CN103483446A - 抗hpv l2 蛋白的广谱中和单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合人乳头瘤病毒(HPV)的L2蛋白并能够中和多个型别的HPV的广谱中和单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。本发明还涉及所述广谱中和单克隆抗体所针对的表位肽，包含此类表位肽的载体蛋白，以及此类表位肽和载体蛋白的用途。

Description

抗HPV L2 蛋白的广谱中和单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及能够结合人乳头瘤病毒(HPV)的L2蛋白并能够中和多个型别的HPV的广谱中和单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。本发明还涉及所述广谱中和单克隆抗体所针对的表位肽，包含此类表位肽的载体蛋白，以及此类表位肽和载体蛋白的用途。 
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是一种无包膜病毒,它由病毒衣壳以及包裹在衣壳内的约8kb DNA构成。HPV的病毒衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成的直径为50-55nm的正二十面体颗粒。目前已经发现了100多种型别的HPV，其中，根据其与肿瘤发生的关系可以分为两类：低危型HPV――包括HPV6和HPV11，其致癌风险低，主要引起尖锐湿疣；高危型HPV――包括HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，其是导致包括女性宫颈癌在内的多种肿瘤疾病的主要原因（Clifford GM，Smith JS，Plummer M，et a1．Br J Cancer，2003，88(1)：63-73）。现有的研究结果表明，可以通过预防HPV感染来预防宫颈癌等疾病的发生。 
HPV的疫苗研究发现，体外表达的HPV L1蛋白能自组装成病毒样颗粒(VLP)，其结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体。因此，现有的以及正在研发的HPV疫苗多以病毒样颗粒为主要疫苗成分。然而，研究发现，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫， 而仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护（Giroglou T,Sapp M,Fligge C,et al.Vaccine.2001;19(13-14):1783-93；Orozco JJ,Carter JJ,Koutsky LA.J Virol  [J].2005;79(15):9503-14;Fleury MJ，Touze A，Maurel MC,et al.Protein Sci.2009.18(7):1425-1438）。 
目前，扩大疫苗的保护范围的主要方法是增加疫苗的价数，开发多价疫苗。然而，随着疫苗价数的增加，不但加大了制备的难度，从而使疫苗的成本急剧增加，而且给疫苗的安全性带来极大的挑战。此外，多价疫苗之间可能存在着相互间的免疫干扰，使得各价疫苗难以充分发挥其诱导免疫的功能。因此，还需要研究一种制备方法简单，成本低并且能够产生针对多个型别的保护的HPV疫苗。 
在疫苗研究中，单克隆抗体是疫苗抗原质控的重要工具，抗体水平是评价疫苗效果的标准，而且，抗体及其表位(尤其是中和抗体对应的中和表位)以及相应的中和机制也是疫苗研发的重要指针。进一步，在应用研究中，中和抗体，特别是广谱中和抗体，在HPV的诊断，预防和治疗上也将具有特别的优势。然而，现有研究表明，HPV L1蛋白所诱导的抗体大多为型别特异性中和抗体，极少有跨型别的广谱中和抗体的报道。最近的研究发现，HPV L2蛋白上存在大量的广谱表位，能够诱导机体产生跨型别的交叉保护抗体。因此，本领域需要更多的针对L2蛋白的广谱中和抗体，以对L2蛋白上的表位进行检测与评价（从而鉴定有价值的广谱表位），并将该抗体及其对应的表位应用于HPV的诊断，预防和治疗中。 
发明内容
本发明提供了能够结合人乳头瘤病毒(HPV)的L2蛋白并能够中和多个型别的HPV的广谱中和单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。本发明还涉及所述广谱中和单克隆抗体所针对的表位肽，包含此类表位肽的载体蛋白，以及此类表位肽和载体蛋白的用途。 
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。 
如本文中所使用的，术语“HPV L2蛋白”是指，人乳头瘤病毒(HPV)的次要衣壳蛋白（L2蛋白），其是本领域公知的。在本申请中，当提及HPV的L2蛋白时，其主要涉及选自以下11种型别的HPV的L2蛋白：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。然而，本领域技术人员理解，术语“HPV L2蛋白”还可以包括其他型别的HPV的L2蛋白。 
在本申请中，为了方便起见，当描述HPV L2蛋白的氨基酸序列时，除非上下文特别指出，否则，参照HPV16 L2蛋白的氨基酸序列进行描述。例如，表述“HPV L2蛋白的第21-30位氨基酸残基”是指，HPV16L2蛋白的第21-30位氨基酸残基。然而，如本文中所使用的，术语“HPVL2蛋白”意欲包括所有型别的HPV（特别是上述11种型别）的L2蛋白。因此，表述“HPV L2蛋白的第21-30位氨基酸残基”不仅包括HPV16L2蛋白的第21-30位氨基酸残基，而且包括其他型别的HPV L2蛋白中的相应序列片段。 
如本文中所使用的，当提及HPV16L2蛋白的氨基酸序列时，其使用NCBI数据登录号：AAD33258.1所示的序列来进行描述。例如，表述“HPV16 L2蛋白的第21-30位氨基酸残基”中的第21-30位氨基酸残基是指，AAD33258.1所对应的多肽的第21-30位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HPV16 L2蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HPV16 L2蛋白”应包括所有此类序列，包括例如AAD33258.1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HPV16 L2蛋白的序列片段时，其不仅包括 AAD33258.1的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HPV16 L2蛋白的第21-30位氨基酸残基”包括，AAD33258.1的第21-30位氨基酸残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。 
如本文中所使用的，术语“HPV16 C50 L2蛋白”是指，缺失了C端50个氨基酸残基的HPV16 L2蛋白。 
如本文中所使用的，术语“HPV L1蛋白”是指，人乳头瘤病毒(HPV)的L1蛋白，其是本领域公知的（参见，例如NCBI GENBANK数据库序列号：DQ469930.1）。在本申请中，当提及HPV的L1蛋白或VLP时，其主要涉及选自以下11种型别的HPV的L1蛋白或VLP：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。然而，本领域技术人员理解，术语“HPV L1蛋白”还可以包括其他型别的HPV的L1蛋白。 
在本申请中，为了方便起见，当描述HPV L1蛋白的氨基酸序列时，除非上下文特别指出，否则，参照HPV16 L1蛋白的氨基酸序列进行描述。例如，表述“HPV L1蛋白的第127-128位氨基酸残基”是指，HPV16L1蛋白的第127-128位氨基酸残基。然而，如本文中所使用的，术语“HPV L1蛋白”意欲包括所有型别的HPV（特别是上述11种型别）的L1蛋白。因此，表述“HPV L1蛋白的第127-128位氨基酸残基”不仅包括HPV16L1蛋白的第127-128位氨基酸残基，而且包括其他型别的HPV L1蛋白中的相应序列片段。 
如本文中所使用的，当提及HPV16 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO:55的氨基酸序列来进行描述。例如，表述“HPV16 L1蛋白的第127-128位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的第127-128位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HPV16 L1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能。因此，在本发明中， 术语“HPV16 L1蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO:55所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HPV16 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:55的序列片段，还包括SEQ ID NO:55的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HPV16 L1蛋白的第127-128位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO:55的第127-128位氨基酸残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。 
如本文中所使用的，术语“HBcore蛋白”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原蛋白，其是本领域公知的（参见，例如NCBI GENBANK数据库序列号：AAF82721.1）。 
如本文中所使用的，当提及HBcore蛋白的氨基酸序列时，其使用NCBI数据登录号：AAF82721.1所示的序列来进行描述。例如，表述“HBcore的第79-81位氨基酸残基”是指，AAF82721.1所对应的多肽的第79-81位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBcore的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBcore”应包括所有此类序列，包括例如AAF82721.1所对应的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBcore的序列片段时，其不仅包括AAF82721.1的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBcore蛋白的第79-81位氨基酸残基”包括，AAF82721.1的第79-81位氨基酸残基，以及其变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。 
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链（每对具有一条“轻”（L）链和一条“重”（H）链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、 α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区（FR）的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。 
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体（例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽， 其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。 
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。 
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。 
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和PoljakR.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。 
可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如本发明提供的单克隆抗体14H6）获得抗体的抗原结合片段（例如，上述抗体片段），并且以与 用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。 
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。 
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得（Nature,256:495,1975），但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。 
如本文中所使用的，以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体14H6是与从杂交瘤细胞株14H6或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。 
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体（其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类），且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体（其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类），但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。 
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白（受体抗体）的全部或部分CDR区被一非人源抗体（供体抗体）的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源（例如，小鼠、大鼠或兔）抗体。此外，受体抗体的构架区（FR）的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522525(1986);Reichmann et al., Nature,332:323329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992);和Clark,Immunol.Today 21:397402(2000)。 
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力（例如，感染细胞的能力）的抗体或抗体片段。 
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子（例如抗体）之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。 
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPV L1蛋白（可以将表位肽插入在所述蛋白的第127-128位氨基酸之间或在第423-424位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003,77:8386-8393），HBV核心抗原（可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Koletzki,D.,et al.HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein[J].Biol Chem,1999,380:325-333），CRM197蛋白（可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端）。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体（例如柔性或刚性连接体），以促进二者各自的折叠。 
