MXPA99007248A - Genes gag de vih sinteticos - Google Patents

Abstract

Se proveen moléculas de ADN sintéticas que codifican para un gag de VIH y modificaciones de gag de VIH;los codones de las moléculas sintéticas son codones que se prefieren por la célula hospedera proyectada, las moléculas sintéticas pueden usarse como una vacuna de polinucleótidos que provea una inmunoprofilaxis efectiva contra la infencción por VIH a través de la estimulación de anticuerpos de neutralización e inmunidad mediada por células.

Description

GENES GAG DE VIH SINTÉTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas contra el VIH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA) y trastornos relacionados. El VIH-1 es un virus de ARN de la familia Retroviridae y exhibe la organización 5'LTR-gag-pol-env- TR3' de todos los retrovirus.

Además, el VIH-1 comprende un grupo de genes con funciones reguladoras o desconocidas, incluyendo los genes tat y rev. El gen env codifica la glucoproteína de la cubierta viral que se traduce como un precursor (gp 160) de 160- ilodaltons (KDa) y es digerido por una proteasa celular para producir la glucoproteína (gp 120) de la cubierta externa de 120-KDa y la glucoproteína (gp41) de la cubierta de transmembrana de 41 -KDa. Las gp120 y gp41 permanecen asociadas y se presentan en las partículas virales y en la superficie de células infectadas por VIH. La gp120 se une al receptor CD4 presente sobre la superficie de linfocitos T auxiliares, macrófagos y otras células objetivo. Después de que la gp120 se une a CD4, la gp41 media el evento de fusión responsable de la entrada del virus.

La infección comienza cuando la gp120 sobre la partícula viral se une al receptor CD4 sobre la superficie de linfocitos T4 u otras células objetivo. El virus unido se fusiona con la célula objetivo y transcribe inversamente su genoma de ARN al ADN de doble cadena de la célula. El ADN viral se incorpora al material genético en el núcleo de la célula, en donde el ADN viral dirige la producción de ARN viral nuevo, proteínas virales, y partículas de virus nuevas. Las partículas nuevas surgen de la membrana de la célula objetivo e infectan otras células. La destrucción de linfocitos T4, decisivos para las defensas inmunológicas, es la causa principal de la disfunción inmunológica progresiva, que es la indicación de la infección por VIH. La pérdida de células objetivo altera seriamente la capacidad del cuerpo para combatir a la mayoría de los invasores, pero tiene un impacto particularmente severo en las defensas contra virus, hongos, parásitos, y ciertas bacterias, incluyendo las micobacterias. El VIH-1 mata las células que infecta al replicarse, surgir de ellas y dañar la membrana de la célula. El VIH-1 puede matar células objetivo indirectamente por medio de la gp120 viral que se presenta sobre una superficie de célula infectada. Debido a que el receptor CD4 en las células T tiene una fuerte afinidad por gp120, las células sanas que expresan al receptor CD4 pueden unirse a gp120 y fusionarse con células infectadas para formar un sincicio.

