CN1324406A - 编码muc－1的dna分子及其在肿瘤疫苗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了一种药物组合物,它含有一种或多种编码在肿瘤细胞内超表达的蛋白质片段的DNA分子,从而诱导抗肿瘤Ag－特异性免疫反应,以及合适的赋形剂和佐剂。
Description
发明领域
本发明涉及一组含有编码人MUC-1片段的序列的DNA质粒构建体并涉及下列一组DNA质粒：其中编码由与细菌LacⅠ片段融合的人遍在蛋白质组成的蛋白质的序列位于所述片段自身之前。本发明进一步涉及它们在制备用作DNA抗肿瘤疫苗的药物组合物中的用途。
背景技术
本发明提供了一种以诱导或激活能够带来肿瘤排斥作用的免疫反应为基础的抗肿瘤疗法。这类意图的可靠性由一期临床结果所证实；例如，用含有癌胚抗原(CEA)编码序列的病毒疫苗治疗的患者表现出对这种抗原的免疫系统激活作用(Tsang KY等《国际癌症协会杂志》(J.Natl.Cancer.Inst.)87:982,1995)。
通过下列4种不同手段可以激活免疫抗肿瘤反应：
a)离体改造患者的肿瘤细胞以便使它们更具有免疫原性且更适合用作疫苗；
b)离体改造患者的免疫细胞以便预激活体外免疫反应；
c)接种编码与肿瘤相关的抗原的裸或脂质体包囊的或病毒颗粒整合的(逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒等)DNA；
d)用与佐剂结合或混合的重组或合成的可溶性肿瘤抗原治疗。
前两种手段由改造每一单个患者细胞的步骤组成且受到限制的方面在于它们必须是患者特异性的；而后两种手段的目的在于获得可与传统药物相比拟的产品。
新的疫苗接种方法反映出新技术的开发。近期来源于对诱导持久抗体或细胞免疫反应的裸DNA疫苗的实验的证明使得诱导淋巴细胞群体的由某些特异性肽类构成的传统蛋白质亚单位疫苗失效。肌内或经皮注射的由裸DNA编码的蛋白质诱导细胞毒性特异性反应以及辅助反应。这种强有力的结合是极为有效的，而基本机理还未完全明确。肌肉细胞仅在低水平上表达Ⅰ类MHC抗原而显然不会表达Ⅱ类抗原或共同刺激分子。因此，转染的肌肉细胞不能在自身免疫反应的发作中起重要作用。近来的数据表明诸如巨噬细胞或树突细胞这样的抗原呈递细胞(APC)在捕捉肌细胞释放抗原中和随后的加工和呈递Ⅰ类和Ⅱ类分子范围内的相应肽类中起重要作用，由此诱导带有细胞毒性活性的CD8+细胞激活以及在引起抗体反应中与B淋巴细胞共同起作用的CD4+细胞的激活(Corr M等《实验药物杂志》(J.Exp.Med.)184:1555,1996)(Tighe,H.等《今日免疫学》(Immunology Today)19:89,1998)。
此外，已知应用细胞因子可改善来源于用DNA免疫接种的治疗作用。可以如Irvine等在《免疫学杂志》(J.Immunol.)156:238,1996中所报导的给予外源蛋白质形式的细胞因子。另一种手段由同期接种肿瘤抗原或编码所需细胞因子的质粒所代表，由此使细胞因子在原位产生(Kim JJ等《(免疫学》(Immunol)158:816,1997)。
本发明的自动免疫接种手段基于将DNA载体用作抗MUC-1人抗原或肿瘤细胞内超表达的多态上皮粘蛋白(PEM)的疫苗。MUC-1是一种上皮腔表面糖蛋白(Patton S.等BBA1241:407,1995)。在细胞转化过程中，这种糖蛋白失去了端部定位且其表达水平显著提高。蛋白质的功能包括保护例如哺乳动物腺体、卵巢、子宫内膜、结肠、胃、胰、膀胱、肾等中的腔表面。据报导糖基化的缺点在于使与肿瘤细胞相关的MUC-1在抗原上不同于与正常细胞相关的MUC-1。这种现象导致肿瘤MUC-1暴露通常由正常细胞表达的MUC-1中糖部分正常掩蔽的抗原表位。这种特性使肿瘤MUC-1在诱导肿瘤特异性抗体反应方面特别有意义(Apostolopoulos V.等《免疫学标准回顾》(Crit.Rev.Immunol.)14:293,1994)。
作为一个目标，接种疫苗的目的在于诱发对以高水平表达MUCl的肿瘤细胞的免疫反应、同时保护低水平表达的正常上皮。DNA疫苗接种依赖于基因及其部分进入体细胞内部、随后是插入序列的转录和翻译和由此胞内相应多肽的合成。这种系统的一个重要优点在于在所述细胞内部天然加工新合成的蛋白质且所产生的肽类与主要的组织适合性复合物Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)相关。由此MHC/肽复合物被自然输送到细胞表面，其中它们可以被免疫系统CD8+细胞毒性细胞识别。然后仅加工并呈递在所述细胞内部合成的与MHCⅠ类分子相关的多肽类，由此成功地刺激唯一的机制、一种特异性细胞毒性反应。以蛋白质或肽给药为基础的疫苗接种系统通常更为有效地刺激抗体免疫反应，迄今为止已经证明这种免疫反应对排斥肿瘤细胞无效。目前的基因疗法技术依赖于重组病毒载体中的DNA包装(逆转录病毒和腺病毒)。给予裸DNA在有效性和安全性方面远比病毒载体疗法更为有利(Kumar V和Sercarz E.《天然药物》(Nature Med.)2:857,1996；McDonnelWM等《新英格兰药物杂志》(New England J.of Med.)334:42,1996)。实际上，裸DNA不能在宿主组织DNA中复制或整合且不会诱导对病毒蛋白质的免疫反应。
