疗法研究所)进行与所取得的抗体的竞争试验。作为竞争试验，使gD1-315与Venilon反应后，使单克隆抗体进行反应。可认为，在该体系中，Venilon中所含的竞争抗体量越多则该单克隆抗体(被检抗体)的结合量越少，竞争率越高。竞争试验中，使用SPR(Biacore)。

(使用SPR的Venilon竞争试验)

竞争试验使用Biacore 3000(GE Healthcare)来进行。在所有实验中，使用HBS-EPbuffer(GE Healthcare)，温度设为25℃，流速设为10μL/分钟。传感器芯片使用NTA(GEHealthcare)。基于建议的规程使0.5mM NiCl2反应10秒。然后，使gD1-315-His以3μg/mL反应60秒而使约300响应单元(resonance units，RU)固相化。在使用Biacore作为表面等离子激元共振传感器进行分析时，得到的信号值即“RU”表示每1mm²结合1pg物质时的单位。另外，芯片如下再生：以350mM EDTA、10秒的条件处理芯片表面2次，用缓冲液洗涤10秒。每次测定新的被检体时，用同样的方式实施固相化及再生。如下计算竞争率。在将浓度20μg/mL的待研究抗体以流速20μL/分钟上样120秒且将增加的RU设为(1)、将浓度150μg/mL的Venilon以流速20μL/分钟持续上样120秒后上样浓度20μg/mL抗体120秒且将增加的RU设为(2)时，通过(1-(2)/(1))×100的计算式计算竞争率。所有的样品均只测定一次。

将Venilon竞争试验的分析结果示于表11。显示最高竞争率的是作为弱中和抗体的抗体No.5，接着是抗体No.13、抗体No.75、抗体No.78、抗体No.72和在P50周边区域具有表位的抗体组较高。另一方面，抗体No.82在7个克隆中为第6位，显示相对低的竞争率，最低的是抗体No.1。

由以上的结果可知，在人血清中所含的抗gD2抗体中，识别野生型gD抗原上的P50周边区域的表位的抗体的数量多于识别RBD上或其周边的表位的抗体的数量。可认为，P50周边区域是虽然具有高抗体诱导能力、但可能诱导较多的低有益性抗体的诱饵区域。

[表11]

表11.各种抗gD2抗体的推定表位区域及群体分析

实施例9用于疫苗抗原的HSV gD修饰体的设计

本发明人等在将存在中和抗体的表位的RBD设为有益表位区域、将存在有益性低的抗体组的表位的P50周边区域及FR3设为诱饵区域来设计可以诱导更多的中和抗体的gD蛋白修饰体时，从突显有益表位、对于诱饵区域中的表位通过导入糖链和缺失突变等去表位化、还通过连接非种系选择性T细胞表位簇肽来有效地·高效地引起体液免疫应答、细胞免疫应答两者的3个观点出发如下所述地设计gD修饰体，调查其中和抗体诱导活性。

＜修饰型gD的设计方针＞

作为存在于野生型HSV gD抗原上的有益表位，推定为作为抗gD2抗体No.82的表位的gD受体结合结构域(RBD)及通过T细胞表位分析而预测的非种系选择性T细胞表位簇DP5(gD2 334-350；序列号8)，另外作为集中了有益性相对低的抗体组的表位的诱饵区域，推定为P50周边区域。

在基于上述3个观点的修饰型gD设计中，采取下述3个方针：(1)通过导入糖链来屏蔽非中和表位、(2)gD1-315的C末端侧序列FR3的修饰、(3)T细胞表位肽的连接。

在(1)的导入糖链时，将R186(SC-A)、P74(SC-D)、P50(SC-F)这三个位置作为候选修饰部位。特别是SC-F，显示出抑制作为非中和抗体组的组C1的结合的结果，以P50(SC-F)为中心实施糖链导入。

