SK5712001A3 - Pharmaceutical composition - Google Patents

Pharmaceutical composition Download PDF

Info

Publication number
SK5712001A3
SK5712001A3 SK571-2001A SK5712001A SK5712001A3 SK 5712001 A3 SK5712001 A3 SK 5712001A3 SK 5712001 A SK5712001 A SK 5712001A SK 5712001 A3 SK5712001 A3 SK 5712001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
dna
fragment
pharmaceutical composition
muc
Prior art date
Application number
SK571-2001A
Other languages
Slovak (sk)
Inventor
Dino Parente
MASSIMO Anna Maria DI
Santis Rita De
Original Assignee
Menarini Ricerche Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Menarini Ricerche Spa filed Critical Menarini Ricerche Spa
Publication of SK5712001A3 publication Critical patent/SK5712001A3/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • A61K39/001136Cytokines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Provided herein is a pharmaceutical composition containing one or more DNA molecules encoding fragments of a protein overexpressed in tumor cells, in order to induce an anti-tumor Ag-specific immune response, in association with suitable excipients and adjuvants.

Description

Farmaceutický prostriedokPharmaceutical composition

Oblasť vynálezuField of the invention

Vynález sa týka skupiny DNA plazmidových konštruktov obsahujúcich sekvencie fragmentov kódujúcich humánny MUC-1 a skupiny DNA plazmidov, v ktorých je pred samotnými fragmentárni sekvencia kódujúca proteín pozostávajúci z humánneho ubiquitínu fúzovaného s bakteriálnym Lacl fragmentom. Vynález sa ďalej týka aj ich použitia ako DNA protinádorových vakcín.The invention relates to a group of DNA plasmid constructs comprising sequences of fragments encoding human MUC-1 and to a group of DNA plasmids in which the fragment itself encoding a protein consisting of human ubiquitin fused to a bacterial Lac1 fragment is preceded. The invention further relates to their use as DNA tumor vaccines.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Vynález poskytuje protinádorovú terapiu založenú na indukcii alebo aktivácii imunitnej odpovede schopnej spôsobiť odvrhnutie nádoru. Platnosť takejto myšlienky je demonštrovaná prvými klinickými výsledkami; napríklad pacienti liečení vírusovou vakcínou obsahujúcou sekvencie kódujúce karcinoembryonický antigén (CEA) demonštrovali aktiváciu imunitného systému proti tomuto antigénu (Tsang KY a ďalší, J. Natl. Cancer. Inst. 87: 982,1995).The invention provides anti-tumor therapy based on the induction or activation of an immune response capable of causing tumor rejection. The validity of such an idea is demonstrated by the first clinical results; for example, patients treated with a viral vaccine containing sequences encoding a carcinoembryonic antigen (CEA) have demonstrated activation of the immune system against this antigen (Tsang KY et al., J. Natl. Cancer. Inst. 87: 982,1995).

Aktivácia imunitnej protinádorovej odpovede je dosiahnuteľná prostredníctvom štyroch odlišných prístupov:Activation of the immune anti-tumor response is achievable through four different approaches:

a) Ex vivo zámerné pozmenenie pacientových nádorových buniek, aby boli imunogénnejšie a vhodné ako vakcína;(a) Ex vivo deliberate alteration of patient tumor cells to make them more immunogenic and suitable as a vaccine;

b) Ex vivo zámerné pozmenenie pacientových nádorových buniek, aby sa vopred aktivovala in vitro imunitná odpoveď;b) Ex vivo deliberate alteration of the patient's tumor cells to pre-activate the in vitro immune response;

c) Inokulácia DNA kódujúcej antigény asociované s nádorom, ktorá je nahá alebo obalená v lipozómoch alebo začlenená do vírusových častíc (retrovírusových, vaccinia vírusových, adenovírusových atď.);c) Inoculation of DNA encoding tumor associated antigens which is naked or enveloped in liposomes or incorporated into viral particles (retroviral, vaccinia viral, adenoviral, etc.);

d) Ošetrenie s rekombinantnými alebo syntetickými rozpustnými nádorovými antigénmi konjugovanými alebo zmiešanými s adjuvansami.d) Treatment with recombinant or synthetic soluble tumor antigens conjugated or admixed with adjuvants.

Prvé dva prístupy pozostávajú zo zámerného menenia každej jednotlivej pacientovej bunky a sú limitované v tom, že sú nevyhnutne špecifické pre každéhoThe first two approaches consist of deliberate alteration of each individual patient cell and are limited in that they are necessarily specific to each patient.

-2pacienta, zatiaľ čo cieľom ďalších dvoch prístupov je získať produkty porovnateľné s tradičným liečivom.The other two approaches aim to obtain products comparable to a traditional drug.

Nové vakcinačné metódy odrážajú vývoj nových technológií. Súčasné informácie pochádzajúce z experimentovania z nahými DNA vakcínami, ktoré indukujú buď perzistnenú protilátkovú, alebo bunkovú imunitnú odpoveď, spôsobujú, že tradičné proteínové podjednotkové vakcíny pozostávajúce z určitých špecifických peptidov, ktoré indukujú lymfocytovú populáciu, zastarávajú. Intramuskulárne alebo intradermálne injektované proteíny kódované nahou DNA indukujú cytotoxický špecifickú odpoveď ako aj pomocnú odpoveď. Táto silná kombinácia je veľmi účinná, ale mechanizmus tohto podriaďovacieho procesu nie je ešte stále úplne objasnený. Svalové bunky exprimujú MHC antigény triedy I len v malých hladinách a zjavne neexprimujú antigény triedy II alebo ko-stimulučné molekuly. Z toho vyplýva, že je nepravdepodobné, že by transfekované svalové bunky samé o sebe hrali dôležitú úlohu v nástupe imunitnej odpovede. Súčasné údaje ukazujú, že antigén prezentujúce bunky (APC), ako napríklad makrofágy alebo dendritické bunky, hrajú základnú úlohu pri zachytení myocytom uvoľneného antigénu a v následnom spracovaní a prezentovaní zodpovedajúcich peptidov v kontexte molekúl triedy I a II, a tak indukujú aktiváciu CD8+ buniek s cytotoxickou aktivitou, ako aj aktiváciu CD4+ buniek spolupracujúcich s B lymfocytami na vyvolaní protilátkovej odpovede (Corr M a ďalší, J. Exp. Med. 184: 1555, 1996) (Tighe, H. a ďalší, Immunology Today 19:89,1998).New vaccination methods reflect the development of new technologies. Recent information derived from experimentation with naked DNA vaccines that induce either a persistent antibody or cellular immune response makes traditional protein subunit vaccines consisting of certain specific peptides that induce lymphocyte populations become obsolete. Intramuscular or intradermal injected proteins encoded by naked DNA induce a cytotoxic specific response as well as a helper response. This strong combination is very effective, but the mechanism of this subordination process is still not fully understood. Muscle cells express MHC class I antigens only at low levels and apparently do not express class II antigens or co-stimulatory molecules. Consequently, transfected muscle cells are unlikely to play an important role in the onset of the immune response. Recent data show that antigen-presenting cells (APCs), such as macrophages or dendritic cells, play an essential role in capturing myocyte-released antigen and subsequently processing and presenting the corresponding peptides in the context of class I and II molecules, thereby inducing CD8 + cell activation with cytotoxic activity as well as activation of CD4 + cells cooperating with B cells to elicit an antibody response (Corr M et al., J. Exp. Med. 184: 1555, 1996) (Tighe, H. et al., Immunology Today 19: 89,1998).

Navyše je známe, že použitie cytokínov zlepšuje terapeutický účinok odvodený od imunizácie s DNA. Cytokíny sa môžu podávať vo forme exogénnych proteínov, ako bolo publikované v Irvine a ďalší, J. Immunol. 156: 238, 1996. Alternatívny prístup je reprezentovaný súčasnou inokuláciou tak plazmidu kódujúceho nádorový antigén, ako aj plazmidu kódujúceho želateľný cytokín, čím sa umožní, aby bol cytokín produkovaný in situ (Kim J J a ďalší, Immunol 158: 816,1997).In addition, the use of cytokines is known to improve the therapeutic effect derived from DNA immunization. Cytokines can be administered in the form of exogenous proteins as published by Irvine et al., J. Immunol. 156: 238, 1996. An alternative approach is represented by the simultaneous inoculation of both a tumor antigen-encoding plasmid and a desirable cytokine-encoding plasmid, thereby allowing the cytokine to be produced in situ (Kim J J et al., Immunol 158: 816, 1997).

Účinný imunizačný prístup podľa predloženého vynálezu je založený na použití DNA vektorov ako vakcín proti MUC-1 humánnemu antigénu alebo polymorfnému epiteliálnemu mucínu (PEM), ktorý je nadmerne exprimovaný v nádorových bunkách. MUC-1 je eptiteliálny luminálny povrchový glykoproteín (Patton S. a ďalší, BBA 1241:407, 1995). V procese transformácie buniek stráca • f t ' rThe efficient immunization approach of the present invention is based on the use of DNA vectors as vaccines against MUC-1 human antigen or polymorphic epithelial mucin (PEM) that is overexpressed in tumor cells. MUC-1 is an eptithelial luminal surface glycoprotein (Patton S. et al., BBA 1241: 407, 1995). In the process of cell transformation, it loses f t 'r

-3tento glykoproteín apikálnu lokalizáciu a jeho úroveň expresie dramaticky rastie. Proteínová funkcia pozostáva z ochrany lumínálnych povrchov, napríklad v prsných žľazách, vaječníkoch, endometriu, hrubom čreve, žalúdku, pankrease, močovom mechúre, obličkách, atď. Publikovalo sa, že defekt v glykozylácii spôsobuje, že MUC-1 asociovaný s nádorovými bunkami je antigénovo odlišný od MUC-1 asociovaného z normálnymi bunkami. Tento fenomén je spôsobený tým, že MUC-1 odhaľuje antigénové epitopy, ktoré sú normálne maskované sacharidovými zvyškami v MUC-1 exprimovanom normálnymi bunkami. Táto vlastnosť robí nádorový MUC-1 veľmi zaujímavým z hľadiska indukcie nádorovo špecifickej protilátkovej odpovede (Apostolopoulos V. a ďalší, Crit. Rev. Immunol. 14:293,1994).This glycoprotein apical localization and its expression level is dramatically increasing. Protein function consists of protecting the luminal surfaces, for example in the mammary glands, ovaries, endometrium, colon, stomach, pancreas, bladder, kidneys, etc. A defect in glycosylation has been reported to cause MUC-1 associated with tumor cells to be antigenically different from MUC-1 associated with normal cells. This phenomenon is due to the fact that MUC-1 reveals antigenic epitopes that are normally masked by carbohydrate residues in MUC-1 expressed by normal cells. This property makes tumor MUC-1 very interesting in terms of inducing a tumor-specific antibody response (Apostolopoulos V. et al., Crit. Rev. Immunol. 14: 293, 1994).

Predmetom je vakcinácia, ktorej cieľom je indukcia imunitných odpovedí voči nádorovým bunkám exprimujúcim MUC1 vo vysokých hladinách, pričom zároveň ostávajú chránené normálne epitely s nízkou expresiou. DNA vakcinácia je založená na vstupe génu alebo jeho častí do vnútra tela buniek, po ktorom nasleduje transkripcia a translácia inzertovanej sekvencie a tým vnútrobunková syntéza zodpovedajúceho polypeptidu. Dôležitou výhodou tohto systému je, že neosyntetizovaný protein sa prirodzene spracúva vo vnútri bunky a produkované peptidy sú asociované s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu triedy I (MHC-I). MHC/peptidové komplexy sa preto prirodzene exportujú na bunkový povrch, kde môžu byť rozoznávané CD8+ cytotoxickými bunkami imunitného systému. Len polypeptidy syntetizované vo vnútri bunky sa potom spracovávajú a prezentujú v spojení s MHC molekulami triedy I, a využívajú tak jediný mechanizmus na stimuláciu špecifickej cytotoxickej odpovede. Vakcinačné systémy založené na podávaní proteínu alebo peptidu sú zvyčajne účinnejšie na stimuláciu protilátkovej imunitnej odpovede, ktorá sa doteraz ukázala ako neúčinná pri odvrhovaní nádorových buniek. Súčasné génové terapeutické techniky sú založené na zbaľovaní DNA v rekombinantných vírusových vektoroch (retrovírusových a adenovírusových). Podávanie nahej DNA je výhodnejšie s ohľadom na účinnosť a bezpečnosť v porovnaní s vírusovými vektorovými terapiami. (Kumar V a Sercarz E. Náture Med. 2: 857, 1996; McDonnel WM a ďalší, New England J. of Med. 334: 42, 1996). V skutočnosti nahá DNA nie je schopná ani sa duplikovať, ani integrovať doThe subject is a vaccination aimed at inducing immune responses to tumor cells expressing MUC1 at high levels while at the same time preserving normal low-expression epitheliums. DNA vaccination is based on the entry of a gene or portions thereof into the body of cells, followed by transcription and translation of the inserted sequence, and thus intracellular synthesis of the corresponding polypeptide. An important advantage of this system is that the non-synthesized protein is naturally processed within the cell and the peptides produced are associated with molecules of the major histocompatibility class I (MHC-I) complex. MHC / peptide complexes are therefore naturally exported to the cell surface, where they can be recognized by CD8 + cytotoxic cells of the immune system. Only polypeptides synthesized within the cell are then processed and presented in conjunction with class I MHC molecules, utilizing a single mechanism to stimulate a specific cytotoxic response. Vaccine systems based on protein or peptide administration are usually more effective in stimulating an antibody immune response which has so far been shown to be ineffective in rejecting tumor cells. Current gene therapy techniques are based on DNA packaging in recombinant viral vectors (retroviral and adenoviral). Administration of naked DNA is more advantageous with respect to efficacy and safety compared to viral vector therapies. (Kumar V and Sercarz E. Nature Med. 2: 857, 1996; McDonnel WM et al., New England J. of Med. 334: 42, 1996). In fact, naked DNA is neither able to duplicate nor integrate into

-4hostiteľskej tkanivovej DNA, a neindukuje imunitnú odpoveď voči vírusovým proteínom.- host tissue DNA, and does not induce an immune response to viral proteins.

V súčasnosti bolo publikované použitie ubiquitínu na zosilnenie spracovania neo-syntetizovaného proteínu, a tým na indukciu cytotoxických lymfocytov (Rodriguez F. a ďalší, J. Virology 71: 8497, 1997). Predtým bolo publikované použitie ubiquitínu na generovanie proteínov s N-koncovou aminokyselinou, čo ich robilo nestabilnými a tým náchylnými na degradáciu vo väčšom rozsahu (BechmairRecently, the use of ubiquitin has been reported to enhance processing of a neo-synthesized protein and thereby induce cytotoxic lymphocytes (Rodriguez F. et al, J. Virology 71: 8497, 1997). Previously, the use of ubiquitin to generate proteins with an N-terminal amino acid has been reported to render them unstable and thus more susceptible to degradation (Bechmair).