在本发明中，CRM197(Cross-Reacting Materials 197)是指，白喉毒素(DT)的一种无毒突变体(Uchida，T.，A.M,Pappenheimer，Jr.，R.Gregory，et al.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核苷酸突变，导致第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Ratti et al.,Nucleic Acids Research.1984.12：4063-4070)。 
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原（例如，HPV L2蛋白）的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，单克隆抗体14H6)竞争结合L2蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段（即，抗原结合部分）。 
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。 
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。 
如本文中所使用的，术语“载体（vector）”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如SV40）。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。 
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。 
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6 个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.）方便地进行的Needleman等人（1970）J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表（weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gap weight）和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。 
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方 法在本领域内是熟知的（参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。 
如本文中使用的，术语“免疫原性（immunogenicity）”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。 
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特异性的抗体）是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力（KD）结合该抗原。 
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体（例如，本发明的单克隆抗体14H6）以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数（KD）结合抗原（例如，L2蛋白），例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。 
如本文中所使用的，术语“广谱”是指，本发明的单克隆抗体能够中和多种型别（例如，至少3种，例如至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种型别）的HPV。例如，本发明的单克隆抗体14H6能够中和下列11种型别的HPV：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。由广谱（中和）单克隆抗体所识 别的L2蛋白的表位被称为“广谱（中和）表位”。 
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。 
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株14H6时，其还指杂交瘤细胞株14H6的亚克隆和后代细胞。 
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995），并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。 
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝）、弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂）、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。 
如本文中所使用的，术语“HPV VLP”是指，由体外表达的HPV L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。 
如本文中所使用的，术语“HPV假病毒”是指，利用HPV VLP可非特异性包装核酸的特性,通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，且包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，而形成的HPV 假病毒(Yeager,M.D,Aste-Amezaga,M.et al(2000)Virology(278)570－7)。用于形成假病毒的方法包括例如，重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。本发明中所指的HPV假病毒主要包括11个型别的HPV假病毒，分别是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒。 
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病（例如HPV感染或与HPV感染相关的疾病）有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病（例如HPV感染或与HPV感染相关的疾病）的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。 
因此，在一个方面，本发明提供了能够特异性结合HPV L2蛋白并且能够中和多个型别的HPV的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包括： 
包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5-7的CDR的重链可变区(VH)；和/或 
包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR的轻链可变区(VL)。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括，如SEQ ID NO:2所示的VH。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括，如SEQ ID NO:4所示的VL。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括： 
包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5-7的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR的VL。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括：如SEQ ID NO: 2所示的VH，和如SEQ ID NO:4所示的VL。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株14H6产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株14H6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。 
在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体（例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合HPV的L2蛋白。 
在一个优选的实施方案中，所述L2蛋白是源自HPV 16的L2蛋白。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。 
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体是中和抗体，其能够中和至少3种，例如至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种型别的HPV。在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够中和下列11种型别的HPV：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。 
在另一个方面，本发明提供了能够特异性结合HPV L2蛋白并且能够中和多个型别的HPV的单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够阻断所述L2蛋白与由杂交瘤细胞株14H6产生的单克隆抗体的结合的至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%，所述杂交瘤细胞株14H6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。 
此类单抗所识别的表位与单抗14H6识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗14H6与HPV的L2蛋白的结合至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少 90%，优选至少95%或优选至少99%。 
可以采用常规方法如Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的方法，测定某一待测单抗降低某一已知单抗结合HPV L2蛋白的能力。一个示例性的方法包括：先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经标记的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中进行孵育，然后在洗涤后测定在不同稀释度的待测抗体下，已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱，结合到板上的已知抗体就越少。通常，将抗原预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定待测单抗阻断经标记的已知单抗的能力。 
可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先用免疫原（必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。将免疫原预先偶联到某些已知蛋白（如血清白蛋白）上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂（如PEG）将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)。 
将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶（HGPRT或HPRT）的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶（HAT培养基）等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。 
优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21 和MC-11小鼠肿瘤衍生株（THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA），以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株（American Type Cμl ture Collection,Rockville,Md.USA）。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。 
杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。 
在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。 
利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。 
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞（如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞），并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。 
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可 以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。 
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中所述抗体重链可变区包含，氨基酸序列为SEQ ID NO:5-7的CDR。 
在一个优选的实施方案中，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。 
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 
在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体轻链可变区包含，氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR。 
在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。 
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。 
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。 
在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。 
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。 
在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。 