关于(2)的gD1-315的C末端侧序列FR3的修饰，存在文献报道的HSV gD1的晶体结构分析(非专利文献7)表明：FR3及作为N末端侧序列的FR1可以以卷绕方式结合在gD分子内的作为核心β折叠结构的FR2的同一面。FR1与FR3彼此妨碍，因此仅其中的一者能够与FR2结合。据推测，通常FR3结合在病毒包膜上，在与受体结合时，按照FR3脱离、FR1进行结合的方式变构而使受体结合区域露出。由抗体No.82的表位分析可知，抗体No.82与结合素-1结合区域结合，与FR1缺失体(gD34-315)的反应性下降，抑制gD与HVEM或结合素-1的结合。即，可认为，使FR3缺失或抑制FR3与FR2的结合对于突显抗体No.82的表位、诱导针对该区域的免疫再聚焦有效。作为FR3缺失体，以存在文献报道的gD1-275为基础(非专利文献12)。另外，由于FR3上存在抗体No.1的表位，因此通过使FR3缺失，可期待部分非中和抗体的诱导受到抑制。另外，从抑制FR3与FR2的结合的观点出发，以同样存在文献报道的gD1-315 V231W突变体(gD1-315V)为基础(非专利文献9)。已经明确，V231W突变抑制FR3与FR2的结合。虽然无法期待这些修饰体抑制抗体No.1等非中和抗体的诱导，但是认为能够突显抗体No.82的表位。

关于(3)的T细胞表位肽的连接，通过将所预测的T细胞表位的序列连接到修饰体的C末端等，从而可以诱导T细胞免疫应答。跨膜区域、细胞内区域也存在T细胞表位，但考虑到作为疫苗使用，需要设计为由细胞外区域构成的分泌表达型，因此通过连接存在于跨膜区域、细胞内区域的T细胞表位，从而可以有效地利用细胞外区域所不含的T细胞表位。gD2胞外结构域序列中仅包含所预测的5个肽中的DP1-3的3个序列，因此认为将细胞内区域的作为表位序列的DP5连接的效果更显著。因此以该DP5的二连接体为中心并进行修饰。

将以上的修饰型gD的设计策略的示意图示于图12。另外，图3示出在HSV gD2单体的立体结构模型中加入糖链导入位置、预测的抗体No.82表位等的结构。

＜修饰型gD的设计、表达、反应性分析＞

基于以上的三个方针进行gD2的修饰，得到共计16种修饰体(表12)。按照以下所示的方法进行修饰体的制作。

(质粒构建体)

gD1-275、gD1-315的质粒构建、导入糖链时使用的引物如上所述。在导入T细胞表位肽的情况下，按照在目标gD序列的C末端残基(D275或G315)之后依次连接接头(GPGPG)、各T细胞表位肽、6×His-tag的方式而设计DNA，对全长进行人工基因合成并克隆到pUC19载体中。将完成的修饰体序列克隆到pCAGGS1-dhfr-neo载体中，得到表达用质粒。

制作4种以gD1-275为基础的修饰体。这些为缺失了FR3的修饰体，因此对它们不进行影响FR3的V231W突变的研究。仅导入糖链(gD1-275v3、gD1-275v5)的情况下，性状看不到变化，但在进一步连接有DP5的修饰体中的gD1-275v3-55中，确认到聚集体的存在。由于其与性状良好的gD1-275v5-55的差异为是否导入了R186(SC-A)，因此推测在结构方面存在于275aa附近的R186(SC-A)的立体结构可能阻止向DP5的主体部分的吸附等成为聚集诱因的变构。另一方面，制作了8种以gD1-315为基础的修饰体，所有的修饰体的性状·表达量均不逊于作为原型的gD1-315。

＜修饰体与各种抗gD2单克隆抗体的反应性的分析＞

(抗体及gD修饰体的表达、纯化)

使用Expi293表达系统来表达各抗gD2单克隆抗体及各gD修饰体。在培养4～6天后，将其上清用蛋白A亲和色谱柱或Ni-NTA亲和色谱柱纯化、用PBS进行透析。用尺寸排阻色谱和SDS-PAGE来确认其纯度。

(与抗gD2抗体的竞争ELISA)

将用磷酸缓冲生理盐水调整成浓度2μg/mL的100μL的gD修饰体在4℃下用一晚固相化于96孔微量滴定板。将各孔用PBS洗涤3次，用300μL的1％BSA PBS在室温下封闭1小时。将各孔用PBS-T(0.05％Tween PBS)洗涤3次，将各抗gD2抗体用1％BSA PBS以任意的稀释倍率进行稀释，加入100μL，在37℃下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，加入HRP标记抗体(抗hFc/HRP/1％BSA PBS)，在37℃下反应1小时。用PBS-T洗涤各孔，用TMB在室温下显色30分钟，用1N硫酸停止反应后，测定450nm/650nm的吸光度。