近来报导了遍在蛋白质在促进新合成蛋白质的加工和由此的细胞毒性淋巴细胞诱导作用中的应用(Rodriguez F.等《病毒学杂志》(J.Virology)71:8497,1997)。目前已经报导了为生产带有N-末端氨基酸的蛋白质而应用遍在蛋白质，从而使这些蛋白质不稳定且由此倾向于增加降解(Bechmair A.等《科学》(SCIENCE)234:179,1986)。这些蛋白质的较高的不稳定性依次与增加的胞内加工和MHC-1呈递的模型蛋白质有关(Grant EP等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)155:3750,1995)(Wu Y和Kipps T.J.，《免疫学杂志》(J.Immunol.)1 59:6037,1997)。
报导了在DNA疫苗接种过程中应用含有编码部分抗原的DNA片段(流感病毒核蛋白)的单一构建体，与具有完整抗原序列的类似物相比具有较高的抗原呈递功效(Anton L.C.等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)158:2535,1997)。此外，在生理条件下由MHCⅠ型蛋白质加工胞内蛋白质并呈递相应的肽类以免疫监视机理为基础。对于得到的蛋白质和特异性MHC前后序列来说，存在称作显性区的肽片段(即对亚显性区和隐性区来说占优势)，它们不能够产生任何免疫反应，这是因为它们被识别为“自体”。根据本发明的一个方面，目前已经概括出一种目的在于通过给予抗原蛋白质片段混合物的维持非显性表位呈递的手段能够引起令人意外的细胞毒性免疫反应。
本发明的描述
目前已经发现可以将编码在肿瘤细胞中超表达的蛋白质片段的DNA分子方便地用于诱导抗原特异性抗肿瘤免疫反应。
本发明特别涉及一种药物组合物，它含有一种或多种编码粘蛋白(MUC-1)蛋白质片段的DNA。
本发明中所用的DNA可以是质粒或病毒DNA，优选使用附图13中所述pMRS30表达载体获得的质粒DNA。
本发明的组合物优选含有至少两种粘蛋白(MUC-1)或另一种在肿瘤细胞中超表达的蛋白质的DNA片段。
本发明的组合物优选含有至少四种片段，它们各自带有约200-约700个核苷酸，各序列在相邻的3’和/或5’末端上的约50-约150个核苷酸彼此邻接且可能部分重叠。
本发明的DNA片段的5’末端可能位于编码遍在蛋白质的DNA序列之后且也能够位于大肠杆菌LacⅠ部分之后。
本发明还涉及新型DNA片段并涉及上述粘蛋白-1片段在药物和抗肿瘤疫苗制品中的用途。
附图的描述
附图1
插在pMRS166表达载体的XbaⅠ位点上的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括相应于EMBL序列J05581136-339位核苷酸的序列，它位于翻译起始密码子ATG之后，它后面有两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括甲硫氨酸(Metionin)和随后的由EMBL序列J05581的136-339位片段编码的氨基酸。
附图2
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS169表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括位于翻译起始密码子ATG之后的相应于EMBL序列J05581205-720位核苷酸的序列，它后面有两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括甲硫氨酸(Metionin)和随后的由EMBL序列J05581的205-720位片段编码的氨基酸。
附图3
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS168表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括位于翻译起始密码子ATG之后的相应于EMBL序列J05581631-1275位核苷酸的序列，它后面有两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括甲硫氨酸(Metionin)和随后的由EMBL序列J05581的631-1275位片段编码的氨基酸。
附图4
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS167表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括位于翻译起始密码子ATG之后的相应于EMBL序列J055811222-1497位核苷酸的序列，它后面有两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括甲硫氨酸(Metionin)和随后的由EMBL序列J05581的1222-1497位片段编码的氨基酸。