在另一个方面，本发明提供了杂交瘤细胞株14H6，其保藏于中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。 
如本申请所证实的，单克隆抗体14H6的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示（其示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示），且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示（其示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示）。 
单克隆抗体14H6重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5-7；轻链的CDR1、CDR2和CDR 3的氨基酸序列分别为SEQID NO:8-10。 
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记时本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶（例如辣根过氧化物酶）等。 
在另一个方面，本发明提供了检测HPV L2蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的（例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品）。 
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HPV的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测HPV L2蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗 体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。 
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HPV L2蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HPV。 
在一个优选的实施方案中，所述L2蛋白是源自HPV 16的L2蛋白。 
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。 
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。 
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）。 
在一个优选的实施方案中，所述HPV选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。 
在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中HPV的毒力的方法，其包括，将包含HPV的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中HPV的毒力。在一个优选的实施方案中，所述HPV选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。 
在另一个方面，本发明还提供了一种分离的表位肽，其由HPV L2蛋白的10－30个连续氨基酸残基组成，且包含HPV L2蛋白的第21－ 30位氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述HPV L2蛋白是HPV16L2蛋白。在一个优选的实施方案中，所述HPV L2蛋白的第21－30位氨基酸残基如SEQ ID NO:31所示。 
在一个优选的实施方案中，本发明的表位肽由L2蛋白的不多于30个的连续氨基酸残基组成，例如，其由30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，11个或10个的连续氨基酸残基组成。例如，本发明的表位肽具有选自SEQ ID NO:13、36、38、40、42、44、46、48、50和52所示的氨基酸序列。 
特别地，本发明的该表位肽，不需要载体蛋白，即能够被单克隆抗体14H6特异性识别/结合。然而，优选地，可以将本发明的表位肽与载体蛋白融合，以增强表位肽的免疫原性，使得表位肽能够被机体的免疫系统识别，并诱导广谱中和抗体的产生。 
因此，在一个方面，本发明还提供了一种重组蛋白，其包含本发明的分离的表位肽和载体蛋白，并且不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。此外，任选地，所述表位肽通过连接体（刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3）与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法（重组技术）产生，也可以通过化学合成方法产生。 
在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HPV L1蛋白和HBV核心抗原。 
在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是CRM197蛋白或其片段，并且将本发明的表位肽，任选地通过连接体，连接至CRM197蛋白或其片段的N末端或C末端。在一个优选的实施方案中，所述CRM197蛋白的片段是CRM389或CRMA，其序列分别如SEQ ID NO:105或119所示。在一个优选的实施方案中，所述连接体的氨基酸序列如SEQ IDNO:166所示。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自 下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：93、95、97、99、101、103、107、109、111、113、115、117、121、123、125、127、129和131。 
在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是HPV L1蛋白，并且将本发明的表位肽插入至所述L1蛋白的第127-128位氨基酸残基之间，或第423-424位氨基酸残基之间。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：57、59、61、63、65、67、69、71、73和75。 
在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白是HBV核心抗原，并且用本发明的表位肽替换所述HBV核心抗原的第79-81位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述表位肽与HBV核心抗原通过连接体连接。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：79、81、83、85、87和89。 
在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或重组蛋白的核苷酸序列。在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。 
在另一个方面，还提供了包含如上所述的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。 
在另一个方面，还提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养如上所述的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的重组蛋白。 
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。 
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的HPV感染 或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的药物组合物或重组蛋白。 
在另一个方面，提供了本发明的重组蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）。 
在另一个方面，本发明提供了用于在受试者体内诱发能够中和至少2个型别的HPV的中和抗体的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物或重组蛋白。 
在另一个方面，提供了本发明的重组蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者体内诱发能够中和至少2个型别的HPV的中和抗体。 
在另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的含有本发明的表位肽的载体蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。 
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的载体蛋白，或者本发明的药物组合物。 
在另一个方面，提供了本发明的表位肽或者载体蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）。 
发明的有益效果 
与现有技术相比，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有显著的有利方面。特别地，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段能够广谱地中和多种型别（多达11种）的HPV，从而对于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）具有特别显著 的优势。 
此外，本发明还提供了能够被本发明的广谱中和单克隆抗体识别的表位肽和含有所述表位肽的载体蛋白。此类表位肽和载体蛋白因含有“广谱”表位，而能够诱导机体产生抗多种型别的HPV的中和抗体，因此，对于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）具有特别显著的优势。 
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。 
附图说明
图1显示HPV16 C50 L2蛋白的SDS-PAGE检测结果。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2：HPV16 C50 L2蛋白。SDS-PAGE检测结果显示，HPV16 C50 L2蛋白的纯度在90%以上。 
图2显示抗体14H6的SDS-PAGE检测结果。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2：抗体14H6。SDS-PAGE检测结果显示，抗体14H6的纯度在95%以上。 
图3显示蛋白质印迹分析的检测结果，其显示了HPV16 C50 L2蛋白与抗体14H6的特异性结合。泳道1：HPV16 C50 L2蛋白；泳道2：蛋白分子量标记。 
图4显示抗体14H6与HPV16 C50 L2蛋白的N端7段多肽(P1-P7)的反应性的ELISA检测。其中，横坐标表示所使用的多肽，纵坐标表示log10（14H6抗体对多肽的抗体滴度），16L2表示用作阳性对照的HPV16 C50 L2蛋白。结果显示，抗体14H6对P3和16L2具有相似的反应性，而不与其他多肽发生反应。这表明，抗体14H6所识别的表位位于P3上。 
图5显示分别以HPV16 L1蛋白，乙肝病毒核心抗原(HBVcoreAg，或简称HBcore蛋白)或白喉毒素无毒突变体CRM197为基础的、包含L2蛋白的表位肽的重组载体蛋白的克隆设计。在本发明中，使用了HPV16 L2蛋白的9种表位肽： 
L2A，HPV16 L2的aa21-aa30（aa表示氨基酸，其置于数字n前面时，表示第n位氨基酸（例如，aa21表示第21位氨基酸）；置于数字n之后时，表示多肽长度为n个氨基酸（下同）），10肽； 
L2B，HPV16 L2的aa20-aa31，12肽； 
L2C，HPV16 L2的aa19-aa32，14肽； 
L2D，HPV16 L2的aa18-aa33，16肽； 
L2E，HPV16 L2的aa17-aa34，18肽； 
L2F，HPV16 L2的aa16-aa35，20肽； 
L2G，HPV16 L2的aa15-aa36，22肽； 
L2I，HPV16 L2的aa13-aa38，26肽； 
L2K，HPV16 L2的aa11-aa40，30肽。 
图5A：以HPV16 L1蛋白作为蛋白载体，并且可使用下列2个插入位置中的任一个。第一个插入位置为HPV16L1蛋白的aa127-aa128之间（即，目标多肽的N端与HPV16L1蛋白的aa127的C端融合，且目标多肽的C端与HPV16L1蛋白的aa128的N端融合，下同）。根据所使用的表位肽(L2B，L2C，L2D，L2E和L2F)，将获得的重组蛋白分别命名为HPV16L1-DE-L2B，HPV16L1-DE-L2C，HPV16L1-DE-L2D，HPV16L1-DE-L2E和HPV16L1-DE-L2F。第二个插入位置为HPV16 L1蛋白的aa423-aa424之间。类似地，根据所使用的表位肽，将获得的重组蛋白分别命名为HPV16L1-α4-L2B等。 
图5B：以HBcore蛋白作为蛋白载体，插入位置为aa78-82（即，目标多肽的N端与HBcore蛋白的aa78的C端融合，且目标多肽的C端与HBVcore蛋白的aa82的N端融合，相当于用目标多肽替换HBcore蛋白的aa79-81）。此外，为了促进目标多肽和载体蛋白的正确折叠，在目标多肽与载体蛋白之间添加连接体。类似地，根据所使用的表位 肽，将获得的重组蛋白分别命名为HBcore-L2A等。 
图5C：以CRM197或其片段（即，CRM389或CRMA）作为蛋白载体，将目的多肽通过连接体(Linker)连接至蛋白载体的C端。其中，CRM389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸残基（aa1-389）的多肽；CRMA是指包含CRM197的第1-190位氨基酸残基（aa1-190）的多肽；Linker是指连接体，其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。类似地，根据所使用的表位肽和蛋白载体，将获得的重组蛋白分别命名为CRM197-L2A等；CRM389-L2A等；和CRMA-L2A等。 
图6显示通过蛋白质印迹分析，使用抗体14H6或单抗21A5（单抗21A5（本实验室制备）特异性抗HPV16 L1蛋白）检测图5A中的重组蛋白的结果。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1：HPV16L1-DE-L2B；泳道2：HPV16L1-DE-L2C；泳道3：HPV16L1-DE-L2D；泳道4：HPV16L1-DE-L2E；泳道5：HPV16L1-DE-L2F；泳道6：HPV16L1蛋白；泳道7：HPV16 C50 L2蛋白；泳道8：HPV16L1-α4-L2B；泳道9：HPV16L1-α4-L2C；泳道10:HPV16L1-α4-L2D；泳道11:HPV16L1-α4-L2E；泳道12:HPV16L1-α4-L2F。结果显示，图5A所构建的重组蛋白均能与单抗21A5反应；并且，图5A所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
结果显示，图5A所构建的重组蛋白均能与单抗21A5反应；并且，图5A所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