将其结果示于表12。对于所有的修饰体，均能够确认到与抗体No.82的反应性，因此判断3个方针对抗体No.82表位没有不良影响。另一方面，如所预测地，表位存在于FR3上的抗体No.1与基于gD1-275的修饰体不显示反应性。另外，关于目前表位未知的抗体No.13，获知向gD1-275基体中导入P50(SC-F)则反应性消失(可能被屏蔽)。在考虑缺失FR3或导入P50(SC-F)中的任一种修饰的情况下抗体No.13仍残存有反应性的结果时，可以认为P50(SC-F)和FR3可能协同地形成了某些立体结构，但详细的表位仍然未知。此外的C组的抗体组大体上显示了预期的反应性。通过导入P50(SC-F)，抗体No.5、抗体No.78的结合被完全阻断，已明确了在FR3中存在部分表位的抗体No.72.及抗体No.75与部分修饰体显示弱反应性。可以使作为弱中和抗体的抗体No.72、抗体No.75残存反应性，这是作为疫苗抗原所期望的结果。

[表12]

表12所制作的gD修饰体与各种抗gD抗体的反应性

对于与抗体No.82的反应性，实施了更详细的分析(图13)。图13示出将与gD1-315(野生型)的反应性设为“1”时的、各gD修饰体与抗体No.82的反应性的相对值。抗体No.82与所制作的所有gD修饰体结合，但其反应性的强度则各种各样。若以抗体No.82相对于gD1-315的反应性为基准，则大部分修饰体与抗体No.82的反应性是增强的。从糖链导入的观点出发，与单独导入P50(SC-F)相比，也同时导入R186(SC-A)的方式的效果更高(gD1-315v5-55、gD1-315v5-55V)。如上所述，抗体No.82的gD受体结合区域和FR1的一部分中存在有表位。可以认为，与gD1-275v3-55的聚集体形成中所言及的理由同样地，R186(SC-A)使FR3丧失柔性，产生出FR1更容易与gD受体结合区域结合的情况。另外，连接有DP5的修饰体的与抗体No.82的反应性也显著增强，特别是gD1-315v5-55与gD1-315原型相比较，显示出约12倍的反应性。可以认为，DP5串联连接于C末端使得DP5序列本身发挥抑制FR3与gD受体结合区域结合的作用。V231W突变体(gD1-315v3-55V、gD1-315v5-55V)与无突变的修饰体(gD1-315v3-55、gD1-315v5-55)相比，结果是抗体No.82的反应性下降。介绍有V231W的文献(非专利文献9)中报道其具有抑制FR3的结合的效果，但是可以认为，实际上是通过其庞大体积而稍稍抑制FR1的结合、或者具有使本来的结合结构改变的效果。

根据以上的考察可大体上推定，各修饰体采取了使FR1与受体结合区域结合的结构。因此利用竞争ELISA对HVEM与各修饰体的反应性进行了测定。

将结果示于图14。HVEM在FR1与受体结合区域结合、采取特征性的发夹结构时，才能与gD结合。表明HVEM的相互作用位点均存在于FR1中，如上述所推测，与HVEM的反应性提高。与作为原型的gD1-315相比与HVEM的反应性最高的是gD1-315v5-55，然后按照gD1-315v5-55V或gD1-275v5-55、之后是gD1-315v3-55的顺序与HVEM反应，gD1-315及gD1-315v5几乎观察不到反应。缺失了FR3的gD1-275v5-55与存在FR3的其它gD1-315基体的修饰体相比，促进了FR1的结合、继而促进了HVEM的结合。在抗体No.82的反应性分析中，1-275v5和1-315v5显示出几乎相同的反应性，因此推测FR3缺失带来的效果与导入R186(SC-A)的效果几乎为同等程度。

＜修饰型gD的小鼠免疫原性试验＞

(小鼠免疫原性试验)