A. a ďalší, Science 234: 179, 1986). Vyššia nestabilita týchto proteínov bola následne spojená so zosilneným vnútrobunkovým spracovaním a prezentáciou modelových proteínov prostredníctvom MHC-1 (Grant E. P. a ďalší, J. Immunol. 155: 3750,1995) (Wu Y a Kipps T.J., J. Immunol. 159: 6037,1997).A. et al., Science 234: 179 (1986). Higher instability of these proteins was subsequently associated with enhanced intracellular processing and presentation of model proteins by MHC-1 (Grant EP et al., J. Immunol. 155: 3750, 1995) (Wu Y and Kipps TJ, J. Immunol. 159: 6037, 1997).

Zverejnené bolo použitie jednotkových konštruktov obsahujúcich DNA fragmenty kódujúce čiastočný antigén (influenza vírusový nukleoproteín), ktoré majú pri DNA vakcinácii vyššiu antigénovú prezentačnú účinnosť ako analógy s celými antigénovými sekvenciami (Anton L. C. a ďalší, J. Immunol. 158: 2535, 1997). Navyše spracovanie vnútrobunkových proteínov a prezentácia zodpovedajúcich peptidov MHC proteínmi triedy I podlieha vo fyziologických podmienkach mechanizmu imunologického dohľadu. Pre daný proteín a špecifický MHC kontext existujú peptidové fragmenty nazývané dominanty (tzn. prevládajúce nad subdominantami alebo kryptami), ktoré nie sú schopné generovať žiadnu imunitnú odpoveď pretože sú rozoznávané ako vlastné. V súlade s predmetom predloženého vynálezu sa teraz zistilo, že prístup, ktorého cieľom je podporiť prezentáciu nedominantného epitopu podávaním zmesi antigénových proteínových fragmentov je schopný vyvolať prekvapujúcu cytotoxickú imunitnú odpoveď.The use of unit constructs containing DNA fragments encoding a partial antigen (influenza viral nucleoprotein) having a higher antigen presentation efficiency in DNA vaccination than analogs with whole antigen sequences has been disclosed (Anton L. C. et al., J. Immunol. 158: 2535, 1997). In addition, the processing of intracellular proteins and the presentation of the corresponding MHC peptides by Class I proteins are subject to immunological surveillance mechanisms under physiological conditions. For a given protein and a specific MHC context, there are peptide fragments called dominants (i.e., predominating over subdominants or crypts) that are unable to generate any immune response because they are recognized as intrinsic. In accordance with the present invention, it has now been found that an approach to promote presentation of a non-dominant epitope by administering a mixture of antigenic protein fragments is capable of eliciting a surprising cytotoxic immune response.

Teraz sa zistilo, že DNA molekuly, ktoré kódujú fragmenty proteínu nadmerne exprimovaného v nádorových bunkách, sa môžu pohodlne používať na indukciu antigén-špecifickej protinádorovej imunitnej odpovede.It has now been found that DNA molecules that encode fragments of a protein overexpressed in tumor cells can be conveniently used to induce an antigen-specific anti-tumor immune response.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatou vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje jeden alebo viac fragmentov DNA kódujúcej mucínový (MUC-1) proteín.The present invention provides a pharmaceutical composition comprising one or more DNA fragments encoding a mucin (MUC-1) protein.

-5Prostriedky podľa vynálezu obsahujú výhodnej najmenej dva DNA fragmenty mucínu (MUC-1) alebo iného proteínu nadmerne exprimovaného v nádorových bunkách.The compositions of the invention preferably comprise at least two DNA fragments of mucin (MUC-1) or other protein overexpressed in tumor cells.

Prostriedky podľa vynálezu výhodne obsahujú najmenej štyri fragmenty, každý z dĺžkou od 200 do 700 nukleotidov, pričom každá sekvencia je radená hneď vedľa susednej sekvencie a môžu sa aj čiastočne prekrývať približne 50 až približne 150 nukleotidmi na 3' a/alebo 5* konci so susednou sekvenciou.The compositions of the invention preferably comprise at least four fragments, each of from 200 to 700 nucleotides in length, each sequence being aligned immediately adjacent to the adjacent sequence and may also partially overlap about 50 to about 150 nucleotides at the 3 'and / or 5 * end of the adjacent sequence.

Pred DNA fragmentárni podľa vynálezu môže byť na 5' konci zaradená aj DNA sekvencia kódujúca ubiquitín a môže tam byť aj Lad časť Escherichia coli.The DNA fragment encoding ubiquitin may also be inserted at the 5 'end upstream of the DNA fragment according to the invention and may also be the Lad part of Escherichia coli.

Vynález sa týka aj nových DNA fragmentov a použitia vyššie definovaných mucín-1 fragmentov v medicínskych a protinádorových vakcinačných prípravkoch.The invention also relates to novel DNA fragments and to the use of the above-defined mucin-1 fragments in medical and anti-cancer vaccine compositions.

Pripravila sa zásoba DNA plazmidov, ktoré v eukaryotických bunkách kódujú fragmenty MUC-1 humánneho proteínového antigénu. Konštrukty sú založené na cicavčom expresnom vektore označovanom ako pMRS30, opísanom na obrázku 13 a už nárokovanom v prihláške vynálezu WO95/11982, a obsahujú čiastočné sekvencie MUC-1 cDNA zverejnené v EMBL databáze pod prístupovým číslom J05581. MUC-1 kódujúca DNA sa rozdelila na fragmenty tak, aby každý fragment reprezentoval diskrétnu časť čiastočne sa prekrývajúcu so susednou časťou. Podávanie zmesi takýchto plazmidov môže spôsobiť, že odlišné plazmidy transfekujú odlišné APC bunky v mieste podania. Preto takéto bunky produkujú a spracovávajú diskrétne časti MUC-1 proteínu, čo vedie ku vzniku príbuzných peptidov. V takýchto podmienkach môže dôjsť aj ku prezentácii subdominantných a kryptických peptidov v spojení s MHC molekulami triedy I, čím sa môže generovať cytotoxická imunitná odpoveď.A pool of DNA plasmids that encode human protein antigen MUC-1 fragments in eukaryotic cells was prepared. The constructs are based on the mammalian expression vector referred to as pMRS30 described in Figure 13 and already claimed in WO95 / 11982, and contain partial MUC-1 cDNA sequences disclosed in the EMBL database under accession number J05581. The MUC-1 encoding DNA was divided into fragments such that each fragment represented a discrete portion partially overlapping with an adjacent portion. Administration of a mixture of such plasmids may cause different plasmids to transfect different APC cells at the site of administration. Therefore, such cells produce and process discrete portions of the MUC-1 protein, resulting in related peptides. Under such conditions, subdominant and cryptic peptides may also be presented in conjunction with class I MHC molecules, thereby generating a cytotoxic immune response.

Takže predložený vynález sa týka použitia skupiny štyroch konštruktov (obrázky 1 až 4) obsahujúcich MUC-1 cDNA čiastočné fragmenty v zmesi obsahujúcej najmenej dva z nich a skupiny štyroch konštruktov (obrázky 7 až 10) obsahujúcich MUC-1 cDNA čiastočné fragmenty, pred ktorými sa nachádza DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť (obrázok 6), ktoré sa používajú oddelene alebo v zmesi, ktorá obsahuje najmenej dva z nich.Thus, the present invention relates to the use of a group of four constructs (Figures 1 to 4) containing MUC-1 cDNA partial fragments in a mixture comprising at least two of them and a group of four constructs (Figures 7 to 10) containing MUC-1 cDNA partial fragments before finds DNA encoding a protein sequence comprising ubiquitin and Escherichia coli Lac I part (Figure 6), which are used separately or in a mixture comprising at least two of them.

-6Predložený vynález sa týka aj použitia konštruktu (obrázok 5) obsahujúceho takmer kompletnú sekvenciu MUC-1 cDNA a konštruktu (obrázok 11) obsahujúceho takmer kompletnú sekvenciu MUC-1 cDNA, pred ktorou je DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť.The present invention also relates to the use of a construct (Figure 5) comprising an almost complete MUC-1 cDNA sequence and a construct (Figure 11) comprising an almost complete MUC-1 cDNA sequence preceded by a DNA encoding a protein sequence comprising ubiquitin and Escherichia coli Lac I moiety .

Zmes štyroch konštruktov obsahujúcich čiastočné fragmenty MUC-1 cDNA a zmes štyroch konštruktov obsahujúcich čiastočné fragmenty MUC-1 cDNA, pred ktorou sa nachádza DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť, predstavuje výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu.A mixture of four constructs containing partial MUC-1 cDNA fragments and a mixture of four constructs containing partial MUC-1 cDNA fragments preceded by a DNA encoding a protein sequence comprising ubiquitin and Escherichia coli Lac I portions is a preferred embodiment of the present invention.

Konštrukty podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na protinádorovú liečbu pacientov postihnutých nádormi, ktoré sa vyznačujú vysokou MUC-1 expresiou.The constructs of the present invention can be used for the anti-tumor treatment of patients afflicted with tumors characterized by high MUC-1 expression.

Konštrukty opísané v predloženom vynáleze sa získali nasledovne.The constructs described in the present invention were obtained as follows.

V prípade prvej série konštruktov sa fragmenty MUC-1 DNA získali RT-PCR z BT200 bunkovej línie alebo čiastočnou chemickou syntézou DNA. Takéto fragmenty sa potom klonovali do pMRS30 expresného vektora a overili sa sekvenovaním.For the first series of constructs, MUC-1 DNA fragments were obtained by RT-PCR from the BT200 cell line or by partial chemical DNA synthesis. Such fragments were then cloned into the pMRS30 expression vector and verified by sequencing.

V prípade druhej série konštruktov sa fragmenty získali z prvej série konštruktov PCR re-amplifikáciou. Tieto fragmenty sa potom fúzovali s DNA kódujúcou ubiquitín (získanou prostredníctvom RT-PCR z MCF7 bunkovej líniovej mRNA) a s čiastočnou lacl sekvenciou (získanou prostredníctvom PCR z komerčného vektora pGEX). Takto získané DNA sekvencie sa potom klonovali do pMRS30 expresného vektora a overili sa sekvenovaním. Na zamýšľané terapeutické alebo profylaktické použitia sú fragmenty alebo konštrukty podľa vynálezu vhodne formulované použitím nosičov a metód, ktoré boli predným využívané v nahých DNA vakcínach, ako je opísané napríklad v The Immunologist, 1994, 2:1; WO 90/11092, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551; US 5580859; Immunology today 19 (1998), 89-97; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994), 1495-1498; DNA Celí. Biol. 12 (1993), 777-783. Dávky budú stanovované na základe klinických a farmakologicko-toxikologických testov. Vo všeobecnosti sa dá povedať, že budúFor the second series of constructs, fragments were obtained from the first series of PCR constructs by re-amplification. These fragments were then fused to DNA encoding ubiquitin (obtained by RT-PCR from MCF7 cell line mRNA) and a partial lacI sequence (obtained by PCR from the commercial vector pGEX). The DNA sequences thus obtained were then cloned into the pMRS30 expression vector and verified by sequencing. For intended therapeutic or prophylactic uses, the fragments or constructs of the invention are suitably formulated using carriers and methods that have been previously utilized in naked DNA vaccines, as described, for example, in The Immunologist, 1994, 2: 1; WO 90/11092, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551; US 5580859; Immunology today 19 (1998), 89-97; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994) 1495-1498; DNA Cell. Biol. 12 (1993), 777-783. Doses will be determined on the basis of clinical and pharmacological-toxicological tests. Generally speaking, they will

-7obsahovať medzi 0,005 gg/kg a 5 pg/kg zmesi fragmentov. Prostriedok podľa vynálezu môže obsahovať aj cytokín alebo cytokín kódujúci plazmid.Contain between 0.005 gg / kg and 5 µg / kg of the fragment mixture. The composition of the invention may also comprise a cytokine or a cytokine encoding a plasmid.

Vynález bude ďalej ilustrovaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov.The invention will be further illustrated by the following examples.

Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obrázok 1Figure 1

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS166 expresného vektora. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 136-339 fragmentom EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the pMRS166 expression vector. This DNA contains a sequence corresponding to nucleotides 136-339 of EMBL sequence J05581, preceded by a translation start codon, ATG, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises methionine followed by amino acids encoded by the 136-339 fragment of EMBL sequence J05581.

Obrázok 2Figure 2

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS169 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 205-720 fragmentom EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the pMRS30 expression vector, thereby producing the pMRS169 expression vector. This DNA contains a sequence corresponding to nucleotides 205-720 of EMBL sequence J05581, preceded by a translation start codon, ATG, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises methionine followed by amino acids encoded by the 205-720 fragment of EMBL sequence J05581.

Obrázok 3Figure 3

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čim vznikol pMRS168 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 631-1275 fragmentom EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the pMRS30 expression vector, resulting in the pMRS168 expression vector. This DNA contains a sequence corresponding to nucleotides 631-1275 of EMBL sequence J05581, preceded by a translation start codon, ATG, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises methionine followed by amino acids encoded by the 631-1275 fragment of EMBL sequence J05581.

-8Obrázok 4-8Picture 4

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS167 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionin nasledovaný aminokyselinami kódovanými 1222-1497 fragmentom EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the pMRS30 expression vector, thereby producing the pMRS167 expression vector. This DNA contains a sequence corresponding to nucleotides 1222-1497 of EMBL sequence J05581, preceded by a translation start codon, ATG, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises methionine followed by amino acids encoded by the 1222-1497 fragment of EMBL sequence J05581.

Obrázok 5Figure 5

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS175 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionin nasledovaný aminokyselinami kódovanými 136-1497 fragmentom EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the pMRS30 expression vector, thereby producing the pMRS175 expression vector. This DNA contains a sequence corresponding to nucleotides 136-1497 of EMBL sequence J05581, preceded by a translation start codon, ATG, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises methionine followed by amino acids encoded by the 136-1497 fragment of EMBL sequence J05581.

Obrázok 6Figure 6

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) označená ako UBILacl. Kódovaný polypeptid zahŕňa ubiquitínovú sekvenciu fúzovanú s čiastočnou sekvenciou bakteriálneho proteínu betagalaktozidázy, ako je opísané v Chau V. a ďalší, Science 243:1576,1989.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) designated UBILac1. The encoded polypeptide comprises a ubiquitin sequence fused to a partial sequence of the bacterial beta-galactosidase protein as described in Chau V. et al., Science 243: 1576, 1989.