图7显示经纯化的图5A所构建的重组蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1：蛋白分子量标记；泳道2：HPV16L1-DE-L2B；泳道3：HPV16L1-DE-L2C；泳道4：HPV16L1-DE-L2D；泳道5：HPV16L1-DE-L2E；泳道6：HPV16L1-DE-L2F；泳道7:HPV16L1-4-L2B；泳道8:HPV16L1-α4-L2C；泳道9:HPV16L1-α4-L2D；泳道10:HPV16L1-4-L2E；泳道11:HPV16L1-α4-L2F，泳道12：蛋白分子量标记。检测结果显示，经纯化的10个重组蛋白的纯度均在95%左右。 
图8显示使用透射电镜观察图5A所构建的重组蛋白的结果。其中， 图8A为HPV16L1-DE-L2B，图8B为HPV16L1-DE-L2C，图8C为HPV16L1-DE-L2D，图8D为HPV16L1-DE-L2E，图8E为HPV16L1-DE-L2F，图8F为HPV16L1-α4-L2B，图8G为HPV16L1-α4-L2C，图8H为HPV16L1-α4-L2D，图8I为HPV16L1-α4-L2E，图8J为HPVL1-α4-L2F，图8K为HPV16的VLP。结果显示，以HPV16L1-DE为蛋白载体所构建的5个重组蛋白均能形成均一的直径约为50nm的颗粒；以HPV16L1-α4为蛋白载体所构建的5个重组蛋白中，HPV16L1-α4-L2B可形成直径为20nm的颗粒，HPV16L1-α4-L2C可形成直径为40nm的松散颗粒，而HPV16L1-α4-L2D，HPV16L1-α4-L2E和HPV16L1-α4-L2F均可形成直径约5nm的小壳粒。 
图9显示各抗体对图5A所构建的重组蛋白的反应性的ELISA检测结果。其中，使用3种抗体（针对HPV16 L1蛋白的单抗PD1和8A9，以及针对HPV16 L2蛋白的单抗14H6，其中抗体PD1和8A9由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程研究中心筛选得到）对各蛋白进行ELISA检测，并且HPV16 VLP和HPV16 C50 L2用作对照。结果显示，各重组蛋白对单抗PD1和8A9的反应性与HPV16 VLP相当；并且，各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16 C50 L2相当。 
图10显示通过ELISA检测用图5A所构建的重组蛋白（5μg和0.5μg）免疫小鼠后获得的血清对HPV16 C50 L2蛋白的抗体滴度的结果。检测结果表明，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的血清针对HPV16 C50 L2蛋白的抗体滴度均在105左右，与用HPV16 C50 L2蛋白单独免疫后的结果相当。这表明，图5A所构建的重组蛋白与HPV16C50 L2蛋白的免疫原性相当。 
图11显示通过假病毒中和实验检测用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后获得的血清的中和滴度。PsV，假病毒。结果表明，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的血清不仅能中和HPV16的假病毒，而且对HPV11、18、45和58假病毒具有交叉中和作用。这表明，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。 
图12显示经纯化的图5B所构建的重组蛋白的SDS-PAGE检测结果（上图框）以及用抗体14H6进行的蛋白质印迹分析的检测结果（下图框）。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1:蛋白分子量标记；泳道2:HBcore-L2A；泳道3:HBcore-L2B；泳道4:HBcore-L2C；泳道5:HBcore-L2D；泳道6:HBcore-L2E；泳道7:HBcore-L2F。 
SDS-PAGE检测结果显示，经纯化的图5B所构建的重组蛋白的纯度在80%以上。蛋白质印迹分析的检测结果显示，除HBcore-L2A外，图5B所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
图13显示图5B所构建的重组蛋白的电镜观察结果。其中图13A-13G所使用的样品如下：图13A：HBcore；图13B:HBcore-L2A；图13C:HBcore-L2B；图13D:HBcore-L2C；图13E:HBcore-L2D；图13F:HBcore-L2E；图13G:HBcore-L2F。电镜结果显示，图5B所构建的6个重组蛋白均能够形成直径为40nm的颗粒。 
图14显示单抗14H6与图5B所构建的重组蛋白的反应性的ELISA检测结果。以HBcore和HPV16C50L2分别作为阴性与阳性对照。检测结果表明，各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16 C50 L2相当。 
图15显示通过ELI SA检测用图5B所构建的重组蛋白（5μg和0.5μg）免疫小鼠后获得的血清对HPV16 C50 L2蛋白的抗体滴度的结果。检测结果表明，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，产生的针对HPV16 L2蛋白的血清抗体滴度均在105左右，与用HPV16 C50 L2蛋白单独免疫后的结果相当。这表明，图5B所构建的重组蛋白与HPV16 C50L2蛋白的免疫原性相当。 
图16显示通过假病毒中和实验检测用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后获得的血清的中和滴度。检测结果表明，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的血清不仅能中和HPV16的假病毒，而且对HPV18假病毒具有一定的交叉中和作用。这表明，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。 
图17显示经纯化的图5C所构建的重组蛋白的SDS-PAGE检测结果（上图框）以及用抗体14H6进行的蛋白质印迹分析的检测结果（下图 框）。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1：CRM197-L2A；泳道2：CRM197-L2C；泳道3：CRM197-L2E；泳道4：CRM197-L2G；泳道5：CRM197-L2I；泳道6：CRM197-L2K；泳道7：CRM389-L2A；泳道8：CRM389-L2C；泳道9：CRM389-L2E；泳道10：CRM389-L2G，泳道11：CRM389-L2I；泳道12：CRM389-L2K；泳道13：CRMA-L2A；泳道14：CRMA-L2C；泳道15：CRMA-L2E；泳道16：CRMA-L2G；泳道17：CRMA-L2I；泳道18：CRMA-L2K；泳道19：蛋白分子量标记。 
SDS-PAGE检测结果显示，经纯化的图5C所构建的重组蛋白的纯度在80%以上。蛋白质印迹分析的检测结果显示，除了CRM197-L2A、CRM389-L2A、CRM A-L2A 外，图5C所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
图18显示单抗14H6与图5C所构建的重组蛋白的反应性的ELISA检测结果。以CRM197蛋白和HPV16 C50 L2蛋白分别作为阴性与阳性对照。检测结果表明，各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16 C50L2相当。 
图19显示通过ELISA检测用图5C所构建的重组蛋白（5μg和0.5μg）免疫小鼠后获得的血清对HPV16 C50 L2蛋白的抗体滴度的结果。。检测结果显示，用基于CRMA的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的针对HPV16 L2蛋白的血清抗体滴度最高，接近106；而用基于CRM197或CRM389的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的针对HPV16 L2蛋白的血清抗体滴度稍低，为大约104。 
图20显示通过假病毒中和实验检测用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后获得的血清对各个型别的假病毒的中和滴度。检测结果显示，用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的血清不仅能中和HPV16的假病毒（中和滴度均为103左右），而且对HPV11、18、45、52、59具有交叉中和作用。这表明，用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。 
序列信息 
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。 
Figure BDA00001742592300311
Figure BDA00001742592300321
序列信息 
序列1(SEQ ID NO:1)：456bp 
ATGGAATGGACCTGGGTTTTTCTCTTCCTGATGGCACTGGTCACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGATGTCCTGCACAGCCTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTATTACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAGGGCCACTATAACAGCGGACACATCCTCCAATACAGTCTATCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTACCGTCTATTATTGTGTTAGAAGTTTGGTAGAAGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTCTCTTCAGCCAAAACGACACCCCCATCGTTTATCCATTGGTCCCTGGAATCTCTA 
序列2(SEQ ID NO:2)：152aa 
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序列3(SEQ ID NO:3)：477bp 
AACATTATAATTAATGCATTTGAAATTGGTTTTGTTTCCTTAGACCCCTTCGTTTCCTGGTGTCTAATAGTGATATCTGCAGTATTCTTGATATTTTTAAATGAAAAGGTCCTCTGCTGGGAAGGCTTTTATACATTAATAACAATAGTCTGTGTGTTTATCATTCCAGGTTCCACAGGTAACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCT 
序列4(SEQ ID NO:4)：159aa 
NIIINAFEIGFVSLDPFVSWCLIVISAVFLIFLNEKVLCWEGFYTLITIVCVFIIPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDP 
序列5(SEQ ID NO:5)：8aa 
GFNI KDTY 
序列6(SEQ ID NO:6)：8aa 
IDPANGIT 
序列7(SEQ ID NO:7)：10aa 
VRSLVEDFDY 
序列8(SEQ ID NO:8)：10aa 
ESVDSYGNSF 
序列9(SEQ ID NO:9)：3aa 
LAS 
序列10(SEQ ID NO:10)：6aa 
QQNNED 
序列11(SEQ ID NO:11)：15aa 
MRHKRSAKRTKRASA 
序列12(SEQ ID NO:12)：15aa 
KRASATQLYKTCKQA 
序列13(SEQ ID NO:13)：15aa 
TCKQAGTCPPDII PK 
序列14(SEQ ID NO:14)：15aa 
DIIPKVEGKTIADQI 
序列15(SEQ ID NO:15)：15aa 
IADQILQYGSMGVFF 
序列16(SEQ ID NO:16)：15aa 
MGVFFGGLGIGTGSG 
序列17(SEQ ID NO:17)：15aa 
GTGSGTGGRTGYIPL 
序列18(SEQ ID NO:18)：14aa 
CKQAGTCPPDIIPK 
序列19(SEQ ID NO:19)：13aa 
KQAGTCPPDIIPK 
序列20(SEQ ID NO:20)：12aa 
QAGTCPPDIIPK 
序列21(SEQ ID NO:21)：11aa 
AGTCPPDIIPK 
序列22(SEQ ID NO:22)：10aa 
GTCPPDIIPK 
序列23(SEQ ID NO:23)：9aa 
TCPPDIIPK 
序列24(SEQ ID NO:24)：8aa 
CPPDIIPK 
序列25(SEQ ID NO:25)：7aa 
PPDIIPK 
序列26(SEQ ID NO:26)：6aa 
PDIIPK 
序列27(SEQ ID NO:27)：14aa 
TCKQAGTCPPDIIP 
序列28(SEQ ID NO:28)：13aa 
TCKQAGTCPPDII 
序列29(SEQ ID NO:29)：12aa 
TCKQAGTCPPDI 
序列30(SEQ ID NO:30)：11aa 
TCKQAGTCPPD 
序列31(SEQ ID NO:31)：10aa 
TCKQAGTCPP 
序列32(SEQ ID NO:32)：9aa 
TCKQAGTCP 
序列33(SEQ ID NO:33)：8aa 
TCKQAGTC 
序列34(SEQ ID NO:34)：7aa 
TCKQAGT 
序列35(SEQ ID NO:35)：6aa 
TCKQAG 
序列36(SEQ ID NO:36)：10aa 
TCKQAGTCPP 
序列37(SEQ ID NO:37)：30bp 
ACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCT 
序列38(SEQ ID NO:38)：12aa 
KTCKQAGTCPPD 
序列39(SEQ ID NO:39)：36bp 
AAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGAC 
序列40(SEQ ID NO:40)：14aa 
YKTCKQAGTCPPDI 
序列41(SEQ ID NO:41)：42bp 
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序列42(SEQ ID NO:42)：16aa 
LYKTCKQAGTCPPDI I 
序列43(SEQ ID NO:43)：48bp 
CTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATA 
序列44(SEQ ID NO:44)：18aa 
QLYKTCKQAGTCPPDI IP 
序列45(SEQ ID NO:45)：54bp 
CAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCT 
序列46(SEQ ID NO:46)：20aa 
TQLYKTCKQAGTCPPDI IPK 
序列47(SEQ ID NO:47)：60bp 
ACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCTAAG 
序列48(SEQ ID NO:48)：22aa 
ATQLYKTCKQAGTCPPDI I PKV 
序列49(SEQ ID NO:49)：66bp 
GCTACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCTAAGGTT 
序列50(SEQ ID NO:50)：26aa 
ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG 
序列51(SEQ ID NO:51)：78bp 
GCATCGGCTACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCTAAGGTTGAAGGC 
序列52(SEQ ID NO:52)：30aa 
KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKT 
