WO2022250107A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株および変異株に対するヒト中和抗体およびその抗原結合性断片 - Google Patents

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りゅう 三浦
幸人 石坂
美華子 上野
賢志 忽那
翔 齋藤
基 木村
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株式会社イーベック
国立研究開発法人国立国際医療研究センター
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Definitions

  • the present invention generally binds to the spike (S) protein of Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (hereinafter referred to as "SARS-CoV-2”), including mutant strains, of SARS - Monoclonal antibodies that neutralize the biological activity of CoV-2, and antigen-binding fragments thereof, and their use as medicaments.
  • SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • COVID-19 severe acute respiratory disease novel coronavirus infection
  • Clinical features of COVID-19 include fever, dry cough, and malaise, which can lead to respiratory failure and death.
  • the World Health Organization has reported 228,394,572 confirmed cases and 4,690,186 deaths, indicating that the epidemic is still spreading and the emergence and transmission of variants is under control globally. do not have.
  • SARS-CoV-2 has a typical betacoronavirus morphology. Similar to other coronaviruses, spherical virus particles with a diameter of about 100 nm are surrounded by a lipid bilayer envelope (outer membrane), and crown-like projections (spikes) are present on the envelope surface.
  • the spike is composed of a spike (S) protein trimer and binds to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor (receptor) on the human cell membrane (Non-Patent Documents 1 and 2). After binding, the spike is activated by host cell proteases (Non-Patent Documents 3, 4), the viral envelope and the host cell membrane fuse, and the virus enters the cytoplasm.
  • the S protein can suppress infection by inhibiting the binding of the spike and ACE2, which is the first step in virus infection of cells, and is therefore a target for antibody therapy including vaccines (Non-Patent Document 5). ).
  • SARS-CoV-2 has a positive single-stranded RNA of approximately 30,000 bases as its genome. RNA is known to be less stable and more susceptible to mutation than DNA. SARS-CoV-2 also has multiple mutations in the S protein that may affect increased transmissibility, virulence, altered antigenicity, and the efficacy of acquired immunity in infected and vaccinated individuals. An epidemic of novel mutant strains has already occurred.
  • Alpha strain B.1.1.7: UK There are beta strains (B.1.351: termed “South African type”), and gamma strains (P1: termed “Brazilian type”). WHO has designated these mutant viruses as VOCs (Variant of Concern). Especially for the alpha strain, epidemiological data suggested the possibility of an increase in the secondary infection rate and an increase in the risk of death.
  • the next threat to the alpha strain was the mutated strain, which caused a rapid increase in the number of infected people in India.
  • the same mutant virus has three subgroups (B.1.617.1, B.1.617.2, B.1.617.3), of which WHO calls B.1.617.2 a "delta strain". and designated as VOC on May 11, 2021.
  • the Delta strain has spread to more than 132 countries and regions, is highly contagious, and has become the global mainstream. For example, in the United Kingdom, which was hit by a second wave of infection due to the alpha strain, the spread of vaccination has succeeded in converging the alpha strain, but it has been announced that the main cause of the current infection has been replaced by the delta strain.
  • a feature of the B.1.617 mutant strain is a mutation called "L452R". It shows that the 452nd amino acid of the S protein, which the virus uses to invade cells, was mutated from L (leucine) to R (arginine). According to a CDC (American Center for Disease Control and Prevention) report (Non-Patent Document 6), it was confirmed that the delta strain is more than twice as contagious as the conventional new corona.
  • the present inventors aim to develop novel antibody drugs that correspond to wild type and / or mutant strains of SARS-CoV-2, from B lymphocytes isolated from the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected recoverers attempted to obtain antibodies for As a result, we discovered a human-derived monoclonal antibody that binds to the SARS-CoV-2 S protein and neutralizes the viral activity of SARS-CoV-2 (wild type and/or mutant strain). In addition, the same antibody has a suppressive effect on immune escape mutants of Regeneron's cocktail antibodies (mAb10933 and mAb10987 (hereinafter referred to as "Reg10933+Reg10987”)) (WO 2021/045836 A1). showed that.
  • the present disclosure includes the following [1] to [17].
  • [1] A monoclonal antibody against the SARS-CoV-2 coronavirus that binds to the spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus and neutralizes its viral activity, and an antigen-binding fragment thereof.
  • [2] a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a heavy chain containing amino acids having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1] or [2] above, comprising a light chain comprising identical amino acids.
  • variable region of the heavy chain is (a) a heavy chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2; (b) a heavy chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3; and (c) a heavy chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; contains (ii) the variable region of the light chain is (a) a light chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6; (b) a light chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a light chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [3] above, containing [5] a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or a heavy chain containing amino acids having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 The antibody or antigen-binding fragment thereof of [1] or [5] above, which comprises a light chain comprising identical amino acids.
  • variable region of the heavy chain is (a) a heavy chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) a heavy chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a heavy chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; contains (ii) the variable region of the light chain is (a) a light chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (b) a light chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and (c) a light chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1], [5], or [6] above, containing [8] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [7] above, which has neutralizing activity against either or both of
  • [10] Treatment or prevention of SARS-CoV-2 coronavirus infection comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [9] above and a pharmaceutically acceptable carrier
  • a pharmaceutical composition for [11] (1) Use of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10] above in the treatment or prevention of SARS-CoV-2 coronavirus infection, (2) Use of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10] above in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of SARS-CoV-2 coronavirus infection, or (3) A method for treating or preventing SARS-CoV-2 coronavirus infection, wherein the subject or patient in need thereof is subjected to any one of [1] to [9] above.
  • a method comprising administering an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition, use, or method of [12] above, wherein the mutant strain is an alpha strain or a delta strain.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [9] above, or any of these nucleic acid molecules and highly stringent An isolated nucleic acid molecule that hybridizes under suitable conditions.
  • [16] An isolated host cell into which the recombinant expression vector of [15] above has been introduced.
  • the monoclonal antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that neutralize the biological activity of SARS-CoV-2 according to the present invention bind to the S protein of wild-type and/or mutant SARS-CoV-2. , loses (neutralizes) its biological activity and is therefore useful in the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection.
  • a fully human monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof against the S protein of SARS-CoV-2 according to the present invention has no or at least reduced immunogenicity in humans compared to an antibody that is not a fully human antibody,
  • the lack of, or at least a reduced immune response compared to antibodies that are not fully human antibodies has the advantage of causing fewer side effects when administered to a human subject or patient.
  • FIG. 2 is a flow chart showing the procedure for producing an anti-SARS-CoV-2S antibody according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the nucleotide and corresponding amino acid sequences of the genes encoding the heavy and light chains of anti-SARS-CoV-2 S antibodies (EV053272 and EV053273) according to the present invention.
  • amino acids are represented by single-letter codes. Dark shaded amino acid sequences are signal sequences, light shaded amino acid sequences are variable region amino acid sequences, and underlined amino acid sequences are CDRs (Kabat).
  • FIG. 1 shows the nucleotide and corresponding amino acid sequences of the genes encoding the heavy and light chains of anti-SARS-CoV-2 S antibodies (EV053272 and EV053273) according to the present invention.
  • amino acids are represented by single-letter codes. Dark shaded amino acid sequences are signal sequences, light shaded amino acid sequences are variable region amino acid sequences, and underlined amino acid sequences are CDR
  • FIG. 2 shows the nucleotide and corresponding amino acid sequences of the genes encoding the heavy and light chains of anti-SARS-CoV-2 S antibodies (EV053272 and EV053273) according to the present invention.
  • amino acids are represented by single-letter codes. Dark shaded amino acid sequences are signal sequences, light shaded amino acid sequences are variable region amino acid sequences, and underlined amino acid sequences are CDRs (Kabat).
  • FIG. 10 shows the results of analysis by ELISA of the binding activity of anti-SARS-CoV-2 S antibodies to spike protein trimers.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the neutralizing activity of anti-SARS-CoV-2 S antibodies against a wild-type strain and two types of alpha and delta strains.
  • Fig. 10 shows the results of neutralizing activity measurement of anti-SARS-CoV-2 antibody (EV053273) against Regeneron antibody cocktail (Reg10933 + Reg10987) escape mutants.
  • Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • the genome of SARS-CoV-2 consists of 30 kb of single-stranded RNA, and its gene shares 80% homology with the SARS coronavirus (SARS-CoV) that caused a pandemic in 2002-2003. (Zhou P. et al., Nature, 579:270-273, 2020 (Non-Patent Document 2)).
  • Coronavirus particles are composed of three proteins: the spike (S) protein, the envelope (E) protein, and the membrane (M) protein.
  • the crown-like projections (spikes) on the virus surface which are morphological features, are formed by S protein trimers.
  • SARS-CoV-2 spike (S) protein SARS-CoV-2 S protein
  • S protein is one of the glycoproteins present on the virus surface and consists of 1181 amino acid residues (GenBank Protein Accesion #QHD43416.1). Strains of SARS-CoV-2 with the S protein identified in this GenBank Protein Accesion # QHD43416.1 are referred to herein as "wild strains.”
  • the S protein contains two functional domains: 'S1', which contains the N-terminal domain (NTD) and receptor binding domain (RBD), and 'S2', which mediates the fusion of the virus and host cell membranes. . Spike first binds to host cell ACE2 via the RBD.
  • the ACE2-bound spike is activated by being cleaved by two host cell proteases (TMPRSS2 and furin), fuses the viral membrane with the cell membrane, and delivers viral genes into the cell. After that, it forms a structure surrounded by a lipid bilayer membrane in the cell and replicates the viral gene (Non-Patent Document 4). Therefore, infection can be suppressed by inhibiting the binding of spike and ACE2, which is an early stage of infection.
  • TMPRSS2 and furin two host cell proteases
  • a "mutant strain” is defined as a strain of SARS-CoV-2 that has a mutation in the S protein of wild-type SARS-CoV-2.
  • mutant strains include the aforementioned three alpha, beta, and gamma strains with the N501Y mutation, plus a new mutant named "B.1.617” of the Indo type.
  • Indo-type mutated viruses include three subgroups (B.1.617.1, B.1.617.2, B.1.617.3) and according to WHO, B.1.617.1 and B. 1.617.2 have been named “kappa strain” and "delta strain” respectively.
  • a characteristic of the indo type is that the 452nd amino acid located within the RBD of the spike protein has a mutation called L452R, which is a change from L (leucine) to R (arginine).
  • the mutation called E484Q, the Delta strain has a mutation called T478K, respectively.
  • SARS-CoV-2 includes its wild-type and mutant types unless otherwise specified.
  • immune evasion refers to the inability of the host, particularly the human immune system, to respond to an infectious agent. , in other words, the inability of the host's immune system to recognize and eliminate pathogens such as viruses.
  • the SARS-CoV-2 coronavirus mutant acquires the ability to escape from the action of neutralizing antibodies due to mutations in the amino acid sequence of its spike protein,
  • a mutation that causes a virus to acquire such an antibody escape ability is called an "immune escape mutation” or simply an “escape mutation”
  • a virus mutant that has such a mutation is an "immune escape mutant” or simply an “escape mutation”. called stocks.
  • Antibodies that bind to the S protein of SARS-CoV-2 binds to any site of the S protein of SARS-CoV-2
  • the epitope can be, for example, a linear epitope, a discontinuous sequence epitope, a conformational epitope, or a fragment of the S protein, etc., and is not limited to the RBD.
  • anti-SARS-CoV-2 antibody As used herein, the terms “anti-SARS-CoV-2 antibody”, “antibody capable of neutralizing SARS-CoV-2”, “anti-SARS-CoV-2 S protein antibody”, “SARS-CoV-2 S
  • antibody that binds to a protein is intended to refer to an antibody that inhibits the biological activity of
  • the spike which plays an important role in the early stages of infection, is formed by the S protein trimer.
  • the S protein trimer was used as an antigen in the examples described later. Two specific examples of antibodies that bind to the S protein of SARS-CoV-2 according to the present invention described in Examples below are referred to herein as "EV053272" and "EV053273.”
  • Antibody refers to four polypeptide chains, namely two heavy (H) chains and two light (L) chains, which are interconnected by disulfide bonds. It is intended to refer to an immunoglobulin molecule consisting of conjugates. Monoclonal antibodies in the present invention also consist of immunoglobulin molecules each containing two heavy (H) and light (L) chains. Each H chain consists of an H chain variable region (sometimes referred to as “HCVR” or “VH”) and an H chain constant region (the H chain constant region consists of three domains, “CH1”, “CH2 ”, and “CH3” (generic name: CH)).
  • Each L chain consists of an L chain variable region (sometimes referred to as “LCVR” or “VL”) and an L chain constant region (the L chain constant region consists of one domain and is sometimes referred to as “C”).
  • L chain variable region sometimes referred to as “LCVR” or “VL”
  • L chain constant region consists of one domain and is sometimes referred to as “C”.
  • the region up to the beginning of each constant region also called constant region or constant region