Obrázok 7Figure 7

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS171 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacl (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou zodpovedajúcou nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú naThe nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the expression vector pMRS30, thereby producing the pMRS171 expression vector. This DNA contains a sequence designated UBILac1 (see FIG. 6) fused to a sequence corresponding to nucleotides 136-339 of EMBL sequence J05581 followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises the amino acid sequence shown in

-9obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 136-339 EMBL sekvencie J05581.Figure 9 fused to a sequence comprising amino acids encoded by fragment 136-339 of EMBL sequence J05581.

Obrázok 8Figure 8

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS174 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 205720 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 205-720 EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) was inserted into the XbaI site of the expression vector pMRS30 to give the pMRS174 expression vector. This DNA contains a sequence designated UBILacI (see FIG. 6) fused to a sequence partially corresponding to nucleotides 205720 of EMBL sequence J05581 followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 6 fused to a sequence comprising the amino acids encoded by the fragment 205-720 of the EMBL sequence J05581.

Obrázok 9Figure 9

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS173 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 6311275 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 631-1275 EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the expression vector pMRS30, thereby producing the pMRS173 expression vector. This DNA contains a sequence designated UBILacI (see FIG. 6) fused to a sequence partially corresponding to nucleotides 6311275 of EMBL sequence J05581 followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 6 fused to a sequence comprising amino acids encoded by fragment 631-1275 of EMBL sequence J05581.

Obrázok 10Figure 10

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS172 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 12221497 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the expression vector pMRS30, thereby producing the pMRS172 expression vector. This DNA contains a sequence designated UBILacI (see FIG. 6) fused to a sequence partially corresponding to nucleotides 12221497 of EMBL sequence J05581, followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 6 fused to a sequence comprising the amino acids encoded by fragment 1222-1497 of EMBL sequence J05581.

-10Obrázok 11-10Picture 11

Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS176 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 1361497 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 136-1497 EMBL sekvencie J05581.The nucleotide DNA sequence (with the corresponding amino acid sequence) inserted into the XbaI site of the expression vector pMRS30, thereby producing the pMRS176 expression vector. This DNA contains a sequence designated UBILacI (see FIG. 6) fused to a sequence partially corresponding to nucleotides 1361497 of EMBL sequence J05581 followed by two translation stop codons, TGA and TAA. Thus, the encoded polypeptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 6 fused to a sequence comprising the amino acids encoded by fragment 136-1497 of EMBL sequence J05581.

Obrázok 12Figure 12

Elektroforetická analýza na 1% agarózovom géli v 1xTBE. mRNA extrahovaná z CHO, CD34+ dentritických buniek, respektíve dentritických buniek z PBMC, transfekovaných s pMRS169, a podrobených RT-PCR reakcii buď s (dráhy 4, 8, 12), alebo bez (dráhy 5, 9, 13) reverznej transkriptázy. Marker molekulovej hmotnosti DNA (dráha 1); interné negatívne kontroly (dráhy 2, 6); interné pozitívne kontroly (dráhy 3, 7,10,11); pozitívna kontrola z Promega kitu (dráha 14).Electrophoresis analysis on 1% agarose gel in 1xTBE. mRNA extracted from CHO, CD34 + dental cells and dental cells from PBMC, respectively, transfected with pMRS169, and subjected to RT-PCR reaction with or without (lanes 4, 8, 12) or without (lanes 5, 9, 13) reverse transcriptase. DNA molecular weight marker (lane 1); internal negative controls (lanes 2, 6); internal positive controls (lanes 3, 7, 10, 11); positive control from the Promega kit (lane 14).

Obrázok 13Figure 13

Nukleotidová sekvencia pMRS30 expresného vektora. 1-1862 oblasť zodpovedá Accl (poloha 504) - BamHI (poloha 3369) oblasti pSV2CAT vektora (EMBL M77788); 2862-3721 oblasť obsahuje humánny cytomegalovírusový promótor (zosiľovač humánneho cytomegalovírusového hlavného okamžite-skorého génu); 3722-4905 oblasť obsahuje niekoľko klonovacích miest vrátane Xbal (poloha 3727) a spracovávací signál králičieho beta-globínového génu.Nucleotide sequence of pMRS30 expression vector. 1-1862 region corresponds to the Acc1 (position 504) - BamHI (position 3369) region of the pSV2CAT vector (EMBL M77788); The 2862-3721 region contains the human cytomegalovirus promoter (enhancer of the human cytomegalovirus major immediate-early gene); The 3722-4905 region contains several cloning sites including the XbaI (position 3727) and rabbit beta-globin gene processing signal.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Konštrukcia plazmidu pMRS166Construction of plasmid pMRS166

-11 ΒΤ20 nádorové bunky (ATCC HTB-19) sa kultivovali v Eagles MEM doplnenom s 10% fetálnym hovädzím sérom. Desať miliónov buniek sa trypsinizovalo, premylo s PBS a extrahovala sa mRNA.-11-20 tumor cells (ATCC HTB-19) were cultured in Eagles MEM supplemented with 10% fetal bovine serum. Ten million cells were trypsinized, washed with PBS, and mRNA extracted.

Alikvota tejto RNA sa podrobila RT-PCR (reverzná transkriptázová polymerázová reťazová reakcia) reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:An aliquot of this RNA was subjected to RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

Vil (5' GATCTCTAGAATGACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')Villa (5 'GATCTCTAGAATGACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')

V4 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCAACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3')V4 (5 'GATCTCTAGAAAGCTTATCAACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3')

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora, ktorý obsahuje humánny cytomegalovírusový promótor a beta-globínový polyadenylačný signál, ako je nárokované v patente č. WO9511982. Výsledný pMRS166 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136339 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzyme XbaI, was cloned into a pMRS30 expression vector containing a human cytomegalovirus promoter and a beta-globin polyadenylation signal as claimed in U.S. Pat. WO9511982. The resulting pMRS166 vector contains a DNA fragment comprising an ATG codon, a sequence corresponding to nucleotides 136339 of EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA.

Tento fragment je znázornený na obrázku 1.This fragment is shown in Figure 1.

Príklad 2Example 2

Konštrukcia plazmidu pMRS169Construction of plasmid pMRS169

Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa podrobila RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:An RNA aliquot obtained as in Example 1 was subjected to RT-PCR in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

VI2 (5' GATCTCTAGAATGGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')VI2 (5 'GATCTCTAGAATGGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')

VI5 (5' GGCGGTGGAGCCCGGGGCTGGCTTGT 3’)VI5 (5 'GGCGGTGGAGCCCGGGGCTGGCTTGT 3')

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Smal a Xbal, sa fúzoval, prostredníctvom Smal reštrikčného miesta, do DNA fragmentu, ktorý bol celý synteticky skonštruovaný a obsahuje sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 457-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Celý fragment sa potom klonoval do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS169 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes SmaI and XbaI, was fused, via the SmaI restriction site, to a DNA fragment which was entirely synthesized and contains a sequence partially corresponding to nucleotides 457-720 of EMBL sequence J05581 and two stop codons, TGA and TAA. The entire fragment was then cloned into the XbaI site of the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS169 vector contains a DNA fragment comprising an ATG codon, a sequence partially corresponding to nucleotides 205-720 of EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA.

Tento fragment je znázornený na obrázku 2.This fragment is shown in Figure 2.

-12Príklad 3-12Example 3

Konštrukcia plazmidu pMRS168Construction of plasmid pMRS168

Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa amplifikovala prostredníctvom RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:An RNA aliquot obtained as described in Example 1 was amplified by RT-PCR in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

VI3 (5' GATCTCTAGAATGGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')VI3 (5 'GATCTCTAGAATGGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')

V8 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3')V8 (5 'GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3')

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS168 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzyme XbaI, was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS168 vector contains a DNA fragment comprising an ATG codon, a sequence corresponding to nucleotides 631-1275 of EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA.

Tento fragment je znázornený na obrázku 3.This fragment is shown in Figure 3.

Príklad 4Example 4

Konštrukcia plazmidu pMRS167Construction of plasmid pMRS167

Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa podrobila RT-PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:An RNA aliquot obtained as described in Example 1 was subjected to RT-PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

VI4 (51 GATCTCTAGAATGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3')VI4 (5 1 GATCTCTAGAATGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3 ')

VI0 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGTTGGCAGAAGTGGCTGC 3') Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS167 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.VI0 (5 'GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGTTGGCAGAAGTGGCTGC 3') The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzyme XbaI, was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS167 vector contains a DNA fragment comprising an ATG codon, a sequence corresponding to nucleotides 1222-1497 of EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA.

Tento fragment je znázornený na obrázku 4.This fragment is shown in Figure 4.

Príklad 5Example 5

Konštrukcia plazmidu pMRS175Construction of plasmid pMRS175

Plazmidy pMRS166, 169, 168, 167 sa podrobili PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich nukleotidových párov.Plasmids pMRS166, 169, 168, 167 were subjected to a PCR reaction in the presence of the following nucleotide pairs.

V11 (pozri príklad 1)V11 (see Example 1)

-13V18 (5' AACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3') prepMRS166-13V18 (5 'AACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3') prepMRS166

V19 (5' GTGCCCAGCTGTACTGAGAAGAATGC 3')V19 (5 'GTGCCCAGCTGTACTGAGAAGAATGC 3')

V20 (5' GCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3') prepMRS169V20 (5 'GCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3') prepMRS169

V21 (51 GGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 31)V21 (5 1 GGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3 1 )

V22 (5' CAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3') prepMRS168V22 (5 'CAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3') prepMRS168

V23 (5' CTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCG 3')V23 (5 'CTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCG 3')

V10 (pozri príklad 4) pre pMRS167V10 (see Example 4) for pMRS167

Štyri DNA fragmenty získané v príslušných PCR reakciách sa zmiešali v ekvimolárnych množstvách a podrobili sa PCR reakcii v prítomnosti V11 a V10 oligonukleotidov.The four DNA fragments obtained in the respective PCR reactions were mixed in equimolar amounts and subjected to a PCR reaction in the presence of V11 and V10 oligonucleotides.

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený Xbal reštrikčným enzýmom, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS175 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny TGA a TAA.The DNA fragment produced, purified and digested with an XbaI restriction enzyme, was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS175 vector contains a DNA fragment comprising the ATG codon, a sequence partially corresponding to nucleotides 136-1497 of EMBL sequence J05581, and two stop codons TGA and TAA.

Príklad 6Example 6

Konštrukcia plazmidu pMRS171Construction of plasmid pMRS171

MCF7 nádorové bunky (ATCC HTB-22) sa kultivovali v Eagles MEM doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom. Desať miliónov buniek sa trypsinizovalo, premylo sa s PBS a extrahovala sa mRNA.MCF7 tumor cells (ATCC HTB-22) were cultured in Eagles MEM supplemented with 10% fetal calf serum. Ten million cells were trypsinized, washed with PBS and extracted with mRNA.

Alikvota RNA sa podrobila RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:An RNA aliquot was subjected to RT-PCR in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

UBlup (5' GATCTCTAGAATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGT 3')UBlup (5 'GATCTCTAGAATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGT 3')

UBIdown (5 ' TCACCAGCGAGACGGGCAACAGCCATGCACCACTACCGTGCCTCCCACCTCTG AGACGGAGCACCAGG 3')UBIdown (5 'TCACCAGCGAGACGGGCAACAGCCATGCACCACTACCGTGCCTCCCACCTCTG AGACGGAGCACCAGG 3')

Výsledkom reakcie je DNA fragment označovaný ako fragment 1.The result of the reaction is a DNA fragment referred to as fragment 1.

DNA z pGEX11T (Pharmacia) sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:DNA from pGEX11T (Pharmacia) was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

-14Laclup (5' CCTCCGTCTCAGAGGTGGGAGGCACGGTAGTGGTGCATGGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAAAAG 3')-14Laclup (5 'CCTCCGTCTCAGAGGTGGGAGGCACGGTAGTGGTGCATGGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAAAAG 3')

Lacldown (5’ gatcggatcctcgggaaacctgtcgtgccagctgc 31)Lacldown (5 'gatcggatcctcgggaaacctgtcgtgccagctgc 3 1 )

Výsledkom tejto reakcie je DNA fragment označovaný ako fragment 2.The result of this reaction is a DNA fragment referred to as fragment 2.

DNA fragmenty 1 a 2, získané v príslušných PCR reakciách, sa zmiešali v ekvimolárnych množstvách a podrobili sa PCR reakcii v prítomnosti UBlup a Lacldown oligonukleotidov.DNA fragments 1 and 2 obtained in the respective PCR reactions were mixed in equimolar amounts and subjected to a PCR reaction in the presence of UBlup and Lacldown oligonucleotides.

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa klonoval do komerčného plazmidu pUC18. Výsledný pMRS156 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci sekvenciu, ktorá kóduje ubiquitín fúzovaný so sekvenciou kódujúcou bakteriálnu beta-galaktozidázovú časť. Tento fragment, označovaný ako UBILacI, je znázornený na obrázku 6.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was cloned into the commercial plasmid pUC18. The resulting pMRS156 vector contains a DNA fragment comprising a sequence that encodes ubiquitin fused to a sequence encoding a bacterial beta-galactosidase portion. This fragment, referred to as UBILacI, is shown in Figure 6.

DNA plazmidu pMRS166 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:The plasmid pMRS166 DNA was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

V3 (5' GATCGGATCCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')V3 (5 'GATCGGATCCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')

V4 (pozri príklad 1)V4 (see example 1)

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS171 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 7.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was fused by ligation to two BamHI sites of the UBILacI fragment derived from the pMRS156 plasmid. The resulting fragment was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS171 vector contains a DNA fragment comprising the UBILacI sequence, the sequence corresponding to nucleotides 136-339 of the EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA. This fragment is shown in Figure 7.

Príklad 7Example 7

Konštrukcia plazmidu pMRS174Construction of plasmid pMRS174

DNA plazmidu pMRS169 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:The plasmid pMRS169 DNA was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

V5 (5' GATCGGATCCGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')V5 (5 'GATCGGATCCGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')

V6 (5 ' GATCTCTAGAAAGCTTATCAGCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3 1 )V6 (5 'GATCTCTAGAAAGCTTATCAGCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3 1 )

-15Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS174 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 8.The produced DNA fragment, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was fused by ligation to two BamHI sites of the UBILacI fragment derived from the pMRS156 plasmid. The resulting fragment was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS174 vector contains a DNA fragment comprising the UBILacI sequence, the sequence corresponding to nucleotides 205-720 of the EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA. This fragment is shown in Figure 8.