序列53(SEQ ID NO:53)：90bp 
AAACGTGCATCGGCTACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCTAAGGTTGAAGGCAAAACT 
序列54(SEQ ID NO:54)：1509bp 
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TTTGGATCCACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACAT 
序列165(SEQ ID NO:165)：59bp 
TTTGAATTCCTTAGGTATAATGTCAGGTGGACATGTACCTGCCTGTTTGCATGTTTTAT 
序列166(SEQ ID NO:166)：15aa 
GGGGSGGGGSGGGGS 
关于生物材料保藏的说明 
本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,Wuhan University,Wuhan,China)进行保藏的生物材料： 
杂交瘤细胞株14H6，保藏号为CCTCC－C201268，保藏时间为2012年5月30日。 
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。 
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。 
实施例1：抗HPV16L2蛋白单克隆抗体的制备 
抗原的制备 
利用大肠杆菌表达系统表达HPV16 C50 L2蛋白，目的蛋白主要以包涵体形式存在。经过包涵体洗涤、纯化后，将HPV16 C50 L2蛋白透析于PBS缓冲液中，进行复性。用SDS-PAGE检测复性至PBS中的HPV16C50 L2蛋白，结果如图1所示。SDS-PAGE检测结果显示，HPV16 C50 L2蛋白具有较高的纯度（大于90%）。将上述得到的HPV16 C50 L2蛋白稀释至10g/ml，备用。 
小鼠 
6周龄雌性Balb/c鼠由厦门大学生命科学院实验动物中心提供。 
杂交瘤的制备 
我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法来制备单克隆抗体。详细方法参见Ed Harlow et al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory 1988。该方法的简要过程如下： 
小鼠免疫：将上述得到的HPV16 C50 L2蛋白与弗氏完全佐剂（CFA）等体积混合乳化，然后进行四肢肌肉多点注射，每只每次注射250μl。首次免疫后14d、28d和42d，用同样剂量的HPV16 C50 L2蛋白加弗氏不完全佐剂（IFA）进行加强免疫。在第3次加强免疫后，采血，检测其与HPV16 C50 L2的反应滴度。当滴度达到106以上时，取小鼠脾脏细胞用于融合。融合前72hr再次进行加强免疫：将HPV16 C50 L2注入小鼠脾脏，50μg/只。制备60块融合板。 
融合：取血清滴度最高的小鼠的脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞相融合。先将脾脏研磨，得到脾细胞悬液；然后将其与细胞数目低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，并经PEG1500作用1min，将两种细胞融合一起；然后把融合细胞液(400ml)分装到20块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛 选培养基。抗原广谱性克隆通过ELISA及中和实验筛选得到，并且经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。 
杂交瘤的筛选：融合细胞在96孔板中培养10天后，吸取细胞上清，进行ELISA及中和检测。将阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定结合HPV16 C50 L2并且中和HPV假病毒为止。 
筛选结果：获得一株分泌单克隆抗体的细胞株：14H6。 
杂交瘤的培养：将稳定的杂交瘤细胞株在二氧化碳培养箱中扩增培养：从96孔板转移至24孔板，再转移至50ml细胞培养瓶。然后，收集细胞培养瓶内的细胞，将其注射到小鼠腹腔内，并在7－10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。 
单克隆抗体的纯化 
腹水先用50％的硫酸铵沉淀处理，然后对PBS，pH7.2进行透析，然后用DEAE柱进行HPLC纯化，最终得到经纯化的单克隆抗体。SDS-PAGE检测显示，经纯化的单克隆抗体的纯度均达到95%左右（结果如图2所示）。 
单克隆抗体与HPV16 C50 L2蛋白的反应性的ELISA检测 
将HPV16 C50 L2蛋白吸附至96孔板上，然后添加所获得的单抗的梯度稀释液，并检测二者的ELISA结合强度。用显示ELISA结合的最小抗体浓度表示单克隆抗体对HPV16 C50 L2蛋白的反应性。结果显示，单抗14H6对HPV16 C50 L2蛋白的反应性为10ng/ml，具有良好的反应性。 
单克隆抗体与HPV16 C50 L2蛋白的反应性的蛋白质印迹(WB)检测 
用蛋白质印迹(WB)法分析14H6是否能与HPV16 C50 L2蛋白反应。若能反应，则说明该抗体所识别的表位为线性表位；反之，则说明该抗体所识别的表位为构象表位。 
简言之，对HPV16 C50 L2蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将 SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上；在封闭后，加入抗体14H6反应1小时，并在反应后用1xTNT（NaCl，Tris，0.05%Tween-20，PH8.0，下同）洗涤膜5遍；之后，加入GAM-AP（缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗，购自美国KPL公司，下同）反应1小时，并在反应后用1xTNT洗涤膜5遍；然后进行显色，以分析14H6对HPV16 C50 L2蛋白的反应活性。蛋白质印迹分析的检测结果如图3所示。WB检测的结果显示，14H6与HPV C50 L2蛋白能发生反应，这表明抗体14H6所识别的表位为线性表位。 
实施例2：单克隆抗体对假病毒的中和活性的鉴定 
本实验通过假病毒-细胞中和模型，检测抗体清除假病毒或显著降低假病毒的毒力的能力。 
用假病毒-细胞中和模型鉴定实施例1中获得的单克隆抗体14H6针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒的中和活性（关于假病毒-细胞中和模型，参照卢五迅等，生物工程学报，2006年，22卷：990-995页）。以下以检测14H6抗体对HPV16假病毒的中和活性为例，示例性描述了此方法。 
首先，将14H6抗体以一定的浓度梯度连续倍比稀释（最高浓度为1mg/ml），然后针对每个稀释度，分别取50μl，将其与HPV16假病毒（MOI=0.1）在96孔板中混合，并在4℃孵育一个小时。以假病毒和PBS的混合液作为阴性对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293FT细胞的96孔细胞板中（每孔约1.5×104的293FT细胞），并于二氧化碳培养箱中、37℃下培养72小时。之后，使用荧光读板机（美国Backman公司）检测每一个孔的荧光强度。 
将荧光强度比阴性对照降低至少50%的最大单抗稀释度作为该单抗对该型HPV的中和滴度。如果单抗的中和滴度小于20,则认为其对于该型别的HPV无中和活性。单抗14H6针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒 的中和活性概括于表2中。结果显示，单抗14H6对HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59等11个型别的假病毒均有中和作用。这些结果表明，本发明所制备的单抗14H6对HPV具有广谱的中和活性（可中和多达11个型别的HPV）。 
表2：单抗14H6对11个型别的HPV假病毒的中和滴度 
Figure BDA00001742592300601
实施例3：14H6所识别的表位的定位及鉴定 
由于抗体14H6所识别的表位为线性表位，因此可以采用分段克隆的方法对其表位进行定位。 
首先，将HPV16 C50 L2蛋白在大肠杆菌中分段克隆表达。特别地，将HPV16 C50 L2蛋白的N端265个氨基酸依次分成五个肽段，共制备5个亚克隆肽，其中，每个肽段长65aa，且相邻的2个亚克隆肽具有15aa的重叠（aa表示氨基酸，其置于数字n前面时表示第n位氨基酸(例如，aa 130表示第130位氨基酸），置于数字之后时则表示多肽长度为n个氨基酸（下同)）。将这5个亚克隆肽分别命名为：HPV16L2-1至HPV16L2-5，其中，HPV16L2-1对应于HPV16 C50 L2蛋白的aa1-65，HPV16L2-2对应于HPV16 C50 L2蛋白的aa51-115，HPV16L2-3对应于HPV16 C50 L2蛋白的aa101-165，依此类推。 
检测这5个亚克隆肽与单抗14H6的WB反应性。结果显示，HPV16L2-1（aa1-aa65）能与单抗14H6发生反应，而其它亚克隆肽不 能与单抗14H6发生反应。这表明，单抗14H6所识别的表位位于HPV16L2-1所对应的65个氨基酸残基上。 
进一步，针对HPV16 C50 L2蛋白的前75个氨基酸，设计合成了7段多肽，每段多肽长15aa，且相邻的两段多肽具有5aa的重叠。将这7段多肽分别命名为P1-P7（其序列分别对应于SEQ ID NO:11-17）。然后，通过间接法ELISA分析这7段多肽与单抗14H6的结合情况。具体步骤如下： 
包被：将这7段多肽分别吸附到8K-96孔板上。 
加样：将抗体14H6的梯度稀释液（以10μg/ml为初始浓度，10倍倍比连续稀释11个梯度）分别加至包被了多肽的孔中。 
孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30min。 
洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 
加酶：每孔加入100μl缀合有GAM-AP（缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗，购自美国KPL公司）。 
孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30mi n。 
洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 
显色：每孔加入显色剂A液和B液（显色剂A液：13.4g/LNa2HPO4.12H2O+4.2g/L柠檬酸.H2O+0.3g/L过氧化氢脲；显色剂B液：0.2mM/L四甲基联苯胺(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺；下同）各50μl，37℃显色10min。 
结果判定：将待测样品的结果与阳性对照（HPV16 C50 L2蛋白）的结果进行对比。用显示ELISA结合的最大抗体稀释倍数（即，抗体对该多肽的抗体滴度）来反应抗体14H6与该多肽的反应性。如果初始浓度的抗体也不能与多肽发生反应，那么将抗体14H6对该多肽的抗体滴度定义为1。 
结果显示，P3（aa21-aa35）能与单抗14H6发生反应，而其它多肽不能与单抗14H6发生反应（参见图4）。这表明，单抗14H6所识别的表位位于P3所对应的15个氨基酸残基(SEQ ID NO:13)上。 
进一步，针对这15个氨基酸，设计合成了18段多肽（P8-P25， 其序列分别对应于SEQ ID NO:18-35）。然后，通过与上述类似的竞争性ELISA检测，分析这18段多肽与单抗14H6的结合情况。 
多肽与单抗的结合：将18段多肽分别与单抗混合，且多肽过量。同时，设置阳性对照：HPV16 C50 L2蛋白；和阴性对照：只有单抗样品，而不加入多肽。所有的样品都于37℃温育1小时。 
包被：将HPV16 C50 L2蛋白吸附到8K-96孔板上。 
加样：将温育后的20个样品分别加至包被有HPV16C50L2的孔中。 
孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30mi n。 
洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 
加酶：每孔加入100μl GAM-AP。 
孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30min。 
洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 
显色：每孔加入显色剂A液和B液各50μl，37℃显色10min。 
结果判定：将待测样品的结果与阳性对照和阴性对照的结果进行对比。 
结果显示，单抗14H6所识别的表位为10肽，其序列为SEQ IDNO:31，对应于HPV16 L2蛋白N端的aa21-30。 
实施例4：单克隆抗体的轻链基因和重链基因可变区的分离 
半贴壁培养107个杂交瘤细胞，用吹管吹起贴壁的细胞使之悬浮，并将其转移到新的4ml离心管中。以1500rpm离心3min，收集沉淀的细胞，并将其重悬于100μl无菌PBS（pH7.45）中。将细胞悬液转移到一新的1.5ml离心管中，加入800μl Trizol(Roche,Germany)，并轻轻颠倒混匀，静置10min。然后，加入200μl氯仿并剧烈振荡15s，静置10min。之后，以4℃、12000rpm离心15min，并转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并静置10min。之后，以4℃、12000rpm离心10min，弃上清；加入600μl 75％乙醇进行洗涤，以4℃、12000rpm离心5min，弃上清；将沉淀于60℃真空抽干5min。之后，将透明的沉淀溶于70μl DEPC H2O中，并分装成 两管。每管分别加入1μl反转录引物，其中一管加入的反转录引物为MVJkR（5'-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3'），用于扩增轻链可变区基因；另一管加入的反转录引物为MVDJhR（5'-CggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CC TTg(g/A)CC CCA-3'），用于扩增重链可变区基因。向每管中加入1μl dNTP(上海生工)，然后于72℃水浴10min，之后立即置于冰浴中5min；然后加入10μl 5x反转录缓冲液，1μl AMV(10u/μl，Pormega)，1μl Rnasin(40u/μl，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。 
采用聚合酶链式反应（PCR）法分离抗体基因可变区，使用根据Novagen公司的Ig-Prime试剂盒合成的引物组（表3）以及另外的两条下游引物MVJkR和MVDJhR（上海博亚公司合成），其中MVJkR为用于轻链可变区基因扩增的下游引物，MVDJhR为用于重链可变区基因扩增的下游引物。所使用的模板为通过上述方法获得的cDNA。PCR条件为：94℃5min；35个循环的（94℃40s，53℃1min，72℃50s）；72℃15min。回收目的片段，并克隆至pMD 18-T载体中，然后进行测序（上海博亚公司）。对测序序列进行blast比对，以确定抗体可变区的核苷酸序列，并进而确定相应的氨基酸序列。 
按照上述方法，从杂交瘤细胞株14H6中克隆出其分泌的单抗的可变区基因，并确定了相应的氨基酸序列。表3显示了所使用的上游引物的序列。表4显示了单克隆抗体14H6的重链和轻链可变区的核甘酸序列和氨基酸序列的序列编号。表5显示了根据Kabat Sequences of  Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))中描述的方法确定的单克隆抗体14H6的CDR氨基酸序列。 
表3：用于扩增单抗可变区基因的上游引物的序列 
  可变区基因   上游引物名称   上游引物序列