附图5
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS175表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括位于翻译起始密码子ATG之后的相应于EMBL序列J05581136-1497位核苷酸的序列，它后面有两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括甲硫氨酸(Metionin)和随后的由EMBL序列J05581的136-1497位片段编码的氨基酸。
附图6
称作UBILacⅠ的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。所编码的多肽包括与细菌蛋白质β-半乳糖苷酶的部分序列融合的遍在蛋白质序列，正如Chau V.等《科学》(Science)243:1576,1989中所述。
附图7
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS171表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括与相应于EMBL序列J05581136-139位核苷酸的序列融合的称作UBILacⅠ的序列和随后的两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括附图6中所述的氨基酸序列，该氨基酸序列与包括由EMBL序列J05581的136-139位片段编码的氨基酸在内的序列融合。
附图8
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS174表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括与相应于EMBL序列J05581205-720位核苷酸的序列融合的称作UBILacⅠ的序列(见图6)和随后的两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括附图6中所述的氨基酸序列，该氨基酸序列与包括由EMBL序列J05581的205-720位片段编码的氨基酸在内的序列融合。
附图9
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS173表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括与部分相应于EMBL序列J05581631-1275位核苷酸的序列融合的称作UBILacⅠ的序列(参见附图6)和随后的两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括附图6中所述的氨基酸序列，该氨基酸序列与包括由EMBL序列J05581的631-1275位片段编码的氨基酸在内的序列融合。
附图10
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS172表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括与部分相应于EMBL序列J055811222-1497位核苷酸的序列融合的称作UBILacⅠ的序列(参见附图6)和随后的两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括附图6中所述的氨基酸序列，该氨基酸序列与包括由EMBL序列J05581的1222-1497位片段编码的氨基酸在内的序列融合。
附图11
插在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上以便得到pMRS176表达载体的核苷酸DNA序列(与相应的氨基酸序列)。这种DNA包括与部分相应于EMBL序列J05581136-1497位核苷酸的序列融合的称作UBILacⅠ的序列(参见附图6)和随后的两个翻译终止密码子TGA和TAA。所编码的多肽由此包括附图6中所述的氨基酸序列，该氨基酸序列与包括由EMBL序列J05581的136-1497位片段编码的氨基酸在内的序列融合。
附图12
在1XTBE中的1％琼脂糖凝胶上进行的电泳分析。mRNA分别提取自CHO、CD34+树突细胞和来自PBMC的树突细胞、用pMRS169转染并与(泳道4、8、12)或不与(泳道5、9、13)逆录酶进行RT-PCR反应。分子量DNA标记(泳道1)；内部阴性对照(泳道2、6)；内部阳性对照(泳道3、7、10、11)；来自Promega试剂盒的阳性对照(泳道14)。
附图13