  • VH and VL are important in that they are involved in antibody binding specificity. Because antibodies interact with target antigens primarily through the amino acid residues of VH and VL, the amino acid sequences within the variable regions vary more between individual antibodies than sequences outside of the variable regions.
  • VH and VL can be further subdivided into regions called framework regions (FR) that are more constant among different antibodies and hypervariable regions called complementarity determining regions (CDR).
  • FR framework regions
  • CDR complementarity determining regions
  • VH and VL are composed of three CDRs and four FRs, respectively, which are arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the order FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • binding to the SARS-CoV-2 S protein and exhibiting the biological activity of SARS-CoV-2 can be performed by techniques well known in the art.
  • Neutralizing human monoclonal antibodies, monoclonal antibodies (including chimeric antibodies and humanized antibodies), or antigen-binding fragments thereof can be obtained. These antibodies are within the scope of the invention.
  • Antibody "antigen-binding fragments" refers to one or more antibodies that have the ability to bind to an antigen (the S protein of SARS-CoV-2). refers to a fragment (e.g., VH) of The fragment also includes a peptide having the minimum amino acid sequence that binds to the antigen.
  • binding moieties included within the term "antigen-binding fragment" of an antibody include (i) Fab fragments, (ii) F(ab')2 fragments, (iii) Fd fragments consisting of the VH and CH1 domains, (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of the antibody, (v) a dAb fragment consisting of the VH domain (Ward ES. et al., Nature, 341:544-546, 1989) (vi) binds (vii) bispecific antibodies, and (viii) multispecific antibodies.
  • antibody when the term "antibody” is used without particular distinction, it includes not only full-length antibodies but also such "antigen-binding fragments.”
  • Isotype Heavy chains are divided into ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, depending on the difference in the constant region.
  • immunoglobulins are formed.
  • IgG has four subclasses, IgG1 to IgG4. On the other hand, it is divided into ⁇ chain and ⁇ chain depending on the difference in the light chain constant region.
  • the classes (subclasses) of the antibodies “EV053272" and "EV053273” shown in Examples below are IgG1 ( ⁇ ) and IgG1 ( ⁇ ), respectively.
  • the present invention in one aspect, binds to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (“SARS-CoV-2”) and provides the “biological activity” (or “viral activity” or “infectivity” of SARS-CoV-2). ) (these terms are used interchangeably herein), or at least suppress infection, or a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof (hereinafter referred to as the "antibody of the present invention”). )I will provide a.
  • the antibodies of the present invention bind to the S protein of either or both wild-type and mutant SARS-CoV-2 and are capable of neutralizing the biological activity of said protein or antigen binding thereof. It is a sex fragment. More particularly, the antibodies of the present invention are antibodies or antigen-binding fragments thereof that can bind to the S protein of both wild-type and mutant SARS-CoV-2 and neutralize the biological activity of the protein. be.
  • Table 1 shows the correspondence between human-derived anti-SARS-CoV-2 antibodies and antigen-binding fragments thereof according to one embodiment of the antibody of the present invention and the SEQ ID NOs of their amino acid sequences in the sequence listing.
  • the monoclonal antibody EV053272 according to one embodiment of the antibody of the present invention comprises a heavy chain (HC) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:9 and a light chain (LC) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
  • the light chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.
  • CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2
  • CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:3
  • CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:4.
  • CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:6
  • CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7
  • CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8.
  • the monoclonal antibody EV053273 according to another embodiment of the antibody of the present invention comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:19 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:20.
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:11
  • the light chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:15.
  • CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Antibodies of the present invention include not only those containing amino acid sequences such as the specific heavy chains or light chains shown in SEQ ID NOS: 1 to 20, their variable regions, or their CDRs, but also those against these amino acid sequences. Included are anti-SARS-CoV-2 antibodies that comprise substantially identical amino acid sequences and are capable of binding to the SARS-CoV-2 S protein and neutralizing the biological activity of SARS-CoV-2.
  • the term "substantially identical” means that one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of the antibody of the present invention, or any two or more of these When the combination is made, it means that there is a deletion, substitution, insertion, or addition of one or more amino acid residues at any position in the same sequence and one or more amino acid sequences. Two or more of deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • amino acid sequences substantially identical to the amino acid sequences of specific heavy or light chains, variable regions thereof, or CDRs thereof shown in each of SEQ ID NOS: 1-20 are represented by SEQ ID NOS: 1-20. 20, at least, for example, about 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more It includes amino acid sequences that have an identity (or sequence identity) greater than.
  • EV053272 and EV053273 For example, about 20% or less of the number of amino acid residues in the amino acid sequences of EV053272 and EV053273 above (or about 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3 %, 2%, or 1% or less) of amino acid residues deleted, substituted, inserted, added, or a combination of any two or more of these mutations. of non-limiting monoclonal antibodies (EV053272 and EV053273) (i.e., binding to the SARS-CoV-2 S protein and inhibiting the viral activity of either the SARS-CoV-2 wild type and/or mutant strains).
  • Antibodies of the present invention may include antibodies whose amino acid sequences other than the CDRs are also derived from humans. can be included in the antibody of 1 to several (specifically, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9) in the framework region (FR) as necessary , 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1) amino acid residue deletion, substitution, or insertion , additions, or combinations of any two or more of these.
  • amino acids that make up proteins in nature can be grouped according to the properties of their side chains.
  • amino acids with similar biochemical properties include aromatic amino acids (tyrosine, phenylalanine, tryptophan), Basic amino acids (lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), neutral amino acids (serine, threonine, asparagine, glutamine), amino acids with hydrocarbon chains (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline) , and others (glycine, methionine, cysteine). Substitutions of amino acid residues between amino acid residues having side chains with similar biochemical properties can be made while retaining the biological activity of the original protein.
  • amino acid residues included in the same group of the following groupings can be substituted for each other (while retaining the biological activity of the original protein).
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, thre
  • the present disclosure provides monoclonal antibodies and antigen-binding fragments thereof characterized by the constitutions of [1] to [9] below.
  • [1] A monoclonal antibody against the SARS-CoV-2 coronavirus that binds to the spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus and neutralizes its viral activity, and an antigen-binding fragment thereof.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 80% (or at least 90% or 95%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; [1] above, which contains a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 or an amino acid sequence having at least 80% (or at least 90% or 95%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 or an antigen-binding fragment thereof.
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or an amino acid having at least 80% (or at least 90% or 95%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence or sequence of SEQ ID NO: 10
  • variable region of the heavy chain is (a) a heavy chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:2; (b) a heavy chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3; and (c) a heavy chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; contains (ii) the variable region of the light chain is (a) a light chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6; (b) a light chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a light chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [3] above, containing [5] a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having at least 80% (or at least 90% or
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid having at least 80% (or at least 90% or 95%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence or sequence of SEQ ID NO: 20
  • variable region of the heavy chain is (a) a heavy chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) a heavy chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a heavy chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; contains (ii) the variable region of the light chain is (a) a light chain CDR1 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (b) a light chain CDR2 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and (c) a light chain CDR3 amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1], [5], or [6] above, containing [8] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [7] above, which has neutralizing activity against either or both of
  • the invention also provides nucleic acid molecules that encode the amino acid sequences of the antibodies of the invention.
  • isolated nucleic acid molecules are provided that encode the amino acid sequences of monoclonal antibodies and antigen-binding fragments thereof characterized by each of [1] to [9] above.
  • an anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof capable of binding to the S protein of SARS-CoV-2 and neutralizing its biological activity (i.e., typically Isolated nucleic acids (molecules) (polynucleotides) that have high identity with the amino acid sequences of monoclonal antibodies and antigen-binding fragments thereof characterized by the constructions of [1] to [9] above
  • a nucleic acid ie, an isolated nucleic acid selected from those that hybridize to the nucleic acid under highly stringent conditions.
  • nucleic acid is DNA or RNA, typically DNA.
  • Highly stringent conditions are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 50°C. (See, e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), especially Section 11.45 “Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”). Under these conditions, it can be expected that polynucleotides (eg, DNA) having higher identity can be efficiently obtained as the temperature is raised. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect the stringency of hybridization, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency in .
  • Nucleic acids that hybridize under highly stringent conditions include nucleic acids encoding amino acid sequences, for example, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% Nucleic acids having greater than 94%, greater than 95%, greater than 96%, greater than 97%, greater than 98%, or greater than 99% identity are included.
  • nucleotide sequences can be determined using the identity search algorithm described above (Karlin S and Altschu SF, PNAS, 87:2264-2268, 1990; PNAS, 90:5873-5877, 1993). .
  • the present invention relates to a vector incorporating the nucleic acid molecule, a host cell into which the vector has been introduced, and a method for producing an antibody using these vectors.
  • Antibodies of the present invention can also be produced as recombinant human antibodies using known methods (Boulianne GL et al., Nature, 312:643-646, 1984, Jones PT et al., Nature, 321:522-525 , 1986, etc.).
  • the antibody of the present invention can be produced by culturing host cells introduced with the vector of the present invention and purifying the produced antibody from the culture supernatant. More specifically, cDNAs encoding VH and VL are inserted into animal cell expression vectors containing genes encoding human antibody CH and/or human antibody CL produced from the same cell or different human cells, respectively. It can be produced by constructing a human antibody expression vector and introducing it into animal cells for expression.
  • the vector that incorporates the nucleic acid encoding the VH or VL of the antibody of the present invention is not necessarily limited, but it is possible to use a vector that is commonly used for expression of protein genes and the like and that is particularly suitable for expression of antibody genes or a vector for high expression. can.
  • Non-limiting examples include vectors containing FE promoters and/or CMV enhancers.
  • expression vectors incorporating nucleic acids encoding VH or VL are usually prepared and co-transfected into host cells, but they may be incorporated into a single expression vector.
  • the host cells into which the expression vector is introduced are not necessarily limited, but include cells that are commonly used for expression of protein genes, etc., and are particularly suitable for expression of antibody genes. Examples thereof include bacteria (E. coli, etc.), actinomycetes, yeast, insect cells (SF9, etc.), and mammalian cells (COS-1, CHO, myeloma cells, etc.).
  • recombinant animal cell lines that stably produce the antibodies at high levels, such as CHO cell lines, are generally used.
  • Known methods can be used for generating such recombinant cell lines, cloning, gene amplification and screening for high expression (for example, Omasa T., J. Biosci. Bioeng., 94: 600-605 , 2002, etc.).
  • the above recombinant antibodies include antigen-binding fragments such as Fab (Fragment of antigen binding), Fab', F(ab') 2 , antibody
  • An active fragment bound by a linker or the like for example, single chain antibody (single chain Fv: scFv) or disulfide stabilized antibody (disulfide stabilized Fv: dsFv)
  • a peptide containing an active antibody fragment for example, a peptide containing CDRs
  • These can be produced by known methods such as treating the antibody of the present invention with an appropriate proteolytic enzyme or genetic recombination techniques.
  • Antibody purification can be performed using known purification means such as salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, or affinity chromatography.
  • scFv single chain Fragment of variable region
  • Antibodies can also be expressed as phage fusion proteins to obtain specific antibodies.