  14H6 Vh   MuIgVh5'-B1   5'-ATg(A/g)AATg(C/g)A(C/g)CTgg gT(C/T)(A/T)T(C/T)CTCTT-3'
  14H6 Vk   MuIgkVl 5'-Cv   5'-ggAggATCCTCATTATTTTg-3'
[0559] 表4：单克隆抗体14H6的可变区的序列编号 
Figure BDA00001742592300641
表5：单克隆抗体14H6的CDR氨基酸序列 
Figure BDA00001742592300642
利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例如嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特性（例如，对HPV的广谱中和活性）。 
实施例5：HPV16 L2蛋白上14H6所识别的表位的同源性分析 
使用MEGA5.0软件将HPV16 L2蛋白的氨基酸序列与NCBI数据库中收录的所有HPV L2蛋白的序列进行比对，分析HPV16 L2蛋白的aa21-30的序列同源性。经搜索和筛选，从NCBI数据库中得到116个型别的HPV在该区段的序列。对这些序列进行比对，并对各氨基酸的保守性进行统计分析。 
分析结果如表6所示。结果显示，HPV16L2蛋白的aa21-30在116个HPV型别中十分保守，其中，第22、23、26、27、28、29位氨基酸的同源性在80%以上；第24、25位氨基酸的差异相对较大，但同源性仍达到40%左右。这说明，14H6所识别的表位为保守表位，其在多个型别的HPV中是相对保守的区段，并因此构成了单抗14H6的广谱中和活性的基础。 
表6：抗体14H6所识别的表位的序列同源性分析 
Figure BDA00001742592300651
实施例6：以HPV16 L1蛋白为基础的、包含表位肽的重组载体蛋白的克隆设计以及相关表达载体的构建 
我们已证实，14H6所识别的表位（即，SEQ ID NO:31）为广谱中和表位，其在诱导机体产生广谱中和抗体方面具有重要作用。然而，由于该表位肽的序列长度太短（10aa），在直接用于免疫接种时，在体内极易被降解且免疫原性低，难以发挥诱导广谱中和抗体的作用，因此，我们通过将表位肽与各种载体蛋白融合来增强表位肽的免疫原性，并考察其在体内诱导广谱中和抗体的效力。 
为此目的，我们首先设计了包含上述表位（即，SEQ ID NO:31）的9条表位肽： 
(1)10肽，其为HPV16 L2的aa21-aa30，且命名为L2A（其氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示）； 
(2)12肽，其为HPV16 L2的aa20-aa31，且命名为L2B（其氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示）； 
(3)14肽，其为HPV16 L2的aa19-aa32，且命名为L2C（其氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示）； 
(4)16肽，其为HPV16 L2的aa18-aa33，且命名为L2D（其氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示）； 
(5)18肽，其为HPV16L2的aa17-aa34，且命名为L2E（其氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:45 所示）； 
(6)20肽，其为HPV16 L2的aa16-aa35，且命名为L2F（其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示）； 
(7)22肽，其为HPV16 L2的aa15-aa36，且命名为L2G（其氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示）； 
(8)26肽，其为HPV16 L2的aa13-aa38，且命名为L2I（其氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示）； 
(9)30肽，其为HPV16 L2的aa11-aa40，且命名为L2K（其氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，且示例性核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示）。 
此外，我们还选择了3种载体蛋白（HPV16 L1蛋白，乙肝病毒核心抗原，以及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段）来进行实验。 
在本实施例中，我们以HPV16L1蛋白和L2A-L2F为基础，设计了一系列重组蛋白。 
HPV L1蛋白能在体外自组装成病毒样颗粒(VLP)，具有良好的免疫原性，并且也是良好的蛋白载体。HPV16L1作为蛋白载体时，可使用2个插入位置。第一个插入位置为HPV16L1的aa127-128之间（即，目标多肽的N端与HPV16L1蛋白的aa 127的C端融合，且目标多肽的C端与HPV16L1蛋白的aa128的N端融合，下同）。根据所使用的表位肽(L2B，L2C，L2D，L2E和L2F)，将获得的重组蛋白分别命名为HPV16L1-DE-L2B，HPV16L1-DE-L2C，HPV16L1-DE-L2D，HPV16L1-DE-L2E和HPV16L1-DE-L2F。第二个插入位置为HPV16 L1蛋白的aa423-424之间。类似地，根据所使用的表位肽，将获得的重组蛋白分别命名为HPV16L1-α4-L2B至HPV16L1-α4-L2F等。图5A示意性地描述了这10个重组蛋白的设计。 
我们使用3轮PCR反应来构建这10个重组蛋白的编码基因，其中，所使用的初始模板为HPV16L1蛋白的编码序列（其核苷酸序列如SEQID NO:54所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示），各轮PCR反应的所使用的模板、引物和退火条件如表7所示，且PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟，25个循环的（94℃变性50秒，在指定的温度退火指定的时间，72℃延伸50秒），最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的序列列于表8。 
将扩增的DNA片段终产物与商售的pMD 18-T载体（TAKARA公司生产）连接，经NdeI/SalI酶切鉴定得到含有目的片段的阳性克隆。然后，将获得的酶切片段与经NdeI/SalI酶切的pTO-T7原核表达载体（罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57）相连接，并转入ER2566细菌；提取质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定得到含有目的基因片段的阳性表达克隆。 
在上海博亚生物工程公司，利用T7引物，测得pTO-T7质粒中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：56、58、60、62、64、66、68、70、72、74，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：57、59、61、63、65、67、69、71、73、75（分别与表7中的10个融合蛋白一一对应）。构建好的表达质粒分别命名为pTO-T7-HPV16-DE-L2-B至F和pTO-T7-HPV16-α4-L2-B至F。 
取1μL的各个上述表达质粒（0.15mg/ml）分别转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566，将菌涂布于含卡那霉素（终浓度100mg/ml，下同）的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃250rpm下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-80℃保存。 
表7：用于构建图5A所示的10个重组蛋白的PCR反应条件 
Figure BDA00001742592300681
表8：用于构建图5A所示的10个重组蛋白的引物序列(SEQ ID NO:132-153) 
Figure BDA00001742592300691
实施例7：实施例6构建的重组蛋白的表达与纯化 
实施例6构建的重组蛋白的表达 
从-80℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右，再转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入I PTG至终浓度0.4mM，在低温条件下即24℃250rpm下振荡诱导8个小时。 
诱导后，以8000rpm离心5min收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪（Sonics VC ×750型超声破碎仪）处理菌 体（处理条件：工作时间30min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55%）。然后，菌体裂解液以13500rpm(30000g)离心15min，留取上清（即，破菌上清）。 
实施例6构建的重组蛋白与抗体14H6的反应性的WB检测 
通过蛋白质印迹分析来检测实施例6构建的重组蛋白与抗体14H6的反应性。简言之，对破菌上清样品进行10%SDS-PAGE分离，然后将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用5%脱脂奶室温封闭2h；之后，加入以1:1000稀释的单抗21A5（针对HPV16L1的特异线性单抗，由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程研究中心制备)或14H6（针对HPV16L2的线性单抗），于室温下反应1h，并在反应后，用TNT溶液（8.765g NaCl、1.21g Tris Base和0.5ml Tween-20，加去离子水至1L，调pH为8.0）洗膜3次，每次10min；然后，加入缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠抗体（1:5000稀释，KPL产品），于室温下反应1h，并在反应后，再次用TNT洗膜3次，每次10min；然后，用NBT(硝基蓝四唑)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)底物进行显色。WB检测结果如图6所示。 
结果显示，实施例6所构建的重组蛋白均能与单抗21A5反应；并且，实施例6所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
实施例6所构建的重组蛋白的色谱纯化 
仪器系统：GE Healthcare公司（原Amershan Pharmacia公司）生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。 
层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow（GE Healthcare公司）、CHT-II(Bio-RAD公司)、Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)。 
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT 
20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。 
样品：上述方法获得的重组蛋白（即，破菌上清）。 
洗脱程序： 
(1)用SP Sepharose 4 Fast Flow对样品进行阳离子交换纯化：400mM NaCl洗脱杂蛋白，800mM NaCl洗脱目的蛋白，收集800mM NaCl洗脱级分； 
(2)对前一步的洗脱级分进行CHT Ⅱ（羟基磷灰石色谱）纯化：将前一步骤获得的洗脱级分中的NaCl浓度稀释至0.5M，然后500mMNaC l洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的蛋白，收集1000mM NaCl洗脱级分；和 
(3)对前一步的洗脱级分进行HIC（疏水相互作用色谱）纯化：1000mM NaCl洗脱杂蛋白，200mM NaCl洗脱目的蛋白，收集200mM NaCl洗脱级分。 
取最终的洗脱级分150μL，加入30μL 6×Loading Buffer，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图7。结果显示，经过上述纯化步骤后，所获得的10种重组蛋白的纯度均大于95％。 
实施例8：重组蛋白的颗粒组装与形态学检测 
重组蛋白的颗粒组装 
采用透析（小量）来进行颗粒组装。简言之，取2ml实施例7所得的纯度大于95％的重组蛋白，针对2L复性缓冲液（50mM PB（磷酸钠缓冲液）pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl）进行充分透析交换；然后，针对2L储存缓冲液（20mM PB（磷酸钠缓冲液）pH6.5，0.5M NaCl）进行充分透析交换。 
颗粒组装后的重组蛋白的形态学检测 
对颗粒组装后的重组蛋白进行透射电镜观察。使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。将颗粒组装后的重组蛋白用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上，进行 观察。电镜观察的结果示于图8。 
结果显示，以HPV16L1-DE为蛋白载体所构建的5个重组蛋白均能形成均一的直径约为50nm的颗粒；以HPV16L1-α4为蛋白载体所构建的5个重组蛋白中，HPV16L1-α4-L2B可形成直径为20nm的颗粒，HPV16L1-α4-L2C可形成直径为40nm的松散颗粒，而HPV16L1-α4-L2D，HPV16L1-α4-L2E和HPV16L1-α4-L2F均可形成直径约5nm的小壳粒。 
实施例9：重组蛋白与抗体14H6的反应性的EL I SA检测 
通过ELISA来检测实施例7所获得的重组蛋白与抗体14H6的反应性。简言之，用磷酸盐缓冲液（20mM磷酸缓冲液，pH7.4，300mM氯化钠）稀释各待测蛋白至终浓度3ng/μl，然后在96孔板上进行包被（包被体积100μl，于37℃进行2h）。在37℃下封闭2h后，抽干，加入本实验室制备的单抗14H6、8A9（特异于HPV16L1蛋白）或PD1（特异于HPV16L1蛋白）的梯度稀释液（以10μg/ml为初始浓度，10倍倍比连续稀释11个梯度），并于37℃下反应30mi n；洗板，然后加入HRP标记的抗鼠IgG二抗（KPL产品），并于37℃下反应30min；洗板，于37℃显色15min。最后，用显示ELI SA结合的最大抗体稀释倍数（即，抗体对待测蛋白的抗体滴度）来反应抗体与待测蛋白的反应性。检测结果如图9所示。结果显示，所获得的各重组蛋白对单抗PD1和8A9的反应性与HPV16L1蛋白相当；并且，各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16C50L2相当。 
实施例10：重组蛋白颗粒的免疫原性的评价 
免疫血清的抗体滴度的ELISA检测 
用实施例8所获得的重组蛋白颗粒免疫小鼠，然后通过ELI SA来检测小鼠血清的抗体滴度，以评价重组蛋白颗粒的免疫原性。 
将各重组蛋白、HPV16 VLP和HPV16 C50 L2分别吸附于氢氧化铝佐剂上。免疫用动物为4周龄普通级小鼠（购自上海斯莱康实验动物 有限公司），并且根据不同的抗原将小鼠分为12组，每组3只。进行2次独立的实验，免疫剂量分别为5μg和0.5μg。免疫程序为：0周时初次免疫；2和4周时各加强一次。免疫方式为腹腔注射。免疫所使用的抗原（即，蛋白）与剂量如表9所示。 
表9：重组蛋白的免疫方案 
Figure BDA00001742592300731
ELISA检测显示，采取上述免疫程序时，血清中的抗体滴度及中和滴度在第8周达到最大值，此后抗体滴度逐渐下降。因此，在初次免疫后第8周，抽取眼球静脉血，分离血清，并通过ELISA检测血清针对HPV16 C50 L2的抗体滴度。 