pMRS30表达载体的核苷酸序列。1-2862区相应于pSV2CAT载体(EMBL M77788)的AccⅠ(504位)-BamHⅠ(3369位)区；2863-3721区包括人巨细胞病毒启动子(人巨细胞病毒主要立即早期基因增强子)；3722-4905区包括几个包括XbaⅠ(3727位)在内的克隆位点和家兔β-珠蛋白基因的加工信号。
发明详述
制备了在真核细胞中编码MUC-1人蛋白质抗原片段的DNA质粒组。构建体以附图13中所述和预先在专利申请W095/11982中要求保护的称作pMRS30的哺乳动物表达载体为基础并含有EMBL数据库中记录的登记号为J05581的MUC-1cDNAs的部分序列。将编码DNA的MUC-1切割成片段，使得各片段代表不连续的部分，从而部分与邻近部分重叠。给予这类质粒的混合物可以使不同的质粒在给药部位转染不同的APC细胞。因此，这类细胞产生并加工生成相关肽类的MUC-1蛋白质的不连续部分。在这些条件下，出现的亚显性和隐性的肽类还可以以与Ⅰ型MHC分子连接的形式存在，从而产生细胞毒性免疫反应。
本发明由此涉及一组含有MUC-1cDNA部分片段的四种构建体(附图1-4)的应用，该应用是以至少含有它们中的两种的混合物形式进行；本发明还涉及一组含有位于编码含有分别使用的遍在蛋白质和大肠杆菌LacⅠ部分(附图6)的蛋白质序列的DNA之后的MUC-1cDNA部分片段的四种构建体(附图7-10)或含有至少它们中的两种的混合物形式的构建体的应用。
本发明还涉及含有大部分MUC-1cDNA全部序列的构建体(附图5)和含有位于编码含有遍在蛋白质和大肠杆菌LacⅠ部分的蛋白质序列的DNA之后的MUC-1cDNA大部分序列的构建体(附图11)。
含有MUC-1cDNA部分片段的四种构建体的混合物和含有位于编码蛋白质序列(含有遍在蛋白质和大肠杆菌LacⅠ部分)的DNA之后的MUC-1cDNA部分片段的四种构建体的混合物代表本发明的优选的实施方案。
在对患有以高MUC-1表达为特征的肿瘤的患者的抗肿瘤疗法中可以使用本发明的构建体。
如下获得本发明中所述的构建体。
就第一类构建体而言，通过来自BT20细胞系的RT-PCR或通过DNA部分化学合成获得MUC-1DNA的片段。然后将这类片段克隆入pMRS30表达载体并通过测序鉴定。
就第二类构建体而言，通过PCR再扩增而从第一类构建体获得所述片段。然后使这些片段与编码遍在蛋白质(通过RT-PCR从MCF7细胞系mRNA获得)和部分LacⅠ序列(通过PCR从商品载体pGEX获得)的DNA融合。接着将由此获得的DNA序列在pMRS30表达载体中克隆并通过测序鉴定。为了治疗或预防的用途，使用载体和预先在裸DNA疫苗中所用的方法合适地配制本发明的片段或构建体，正如例如下列文献中所述：《免疫学家》(Immunologist)1994,2:1；WO90/11092；《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)1986,83,9551；US5580859；《今日免疫学》(Immunology Today)19(1998),89-97；《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90(1993),11478-11482；《国际药物》(Nat.Med.)3(1997),526-532；《疫苗》(Vaccine)12(1994,1495-1498；)《DNA细胞生物学》(DNACell Biol.)12(1993),777-783。以临床和药理-毒理试验为基础确定剂量。一般来说，这些剂量由0.005μg/kg-5μg/kg片段混合物组成。本发明的组合物还可以含有细胞因子或编码细胞因子的质粒。
通过下列实施例来进一步解释本发明。
实施例1．质粒pMRS166的构建
在补充了10％胎牛血清的Eagles MEM中培养BT20肿瘤细胞(ATCCHTB-19)。将1000万个细胞用胰蛋白酶消化、用PBS洗涤并提取mRNA。
使这种RNA的等分试样在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行RT-PCR(逆转录酶-聚合酶链反应)反应：
V11(5 GATCTCTAGAATGACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3)
V4(5 GATCTCTAGAAAGCTTATCAACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3)
将产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ纯化和消化、克隆入含有专利WO9511982中所要求保护的人巨细胞病毒启动子和β-珠蛋白聚腺苷酸化信号的pMRS30表达载体中。所得的pMRS166载体含有一种DNA片段，它包括ATG密码子(其序列相应于EMBL序列J05581的136-339位核苷酸)和两个终止密码子TGA和TAA。
这种片段如附图1中所述。
实施例2．质粒pMRS169的构建
在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下用RT-PCR扩增如实施例1中所述获得的RNA等分试样：