  • This technology is highly evaluated as a humanized antibody production technology that can avoid immunity and can replace the cell fusion method.
  • specific antibodies or antigen-binding fragments thereof produced with reference to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-4, 6-8, 12-14, and 16-18 in the present specification are also within the scope of the invention.
  • an antibody obtained by applying Potellegent technology, which significantly improves the ADCC activity of an antibody by modifying the sugar chain portion of the antibody, to the antibody of the present invention (Niwa R et al., Clin. Cancer Res. ., 10:6248-6255, 2004) and an antibody obtained by applying Complement technology that improves CDC activity to the antibody of the present invention (Kanda Y. et al., Glycobiology, 17:104 -118, 2007) are also within the scope of the present invention.
  • antibodies obtained by modifying the amino acid sequence of the constant region portion of the antibody to modify ADCC activity WO2007/039682 and WO2007/100083
  • CDC activity WO2007/011041 and WO2011/091078
  • an antibody or an antigen-binding fragment thereof obtained by applying a technique for partial substitution of the Fc region (see WO2006/071877) to add protease resistance ability to the antibody and enable oral administration, It is within the scope of the present invention.
  • mice, rabbits, and goats are usually used to obtain polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. Since it has a sequence characteristic of animal species, if it is administered to humans as it is, it may be recognized as a foreign substance by the human immune system and cause a human anti-animal antibody response (that is, the production of antibodies against antibodies).
  • the anti-SARS-CoV-2 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention can be obtained from antibody-producing cells derived from the blood of a person who has recovered from SARS-CoV-2 infection, and is a fully human antibody.
  • This fully human antibody even when administered to the human body as an antibody drug, does not have immunogenicity, or at least has reduced immunogenicity compared to an antibody that is not a fully human antibody, and no immune response is observed, or It has at least a reduced advantage compared to antibodies that are not fully human antibodies.
  • compositions containing an antibody of the invention, use of an antibody of the invention as a medicament, use of an antibody of the invention for the manufacture of a medicament, and treatment or prevention comprising administering an antibody of the invention to a patient includes the use of the antibody of the present invention as a medicament.
  • pharmaceutical compositions for preventing or treating SARS-CoV-2 infection are provided comprising an antibody of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • use of the antibodies of the invention in treating or preventing SARS-CoV-2 coronavirus infection is provided.
  • use of the antibody of the invention in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of SARS-CoV-2 coronavirus infection is provided.
  • a method of treating or preventing SARS-CoV-2 coronavirus infection comprising administering an antibody of the invention to a subject or patient in need thereof.
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention binds to the S protein of SARS-CoV-2 and has a high neutralizing ability. It is useful as a prophylactic or therapeutic drug for
  • pharmaceutically acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coatings, isotonic and absorption delaying agents and the like that are physiologically compatible.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate-buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, etc., and combinations thereof.
  • the composition can contain pH adjusting agents and isotonic agents, such as sugars, polyalcohols such as mannitol and sorbitol, or sodium chloride.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can further contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting and emulsifying agents, preservatives, buffers and stabilizers, which enhance the preservation or effectiveness of the antibody or antibody portion. .
  • compositions include, for example, solutions (eg, injectable and infusible solutions), dispersions, suspensions, tablets, capsules, troches, pills, powders, liposomes, suppositories, liquids, semisolids, and the like. , including solid dosage forms.
  • Dosage forms may vary depending on the intended mode of administration and therapeutic application. Examples include those in the form of injectable or infusible solutions, such as compositions similar to those commonly used for passive immunization of humans with other antibodies.
  • the mode of administration can be parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, pulmonary nasal).
  • antibody can be administered by intravenous infusion or injection.
  • antibody can be administered by intramuscular or subcutaneous injection.
  • antibodies can be administered by inhalation or nasally.
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody and antigen-binding fragment thereof according to the present invention are isolated from the blood of SARS-CoV-2 infected recoverers through various steps, and cell clones producing the antibody are isolated, and the target antibody is obtained. It can be obtained by cloning the encoding DNA, followed by gene expression and antibody production.
  • FIG. 1 shows a flow chart of the steps for preparing the anti-SARS-CoV-2S antibody according to the present invention.
  • S protein B lymphocytes are separated from the blood of a person who has recovered from SARS-CoV-2 infection, and proliferation of the B lymphocytes is induced.
  • the method for inducing proliferation is known per se, and for example, a transformation method (Kozbor D. and Roder JC., Immunol Today, 4:72-9, 1983).
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody obtained as described above is a fully human antibody produced from B lymphocytes sensitized in the human body, it is possible to have an immune response to the antibody when administered to humans. It has the advantage of being less sensitive.
  • EB virus which has the activity of infecting B lymphocytes and inducing their proliferation.
  • the advantage of the EB virus method is that it can produce natural antibodies that are produced in the human body, and that antibodies can be obtained even from cells with a very low positive rate.
  • the antigen-binding property of an antibody or antibody composition can be evaluated by an ELISA method, a surface plasmon resonance (SPR) method, or the like.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the ability of the antibody to suppress the biological activity of the S protein of SARS-CoV-2 in vitro can be evaluated by receptor binding inhibition assays such as ELISA, neutralization assays, and the like.
  • a known method can be used to measure the binding activity between an antibody and the S protein of SARS-CoV-2.
  • ELISA using the S protein trimer as an antigen can be employed (see “5. Antigen binding evaluation” in Examples and Fig. 3).
  • the binding affinity to the S protein trimer or RBD can be measured using a protein interaction analyzer such as Biacore T200 (registered trademark).
  • the human anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has a binding affinity ( K value) of 1 ⁇ 10 to wild-type S protein and wild-type, alpha, and delta strain RBD. ⁇ 8 M or less, preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less. (See “6. Evaluation of Antigen Affinity" in Examples and Fig. 4)
  • neutralizing refers to antigens (SARS-CoV-2 ) by at least about 5-100%, 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100% %, or 80-100% reduction.
  • the in vitro neutralization ability of anti-SARS-CoV-2 antibodies can be evaluated using wild type and/or mutant strains of SARS-CoV-2 (e.g. alpha strain, delta strain).
  • wild strain used is JPN/TY/WK-521 strain
  • mutant strains such as JPN/QK002/2020 as alpha strain, JPN/TKYTK1734/2021 as delta strain, and TMPRSS2 in Vero E6 cells.
  • the neutralizing ability of the antibody can be evaluated ("7. Neutralizing Activity Evaluation” and FIG. 5).
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is about 200 ng for the wild type in the SARS-CoV-2 infectivity evaluation system using Vero cells. /mL or less, approximately 100 ng/mL or less, approximately 50 ng/mL or less, or approximately 10 ng/mL or less with 50% infection inhibitory activity (IC50).
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is a SARS-CoV-2 infectivity evaluation system using the Vero cells, and the mutant strain is about 200 ng / mL It has 50% infection inhibitory activity (IC50) at about 100 ng/mL or less, about 50 ng/mL or less, or about 10 ng/mL or less.
  • IC50 infection inhibitory activity
  • Non-limiting examples of the mutant strains described above include alpha and delta strains.
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is about 200 It has 50% infection inhibitory activity (IC50) at ng/mL or less, approximately 100 ng/mL or less, approximately 50 ng/mL or less, or approximately 10 ng/mL or less.
  • IC50 infection inhibitory activity
  • Non-limiting examples of the mutant strains described above include alpha and delta strains.
  • Fig. 1 shows the flowchart of the procedure for producing the anti-SARS-CoV-2 S antibody according to the present invention.
  • the cells in the neutralizing antibody-positive well are seeded on a cell microarray, and a slide glass on which the S protein trimer is immobilized or microbeads are used to identify single cells that produce the target antibody. did. 8)
  • the total-RNA of the antibody-producing cells in 5) and 7) above was reverse transcribed using an oligo-dT primer, and the resulting cDNA was used as a template to amplify the antibody gene by PCR.
  • the primers used for PCR were designed based on a database of cDNAs encoding human IgG antibody H and L chains.
  • a 5′-end primer and a 3′-end primer were designed to amplify the H chain from the translation initiation site to the constant region, and the L chain to amplify the full-length cDNA.
  • the obtained antibody gene encodes an anti-SARS-CoV-2 antibody
  • H chain and L chain genes were each inserted into an expression vector and simultaneously introduced into CHO-K1 cells. Gene transfer was performed using Lipofectamine LTX (Invitorgen) and plus reagent (Invitorgen) under the manufacturer's recommended conditions. Two days later, the culture supernatant was collected, and the antibody in the culture supernatant bound to the S protein of SARS-CoV-2 by ELISA using a multi-well plate with S protein trimer immobilized. did. For clones confirmed to bind to the S protein, the neutralizing activity was measured using the culture supernatant.
  • the obtained anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibody expression vector was introduced into ExpiCHO cells (Invitorgen), and the culture supernatant was collected. This culture supernatant was subjected to affinity purification using a Protein A column (Cytiva) to obtain a purified antibody. Gene introduction, culture, and purification were performed under the manufacturer's recommended conditions. After purification, antibody H chain (about 50 kDa) and antibody L chain (about 25 kDa) were confirmed by SDS-PAGE.
  • a purified antibody was used to confirm binding to the S protein trimer by ELISA.
  • the purified anti-SARS-CoV-2 antibody was prepared from 5 ⁇ g/mL in 8 steps of 5-fold dilution series.
  • a commercially available neutralizing antibody (ACRO Biosystems, SAD-S35) was used as a control antibody. The results obtained are shown in FIG.
  • the EC50 of EV053272 and EV053273 are 13 ng/mL and 145 ng/mL of the 20 ng/mL control antibody, respectively, and the binding activity is significantly higher.
  • Neutralizing activity was confirmed as an evaluation of the efficacy of the anti-SARS-CoV-2 antibody.
  • Neutralizing activity was assessed by antibody inhibition of SARS-CoV-2 infection against SARS-CoV-2 wild strain, two alpha strains, and delta strain.
  • Virus neutralization experiments using antibodies are in accordance with the COVID-19 serology test manual published by the National Institute of Infectious Diseases https://www.niid.go.jp/niid/images/pathol/pdf/COVID-19Serology_Ver1.pdf implemented.
  • Virus strain Wild strain JPN/TY/WK-521 strain
  • 2 alpha strains JPN/QK002/2020, alpha strain 1: Accession ID: EPI_ISL_768526, alpha strain 2: Accession ID from the National Institute of Infectious Diseases) : EPI_ISL_804007)
  • delta strain JPN/TKYTK1734/2021 strain.
  • Virus stocks were serially diluted using Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, 31985070) and added to 96-well plates. One dilution series was applied to eight wells as one set. After 3-4 days, the virus concentration at which half of the eight wells showed CPE (Cytopathertic effects) was calculated as the 50% infectious dose (TCID50, Median tissue culture infectious dose).
  • IC50 50% inhibitory concentration of the purified antibody was evaluated using a 96-well plate. That is, an antibody solution diluted with Opti-MEM to a final concentration of 250 ng/mL to 0.25 ng/mL was added to one column of a 96-well plate. Next, an equal amount of the virus solution prepared to have a final MOI of 0.03 was added to a 96-well plate, shaken and reacted at 37°C for 1 hour, and then added to the cell plate at 100 ⁇ L each.
  • the antibody of the present invention which has an IC50 value of about 10 ng/mL or less against at least the wild-type strain, has an IC50 value of 10-30 for monoclonal antibodies (LY-Cov555, Ab169) produced and clinically derived by Eli Lilly. ng/mL (Jones BE. Et al. bioRxiv. 2020 Oct 1; 2020.09.30.318972.doi: 10.1101/2020.09.30.318972.) and can be said to be equal to or better than it.
  • EV053272 and EV053273 have high neutralizing activity against alpha and delta strains as well.
  • Regeneron's antibodies, Reg10933 and Reg10987 are gene sequences described in WO 2021/045836 A1 (paragraph [000107] table ("Table of Exemplary Sequences") (see sequence information described in )), a full-length light chain gene and a heavy chain variable region gene were synthesized (GeneArt). After inserting the synthesized H chain and L chain genes into expression vectors, they were introduced into ExpiCHO cells (Invitrogen), and purified antibodies were obtained from the culture supernatant. Construction of the expression vector, gene introduction, and culture purification were performed according to the method described in 1-4 above.
  • the virus solution was diluted to a final 20-fold dilution, mixed with a 10-0.016 mg/mL antibody solution, added to new cultured cells, and three days later the virus solution was collected (second generation). After that, subculturing was repeated, and at the 16th generation, a virus that established infection in a 10 mg/mL antibody solution was obtained and used as an escape mutant strain of Regeneron's cocktail antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention that the 50% inhibitory concentration for virus neutralizing activity is low and that it is effective (exhibits neutralizing ability) in an extremely small amount are advantageous in use as a medicine (e.g., reduced burden on patients, reduced medical costs).
  • the monoclonal antibody of the present invention exhibits significantly superior effects in that it has neutralizing activity against multiple mutant strains including escape mutant strains of Regeneron's cocktail antibody.
  • the anti-SARS-CoV-2 antibody of the present invention is useful for applications in fields such as pharmaceutical compositions for preventing or treating diseases associated with SARS-CoV-2.