简言之，用HPV16 C50 L2以300ng/孔包被96孔板，然后添加第8周的免疫血清的梯度稀释液（以1:1000稀释的血清作为起始浓度，进行连续梯度稀释），并检测二者的ELISA结合强度。用显示ELISA结合的最大血清稀释度表示血清对HPV16 L2蛋白的抗体滴度。 
ELISA的检测结果示于图10中。结果显示，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的血清针对HPV16 L2蛋白的抗体滴度均在105左右，与用HPV16 C50 L2蛋白单独免疫后的结果相当。这表明，图5A所构建的重组蛋白与HPV16 C50 L2蛋白的免疫原性相当。 
免疫血清的中和滴度的检测 
如实施例2所述，用HPV假病毒-细胞中和模型检测第8周的血清（5μg）针对HPV16、18、45、11、58假病毒的中和滴度。检测结果如图11所示。结果表明，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的免疫血清不仅能中和HPV16的假病毒（即，包含针对HPV16假病毒的中和抗体），而且对HPV11、18、45和58假病毒具有交叉中和作用。其中，各免疫血清针对HPV16假病毒的中和滴度均在103左右，而针对HPV45，HPV58和HPV11的中和滴度在30-1000的范围内。这表明，用图5A所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。因此，特别有利地，本发明所构建的重组蛋白可以用于制备抗多个型别的HPV的广谱疫苗。 
实施例11：以乙肝病毒核心抗原为基础的、包含表位肽的重组载体蛋白的克隆设计以及相关表达载体的构建 
在本实施例中，我们以乙肝病毒核心抗原(简称为HBcore)和L2A-L2F为基础，设计了一系列重组蛋白。 
乙肝病毒核心抗原能在体外自组装形成VLP，是一种良好的载体蛋白。研究已显示，HBcore的MIR区（即HBcore的aa79-81）位于VLP的表面，可用于替换成期望的多肽并增强该多肽的免疫原性。 
因此，我们将HBcore的编码序列克隆入pTO-T7载体中，然后将编码HBcore的MIR区（即HBcore的aa79-81）的核苷酸序列缺失，并在缺失两端各引入一个连接体，并且在2个连接体之间设计BamHI/EcoR I酶切位点。由此，我们在pTO-T7载体中插入了经改造的蛋白：HBcore-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示，且氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示，并且其示意性结构如下：(HBcore aa1-78)－Linker-(BamH I/EcoR I酶切位点)-Linker-(HBcore aa82-149)。将该载体命名为pTO-T7-HBcore载体，用于后续实验。 
通过退火PCR来扩增表位肽L2A-L2F的编码基因。其中，退火PCR的反应条件如表10所示；并且，用于退火PCR的引物的核苷酸序列如 表11所示。其中，在用于退火PCR的引物两端引入相应的酶切位点：BamH I（上游引物）和EcoR I（下游引物），以便于在后续步骤中，将PCR产物克隆入pTO-T7-HBcore载体。另外，由于L2E（18肽）和L2F（20肽）的编码基因的核苷酸序列太长，因此，在其引物5'端引入保护碱基：TTTG。 
在退火PCR后，将扩增的目的基因片段经由BamH I/EcoR I酶切位点连接入pTO-T7-HBcore载体，并转入ER2566细菌；然后，提取质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定得到含有目的重组蛋白基因片段的阳性表达克隆。在上海博亚生物工程公司，利用T7引物，测得pTO-T7质粒中插入的重组蛋白的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：78、80、82、84、86、88，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：79、81、83、85、87、89（分别与图5B中所构建的6个重组蛋白一一对应）。构建好的质粒分别命名为pTO-T7-HBcore-L2A至F。HBcore-L2A至F这6个重组蛋白的设计示意性地描述于图5B中。 
表10：用于扩增L2A-L2F的编码基因的退火PCR的反应条件 
Figure BDA00001742592300751
表11：用于退火PCR的引物的核苷酸序列 
Figure BDA00001742592300761
取1μL的各个上述表达质粒（0.15mg/ml）分别转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566，将菌涂布于含卡那霉素（终浓度100mg/ml，下同）的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃250rpm下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-80℃保存。 
实施例12：实施例11构建的重组蛋白的表达与纯化 
实施例11构建的重组蛋白的表达 
从-80℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右，再转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入I PTG至终浓度0.4mM，在37℃250rpm下振荡诱导8个小时。 
诱导后，以8000rpm离心5min收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪（Sonics VCX750型超声破碎仪）处理菌体（处理条件：工作时间30min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55%）。 然后，菌体裂解液以13500rpm(30000g)离心15min，留取上清（即，破菌上清）。 
实施例11构建的重组蛋白的纯化 
由于HBcore为耐热蛋白，因此采用热沉淀对重组蛋白HBcore-L2A至F进行初纯化。简言之，65℃热处理破菌上清，离心，留取上清。然后，对上清进行饱和硫酸铵沉淀，并再次离心，留取沉淀。之后，将沉淀复溶于1×PBS中，获得经纯化的重组蛋白HBcore-L2A至F。对获得的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图12（上图框）所示。SDS-PAGE检测结果显示，重组蛋白HBcore-L2A至F的纯度在80%以上。 
经纯化的重组蛋白与抗体14H6的反应性的WB检测 
通过蛋白质印迹分析来检测上述经纯化的重组蛋白(HBcore-L2A至F)与抗体14H6的反应性。简言之，对上述经纯化的重组蛋白进行10%SDS-PAGE分离，然后将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用5%脱脂奶室温封闭2h；之后，加入以1:1000稀释的单抗14H6（针对HPV16 L2的线性单抗），于室温下反应1h，并在反应后，用TNT溶液（8.765g NaCl、1.21g Tris Base和0.5ml Tween-20，加去离子水至1L，调pH为8.0）洗膜3次，每次10min；然后，加入缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠抗体（1:5000稀释，KPL产品），于室温下反应1h，并在反应后，再次用TNT洗膜3次，每次10min；然后，用NBT(硝基蓝四唑)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)底物进行显色。WB检测的结果如图12（下图框）所示。结果显示，除HBcore-L2A外，图5B所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
实施例13：重组蛋白的形态学检测 
对实施例12所获得的经纯化的重组蛋白进行透射电镜观察。使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。将经纯化的重组蛋白用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网 上，进行观察。电镜观察的结果示于图13。结果显示，所构建的6个重组蛋白均能形成均一的直径约为40nm的病毒样颗粒。 
实施例14：重组蛋白与抗体14H6的反应性的ELISA检测 
通过ELISA来检测实施例12所获得的重组蛋白与抗体14H6的反应性。简言之，用磷酸盐缓冲液（20mM磷酸缓冲液，pH7.4，300mM氯化钠）稀释各待测蛋白至终浓度3ng/μl，然后在96孔板上进行包被（包被体积100μl，于37℃进行2h）。在37℃下封闭2h后，抽干，加入本实验室制备的单抗14H6的梯度稀释液（以10μg/ml为初始浓度，10倍倍比连续稀释11个梯度），并于37℃下反应30mi n；洗板，然后加入HRP标记的抗鼠IgG二抗（KPL产品），并于37℃下反应30min；洗板，于37℃显色15min。最后，用显示ELISA结合的最大抗体稀释倍数（即，抗体对待测蛋白的抗体滴度）来反应抗体与待测蛋白的反应性。检测结果如图14所示。结果显示，所获得的各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16 C50 L2相当。 
实施例15：重组蛋白颗粒的免疫原性的评价 
免疫血清的抗体滴度的ELISA检测 
用HBcore-L2A至F重组蛋白颗粒免疫小鼠，然后通过ELISA来检测小鼠血清的抗体滴度，以评价重组蛋白颗粒的免疫原性。 
将各重组蛋白、HBcore和HPV16 C50 L2分别吸附于氢氧化铝佐剂上。免疫用动物为4周龄普通级小鼠（购自上海斯莱康实验动物有限公司），并且根据不同的抗原将小鼠分为8组，每组3只。进行2次独立的实验，免疫剂量分别为5μg和0.5μg。免疫程序为：0周时初次免疫；2和4周时各加强一次。免疫方式为腹腔注射。免疫所使用的抗原（即，蛋白）与剂量如表12所示。 
表12：重组蛋白的免疫方案 
Figure BDA00001742592300781
Figure BDA00001742592300791
ELISA检测显示，采取上述免疫程序时，血清中的抗体滴度及中和滴度在第8周达到最大值，此后抗体滴度逐渐下降。因此，在初次免疫后第8周，抽取眼球静脉血，分离血清，并通过ELISA检测血清针对HPV16 C50 L2的抗体滴度。 
简言之，用HPV16 C50 L2以300ng/孔包被96孔板，然后添加第8周的免疫血清的梯度稀释液（以1:1000稀释的血清作为起始浓度，进行连续梯度稀释），并检测二者的ELISA结合强度。用显示ELISA结合的最大血清稀释度表示血清对HPV16 L2蛋白的抗体滴度。 
ELISA的检测结果示于图15中。结果显示，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的血清针对HPV16 L2蛋白的抗体滴度均在105左右，与用HPV16 C50 L2蛋白单独免疫后的结果相当。这表明，图5B所构建的重组蛋白与HPV16 C50 L2蛋白的免疫原性相当。 
免疫血清的中和滴度的检测 
如实施例2所述，用HPV假病毒-细胞中和模型检测第8周的血清（5μg）针对HPV16、18假病毒的中和滴度。检测结果如图16所示。检测结果表明，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的血清不仅能中和HPV16的假病毒，而且对HPV18假病毒具有一定的交叉中和作用(所获得的血清对这2种假病毒具有相似的中和滴度)。这表明，用图5B所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。因此，特别有利地，本发明所构建的重组蛋白可以用于制备抗多个型别的HPV的广谱疫苗。 
实施例16：以CRM197或其片段为基础的、包含表位肽的重组载 体蛋白的克隆设计以及相关表达载体的构建 
在本实施例中，我们以CRM197或其片段和6种表位肽（L2A，L2C，L2E，L2G，L2I，L2K）为基础，设计了一系列重组蛋白。 
CRM197其核苷酸序列如SEQ ID NO:90所示，由535个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示。CRM197的一个示例性片段是CRM389，其由CRM197的N端390个氨基酸组成，且核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:104和105所示。CRM197的另一个示例性片段是CRM A，其由CRM197的N端191个氨基酸组成，且核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:118和119所示。 
如图5C所示，将6种表位肽（L2A，L2C，L2E，L2G，L2I，L2K）分别经由连接体连接至CRM197，CRM389或CRM A的C末端，其中所述连接体的序列为GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO:166）。连接体的主要功能是，促进其所连接的2个肽相对独立地折叠，以获得较高的生物学活性。所获得的重组蛋白分别命名为CRM197-L2A/C/E/G/I/K；CRM389-L2A/C/E/G/I/K；和CRMA-L2A/C/E/G/I/K。 
将各重组蛋白的编码序列分别连接入pTO-T7原核表达载体（罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57）中，并转入ER2566细菌；提取质粒，经酶切鉴定得到含有目的基因片段的阳性表达克隆。 
在上海博亚生物工程公司，利用T7引物，测得pTO-T7质粒中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：92、94、96、98、100、102、106、108、110、112、114、116、120、122、124、126、128、130，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：93、95、97、99、101、103、107、109、111、113、115、117、121、123、125、127、129、131（分别与图5C中所构建的18个重组蛋白一一对应）。 
取1μL的各个上述表达质粒（0.15mg/ml）分别转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566，将菌涂布于含卡那霉素（终浓度100mg/ml，下同）的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃250rpm下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-80℃ 保存。 
实施例17：实施例16构建的重组蛋白的表达与纯化 
所构建的重组蛋白的表达
从-80℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右，再转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入I PTG至终浓度0.4mM，在37℃250rpm下振荡诱导8个小时。 
所构建的重组蛋白的纯化
诱导后，以8000rpm离心5min收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪（Sonics VCX750型超声破碎仪）处理菌体（处理条件：工作时间15min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55%）。然后，菌体裂解液以12000rpm，4℃离心5min（下同），弃上清保留沉淀（即包涵体）。用等体积2%Triton-100洗涤获得的沉淀，振荡30min，离心弃上清；再用Buffer I（20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，5mM EDTA）重悬沉淀，振荡30min，离心弃上清；然后用含2M尿素的Buffer I重悬沉淀，37℃振荡30min，离心得上清和沉淀；保留上清，并继续用等体积含4M尿素的Buffer I重悬沉淀，37℃振荡30min，以12000rpm，4℃离心15min得上清和沉淀；保留上清（即，4M尿素溶解上清），并继续用等体积含8M尿素的Buffer I重悬沉淀，37℃振荡30min，离心并保留上清（即，8M尿素溶解上清）。 