V12(5 GATCTCTAGAATGGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3)
V15(5 GGCGGTGGAGCCCGGGGCTGGCTTGT 3)
用限制酶SmaⅠ和XbaⅠ纯化和消化产生的DNA片段，用SmaⅠ限制位点使之与完全合成构建的DNA片段融合，它包括部分相应于EMBL序列J05581的457-720位核苷酸的序列和两个终止密码子TGA和TAA。由此将完整的片段在pMRS30表达载体的XbaⅠ位点上克隆。所得的pMRS169载体含有一种DNA片段，它包括ATG密码子(其序列部分相应于EMBL序列J05581的205-720位核苷酸)和两个终止密码子TGA和TAA。
这种片段如附图2中所述。
实施例3．质粒pMRS168的构建
在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下用RT-PCR扩增如实施例1中所述获得的RNA等分试样：
V13(5 GATCTCTAGAATGGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3)
V8(5 GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ纯化和消化，克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS168载体含有一种DNA片段，它包括ATG密码子(其序列相应于EMBL序列J05581的631-1275位核苷酸)和两个终止密码子TGA和TAA。
这种片段如附图3中所述。
实施例4．质粒pMRS167的构建
在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下使如实施例1中所述获得的RNA等分试样进行RT-PCR反应：
V14(5 GATCTCTAGAATGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3)
V10(5 GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGTTGGCAGAAGTGGCTGC 3)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ纯化和消化，克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS167载体含有一种DNA片段，它包括ATG密码子(其序列相应于EMBL序列J05581的1222-1497位核苷酸)和两个终止密码子TGA和TAA。
这种片段如附图4中所述。
实施例5．质粒pMRS175的构建
在有下列核苷酸对存在的情况下使pMRS166、169、168、167质粒进行PCR反应：
V11(参见实施例1)
用于pMRS166的V18(5 AACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3)
V19(5 GTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3)
用于pMRS169的V20(5 GCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3)
V21(5 GGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3)
用于pMRS168的V22(5 CAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3)
V23(5 CTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTTGCG 3)
用于pMRS167的V10(参见实施例4)
将在相应PCR反应中获得的四种DNA片段按等摩尔量混合并在有V11和V10寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应。
使产生的DNA片段用XbaⅠ限制酶纯化和消化，克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS175载体含有一种DNA片段，它包括ATG密码子(其序列部分相应于EMBL序列J05581的136-1497位核苷酸)和两个终止密码子TGA和TAA。
这种片段如附图5中所述。
实施例6．质粒pMRS171的构建
在补充了10％胎牛血清的Eagles MEM中培养MCF7肿瘤细胞(ATCCHTB-22)。将1000万个细胞用胰蛋白酶消化、用PBS洗涤并提取mRNA。
使这种RNA的等分试样在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行RT-PCR反应：