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Abstract

本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のスパイク(S)タンパク質に結合し、SARS-CoV-2を中和する新規なヒト由来のモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片、該抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供することを目的として、SARS-CoV-2コロナウイルスのSタンパク質に結合し、免疫逃避変異を含むそのウイルス活性を中和するSARS-CoV-2コロナウイルスに対するヒト由来モノクローナル抗体およびその抗原結合性断片、それらをコードする核酸、ならびに該抗体またはその抗原結合性断片を含むSARS-CoV-2コロナウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物を提供する。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株および変異株に対するヒト中和抗体およびその抗原結合性断片
　本発明は、概して、変異株を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）（以下、「SARS-CoV-2」と称する）のスパイク(S)タンパク質に結合し、SARS-CoV-2の生物活性を中和するモノクローナル抗体、およびその抗原結合性断片、ならびにその医薬としての使用に関する。
　2019年に中国武漢で最初に発生した新興コロナウイルスSARS-CoV-2は、重症急性呼吸器疾患新型コロナウイルス感染症（以下、「COVID-19」と称する）として「パンデミック」と呼ばれる世界的大流行を引き起こした。COVID-19の臨床的特徴には、発熱、空咳、倦怠感などがあり、呼吸不全を引き起こして死に至る可能性がある。2021年9月20日の時点で、世界保健機関は228,394,572の確定症例、4,690,186人の死亡を報告しており、未だ感染拡大は衰えることなく、変異株の出現・感染を世界的にコントロールできていない。
　SARS-CoV-2は、典型的なベータコロナウイルスの形態を有する。他のコロナウイルスと同様、直径約100 nmの球形ウイルス粒子は、脂質二重膜のエンベロープ（外膜）に包まれ、エンベロープ表面上には王冠様突起（スパイク）が存在する。
　スパイクはスパイク(S)タンパク質3量体で構成され、ヒト細胞膜のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体（レセプター）に結合する（非特許文献１、２）。結合後、スパイクは宿主細胞のプロテアーゼにより活性化され（非特許文献３、４）、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜が融合して、ウイルスが細胞質内に侵入する。つまり、ウイルスが細胞に感染する最初の段階であるスパイクとACE2との結合を阻害することで感染を抑制できるため、Sタンパク質はワクチンを含めた抗体治療の標的となっている（非特許文献５）。
　SARS-CoV-2は、約3万塩基のプラス一本鎖RNAをゲノムとして有している。RNAはDNAよりも安定性が低く、突然変異が生じやすいことが知られている。SARS-CoV-2においても、伝播性・病原性の増加、抗原性の変化や、感染した人やワクチン接種者が獲得した免疫の効果に影響を与える可能性のあるSタンパク質に変異を有する複数の新規変異株の流行が既に起こっている。
　SARS-CoV-2のSタンパク質に変異を有する複数の変異株として、感染性・伝播のしやすさに影響があるとされる「N501Y」変異を有するアルファ株（B.1.1.7：「イギリス型」と称される）、ベータ株（B.1.351：「南アフリカ型」と称される）、 ガンマ株（P1：「ブラジル型」と称される）がある。WHOはこれらの変異型ウイルスをVOC（Variant of Concern、注視すべき変異）に指定している。特にアルファ株については、2次感染率の増加や、死亡リスクの増加の可能性が疫学データから示唆された。
　アルファ株に続く脅威となったのがインドで感染者が急増した変異株である。同変異型ウイルスには、3種類のサブグループ（B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3）があり、WHOはこれらの中のB.1.617.2を「デルタ株」と命名し、2021年5月11日VOCに指定した。WHOの2021年7月20日付の発表によると、デルタ株は132以上の国や地域に拡大し、感染力が強く、世界的な主流となっている。例えば、アルファ株による感染第2波に襲われたイギリスではワクチン接種の広がりによりアルファ株の収束に成功しているが、現在の感染の主体はデルタ株に置き換わったと発表している。
　日本国内でも感染力の強いデルタ株にほぼ置き換わっている状況である。国立感染症研究所感染症疫学センターの解析(2021年8月23日時点)によると、SARS-CoV-2陽性の中でデルタ株変異のある割合は、関東で99%、関西で96%と推定されている。
　B.1.617変異株の特徴は「L452R」と呼ばれる変異である。ウイルスが細胞に侵入する際に使うSタンパクの452番目のアミノ酸が、L（ロイシン）からR（アルギニン）に変異したことを示す。CDC(アメリカ疾病予防管理センター）の報告（非特許文献６）によると、デルタ株は従来の新型コロナの2倍以上の伝染性があることが確認された。
　デルタ株出現の最大の問題は、アルファ株では「60%～70%」とされていた集団免疫を達成するための閾値が「85%」に上がったこととされる。加えて、ワクチンの効果には個人差がある可能性が指摘され、また、ワクチン接種ができない健康上の問題をかかえる人もいる。「ワクチン忌避」感情も存在するのが実情である。世界的に集団免疫を獲得することは不可能であり、新型コロナウイルスは世界のどこかで伝播・増殖し続ける可能性がある。
　実際、新たな変異株が出現している。2020年8月にペルーで初めて報告されたラムダ株と、2021年1月にコロンビアで初めて報告されたミュー株が9月30日現在、VOIに位置づけられている。いずれも南米諸国を中心に感染が広がっている。2021年11月24日に南アフリカで報告されたオミクロン株は現在日本も含め世界各国で猛威を振るっている。今後も局所的な感染拡大により、ウイルスの変異は持続的に発生する可能性が高い。
　このように、ワクチンだけでは感染を完全には抑えられない現状を踏まえ、変異株に対応しうる治療薬開発は必須である。治療薬として低分子経口薬の開発が進んでいるが、個々の薬剤への新たな薬剤耐性株の出現リスク、ターゲット以外のタンパクへの作用（特異性の問題）、長期安全性などが、現時点で懸念されるところである。一方、中和抗体は、その特異性、血中半減期の長さ、長期間の投与効果などの点で優位性を有し、治療薬として臨床の場ですでに効果を示している。しかしながら、今後の感染状況に対して最大のリスクと考えられるのが、中和抗体から逃避する能力を獲得した「免疫逃避変異」である。
Wu F. et al. Nature, 2020;Mar;579(7798):265-269 Zhou P. et al. Nature, 2020;Mar;579(7798):270-273 Hoffmann M. et al. Cell, 2020 Apr16;181(2):271-280.e8 Walls AC. et al. Cell, 2020 Apr16;181(2):281-292.e6 Wu Y. et al. Science, 2020 June 12;368(6496):1274-1278 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/delta-variant.html（最終閲覧日：2021年10月7日）
　このような状況下、SARS-CoV-2 Sタンパク質に結合し、SARS-CoV-2のウイルス活性を中和するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含む、SARS-CoV-2感染症を治療および／または予防するための新規の抗体医薬品であって、SARS-CoV-2の免疫逃避変異に対応できるものの開発が求められている。
　本発明者らは、SARS-CoV-2の野生株および／または変異株に対応する新規の抗体医薬品の開発を目的とし、SARS-CoV-2感染回復者の末梢血から分離したBリンパ球からの抗体取得を試みた。その結果、SARS-CoV-2 Sタンパク質に結合し、SARS-CoV-2（野生株および／または変異株）のウイルス活性を中和するヒト由来モノクローナル抗体を見出すに至った。加えて、同抗体はRegeneron社のカクテル抗体（mAb10933およびmAb10987（本明細書中以下で「Reg10933+Reg10987」と示す。））（WO 2021/045836 A1）の免疫逃避変異株に対しても抑制効果を示した。
　したがって、本開示は、以下の[１]から[１７]を含む。
［１］SARS-CoV-2コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合し、そのウイルス活性を中和するSARS-CoV-2コロナウイルスに対するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片。
［２］配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［３］配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
　配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
を含む、上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］（ｉ）重鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有する、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［５］配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［６］配列番号１９のアミノ酸配列または配列番号１９のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または配列番号２０のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
を含む、上記［１］または［５］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［７］（ｉ）重鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有する、上記［１］、［５］、または［６］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［８］上記［１］～［７］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、SARS-CoV-2野生株および変異株のいずれかまたはその両方に対する中和活性（IC50；感染を50%阻害する濃度）が、約10 ng/mL以下で、Sタンパク質3量体に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［９］上記［１］～［８］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、WO2021/045836においてmAb10933およびmAb10987でそれぞれ特定される抗体またはそれらの等価物を含むカクテル抗体の逃避変異株に対しても抑制効果を示す（または中和する活性を有する）抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物。
［１１］（１）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防における、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用、
　（２）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防のための医薬の製造における、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片の使用、または
　（３）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象または患者に上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む、方法。
[１２］上記SARS-CoV-2が変異株である、上記［１０］に記載の医薬組成物、または上記［１１］に記載の使用もしくは方法。
［１３］上記変異株がアルファ株またはデルタ株である、上記［１２］に記載の医薬組成物、使用、または方法。
［１４］上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、またはこれらの核酸分子のいずれかと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸分子。
［１５］上記［１４］に記載の単離された核酸分子を組み込んだ組換え発現ベクター。
［１６］上記［１５］に記載の組換え発現ベクターが導入された単離された宿主細胞。
［１７］上記［１６］に記載の宿主細胞を培養し、上記培養された宿主細胞から抗体を精製することを含む、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
　本発明に係るSARS-CoV-2の生物活性を中和するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片は、野生株および変異株のいずれかまたはその両方のSARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、その生物活性を喪失（中和）させることから、SARS-CoV-2感染症の予防または治療において有用である。本発明に係るSARS-CoV-2のSタンパク質に対する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトに対する免疫原性がないか、または完全ヒト抗体でない抗体と比較して少なくとも低減されており、免疫反応は見られないか、または完全ヒト抗体でない抗体と比較して少なくとも低減されていることから、ヒトである対象または患者に投与した際に副作用が少ないという利点がある。
本発明に係る抗SARS-CoV-2 S抗体の作製手順をフローチャートで表した図である。 本発明に係る抗SARS-CoV-2 S抗体（EV053272およびEV053273）の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す図である。図中、アミノ酸は一文字表記で表されている。濃い影を付したアミノ酸配列はシグナル配列、薄い影を付したアミノ酸配列は可変領域のアミノ酸配列、下線を付したアミノ酸配列はCDR(Kabat)をそれぞれ示す。 本発明に係る抗SARS-CoV-2 S抗体（EV053272およびEV053273）の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す図である。図中、アミノ酸は一文字表記で表されている。濃い影を付したアミノ酸配列はシグナル配列、薄い影を付したアミノ酸配列は可変領域のアミノ酸配列、下線を付したアミノ酸配列はCDR(Kabat)をそれぞれ示す。 抗SARS-CoV-2 S抗体のスパイクタンパク質3量体への結合活性をELISA法により解析した結果を示す図である。 抗SARS-CoV-2 S抗体の野生型スパイク3量体および野生株、アルファ株、デルタ株レセプター結合部位（RBD）への親和性をBiacore T-200を使用して解析した結果を示す図である。 抗SARS-CoV-2 S抗体の野生株ならびに2種のアルファ株およびデルタ株に対する中和活性測定の結果を示す図である。 抗SARS-CoV-2 抗体（EV053273）のRegeneron抗体カクテル（Reg10933　+　Reg10987）逃避変異株に対する中和活性測定の結果を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は専ら本発明の原理を理解することを容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限定されるものではない。当業者が本明細書の開示及び当該分野の技術常識に基づいて以下に示す本発明の実施形態の各要素を適宜当業者に自明な等価物に置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれることが理解されるであろう。本発明の説明のために以下において引用する各文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
　1．用語の説明
　本明細書において、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、特に断らない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質と核酸化学の技術に関連して用いられる命名法は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されているものである。
　１）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）