Príklad 8Example 8

Konštrukcia plazmidu pMRS173Construction of plasmid pMRS173

DNA plazmidu pMRS168 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:The plasmid pMRS168 DNA was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

V7 (5' GATCGGATCCGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')V7 (5 'GATCGGATCCGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')

V8 (pozri príklad 3)V8 (see example 3)

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS173 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 9.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was fused by ligation to two BamHI sites of the UBILacI fragment derived from the pMRS156 plasmid. The resulting fragment was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS173 vector contains a DNA fragment comprising the UBILacI sequence, the sequence corresponding to nucleotides 631-1275 of the EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA. This fragment is shown in Figure 9.

Príklad 8Example 8

Konštrukcia plazmidu pMRS172Construction of plasmid pMRS172

DNA plazmidu pMRS167 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:The plasmid pMRS167 DNA was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

V9 (5' GATCGGATCCCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3')V9 (5 'GATCGGATCCCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3')

V10 (pozri príklad 4)V10 (see Example 4)

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacIThe DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was fused by ligation to two BamHI sites of UBILacI.

-16fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS172 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 10.-16 fragment derived from the pMRS156 plasmid. The resulting fragment was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS172 vector contains a DNA fragment comprising the UBILacI sequence, the sequence corresponding to nucleotides 1222-1497 of the EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA. This fragment is shown in Figure 10.

Príklad 10Example 10

Konštrukcia plazmidu pMRS176Construction of plasmid pMRS176

DNA plazmidu pMRS167 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:The plasmid pMRS167 DNA was subjected to a PCR reaction in the presence of the following synthetic oligonucleotides:

V3 (pozri príklad 6)V3 (see example 6)

V10 (pozri príklad 4)V10 (see Example 4)

Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS176 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 11.The DNA fragment produced, purified and digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, was fused by ligation to two BamHI sites of the UBILacI fragment derived from the pMRS156 plasmid. The resulting fragment was cloned into the pMRS30 expression vector. The resulting pMRS176 vector contains a DNA fragment comprising the UBILacI sequence, the sequence corresponding to nucleotides 136-1497 of the EMBL sequence J05581, and two stop codons, TGA and TAA. This fragment is shown in Figure 11.

Príklad 11Example 11

Transformácia eukaryotických buniek a testovanie transkripcieTransformation of eukaryotic cells and transcription testing

CHO bunky (vaječníkové bunky čínskeho škrečka) sa kultivovali v alfa MEM doplnenom s ribonukleotidmi a deoxyribonukleotidmi v čase transfekcie.CHO cells (Chinese hamster ovary cells) were cultured in alpha MEM supplemented with ribonucleotides and deoxyribonucleotides at the time of transfection.

Dendritické bunky sa získali z CD34+ hemopoetických prekurzorov kultivovaných v IMDM bez séra, ktoré bolo doplnené s GM-CSF, IL4, SCF, Flt3 a TNFalfa. Po 7 dňoch sa získaná populácia buniek transfekovala.Dendritic cells were obtained from CD34 + hemopoietic precursors cultured in serum-free IMDM, supplemented with GM-CSF, IL4, SCF, Flt3 and TNFalpha. After 7 days, the cell population obtained was transfected.

Dendritické bunky sa získali z monocytov izolovaných z PBMC (periférne krvné mononukleárne bunky), kultivovali sa v RPMI doplnenom s FCS, GM-CSF a IL-4. Po 7 dňoch sa získaná populácia buniek transfekovala.Dendritic cells were obtained from monocytes isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells), cultured in RPMI supplemented with FCS, GM-CSF, and IL-4. After 7 days, the cell population obtained was transfected.

-17V každom prípade sa transfekovalo približne milión buniek s jedným z plazmidov uvedených v príkladoch 1 až 10. Transfekcia sa uskutočňovala použitím 3 pg plazmidovej DNA a 4 μί DMRIE (Gibco) lipofekciou.In each case, approximately one million cells were transfected with one of the plasmids listed in Examples 1 to 10. Transfection was performed using 3 µg plasmid DNA and 4 µί DMRIE (Gibco) lipofection.

Po 24 hodinách sa bunky zozbierali, premyli s PBS a lyžovali sa, aby sa extrahovala mRNA.After 24 hours, cells were harvested, washed with PBS and lysed to extract mRNA.

Alikvota mRNA sa podrobila RT-PCR reakcii v prítomnosti oligonukleotidového páru špecifického pre transfekovaný DNA plazmid.An mRNA aliquot was subjected to an RT-PCR reaction in the presence of an oligonucleotide pair specific for the transfected DNA plasmid.

Tento experiment sa uskutočňoval pre každý plazmid uvedený v príkladoch 1 až 10 použitím nasledujúcich oligonukleotidových párov: V11/V4 pre pMRS166, V12/V6 pre pMRS169, V13/V8 pre pMRS168, V4/V10 pre pMRS167, V4ZV10 pre PMRS175, UBIup/V4 pre pMRS171, UBIup/V6 pre pMRS174, UBIup/V8 pre pMRS173, UBIup/V10 pre pMRS172, V14/V10 pre pMRS176.This experiment was performed for each plasmid shown in Examples 1 to 10 using the following oligonucleotide pairs: V11 / V4 for pMRS166, V12 / V6 for pMRS169, V13 / V8 for pMRS168, V4 / V10 for pMRS167, V4ZV10 for PMRS175, UBIup / V4 for pMRS171, UBIup / V6 for pMRS174, UBIup / V8 for pMRS173, UBIup / V10 for pMRS172, V14 / V10 for pMRS176.

Ako reprezentatívny príklad znázorňuje obrázok 12 elektroforetickú analýzu DNA fragmentov získaných prostredníctvom RT-PCR z mRNA troch bunkových populácií transfekovaných plazmidom pMRS169. V tomto prípade bol použitý oligonukleotidový pár V12/V6.As a representative example, Figure 12 shows an electrophoretic analysis of DNA fragments obtained by RT-PCR from mRNA of three cell populations transfected with plasmid pMRS169. In this case, the V12 / V6 oligonucleotide pair was used.

Príklad 12Example 12

Výsledky in vivo štúdiíResults of in vivo studies

Pri in vivo štúdiách sa používali zmesi štyroch fragmentov a pMRS30 plazmid (vektor bez inzertu používaný ako negatívna kontrola). Aby sa otestovalo či nastala imunizácia, používal sa ELISA test na dokázanie špecifických antigénov voči humánnemu mucínu.In vivo studies used a mixture of four fragments and a pMRS30 plasmid (no insert vector used as a negative control). To test whether immunization occurred, an ELISA assay was used to detect specific antigens against human mucin.

In vivo štúdie sa uskutočňovali použitím transgénnych C57BL myší s humánnym MUC1. V dôsledku toho predstavoval v týchto zvieratách MUC1 proteín vlastný proteín. Využívaný vakcinačný režim pozostával z 3 intradermálnych (do chrbtovej časti, 50 pg DNA do každej strany) podaní ( v dňoch 0, 14, 28) 100 pg plazmidovej DNA. 14 dní po poslednom podaní sa zvieratá usmrtili a ich séra boli testované na obsah anti-humánnych mucínových protilátok.In vivo studies were performed using transgenic C57BL mice with human MUC1. As a result, the MUC1 protein was a self-protein in these animals. The vaccine regimen utilized consisted of 3 intradermal (in the back, 50 pg of DNA on each side) (on days 0, 14, 28) administration of 100 pg of plasmid DNA. 14 days after the last administration, the animals were sacrificed and their sera tested for anti-human mucin antibodies.

Testované fragmentové zmesi, predmet predloženého vynálezu, stimulovali v ošetrených zvieratách dobrú imunitnú odpoveď.The fragment fragments tested object of the present invention stimulated a good immune response in the treated animals.

r -18Na druhej strane sa uskutočňovali aj vakcinačné experimenty so 60aminokyselinovým peptidom zodpovedajúcim 20 aminokyselinám uvedeným na obrázku 2 od polohy 86 po polohu 105, ktoré sa tri krát opakovali (tento peptid sa označuje 3xTR).On the other hand, vaccination experiments were also performed with a 60 amino acid peptide corresponding to the 20 amino acids shown in Figure 2 from position 86 to position 105, which was repeated three times (this peptide is referred to as 3xTR).

Tieto dve vakcinácie sa líšia v type vyvolanej protilátkovej odpovede. Protilátkové titračné výsledky sú oveľa vyššie pri vakcinácii s 3xTR. Navyše zaznamenané IgG subtypy sú v prospech najmä humorálnej (protilátkovej) odpovede v prípade vakcinácie s 3xTR, a v prospech bunkovej odpovede (cytotoxickej) v prípade vakcinácie s DNA. Na protinádorovú terapiu je principiálne výhodná cytotoxická imunitná odpoveď. Keďže sa experimenty uskutočňovali v transgénnych myšiach, pre ktoré bol humánny mucín vlastný, môžeme predpokladať podobnú odpoveď u ľudí. Táto odpoveď by mohla oprávňovať použitie zlúčenín podľa predloženého vynálezu ako DNA vakcín na liečbu humánnych nádorov, v ktorých je nadmerne exprimovaný MUC1.These two vaccinations differ in the type of antibody response elicited. Antibody titration results are much higher when vaccinated with 3xTR. In addition, the IgG subtypes observed are in favor of a humoral (antibody) response in the case of 3xTR vaccination, and a cellular response (cytotoxic) in the case of DNA vaccination. A cytotoxic immune response is principally preferred for anti-tumor therapy. Since the experiments were carried out in transgenic mice for which human mucin was intrinsic, we can assume a similar response in humans. This response could justify the use of the compounds of the present invention as DNA vaccines for the treatment of human tumors in which MUC1 is overexpressed.

r r r r p ryy yy yy yy

-19Zoznam sekvencií <110> Menarini Ricerche S.p.A.-19 Sequence Listing <110> Menarini Ricerche S.p.A.

<120> Farmaceutický prostriedok obsahujúci fragmenty DNA kódujúcej antigénny proteín, ktorý má protinádorový účinok <130> 5653MEUR <140><120> A pharmaceutical composition comprising DNA fragments encoding an antigenic protein having an antitumor effect <130> 5653MEUR <140>

<141><141>

<150> MI98A002330 <151> 1998-10-30 <160> 35 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 213 <212> DNA <213> ľudská <400> 1<150> MI98A002330 <151> 1998-10-30 <160> 35 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 213 <212> DNA <213> human <400> 1

accacaggtt accacaggtt ccggtcatgc ccggtcatgc aagccccacc aagccccacc ccacctggag ccacctggag aaaacgagac aaaacgagac ttcccctacc ttcccctacc 60 60 cacagaagtt cacagaagtt cagtgcccag cagtgcccag ccccactcag ccccactcag aagaatcctg aagaatcctg tgactacgac tgactacgac cagcaacgta cagcaacgta 120 120 ccc:ccagcc ccc: ccagcc acagccccgg acagccccgg tccagcctcc tccagcctcc tccaccactc tccaccactc acgcacagga acgcacagga tcccactccg tcccactccg 180 180 gccccggcca gccccggcca cggaaccagc cggaaccagc tccaggccga tccaggccga taa taa 213 213

<210>2 <211 >525<210> 2 <211> 524

<212> DNA <213>ľudská <212> DNA <213> human <400> 2 <400> 2 a;cgcgccca and, cgcgccca gccccactga gccccactga gaagaatgcc gaagaatgcc gcgaccacga gcgaccacga ccagcagcgc ccagcagcgc accctccagc accctccagc 60 60 cacagccccg cacagccccg gctcajgcccc gctcajgcccc ccccaccacc ccccaccacc cagggacagc cagggacagc acgtcacccc acgtcacccc ggccccggcc ggccccggcc 120 120 acggaaccac acggaaccac cctcacgtcc cctcacgtcc agctgccacc agctgccacc tggggacagg tggggacagg atgccacctc atgccacctc ggccccaccc ggccccaccc ISO ISO accaggccag accaggccag ccccgggccc ccccgggccc caccaccccg caccaccccg ccagcccacg ccagcccacg acgccacctc acgccacctc agccccggac agccccggac 240 240 aacaagccag aacaagccag ccccgggaag ccccgggaag caccgctcca caccgctcca ccagcacacg ccagcacacg gcatcacctc gcatcacctc gcccccgcat gcccccgcat 300 300 accaggccgg accaggccgg ccccaagtag ccccaagtag caccgccccc caccgccccc cccgcccatg cccgcccatg ccgtcacatc ccgtcacatc tgccccggac tgccccggac 360 360 aacaggcccg aacaggcccg caccgcgcag caccgcgcag cacagcaccg cacagcaccg Ccagtacaca Ccagtacaca acgttactag acgttactag tgccccaggc tgccccaggc 420 420 cczgccagcg cczgccagcg gcccagcccc gcccagcccc tactccagcg tactccagcg cacaacggca cacaacggca cctccgcgcg cctccgcgcg cccgaccaca cccgaccaca 480 480 accccagcga accccagcga gcaagagcac gcaagagcac cccaccctca cccaccctca attcccagct attcccagct gataa Gataa S25 S25

<210>3 <211 >654 <212> DNA <213> ľudská <400> 3<210> 3 <211> 654 <212> DNA <213> human <400> 3

atgggcccag atgggcccag ctcctacccc ctcctacccc ggtccacaac ggtccacaac cgcacctctg cgcacctctg ccagggctac ccagggctac cacaacccca cacaacccca 60 60 gccagcaaga gccagcaaga gcactccatt gcactccatt ctcaattccc ctcaattccc agccaccact agccaccact ctgatactcc ctgatactcc taccaccctt taccaccctt 120 120 gccagccata gccagccata gcaccaagac gcaccaagac tgatgccagt tgatgccagt agcactcacc agcactcacc atagcacggt atagcacggt acctcctctc acctcctctc 180 180 acctccccca acctccccca atcacagcac atcacagcac ttctccccag ttctccccag ttgtctactg ttgtctactg gcgtctcttt gcgtctcttt ccttttcctg ccttttcctg 240 240 tcttttcaca tcttttcaca tctcaaacct tctcaaacct ccagtctaat ccagtctaat tcctctctgg tcctctctgg aagatcccag aagatcccag caccgactac caccgactac 300 300 taccaagagc taccaagagc tgcagagaga tgcagagaga catttctgaa catttctgaa atgtttttgc atgtttttgc agatttataa agatttataa acaagggggc acaagggggc 360 360 ttcctgggcc ttcctgggcc tcCccaatat tcCccaatat taagttcacg taagttcacg ccaggatctg ccaggatctg tggtggtaca tggtggtaca attgactctg attgactctg 420 420 gccctccgag gccctccgag aaggtaccat aaggtaccat caatgtccac caatgtccac gacgtggaga gacgtggaga cacagttcaa cacagttcaa tcaatataaa tcaatataaa 430 430 acgaaagcag acgaaagcag cctctcgata cctctcgata taacctgacg taacctgacg atctcagacg atctcagacg tcagcgtgag tcagcgtgag tgatgtgcca tgatgtgcca 540 540 cccccttcct cccccttcct ctgcccagtc ctgcccagtc tggggceggg tggggceggg gtgccaggct gtgccaggct gggccatcgc gggccatcgc gctgctggtg gctgctggtg 600 600 cccgtccetg cccgtccetg ttctgattgc ttctgattgc cctggccatt cctggccatt gtctatctca gtctatctca ttgccttccg ttgccttccg ataa ATAA 654 654

r r r er r r e

-21 <210>4 <211 >285 <212> DNA <213> ľudská <400>4-21 <210> 4 <211> 285 <212> DNA <213> Human <400> 4

atccccgegc atccccgegc tgcccCgtgC tgcccCgtgC tctggttgcg tctggttgcg ctcgccattg ctcgccattg tctatctcat tctatctcat tgccttcgct tgccttcgct 60 60 gcccgtcagG gcccgtcagG gccgccgaaa gccgccgaaa gaactacggg gaactacggg cacccggaca cacccggaca tctttccagc tctttccagc ccgggatacc ccgggatacc 120 120 caccatccca caccatccca cgagcgagta cgagcgagta ccccacctac ccccacctac cacacccacg cacacccacg ggcgctatgt ggcgctatgt gccccctagc gccccctagc 180 180 agcaccgatc agcaccgatc gcacccccta gcacccccta tgagaaagct tgagaaagct tctgcaggta tctgcaggta atggtggcag atggtggcag cagcctctct cagcctctct 240 240 Cacacaaacc Cacacaaacc cagcagccgc cagcagccgc agccacctct agccacctct gccaacttgt gccaacttgt oataa oataa 235 235

<210>5 <211> 1371 <210> 5 <211> 1371 <212> DNA <212> DNA <213> ľudská <213> human <400> 5 <400> 5 atgacaggcc cccgtcacgc atgacaggcc cccgtcacgc aagccctacc aagccctacc ccaggtcgag ccaggtcgag aaaaggagac aaaaggagac ctcggccacc ctcggccacc 60 60 cacagaagcc c ag —gcccag cacagaagcc c ag — gcccag ccccaccgag ccccaccgag aagaacgccg aagaacgccg ccagcacgac ccagcacgac cagcaccgca cagcaccgca 120 120 c:ccccac;c acagccccgg c: ccccac; c acagccccgg cccacgcccc cccacgcccc cccaccaccc cccaccaccc acggacagga acggacagga cgccaccctg cgccaccctg 180 180 gcccccgcca cggaaccagc gcccccgcca cggaaccagc cccaggctca cccaggctca gctgccaccc gctgccaccc ggggacagga ggggacagga tcecaccccg tcecaccccg 240 240 gtcccagtca ccaggccagc gtcccagtca ccaggccagc cctgggctcc cctgggctcc accaccccac accaccccac cagcccacga cagcccacga cgccacctca cgccacctca 300 300 cccccggaca acaagccagc cccccggaca acaagccagc cccgggaagt cccgggaagt accgccccac accgccccac cagcacacgg cagcacacgg cgctacctcg cgctacctcg 360 360 cccccggaca ccaggccgcc cccccggaca ccaggccgcc cccaggtagc cccaggtagc accgcccctc accgcccctc ccgcccatcc ccgcccatcc tcccacatcc tcccacatcc 420 420 cccccggaca acaggcccgc cccccggaca acaggcccgc atcgcgcagc atcgcgcagc acagcaccgc acagcaccgc cagcacacaa cagcacacaa cgttactact cgttactact 480 480 eccccagccc ccgccagcgg eccccagccc ccgccagcgg cccagcctct cccagcctct actccggccc actccggccc acaacggcac acaacggcac ccccgcgcgc ccccgcgcgc 540 540 gccaccacaa ccccacccag gccaccacaa ccccacccag caagaccact caagaccact ccatcctcaa ccatcctcaa tccccaccca tccccaccca ccactcccat ccactcccat 500 500 actcctacca czz.^zzzzz actcctacca czz. ^ zzzzz ctataccatt ctataccatt aacaccgact aacaccgact ct=ct=cc=t ct = ct = CC = t tcaccatagc tcaccatagc í □: í □: a:=::a:::c a: = a :: ::: c ctccaaccac ctccaaccac acaacííc'c acaacííc'c zzzs.=zzzzc zzzs. = zzzzc taccggggcc taccggggcc . 2 v . 2 v tctctctctt cctccccctc tctctctctt cctccccctc tcacatttca tcacatttca aacctccact aacctccact ttaattcctc ttaattcctc tccggaagat tccggaagat 7SC 7SC cccaccaccg accaccacca cccaccaccg accaccacca agacctgcag agacctgcag acagacactt acagacactt ctgaaatgtt ctgaaatgtt tttgcacatt tttgcacatt 840 840 tataaacaac ccagttttct tataaacaac ccagttttct gcccctctcc gcccctctcc aacactaact aacactaact tcaggccagg tcaggccagg atctgcggtc atctgcggtc 900 900 gcacaatcaa ctcccgcctC gcacaatcaa ctcccgcctC ccgagaaggt ccgagaaggt accatcaacc accatcaacc tccacgacgc tccacgacgc ggagacacag ggagacacag 960 960

r rr r

cccaaccacc cccaaccacc ataaaaccca ataaaaccca accagcctct accagcctct ccaCataacc ccaCataacc tgacgatccc tgacgatccc acaccccagc acaccccagc 1020 1020 gcgagccacg gcgagccacg tcccattCcc tcccattCcc tttcCctgcc tttcCctgcc cagCctggcg cagCctggcg cCgggctgcc cCgggctgcc acgctggggc acgctggggc 1080 1080 atcgcgccgc atcgcgccgc tcgcgctggc tcgcgctggc ccgcgttccg ccgcgttccg cccgcgccgg cccgcgccgg ccattgccca ccattgccca tcccattgcc tcccattgcc 1140 1140 ccggccgccc ccggccgccc gtcagcgccg gtcagcgccg ccgaaagaac ccgaaagaac tacgggcagc tacgggcagc tggacatctc tggacatctc tccagcccgg tccagcccgg 1200 1200 gacaccCacc gacaccCacc atcctatcag atcctatcag cgagtacccc cgagtacccc acctaccaca acctaccaca cccaCcggcg cccaCcggcg ctatgtgccc ctatgtgccc 1260 1260 cccagcagca cccagcagca ccgaccgcag ccgaccgcag cccccatgag cccccatgag aaggttcccg aaggttcccg caggtaaccg caggtaaccg cggcagcagc cggcagcagc 1320 1320 cccccecaca cccccecaca caaacccagc caaacccagc agtggcagcc agtggcagcc acttctgcca acttctgcca actcgcgata actcgcgata a and 1371 1371

<210>6 <211 >369 <212> DNA <213> ľudská <400> 6<210> 6 <211> 369 <212> DNA <213> human <400> 6

atgcagatct atgcagatct tcgtgaagac tcgtgaagac cctgactggc cctgactggc aacaccaCca aacaccaCca cCcCccaagC cCcCccaagC ggagccgagC ggagccgagC 60 60 gacaccaccg gacaccaccg agaacgccaa agaacgccaa ggcaaagacc ggcaaagacc caagacaacg caagacaacg aaggcacccc aaggcacccc CccCcaccag CccCcaccag 120 120 cagaggccca cagaggccca tcCCCgcagg tcCCCgcagg caagcagccg caagcagccg gaacaCgccc gaacaCgccc gcacccCCCc gcacccCCCc cgaccacaac cgaccacaac ISO ISO atccagaaag atccagaaag agcccacccc agcccacccc gcacccggcg gcacccggcg ccccgcccca ccccgcccca gagccccgac gagccccgac gcacggcagc gcacggcagc 240 240 cccgcatggc cccgcatggc tgecccccgt tgecccccgt ctcgcccgcg ctcgcccgcg aaaagaaaaa aaaagaaaaa ccaccccggc ccaccccggc gcccaacacc gcccaacacc 300 300 caaaccgccc caaaccgccc ctcccccccc ctcccccccc gccggccgac gccggccgac tcaccaaccc tcaccaaccc agcccccacg agcccccacg acacgCCCcc acacgCCCcc 360 360 cgaggaccc cgaggaccc 369 369

<210>7 <211 >579 <212> DNA <213> ľudská <400> 7 atgcagaccc tcgcgaagac cccgacccgc aagaccacca cccccgaagc ggagccgagC 60 gacaccaccg agaatgccaa ggcaaagacc caagacaacg aaggcacccc ccccgaccag 120 cagaggccca cccccccagg caagcagccg gaagaccgcc gcaccccccc Cgaccacaac 130 acccagaaac agcccacccc gcaccccccg ccccccccca gaggcccgag gcacggcagc 240<210> 7 <211> 579 <212> DNA <213> human <400> 7 atgcagaccc tcgcgaagac cccgacccgc aagaccacca cccccgaagc ggagccgagC 60 gacaccaccg agaatgccaa ggcaaagacc caagacaacg aaggcacccc ccccgaccag 120 cagaggccca cccccccagg caagcagccg gaagaccgcc gcaccccccc Cgaccacaac 130 acccagaaac agcccacccc gcaccccccg CCCCCCCCC gaggcccgag gcacggcagc 240

-23SS^Scacggc cgccccccgc cccgccggcg aaaagaaaaa ceaccccggc ccccaacacg 300 caaaccgccc ccecccgcgc gccggccgac ccaccaacgc agccggcacg acaggccccc 360 caaggaccca caggccccgg ccacgcaagc Cccaccccag ccggagaaaa ggagacttcg 420 gccacccaga gaagcccacc ccccagcccc accgagaaga acgccgcgag cacgaccacc 480 agcgcacccc ccagccacag ccccggccca ggccccccca ccacccagca acacgacccc 540 accccggccc cggccacgga accagcccca agccgacaa 579 <210>8 <211 >891 <212> DNA <213> ľudská <400> 8-23SS ^ Scacggc cgccccccgc cccgccggcg aaaagaaaaa ceaccccggc ccccaacacg 300 caaaccgccc ccecccgcgc gccggccgac ccaccaacgc agccggcacg acaggccccc 360 caaggaccca caggccccgg ccacgcaagc Cccaccccag ccggagaaaa ggagacttcg 420 gccacccaga gaagcccacc ccccagcccc accgagaaga acgccgcgag cacgaccacc 480 agcgcacccc ccagccacag ccccggccca ggccccccca ccacccagca acacgacccc 540 accccggccc cggccacgga accagcccca agccgacaa 579 <210> 8 <211> 891 <212> DNA <213> human <400> 8

aCccagaCcC aCccagaCcC ccgcgaagac ccgcgaagac cccgaccggc cccgaccggc aagaccatca aagaccatca ctctcgaagC ctctcgaagC ggagccgagC ggagccgagC 60 60 gacaccactg gacaccactg agaacgccaa agaacgccaa ggcaaagacc ggcaaagacc caaaacaagg caaaacaagg aaggcatccc aaggcatccc tčctgaccag tčctgaccag 120 120 cagaggccca cagaggccca cccttgcagg cccttgcagg caagcagcCg caagcagcCg gaagaCcgcc gaagaCcgcc gcactctttc gcactctttc CgacCacaac CgacCacaac 180 180 acccagaaag acccagaaag agcccacccc agcccacccc ccacccggcg ccacccggcg ccccgcccca ccccgcccca gaggcgggag gaggcgggag gcacggcagt gcacggcagt 240 240 ggcgcacggc ggcgcacggc cgCtgcccgc cgCtgcccgc cccgccggcg cccgccggcg aaaagaaaaa aaaagaaaaa ccaccctggc ccaccctggc gcccaatacg gcccaatacg 300 300 caaaccgccc caaaccgccc ctccccacgc ctccccacgc gccggccgac gccggccgac tcactaacgc tcactaacgc agccggcacg agccggcacg acacgccccc acacgccccc 360 360 cgaggatccg cgaggatccg tgcccagctc tgcccagctc tacegacaag tacegacaag aaCgctgcga aaCgctgcga gCaCgaccac gCaCgaccac caccgtacCc caccgtacCc 420 420 cccagccaca cccagccaca gccccggctc gccccggctc aggctcctcc aggctcctcc accacccagg accacccagg gacaggatgc gacaggatgc cactctcccc cactctcccc 480 480 ccggccacgg ccggccacgg aaccagcccc aaccagcccc aggctcagcC aggctcagcC cccacccggg cccacccggg gacaccaCgC gacaccaCgC caccCcggtc caccCcggtc 540 540 ccagccacca ccagccacca ggccagcccC ggccagcccC cggctccacc cggctccacc accccgccag accccgccag cccaccatgt cccaccatgt caccccagcc caccccagcc 600 600 ccggacaaca ccggacaaca agccagcccc agccagcccc gggaagcacc gggaagcacc cccccaccag cccccaccag cacacggcgC cacacggcgC taccccggcC taccccggcC 660 660 ccggatacca ccggatacca ccccggcccc ccccggcccc aggtagcacc aggtagcacc gccccccccg gccccccccg cccacggcgC cccacggcgC cacatctgcc cacatctgcc 720 720 ccggacaaca ccggacaaca cgcctgcaCt cgcctgcaCt cggcagcaca cggcagcaca gcaccgccag gcaccgccag cacacaacgc cacacaacgc caccacCgcc caccacCgcc 780 780 CcaggcCccg CcaggcCccg ctagcggctc ctagcggctc agcccccacc agcccccacc ccggcgcaca ccggcgcaca acggcaccCc acggcaccCc cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg 840 840 accacaaccc accacaaccc cagcgagcaa cagcgagcaa gagcacccca gagcacccca ttcecaattc ttcecaattc ccagctgata ccagctgata a and e9i e9i

<210> 9 <211> 1020 <212> DNA <213> ľudská<210> 9 <211> 1020 <212> DNA <213> human

-24+ r r f “ e Iť e r r r · <-24+ r r f “e It is r r r · <

r r - r- e i - t <400>9r r - r - e i - t <400> 9

atgcagatct atgcagatct tcgtgaagac tcgtgaagac cctgactcgt cctgactcgt aagaccatca aagaccatca ctctcaaagt ctctcaaagt cgacccgagt cgacccgagt 60 60 cacaccattg cacaccattg agaatgtcaa agaatgtcaa ggcaaagatc ggcaaagatc caagacaagg caagacaagg aaggcatccc aaggcatccc Ccctcaccag Ccctcaccag 120 120 cagaggctca cagaggctca tctttgcagg tctttgcagg caagcagcca caagcagcca gaagatcgcc gaagatcgcc ccactctttc ccactctttc tgactacaac tgactacaac ISO ISO atccagaaag atccagaaag agtccaccct agtccaccct gcacctggtg gcacctggtg ctccgtctca ctccgtctca gagctcggag gagctcggag gcacggtagt gcacggtagt 240 240 ggtgcatggc ggtgcatggc tgttgcccgt tgttgcccgt ctcgccggtc ctcgccggtc aaaagaaaaa aaaagaaaaa ccaccctggc ccaccctggc gcccaatacg gcccaatacg 300 300 caaaccgcct caaaccgcct ctccccgcgc ctccccgcgc gttcgccgat gttcgccgat tcattaatgc tcattaatgc agctagcacg agctagcacg acaggtttcc acaggtttcc 360 360 ccaggatccg ccaggatccg gctcagcttc gctcagcttc tactccggcc tactccggcc cacaacggca cacaacggca cctctgccag cctctgccag ggccaccaca ggccaccaca 420 420 accccagcca accccagcca ccaagagcac ccaagagcac tccactctca tccactctca acccccagcc acccccagcc accactctga accactctga tacccctacc tacccctacc 480 480 acccttccca acccttccca cccatagcac cccatagcac caagactgat caagactgat cccagcagca cccagcagca cccaccatag cccaccatag cacagtacct cacagtacct 540 540 cctctcacct cctctcacct cccccaatca cccccaatca cagcacttct cagcacttct ccccacctgc ccccacctgc ccactggggc ccactggggc ccctttctct ccctttctct 600 600 ttCCtgtCtt ttCCtgtCtt ttcacatttc ttcacatttc SaäCZZCCä^ SaäCZZCCä ^ tttaattcct tttaattcct ctctggaaga ctctggaaga tc:cagca:c tc: CAGC c 650 650 gactactacc gactactacc aaaagctgca aaaagctgca gagagacacc gagagacacc tctgaaatgt tctgaaatgt ttttccagac ttttccagac ttataaacaa ttataaacaa 720 720 gggggttttc gggggttttc tcgccctctc tcgccctctc caacactaag caacactaag ttcaagccag ttcaagccag gatctgcggt gatctgcggt cgtacaattg cgtacaattg 780 780 actctggcct actctggcct cccgagaagc cccgagaagc taccatcaat taccatcaat gtccaccacg gtccaccacg cggagacaca cggagacaca gctcaaccag gctcaaccag 840 840 tataaaacgg tataaaacgg aagcagcctc aagcagcctc tcgatacaac tcgatacaac ctaacgatcc ctaacgatcc cagacgtcag cagacgtcag cgcgagtgat cgcgagtgat 900 900 gtgccatttc gtgccatttc ctttctctgc ctttctctgc ccagcccgcg ccagcccgcg cctgcggccc cctgcggccc caggcCcggg caggcCcggg catcgcgccg catcgcgccg 960 960 ctggcgctgg ctggcgctgg tccgtgctcc tccgtgctcc ggccccgctg ggccccgctg gccacccccc gccacccccc atctcaccgc atctcaccgc cctgtgataa cctgtgataa 1020 1020

<210> 10 <211 >651 <212> DNA <213> ľudská<210> 10 <211> 651 <212> DNA <213> human

<400> 10 <400> 10 atgcagatct atgcagatct tcgtgaagac tcgtgaagac cctgactcgt cctgactcgt aagaccatca aagaccatca ctctccaact ctctccaact cgacccgagt cgacccgagt 60 60 cacaccaccg cacaccaccg agaatgtcaa agaatgtcaa ggcaaagatc ggcaaagatc caagacaagg caagacaagg aaggcatccc aaggcatccc tcctcaccag tcctcaccag 120 120 cagaggctca cagaggctca tctctgcagg tctctgcagg caagcacctg caagcacctg gaagatggcc gaagatggcc ccactctttc ccactctttc tgactacaac tgactacaac 180 180 atccagaaag atccagaaag agtccaccct agtccaccct ccacccggtg ccacccggtg ctccgtctca ctccgtctca caggtgggag caggtgggag gcacggtagt gcacggtagt 240 240 ggtgcatggc ggtgcatggc tgttgcccgt tgttgcccgt ctcgccggta ctcgccggta aaaagaaaaa aaaagaaaaa ccaccctggc ccaccctggc gcccaatacg gcccaatacg 300 300 caaaccgcct caaaccgcct ctccccgcgc ctccccgcgc gttggccaat gttggccaat tcattaatgc tcattaatgc agctggcacg agctggcacg acaggtttcc acaggtttcc 360 360 cgaggatccc cgaggatccc tggtgecggt tggtgecggt ccccgttctg ccccgttctg gttgcgctcg gttgcgctcg ccattgtcta ccattgtcta tctcattgcc tctcattgcc 420 420 ttggctgtct ttggctgtct gtcagtgccg gtcagtgccg ccgaaagaac ccgaaagaac taccgccagc taccgccagc tggacatctt tggacatctt tccagcccgg tccagcccgg 480 480 catacctacc catacctacc accctatgag accctatgag cgagcacccc cgagcacccc acctaccaca acctaccaca cccacgagcg cccacgagcg ctatgtgccc ctatgtgccc 540 540 cctaccagta cctaccagta ccgatcctag ccgatcctag cccctataag cccctataag aacctttctg aacctttctg cacctaatcc cacctaatcc tcacaccacc tcacaccacc 600 C 5 1 600 C 5 1 caaacccag»- caaacccag »- agtggcagcc agtggcagcc acctccgcca acctccgcca a and

<210> 11 <211> 1737 <212> DNA <213> ľudská r ·-25<400> 11<210> 11 <211> 1737 <212> DNA <213> human r -25 <400> 11

atgcagacct atgcagacct tcgtgaagac tcgtgaagac cctgactggt cctgactggt aagaccatca aagaccatca ctctcgaagt ctctcgaagt cgagccgagt cgagccgagt 60 60 cacaccattg cacaccattg agaatgccaa agaatgccaa cgcaaagatc cgcaaagatc caagacaagg caagacaagg aagccatccc aagccatccc tcctgaccag tcctgaccag 120 120 cagaggctca cagaggctca tctttgcagg tctttgcagg caagcagccg caagcagccg caagatggcc caagatggcc gcaccccctc gcaccccctc tgaccacaac tgaccacaac 180 180 atccagaaag atccagaaag agcccacccc agcccacccc gcacctggcg gcacctggcg ccccgcccca ccccgcccca gacgcgggag gacgcgggag gcacggcagt gcacggcagt 240 240 ggcgcatcgc ggcgcatcgc tgtcgcccgt tgtcgcccgt cccgctggcg cccgctggcg aaaagaaaaa aaaagaaaaa ccaccctccc ccaccctccc gcccaatacg gcccaatacg 300 300 caaaccgcct caaaccgcct ctccccacgc ctccccacgc cctggccgat cctggccgat tcattaatge tcattaatge agccggcacg agccggcacg acaggcttcc acaggcttcc 360 360 cgaggaccca cgaggaccca caggccccgg caggccccgg ccacgcaagc ccacgcaagc tccaccccag tccaccccag ctcgagaaaa ctcgagaaaa ggagacttcg ggagacttcg 420 420 gccacccaga gccacccaga gaagttcagt gaagttcagt gcccagcccc gcccagcccc actgagaaga actgagaaga acgctgtgag acgctgtgag CaCcaccacc CaCcaccacc 430 430 agcgcacccc agcgcacccc ccagccacag ccagccacag ccccggttca ccccggttca gccccctcca gccccctcca ccactcaggg ccactcaggg acacgatctc acacgatctc 540 540 accctgcccc accctgcccc cggccacgga cggccacgga accagcccca accagcccca ggttcagcĽg ggttcagcĽg ccacccgggg ccacccgggg acaggacgcc acaggacgcc 600 600 accccggtcc accccggtcc cagccaccag cagccaccag gccagccccg gccagccccg ggccccacca ggccccacca ccccgccagc ccccgccagc ccacgacgcc ccacgacgcc 660 660 accccagccc accccagccc cagacaacaa cagacaacaa cccagccccg cccagccccg ggaagcaccg ggaagcaccg ccccaccagc ccccaccagc acacggcgcc acacggcgcc 720 720 accccggccc accccggccc cggacaccag cggacaccag gccggcccca gccggcccca ggcagtaccg ggcagtaccg ccccccccgc ccccccccgc ccacggcgtc ccacggcgtc 780 780 acatccgccc acatccgccc cggacaacac cggacaacac ccctgcaccg ccctgcaccg ggtagcacag ggtagcacag caccgccagc caccgccagc acacaacgct acacaacgct 840 840 accagtgccc accagtgccc caggccccgc caggccccgc cagccgctca cagccgctca gcccccaccc gcccccaccc cggcgcacaa cggcgcacaa cggcaccccc cggcaccccc 900 900 gcgcgcgcga gcgcgcgcga ccacaa'cccc ccacaa'cccc accgagcaag accgagcaag agcaccccac agcaccccac ccccaatccc ccccaatccc cagccaccac cagccaccac 960 960 tctgatactc tctgatactc ceaccaccct ceaccaccct tgccagccat tgccagccat agcaccaaga agcaccaaga ccgacgccáa ccgacgccáa tagcactcac tagcactcac 1020 1020 cacagcacgg cacagcacgg cacctccccc cacctccccc cacccccccc cacccccccc aaccacagca aaccacagca ccccccccca CCCCCCCCC gccgcctacc gccgcctacc 1080 1080 gcggcccctc gcggcccctc ccccttccct ccccttccct gtctctccac gtctctccac ačtccaaacc ačtccaaacc tccagtttaa tccagtttaa tccccctctg tccccctctg 1140 1140 gaagatccca gaagatccca gcaccgacta gcaccgacta ccaccaagag ccaccaagag ccgcagagag ccgcagagag acatccctga acatccctga aatgcctccg aatgcctccg 1200 1200 cagatccata cagatccata aacaagggcg aacaagggcg ccccctgggc ccccctgggc c:c;ccaata C: C ccaata ttaagttcag ttaagttcag cccaggatct cccaggatct 1250 1250 gcggcggcac gcggcggcac aa:cgac::c aa: CGAC :: C cgccccccga cgccccccga gaaggcacca gaaggcacca ccaacgccca ccaacgccca cgacgcgcag cgacgcgcag 1320 1320 acacagttca acacagttca atcagtataa atcagtataa aacggaagca aacggaagca gcctcccgat gcctcccgat ataacctgac ataacctgac gateteagae gateteagae 13S0 13s0 etcagcgtga etcagcgtga gcgatgtgcc gcgatgtgcc atttccctcc atttccctcc tctgcccagt tctgcccagt ctggggctgg ctggggctgg agcgccsggc agcgccsggc 1440 1440 tggcgcatcg tggcgcatcg cgctgctggt cgctgctggt gctggtctgt gctggtctgt gttctggttg gttctggttg cgctggccat cgctggccat tgtctatctc tgtctatctc 1500 1500 attgccttgg attgccttgg ccgtctgtca ccgtctgtca gtgccgccga gtgccgccga aagaactacg aagaactacg ggcagctgga ggcagctgga catctttcca catctttcca 1560 1560 gcccgggata gcccgggata cctaccatcc cctaccatcc tatgagcgag tatgagcgag taccccacct taccccacct accacaccca accacaccca tcggcgctat tcggcgctat 1620 1620 gcccccccta gcccccccta gcactaccga gcactaccga ccgcagcccc ccgcagcccc tatcagaagg tatcagaagg tttctgcagc tttctgcagc taatcgtgcc taatcgtgcc 1680 1680 agcagcccct agcagcccct cttacacaaa cttacacaaa cccaccagtg cccaccagtg gcagccacct gcagccacct ctgccaactt ctgccaactt gtcataa gtcataa 1737 1737

<210> 12 <211 >4905 <212> DNA <213> ľudská <400> 12<210> 12 <211> 4905 <212> DNA <213> human <400> 12

ccaggaagct ccaggaagct cctctgtgtc cctctgtgtc ctcataaacc ctcataaacc ctaacctcct ctaacctcct ctacttgaga ctacttgaga cgacattcca cgacattcca 60 60 accataggct accataggct gcccatccac gcccatccac cctctgtgtc cctctgtgtc ctcctgctaa ctcctgctaa ttaggtcact ttaggtcact taacaaaaac taacaaaaac 120 120 caaactgggt caaactgggt agggcttttt agggcttttt cacacaccgc cacacaccgc tttctaaggg tttctaaggg taattttaaa taattttaaa atatctggga atatctggga 130 130 agccccttcc agccccttcc actgctgcgt actgctgcgt tccagaactg tccagaactg ttcgtaaaca ttcgtaaaca gcccacaaat gcccacaaat gtcaacagca gtcaacagca 240 240 gaaacataca gaaacataca agctgtcagc agctgtcagc tttgcacaag tttgcacaag ggcccaacac ggcccaacac cctgctcatc cctgctcatc aagaagcact aagaagcact 300 300 ccggttgctc ccggttgctc tgttagtaat tgttagtaat gtccaaaaca gtccaaaaca ggaggcacat ggaggcacat tttccccacc tttccccacc tctgtaggtt tctgtaggtt 360 360 ccaaaatatc ccaaaatatc tagtgttttc tagtgttttc atttttactt atttttactt cgatcaggaa cgatcaggaa cccagcactc cccagcactc cactcgataa cactcgataa 420 420 geattatcct geattatcct tatccaaaac tatccaaaac agccttgtcg agccttgtcg tcagcgtcca tcagcgtcca tctgctgact tctgctgact gtcaactata gtcaactata 4S0 4S0 ccattttttg ccattttttg gggttacagt gggttacagt ttgagcagga ttgagcagga tatttggtcc tatttggtcc tgtagtctgc tgtagtctgc taacacaccc taacacaccc 540 540 tccagctcca tccagctcca aaggttcccc aaggttcccc accaacacca accaacacca aaaaaacgaa aaaaaacgaa aatttgaccc aatttgaccc ttcaatggct ttcaatggct 600 600 ttcccagcac ttcccagcac caccctcatg caccctcatg agtcttttgt agtcttttgt gtccccgaat gtccccgaat gcaagtetaa gcaagtetaa catagcagtc catagcagtc 660 660 accccaataa accccaataa cctcagtttt cctcagtttt aacagcaaca aacagcaaca gccccccaca gccccccaca tcaaaatact tcaaaatact tccacacgtt tccacacgtt 720 720 aactcctcat aactcctcat ttaaattacc ttaaattacc caaaggaatt caaaggaatt cttgaagacg cttgaagacg aaagggccec aaagggccec gtcatacgcc gtcatacgcc 7S0 7s0 tattttcata tattttcata ggtcaatgtc ggtcaatgtc atgataataa atgataataa tggcttctta tggcttctta gacgtcaggt gacgtcaggt gccacetttc gccacetttc 840 840 cgggaaatgt cgggaaatgt ccgcggaacc ccgcggaacc cctatttgtt cctatttgtt tatttttcta tatttttcta aatacattca aatacattca aatatgtatc aatatgtatc 900 900 cgctcatgag cgctcatgag acaataaccc acaataaccc tgataaatgc tgataaatgc ttcaataata ttcaataata tcgaaaaagg tcgaaaaagg aagageatca aagageatca 960 960 g t a t LcScCä g t and t LcScCä tctccgtgtc tctccgtgtc gcccttactc gcccttactc cccttcccgc cccttcccgc ggcatettgc ggcatettgc cttcctgttt cttcctgttt 1020 1020 ttcctcaccc ttcctcaccc agaaacgctg agaaacgctg ccgaaagtaa ccgaaagtaa aagacgccga aagacgccga agaecagetg agaecagetg cgtgcacgag cgtgcacgag 1030 1030 tgggttacat tgggttacat cgaactggat cgaactggat cccaacagcg cccaacagcg gtaagatcct gtaagatcct tgagagtttt tgagagtttt cgccccgaag cgccccgaag 1140 1140 aacgttttcc aacgttttcc aatgatgagc aatgatgagc acttttaaag acttttaaag ttcccccatg ttcccccatg tggcgcggta tggcgcggta Ctatcccgtc Ctatcccgtc 1200 1200 tccacgccgg tccacgccgg gcaagagcaa gcaagagcaa cccggccgcc cccggccgcc gcacacacca gcacacacca ttctcagaat ttctcagaat gacttggttg gacttggttg 1260 1260 agtactcacc agtactcacc agtcacagaa agtcacagaa aagcatctta aagcatctta cggatggcat cggatggcat gacagtaaga gacagtaaga gaattatcca gaattatcca 1320 1320 gtgctgccac gtgctgccac aaccatgagc aaccatgagc gataacactg gataacactg cggccaacct cggccaacct actcccgaca actcccgaca accatcggag accatcggag 1380 1380 gacccaacga gacccaacga gctaaccgct gctaaccgct tctctgcaca tctctgcaca acatcgggga acatcgggga tcatgcaact tcatgcaact cgccttgatc cgccttgatc 1440 1440 gttgggaacc gttgggaacc ggagctgaat ggagctgaat gaagccatac gaagccatac caaacgacga caaacgacga gcgtgaeacc gcgtgaeacc acgatccctg acgatccctg 1SC0 1SC0 cagcaatggc cagcaatggc aacaaccttg aacaaccttg cgcaaactat cgcaaactat taaccgccga taaccgccga actactcact actactcact ctaccctccc ctaccctccc 15 = 0 15 = 0 ggcaacaatt ggcaacaatt aatagactgg aatagactgg atggaggcgg atggaggcgg acaaacctgc acaaacctgc aagaccactt aagaccactt ctgcgcccgg ctgcgcccgg 1620 1620 cccttcccgc cccttcccgc cggccggtct cggccggtct attgctgata attgctgata aacctgcagc aacctgcagc cggtgagcgt cggtgagcgt ccctctcgcc ccctctcgcc 1630 1630 gtatcattgc gtatcattgc agcaccaggg agcaccaggg ccagatcgca ccagatcgca agccctcccg agccctcccg tatcgcagtc tatcgcagtc atctacacga atctacacga 1740 1740 cggggagcca cggggagcca ggcaactatg ggcaactatg gatcaacgaa gatcaacgaa atagacagat atagacagat egetgagata egetgagata ggtgcctcac ggtgcctcac 1800 1800 tgattaacca tgattaacca ttggtaactg ttggtaactg tcagaccaag tcagaccaag tttactcata tttactcata tatactttag tatactttag attgattcaa attgattcaa 1860 1860 aacctcattt aacctcattt ttaatttaaa ttaatttaaa aggatccagg aggatccagg egaagatcct egaagatcct tctcgataat tctcgataat cccatgacca cccatgacca 1920 1920 aaatccctca aaatccctca acgtgagcct acgtgagcct tccctccact tccctccact caccgtcaga caccgtcaga ccccgtagaa ccccgtagaa aagatcaaag aagatcaaag 1930 1930 catcttcttg catcttcttg cttctccccg cttctccccg taatctcctg taatctcctg cctgcaaaca cctgcaaaca aaaaaaccac aaaaaaccac 2 04 0 2 04 0 cgctaccacc cgctaccacc ttgccggatc ttgccggatc aagagcxacc: aagagcxacc: ccgaacgtaa ccgaacgtaa M _ w w M _ w w ccggccccag ccggccccag cagag=gcäc cagag = GCAC azaccaaa.a azaccaaa.a c-gccctzcc- c-gccctzcc- 21í: 21i: accacttcaa accacttcaa gaactcccca gaactcccca ccaccgccca ccaccgccca cat^acctcgc cat ^ acctcgc cctgccaatc cctgccaatc c^gcuäcc&g c ^ g & gcuäcc 222C 222C tggctgctgc tggctgctgc cagtggcgat cagtggcgat aactcgtgtc aactcgtgtc ttacccggct ttacccggct cgactcaaga cgactcaaga cgatagttac cgatagttac 2260 2260 cggataaggc cggataaggc gcagcgctcg gcagcgctcg ggctgaacgg ggctgaacgg cgggetegtg cgggetegtg cacacagccc cacacagccc agcttggagc agcttggagc 2340 2340 gaaccacci.a gaaccacci.a caccgaactg caccgaactg agatacctac agatacctac agegegaget agegegaget aegagaaagc aegagaaagc gccacacttc gccacacttc 2400 2400 ccgaagcgag ccgaagcgag aaaggcggac aaaggcggac aggtatccgg aggtatccgg taagcggcag taagcggcag ggtcggaaca ggtcggaaca ggagagegea ggagagegea 2460 2460 cgagcgagct cgagcgagct tccaggggga tccaggggga aacgcccgct aacgcccgct atctttatag atctttatag tcctgtcggg tcctgtcggg tttccccacc tttccccacc 2520 2520 tccgactcaa tccgactcaa gcgccgatct gcgccgatct ttgtgatgct ttgtgatgct cgtcacgggg cgtcacgggg gcggagccta gcggagccta tcgaaaaacg tcgaaaaacg 2580 2580 ccagcaacgc ccagcaacgc ggccttttca ggccttttca ccgctcctgg ccgctcctgg ccttctgctg ccttctgctg cccctttgct cccctttgct cacatgttct cacatgttct 2640 2640 ttcctgcctt ttcctgcctt atcccctgat atcccctgat tctgtggata tctgtggata accgtattac accgtattac cccctttgag cccctttgag tgagctgata tgagctgata 2700 2700

r * · r r rr * · r r r

ccgctzcgcca ccgctzcgcca cagccgaacg cagccgaacg accgagcgca accgagcgca gcgagccagt gcgagccagt gagcgaggaa gagcgaggaa gcggaagagc gcggaagagc 2760 2760 gcccgacgcg gcccgacgcg gcatcccctc gcatcccctc ctcacgcatc ctcacgcatc tgtgcggcac tgtgcggcac ttcacaccgc ttcacaccgc atatcgcgca atatcgcgca 2820 2820 cccCcagtac cccCcagtac aacctgcGcc aacctgcGcc gacgccgcat gacgccgcat £CCtä3CCCd £ CCtä3CCCd gtacacaatc gtacacaatc aatattcgcc aatattcgcc 23=0 23 = 0 atcagccaCa atcagccaCa ttattcactg ttattcactg gttatatagc gttatatagc acaaaccaat acaaaccaat accggctatt accggctatt ggccatcgca ggccatcgca 2.-4 0 2.-4 0 tacgCtgtac tacgCtgtac ccatatcata ccatatcata acatgtacac acatgtacac ttacaccggc ttacaccggc Ccacgtccaa Ccacgtccaa cattaccgcc cattaccgcc 3000 3000 acgccgacat acgccgacat tgaccaccga tgaccaccga ctacctacca ctacctacca acagcaazca acagcaazca attacggcgt attacggcgt cattagctca cattagctca 3060 3060 cagcccacac cagcccacac accgagcccc accgagcccc gcgccacaca gcgccacaca acccacggca acccacggca aacggcccgc aacggcccgc ctggccgacc ctggccgacc 3120 3120 gcccaacgac gcccaacgac ccccgcccac ccccgcccac tgacgtcaac tgacgtcaac aatgacgcat aatgacgcat gcccccatag gcccccatag taacgccaať taacgccaať 3180 3180 agggacCCCc agggacCCCc caccgacgcc caccgacgcc aacgggcgga aacgggcgga gcacctacgg gcacctacgg taaactgccc taaactgccc acttgccagt acttgccagt 3240 3240 acaccaagcg acaccaagcg tatcacatgc tatcacatgc caagcacgcc caagcacgcc ccccatcgac ccccatcgac gtcaatgacc gtcaatgacc gtaaatcgcc gtaaatcgcc 3300 3300 cccccagcac cccccagcac tacgcccagc tacgcccagc acacgacctt acacgacctt acgggaccct acgggaccct cctacctgcc cctacctgcc agtacaccta agtacaccta 3360 3360 cgcatcagtc cgcatcagtc atcgctatta atcgctatta ccatggtgat CCATGGTG gcggttCCgg gcggttCCgg cagtacatca cagtacatca atgggcgtgg atgggcgtgg 3420 3420 acagcggcct acagcggcct gactcacggc gactcacggc catttccaag catttccaag tctccacccc tctccacccc attgacgtca attgacgtca atgggagctc atgggagctc 3480 3480 gcrccggcac gcrccggcac caaaaCcaac caaaaCcaac cagactCtcc cagactCtcc aaaatgtcgt aaaatgtcgt aacaactccg aacaactccg ccccatcgac ccccatcgac 3540 3540 claaatgggc claaatgggc cgcaggcgcg cgcaggcgcg tacggcggga tacggcggga agtctatata agtctatata agcagagccc agcagagccc ctttactgaa ctttactgaa 3500 3500 ccgccagacc ccgccagacc gcctggagac gcctggagac gccatccacg gccatccacg ccccccccac ccccccccac ctccatagaa ctccatagaa gacaccggga gacaccggga 3660 3660 ccgaCccagc ccgaCccagc cCccgcggcc cCccgcggcc gggaacggtg gggaacggtg catcggaacg catcggaacg cggattcccc cggattcccc ctgccaagaa ctgccaagaa 3720 3720 agcccgccca agcccgccca gaacccggga gaacccggga gagctcctga gagctcctga caacctcagg caacctcagg gtgagtccgg gtgagtccgg ccacccctga ccacccctga 3780 3780 ccccccCCCc cccccccccc ccctccacca ccctccacca ttgcaaaatc ttgcaaaatc catgtcacac catgtcacac cgagggegca cgagggegca aagctttcag aagctttcag 3840 3840 agzgccgccc agzgccgccc agaatggcaa agaatggcaa gatgcccctt gatgcccctt gcatcaccat gcatcaccat ggacccccac ggacccccac gacaatctcg gacaatctcg 3900 3900 ccccccccac ccccccccac cccccacccc cccccacccc gctgacaacc gctgacaacc accgccccct accgccccct cttattttct cttattttct tcccaccccc tcccaccccc 3960 3960 cgcaaccccc cgcaaccccc ccgttaaact ccgttaaact tcagcctgca tcagcctgca tccgcaacga tccgcaacga atttttaaat atttttaaat tcacccccgt tcacccccgt 4020 4020 ccacccgcca ccacccgcca gattgtaagc gattgtaagc actctctcta actctctcta atcacccctc atcacccctc tttcaacgca tttcaacgca accacggcat accacggcat 4080 4080 accacaccgc accacaccgc accccagcac accccagcac agctttagag agctttagag aacaaccgtc aacaaccgtc ataattaaat ataattaaat gataaggtag gataaggtag 4140 4140 aacacccccg aacacccccg cacacaaacc cacacaaacc ccggccggcg ccggccggcg cggaaacacc cggaaacacc cccaccggca cccaccggca gaaacaacta gaaacaacta 4200 4200 caccccggcc caccccggcc accaccccgc accaccccgc ccccccctcc ccccccctcc acggccacaa acggccacaa tgatatacac tgatatacac tgcccgagac tgcccgagac 4260 4260 gagcacaaaa gagcacaaaa tactccgagc tactccgagc ccaaaccggg ccaaaccggg cccccccgct cccccccgct aaccatgttc aaccatgttc acgcccccct acgcccccct 4320 4320 c:::cccc:a ::: c cccc: and cagcccccgg cagcccccgg gcaacgtgcc gcaacgtgcc cgccgccccg cgccgccccg ccgcctcatc ccgcctcatc attttgccaa attttgccaa 4380 4380 agaacccacc agaacccacc ccccaggcgc ccccaggcgc aggctgccca aggctgccca ccagaaggcg ccagaaggcg gcggccggtg gcggccggtg Cgcccaacgc Cgcccaacgc 4440 4440 cccggcccac cccggcccac aaacaccacc aaacaccacc aagacccccc aagacccccc cccccccgcc cccccccgcc aaaaattatg aaaaattatg gagacaccat gagacaccat 4500 4500 gaagcccccc gaagcccccc gagcatccga gagcatccga cccccggcca cccccggcca ataaaggaaa ataaaggaaa tttatcttca tttatcttca Ctgcaatagt Ctgcaatagt 4560 4560 gccccggaae gccccggaae cccccgcgcc cccccgcgcc ccccacccgg ccccacccgg aaggacacac aaggacacac gcgagcgcaa gcgagcgcaa atcattcaaa atcattcaaa 4620 4620 acaccagaac acaccagaac gagcacccgg gagcacccgg cccagagccc cccagagccc ggcaacacac ggcaacacac gccacatgcc gccacatgcc ggccgccata ggccgccata 4580 4580 aacaaacgcg aacaaacgcg gctaCaaaga gctaCaaaga ccccaccagt ccccaccagt atacgaaaca atacgaaaca cccccccgct cccccccgct gcccactccc gcccactccc 4740 4740 caccccacag caccccacag aaaacccccg aaaacccccg acccgagccc acccgagccc acacccccct acacccccct tatactctgt tatactctgt ttCccgctat ttCccgctat 4800 4800 aacaxcccxa aacaxcccxa aaaccttcct aaaccttcct actagccaga actagccaga cctttcctcc cctttcctcc 4 3 60 4 3 60

<210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

r -28<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 13 gatcggatcc acaggttctg gtcatgcaag c 31 <210> 14 <211 >41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>r -28 <223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 13 gatcggatcc acaggttctg gtcatgcaag c 31 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 14 gatctctaga aagcttatca acctgaagct ggttccgtgg c 41 <210> 15 <211 >36 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 14 gatctctaga aagcttatca acctgaagct ggttccgtgg c 41 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 15 gatcggatcc gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 36 <210> 16 <211 >49 <212> DNA <213> umelá sekvencia • r<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 15 gatcggatcc gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 36 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence • r

-29<220>-29 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 16 gatctctaga aagcttatca gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 49 <210> 17 <211 >40 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 16 gatctctaga aagcttatca gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 49 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 17 gatcggatcc ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 40 <210> 18 <211 >45 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 17 gatcggatcc ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 40 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 18 gatctctaga aagcttatca caaggcaatg agatagacaa tggcc 45 <210> 19 <211 >38 <212> DNA <213> umelá sekvencia<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 18 gatctctaga aagcttatca caaggcaatg agatagacaa tggcc 45 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence

-30<220>-30 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 19 gatcggatcc ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcgc 38 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 19 gatcggatcc ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcgc 38 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 20 gatctctaga aagcttatca caagttggca gaagtggctg c 41 <210> 21 <211 >34 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 20 gatctctaga aagcttatca caagttggca gaagtggctg c 41 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 21 gatctctaga atgacaggtt ctggtcatgc aagc 34 <210> 22 <211 >39 <212> DNA <213> umelá sekvencia f ·<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 21 gatctctaga atgacaggtt ctggtcatgc aagc 34 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence f ·

-31 <220>-31 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 22 gatctctaga atggtgccca gctctactga gaagaatgc 39 <210> 23 <211 >43 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 22 gatctctaga atggtgccca gctctactga gaagaatgc 39 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 23 gacctctaga atgggctcag cttctactct ggtgcacaac ggc 43 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 23 gacctctaga atgggctcag cttctactct ggtgcacaac ggc 43 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 24 gatctctaga atgctggtgc tggtctgtgt tctggttgcg c 41 <210> 25 <211 >26 <212> DNA <213> umelá sekvencia<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 24 gatctctaga atgctggtgc tggtctgtgt tctggttgcg c 41 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence

-32<220>-32 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 25 ggcggtggag cccggggctg gcttgt 26 <210> 26 <211 >22 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 25 ggcggtggag cccggggctg gcttgt 26 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 26 aacctgaagc tggttccgtg gc 22 <210> 27 <211 >26 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 26 aacctgaagc tggttccgtg gc 22 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 27 gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 26 <210> 28 <211 >29 <212> DNA <213> umelá sekvencia<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 27 gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 26 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence

-33<220>-33 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 28 gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 29 <210> 29 <211 >30 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 28 gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 29 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 29 ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 30 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 29 ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 30 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 30 caaggcaatg agatagacaa tggcc 25 <210> 31 <211 >27 <212> DNA <213> umelá sekvencia<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 30 caaggcaatg agatagacaa tggcc 25 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence

-34<220>-34 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 31 ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcg 27 <210> 32 <211 >40 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 31 ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcg 27 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 32 gatctctaga atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 <210> 33 <211 >68 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220><223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 32 gatctctaga atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 <210> 33 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 33 tcaccagcga gacgggcaac agccatgcac cactaccgtg cctcccacct ctgagacgga 60 gcaccagg 68 <210> 34 <211 >66 <212> DNA <213> umelá sekvencia f r<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 33 tcaccagcga gacgggcaac agccatgcac cactaccgtg cctcccacct ctgagacgga 60 gcaccagg 68 <210> 34 <211> 66 <212> DNA <213> artificial sequence f r

-35r r r r f t r t* <220>-35yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyat!

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 34 cctccgtctc agaggtggga ggcacggtag tggtgcatgg ctgttgcccg tctcgctggt gaaaag <210> 35 <211 >35 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400 35 gatcggatcc tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgc<223> Artificial sequence description: synthetic oligonucleotide <400> 34 cctccgtctc agaggtggga ggcacggtag tggtgcatgg ctgttgcccg tctcgctggt gaaaag <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220 <223> Description 35 gatcggatcc tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgc

Claims (15)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Farmaceutický prostriedok, ktorý spolu s vhodnými excipientami a adjuvansami, obsahuje jeden alebo viac odlišných cicavčích expresných plazmidov, z ktorých každý zahŕňa sekvenciu kódujúcu odlišný fragment mucinového proteínu MUC-1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že sekvencia:A pharmaceutical composition which, together with suitable excipients and adjuvants, comprises one or more different mammalian expression plasmids, each comprising a sequence encoding a different fragment of the MUC-1 mucin protein, wherein the sequence: a) v prípade, že kóduje viac ako jeden MUC-1 fragment, je vybraná zo skupiny sekvencií, ktoré majú 200 až 700 nukleotidov, ktoré na seba nadväzujú, alebo sa prekrývajú v oblasti 50 až 150 nukleotidov na zodpovedajúcich 3' alebo 5’ koncoch, alebo(a) if it encodes more than one MUC-1 fragment, it is selected from the group of sequences having 200 to 700 nucleotides which bind to each other or overlap in the region of 50 to 150 nucleotides at the corresponding 3 'or 5' ends or b) v prípade, že kóduje len jeden fragment, je to fragment uvedený na obrázku 5.(b) if it encodes only one fragment, it is the fragment shown in Figure 5. 2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej dva odlišné plazmidy.Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that it comprises at least two different plasmids. 3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej tri odlišné plazmidy.Pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that it comprises at least three different plasmids. 4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej štyri odlišné plazmidy.A pharmaceutical composition according to claim 3 comprising at least four different plasmids. 5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej dva odlišné plazmidy, ktorých sekvencie kódujúce MUC-1 fragment sú vybrané zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1, 2, 3 a 4.Pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that it comprises at least two different plasmids whose sequences encoding the MUC-1 fragment are selected from the sequences shown in Figures 1, 2, 3 and 4. 6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje štyri odlišné plazmidy, ktorých sekvencie kódujúce MUC-1 fragment sú vybrané zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1, 2, 3 a 4.Pharmaceutical composition according to claim 5, characterized in that it comprises four different plasmids whose sequences encoding the MUC-1 fragment are selected from the sequences shown in Figures 1, 2, 3 and 4. 7. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že pred 5’ koncom sekvencie kódujúcej MUC-1 r · p »Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that before the 5 'end of the MUC-1 coding sequence » -37fragment sa nachádza sekvencia uvedená na obrázku 6, ktorá kóduje ubiquitín a Lacl časť Escherichia coli.The fragment is the sequence shown in Figure 6 that encodes ubiquitin and the Lac1 portion of Escherichia coli. 8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sekvencia nachádzajúca sa pred 5’ koncom sekvencie kódujúcej MUC-1 fragment, ktorá kóduje ubiquitín a Lacl časť z Escherichia coli, je vybraná zo sekvencií uvedených na obrázkoch 7, 8, 9 a 10.The pharmaceutical composition of claim 7, wherein the sequence upstream of the 5 'end of the sequence encoding the MUC-1 fragment that encodes ubiquitin and the Lac1 portion of Escherichia coli is selected from the sequences shown in Figures 7, 8, 9, and 10th 9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zmes odlišných plazmidov, z ktorých každý nesie konštrukty znázornené na obrázkoch 7, 8, 9 a 10.Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that it comprises a mixture of different plasmids, each carrying the constructs shown in Figures 7, 8, 9 and 10. 10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vy z n a č u j ú c i sa tým, že obsahuje konštrukt znázornený na obrázku 11.Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that it comprises the construct shown in Figure 11. 11. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sekvencia kódujúca MUC-1 fragment je začlenená do pMRS30 expresného vektora opísaného na obrázku 13.Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the sequence encoding the MUC-1 fragment is incorporated into the pMRS30 expression vector described in Figure 13. 12. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aj cytokín alebo plazmid kódujúci cytokín.Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 11, characterized in that it also contains a cytokine or a plasmid encoding a cytokine. 13. Plazmid, ktorý sa skladá z pMRS30 expresného vektora znázorneného na obrázku 13, ktorý je fúzovaný so sekvenciou kódujúcou MUC-1 fragment, ktorá je vybraná zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1,2, 3,4 a 5.A plasmid consisting of the pMRS30 expression vector shown in Figure 13, which is fused to a sequence encoding an MUC-1 fragment selected from the sequences shown in Figures 1, 2, 3, 4 and 5. 14. Plazmid, ktorý sa skladá z pMRS30 expresného vektora znázorneného na obrázku 13, ktorý je fúzovaný s konštruktom vybraným z konštruktov uvedených na obrázkoch 7,8, 9,10 a 11.A plasmid consisting of the pMRS30 expression vector shown in Figure 13, which is fused to a construct selected from the constructs shown in Figures 7,8, 9,10 and 11. -3815. DNA molekula vybraná z DNA molekúl uvedených na obrázkoch 7, 8, 9, 10a 11.-3815. A DNA molecule selected from the DNA molecules shown in Figures 7, 8, 9, 10 and 11. 16. Použitie DNA molekuly podľa nároku 15 na výrobu lieku s protinádorovým účinkom.Use of a DNA molecule according to claim 15 for the manufacture of a medicament having an antitumor effect.
SK571-2001A 1998-10-30 1999-10-18 Pharmaceutical composition SK5712001A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1998MI002330A IT1303683B1 (en) 1998-10-30 1998-10-30 PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH ANTI-TUMORAL ACTION CONTAINING DNACODIFIER FOR FRAGMENTS OF AN ANTIGENIC PROTEIN.
PCT/EP1999/007874 WO2000025827A2 (en) 1998-10-30 1999-10-18 Dna molecules encoding muc-1 and use thereof in tumor vaccination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK5712001A3 true SK5712001A3 (en) 2002-04-04

Family

ID=11380969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK571-2001A SK5712001A3 (en) 1998-10-30 1999-10-18 Pharmaceutical composition

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1124956A2 (en)
JP (1) JP2002528519A (en)
CN (1) CN1324406A (en)
AR (1) AR020927A1 (en)
AU (1) AU1152200A (en)
BG (1) BG105458A (en)
BR (1) BR9914892A (en)
CA (1) CA2348745A1 (en)
CO (1) CO5231134A1 (en)
CZ (1) CZ20011521A3 (en)
EA (1) EA200100395A1 (en)
HU (1) HUP0103784A2 (en)
IT (1) IT1303683B1 (en)
MX (1) MXPA01004186A (en)
PE (1) PE20001287A1 (en)
PL (1) PL348156A1 (en)
SK (1) SK5712001A3 (en)
TR (1) TR200101141T2 (en)
WO (1) WO2000025827A2 (en)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6548643B1 (en) 1994-11-16 2003-04-15 Austin Research Institute Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
WO2001057068A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-09 The Austin Research Institute Mucin-1 derived antigens and their use in immunotherapy
CN1455680A (en) * 2000-09-11 2003-11-12 达纳-法伯癌症协会有限公司 MUCl extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
AU2002246791C1 (en) 2000-12-22 2008-04-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulation of cell growth by MUC1
BRPI0408774A (en) * 2003-03-24 2006-03-28 Scripps Research Inst dna vaccines against tumor growth and their uses
US7696306B2 (en) 2003-07-11 2010-04-13 Board of Agents of the University of Nebraska Compositions and methods for preventing or treating cancer
WO2005042573A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands
WO2008097844A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Dana -Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by muc1 and bh3- containing proapoptotic proteins
US7972870B2 (en) 2007-02-02 2011-07-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3
CN106279435B (en) * 2016-08-16 2019-06-07 新乡医学院 Target anti-tumor vaccine, encoding gene, expression vector, expression engineering bacteria and the application of VEGF and mucin1
CN114230655A (en) * 2021-03-24 2022-03-25 深圳市新靶向生物科技有限公司 Antigenic peptide combination related to esophageal cancer driver gene mutation and application thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1262545B (en) * 1993-10-25 1996-07-02 Menarini Ricerche Sud S P A A EXPRESSION SYSTEM FOR EUKARYOTIC CELL LINES
WO1998037095A2 (en) * 1997-02-24 1998-08-27 Therion Biologics Corporation Recombinant pox virus for immunization against muc1 tumor-associated antigen

Also Published As

Publication number Publication date
EP1124956A2 (en) 2001-08-22
CZ20011521A3 (en) 2001-10-17
AU1152200A (en) 2000-05-22
IT1303683B1 (en) 2001-02-23
CN1324406A (en) 2001-11-28
MXPA01004186A (en) 2002-06-04
BR9914892A (en) 2001-07-17
JP2002528519A (en) 2002-09-03
CA2348745A1 (en) 2000-05-11
PE20001287A1 (en) 2000-12-07
ITMI982330A1 (en) 2000-04-30
CO5231134A1 (en) 2002-12-27
ITMI982330A0 (en) 1998-10-30
TR200101141T2 (en) 2001-09-21
EA200100395A1 (en) 2001-10-22
PL348156A1 (en) 2002-05-06
BG105458A (en) 2002-06-28
WO2000025827A2 (en) 2000-05-11
AR020927A1 (en) 2002-06-05
WO2000025827A3 (en) 2000-08-10
HUP0103784A2 (en) 2002-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7244462B2 (en) Combination therapy with neoantigen vaccine
JP7491965B2 (en) Neoantigens and methods of use thereof
JP7534962B2 (en) Neoantigens and uses thereof
JP7514189B2 (en) Neoantigens and their uses
US20070298051A1 (en) Adjuvants Of Immune Response
TW201930340A (en) Neoantigens and uses thereof
WO2003055439A2 (en) Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
CN111533812B (en) DNA vaccine for SARS-COV-2 virus and its use
KR20210005046A (en) Combinations of T-cell induction vaccine compositions and uses thereof
US20240317830A1 (en) Multi-domain protein vaccine
WO2019101062A1 (en) Recombinant vaccine and application thereof
US20220233666A1 (en) Cancer vaccine
SK5712001A3 (en) Pharmaceutical composition
TW202126327A (en) Neoantigen compositions and uses thereof
KR101810840B1 (en) Msi-specific framshift peptides (fsp) for prevention and treatment of cancer
ITMI990396A1 (en) IMMUNOLOGICAL PEPTIDES DERIVED FROM MAGE-3 PRESENTED BY MHC CLASS II AND THEIR USE
JP2007537143A (en) Vaccine composition comprising angiomotin or angiomotin-encoding polynucleotide and use of the vaccine composition for the treatment of diseases associated with angiogenesis
US20230233656A1 (en) Breast Cancer Vaccine
RU2805196C2 (en) Neoantigens and their application
JP2005526511A (en) vaccine
WO2021170111A1 (en) Tumor immune enhancer, and preparation method therefor and application thereof
RU2773273C2 (en) Neoantigens and their application methods