以野生型gD抗原gD1-315(WT)为阳性对照、以盐水为阴性对照而实施修饰型gD抗原的免疫原性试验。将规定量的抗原与MPLA(10μg/只)及CpG(1μg/只)一起溶解于注射用生理盐水(saline)，以200μL/只的体积免疫小鼠。试验中，使用BALB/c小鼠(5周龄、雌性)，每隔2周免疫于背部皮下，合计3次(以每组N＝4的样本数实施)。在末次免疫(第3次)起2周后，对每个个体采血，制备血清。将制备的血清进行梯度稀释，评价对于HSV-2的中和抗体诱导活性(噬斑数减少50％的活性)。

将关于中和抗体诱导活性的分析结果示于图15～图19。各图中，用黑色实线表示修饰型gD的数据，用灰色虚线表示野生型gD的数据，用黑色原点表示高用量给药组(3μg/只)，用黑色三角表示中用量给药组(0.3μg/只)，另外用黑色方形表示低用量给药组(0.1μg/只)。将各组的动物样本数设为n＝4而进行实验，标绘它们的平均值并添加±SE误差棒。供于评价的13种修饰型gD中，除(E)的gD1-315 V以外的12种免疫血清与野生型gD(gD1-315)的免疫血清相比，几乎均显示出高的中和抗体活性。即，若对同一给药量下的同一稀释倍率的噬斑数减少率进行比较，有与野生型gD相比修饰型gD显示出高减少率的倾向。

然后将利用ELISA法得到的、关于抗gD抗体诱导活性的分析结果示于图20～24。各图中的关于符号、折线的标记与此前的中和抗体诱导活性图相同。与关于中和抗体活性的结果相反，供于评价的14种修饰型gD中，除(C)的gD1-315v5、(F)的gD1-315V、(J)的gD1-275以外的11种免疫血清中的抗gD结合抗体活性，有与野生型gD相比显示出相对低的值的倾向。即，获知修饰型gD与野生型gD相比可以以少的结合抗体效价(抗体量)诱导高的中和抗体活性。

可认为，以上的结果表明，通过利用N型糖链导入将大量存在于野生型gD抗原上的P50周边区域的有害·无益的表位去表位化，可以更加有效地·高效地诱导针对残存的有益性高的中和表位的免疫应答。换言之，可以说通过本发明人们的免疫再聚焦策略可以将对野生型gD抗原的偏离的免疫应答(免疫偏离)矫正(免疫矫正)为理想形式。

进一步地，关于细胞免疫(T细胞免疫)诱导活性，比较分析了由利用作为修饰型gD抗原的一例的gD1-315v3-55和野生型gD(gD1-315)分别免疫的小鼠(3μg/只给药组)制备的脾细胞(汇总了4例的量的样品池)的IFN-γ产生应答活性(回忆活性)。具体而言，对5周龄的BALB/c小鼠，以2周的间隔向背部皮下免疫3μg的抗原共3次，在末次免疫的2周后回收脾脏细胞。使抗IFN-γ固相化于底面为PVDF膜的96孔平板，以1×10⁶个细胞/100μL/孔接种细胞。添加作为刺激物质的免疫抗原10mM，在37℃、5％CO₂下培养20小时。除去上清，使抗小鼠IFNγ-HRP抗体反应，然后利用AEC试剂染色HRP，使用Image Analyzer(CTL公司)统计IFNγ产生细胞数。将结果示于图25。获知gD1-315v3-55免疫组显示出高于野生型gD免疫组的应答活性。可知：通过在修饰型gD抗原的C末端连接2个HLA Class II限制性非种系选择性T细胞表位簇DP5，可增强细胞免疫(T细胞免疫)诱导活性。

＜修饰型gD的小鼠抗感染试验＞

(小鼠抗感染试验)

使用小鼠生殖器疱疹感染模型，实施修饰型gD抗原的预防性给药时的抗感染试验。与上述的小鼠免疫原性试验同样地进行，以每组N＝10的样本数对小鼠进行免疫。为了提高在末次免疫(第3次)起2周后进行的病毒接种时的感染效率，在接种病毒前6天以2mg/只皮下接种Depo-Provera。在麻醉下经阴道接种5×10⁵PFU/20μL的HSV-2 MS株，进行21天追踪观察。以存活天数(存活率)为指标评价抗感染能力。