El VIH-1 también puede inducir defensas inmunológicas celulares normales contra células infectadas. Con o sin la ayuda de anticuerpos, las células defensoras citotóxicas pueden destruir una célula infectada que presente proteínas virales sobre su superficie. Finalmente, las proteínas gag y gp120 libres pueden circular en la sangre de individuos infectados con VIH-1. La proteína gp120 libre puede unirse al receptor CD4 de células no infectadas, haciéndolas parecer infectadas y provocando una respuesta inmunológica. La infección por VIH-1 casi siempre es fatal, y en la actualidad no existen curas para la infección por VIH-1. Todavía no existen vacunas efectivas disponibles para la prevención de la infección por VIH-1. Debido al peligro de reversión o infección, los virus vivos atenuados probablemente no puedan ser usados como una vacuna. La mayoría de los enfoques de vacunas de subunidad no han tenido éxito para prevenir la infección por VIH. Los tratamientos para la infección por VIH-1 , aunque prolongan la vida de algunas personas infectadas, tienen serios efectos secundarios. Por lo tanto, existe una gran necesidad de tratamientos y vacunas efectivos para combatir esta infección letal. La vacunación es una manera efectiva de prevenir las enfermedades y ha demostrado tener éxito contra varios tipos de infección viral. La determinación de maneras para presentar antígenos de VIH-1 al sistema inmunológico humano con el propósito de provocar inmunidad humoral y celular protectora, es una tarea difícil. Hasta ahora, los intentos por generar una vacuna efectiva contra el VIH no han sido exitosos. En pacientes con SIDA, el virus libre sólo se presenta a niveles bajos. La transmisión del VIH-1 es incrementada por la interacción de célula a célula mediante la formación de fusión y sincicia. Por lo tanto, los anticuerpos generados contra las subunidades de virus libre o virales generalmente no son efectivos para eliminar las células infectadas con virus. Las vacunas aprovechan la capacidad del cuerpo para "recordar" un antígeno. Después de los primeros encuentros con cierto antígeno, el sistema inmunológico genera células que retienen una memoria inmunológica del antígeno durante toda la vida del individuo. La exposición subsecuente al antígeno estimula la respuesta inmunológica y como resultado elimina o inactiva al patógeno. El sistema inmunológico se enfrenta con patógenos en dos formas: por respuestas humorales y respuestas mediadas por células. En la respuesta humoral, los linfocitos generan anticuerpos específicos que se unen al antígeno y de esta manera inactivan al patógeno. La respuesta mediada por células involucra linfocitos citotóxicos y linfocitos T auxiliares que atacan y destruyen específicamente células infectadas. El desarrollo de vacunas con virus de VIH-1 presenta problemas ya que el VIH-1 infecta algunas de las mismas células que la vacuna necesita activar en el sistema inmunológico (es decir, linfocitos T4). Sería una ventaja desarrollar una vacuna que inactive el VIH antes de que ocurra la alteración del sistema inmune. Un tipo de vacuna contra el VIH particularmente adecuado generaría una respuesta inmune contra el VIH que reconociera variantes de VIH y que funcionara en individuos VIH positivos que se encontraran en el inicio de la infección. Un reto importante para el desarrollo de vacunas contra virus, particularmente aquellos con una alta velocidad de mutación, tales como el virus de inmunodeficiencia humana, contra el cual se desea el desarrollo de respuestas inmunológicas neutralizadoras y protectoras, es la diversidad de las proteínas de la cubierta viral entre los diferentes aislados o cepas virales.

Debido a que los linfocitos T citotóxicos (CTLs) tanto en ratones como en humanos, son capaces de reconocer epítopes derivados de proteínas virales internas conservadas, y se piensa que son importantes para la respuesta ¡nmunológica contra virus, los esfuerzos se han dirigido hacia el desarrollo de vacunas de CTL capaces de proveer protección heteróloga contra diferentes cepas virales. Se sabe que los CTLs CD8+ matan células infectadas viralmente cuando sus receptores de célula T reconocen péptidos virales asociados con moléculas de MHC clase I. Los péptidos virales se derivan de proteínas virales endógenamente sintetizadas, sin importar la ubicación de la proteína o su función dentro del virus. Por lo tanto, mediante el reconocimiento de epítopes a partir de proteínas virales conservadas, los CTLs pueden proveer protección de cepa cruzada. Los péptidos capaces de asociarse con MHC clase I para el reconocimiento de CTL se originan de proteínas que están presentes o que pasan a través del citoplasma o retículo endoplásmico. En general, las proteínas exógenas, las cuales entran en la vía de procesamiento endosomático (como en el caso de antígenos presentados por moléculas de MHC clase II), no son efectivas para generar respuestas a CTL CD8+. La mayoría de los esfuerzos para generar respuestas a CTL han utilizado vectores de replicación para producir el antígeno de proteína dentro de la célula o se han enfocado en la introducción de péptidos en el citosol.