　「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2」（「SARS-CoV-2」と略す。）は、コロナウイルス科の一種で、ベータコロナウイルス属に属するウイルスである。SARS-CoV-2のゲノムは30 kbの1本鎖RNAからなり、その遺伝子は2002年から2003年に世界的な流行が起こったSARSコロナウイルス（SARS-CoV）と80%の相同性を有する（Zhou P. et al., Nature, 579:270-273, 2020（非特許文献２））。コロナウイルス粒子はスパイク(S)タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、および膜(M)タンパク質の３つのタンパク質で構成されている。形態学的特徴であるウイルス表面の王冠様突起（スパイク）はSタンパク質3量体により形成される。
　２）SARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質
　「SARS-CoV-2 Sタンパク質」は、ウイルス表面に存在する糖タンパク質の1つであり、1181個のアミノ酸残基から構成されている（GenBank Protein Accesion # QHD43416.1）。本明細書中、このGenBank Protein Accesion # QHD43416.1で特定されるSタンパク質を有するSARS-CoV-2の株を「野生株」と呼ぶ。Sタンパク質は、N末ドメイン（NTD）、およびレセプター結合部位（recepter binding domain; RBD）を含む「S1」と、ウイルスと宿主細胞の膜の融合を仲介する「S2」の2つの機能ドメインを含む。スパイクは、まず、RBDを介して宿主細胞のACE2に結合する。ACE2に結合したスパイクは宿主細胞の2種のプロテアーゼ（TMPRSS2、フリン）により開裂を受けて活性化し、ウイルス膜を細胞膜と融合させてウイルス遺伝子を細胞内に送り込む。その後、細胞内で脂質二重膜に包まれた構造を形成し、ウイルスの遺伝子を複製する（非特許文献４）。したがって、感染の初期段階であるスパイクとACE2との結合を阻害することで感染を抑制しうる。
　本明細書中、「変異株」は、野生型のSARS-CoV-2のSタンパク質に変異を有するSARS-CoV-2の株として定義される。変異株の非限定的な例には、前述のN501Y変異を有するアルファ株、ベータ株、およびガンマ株の三種に加えて、インド型の「B.1.617」と命名された新しい変異株が含まれる。インド型の変異型ウイルスには、3種類のサブグループ（B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3）が含まれ、WHOによれば、B.1.617.1およびB.1.617.2が、それぞれ「カッパ株」および「デルタ株」と命名されている。インド型の特徴は、スパイクタンパク質のRBD内に位置する452番目のアミノ酸がL（ロイシン）からR（アルギニン）変化したL452Rと呼ばれる変異を有することであり、カッパ株はこの変異に加えRBD内にE484Qと呼ばれる変異、デルタ株はT478Kと呼ばれる変異を、それぞれ有する。
　本明細書中、単に「SARS-CoV-2」という場合、特に限定しない限り、その野生型および変異型を含む。
　本明細書中、「免疫逃避」、「免疫回避」、「抗体逃避」、「抗体回避」等の用語は互換的に使用され、宿主、特に人間の免疫系が感染性病原体に応答できなくなること、換言すれば、宿主の免疫系がウイルスなどの病原体を認識して排除することができなくなることを意味するために用いられる。本明細書中では、特に、SARS-CoV-2コロナウイルスの変異株が、そのスパイクタンパク質のアミノ酸配列に生じた変異のために中和抗体の作用から逃避する能力を獲得することを意味し、そのような抗体逃避能力をウイルスに獲得させる変異を「免疫逃避変異」または単に「逃避変異」と呼び、そしてそのような変異を有するウイルスの変異株を「免疫逃避変異株」または単に「逃避変異株」と呼ぶ。
　３）SARS-CoV-2のSタンパク質に結合する抗体
　本明細書中、用語「SARS-CoV-2のSタンパク質に結合する抗体」は、SARS-CoV-2のSタンパク質の任意の部位に結合する抗体を意味し、エピトープは、例えば、線状エピトープ、不連続配列エピトープ、立体構造的エピトープ、またはSタンパク質の断片等であり得、RBDに限定されるものではない。本明細書中で、用語「抗SARS-CoV-2抗体」、「SARS-CoV-2を中和し得る抗体」、「抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体」「SARS-CoV-2のSタンパク質に結合する抗体」、「SARS-CoV-2の生物活性を中和し得る抗体」等は、互換的に使用され、SARS-CoV-2のSタンパク質に結合することによってSARS-CoV-2の生物活性を阻害する抗体を指すものとする。前述のように、感染の初期段階において重要な役割を有するスパイクはSタンパク質3量体により形成される。なお、後述の実施例では、Sタンパク質3量体を抗原として使用した。なお、後述の実施例に記載する本発明に係るSARS-CoV-2のSタンパク質に結合する抗体の具体例2種を、本明細書では「EV053272」および「EV053273」と称する。
　４）抗体
　本明細書で使用される「抗体」という用語は、4本のポリペプチド鎖、すなわち、2本の重（H）鎖および2本の軽（L）鎖であってジスルフィド結合によって相互結合されたものからなる免疫グロブリン分子を指すものとする。本発明におけるモノクローナル抗体も、各々2本の重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）を含む免疫グロブリン分子からなる。各H鎖は、H鎖可変部領域（「HCVR」または「VH」と称す場合がある）とH鎖不変部領域（H鎖不変部領域は3つのドメインからなり、それぞれ「CH1」、「CH2」、「CH3」と称す場合がある（総称：CH））からなる。各L鎖は、L鎖可変部領域（「LCVR」または「VL」と称す場合がある）とL鎖不変部領域（L鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「C」と称す場合がある）からなり、それぞれの不変部領域（不変領域、または定常領域とも呼ぶ）の始まる前までを可変部領域（または可変領域）と呼ぶ。
　特に、VHおよびVLは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はVHおよびVLのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するため、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。さらに、VHおよびVLにおいても、各種抗体間でより一定に保たれたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域と相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。VHおよびVLは、それぞれ3つのCDRおよび4つのFRからなり、これらはFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
　可変部領域を示すアミノ酸配列や、CDRのアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、SARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、SARS-CoV-2の生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体も含む）、またはそれらの抗原結合性断片を得ることができる。これらの抗体は、本発明の範囲内にある。
　５）抗体の「抗原結合性断片」（または単に「抗体断片」）
　本明細書で使用される抗体の「抗原結合性断片」（または単に「抗体断片」）という用語は、抗原（SARS-CoV-2のSタンパク質）に結合する能力を有する1つまたは複数の抗体のフラグメント（例えばVH）を指す。なお、そのフラグメントには抗原に結合する最小限のアミノ酸配列を有するペプチドも含むものとする。抗体の「抗原結合性断片」という用語内に含まれる結合部分の例としては、(i) Fab断片、(ii) F(ab')2断片、(iii) VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iv) 抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v) VHドメインからなるdAb断片（Ward ES. et al., Nature, 341:544-546, 1989）(vi)結合するのに十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域（CDR）、(vii) 二重特異性抗体、および(viii) 多特異性抗体などがあげられる。なお、本明細書において、特に区別せずに単に「抗体」という場合、完全長の抗体のみならず、このような「抗原結合性断片」も含むものとする。
　６）アイソタイプ
　重鎖は定常領域の違いにより、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖に分けられ、この違いによりそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、IgEの5種類のクラス（アイソタイプ）の免疫グロブリンが形成される。さらにヒトの場合、IgGにはIgG1～IgG4の4つのサブクラスが存在する。一方、軽鎖定常領域の違いにより、κ鎖、λ鎖に分けられる。なお、後述の実施例で示す抗体「EV053272」および「EV053273」のクラス（サブクラス）は、それぞれ、IgG1（κ）およびIgG1（λ）である。
　２．本発明に係る抗体またはその抗原結合性断片
　本発明は、一つの局面において、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（「SARS-CoV-2」）に結合し、SARS-CoV-2の「生物活性」（または「ウイルス活性」もしくは「感染能」）（これらの用語は本明細書中、互換的に使用される。）を中和、または少なくとも感染を抑制し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片（以下、「本発明の抗体」という。）を提供する。特定的には、本発明の抗体は、野生株および変異株のいずれかまたはその両方のSARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、該タンパク質の生物活性を中和し得る抗体またはその抗原結合性断片である。より特定的には、本発明の抗体は、野生株および変異株の両方のSARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、該タンパク質の生物活性を中和し得る抗体またはその抗原結合性断片である。
　これら抗体の作製方法としては、公知の方法を用いることができる(Riechmann L. et al., Nature, 332：323-327, 1988）。そのような方法の非限定的な例として、本発明においては、後述の実施例で示す手順を含む、完全ヒト抗体の作製方法を用いることができる。
　本発明の抗体の一実施形態に係るヒト由来抗SARS-CoV-2抗体、およびその抗原結合性断片と、それらの配列表におけるアミノ酸配列の配列番号との対応関係を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の抗体の一実施形態に係るモノクローナル抗体EV053272は、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖（HC)および配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖（LC)を含む。
　EV053272の重鎖および軽鎖のそれぞれにおいて、重鎖可変部領域は配列番号１のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変部領域は配列番号５のアミノ酸配列からなる。
　EV053272の重鎖可変部領域において、CDR1は配列番号２のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号３のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号４のアミノ酸配列からなる。
　EV053272の軽鎖可変部領域において、CDR1は配列番号６のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号７のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号８のアミノ酸配列からなる。
　本発明の抗体の別の実施形態に係るモノクローナル抗体EV053273は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
　EV053273の重鎖および軽鎖のそれぞれにおいて、重鎖可変部領域は配列番号１１のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変部領域は配列番号１５のアミノ酸配列からなる。
　EV053273の重鎖可変部領域において、CDR1は配列番号１２のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号１３のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
　EV053273の軽鎖可変部領域において、CDR1は配列番号１６のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号１７のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号１８のアミノ酸配列からなる。
　本発明の抗体としては、上記の配列番号１～２０で示される特定の重鎖または軽鎖、その可変領域、あるいはそのCDR等のアミノ酸配列を含むもののみならず、これらのアミノ酸配列に対して実質的に同一なアミノ酸配列を含み、かつSARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、SARS-CoV-2の生物活性を中和し得る抗SARS-CoV-2抗体が含まれる。ここで、「実質的に同一」という用語は、本発明の抗体のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、付加の存在を意味し、またはこれらのいずれか2つ以上の組み合わせがされた時は、同一配列中の任意かつ１または複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　典型的には、配列番号１～２０の各々で示される特定の重鎖または軽鎖、その可変領域、あるいはそのCDR等のアミノ酸配列に対して実質的に同一なアミノ酸配列は、配列番号１～２０の各々に対して、少なくとも、例えば、約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える同一性（または配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
　例えば、上記のEV053272およびEV053273のアミノ酸配列中のアミノ酸残基数の約20%以下（または、約15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%以下）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか2つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体であっても、上記の非限定的なモノクローナル抗体（EV053272およびEV053273）の活性（すなわち、SARS-CoV-2 Sタンパク質に結合し、SARS-CoV-2野生株および変異株のいずれか、またはその両方のウイルス活性を中和する）と同等の活性を保持する限り、本発明の抗体の範囲に含まれ得る。本発明の抗体において、CDR以外のアミノ酸配列もヒト由来である抗体が含まれ得るが、CDR以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるCDR移植抗体も本発明の抗体に包含され得る。必要に応じてフレームワーク領域（ＦＲ）に１ないし数個（具体的には、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または1個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異があってもよい。
　自然界のタンパク質を構成しているアミノ酸は、それらの側鎖の特性によって群分け可能であり、例えば、同様な生化学的特性を有するアミノ酸群としては、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性アミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、炭化水素鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、およびその他（グリシン、メチオニン、システイン）の群などに分類できる。同様な生化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基間のアミノ酸残基の置換は、元のタンパク質の生物学的活性を保持したまま行われ得る。