对获得的各种级分进行SDS-PAGE分析。结果表明，重组蛋白均表达于包涵体中，并且经过包涵体洗涤步骤后，大部分重组蛋白可溶解于含4M尿素的Buffer I中。用100倍样品体积的PBS（包含10mM pH7.45的磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl）对4M尿素溶解上清进行充分的透析交换，然后将样品用0.22μm滤器除菌过滤并保存于4℃。对最 终获得的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果示于图17（上图框）。结果显示，复性至PBS溶液中的重组蛋白的纯度在80%以上。 
经纯化的重组蛋白与抗体14H6的反应性的WB检测 
通过蛋白质印迹分析来检测上述经纯化的重组蛋白与抗体14H6的反应性。简言之，对上述经纯化的重组蛋白进行12%SDS-PAGE分离，然后将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用5%脱脂奶室温封闭2h；之后，加入以1:1000稀释的单抗14H6（针对HPV16L2的线性单抗），于室温下反应1h，并在反应后，用TNT溶液（8.765gNaCl、1.21g Tris Base和0.5ml Tween-20，加去离子水至1L，调pH为8.0）洗膜3次，每次10min；然后，加入缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠抗体（1:5000稀释，KPL产品），于室温下反应1h，并在反应后，再次用TNT洗膜3次，每次10min；然后，用NBT(硝基蓝四唑)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)底物进行显色。WB检测的结果如图17（下图框）所示。结果显示，除了CRM197-L2A、CRM389-L2A和CRMA-L2A外，图5C所构建的重组蛋白均能与单抗14H6反应。 
实施例18：重组蛋白与抗体14H6的反应性的ELISA检测 
通过ELISA来检测实施例17所获得的重组蛋白与抗体14H6的反应性。简言之，用磷酸盐缓冲液（20mM磷酸缓冲液，pH7.4，300mM氯化钠）稀释各待测蛋白至终浓度3ng/μl，然后在96孔板上进行包被（包被体积100μl，于37℃进行2h）。在37℃下封闭2h后，抽干，加入本实验室制备的单抗14H6的梯度稀释液（以10μg/ml为初始浓度，10倍倍比连续稀释11个梯度），并于37℃下反应30mi n；洗板，然后加入HRP标记的抗鼠IgG二抗（KPL产品），并于37℃下反应30min；洗板，于37℃显色15min。最后，用显示ELISA结合的最大抗体稀释倍数（即，抗体对待测蛋白的抗体滴度）来反应抗体与待测蛋白的反应性。检测结果如图18所示。结果显示，所获得的各重组蛋白对单抗14H6的反应性与HPV16 C50 L2相当。 
实施例19：重组蛋白颗粒的免疫原性的评价 
免疫血清的抗体滴度的ELISA检测 
用实施例17所获得的重组蛋白免疫小鼠，然后通过ELISA来检测小鼠血清的抗体滴度，以评价重组蛋白颗粒的免疫原性。 
将各重组蛋白、CRM197和HPV16 C50 L2分别吸附于氢氧化铝佐剂上。免疫用动物为4周龄普通级小鼠（购自上海斯莱康实验动物有限公司），并且根据不同的抗原将小鼠分为20组，每组3只。进行2次独立的实验，免疫剂量分别为5μg和0.5μg。免疫程序为：0周时初次免疫；2和4周时各加强一次。免疫方式为腹腔注射。免疫所使用的抗原（即，蛋白）与剂量如表15所示。 
表15：重组蛋白的免疫方案 
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ELISA检测显示，采取上述免疫程序时，血清中的抗体滴度及中和滴度在第8周达到最大值，此后抗体滴度逐渐下降。因此，在初次免疫后第8周，抽取眼球静脉血，分离血清，并通过ELISA检测血清 针对HPV16 C50 L2的抗体滴度。 
简言之，用HPV16 C50 L2以300ng/孔包被96孔板，然后添加第8周的免疫血清的梯度稀释液（以1:1000稀释的血清作为起始浓度，进行连续梯度稀释），并检测二者的ELISA结合强度。用显示ELISA结合的最大血清稀释度表示血清对HPV16 L2蛋白的抗体滴度。 
ELI SA的检测结果示于图19中。结果显示，用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所产生的血清针对HPV16 L2蛋白的抗体滴度在104－106之间，与用HPV16 C50 L2蛋白单独免疫后的结果相当。这表明，图5C所构建的重组蛋白与HPV16 C50 L2蛋白的免疫原性相当。 
免疫血清的中和滴度的检测 
如实施例2所述，用HPV假病毒-细胞中和模型检测第8周的血清（5μg）针对HPV16、11、18、45、52、59假病毒的中和滴度。检测结果如图20所示。检测结果表明，用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后，所获得的血清不仅能中和HPV16的假病毒，而且对HPV11、18、45、52、59假病毒具有交叉中和作用。这表明，用图5C所构建的重组蛋白免疫小鼠后，小鼠获得了广谱的中和保护作用。因此，特别有利地，本发明所构建的重组蛋白可以用于制备抗多个型别的HPV的广谱疫苗。 
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。 
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Claims (38)

1.能够特异性结合HPV L2蛋白并且能够中和多个型别的HPV的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包括：
包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5-7的CDR的重链可变区(VH)；和/或
包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR的轻链可变区(VL)。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括，如SEQ ID NO:2所示的VH，和/或，如SEQ ID NO:4所示的VL。
3.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体（例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
4.权利要求1-3任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合HPV的L2蛋白。
5.权利要求1-4任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述L2蛋白是HPV 16的L2蛋白。
6.权利要求1-5任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
7.权利要求1-6任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是中和抗体，其能够中和至少3种，例如至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种型别的HPV；例如，所述的单克隆抗体能够中和下列11种型别的HPV：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。
8.权利要求1-7任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株14H6产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株14H6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。
9.能够特异性结合HPV L2蛋白并且能够中和多个型别的HPV的单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够阻断所述L2蛋白与由杂交瘤细胞株14H6产生的单克隆抗体的结合的至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%，所述杂交瘤细胞株14H6保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。
10.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中所述抗体重链可变区包含，氨基酸序列为SEQ ID NO:5-7的CDR；
例如，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
例如，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
11.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体轻链可变区包含，氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR；
例如，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
例如，所述核酸分子具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
12.一种载体，其包含权利要求10和/或11的分离的核酸分子。
13.一种宿主细胞，其包含权利要求10和/或11的分离的核酸分子，或权利要求12的载体。
14.制备权利要求1-8任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求13的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
15.杂交瘤细胞株14H6，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201268。
16.试剂盒，其包括权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。
17.用于检测HPV L2蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
例如，所述方法还包括，使用携带可检测的标记（例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶）的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HPV L2蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HPV。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
20.用于中和样品中HPV的毒力的方法，其包括，将包含HPV的样品与权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。
21.权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中HPV的毒力。
22.权利要求1-9任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）。
23.权利要求20的方法或权利要求21或22的用途，其中，所述HPV选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。
24.一种分离的表位肽，其由HPV L2蛋白的10－30个（例如，30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，11个或10个）连续氨基酸残基组成，且包含HPV L2蛋白的第21－30位氨基酸残基。
25.权利要求24的表位肽，其中，所述HPV L2蛋白是HPV16 L2蛋白。
26.权利要求24或25的表位肽，其中，所述HPV L2蛋白的第21－30位氨基酸残基如SEQ ID NO:31所示。
27.权利要求24-26任一项的表位肽，其中所述表位肽具有选自SEQ ID NO:13、36、38、40、42、44、46、48、50和52所示的氨基酸序列。
28.一种重组蛋白，其包含权利要求24-27任一项的分离的表位肽和载体蛋白，并且不是天然存在的蛋白或其片段，其中，
例如，所述表位肽通过连接体（刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3）与载体蛋白相连接；
例如，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HPV L1蛋白和HBV核心抗原。
29.权利要求28的重组蛋白，其中，
例如，所述载体蛋白是CRM197蛋白或其片段，并且所述表位肽，任选地通过连接体，连接至CRM197蛋白或其片段的N末端或C末端；
例如，所述CRM197蛋白的片段是CRM389或CRMA，其序列分别如SEQ ID NO:105或119所示；
例如，所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示；
例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：93、95、97、99、101、103、107、109、111、113、115、117、121、123、125、127、129和131。
30.权利要求28的重组蛋白，其中，
例如，所述载体蛋白是HPV L1蛋白，并且将所述表位肽插入至所述L1蛋白的第127-128位氨基酸残基之间，或第423-424位氨基酸残基之间；
例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：57、59、61、63、65、67、69、71、73和75。
31.权利要求28的重组蛋白，其中，
例如，所述载体蛋白是HBV核心抗原，并且用所述表位肽替换所述HBV核心抗原的第79-81位氨基酸；优选地，所述表位肽与HBV核心抗原通过连接体连接；
例如，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：79、81、83、85、87和89。
32.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求24-27任一项的表位肽或权利要求28－31任一项的重组蛋白的核苷酸序列。
33.一种载体，其包含权利要求32的分离的核酸分子。
34.一种宿主细胞，其包含权利要求32的分离的核酸分子或权利要求33的载体。
35.制备权利要求28－31任一项的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求34的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述重组蛋白。
36.一种药物组合物，其包含权利要求28－31任一项的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
37.权利要求28－31任一项的重组蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病（例如宫颈癌）。
38.权利要求28－31任一项的重组蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者体内诱发能够中和至少2个型别的HPV的中和抗体。
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