Estos enfoques tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales tienen restricciones en el tamaño y construcción de polipéptidos que pueden expresarse como proteínas de fusión manteniendo al mismo tiempo la capacidad de replicación del virus recombinante, y la efectividad de vectores tales como vaccinia para inmunizaciones subsecuentes puede comprometerse por respuestas inmunológicas contra los propios vectores. Además, los vectores virales y patógenos modificados tienen riesgos inherentes que podrían impedir su uso en humanos. Más aún, la selección de epítopes de péptidos que será presentada depende de la construcción de los antígenos MHC del individuo y, por lo tanto, las vacunas de péptidos pueden tener efectividad limitada debido a la diversidad de haplotipos de MHC en poblaciones exogámicas. Benvenisty, N., y Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] mostraron que se podía expresar ADN de precipitado por CaCl2 introducido en ratones en forma intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.) o intramuscular (i.m.). La inyección i.m. de vectores de expresión de ADN sin tratamiento con CaC en ratones dio como resultado la captación de ADN por las células musculares y la expresión de la proteína codificada por el ADN. Los plásmidos se mantuvieron episómicamente y no se replicaron. Subsecuentemente, la expresión persistente se ha observado después de la inyección i.m. en músculo esquelético de ratas, peces y primates, y músculo cardiaco de ratas. La técnica para utilizar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos se reportó en WO90/11092 (4 de octubre de 1990), en donde se utilizaron polinucleótidos desnudos para vacunar vertebrados. Para que el método resulte exitoso no es necesario que la inmunización sea intramuscular. La introducción de microproyectiles de oro revestidos con ADN que codifica para hormona de crecimiento humano (HCH) en la piel de los ratones dio como resultado la producción de anticuerpos anti-HCH en los ratones. Se ha utilizado un inyector a chorro para transfectar piel, músculo, grasa y tejidos mamarios de animales vivos. Se han analizado varios métodos para introducir ácido nucleico. Zhu y otros, [Science 261 :209-211 (9 de Julio de 1993) expusieron la inyección intravenosa de un complejo de ADN.liposoma catiónico en ratones, que dio como resultado la expresión sistémica de un transgen clonado. Ulmer y otros [Science 259:1745-1749, (1993)] informaron sobre la protección heteróloga contra la infección del virus de influenza mediante la inyección intramuscular de ADN que codifica para proteínas dei virus de la influenza. La presente invención satisface la necesidad de agentes terapéuticos y profilácticos específicos capaces de inducir respuestas inmunes deseadas contra antígenos patógenos y tumores. En esta propuesta terapéutica es de particular importancia la habilidad para inducir respuestas inmunes de células T, las cuales pueden prevenir infecciones o enfermedades provocadas aun por cepas de virus que sean heterólogas a la cepa de la cual se obtuvo el gen de antígeno. Esto es de suma importancia cuando se trata del VIH, ya que este virus muta rápidamente y se han identificado muchos aislados virulentos [ver, por ejemplo, La Rosa y otros, Science 249:932-935 (1990), identificando 245 aislados separados de VIH]. En respuesta a esta diversidad reconocida, los investigadores intentan generar CTLs en base a la inmunización de péptidos. De esta manera, Takahashi y otros [Science 255:333-336 (1992)] se refirieron a la inducción de células T citotóxicas generalmente de reacción cruzada que reconocen un determinante de la cubierta (gp160) de VIH. No obstante, dichos investigadores reconocieron la dificultad para alcanzar una respuesta de CTL verdaderamente de reacción cruzada y sugirieron que existe una dicotomía entre la iniciación o reestimulación de células T, la cual es muy astringente, y la inducción de la función efectora, incluyendo citotoxicidad, de CTLs ya estimulados. Wang y otros informaron sobre la inducción de respuestas inmunes en ratones contra el VIH mediante la inoculación intramuscular con un gen de VIH clonado, genómico (no empalmado). Sin embargo, el nivel de respuestas inmunes alcanzado en estos estudios fue muy bajo. Además, la construcción de ADN de Wang y otros, utilizó una pieza de VIH esencialmente genómica que codifica para secuencias de codificación contiguas JaXIrev-gp160-Tat/re?