　例えば、下記の様な群分けの同一群に含まれるアミノ酸残基（非天然型のアミノ酸も含む）は（元のタンパク質の生物学的活性を保持したまま）相互に置換可能であり得る。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Karlin S and Altschu SF, PNAS, 87:2264-2268, 1990; PNAS, 90:5873-5877, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF. et al., J Mol Biol, 215:403-410,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、word length＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、word length＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。あるいは、タンパク質のアミノ酸配列の同一性を求める際、比較する2種類のタンパク質のアミノ酸配列を並べ、同じアミノ酸残基である部分の数を数えることにより「（同一なアミノ酸残基数／タンパク質全長のアミノ酸残基数）×100（%）」により求めることもできる。
　したがって、代表的には、本開示は、一つの局面において、下記［１］から［９］のそれぞれの構成によって特徴付けられるモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片を提供する。
［１］SARS-CoV-2コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合し、そのウイルス活性を中和するSARS-CoV-2コロナウイルスに対するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片。
［２］配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［３］配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
　配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
を含む、上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］（ｉ）重鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有する、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［５］配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95の抗体またはその抗原結合性断片。
［６］配列番号１９のアミノ酸配列または配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも80%（または、少なくとも90%もしくは95%）の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
を含む、上記［１］または［５］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［７］（ｉ）重鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
を含有する、上記［１］、［５］、または［６］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［８］上記［１］～［７］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、SARS-CoV-2野生株および変異株のいずれかまたはその両方に対する中和活性（IC50）が、約10 ng/mL以下で、Sタンパク質3量体に結合する抗体またはその抗原結合性断片。［９］上記［１］～［８］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、WO2021/045836においてmAb10933およびmAb10987でそれぞれ特定される抗体またはそれらの等価物を含むカクテル抗体の逃避変異株に対しても抑制効果を示す（または中和する活性を有する）抗体またはその抗原結合性断片。
　３．本発明の抗体をコードする核酸
　本発明はまた、別の局面において、本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。典型的には、上述の［１］から［９］のそれぞれによって特徴付けられるモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。
　さらに、非限定的な例として、SARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、その生物活性を中和し得る抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片（すなわち、典型的には、上述の［１］から［９］のそれぞれの構成によって特徴付けられるモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片）のアミノ酸配列をコードする核酸（分子）（ポリヌクレオチド）と高い同一性を有する単離された核酸（すなわち高ストリンジェントな条件下で該核酸とハイブリダイズする核酸から選択される単離された核酸）が提供される。ここで、「高い同一性を有する」とは、高ストリンジェントな条件下で所定の核酸配列に対してハイブリダイズすることができる程度の配列同一性を意味し、例えば、少なくとも約60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%、またはそれを超える同一性を有することを意味する。例えば、上記核酸はDNAまたはRNAであり、典型的には、DNAである。
　「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。（例えば、J.SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), 特に11.45節"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"参照）。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、DNA）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　上記高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸としては、アミノ酸配列をコードする核酸と、例えば、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する核酸が含まれる。
　塩基配列の同一性は、上述した同一性検索アルゴリズムなどを利用して決定することが出来る（Karlin S and Altschu SF, PNAS, 87:2264-2268, 1990; PNAS, 90:5873-5877, 1993）。
　４．本発明に係るベクター、宿主細胞および抗体の作製方法
　本発明は、さらに別の局面において、上記核酸分子を組み込んだベクターおよびそのベクターが導入された宿主細胞、これらを用いる抗体の作製方法に関する。
　本発明の抗体は、公知の方法を用いた組換えヒト抗体としても作製できる（Boulianne GL et al., Nature,312:643-646,1984 、Jones PT et al., Nature,321:522-525,1986など参照）。例えば、本発明の抗体は、本発明に係るベクターを導入した宿主細胞を培養し、培養上清などから、産生された抗体を精製することによって作製することができる。より具体的には、VHおよびVLをコードするcDNAを同一細胞または別のヒト細胞より作製したヒト抗体CHおよび／またはヒト抗体CLをコードする遺伝子を含有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
　本発明の抗体のVHまたはVLをコードする核酸を組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、タンパク質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターを用いることができる。非限定的な例としては、FEプロモーターおよび／またはCMVエンハンサーを含有するベクターが挙げられる。また、通常VHまたはVLをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にコトランスフェクトするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。
　発現ベクターを導入する宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が含まれる。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（SF9等）、哺乳類細胞（COS-1、CHO、ミエローマ細胞等）が挙げられる。
　組換え抗体を工業的に生産するためには、一般的には当該抗体を安定して高生産する組換動物細胞株、例えば、CHO細胞株が利用される。そのような組換細胞株の作製、クローン化、高発現のための遺伝子増幅およびスクリーニングは公知の方法を用いることができる（例えば、Omasa T., J. Biosci. Bioeng., 94:600-605, 2002等参照）。
　上記の組換え抗体には、重鎖2本と軽鎖2本からなる抗体のほかに、抗原結合性断片、例えばFab （Fragment of antigen binding）、Fab'、F(ab')２、抗体の活性断片をリンカー等で結合したもの（例えば一本鎖抗体（single chain Fv：scFv）やジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv：dsFv））、抗体の活性断片を含むペプチド（例えばCDR を含有するペプチド）が含まれる。これらは、本発明の抗体を適当なタンパク質分解酵素で処理する方法または遺伝子組換技術等、公知の方法で製造することができる。
　抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
　その他、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表面に発現させる、ファージディスプレイ抗体技術により、人工的にVH、VL遺伝子をシャッフリングさせ多様化したscFv（single chain Fragment of variable region）抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。この技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価されている。この技術を用いて、本願明細書における、例えば、配列番号２～４、６～８、１２～１４、および１６～１８のアミノ酸配列を参考に作製した特異抗体またはその抗原結合性断片も、本発明の範囲内にある。
　さらには、抗体の糖鎖部分の修飾により抗体のADCC活性を大幅に改善するポテリジェント（Potellegent）技術を本発明の抗体に応用して得られた抗体（Niwa R et al., Clin. Cancer Res., 10:6248-6255, 2004参照）や、CDC活性を改善するコンプリジェント（Complegnent）技術を本発明の抗体に応用して得られた抗体（Kanda Y. et al., Glycobiology, 17:104-118, 2007参照）も、本発明の範囲内にある。同様に、抗体の定常領域部分のアミノ酸配列を修飾することにより、ADCC活性（WO2007/039682及びWO2007/100083）やCDC活性（WO2007/011041及びWO2011/091078)を改変する方法で得られた抗体も、本発明の範囲内にある。
　さらに、当該抗体にプロテアーゼ耐性能力を付加し、経口投与可能にするために行うFc領域の部分的な置換技術（WO2006/071877参照）を応用して得られた抗体またはその抗原結合性断片も、本発明の範囲内にある。
　なお、抗体作製の手法として、通常はマウス、ウサギ、ヤギ等の実験動物を利用してポリクローナル抗体や、モノクローナル抗体を取得することが行われているが、このようにして得られる抗体は用いた動物種に特徴的な配列を有しているので、そのままヒトに投与するとヒト免疫系により異物として認識され、ヒト抗動物抗体応答が起こる（即ち、抗体の抗体を作ってしまう）ことがある。
　本発明に係る抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、SARS-CoV-2感染回復者の血液由来の抗体産生細胞から得ることができ、それは完全ヒト抗体である。この完全ヒト抗体は、抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さないか、または完全ヒト抗体でない抗体と比較して少なくとも低減されており、免疫反応は見られないか、または完全ヒト抗体でない抗体と比較して少なくとも低減されているという利点がある。
　５．本発明の抗体を含有する医薬組成物、本発明の抗体の医薬としての使用、医薬の製造のための本発明の抗体の使用、および本発明の抗体を患者に投与することを含む治療または予防方法
　本発明は、さらに別の局面において、本発明の抗体を医薬として使用することを含む。一実施形態において、本発明の抗体および薬学的に許容可能な担体を含む、SARS-CoV-2感染を予防または治療するための医薬組成物が提供される。一実施形態において、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防における、本発明の抗体の使用が提供される。さらに、一実施形態において、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防のための医薬の製造における、本発明の抗体の使用が提供される。さらに、一実施形態において、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防方法であって、それを必要とする対象または患者に本発明の抗体を投与することを含む方法が提供される。
　特に、本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片は、SARS-CoV-2のSタンパク質に結合し、高い中和能を有するので、SARS-CoV-2が関与する疾患の予防または治療薬として有用である。
　本明細書中で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
　薬学的に許容可能な担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1種または複数、ならびにこれらの組合せが含まれる。注射剤などとして使用される場合、pH調節剤や等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。薬学的に許容可能な担体には、さらに、湿潤剤や乳化剤、防腐剤、緩衝剤、安定化剤など、抗体または抗体部分の保存性または有効性を増大させる少量の補助物質を含めることができる。
　本発明の医薬組成物は、様々な剤型にすることができる。そのような組成物には、例えば、溶液（例えば注射可能であり輸液可能な溶液）や分散液、懸濁液、錠剤、カプセル、トローチ、ピル、粉末、リポソーム、坐剤など、液体、半固体、固体の剤型が含まれる。剤型は、意図される投与形態および治療の適用例により異なり得る。例えば、一般に他の抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物など、注射可能または輸液可能な溶液の形にあるものが含まれる。例えば、投与形態は、非経口的なもの（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経肺経鼻から）であり得る。あるいは、抗体は、静脈輸液または静脈注射によって投与され得る。あるいは、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与され得る。あるいは、抗体は吸入または経鼻によって投与され得る。
　６．本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体およびその抗原結合性断片を取得する方法
　次に、本発明に係る抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体およびその抗原結合性断片を得た方法について説明するが、本発明に係る抗体等を得る方法はこれらの記載に何ら限定されるものではなく、上述したとおり、当業者の通常の創作能力の範囲内での変更または修飾が可能である。
　本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体およびその抗原結合性断片は、SARS-CoV-2感染回復者の血液から種々の工程を経て、該抗体を産生する細胞クローンを単離、目的抗体をコードするDNAをクローニング後、遺伝子発現、抗体産生を行うことによって得ることができる。以上の本発明に係る抗SARS-CoV-2 S抗体の作製工程のフローチャートを図１に示す。
　１）SARS-CoV-2のSタンパク質に対する完全ヒト抗体産生細胞の増殖誘導
　SARS-CoV-2感染回復者の血液からBリンパ球を分離し、該Bリンパ球の増殖を誘導する。増殖誘導の方法自体は公知であり、例えばガンの誘因因子となる「エプスタイン・バールウイルス（EBウイルス）」（Epstein-Barr virus）（以下、「EBV」と称す）を用いたトランスフォーム法（Kozbor D. and Roder JC., Immunol Today, 4:72-9, 1983）により行うことができる。
　２）SARS-CoV-2のSタンパク質に対する完全ヒト抗体産生細胞クローンの単離
　上述のEBVの感染により増殖誘導されたBリンパ球群から、Sタンパク質3量体を固相したELISA、および、培養上清の中和活性測定により、抗体産生細胞を同定する。場合により、前記Bリンパ球をセルマイクロアレイに播種し、Sタンパク質3量体を固相したスライドガラスあるいはマイクロビーズを用いてSタンパク質結合抗体を産生するシングル細胞を選択、単離する。