UBIup(5GATCTCTAGAATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGT 3)
UBIdown(5TCACCAGCGAGACGGGCAACAGCCATGCACCACTACCGTGCCTCCCACCTCTGAGACGGAGCACCAGG 3)
该反应产生称作片段1的DNA片段。
使来自pGEX11T(Pharmacia)的DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
LacIup(5CCTCCGTCTCAGAGGTGGGAGGCACGGTAGTGGTGCATGGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAAAAG 3)LacIdown(5GATCGGATCCTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC 3)
该反应生成称作片段2的DNA片段。
将在相应PCR反应中获得的1和2 DNA片段按等摩尔量混合并在有UBIup和LacIdown寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应。
将产生的用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化的DNA片段克隆入pUC18商品质粒。所得的pMRS156载体含有一种DNA片段，它包括编码遍在蛋白质的序列，所述遍在蛋白质与编码细菌β-半乳糖苷酶部分的序列融合。称作UBILacⅠ的这种片段如附图6中所述。
使质粒pMRS166 DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
V3(5GATCGGATCCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3)
V4(参见实施例1)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化，通过与两个BamHⅠ位点连接而与来源于pMRS156质粒的UBILacⅠ片段融合。所得片段被克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS171载体含有一种DNA片段，它包括UBILacⅠ序列(该序列相应于合EMBL序列J05581的136-339位核苷酸的序列)和两个终止密码子TGA和TAA。这种片段如附图7中所述。
实施例7．质粒pMRS174的构建
使质粒pMRS169 DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
V5(5GATCGGATCCGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3)
V6(5GATCTCTAGAAAGCTTATCAGCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3)3)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化，通过与两个BamHⅠ位点连接而与来源于pMRS156质粒的UBILacⅠ片段融合。将所得的片段克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS174载体含有一种DNA片段，它包括UBILacⅠ序列(该序列相应于EMBL序列J05581的205-720位核苷酸的序列)和两个终止密码子TGA和TAA。这种片段如附图8中所述。
实施例8．质粒pMRS173的构建
使质粒pMRS168 DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
V7(5GATCGGATCCGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3)
V8(参见实施例3)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化，通过与两个BamHⅠ位点连接而与来源于pMRS156质粒的UBILacⅠ片段融合。将所得的片段克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS173载体含有一种DNA片段，它包括UBILacⅠ序列(该序列相应于EMBL序列J05581的631-1275位核苷酸的序列)和两个终止密码子TGA和TAA。这种片段如附图9中所述。
实施例9．质粒pMRS172的构建
使质粒pMRS167 DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
V9(5 GATCGGATCCCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3)
