DE69827495T2 - Immunotherapie chronischer Hepatitis B Virusinfektion mittels DNA-Immunisierung - Google Patents

Immunotherapie chronischer Hepatitis B Virusinfektion mittels DNA-Immunisierung Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für DNA-basierte Immuntherapie an mit Hepatitis-B-Virus infizierten Patienten.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Virale Hepatitis ist eine allgemeine Bezeichnung, die für Infektionen der Leber verwendet wird, die durch einen von zumindest fünf verschiedenen Hepatitis-Viren – den Hepatitis-Viren A, B, C, D und E – ausgelöst werden. Abgesehen von der Ätiologie ist der Ablauf akuter viraler Hepatitis ähnlich und kann in vier klinische Phasen unterteilt werden: (a) die Inkubationszeit, die der Zeitspanne zwischen der Aussetzung und den ersten Tagen der Symptome oder der Gelbsucht entspricht, (b) ein Prodromalstadium oder präikterisches Stadium, (c) das ikterische Stadium und (d) die Genesungszeit. Die Inkubationszeit für virale Hepatitis Typ B ("HBV") liegt im Bereich von 45 bis 120 Tagen und wird durch mehrere Faktoren wie die Größe des Inokulums und Wechselwirkungen zwischen dem Virus und dem Wirt beeinflusst. L.F. Barker und J.E. Maynard, Am. J. Med. Sci. 263, 27–33 (1972).
  • In den Vereinigten Staaten zählt chronische Lebererkrankung zu den zehn Haupttodesursachen unter Menschen. Beinahe 50 % dieser Todesfälle sind Personen unter 60 Jahren. Unglücklicherweise bleibt die große Mehrheit der Patienten mit chronischer Hepatitis B zahlreiche Jahre symptomlos, obwohl biochemische Beweise für die Erkrankung möglicherweise vorliegen. Virale Hepatitis ist immer noch ein zentrales Problem der Volksgesundheit. Im Jahr 1993 wurden 43.012 Fälle von Hepatitis-Erkrankungen gezählt, was eine statistisch belegte Häufigkeit von 17 Erkrankungsfällen pro 100.000 Menschen ergibt. (Centers for Disease Control and Prevention. Final 1993 Reports of Specified Notable Diseases. MMWR 43, 597–603 (1994).) Etwa ein Drittel dieser Fälle wurde als Hepatitis B bestimmt.
  • Chronische Infektionen mit HBV betreffen mehr als 200 Millionen Menschen weltweit. Diese tragen ein großes Risiko in sich, Zirrhose und Leberzellenkarzinome zu entwickeln. M. Feitelson, Clin. Micro. Rev. 5, 275–301 (1992). Das Stoppen chronischer Hepatitisinfektion könnte die Entwicklung dieser Schäden unterbinden. Nucleinsäure-basierende Vakzinen haben das Potential, im Rahmen von Massenimmunisierungen eingesetzt zu werden, da sie kostengünstig sind und einfach kombiniert werden können, um vielwertige Immunogene herzustellen. Die hohe Rate vertikaler Übertragung von HBV in Asien und Afrika stellt ein großes Problem dar, wie chronische HBV-Infektionen zu behandeln sind bzw. ihnen ein Ende zu setzen ist.
  • Mit gewissem Erfolg wurden Versuche unternommen, um der chronischen HBV-Infektion mit herkömmlichen HBV-Vakzinen ein Ende zu setzen. In zwei Berichten von Studien, im Rahmen derer herkömmliche Drei-Dosen-Immunisierungstherapien verwendet wurden, wiesen 3 von 14 und 11 von 42 Patienten negative Resultate in Bezug auf HBV-DNA auf. S. Pol et al., C.R. Acad. Sci. III 7, 688–691 (1993); und S. Pol et al., Lancet 344, 342 (1994); S.M. Fazle Akbar, J. Hepatology 26, 131–137 (1997), berichteten, dass wiederholte monatliche Immunisierung von HBV-transgenen Mäusen mit HBsAg in Freundschem komplettem Adjuvans, das intraperitoneal verabreicht wurde, HBsAg bei 25 von 32 Mäusen abbaute. Diese Strategie kann jedoch aufgrund der Toxizität von Freundschem komplettem Adjuvans nicht direkt auf Menschen umgelegt werden.