　３）SARS-CoV-2のSタンパク質に対する完全ヒト抗体の遺伝子獲得および抗体産生
　上述の単離したSタンパク質結合抗体産生Bリンパ球からcDNAを合成し、抗体遺伝子をクローニングする。獲得遺伝子をCHO細胞に導入し、抗体を発現させ、抗原結合性、および中和活性を測定する。
　上述のようにして得られた抗SARS-CoV-2抗体は、ヒト体内で感作されたBリンパ球から作製した完全ヒト抗体であるので、ヒトに投与された場合の抗体に対する免疫反応の可能性が低いという利点がある。
　また、Bリンパ球に感染して増殖誘導させる活性があるEBウイルスを利用している点も特徴である。EBウイルス法の利点は、ヒトの体内で作られるナチュラルな抗体を作製できる点、および陽性率の非常に低い細胞からでも抗体が獲得できる点である。
　７．In vitroでの活性を評価する方法
　抗体または抗体組成物の抗原結合性は、ELISA法、表面プラズモン共鳴（SPR）法などにより評価できる。また、SARS-CoV-2のSタンパク質の生物活性を当該抗体がin vitroで抑制する能力は、ELISAなどの受容体結合阻害アッセイ法および中和アッセイ法などにより評価できる。
　１）抗原結合活性
　抗体とSARS-CoV-2のSタンパク質との結合性を測定するには、公知の方法を用いることができる。例えば、当該Sタンパク質3量体を抗原としたELISAを採用して行うことができる（実施例の「５.抗原結合性評価」および図３を参照）。あるいは、当該Sタンパク質3量体あるいはRBDへの結合親和性をBiacore T200（登録商標）のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。結合親和性（KD値）は、当該測定法で得られたkd(解離定数)とka（結合定数）の比（KD=kd/ka）で表示される。本発明に係るヒト抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片は、野生型Sタンパク質、および、野生株、アルファ株、デルタ株RBDへの結合親和性（KD値）が１×10-8 M以下、好ましくは1×10-9 M以下である。（実施例の「６. 抗原親和性評価」および図４を参照）
　２）In vitro中和活性
　本明細書で使用される、「中和」、「阻害効果」、「阻害」、「抑制」、「阻害し得る」等々の用語は、抗原（SARS-CoV-2）に起因する生物活性を、例えば、少なくとも約5～100%、10～100%、20～100%、30～100%、40～100%、50～100%、60～100%、70～100%、または80～100%低減させることをいう。
　抗SARS-CoV-2抗体のin vitro中和能評価については、SARS-CoV-2の野生株および／または変異株（例：アルファ株、デルタ株）を用いて実施することができる。例えば、使用する野生株としては、JPN/TY/WK-521株、および変異株、例えば、アルファ株としてJPN/QK002/2020、デルタ株としてJPN/TKYTK1734/2021を使用し、Vero E6細胞にTMPRSS2 cDNAを導入した細胞株（Matsuyama S et al., 2020）への感染能を抗SARS-CoV-2抗体存在下で調べることにより、当該抗体の中和能を評価出来る（実施例の「７.中和活性評価」および図５を参照）。
　典型的には、本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片は、上記Vero細胞を用いたSARS-CoV-2感染能の評価系で、野生株に対し、約200 ng/mL以下、約100 ng/mL以下、約50 ng/mL以下、または約10 ng/mL以下で50%の感染阻害活性（IC50）を有する。
　あるいは、本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片は、上記Vero細胞を用いたSARS-CoV-2感染能の評価系で、変異株に対して、約200 ng/mL以下、約100 ng/mL以下、約50 ng/mL以下、または約10 ng/mL以下で50%の感染阻害活性（IC50）を有する。上記の変異株の非限定的な例として、アルファ株およびデルタ株が含まれる。
　あるいは、本発明に係る抗SARS-CoV-2抗体またはその抗原結合性断片は、上記Vero細胞を用いたSARS-CoV-2感染能の評価系で、野生株および変異株に対して、約200 ng/mL以下、約100 ng/mL以下、約50 ng/mL以下、または約10 ng/mL以下で50%の感染阻害活性（IC50）を有する。上記の変異株の非限定的な例として、アルファ株およびデルタ株が含まれる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
　本発明に係る抗SARS-CoV-2 S抗体の作製手順のフローチャートを図１に示す。
　１. SARS-CoV-2に対する完全ヒト抗体の遺伝子クローニング
　下記手順により本実施例に係るモノクローナル抗体の遺伝子クローニングを行った。
　１）SARS-CoV-2感染回復者の末梢血を採取した。
　２）末梢血単核細胞（PBMC）を遠心により分離した。
　３）PBMCからBリンパ球を分離し、EBVを感染させた。感染細胞は96ウェルプレートに播種し、3週間程度培養した。
　４）培養上清中の抗SARS-CoV-2抗体の1次スクリーニングを行った。スクリーニングはSARS-CoV-2の主要な中和ターゲットであるSタンパク質3量体(ACROBiosystems)に対する抗体を対象とし、ELISA法により目的抗体陽性ウェルを同定した。
　５）抗SARS-CoV-2抗体産生が確認された各ウェルの中和活性を測定し、中和抗体陽性ウェルを特定した。
　６）中和抗体陽性ウェルの培養上清を用い、産生する抗体のアイソタイプをELISA法により確認した。すなわち、Sタンパク質3量体を固相化した抗SARS-CoV-2抗体スクリーニングプレートを用い、2次抗体としてそれぞれのアイソタイプおよびサブクラスに特異的な抗体を使用した。得られた抗SARS-CoV-2抗体のアイソタイプおよびサブクラスを表１に示す。
　７）場合により、中和抗体陽性ウェルの細胞をセルマイクロアレイに播種し、Sタンパク質3量体を固相化したスライドグラス、あるいはマイクロビーズを使用し、目的抗体を産生しているシングル細胞を同定した。
　８）上記５）および７）の抗体産生細胞のtotal-RNAから、oligo-dTプライマーを用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてPCR法による抗体遺伝子の増幅を行った。PCRに使用したプライマーは、ヒトIgG抗体H鎖およびL鎖をコードするcDNAのデータベースをもとに設計した。H鎖は翻訳開始地点から定常領域までを、L鎖は完全長のcDNAを増幅するため、5’末端側プライマー、および3’末端側プライマーを設計した。
　２.得られた抗体遺伝子が抗SARS-CoV-2抗体をコードしていることの確認
　得られたH鎖およびL鎖の遺伝子をそれぞれ発現ベクターに挿入し、CHO-K1細胞に同時に導入した。遺伝子導入はリポフェクタミンLTX（Invitorgen）とプラス試薬（Invitorgen）により、メーカーの推奨条件で行った。2日後に培養上清を回収し、Sタンパク質3量体を固相化したマルチウェルプレートを用いたELISA法により培養上清中の抗体がSARS-CoV-2のSタンパク質に結合することを確認した。Sタンパク質への結合が確認されたクローンについては、培養上清を用いて中和活性を測定した。
　３.塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
　H鎖およびL鎖それぞれの塩基配列をABIシークエンサー（TermoFisher）により確認した。得られた塩基配列より、抗体のシグナル配列、H鎖およびL鎖のアミノ酸配列、可変領域のアミノ酸配列、及び相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列をそれぞれ決定した（図２）。CDRの解析にはKabatの方法（www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R. Martin’s Group, Antibodies: General Information）を用いた。得られた抗体のH鎖およびL鎖のアミノ酸配列、可変領域のアミノ酸配列、及び相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列の配列番号を表１にそれぞれ示す。また、アイソタイプおよびサブクラスについても確認した。
　４.抗体タンパク質の産生および精製
　得られた抗SARS-CoV-2中和抗体発現ベクターをExpiCHO細胞（Invitorgen）に導入し、培養上清を回収した。この培養上清をProtein Aカラム（Cytiva）によるアフィニティー精製にかけ、精製抗体を得た。遺伝子導入、培養、精製はメーカーの推奨条件で行った。精製後、SDS-PAGEによる抗体H鎖（約50 kDa）、抗体L鎖（約25 kDa）の確認を行った。
　５.抗原結合性評価
　精製抗体を用いてSタンパク質3量体に対する結合性をELISA法により確認した。精製抗SARS-CoV-2抗体は5 μg/mLから5倍希釈系列を8段階用意した。コントロール抗体は市販の中和抗体（ACROBiosystems、SAD-S35）を使用した。得られた結果を図３に示す。EV053272、EV053273のEC50はそれぞれ、13 ng/mL、20 ng/mLコントロール抗体の145 ng/mLと比較し、結合活性は顕著に高い。
　６.抗原親和性評価
　抗SARS-CoV-2抗体の抗原親和性評価として、Sタンパク質3量体、あるいは、RBDを用いてBiacore T-200によるアフィニティー解析を行なった。human IgG capture kit（GE Healthcare）によりセンサーチップに抗ヒトIgGを固定化し、抗SARS-CoV-2抗体をキャプチャーさせてリガンドとした。アナライトはSタンパク質3量体、野生株、あるいは変異株RBD（ACROBiosystems）を使用した。結果を図４に示す。Sタンパク質3量体、および、野生株、アルファ株、デルタ株RBDに対するKD値は、殆どが1.0 nM以下と非常に高い結合活性を示した。
　７.中和活性評価
　抗SARS-CoV-2抗体の有効性評価として中和活性を確認した。中和活性はSARS-CoV-2野生株、2種のアルファ株、および、デルタ株に対するSARS-CoV-2感染の抗体による阻止率で評価した。抗体によるウイルス中和実験は国立感染症研究所が公表したCOVID-19血清学的検査マニュアルhttps://www.niid.go.jp/niid/images/pathol/pdf/COVID-19Serology_Ver1.pdfに準じて実施した。
　１）培養細胞
　Vero E6細胞にTMPRSS2 cDNAを導入した細胞株（Matsuyama S et al.,PNAS, 117:7001-7003, 2020）をJapanese Collection of Research　Bioresources (JCRB)から入手した(JCRB1819 VeroE6 /TMPRSS2)。細胞の維持は、牛胎児血清（FCS、fetal calf serum）を10%の濃度で添加したDulbecco Modified Eagle’s medium (DMEM、 Nissui 05919) にさらに400 μg/mLネオマイシン（G418、Sigma-Aldrich、A1720）を加えた培養液を使用した。37℃、5% CO2下に維持し、継代の際には、リン酸バッファー（Phosphate buffer saline (-), PBS、Nissui、05913）で2回リンスした後、0.25%トリプシン/EDTA液（Lonza, CC-5012）を10 cm plateあたり1 mL添加した。10% FCS/DMEMで細胞を回収し、x120 gで5分間、遠心した。上清を除去した後、4% FCS/DMEMに懸濁し、細胞濃度をカウント後、96穴プレートに１ウェルあたり、104個/100 μLで播種した。ウイルス感染実験は、細胞プレート作製の翌日に行なった。
　２）ウイルス株
　国立感染症研究所から、野生株（JPN/TY/WK―521株）、アルファ株2種（JPN/QK002/2020、アルファ株1：Accession ID: EPI_ISL_768526、アルファ株2：Accession ID: EPI_ISL_804007）、およびデルタ株（JPN/TKYTK1734/2021株）を入手した。Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific, 31985070）を用いて、ウイルスストック液を段階的に希釈し、96穴プレートに添加した。一つの希釈系列をワンセットとして8つのウェルに作用した。3-4日後、8つの内の半分のウェルがCPE（Cytopathertic effects）を示すウイルス濃度を50%感染量（TCID50、Median tissue culture infectious dose）として算出した。
　３）IC50の算出
　精製抗体の50% 抑制濃度（IC50）を96穴プレートを用いて評価した。即ち、Opti-MEMで最終濃度が250 ng/mLから0.25 ng/mLになるように希釈した抗体溶液を、96穴プレートの縦１列に添加した。次に、最終MOIが0.03になるように調製したウイルス液を、96穴プレートに等量添加し、1時間、37℃で振盪・反応させた後、細胞プレートに100 μLずつ添加した。野生株の場合は2日後、アルファ株の場合は3日後、デルタ株の場合は4日後、細胞増殖・毒性アッセイキット（富士フィルム和光純薬、347-07621）溶液を10 μLずつ、それぞれのウェルに添加した後、37℃で培養を継続した。2-3時間後、OD450 nmの吸光度をプレートリーダー（BIO-RAD、Model 550）測定し、培養液だけを添加したウェルの値をバックグラウンドとして各値から差し引いた値を元に、非感染サンプルに対しての割合（%）を算出し、各抗体濃度における中和活性（阻害）率を算出した（図５）。IC50は、以下の計算式から算出した。
IC50=10^(LOG(A/B)*(50-C)/(D-C)+LOG(B))
A:50%を挟む高い濃度, B:50%を挟む低い濃度
C:Bでの阻害率, D:Aでの阻害率
　少なくとも野生株に対してIC50値が約10 ng/mL以下である本発明の抗体は、Eli Lilly社が作製し、臨床に導出した単クローン抗体(LY-Cov555、Ab169)のIC50値10-30 ng/mL（Jones BE. Et al. bioRxiv. 2020 Oct 1;2020.09.30.318972.doi: 10.1101/2020.09.30.318972.）と比較し、それと同等以上に優れていると言える。
　さらに、アルファ株2種、およびデルタ株に対しても感染抑制効果を示し、IC50値は10 ng/mL以下と算出された。つまり、EV053272、EV053273はアルファ株、およびデルタ株に対しても高い中和活性を有していると言える。
　４）Regeneron社抗体Reg10933およびReg10987（WO 2021/045836 A1）の作製
　Regeneron社の抗体、Reg10933およびReg10987はWO 2021/045836 A1記載の遺伝子配列（段落［000107］の表（「Table of Exemplary Sequences」）に記載される配列情報を参照）を基に、軽鎖については全長、重鎖は可変部領域の遺伝子を合成した（GeneArt）。合成したH鎖およびL鎖の遺伝子をそれぞれ発現ベクターに挿入した後、ExpiCHO細胞（Invitrogen）に導入し、培養上清から精製抗体を得た。発現ベクターの作製、遺伝子導入、培養精製は上記１－４に記載の方法に準じた。
　５）Regeneron社カクテル抗体の逃避変異株検出
　デルタ株を用いて、Regeneron社のカクテル抗体（Reg10933+Reg10987）の逃避変異株を作出した。本逃避変異株の作出方法は、Copin et al. (2021), Cell 184, 3949-3061に準じた。10～0.016 mg/mLの抗体溶液と、最終MOIが1になるように調製したウイルス液を混合・反応させた後、培養細胞に添加し、3日後に培養上清を回収した。回収した培養上清のうち、感染が完全に成立した最高抗体濃度の培養上清すなわちウイルス液を、次の感染実験に供試した。ウイルス液は最終20倍希釈となるように調製し、10～0.016 mg/mLの抗体溶液と混合して、新しい培養細胞に添加し、3日後にウイルス液を回収した（第二世代）。以降、継代を繰り返し、第十六世代目で10 mg/mLの抗体溶液中で感染が成立するウイルスを得て、Regeneron社カクテル抗体の逃避変異株とした。
　次に、125～31.25 ng/mL精製抗体（EV053273）溶液と最終MOIが0.01となるように調製した逃避変異ウイルス液を混合し、培養細胞に添加したところ、本発明の抗体によって感染が抑制された(図６)。
　ウイルスの中和活性に関する50%阻害濃度が低く、極めて少ない量で有効である（中和能を発揮する）という本発明のモノクローナル抗体の上記特性は、医薬としての使用において有利である（例えば、患者への負荷の低減、医療コストの低減）。加えて、本発明のモノクローナル抗体は、Regeneron社カクテル抗体の逃避変異株を含む複数の変異株に対して中和活性を有するという点で有意に優れた効果を奏するものである。
　本発明の抗SARS-CoV-2抗体は、SARS-CoV-2が関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物等の分野における適用に有用である。
　［配列の簡単な説明］
>EV053272 HCVR
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLKWMGGIIPIFGTAKYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGRPVTIGVSSTTGVFDYWGQGTLVTVSS（配列番号１）
 