使用小鼠生殖器疱疹感染模型，通过预防性给药来评价各种修饰型gD的抗感染能力。将各组的动物样本数设为n＝10，使用野生型gD(gD1-315)作为阳性对照，使用盐水作为阴性对照。实施总计4次实验(实验1～4)，对于阳性对照、阴性对照及被检修饰型gD抗原，均设定0.1μg/只/次、0.03μg/只/次、0.01μg/只/次及0.003μg/只/次的4种用量。为了提高在末次免疫(第3次)起的2周后进行的病毒接种时的感染效率，在接种病毒6天前以2mg/只皮下接种Depo-Provera。在麻醉下经阴道接种5×10⁵PFU/20μL的HSV-2 MS株，进行21天追踪观察。以存活天数(存活率)为指标评价抗感染能力。图中标绘出它们的平均值。利用Kaplan-Meier法进行相对于阴性对照组的差异显著性检验，并将基于检验结果的最小有效用量与野生型gD相比在3倍公比下高2个用量以上者判定为“++”，将高1个用量者判定为“+”，将同等者判定为“±”。

将实验1的结果示于表13及图26～图28。所评价的6种修饰型gD均显示出相对于野生型gD的优越性，其中判定为“++”的是gD1-315v3-55、gD1-315v5-55V、gD1-275v5-55这3种，判定为“+”的是gD1-315v5、gD1-315v4V、gD1-315v4-55V这3种。

[表13]

实验1(存活天数表)

[差异显著性检验]***：p＜0.001/**：0.001＝＜p＜0.01/*：0.01＝＜p＜0.05(Kaplan-Meier法)

[判定#]将基于差异显著性检验的最低有效量与gD1-315(WT)相比在3倍公比下高2个用量以上者判定为++，将高1个用量者判定为+，将同等者判定为±。

将实验2的结果示于表14及图29。所评价的2种修饰体gD1-315v3-55、gD1-315v3-55V均判定为“+”，显示出相对于野生型gD的优越性。

[表14]

实验2(存活天数表)

将实验3的结果示于表15及图30。所评价的修饰体gD1-315v3V的判定为“±”，未见相对于野生型gD的明确的优越性。

[表15]

实验3(存活天数表)

将实验4的结果示于表16及图31～图32。所评价的5种修饰型gD均显示出相对于野生型gD的优越性，其中，判定为“++”的是gD1-315v4-55V、gD1-315v5-55V这2种，判定为“+”的是gD1-275v3-55、gD1-275v4-55、gD1-275v5-55这3种。

[表16]

实验4(存活天数表)

[差异显著性检验]***：p＜0.001/**：0.001＝＜p＜0.01/*：0.01＝＜p＜0.05＜Kaplan-Meier法)

根据以上，对于除gD1-315v3V以外的几乎所有修饰型gD，与中和抗体诱导能力同样地，在抗感染能力方面也确认到相对于野生型gD的优越性。

＜修饰型gD免疫血清中的抗体群体分析＞

对于在小鼠免疫原性试验及小鼠抗感染试验中与野生型gD(gD1-315)相比确认到优越性的一系列修饰型gD中的gD1-315v3-55及gD1-315v5-55，为了调查其机制而进行免疫血清分析。调查是否实际高效诱导了作为目标的抗体No.82样抗体。为了统一抗体量，从血清中纯化IgG，通过使用SPR(Biacore)的竞争法进行分析。

(使用SPR的抗gD2抗体竞争试验)

使用Biacore 3000(GE Healthcare)进行抗gD2抗体竞争试验，在所有实验中均使用HBS-EP buffer(GE Healthcare)，温度设为25℃，流速设为20μL/分钟。传感器芯片使用CM5传感器芯片(GE Healthcare)，基于建议的规程进行实验。芯片表面固相化有约300RU的gD1-315-His，在芯片的再生中，使用0.1M且pH2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液以流速30μL/分钟洗涤30秒，共洗涤2次。如下进行竞争的步骤和竞争率的计算。将各种抗gD2抗体10μg/mL或缓冲液以与芯片结合1分钟、解离2.5分钟的条件进行上样，然后将经IgG纯化的各种免疫血清20μg/mL以结合1分钟、解离5分钟的条件进行上样。将上样缓冲液后再上样免疫血清时检测到的RU设为100％，计算由于上样抗gD2抗体而引起的免疫血清响应的下降，作为竞争率。