V10(参见实施例4)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化，通过与两个BamHⅠ位点连接而与来源于pMRS156质粒的UBILacⅠ片段融合。将所得的片段克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS172载体含有一种DNA片段，它包括UBILacⅠ序列(该序列相应于EMBL序列J05581的1222-1497位核苷酸的序列)和两个终止密码子TGA和TAA。这种片段如附图10中所述。
实施例10．质粒pMRS176的构建
使质粒pMRS167 DNA在有下列合成的寡核苷酸存在的情况下进行PCR反应：
V3(参见实施例6)
V10(参见实施例4)
使产生的DNA片段用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ纯化和消化，通过与两个BamHⅠ位点连接而与来源于pMRS156质粒的UBILacⅠ片段融合。将所得的片段克隆入pMRS30表达载体。所得的pMRS176载体含有一种DNA片段，它包括UBILacⅠ序列(该序列相应于EMBL序列J05581的136-1497位核苷酸的序列)和两个终止密码子TGA和TAA。这种片段如附图11中所述。
实施例11．真核细胞转染和转录测试
在转染时间时在补充了核苷酸和脱氧核苷酸的αMEM中培养CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。
从在不含血清的补充了GM-CSF、IL4、SCF、Flt3和TNFα的IMDM中培养的CD34+造血前体获得树突细胞。7天后转染获得的细胞群。
由从PBMC(外周单核血细胞)分离的单核细胞获得树突细胞，将它们在补充了FCS、GM-CSF和IL-4的RPMI中培养。7天后转染获得的细胞群。
在每种情况中，用实施例1-10中所述的质粒之一转染约1百万个细胞。使用3μg质粒DNA和4μ1DMRIE(Gibco)通过脂转染进行转染。
24小时后收集细胞、用PBS洗涤并裂解以便提取mRNA。
使mRNA的等分试样在有对转染DNA质粒具有特异性的寡核苷酸对存在的情况下进行RT-PCR反应。
对于实施例1-10中所述的各质粒来说，该实验使用下列寡核苷酸对进行：用于pMRS166的V11/V4；用于pMRS169的V12/V6；用于pMRS168的V13/V8；用于pMRS167的V4/V10；用于pMRS175的V4/V10；用于pMRS171的UBIup/V4；用于pMRS174的UBIup/V6；用于pMRS173的UBIup/V8；用于pMRS172的UBIup/V10；用于pMRS176的V14/V10。
作为一个有代表性的实施例，附图12记录了对通过RT-PCR从三种细胞群体(用pMRS169质粒转染)mRNA获得的DNA片段的电泳分析。在这种情况中使用寡核苷酸对V12/V6。
实施例12．体内研究结果
在体内研究中，使用四种片段的混合物和pMRS30质粒(不含插入片段且由此用作阴性对照的载体)。为了测试发生的免疫接种，将ELISA试验用于证实人粘蛋白特异性抗原。
使用人MUC1转基因C57BL小鼠进行体内研究。从而在这些动物中MUC1蛋白质代表自体蛋白。所用的疫苗接种方案由3次皮内(背部、每侧50微克DNA)给予(在第0天、第14天、第28天)100微克质粒DNA组成。在最后一次给药后的第14天时，处死动物并检测血清的抗人粘蛋白抗体。
所检测的本发明目的的片段混合物刺激了所治疗动物中的良好的免疫反应。
另一方面，还进行了重复3次的疫苗接种实验，该实验使用60个氨基酸的肽(这种肽称作3XTR)，它相应于附图2中所述86位-105位的20个氨基酸。
两种疫苗接种在引起的抗体反应的类型上不同。导致抗体滴度远高于使用3XTR的疫苗接种中的抗体滴度。此外，就使用3XTR的疫苗接种而言，所注意到的IgG亚型有利于主要的体液(抗体)反应；而就使用DNA的疫苗接种而言，所注意到的IgG亚型有利于细胞反应(细胞毒性)。对于抗肿瘤疗法来说，优选主要的细胞毒性免疫反应。因为是对人粘蛋白是“自体”的转基因小鼠进行实验，所以我们可以预见在人体中的类似反应。这种反应可以证明本发明化合物作为DNA疫苗在治疗MUC1超表达人肿瘤中的用途是正确的。
序列表<110>MENARINI RICERCHE s.p.A.