>EV053272 HCDR1
SYAIS（配列番号２）
 
>EV053272 HCDR2
GIIPIFGTAKYAQKFQG（配列番号３）
 
>EV053272 HCDR3
GRPVTIGVSSTTGVFDY（配列番号４）
 
>EV053272 LCVR
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSRQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPITFGQGTRLEIK（配列番号５）
 
>EV053272 LCDR1
KSRQSVLYSSNNKNYLA（配列番号６）
 
>EV053272 LCDR2
WASTRES（配列番号７）
 
>EV053272 LCDR3
QQYYSSPIT（配列番号８）
 
>EV053272 HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLKWMGGIIPIFGTAKYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGRPVTIGVSSTTGVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号９）
 
>EV053272 LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSRQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１０）
 
>EV053273 HCVR
QVQLVQSGAEVKEPGTSVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGRNYTQKFQGRVTMTRDKSISTVYMELSGLRSDDTAIYYCARDNSWSTVQFCLDYWGQGTLVTVSS（配列番号１１）
 
>EV053273 HCDR1
GYYIH（配列番号１２）
 
>EV053273 HCDR2
WINPNSGGRNYTQKFQG（配列番号１３）
 
>EV053273 HCDR3
DNSWSTVQFCLDY（配列番号１４）
 
>EV053273 LCVR
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYNYVSWYQQYPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYGGSNNLVFGGGTKLTVL（配列番号１５）
 
>EV053273 LCDR1
TGTSSDVGSYNYVS（配列番号１６）
 
>EV053273 LCDR2
EVSKRPS（配列番号１７）
 
>EV053273 LCDR3
SSYGGSNNLV（配列番号１８）
 
>EV053273 HC
QVQLVQSGAEVKEPGTSVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGRNYTQKFQGRVTMTRDKSISTVYMELSGLRSDDTAIYYCARDNSWSTVQFCLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１９）
 
>EV053273 LC
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYNYVSWYQQYPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYGGSNNLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号２０）
 
>EV053272 HC（シグナル配列を含む）をコードするDNA
ATGGAATGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTAAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGGACAGCAAAGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCGGACGGCCTGTTACGATTGGCGTCTCCTCAACGACCGGGGTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA（配列番号２１）
 
>EV053272 HC（シグナル配列を含む）
MEWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLKWMGGIIPIFGTAKYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGRPVTIGVSSTTGVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２２）
 
>EV053272 LC（シグナル配列を含む）をコードするDNA
ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGACAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTTCCCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG（配列番号２３）
 
>EV053272 LC（シグナル配列を含む）
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSRQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２４）
 
>EV053273 HC（シグナル配列を含む）をコードするDNA
ATGGCATGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGGAGCCTGGGACCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACATCTTCACCGGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCAGAAACTATACACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACAAGTCCATCAGCACAGTCTACATGGAACTGAGCGGACTGAGATCTGACGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGATAATTCATGGTCTACGGTTCAATTCTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA（配列番号２５）
 
>EV053273 HC（シグナル配列を含む）
MAWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKEPGTSVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGRNYTQKFQGRVTMTRDKSISTVYMELSGLRSDDTAIYYCARDNSWSTVQFCLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２６）
 
>EV053273 LC（シグナル配列を含む）をコードするDNA
ATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTAGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGTATCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGTTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGAGGCAGCAACAATTTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG（配列番号２７）
 
>EV053273 LC（シグナル配列を含む）
MAWALLLLTLLTQGTGSWAQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYNYVSWYQQYPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYGGSNNLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号２８）
 

Claims (16)

  1. 　SARS-CoV-2コロナウイルスのSタンパク質に結合し、そのウイルス活性を中和するSARS-CoV-2コロナウイルスに対するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片。
  2. 　配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
    　配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 　配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
    　配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
    を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  4. （ｉ）重鎖の可変領域が、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
    を含有し、
    （ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
    （ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
    を含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 　配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
    　配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 　配列番号１９のアミノ酸配列または配列番号１９のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖、および
    　配列番号２０のアミノ酸配列または配列番号２０のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖
    を含む、請求項１または５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  7. （ｉ）重鎖の可変領域が、
    （ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2のアミノ酸配列、および
    （ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3のアミノ酸配列、
    を含有し、
    （ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
    （ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および
    （ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3のアミノ酸配列、
    を含有する、請求項１、５、または６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、SARS-CoV-2野生株および変異株のいずれかまたはその両方に対する中和活性（IC50）が、約10  ng/mL以下である、Sタンパク質3量体に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、SARS-CoV-2コロナウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物。
  10. 　（１）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療または予防における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用、
    　（２）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症の治療もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片の使用、または
    　（３）SARS-CoV-2コロナウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象または患者に請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む、方法。
  11. 　前記SARS-CoV-2が変異株である、請求項９に記載の医薬組成物、または請求項１０に記載の使用もしくは方法。
  12. 　前記変異株がアルファ株またはデルタ株である、請求項１１に記載の医薬組成物、使用、または方法。
  13. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、またはこれらの核酸分子のいずれかと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸分子。
  14. 　請求項１３に記載の単離された核酸分子を組み込んだ組換え発現ベクター。
  15. 　請求項１４に記載の組換え発現ベクターが導入された単離された宿主細胞。
  16. 　請求項１５に記載の宿主細胞を培養し、前記培養された宿主細胞から抗体を精製することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
     
     
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