将分析结果示于图33。可确认，gD1-315v3-55免疫血清及gD1-315v5-55免疫血清与野生型gD免疫血清相比，与抗体No.82竞争的抗体的比例均上升。另一方面，确认到在通过导入N型糖链而受到屏蔽的P50周边区域，与具有表位的抗体No.72竞争的抗体的比例有减少的倾向。另外，与残存有表位的非中和抗体No.1竞争的抗体的比例则几乎未见变化。以上的结果表明，与野生型gD免疫血清相比，修饰型gD免疫血清中存在相对多的作为优质中和抗体的抗体No.82样抗体，可以诱导作为目标的免疫再聚焦。

(与gD受体的竞争ELISA)

进一步地，还分析了修饰型gD免疫血清对gD-HVEM相互作用的抑制。具体而言，将用磷酸缓冲生理盐水调整为浓度5μg/mL的100μL的gD1-305-cys-strep dimer在4℃下用一晩固相化于96孔微量滴定板。然后，与上述竞争ELISA的方法同样地进行封闭、洗涤，将由各免疫血清纯化而得的IgG以任意的浓度添加100μL，在室温下反应1小时。然后，将1μg/mL的HVEM(Recombinant Human HVEM/TNFRSF14 Fc Chimera Protein、R&D SYSTEMS)用1％BSAPBS以任意的稀释倍率稀释，分别添加100μL，进一步在室温下反应1小时。再次用PBS-T洗涤各孔，使HRP标记抗体(抗hFc/HRP/1％BSA PBS)进行反应。用PBS-T洗涤各孔，显色，用1N硫酸停止反应后，测定450nm/650nm的吸光度。

将结果示于图34。与野生型gD免疫血清相比，修饰型gD免疫血清中包含更多的抑制gD-HVEM相互作用的抗体，特别是gD1-315v5-55免疫血清，显示强抑制作用。以上的结果表明，修饰型gD与野生型gD相比，可以更有效地诱导可以抑制gD与HVEM的相互作用的优质抗体，从而有可能带来更强的防御效果。

产业上的可利用性

本发明的修饰型HSV gD蛋白可以用于制作对于HSV感染症的预防及治疗有效的疫苗。

序列表

<110> KM生物医薬股份公司( KM Biologics Co., Ltd.)

<120> 修饰型HSV gD蛋白及包含其的疫苗

<130> FP18-0824-00

<150> JP2017-165681

<151> 2017-08-30

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 315

<212> PRT

<213> HSV gD1-315

<400> 1

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg

1 5 10 15

Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro

20 25 30

Gly Val Lys Arg Val Tyr His Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe

35 40 45

Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg

50 55 60

Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile

65 70 75 80

Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr

85 90 95

Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val

100 105 110

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro

115 120 125

Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val

130 135 140

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr

145 150 155 160

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile

165 170 175

Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala

180 185 190

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr

195 200 205

Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile

210 215 220

Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly

225 230 235 240

Trp His Gly Pro Lys Pro Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu

245 250 255

Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Ala Gly Thr Val Ser Ser

275 280 285

Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Val Ala Pro

290 295 300

His His Ala Pro Ala Ala Pro Ser Asn Pro Gly

305 310 315

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-1（Herpes simplex virus-1）

<400> 2

Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val

-25 -20 -15 -10

Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala

-5 1 5

Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro

10 15 20

Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His

25 30 35

Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile

40 45 50 55

Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu

60 65 70

Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp

75 80 85

Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly

90 95 100

Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser

105 110 115

Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp

120 125 130 135

Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe

140 145 150

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu

155 160 165

Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His

170 175 180

Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro

185 190 195

Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp

200 205 210 215

Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

220 225 230

Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro

235 240 245

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala

250 255 260

Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

265 270 275

Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His

280 285 290 295

Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr

300 305 310

Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu

315 320 325

Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met His Arg Arg Thr

330 335 340

Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp

345 350 355

Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr

360 365

<210> 3

<211> 393

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 3

Met Gly Arg Leu Thr Ser Gly Val Gly Thr Ala Ala Leu Leu Val Val

-25 -20 -15 -10

Ala Val Gly Leu Arg Val Val Cys Ala Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro

-5 1 5

Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro

10 15 20

Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Lys Arg Val Tyr His

25 30 35

Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile

40 45 50 55

Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu

60 65 70

His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu

75 80 85

Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly

90 95 100

Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro

105 110 115

Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp

120 125 130 135

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe

140 145 150

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu

155 160 165

Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His

170 175 180

Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro

185 190 195

Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp

200 205 210 215

Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

220 225 230

Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Pro Pro

235 240 245

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala

250 255 260

Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

265 270 275

Glu Asp Pro Ala Gly Thr Val Ser Ser Gln Ile Pro Pro Asn Trp His

280 285 290 295

Ile Pro Ser Ile Gln Asp Val Ala Pro His His Ala Pro Ala Ala Pro

300 305 310

Ser Asn Pro Gly Leu Ile Ile Gly Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Ala

315 320 325

Val Leu Val Ile Gly Gly Ile Ala Phe Trp Val Arg Arg Arg Ala Gln

330 335 340

Met Ala Pro Lys Arg Leu Arg Leu Pro His Ile Arg Asp Asp Asp Ala

345 350 355

Pro Pro Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr

360 365

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 4

Lys Arg Val Tyr His Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe Gln

1 5 10 15

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 5

Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu

1 5 10 15

Leu

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 6

Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala

1 5 10 15

Arg Ala Ser Cys Lys Tyr

20

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 7

Pro Gly Leu Ile Ile Gly Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Ala Val Leu

1 5 10 15

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒-2（Herpes simplex virus-2）

<400> 8

Ile Ala Phe Trp Val Arg Arg Arg Ala Gln Met Ala Pro Lys Pro Leu

1 5 10 15

Arg

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> No.82 H-CDR1

<400> 9

Gly Tyr Ala Ile Asn

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> No.82 H-CDR2

<400> 10

Gly Ile Met Pro Ile Phe Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> No.82 H-CDR3

<400> 11

Asp Trp Gly Ala Pro Leu Glu Lys Gly Ala Gly Ser Pro Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223>

No.82 L-CDR1

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> No.82 L-CDR2

<400> 13

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> No.82 L-CDR3

<400> 14

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Ser

1 5

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-A-Fw

<400> 15

cgggccaatg cctcctgcaa gtacgct 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-A-Re

<400> 16

ggaggcattg gcccggtgct ccaggat 27

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-B-Fw

<400> 17

gggtggaatg gcaccaagcc cccgtacacc agc 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-B-Re

<400> 18

gggcttggtg ccattccacc cggcgatttt taa 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-D-Fw

<400> 19

catgccaatt cgaccgcccc ccagatcgtg cgc 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-D-Re

<400> 20

gggggcggtc gaattggcat gtaggagcac gct 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-E-Fw

<400> 21

cgcatgaatg acacctgcgc tatccccatc acg 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-E-Re

<400> 22

agcgcaggtg tcattcatgc gataccaggc gat 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-F-Fw

<400> 23

ttccagaatg caagcatccc gatcactgtg tac 33

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-F-Re

<400> 24

cgggatgctt gcattctgga acgggtcctc cag 33

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-H-Fw

<400> 25

ctccccaatc gcacgccccc ggcagcgtgc ctc 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-H-Re

<400> 26

cgggggcgtg cgattgggga gagcgtactt gca 33

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-K-Fw

<400> 27

agcatcaata tcactgtgta ctacgca 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-K-Re

<400> 28

agtgatattg atgctggggg gctggaa 27

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-L-Fw

<400> 29

ggggctaatg acaccgcccg aaagcacacg tac 33

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-L-Re

<400> 30

tcgggcggtg tcattagccc cgcgcacgat ctg 33

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-M-Fw

<400> 31

ataaacaatt ggacggagat cacacaa 27

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SC-M-Re

<400> 32

cgtccaattg tttatcttca ctagccg 27

<210> 33

<211> 1180

<212> DNA

<213> 单纯疱疹病毒-2(Herpes simplex virus-2)

<400> 33

atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc 60

cgcgtcgtct gcgccaaata cgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat 120

cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag 180

cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc 240

actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg 300

gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg 360

accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac 420

accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg 480

agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc 540

cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag 600

atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg 660

cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac 720

agcatcggga tgctcccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc 780

ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg 840

gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac 900

tcggccctct tagaggatcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac 960

atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc 1020

ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggtgc tggtcatcgg cggtattgcg 1080

ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg 1140

gatgacgacg cgcccccctc gcaccagcca ttgttttact 1180

Claims

1.一种修饰型HSV gD蛋白，其为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白(修饰型HSV gD蛋白)，其为如下修饰的修饰型HSV gD蛋白：野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、与存在于受体结合结构域(RBD)的B细胞表位相比较，中和抗体诱导活性低或无中和抗体诱导活性的B细胞表位(诱饵表位)中的至少1个不发挥作为表位的功能。

2.根据权利要求1所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述存在于RBD中的B细胞表位为包含下述氨基酸残基的表位，所述氨基酸残基相当于选自由序列号1记载的氨基酸序列中的第134位的精氨酸残基、第139位的天冬氨酸残基及第222位的精氨酸残基组成的组中的至少1个氨基酸残基。

3.根据权利要求1或2所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位为存在于gD胞外结构域的N末端脯氨酸富集区域(PRR)的B细胞表位。

4.根据权利要求3所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位为：

包含存在于下述区域的至少1个氨基酸残基的表位，所述区域为在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于所述第50位的脯氨酸残基的氨基酸的距离为1.5nm以下的区域。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位的修饰通过氨基酸残基的置换、氨基酸残基的缺失、和/或基于氨基酸残基的置换或缺失的糖链导入而进行。

6.根据权利要求5所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

7.根据权利要求5或6所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述诱饵表位的修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

9.根据权利要求5所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述野生型HSV gD的胞外结构域包含序列号1记载的氨基酸序列，

所述诱饵表位的修饰包含选自由下述修饰组成的组中的至少1种修饰：

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸残基置换为天冬酰胺残基而导入糖链来进行的修饰。

10.根据权利要求5～9中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述糖链为N型糖链。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰型HSV gD蛋白进一步在HSV gD的胞外结构域的C末端侧连接有至少1个非种系选择性T细胞表位。

12.根据权利要求11所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述非种系选择性T细胞表位为包含序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、或序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

13.根据权利要求12所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述非种系选择性T细胞表位为包含序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰型HSV gD蛋白还包含：所述野生型HSV gD的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第251～315位的氨基酸残基的氨基酸残基中的至少一部分的缺失。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰型HSV gD蛋白进一步包含：通过将野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第231位的缬氨酸残基的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基而进行的修饰。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述HSV为HSV-1或HSV-2。

17.一种HSV疫苗，其包含权利要求1～16中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白。

18.一种修饰型HSV gD蛋白，其为单纯疱疹病毒(HSV)的包膜糖蛋白D(gD)的修饰蛋白(修饰型HSV gD蛋白)，其是按照使野生型HSV gD的胞外结构域(ectodomain)中的、存在于gD胞外结构域的N末端脯氨酸富集区域(PRR)的B细胞表位中的至少1个表位不发挥表位的功能的方式修饰而得的。

19.根据权利要求18所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述存在于PRR的B细胞表位为：

包含存在于下述区域的至少1个氨基酸残基的表位，其中，所述区域为在野生型HSV gD的胞外结构域的晶体结构的表面的、与相当于所述第50位的脯氨酸残基的氨基酸的距离为1.5nm以下的区域。

20.根据权利要求18或19所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰通过基于氨基酸残基的置换或缺失而导入糖链来进行。

21.根据权利要求20所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰包含：通过向野生型HSVgD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

22.根据权利要求20或21所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

23.根据权利要求20～22中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰包含：通过向野生型HSV gD的胞外结构域的、相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第186位的精氨酸的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

24.根据权利要求20所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述野生型HSV gD的胞外结构域包含序列号1记载的氨基酸序列，

所述修饰包含选自由下述修饰组成的组中的至少1种修饰：

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第50位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第51位的脯氨酸残基置换为脯氨酸残基以外的氨基酸残基而导入糖链来进行的修饰、

通过基于将序列号1记载的氨基酸序列中的第74位的脯氨酸残基置换为天冬酰胺残基、将第76位的谷氨酸残基置换为丝氨酸残基而导入糖链来进行的修饰、及

25.根据权利要求19～24中任一项所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述修饰型HSV gD蛋白进一步在HSV gD的胞外结构域的C末端侧连接有至少1个非种系选择性T细胞表位。

26.根据权利要求25)所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述非种系选择性T细胞表位为包含序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、或序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。

27.根据权利要求26所述的修饰型HSV gD蛋白，其中，所述非种系选择性T细胞表位为包含序列号8记载的氨基酸序列的非种系选择性T细胞表位。