<120>含有具有抗肿瘤作用的编码抗原蛋白质的DNA片段的药物组合物<130>5653MEUR<140><141><150>MI98A002330<151>1998-10-30<160>35<170>PatentIn.2.1版<210>1<211>213<212>DNA<213>human<400>1atgacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 60cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 120ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 180gccccggcca cggaaccagc ttcaggttga taa 213<210>2<211>525<212>DNA<213>人<400>2atggtgccca gctctactga gaagaatgct gtgagtatga ccagcagcgt actctccagc 60cacagccccg gttcaggctc ctccaccact cagggacagg atgtcactct ggccccggcc 120acggaaccag cttcaggttc agctgccacc tggggacagg atgtcacctc ggtcccagtc 180accaggccag ccctgggctc caccaccccg ccagcccacg atgtcacctc agccccggac 240aacaagccag ccccgggaag tactgctcca ccagcacacg gtgttacctc ggctccggat 300accaggccgg ccccaggtag taccgcccct cctgcccatg gtgtcacatc tgccccggac 360aacaggcctg cattgggtag tacagcaccg ccagtacaca acgttactag tgcctcaggc 420tctgctagcg gctcagcttc tactctggtg cacaacggca cctctgcgcg 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Claims (20)
1．药物组合物，它含有一种或多种DNA分子以及合适的赋形剂和佐剂，其中所述的一种或多种DNA分子编码在肿瘤细胞内超表达的蛋白质片段从而诱导抗肿瘤Ag-特异性免疫反应。
2．根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的超表达的蛋白质是MUC-1。
3．根据权利要求1或2所述的药物组合物，它含有至少两种DNA分子，它们各自含有编码粘蛋白片段(MUC-1)的cDNA序列。
4．根据权利要求3所述的组合物，它含有至少三种DNA分子，它们各自含有编码粘蛋白片段(MUC-1)的cDNA序列。
5．根据权利要求4所述的组合物，它含有至少四种DNA分子，它们各自含有编码粘蛋白片段(MUC-1)的cDNA序列。
6．根据权利要求3、4或5所述的组合物，其中所述的DNA序列包括约200-约700个核苷酸，各序列在3’和/或5’末端上的约50-约150个核苷酸彼此邻接且可能部分重叠。
7．根据权利要求2-6中任意一项权利要求所述的药物组合物，其中所用的混合物至少由两种质粒DNA分子组成，各分子含有选自附图1、2、3和4中所述序列的DNA片段。
8．根据权利要求7所述的药物组合物，其中所用的混合物由质粒DNA分子组组成，其中各分子含有选自附图1、2、3和4中所述序列的DNA片段。
9．根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中使用含有附图5中所述序列的质粒DNA分子。
10．根据权利要求7、8或9所述的药物组合物，其中所用的质粒DNA分子来源于附图13中pMRS30表达载体与附图1、2、3、4、5中所述各序列的融合。
11．根据权利要求2-6所述的药物组合物，其中相应于蛋白质单一片段的所用序列的5’末端之前是附图6中所述编码遍在蛋白质和来自大肠杆菌的LacⅠ部分的序列。
12．根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的混合物由选自附图7、8、9和10中所述DNA序列与附图13中所述的pMRS30表达载体相连接产生的一种或多种序列组成。
13．根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的混合物由选自附图7、8、9和10中所述DNA序列与pMRS30表达载体相连接产生的全部序列组成。
14．根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的混合物由附图11中所述序列与pMRS30表达载体相连接产生的序列组成。
15．根据上述任意一项权利要求所述的药物组合物，进一步含有细胞因子或编码质粒的细胞因子。
16．一种质粒DNA分子，它由与DNA序列连接的pMRS30表达载体组成，其中所述的DNA序列编码MUC-1蛋白质片段且其序列选自附图1、2、3、4和5中所述序列的组。
17．一种编码蛋白质MUC-1片段的DNA分子，其5’末端之前是附图6中所述序列。
18．一种根据权利要求17所述的DNA分子，它选自附图7、8、9、10和11中所述的那些DNA分子。
19．一种通过将pMRS表达载体与选自权利要求17或18的DNA分子连接而获得的质粒DNA分子。
20．权利要求16-19的DNA分子在制备具有抗肿瘤作用的组合物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |