MXPA01004186A - Composicion farmaceutica, que contiene fragmentos de acido de desoxirribonucleico que codifica una proteina antigenica con efecto anti-tumoral. - Google Patents

Abstract

Se provee aqui una composicion farmaceutica que contiene una o mas moleculas de ADN que codifican fragmentos de una proteina que se sobreexpresa en las celulas tumorales, con el objeto de inducir una respuesta inmune especifica de Ag anti-tumoral, en asociacion con excipientes y adyuvantes adecuados.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA, QUE CONTIENE FRAGMENTOS DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA ANTIGENICA CON EFECTO ANTI-TUMORAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un grupo de construcciones de ADN plasmídico que contienen las secuencias de los fragmentos que codifican MUC-1 humana y a un grupo de plásmidos de ADN en los cuales los fragmentos mismos se preceden por la secuencia que codifica una proteína que consiste de ubiquitina humana fusionada a un fragmento bacteriano Lacl. La invención además se refiere a su uso en la preparación de composiciones farmacéuticas para su uso como vacunas anti-tumorales de ADN.

TÉCNICA ANTECEDENTE RELACIONADA La invención provee una terapia anti-tumoral basada en la inducción o activación de la respuesta inmune capaz de llevar a cabo rechazo tumoral. La validez de dicha idea se demuestra a partir de los primeros resultados clínicos; por ejemplo pacientes tratados con una vacuna viral que contiene el antígeno carcinoembriónico (CEA) que codifica secuencias que demuestran activación del sistema inmune en contra de este antígeno (Tsang KY et al. J. Nati. Cáncer. Inst. 87: 982, 1995).

La activación de una respuesta inmune anti-tumoral se logra a través de cuatro métodos diferentes: a) Ingeniería ex vivo de las células tumorales del paciente con el objeto de hacerlas inmunogénicas y adecuadas como una vacuna; b) Ingeniería ex Vo de las células inmunes del paciente con el objeto de preactivar una respuesta inmune in vitro. c) Inoculación del ADN, ya sea desnudo o encapsulado en liposomas o integrado en partículas virales (retrovirus), virus de vacuna, adenovirus, etc.), que codifica los antígenos asociados al tumor; d) Tratamiento con antígenos tumorales solubles recombinantes o sintéticos conjugados o mezclados con adyuvantes. Los primeros dos métodos consisten en la ingeniería de cada célula individual del paciente y están limitados en cuanto a que son necesariamente paciente-específicos, mientras que los siguientes dos están dirigidos a obtener productos comparables a un fármaco tradicional. Los nuevos métodos de vacunación reflejan el desarrollo de nuevas tecnologías. Las indicaciones recientes que provienen de la experimentación de las vacunas con ADN desnudo que induce ya sea una respuesta persistente del anticuerpo o una respuesta inmune celular, hace obsoleta a la vacuna con subunidad proteica tradicional constituida de ciertos péptidos específicos, que inducen a una población linfocitaria. Las proteínas inyectadas intramuscularmente o intradérmicamente, codificadas por el ADN desnudo, inducen una respuesta citotóxica-específica así como una respuesta ayudadora. Está combinación poderosa es extremadamente efectiva pero los mecanismos que en que se basa no están completamente aclarados aún. Las células musculares expresan los antígenos MHC de la clase I solamente a bajos niveles, y aparentemente no expresan antígenos de la clase II o moléculas co-estimulantes. Consecuentemente las células musculares transfectadas probablemente desempeñan un papel importante en el inicio de la respuesta inmune per se. Datos recientes muestran que las células presentadoras del antígeno (APC), tales como macrófagos o células dendríticas, juegan un papel fundamental al capturar el antígeno liberado por miocitos y en el procesamiento y presentación subsecuente de los péptidos respectivos en el contexto de las moléculas de la clase I y II, se induce así la activación de las células CD8+ con actividad citotóxica así como la activación de las células CD4+ que cooperan con los linfocitos B para producir la respuesta de anticuerpos (Corr M et al J. Exp. Med. 184:1555, 1996) (Tighe, H. et al. Immunology Today 19:89, 1998). Además, se sabe que el uso de citocína mejora el efecto terapéutico derivado de la inmunización con ADN. Las citocinas pueden administrarse en la forma de proteínas exógenas como se reportó en Irvine et al., J. Immunol. 156: 238, 1996. Un método alternativo está representado por la inoculación contemporánea tanto del antígeno tumoral como de los plásmídos que codifican la citocina deseada, permitiendo así que la citocina se produzca in situ (Kim JJ et al. Immunol 158: 816, 1997). '="* ' •* - - í,?.ya,..„ . . .. . . . . . . ... . . t . . .Bfe^ato^ El método de inmunización activa de la presente invención se basa en el uso de vectores de ADN como vacunas contra el antígeno MUC-1 humano o mucínas epiteliales polimórficas (PEM), que se sobreexpresan en las células tumorales. MUC-1 es una glucoproteína de superficie luminal epitelial (Patton S. et al. BBA 1241:407, 1995). En el proceso de transformación de células esa glucoproteína pierde la localización apical y sus niveles de expresión aumentan drásticamente. La función de la proteína consiste en proteger las superficies luminales, por ejemplo en la glándula mamaria, ovario, endometrio, colon, estómago, páncreas, vejiga, riñon, etc. Se reporta que un defecto en la glucosilación hace que la célula tumoral asociada a MUC-1 sea antigénicamente diferente de las células normales asociadas a MUC-1. Este fenómeno causa que el MCU-1 tumoral exponga los epítopes antigénicos que normalmente están enmascarados por porciones de azúcar en las células normales que expresan MUC-1. Esta característica hace al MUC-1 tumoral particularmente interesante en una inducción de la respuesta de anticuerpos específica al tumor (Apostolopoulos V. et al. Crit. Rev. Immunol, 14:293, 1994). Como un objetivo, la vacunación está dirigida a inducir la respuesta inmune contra las células tumorales que expresan MUC1 a altos niveles conservando al mismo tiempo la baja expresión del epitelio normal. La vacunación de ADN se basa en la entrada de un gen o porción del mismo dentro del cuerpo celular seguido por transcripción y traducción de la secuencia insertada y por lo tanto síntesis intracelular del polipéptido „¿^^ l jj>j ^! correspondiente. Una ventaja importante de este sistema es que la proteína neosintetizada se procesa naturalmente dentro de la célula y los péptidos producidos se asocian con las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-I). Los complejos MHC/péptido por lo tanto se 5 exportan naturalmente a la superficie celular en donde pueden ser reconocidos por las células citotóxicas CD8+ del sistema inmune. Solamente los polipéptidos sintetizados dentro de la célula se procesan y presentan en asociación con las moléculas de clase I de MHC, haciéndolo así el único mecanismo para estimular, una respuesta citotóxica específica. Los sistemas 10 de vacunación basados en la administración de proteína o péptido son usualmente más efectivos en estimular la respuesta inmune del anticuerpo el cual, hasta la fecha, ha mostrado no ser efectivo para rechazar las células tumorales. Las técnicas de terapia génica actual se basan en el empaquetamiento de ADN en vectores virales recombinantes (retrovirus y 15 adenovirus). La administración del ADN desnudo es mucho más ventajosa en términos de efectividad y seguridad en comparación con las terapias del vector viral (Kumar V y Sercarz E. Nature Med. 2: 857, 1996; McDonnel WM et al., New England J. Of Med. 334: 42, 1996). De hecho, el ADN desnudo es incapaz ya sea de duplicarse o de integrarse en el ADN del tejido del 20 hospedero y no induce la respuesta inmune a las proteínas vírales. Recientemente se reportó el uso de la ubiquitina para mejorar el procesamiento de la proteína neosintetizada y por lo tanto la inducción linfocitaria citotóxica (Rodríguez F. et al., J. Virology 71: 8497, 1997). El uso de ubiquitina con el objeto de generar proteína con un aminoácido N-terminal, las hace inestables y por lo tanto las hace propensas a la degradación mejorada, que se ha reportada {BechmairA. et al., SCIENCE 234: 179, 1986). Subsecuentemente se relacionó la inestabilidad mayor de estas proteínas con 5 el procesamiento intracelular mejorado y la presentación de proteínas modelo por MHC-I (Grant EP et al., J. Immunol. 155: 3750, 1995) (Wu Y y Kípps T.J., J. Immunol. 159: 6037, 1997). Se reportó el uso de construcciones particulares que contienen fragmentos de ADN que codifican un antígeno parcial (nucleoproteínas del 10 virus de la influenza), que tiene una mayor eficiencia en la presentación antigénica en comparación con los análogos con la secuencia antigénica total, en las vacunaciones con ADN (Antón L. C. et al., J. Immunol. 158:2535, 1997). Además, el procesamiento de las proteínas ¡ntracelulares y la presentación de los péptidos respectivos por las proteínas MHC de la clase I 15 en condiciones fisiológicas, sirve de base para el mecanismo de inspección inmunológica. Para una proteína dada y un contexto de MHC específico, hay fragmentos peptídicos denominados dominantes (es decir que prevalecen sobre los subdominantes o crípticos), los cuales son incapaces de generar cualquier respuesta inmune debido a que se reconocen como "propios". Se ha 20 determinado ahora, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, que un método destinado a mantener la presentación de los epitopes no dominantes por la administración de una mezcla de fragmentos de proteína antigénica es capaz de producir una sorprendente respuesta inmune citotóxica.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 5 Actualmente se ha encontrado que las moléculas de ADN, que codifican fragmentos de una proteína que se sobreexpresa en las células tumorales, puede usarse convenientemente para inducir una respuesta inmune anti-tumoral antígeno-específica. La invención se refiere 10 particularmente a una composición farmacéutica que contiene uno o más ADN que codifican fragmentos de la proteína mucina (MUC-1 ). El ADN usado en la presente invención puede ser ADN plasmídico o viral, preferiblemente ADN plasmídíco obtenido empleando el vector de expresión pMRS30 descrito en la figura 13. 15 Las composiciones de conformidad con la invención contienen preferiblemente al menos dos fragmentos de la mucina (MUC-1 ) o de otra proteína que se sobreexprese en las células tumorales. Las composiciones de acuerdo con la invención contienen preferiblemente al menos cuatro fragmentos, cada uno con un intervalo de 20 200 a alrededor de 700 nucleótidos, cada secuencia siendo yuxtapuesta y posiblemente parcialmente sobrepuesta, de alrededor de 50 a alrededor de 150 nucleótidos, en el extremo 3' y/o 5' del adyacente. ..i¿^i^ -^^^^^^ t T 7l * "> • • - - - " -*-» . . -> .. , < . ^AA^jfe=A Los fragmentos de ADN de conformidad con la invención pueden posiblemente estar precedidos en el extremo 5' por una secuencia de ADN que codifique ubiquitina y posiblemente también por una porción Lacl de Escherichia coli. La invención se refiere también a nuevos fragmentos de ADN y al uso de los fragmentos de Mucin-1 definidos anteriormente en la medicina y en la preparación de vacunas antitumorales.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS166. Este ADÑ incluye las secuencias que corresponden a los nucleótidos 136-339 de la secuencia J05581 de EMBL, precedida por el codón de inicio de la traducción, ATG y seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye una metionina seguida por los aminoácidos codificados por el fragmento 136-339 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 2 Secuencia nucleotídíca de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión Itf . t -t -r-,* , «f-Tff ~ - -y-af n- - - y- . ., ,. ., > » - ., . ^,^.'& ^- pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS169. Este ADN incluye las secuencias que corresponden a los nucleótidos 205-720 de la secuencia J05581 de EMBL, precedida por el codón de inicio de la traducción, ATG y seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye una metionina seguida por los aminoácidos codificados por el fragmento 205-720 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 3 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS168. Este ADN incluye las secuencias que corresponden a los nucleótidos 631-1275 de la secuencia J05581 de EMBL, precedida por el codón de inicio de la traducción, ATG y seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye una metionina seguida por los aminoácidos codificados por el fragmento 631-1275 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 4 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS167. Este ADN incluye las secuencias que corresponde a los nucleótidos 1222-1497 de la secuencia J05581 de EMBL, precedida por el codón de inicio de la traducción, ATG y seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye una metionina seguida por los aminoácidos codificados por el fragmento 1222-1497 de la secuencia J05581 de EMBL. 5 Fiqura 5 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS175. Este ADN incluye las secuencias que corresponde a los nucleótidos 136-1497 de la secuencia 10 J05581 de EMBL, precedida por el codón de inicio de la traducción, ATG y seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye una metionina seguida por los aminoácidos codificados por el fragmento 136-1497 de la secuencia J05581 de EMBL. 15 Figura 6 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) denominada UBILacl. El polipéptido codificado incluye la secuencia de ubiquitina fusionada a una secuencia parcial de la proteína bacteriana beta-galactosidasa, como se describió en Chau V. Et al. 20 Science 243: 1576, 1989.

Figura 7 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS171. Este ADN incluye la secuencia denominada UBILacl (ver figura 6) fusionada a la secuencia que corresponde a los nucleótidos 136-339 de la secuencia J05581 de EMBL seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye la secuencia de aminoácidos reportada en la figura 6, fusionada a la secuencia que incluyen los aminoácidos codificados por el fragmento 136-339 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 8 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS174. Este ADN incluye la secuencia denominada UBILacl (ver figura 6) fusionada a la secuencia que corresponde a los nucleótidos 205-720 de la secuencia J05581 de EMBL seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye la secuencia de aminoácidos reportada en la figura 6, fusionada a la secuencia que incluyen los aminoácidos codificados por el fragmento 205-720 de la secuencia J05581 de EMBL.

N l M H - t t» . . , . .. . .. . A>¿^ Figura 9 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS173. Este ADN incluye la secuencia denominada UBILacl (ver figura 6) fusionada a la secuencia que corresponde a los nucleótidos 631-1275 de la secuencia J05581 de EMBL seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye la secuencia de aminoácidos reportada en la figura 6, fusionada a la secuencia que incluyen los aminoácidos codificados por el fragmento 631-1275 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 10 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS172. Este ADN incluye la secuencia denominada UBILacl (ver figura 6) fusionada a la secuencia que corresponde a los nucleótidos 1222-1497 de la secuencia J05581 de EMBL seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye la secuencia de aminoácidos reportada en la figura 6, fusionada a la secuencia que incluyen los aminoácidos codificados por el fragmento 1222-1497 de la secuencia J05581 de EMBL. Figura 11 Secuencia nucleotídica de ADN (con la secuencia de aminoácidos respectiva) insertada en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30 para dar el vector de expresión pMRS176. Este ADN incluye la secuencia denominada UBILacl (ver figura 6) fusionada a la secuencia que corresponde a los nucleótidos 136-1497 de la secuencia J05581 de EMBL seguida por los dos codones de paro de la traducción, TGA y TAA. El polipéptido codificado así incluye la secuencia de aminoácidos reportada en la figura 6, fusionada a la secuencia que incluyen los aminoácidos codificados por el fragmento 136-1497 de la secuencia J05581 de EMBL.

Figura 12 Análisis electroforético de un gel de agarosa al 1 % en TBE 1X. El ARNm extraído de CHO, células dendríticas CD34+ y células dendríticas de PBMC, respectivamente, se transfectó con pMRS169, y se sometió a reacción de RT-PCR ya sea con (líneas 4, 8, 12) o sin (líneas 5, 9, 13) transcriptasa reversa. Marcador de ADN de peso molecular (línea 1 ); controles negativos internos (líneas 2, 6); controles positivos internos (líneas 3, 7, 10, 11 ); control positivo del equipo Promega (línea 14).

Figura 13 Secuencia nucleotídica del vector de expresión pMRS30. La región 1-2862 que corresponde a la región Accl (ubicación 504) - BamHl (ubicación 3369) del vector pSV2CAT (EMBL M77788); la región 2863-3721 '••*- -^ -* — " * * .-^^.^^m^ incluye el promotor del citomegalovirus humano (mejorador del gen temprano- inmediato del citomegalovirus); la región 3722-4905 incluye varios sitios de clonación, incluyendo Xbal (ubicación 3727), y la señal de procesamiento del gen de beta-globina de conejo. 5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se preparó un grupo de ADN plasmídico que codifica, en las células eucariontes, fragmentos del antígeno de proteína humana MUC-1. Las 10 construcciones se basan en el vector de expresión de mamífero denominado pMRS30, descrito en la figura 13 y previamente reivindicada en la solicitud de patente WO95/11982, y que contiene las secuencias parciales del ADN reportado en la base de datos EMBL con el número de acceso J05581. El ADN que codifica MUC-1 se fragmentó de manera que cada fragmento 15 representa una porción discreta, que parcialmente se sobrepone a las adyacentes. La administración de una mezcla de dichos plásmidos puede ocasionar plásmidos diferentes que transfecten a diferentes células APC en el sitio de administración. Por lo tanto, dichas células producen y procesan porciones discretas de la proteína MUC-1 dadas por los péptidos 20 relacionados. En esas condiciones, el subdominante que aparece y los péptidos críticos también pueden presentarse en asociación con las moléculas MHC de la clase I generando así una respuesta inmune citotóxica. «t<**iti?& i*£a . .. ..... ... >. ^ - *- *•- - - • -"""- La presente invención se relaciona al uso de un grupo de 4 construcciones (figura 1 a 4) que contienen fragmentos parciales de ADNc a MUC-1 en una mezcla que contiene al menos dos de ellas y un grupo de cuatro construcciones (figura 7 a 10) que contienen fragmentos parciales de 5 ADNc a MUC-1 precedidos por el ADN que codifica una secuencia proteica que contiene ubiquitina y una porción Lac I de Escherichia coli (figura 6) usadas separadamente o en mezcla que contiene al menos dos de ellas. La presente invención se refiere también al uso de una construcción (figura 5) que contiene la secuencia del ADNc MUC-1 casi 10 completa y la construcción (figura 11 ) que contiene la secuencia del ADNc a MUC-1 casi completa precedida por el ADN que codifica una secuencia proteica que contiene ubiquitina y una porción Lac I de Escherichia coli. La mezcla de las cuatro construcciones que contienen los fragmentos parciales del ADNc a MUC-1 y la mezcla de las cuatro 15 construcciones que contienen los fragmentos parciales del ADNc a MUC-1 precedidas por el ADN que codifica una secuencia proteica que contiene ubiquitina y una porción Lac I de Escherichia coli representa una modalidad preferida de la presente invención. Las construcciones de acuerdo con la presente invención 20 pueden usarse en la terapia anti-tumoral de pacientes afectados con tumores caracterizados por una alta expresión de MUC-1. Las construcciones descritas en la presente invención se obtuvieron como sigue. t^.M ^m^¡ 1^j|¡ri| | |,i;|- ^ . . . ?.?. . . . . ¿ j . , . ^ . y • - M i***~*3¡ En el caso de la primera serie de construcciones, los fragmentos del ADN de MUC-1 se obtuvieron por RT-PCR de la línea celular BT20 o por síntesis química parcial del ADN. Entonces dichos fragmentos se clonaron dentro del vector de expresión pMRS30 y se verificaron por secuenciacíón. En el caso de la segunda serie de construcciones, los fragmentos se obtuvieron de la primera serie de construcciones por una reamplificación con PCR. Estos fragmentos se fusionaron entonces al ADN que codifica para ubiquitina (obtenida por RT-PCR del ARNm de la línea celular MCF7) y una secuencia parcial Lacl (obtenida por PCR a partir del vector comercial pGEX). Las secuencias de ADN obtenidas así se clonaron en el vector de expresión pMRS30 y se verificaron por secuenciación. Para los usos terapéuticos o profilácticos pretendidos, los fragmentos o construcciones de acuerdo con la invención se formulan adecuadamente, usando acarreadores y métodos previamente empleados en vacunas de ADN desnudo, como se describe por ejemplo en The Immunologist, 1994, 2:1 ; WO 90/11092, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551 ; US 5580859; Immunology Today 19 (1998), 89-97); Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994), 1495-1498; ADN Cell. Biol. 12 (1993), 777-783. Las dosis se determinarán con base en los ensayos farmacológicos-toxicológicos y clínicos. Generalmente hablando, comprenderán entre 0.005 µg/kg y 5 µg/kg de la mezcla de fragmentos. La composición de la invención también puede contener citocína o un plásmido que codifique citocina.

La invención además se ¡lustrará por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Construcción del plásmido pMRS166 Las células tumorales BT20 (ATCC HBT-19) se cultivaron en MEM de Eagle complementado con 10% de suero de ternera fetal. Se tripsinizaron diez millones de células, se lavaron con PBS, y se extrajo el ARNm. Una alícuota de este ARN se sometió a la reacción de RT-PCR (transcriptasa reversa - reacción en cadena de la polimerasa) en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V11 (5' GATCTCTAGAATGACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3') V4 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCAACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3') El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con la enzima de restricción Xbal, se clonó dentro del vector de expresión pMRS30, que contenía el promotor del citomegalovirus humano y la señal de poliadenilación de la beta-globina como se reivindica en la patente WO 9511982. El vector resultante pMRS166 contiene un fragmento de ADN que incluye el codón ATG, la secuencia correspondiente a los nucleótidos 136-339 de la secuencia J05581 de EMBL, y dos codones de paro TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 1. t , . . . . n EJEMPLO 2 Construcción del plásmido pMRS169 Una alícuota del ARN obtenido como se reportó en el ejemplo 1 se amplificó por RT-PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V12 (5' GATCTCTAGAATGGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3') V15 (5'GGCGGTGGAGCCCGGGGCTGGCTTGT 3') El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y Smal, se fusionó, por el sitio de restricción Smal, a un fragmento de ADN construido completamente sintético, y que incluía una secuencia que correspondía parcialmente a los nucleótidos 457-720 de la secuencia J05581 de EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. El fragmento completo se clonó luego en el sitio Xbal del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS169 contenía un fragmento de ADN que incluía el codón ATG, la secuencia que corresponde parcialmente a los nucleótidos 205-720 de la secuencia J05581 de EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 2.

EJEMPLO 3 Construcción del plásmido pMRS168 Una alícuota del ARN obtenido como se reportó en el ejemplo 1 se amplificó por RT-PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V13 (5'GATCTCTAGAATGGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3') V8(5'GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3') El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con la enzima de restricción Xbal se clonó en el vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS168 contenía un fragmento de ADN que incluía el codón ATG, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 631-1275 de la secuencia J05581 de EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 3.

EJEMPLO 4 Construcción del plásmido pMRS167 Una alícuota del ARN obtenido como se reportó en el ejemplo 1 se amplificó por RT-PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V14 (5'GATCTCTAGAATGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3') V10 (5'GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGTTGGCAGAAGTGGCTGC 3') f f ? ' -f ?-J " ' - a"*-»^ ' - *-"> -• '- ¡. i ac? . - - • afcAta ..,.

El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con la enzima de restricción Xbal se clonó en el vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS167 contenía un fragmento de ADN que incluía el codón ATG, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 1222-1497 de la secuencia J05581 de EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 4.

EJEMPLO 5 Construcción del plásmido pMRS175 Los plásmidos pMRS166, 169, 168, 167 se sometieron a reacciones de PCR en la presencia de los siguientes pares nucleotídicos: V11 (ver ejemplo 1 ) V18 (5' AACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3') para pMRS166 V19 (5' GTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3') V20 (5' GCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3') para pMRS169 V21 (5' GGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3') V22 (5' CAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3') para pMRS168 V23 (5' CTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCG 3') V10 (ver ejemplo 4) para pMRS167 Los cuatro fragmentos de ADN obtenidos en las reacciones de PCR respectivas se mezclaron en cantidades equimolares y el PCR se hizo reaccionar en la presencia de los oligonucleótidos V11 y V10.

El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con la enzima de restricción Xbal, se clonó en el vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS175 contenía un fragmento de ADN que incluía el codón ATG, la secuencia que parcialmente corresponde a los nucleótidos 136-1497 de la secuencia J05581 de EMBL y dos codones de paro TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 5.

EJEMPLO 6 Construcción del plásmido pMRS171 Las células tumorales MCF7 (ATCC HTB-22) se cultivaron en MEM de Eagle complementado con 10% de suero de ternera fetal. Se tripsinizaron diez millones de células, se lavaron con PBS, y se les extrajo el ARNm. Una alícuota de este ARN se sometió a RT-PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: UBI hacia el extremo 5' (5'GATCTCTAGAATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGT 3') UBI hacia el extremo 3' (5TCACCAGCGAGACGGGCAACAGCCATGCACCACTACCGTGCCTCCCA CCTCTGAGACGGAGCACCAGG 3 ) La reacción produce un fragmento de ADN denominado fragmento 1. El ADN de pGEX11T (Pharmacia) se sometió a reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: 5 Lacl hacia el extremo 5' (5'CCTCCGTCTCAGAGGTGGGAGGCACGGTAGTGGTGCATGGCTGTTGC CCGTCTCGCTGGTGAAAAG 3') Lacl hacia el extremo 3' (5'GATCGGATCCTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC 3') 10 Esta reacción da un fragmento de ADN denominado fragmento 2. Los fragmentos 1 y 2 del ADN, obtenidos en las respectivas reacciones de PCR, se mezclaron en cantidades equimolares y se sometieron a reacción de PCR en presencia de los oligonucleótidos UBI hacia el extremo 15 5' y Lacl hacia el extremo 3'. El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se clonó dentro del plásmido comercial pUC18. El vector resultante pMRS156 contenía un fragmento de ADN que incluía la secuencia que codifica la ubiquitina fusionada a la secuencia que 20 codifica una porción de la beta-galactosidasa bacteriana. Este fragmento, denominado UBILacl, se reporta en la figura 6. El ADN plasmídíco de pMRS166 se sometió a una reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V3 (5'GATCGGATCCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3') V4 (ver el ejemplol ) El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se fusionó, por ligación dentro de los 5 dos sitios BamHl, al fragmento UBILacl derivado del plásmido pMRS156. El fragmento resultante se clonó dentro del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS171 contiene un fragmento de ADN que incluye la secuencia UBILacl, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 136-339 de la secuencia J05581 EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este 10 fragmento se reporta en la figura 7.

EJEMPLO 7 Construcción del plásmido pMRS174 15 El plásmido de ADN pMRS169 se sometió a una reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V5 (5'GATCGGATCCGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3') V6 (5'GATCTCTAGAAAGCTTATCAGCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTG 20 C 3') El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se fusionó, por ligación dentro de los dos sitios BamHl, al fragmento UBILacl derivado del plásmído pMRS156. El fragmento resultante se clonó dentro del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS174 contiene un fragmento de ADN que incluye la secuencia UBILacl, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 205-720 de la secuencia J05581 EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 8.

EJEMPLO 8 Construcción del plásmido pMRS173 El plásmido de ADN pMRS168 se sometió a reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V7 (5' GATCGGATCCGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3') V8 (ver ejemplo 3) El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se fusionó, por ligación dentro de los dos sitios BamHl, al fragmento UBILacl derivado del plásmido pMRS156. El fragmento resultante se clonó dentro del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS173 contiene un fragmento de ADN que incluye la secuencia UBILacl, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 631-1275 de la secuencia J05581 EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 9.

EJEMPLO 9 Construcción del plásmido pMRS172 El plásmido de ADN pMRS167 se sometió a reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V9 (5' GATCGGATCCCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3') V10 (ver ejemplo 4) El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se fusionó, por ligación dentro de los dos sitios BamHl, al fragmento UBILacl derivado del plásmido pMRS156. El fragmento resultante se clonó dentro del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS172 contiene un fragmento de ADN que incluye la secuencia UBILacl, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 1222-1497 de la secuencia J05581 EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 10.

EJEMPLO 10 Construcción del plásmido pMRS176 El plásmido de ADN pMRS167 se sometió a reacción de PCR en la presencia de los siguientes oligonucleótidos sintéticos: V3 (ver ejemplo 6) V10 (ver ejemplo 4) El fragmento de ADN producido, purificado y digerido con las enzimas de restricción Xbal y BamHl, se fusionó, por ligación dentro de los dos sitios BamHl, al fragmento UBILacl que deriva del plásmido pMRS156. El fragmento resultante se clonó dentro del vector de expresión pMRS30. El vector resultante pMRS176 contiene un fragmento de ADN que incluye la secuencia UBILacl, la secuencia que corresponde a los nucleótidos 136-1497 de la secuencia JO5581 EMBL y dos codones de paro, TGA y TAA. Este fragmento se reporta en la figura 11.

EJEMPL0 11 Transfección de la célula eucarionte y ensayo para la transcripción Se cultivaron células CHO (ovario de hámster chino) en MEM alfa complementado con ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos al tiempo de la transfección. Las células dendríticas se obtuvieron de precursores hematopoyéticos CD34+ cultivados en IMDM sin suero, complementado con GM-CSF, IL4, SCF, Flt3 y TNFalfa. Después de 7 días la población de células obtenida se transfectó. Las células dendríticas se obtuvieron de aislados de monocitos de PBMC (células mononucleares de sangre periférica), cultivadas en RPMI complementado con FCS, GM-CSF, e IL-4. Después de 7 días la población de células obtenidas se transfectó.

En cada caso, alrededor de un millón de células se transfectó con uno de los plásmidos reportados en los ejemplos 1 a 10. La transfección se llevó a cabo usando 3 µg de ADN plasmídico y 4 µl de DMRIE (Gibco) por lipofección. Después de 24 horas las células se cosecharon, lavaron con PBS y se usaron con el objeto de extraer el ARNm. Una alícuota de ARNm se sometió a reacción de RT-PCR en la presencia del par de oligonucleótidos específicos para e! plásmido de ADN transfectado. Este experimento se llevó a cabo para cada plásmido reportado en los ejemplos 1 a 10, usando los siguientes pares oligonucleótidos: V11 /4 para pMRS166, V12/V6 para pMRS169, V13/V8 para pMRS168, V4/V10 para pMRS167, V4?/10 para pMRS175, UBI hacia el extremo 57V4 para pMRS171 , UBI hacia el extremo 57V6 para pMRS174, UBI hacia el extremo 57v8 para pMRS173, UBI hacia el extremo 57V10 para pMRS172, V14A 10 para pMRS 176. Como ejemplo representativo, la figura 12 reporta el análisis electroforético de los fragmentos de ADN obtenidos por RT-PCR del ARNm de las tres poblaciones celulares, transfectadas con el plásmido pMRS169. En este caso se usó el par oligonucleótido V12/V6.

EJEMPLO 12 Resultados de los estudios in vivo En los estudios in vivo, se usaron las mezclas de los cuatro fragmentos y del plásmido pMRS30 (vector sin inserto y por lo tanto usado como control negativo). Con el objeto de ensayar la inmunización ocurrida, se usó una prueba de ELISA para mostrar los antígenos específicos a mucina humana. Los estudios in vivo se condujeron usando ratones C57BL transgénicos para MUCI humana. Como una consecuencia en estos animales la proteína MUCI representa una autoproteína. El programa de vacunación empleado consiste de 3 administraciones intradérmicas (porción dorsal, 50 mícrogramos de ADN para cada lado) (a los días 0, 14, 28) de 100 mícrogramos de ADN plasmídico. Al día 14 después de la última administración, los animales se sacrificaron y el suero se evaluó para anticuerpos a mucina antihumanos. Las mezclas de fragmentos ensayadas, objetos de la presente invención, estimularon una buena respuesta inmune en los animales tratados. Por otra parte, también se llevaron a cabo los experimentos de vacunación con un péptido de 60 aminoácidos que corresponde a los 20 aminoácidos reportados en la figura 2, a partir de la posición 86 a la posición 105, repetidos tres veces (esté péptido se denomina 3XTR).

Las dos vacunaciones difieren en el tipo de respuesta de anticuerpos que produjeron. Los títulos de anticuerpos resultaron mucho más grandes en la vacunación con 3XTR. Además los subtipos IgG evidenciados están a favor de una respuesta esencialmente humoral (anticuerpo) en el caso de la vacunación con 3XTR, y de una respuesta celular (citotóxica) en el caso de la vacunación con ADN. Para la terapia anti-tumoral, es preferible una respuesta inmune principalmente citotóxica. Debido a que los experimentos se llevaron a cabo en ratones transgénicos, en los cuales la mucina humana es "propia", se puede prever una respuesta similar en los humanos. Estas respuestas podrían justificar el uso, como vacunas de ADN, de los compuestos de la presente invención en el tratamiento de los tumores humanos que sobreexpresan MUCI. • ÉikM^AÉiÉiÉ?i LISTADO DE SECUENCIAS <110> MENARINI RICERCHE S.p.A. <120> Composición farmacéutica, que contiene fragmentos de ácido desoxirpbonucleico que codifica una proteína antígena con efecto antitumoral <130> 5653MEUR <140> <141> <150> MI98A002330 <151> 1998-10-30 <160> 35 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 213 <212> ADN <213> humano <400> 1 accacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 60 cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 120 ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 180 gccccggcca cggaaccagc ttcaggttga taa 213 <210> 2 <211> 525 <212> ADN <213> humano <400> 2 accgcgccca gctctactga gaagaatgct gtgagtatga ccagcagcgt actc tccagc 60 cacagccccg gt tcfgctc c tccaccac t cagggacagg atgtcactct ggccccggcc 120 acggaaccag cttcaggttc 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cctgggctcc accaccccgc cagcccacga tgtcacctca 300 gccccggaca acaagccagc cccgggaagt accgctccac cagcacacgg tgttacctcg 360 gctccggata ccaggccggc cccaggtagt accgcccctc ctgcccatgg tgtcacatct 420 gccccggaca acaggcctgc attgggtagc acagcaccgc cagtacacaa cgttactagt 480 gcctcaggct ctgctagcgg ctcagcttct actctggtgc acaacggcac ctctgcgcgc 540 gcgaccacaa ccccagcgag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 600 actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 660 acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 720 tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 780 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 840 tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 900 gtacaattga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 960 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1020 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1080 atcgcgccgc tggtgctggt ctgtgttctg 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agaatgtcaa ggcaaagatc caagacaagg aaggcatccc tcctgaccag 120 - cagaggctca tctttgcagg caagcagctg gaagatggcc gcactctttc tgactacaac 180 atccagaaag agtccaccct gcacctggtg ctccgtctca gaggtgggag gcacggtagt 240 ggtgcatggc tgttgcccgt ctcgctggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg 300 caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 360 cgaggatcca caggttctgg tcatgcaagc tctaccccag gtggagaaaa ggagacttcg 420 gctacccaga gaagttcagt gcccagctct actgagaaga atgctgtgag tatgaccagc 480 agcgtactct ccagccacag ccccggttca ggctcctcca ccactcaggg acaggatgtc 540 actctggccc cggccacgga accagcttca ggttcagctg ccacctgggg acaggatgtc 600 acctcggtcc cagtcaccag gccagccctg ggctccacca ccccgccagc ccacgatgtc 660 acctcagccc cggacaacaa gccagccccg ggaagtaccg ctccaccagc acacggtgtt 720 10 acctcggctc cggataccag gccggcccca ggtagtaccg cccctcctgc ccatggtgtc 780 acatctgccc cggacaacag gcctgcattg ggtagtacag caccgccagt 'acacaacgtt 840 actagtgcct caggctctgc tagcggctca gcttctactc tggtgcacaa cggcacctct 900 gc cgcgcga ccacaacccc 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ItTff ir f" .> ^¿A.^^ . . .. . . .. .y.y^&v tjjt 210> 12 <211> 4905 <212> ADN <213> humano <400> 12 ccaggaagct cctctgtgtc ctcataaacc ctaacctcct ctacttgaga ggacattcca 60 accataggct gcccatccac cctctgtgtc ctcccgttaa ttaggtcact taacaaaaag 120 gaaattgggt aggggttttt cacagaccgc tttctaaggg taattttaaa atatctggga 180 agccccttcc actgctgtgt tccagaagtg ttggtaaaca gcccacaaat gtcaacagca 240 gaaacataca agctgtcagc tttgcacaag ggcccaacac cctgctcatc aagaagcact 300 gtggttgctg tgttagtaat gtgcaaaaca ggaggcacat tttccccacc tgtgtaggtt 360 ccaaaatatc tagtgttttc atttttactt ggatcaggaa cccagcactc cactggataa 420 gcattatcct tatccaaaac agccttgtgg tcagtgttca tctgctgact gtcaactgta 480 gcattttttg gggttacagt ttgagcagga tatttggtcc tgtagtttgc taacacaccc 540 tgcagctcca aaggttcccc accaacagca aaaaaatgaa aatttgaccc ttgaatgggt SOO tttccagcac cattttcatg agttttttgt gtccctgaat gcaagtttaa catagcagtt 660 accccaataa cctcagtttt aacagtaaca gcttcccaca tcaaaatatt tccacaggtt 720 aagtcctcat ttaaattagg caaaggaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc 780 tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 840 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 900 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 960 gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 1020 ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 1080 tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 1140 aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg 1200 ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 1260 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 1320 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 1380 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 1440 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 1500 agcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 1560 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 1620 cccctccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggcctcgcg 1S80 gtaccattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 1740 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 1800 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 1860 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 1920 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1980 atceccetg agatcc-ctt eetctgcgcg eaaecegceg ctcgcaaaca aaaaaaccac 2040 cgceaccagc cgtgg-t.gt tegccggaec aagagctacc aacccceeee ccgaaggcaa 2100 ctggceecag cagagcgcag aeaccaaaea cegecceec agtgtagccg eageeaggcc 21S0 accaceecaa gaactc-sta gcaccgccea catacctcgc tccgctaatc cegetaccag 2220 Cggctgctgc cageggcgat aagccgcgtc etaccgggcí ggactcaaga cgatagctac 2280 cggataaggc gcagcggccg ggctgaacgg gggeecgeg cacacagccc agcctggagc 2340 gaacgaccea caccgaactg agatacctac agcgcgagct atgagaaagc gccacgccec 2400 ccgaagsgag aaaggcggac aggeaeccgg taagcggcag ggccggaaca sgagagcgca 24 ß0 cgagggagct cccaggggga aacgccesge aeceeeaeag eccegccggg tttcgccacc 2520 ecegacecga gcgecga.et tcgtgatgce cgecaggg g gcggagccea tggaaaaacg 2 S SO ccagcaacgc ggcceeeeea cggeecccgg cceeeegceg gccceetgce cacatgttce 2S40 eeccegcgee acccccegat tctgtggata accgeaeeac cgcceeegag tgagcügata 2700 ccgcecgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagecage gagcgaggaa gcggaagagc 27 ß0 gccegaegcg gcaeeeeccc ceeacgcaec egegcggeae etcacaccgc atatggtgca 2320 cectcageac aaecegctct gaegccgcae agtcaagcca gcaeacaaec aaeateggcc 23 S 0 attagccata ecatecattg gttatatagc aeaaaecaae aeeggctaee ggccaecgca 2940 eacgeegeae ccaeatcata aeaegeacae eeaeaeeggc ecaegeccaa caeeaccgcc 3000 aegecgacat tgaeeaecga ceageeaeea aeageaaeca attacggcge caeeageeca 3060 eagcccaeae aeggagetcc gcgeeacaea acteacggea aaeggcccgc ctggcegacc 3120 0 gcccaacgac ccccgcccat egacgecaae aaegacgeae geecccaeag eaacgccaae 3180 aggcaceeec caeegac ec aaegggegga geaeeeacgg eaaacegccc aceeggcage 3240 acaecaageg eaecacatgc caageacgcc ccceaeegac gecaaegacg geaaaeggcc 3300 cgcceggcae eaegcccagc acaegaccee aegggaceee cceacecggc ageacaecea 33 S0 cgeaeeagec aecgceaeea ccaeggegae gcggeeeegg cageacaeca aegggcgegg 3420 aeagc gete gactcacggg gaeeeccaag tctccacccc aeegacgeca aegggagtee 3480 geeceggcac caaaatcaac gggaceeecc aaaaegecge aacaactccg ccccaecgac 3S40 gcaaaegggc ggeaggcgtg eacggeg ga ggeceaeaea agcagagcec geeeagegaa 3 SO0 ccgecagaec gcce gagac gccaeccacg cegeeeegac ceccaeagaa gacaccgsga SS0 ccgaeccagc ceccgcggcc gggaacggtg caeeggaacg cggaetcccc gegccaagaa 3720 agceegecea gaacccggga gagceccega gaaceecagg gtgagetegg ggaccceega 3780 ecgeeceeec eeeeccgcea tegeaaaaee caegeeaeae ggagggggca aageeeecag 3840 i c ggcgtcge c e agaatgggaa gaegccccec gcaccaccat ggacccccac gaeaaeeeeg 3900 eecceeecac eetceacccc geegacaacc ategececce ceeaeettce eeecaeeeec 3 SS0 egcaaceeee ecgeeaaace eeagceegca eeegeaacga aceteeaaac ecaceeeege 4020 eeaeeegeca gaeegeaage acceececea aecaccceec ececaaggca aecagggeae 4080 aecaeacege accecagcac ageeeeagag aacaaecgee aeaaeeaaae gataaggtag 4140 aaeaectceg cacaeaaace ceggceggcg eggaaaeaee cecaceggea gaaacaacea 4200 caecceggec aecaecccgc ceeececee e acggeeacaa egaeatacac egecegaga. 42 S0 gaggaeaaaa eaceccgage ccaaaccggg ccccccegce aaccacgcec aegcceecee 4320 ccececccea cagccccegg gcaacgegce ggeegcegeg ccgececacc aeceeggcaa 4380 agaaeecace ccccaggcgc aggcegccca ccagaaggeg geggcesgeg eggccaaegc 4440 cceggcecac aaacaccacc gagaeceeee ecccecegcc aaaaaecacg gggacaecac 4SO0 gaagccccc e gagcaeccga ceeceggcea aeaaaggaaa eeeaecceca eegcaaeage 4 S60 gegeeggaae ceeecgegcc ccecacecgg aaggacaeae gggagggcaa aecaeceaaa 4520 20 acaecagaae gageaeecgg cecagagtce ggcaacaeac gcca.aegcc ggcegccatg 4 S 80 aacaaaggtg gctacaaaga cgecaccage aeaegaaaca gccccccgce geccaeecce 4740 eaeeccaeag aaaagccceg aceegaggce agae eceeee caeaeecegc eecgtgecae 48 O0 eceeccce ct aacaccccca aaacccecce cacacgeeec accagccaga ceceeccccc 45 S0 tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctg gatee ^° <210 > 13 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético. <400> 13 gatcggatcc acaggttctg gtcatgcaag c 31 <210> 14 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 14 -gatctctaga aagcttatca acctgaagct ggttccgtgg c 1 <210> 15 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 15 gatcggatcc gtgcccagct c tactgagaa gaatgc 3 S' <210> 16 <211> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 16 gatctctaga aagct tatca gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 43 <210> 17 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético 5 <400> 17 gatcggatcc ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 40 <210> 18 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 18 10 Satctctaga aagcttatca caaggcaatg agatagacaa tggcc 45 <210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido sintético <400> 19 gazcggatcc ctggtgctgg tctgtgttct ggc tgcgc 38 15 <210> 20 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial' Oligonucleótido sintético <400> 20 ^ gatctctaga aagcttatca caagttggca gaagtggctg c 41 20 í?KUttí . i^fm .. <210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 21 gatctctaga atgacaggtk ctggtcatgc aagc " 34 <210> 22 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 22 gatctctaga atggtgccca gctctactga gaagaa tgc 39 10 <210> 23 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 23 gaoctctaga atgggctcag cttctactct ggtgcacaac ggc 43 15 <210> 24 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 24 gatctctaga atgctggtgc tggtctgtgt tctggttgcg c 41 20 &¡áb - - , t 1 . — -. a*?- - ~- ' ..-. - - ¡S.M*¡*¡SM* <210> 25 <21 1> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial' Oligonucleótido sintético <400> 25 3gcggtggag cccggggctg gc tgt 26 <210> 26 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 26 aacctgaagc tggttccgtg ge 22 <210> 27 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 27 gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 2 S <210> 28 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial' Oligonucleótido sintético <400> 28 gctgggaatt gagaatggag tgctcctgc 29 <210> 29 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 29 ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 30 5 <210> 30 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 30 caaggcaatg agatagacaa tggcc 25 <210> 31 10 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 31 ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcg 27 <210> 32 <211> 40 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 32 gatctctaga atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 20 »*&--»»>&* yéjí <210> 33 <211> 68 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 33 5 tcaccagcga gacgggcaac agccatgcac cactaccgtg cctcccacct ctgagacgga 60 gcaccagg 68 <210> 34 <211> 66 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 34 O ccoccgtctc agaggtggga ggcacggtag tggtgcatgg ctgttgcccg tctcgctggt 60 <210> 35 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 35 15 gaaaag 66 <210> 35 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético <400> 35 gatcggatcc tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgc 35 20 nff-[¡lllri fBa'IJfa*----J*'B- '-• •"• *- *""*-- • trl-ii-? i ü i ti ra. i ni. . ~t""~

Claims (3)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN •t REIVINDICACIONES 5 1.- Una composición farmacéutica que contiene, en combinación con excipientes y adyuvantes adecuados, uno o más plásmidos de expresión de mamíferos diferentes, cada uno comprendiendo una secuencia que codifica para un fragmento diferente de la proteína mucina (MUC-1 ), en donde dicha secuencia se caracteriza porque: a) en el caso de que más de un 10 fragmento de MUC-1 se codifique, se selecciona del grupo de secuencias que tienen de 200 a 700 nucleótidos, contiguos o que se sobreponen parcialmente sobre una región de 50 a 150 nucleótidos en los extremos respectivos 3' o 5', o b) en el caso de que solamente uno de los fragmentos se codifique, es el que se reporta en la figura 5. 15 2 - Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque contiene al menos dos plásmidos diferentes. 3.- Una composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque contiene al menos tres plásmidos diferentes. 4.- Una composición de conformidad con la reivindicación 3, 20 caracterizado además porque contiene al menos cuatro plásmidos diferentes. 5.- Una composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque contiene al menos dos plásmidos diferentes cuyas secuencias que codifican los fragmentos MUC-1 se seleccionan de aquellas reportadas en las figuras 1 , 2, 3 y 4. 6.- Una composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque contiene cuatro diferentes plásmidos cuyas secuencias codifican fragmentos de MUC-1 se seleccionan de aquellos reportados en las figuras 1 , 2, 3 y 4. 7.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1-6, caracterizada además porque la secuencia que codifica fragmentos de MUC-1 está precedida en el extremo 5' por la secuencia, reportada en la figura 6, que codifica la ubiquitina y un promotor Lacl de Escherichia coli. 8.- Una composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la construcción de la secuencia que codifica al fragmento MUC-1 está precedida en el extremo 5' por la secuencia que codifica ubiquitina y una porción Lacl de Escherichia coli, se selecciona de aquellas reportadas en cualquiera de las figuras 7, 8, 9 y 10. 9.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque contiene una mezcla de diferentes plásmidos que llevan cada una de las construcciones de las figuras 7, 8, 9 y 10. 10.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el plásmido contiene la construcción de la figura 11. 11.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la secuencia que codifica el fragmento MUC-1 está insertada en el vector de expresión pMRS30 descrito en la figura 13. 12.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque contiene una 5 citocina o un plásmido que codifica citocina. 13.- Un plásmido que consiste del vector de expresión pMRS30 de la figura 13 fusionado con una secuencia que codifica el fragmento MUC-1 seleccionado de aquellas descritas en las figuras 1 , 2, 3, 4, y 5. 14.- Un plásmido que consiste del vector de expresión pMRS30 10 de la figura 13 fusionado con una construcción seleccionada de aquellas t descritas en las figuras 7, 8, 9, 10 y 11. 15.- Una molécula de ADN seleccionada de aquellas reportadas en las figuras 7, 8, 9, 10, 11. 16.- El uso de una molécula de ADN de conformidad con la 15 reivindicación 16, en donde se utiliza para la preparación de una composición con efecto anti-tumoral.