  • Mancini et al. berichteten von Abbau von zirkulierendem HBsAg und von Leber-HBV-RNA von transgenen Mäusen, die für das HBV-Genom mit deletiertem Kerngen kodiert, worauf Immunisierung mittels einer einzelnen Injektion von Plasmid folgte, das für S- und Prä-S2-Determinanten von HBV kodiert. M. Mancini, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12496–12501 (1996). Auch rekombinantes Enten-Hepatitis-B-Virus-Vakziniavirus wurde in einem Versuch eingesetzt, chronische Enten-Hepatitis-B-Infektion zu beenden. Z.M. Ma, Y.Y. Kong, Y. Wang, Y.M. Wen, Acta Virologica 40, 311–314 (1996). Es konnte zwar ein kurzfristiges Abfallen des Oberflächen-Antigentiters, jedoch keine permanente Auflösung beobachtet werden.
  • Davis et al. untersuchten die Wirkungen der Immunisierung von Mäusen mit Plasmid-DNA-Expressionsvektoren, die für HBsAg kodieren (Vaccine, Bd. 14(9), 910–915 (1996)), und sie verwendeten Mäuse, die für HBsAg transgen waren, als ein Modell für chronische Infektion mit HBV (Vaccine, Bd. 15(8), 849–852 (1997)). Weiters untersuchten Prince et al. die Entwicklung von Antikörper-Reaktionen in neugeborenen Schimpansen, die mit für HBsAg kodierenden Plasmid-DNA-Expressionsvektoren immunisiert wurden (Vaccine, Bd. 15(8), 916–919 (1997)).
  • Immuntherapeutische Behandlung von chronisch infizierten Versuchspersonen nach Verabreichung von DNA-basierter Immunisierung, um HBV-DNA-Replikation mit HBsAg-Determinanten zu stoppen, wurde hiervor an chronisch infizierten Säugetieren noch nicht noch nicht durchgeführt oder ausgewertet.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Transkriptionseinheiten nach Anspruch 1 bei der Herstellung einer Immuntherapie zur Verwendung bei Verfahren für DNA-basierte Immuntherapie von Säugetieren im Rahmen der Behandlung chronischer Hepatitis-B-Infektion. Insbesondere umfasst die DNA-basierte Immunisierung die Injektion von DNA-Transkriptionseinheiten, die für zumindest eine Hepatitis-B-Oberflächenantigen- (HBsAg-) Determinante kodieren, woraufhin Booster-Injektionen von DNA-Transkriptionseinheiten folgen, die für zumindest eine HBsAg-Determinante kodieren.
  • Das Verfahren zur DNA-basierten Immuntherapie umfasst das Verabreichen einer ersten DNA-Transkriptionseinheit, die DNA, die zumindest für ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) und eine Leadersequenz zur Sekretion von translatiertem Protein kodiert, umfasst, an eine chronisch infizierte Versuchsperson. Die Aufnahme der DNA-Transkriptionseinheit durch die Wirtszellen führt zur Expression und Sekretion des Hepatitis-B-Antigens oder der Hepatitis-B-Antigene, wodurch eine Immunreaktion hervorgerufen wird. Die hervorgerufene Immunreaktion sorgt für immunthera peutische Behandlung chronischer Hepatitis-B-Infektion. Im Anschluss an die Verabreichung der ersten Transkriptionseinheit wird eine zweite DNA-Transkriptionseinheit verabreicht, die für zumindest ein HBsAg kodierende DNA umfasst. Die Aufnahme der zweiten DNA-Transkriptionseinheit durch Wirtszellen führt zur Expression des Hepatitis-B-Antigens oder der Hepatitis-B-Antigene, wodurch eine zweite Immunreaktion hervorgerufen wird. Nach der Verabreichung der zweiten Transkriptionseinheit wird eine dritte DNA-Transkriptionseinheit verabreicht, die für zumindest ein HBsAg kodierende DNA umfasst. Die dritte DNA-Transkriptionseinheit ist in einem attenuierten Vakzinevirus enthalten, das in der Lage ist, Säugetierzellen zu infizieren, sich in diesen jedoch nicht zu replizieren. Die dritte Transkriptionseinheit umfasst zumindest eine Expressionskassette, die für zumindest ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert. Die Aufnahme der dritten DNA-Transkriptionseinheit durch Wirtszellen führt zur Expression des Hepatitis-B-Antigens oder der Hepatitis-B-Antigene, wodurch eine dritte Immunreaktion hervorgerufen wird.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt die Ergebnisse der Immunisierung und Booster-Impfungen bei einem mit HBV chronisch infizierten Schimpansen dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Säugetiere, die mit HBV chronisch infiziert sind, gegen Hepatitis-B-Antigen oder -Antigene immunisiert, wodurch eine Immunreaktion hervorgerufen wird, die für immuntherapeutische Behandlung chronischer Hepatitis-Infektion über das Stoppen von viraler HBV-DNA-Replikation sorgt. Die Verfahren DNA-basierter Immuntherapie lösen bei chronisch infizierten Säugetieren, besonders bei Menschen im Kindes- bis Erwachsenenalter, schützende immuntherapeutische Behandlung aus.
  • Direkte Genübertragung kann unter Verwendung viraler Vektoren oder rekombinanter Plasmid-DNA, die in sich klonierte Gene trägt, die in situ zu exprimieren sind, durchgeführt werden. Die Verwendung reiner Plasmid-DNA bietet im Vergleich zu viralen Vektoren zum Zweck der Immunisierung Vorteile, z.B. einfachere und raschere Herstellung, leichtere Qualitätskontrolle, Nicht-Integration der DNA, mangelnde Immunogenität des Vektors selbst, einfache und günstigere Herstellung zur Verwendung in Entwicklungsländern und die Hitzebeständigkeit von DNA, die in lyophilisierter Form oder bei 4°C gelagert werden kann.
  • Die hierin verwendete Bezeichnung "Immunisierung" bezieht sich auf das Hervorrufen einer Immunreaktion, die für verbessernde (teilweise oder gänzliche) Behandlung chronischer Infektion sorgt.
  • Die hierin verwendete Bezeichnung "DNA-basierte Immunisierung" bezieht sich auf das Auslösen einer Immunreaktion auf ein in vivo exprimiertes Protein-Antigen nach der Verabreichung von Plasmid- oder Vektor-DNA, die für die Polypeptidsequenz kodiert. Die resultierende In-situ-Produktion des Proteins kann biosynthetisches Processing und posttranslationelle Modifikationen einbinden. Dieses Immunisierungsverfahren unterscheidet sich von der Verwendung klassischer Vakzinen, die sich aus dem Antigen in Form eines ganzen Pathogens, eines getöteten Virus oder getöteter Bakterien, eines attenuierten Virus oder attenuierter Bakterien oder einer Untereinheits-Komponente (z.B. gereinigte oder rekombinante Proteine oder synthetische Peptide) zusammensetzen.
  • Die hierin verwendete Bezeichnung "chronisch infiziert" bezeichnet jene Personen, die zumindest ein Jahr lang nach Infektion mit dem Virus-durchwegs positive Ergebnisse hinsichtlich der Gegenwart von HBV-DNA, gemessen mittels Standard-PCR-Testverfahren (siehe nachstehend unter Materialien und Verfahren) und hinsichtlich des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg), gemessen mittels Standard-Antikörper-Testscreenens, aufweisen.
  • Die hierin verwendete Bezeichnung "schützende immuntherapeutische Behandlung" ist als das Stoppen von HBV-DNA-Produktion im Anschluss an DNA-basierte Immunisierung mit HBsAg-Determinanten definiert.
  • Ultrastrukturelle Untersuchung von Seren aus Hepatitis-B-Patienten zeigen drei unterschiedliche morphologische Formen: das komplette Hepatitis-B-Virion (HBV), ein 42-nm-doppelschaliges Partikel, das aus einer aus Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) zusammengesetzten Hülle, einem Hepatitis-B-Kernantigen (HBcAg) als innerem Kern, das eng mit dem Nucleocapsid assoziiert ist, das sein eigenes bestimmtes Antigen enthält, und dem Hepatitis-Be-Antigen (HBeAg) besteht.
  • HBsAg wird durch ein einzelnes Gen mit einem großen offenen Leseraster kodiert, der drei Startcodons enthält, die das Gen in S, pre-S1 und pre-S2 teilen. Die drei Polypeptide mit unterschiedlichen Längen, die hergestellt werden können, sind als die kleinen (S), mittleren (M, pre-S2 + S) und großen (L, pre-S1 + pre-S2 + S) Proteine bekannt. Die Hülle des infektiösen Partikels von HBV enthält alle drei Formen. H.L. Davis et al., Vaccine 12, 1503–1509).
  • Das immuntherapeutische Verfahren der Erfindung umfasst: die Injektion einer immuntherapeutisch wirksamen Menge eines ersten sekretorischen Plasmids, das eine DNA-Transkriptionseinheit umfasst, die für das HBsAG-S-Protein kodiert, worin das Plasmid in der Lage ist, sich in einer Säugetierzelle zu replizieren, und eine Transkriptionseinheit enthält, die für eine translatierte Leadersequenz kodiert, die das translatierte HBsAg-S-Protein mit der Fähigkeit bereitstellt, aus der Zelle nach der Proteinproduktion sekretiert zu werden. Das für das HBsAg-S-Protein kodierende Gen wird in die Transkriptionseinheit so insertiert, dass es im Raster mit den Promotor- und Leadersequenzen ist, die im Plasmid enthalten sind, und dass der offene HBsAg-S-Leseraster des Proteins im Raster hergestellt wird.
  • Das erste sekretorische Plasmid wird am Tag 0 durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
  • Eine immuntherapeutisch wirksame Menge eines zweiten Nicht-Sekretorplasmids wird anschließend injiziert, wobei das Nicht-Sekretorplasmid eine DNA-Transkriptionseinheit, die für HBsAg-S-Protein kodiert, enthält, worin das Plasmid in der Lage ist, sich in einer Säugetierzelle zu replizieren, und worin das Plasmid keine einzige Transkriptionseinheit enthält, die für eine Leadersequenz kodiert, die zur Sekretion translatierter Proteine erforderlich ist. Das für das HBsAg-S-Protein kodierende Gen wird so in die Transkriptionseinheit insertiert, dass es im Raster mit der im Plasmid enthaltenen Promotorsequenz ist, sodass der offene HBsAg-S-Leseraster des Proteins im Raster hergestellt wird.
  • Das zweite Nicht-Sekretorplasmid wird 2–6 Wochen nach Tag 0 durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Eine besonders bevorzugte Zeit für die Injektion des zweiten Nicht-Sekretorplasmids ist Woche 4.
  • Nach Verabreichung der ersten und der zweiten Plasmidtranskriptionseinheiten wird eine immuntherapeutisch wirksame Menge einer Boosterinjektion eines attenuierten Vakzinevirus verabreicht. Das attenuierte Virus ist in der Lage, Säugetierzellen zu infizieren, kann sich jedoch nicht in ihnen replizieren, und es enthält zumindest eine Expressionskassette, die für zumindest eines der folgenden Hepatitis-Oberflächenantigene von HBV kodiert: die L-Form, bestehend aus HBsAg(S), pre-S1 und Pre-S2; und die M-Form, bestehend aus HBsAg(S) und Pre-S2.
  • Booster-Injektionen der nicht-replizierenden Vakzine können sowohl intramuskulär als auch intravenös verabreicht werden, z.B. in den Wochen 13–17 und 26–30. Besonders bevorzugte Zeiten für Booster-Injektionen der nicht-replizierenden Vakzine sind Woche 15 und 28.
  • Jedes beliebige, passende, physiologisch kompatible Medium ist zur Einführung des Plasmids oder für Booster-Injektionen in eine Versuchsperson geeignet. Ein besonders bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte Salzlösung (PBS).
  • Eine geeignete Immunisierungsdosierung für den Beginn der immuntherapeutischen Behandlung chronisch infizierter Versuchspersonen ist wie folgt definiert: auf der Grundlage einer Dosis pro Kilogramm erhält eine Versuchsperson intramuskuläre Injektionen von 0,004 bis 0,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Injektion, sowohl für die erste Sekretorplasmid-DNA und die zweite Nicht-Sekretorplasmid-DNA, die für das HBsAg-S-Protein kodiert. Jede Injektion wird in einem Volumen von 1–3 ml verabreicht. Ein besonders bevorzugtes Volumen beträgt 2,0 ml. Die nichtreplizierende virale Booster-Vakzine wird in einer Dosis von 106–108 PFU pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht. Jede intramuskuläre oder intravenöse Booster-Injektion wird in einem Volumen von 0,25–1 ml verabreicht. Ein besonders bevorzugtes Volumen beträgt 0,50 ml.
  • Bei intramuskulärer Injektion von Plasmid-DNA-Transkriptionseinheit und Booster-Injektionen wird jede Verabreichung an 1–20 verschiedenen Stellen verabreicht. Eine besonders bevorzugte Anzahl an Stellen für intramuskuläre Injektionsverabreichung beläuft sich auf 4 unterschiedliche Stellen.
  • BEISPIEL
  • Dieses Beispiel illustriert die Behandlung eines Säugetiers, das mit Hepatitis-B-Virus chronisch infiziert ist, d.h. das sich im chronischen Trägerzustand befindet. Immunisierung mit für HBsAg kodierenden Plasmiden, gefolgt von Boosts mit einer Kanarienvogel-Pocken-Vakzine, die für HBsAg kodiert, resultiert im Verschwinden nachweisbarer HBV-DNA, das eine Woche nach dem Kanarienvogel-Pocken-Booster einsetzt und die gesamte Dauer der Nachbehandlung anhält.
  • Plasmidkonstrukte
  • Plasmid pJW-So, das für das Produkt des S-Gens von HBV kodiert und es sekretiert, wird für die erste DNA-basierte Immunisierung verwendet. Das pJW-So-Plasmid basiert auf pJW4303, das Gene enthält, die für β-Lactamase, SV40-Repli kationsstartpunkt, CMV-iA-Promotor und die Rinder-Wachstumshormon-TPA-Leadersequenz kodieren. Das S-Gen von HBV-Strang ayw wurde unter Verwendung einer PCR-Sequenz mit einem Stromauf-Primer, der eine Nhel-Stelle enthielt und an das zweite 5'-Aminosäurecodon des S-Gens hybridisiert, in die Polylinker-Nhel/Bgl-II-Stelle insertiert. Ein Primer wurde für das 3'-Ende des S-Gens verwendet, das eine BgI-II-Stelle enthielt. Die für 225 Aminosäuren kodierende Sequenz wurde mittels des obigen Verfahrens insertiert, was im 5'-Ende im Raster mit dem TPA-Leader an der Nhel-Stelle resultierte.
  • Plasmid pIII-So, das für HBsAg kodiert, jedoch nicht HBsAg sekretiert, wird für die zweite DNA-basierte Immunisierung nach 4 Wochen verwendet. Dieses Konstrukt basiert auf dem pCDNA3-Plasmid (Invitrogen Corp., San Diego, CA), das Gene enthält, die für B-Lactamase, SV40-Replikationsstartpunkt, frühe Haupt-Zwischenprodukt-CMV-Promotor/Enhancer-Region und das Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal kodieren. Das Plasmid weist keine Leadersequenz zur Sekretion auf. Das S-Gen von HBV-Strang ayw wurde nach dem zuvor für das pJW-So-Plasmid beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer PCR-Sequenz mit einem Stromauf-Primer, der eine HindIII-Stelle aufwies und an das zweite 5'-Aminosäurecodon des S-Gens hybridisierte, in die Polylinker-HindIII/BgI-II-Stelle insertiert. Ein Primer wurde für das 3'-Ende des S-Gens verwendet, das eine BgI-II-Stelle enthielt. Die für 225 Aminosäuren kodierende Sequenz des S-Gens wurde mittels dieses Verfahrens insertiert, was im 5'-Ende im Raster an der HindIII-Stelle resultierte.
  • Die Plasmide wurden durch Doppelbanding in CsCl-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt.
  • Kanarienvogelpocken-Konstrukt
  • Das Kanarienvogelpocken-Konstrukt: ALVAC HBV L;M (vCP 157) verwendet als einen Vektor den ALVAC-Vakzinenstamm von Kanarienvogelpocken. Virogenetics Corp., Troy N.Y.; und J. Tartaglia et al., Virology 188, 217–232 (1992). ALVAC HBV L;M enthält zwei Expressionskassetten, die für zwei verschiedene Formen des Oberflächenantigens des ayw-Stamms von HBV kodieren: die L-Form, bestehend aus HBsAg(S), pre-S1 und Pre-S2; und die M-Form, bestehend aus HBsAg(S) und Pre-S2.
  • Chronisch infizierter Schimpanse
  • Schimpanse 292, Fr. Thatcher, wurde im Jahr 1981 geboren und wurde durch ein Experiment, bei dem im Jahr 1985 HBV geimpft wurde, chronisch mit HBV infiziert. Das Tier blieb 12 Jahre lang ohne Infektion HBsAg-positiv. Nach der akuten Infektionsphase waren Leberhistologie, PCR-HBV-DNA-Tests und HBsAg-Proteintests bis zum Ende der Nachbehandlung charakteristisch für chronische, persistierende Hepatitis.
  • Immunisierung
  • Dem chronisch infizierten Schimpansen 292 wurden 2 ml, die 2,0 mg pJW-So-Plasmid- (Sekretor-) DNA in phosphatgepufferter Salzlösung(PBS) enthielten, intramuskulär in den Deltamuskel und den Quadrizeps an 4 verschiedenen Stellen in Woche 0 injiziert.
  • In Woche 4 wurden dem Schimpansen 292 2 ml, die 2,0 mg pIII-So-Plasmid- (Nicht-Sekretor-) DNA in PBS enthielten, intramuskulär an 4 verschiedenen Stellen, wie zuvor bei der pJW-So-Immunisierung beschrieben, injiziert.
  • In Woche 15 wurde Schimpanse 292 mit ALVAC HBV L;M 4 × 108 PFU in 0,50 ml PBS intramuskulär (bilateral) an 4 verschiedenen Stellen und 4 × 108 PFU in 0,50 ml PBS intravenös geboostet. Dieses Boost-Verfahren wurde in Woche 28 wiederholt.
  • Hauttests
  • In den Wochen 17 und 30 wurden Hauttests durch intradermale Injektion von 10, 1 und 0,1 μg von gereinigtem, inaktiviertem HBsAg durchgeführt. (Wuhan Institute of Biological Products, Wuhan, China.) Dieses Antigen wird aus infiziertem Plasma mittels Ammoniumsulfatfällung, CsCl-Banding und Pepsinverdau hergestellt. Das Antigen wird mit Formalin inaktiviert, ihm wird jedoch kein Alaun zugesetzt.
  • PCR-Test für HBV-DNA
  • DNA wurde unter Verwendung des QiaAmp-Sets (Diagen, Hilden, Deutschland) laut Anleitung des Herstellers aus Serum isoliert.
  • Quantitative HBV-DNA-Tests wurden unter Verwendung des AmpliSensor-Testsystems laut Anleitung des Herstellers durchgeführt (Biotronics, Lowell, Mass.). Das AmpliSensor-System überwacht die Amplifikation der PCR-Reaktion über einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Ursprünglich wurde eine Sequenz aus dem HBsAg-Gen auf asymmetrische Weise hergestellt, wodurch eine 241 Nucleotide lange, einzelsträngige DNA gebildet wurde. Diese wurde dann auf halbverschachtelte Weise in Gegenwart eines fluoreszierenden Primerduplex reamplifiziert, woraus ein 66 bp langes Amplicon entstand, das unter Verwendung des Amplisensor Minilyzer (Biotronics) quantifiziert wurde. Biotronics stellte ein für das HBsAg-Gen kodierendes Plasmid zur Verwendung als Quantifizierungsstandard zur Verfügung. Reihenverdünnungen dieses Plasmids wurden in jedem Durchgang doppelt laufen gelassen. Das Accugene-System basiert auf Reihen-Fluoreszenz-Messungen, die zwischen dem 22. und dem 41. Durchlauf durchgeführt werden. Hierbei wurden die Mikroplatten im gesamten Durchlauf- und Leseverfahren abgedichtet. Dies trug hauptsächlich der Kontrolle von Verunreinigungen bei. Die PCR-Anordnung wurde in einer Laminarbox in einem dafür bestimmten Raum zum Einsatz gebracht, aus dem Plasmide und Amplicone ausgeschlossen waren.
  • Quantifizierung von HBsAg
  • Quantitative Bestimmungen von HBsAg wurden mittels des Verfahrens nach Hollinger et al. unter Verwendung des WHO International HBsAg Standards als ein Standard zur Wirksamkeit durchgeführt. F.B. Hollinger, C.L. Troisi, P.E. Pepe, J. Infect. Dis. 153, 156–159 (1986).
  • Tests für HBeAg und Anti-HBE
  • HBeAg und Anti-HBe wurden mit Sets nachgewiesen, die von Abbott Laboratories (North Chicago, III.) zur Verfügung gestellt wurden.
  • Ergebnisse
  • 1 fasst die Ergebnisse für diese Studie zusammen. HBV-DNA-Konzentrationen fluktuierten zwischen 5,0 und 5,4 log10 HBV-DNA-Moleküle/ml bis Woche 14, also genau vor Injektion des ALVAC-Boosters. Eine Woche nach dem Booster fiel die HBV-DNA-Konzentration auf 2,8 log10 HBV-DNA-Moleküle/ml. Danach war HBV bei der Empfindlichkeit des Tests (< 2,5 log10 DNA-Moleküle/ml) die gesamten 22 Wochen der Nachbehandlung lang nicht mehr nachweisbar.
  • Der HBsAg-Gehalt fiel nur geringfügig nach dem ALVAC-Booster und stieg anschließend wieder auf eine normale Konzentration an. Hinsichtlich der Transaminase- (ALT, AST) Konzentrationen konnten keine Anomalien festgestellt werden (Daten nicht dargestellt).
  • Vor der Behandlung wies das Tier sowohl für HBeAg als auch für Anti-HBe positive Werte auf. Kurz nach der ALVAC-Behandlung wurde der HBeAg-Wert negativ, während Anti-HBe positiv blieb, wobei jedoch in den Wochen 28 und 30 HBeAg wieder aufschien und Anti-HBe nicht mehr nachweisbar war.
  • Die Hauttests wurden nach 24 und 48 Stunden ausgewertet und wiesen bei keiner der Konzentrationen Indurationen auf, d.h. es wurde keine Empfindlichkeit beobachtet.
  • Die vorliegende Erfindung dient somit der Behandlung chronischer viraler Hepatitis-B-Infektionen durch die lang andauernde Inhibition von HBV-Replikation. Diese therapeutische Immunisierung dient der Behandlung und der Kontrolle von HBV-Replikation bei Patienten mit chronischer Hepatitis-B-Infektion. Eine derartige Kontrolle der Virusreplikation kann das Entstehen chronischer Schäden des chronischen Trägerzustands unterbinden.
  • Die vorliegende Erfindung ist durch die hierin beschriebenen, spezifischen Ausführungsformen oder Modelle nicht im Schutzumfang beschränkt: Fachleuten werden aufgrund der obigen Beschreibung zusätzlich zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen verschiedene Modifikationen der Erfindung zugänglich sein. Solche Modifikationen fallen selbstverständlich in den Schutzumfang der beiliegenden Patentansprüche.

Claims (20)

  1. Verwendung (i) einer ersten DNA-Transkriptionseinheit, die DNA umfasst, die für zumindest ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen und eine Leadersequenz zur Sekretion von translatiertem Protein kodiert; (ii) einer zweiten DNA-Transkriptionseinheit, die DNA umfasst, die für zumindest ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert; und (iii) einer dritten DNA-Transkriptionseinheit, die zumindest eine DNA-Expressionskassette umfasst, die für zumindest ein in einem attenuierten rekombinanten viralen Vektor enthaltenes Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einer DNA-basierten immuntherapeutischen Behandlung von mit Hepatitis B chronisch infizierten Säugetieren, worin die Immuntherapie Folgendes umfasst: (a) intramuskuläre Verabreichung einer immuntherapeutisch wirksamen Menge einer ersten DNA-Transkriptionseinheit, die DNA umfasst, die für zumindest ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen und eine Leadersequenz zur Sekretion von translatiertem Protein kodiert, worin die Aufnahme der DNA-Transkriptionseinheit durch Wirtszellen zur Expression und Sekretion des Hepatitis-B-Oberflächenantigens führt und eine Immunreaktion hervorruft; (b) intramuskuläre Verabreichung einer immuntherapeutisch wirksamen Menge einer zweiten DNA-Transkriptionseinheit, die DNA umfasst, die für zumindest ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert, nach Verabreichung der ersten Transkriptionseinheit, worin die Aufnahme der zweiten DNA-Transkriptionseinheit durch Wirtszellen zur Expression des Hepatitis-B-Antigens führt und eine zweite Immunreaktion hervorruft; (c) Verabreichung einer immuntherapeutisch wirksamen Menge einer dritten Transkriptionseinheit, die zumindest eine DNA-Expressionskassette umfasst, die für zumindest ein in einem attenuierten rekombinanten viralen Vektor enthaltenes Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert, nach Verabreichung der zweiten Transkriptionseinheit, worin die Aufnahme der dritten DNA-Transkriptionseinheit durch Wirtszellen zur Expression des Hepatitis-B-Antigens führt, wodurch eine dritte Immunreaktion hervorgerufen wird.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite DNA-Transkriptionseinheit in DNA-Plasmiden enthalten sind.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite DNA-Transkriptionseinheit ein Gen umfassen, das für Hepatitis-B-Oberflächenantigen-S-Protein kodiert.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, worin das für Hepatitis-B-Oberflächenantigen-S-Protein kodierende Gen vom Hepatitis-B-ayw-Stamm abgeleitet ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, worin der die dritte DNA-Transkriptionseinheit enthaltende rekombinante virale Vektor ein attenuierter Kanarienvogel-Pockenvirus-Vektor ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die dritte DNA-Transkriptionseinheit zwei Expressionskassetten umfasst, die jeweils Gene enthalten, die für die L- bzw. M-Form von Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodieren.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin die für die L- bzw. M-Form von Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodierenden Gene vom Hepatitis-B-ayw-Stamm abgeleitet sind.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite DNA-Transkriptionseinheit an 1 bis 20 Stellen injiziert werden.
  9. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Verabreichung der die Plasmide enthaltenden ersten und zweiten DNA-Transkriptionseinheit eine Dosis von 0,004 bis 0,50 mg Plasmid-DNA pro kg Körpergewicht umfasst.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, worin die in dem attenuierten rekombinanten viralen Vektor enthaltene dritte DNA-Transkriptionseinheit in einer Dosis von etwa 106 bis 108 PFU pro kg Körpergewicht verabreicht wird.
  11. Verwendung nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Transkriptionseinheit 2 bis 6 Wochen nach der Verabreichung der ersten DNA-Transkriptionseinheit verabreicht wird.
  12. Verwendung nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Transkriptionseinheit in Woche 4 verabreicht wird.
  13. Verwendung nach Anspruch 1, worin die dritte DNA-Transkriptionseinheit in den Wochen 13 bis 17 mittels Injektion verabreicht wird.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die dritte DNA-Transkriptionseinheit in den Wochen 26 bis 30 mittels Injektion erneut verabreicht wird.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, worin die Injektionen der dritten DNA-Transkriptionseinheit in den Wochen 15 und 28 verabreicht werden.
  16. Verwendung nach Anspruch 1, worin jede Injektion der ersten und zweiten DNA-Transkriptionseinheit in einem Volumen von 1 bis 3 ml verabreicht wird.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, worin jede Injektion in einem Volumen von etwa 2,0 ml verabreicht wird.
  18. Verwendung nach Anspruch 1, worin die dritte DNA-Transkriptionseinheit mittels intramuskulärer und intravenöser Injektion verabreicht wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, worin jede Injektion der dritten DNA-Transkriptionseinheit in Volumen von 0,25 bis 1 ml verabreicht wird.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, worin jede Injektion der dritten DNA-Transkriptionseinheit in einem Volumen von 0,50 ml verabreicht wird.
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