/. Como se describe más adelante con mayor detalle, este es un sistema suboptimal para obtener expresiones de alto nivel de gp160. Además es potencialmente peligroso porque la expresión de Tat contribuye al progreso del Sarcoma de Kaposi. El documento WO 93/17706 describe un método para vacunar un animal contra un virus, en donde partículas portadoras fueron revestidas con una construcción de gen y las partículas revestidas son aceleradas en las células de un animal. Con respecto al VIH, se propuso utilizar esencialmente el genoma entero completo, menos las repeticiones terminales largas. Ese método representa riesgos substanciales en los receptores. Generalmente se cree que las construcciones de VIH deben contener menos de alrededor de 50% de genoma de VIH para consolidar seguridad de la vacuna; esto asegura que las porciones enzimáticas y las proteínas reguladoras virales, muchas de las cuales tienen funciones desconocidas o muy poco comprendidas hayan sido eliminadas. Por consiguiente, persiste un número de problemas si una vacuna contra el VIH útil para los humanos surge de la tecnología de suministro de genes. La presente invención contempla cualquiera de los métodos conocidos para introducir polinucleótidos en tejido vivo para inducir la expresión de proteínas. Sin embargo, esta invención provee un ¡nmunógeno novedoso para introducir VIH y otras proteínas en la vía de procesamiento de antígenos para generar eficientemente CTLs específicos de VIH y anticuerpos. El producto farmacéutico es efectivo como una vacuna para inducir respuestas inmunes celulares y humorales de neutralización anti-VIH y de VIH. En la presente invención, los problemas anteriores se establecen y se resuelven al proveer inmunógenos de polinucleótidos los cuales, cuando se introducen en un animal, dirigen la expresión eficiente de proteínas y epítopes de VIH sin los consecuentes riesgos asociados con esos métodos. Las respuestas inmunológicas generadas de esta manera son efectivas para reconocer VIH, inhibir la replicación del VIH, identificar y matar células infectadas por VIH, y son de reacción cruzada contra muchas cepas de VIH. Los apareamientos de codones de organismos son sumamente no aleatorios, y difieren de un organismo a otro. Esta información se utiliza para construir y expresar genes alterados o sintéticos que tengan niveles deseados de eficiencia de traducción, para determinar qué regiones en un genoma son regiones codificadoras de proteínas, para introducir sitios de pausa de traducción en genes heterólogos, y para determinar la relación u origen ancestral de secuencias de nucleótidos. La expresión de genes heterólogos extraños en organismos transformados es ahora algo común. Un gran número de genes de mamífero, incluyendo, por ejemplo, genes de murino y humano, se ha insertado con éxito en organismos unicelulares. Las técnicas estándares relacionadas incluyen la introducción de genes extraños que serán expresados en un vector tal como un plásmido o un fago, y la utilización de ese vector para insertar al gen en un organismo. Los promotores nativos para dichos genes comúnmente son reemplazados con promotores fuertes compatibles con el hospedero en donde el gen es insertado. La maquinaria de determinación de secuencia de proteínas permite dilucidar las secuencias de aminoácidos de cantidades iguales de minutos de proteínas nativas. De estas secuencias de aminoácidos se pueden deducir las secuencias de ADN que codifican para esas proteínas.

La síntesis de ADN también es una técnica que se desarrolla rápidamente, y los genes sintéticos que corresponden a esas secuencias de ADN deducidas pueden ser construidos fácilmente. A pesar del creciente conocimiento de los sistemas de expresión y ADN recombinante, aún existen obstáculos importantes cuando se intenta expresar un gen extraño o sintético en un organismo. Muchas proteínas nativas y activas, por ejemplo, son glucosiladas de una manera diferente a la que ocurre cuando son expresadas en un hospedero extraño. Por esta razón, se pueden preferir los hospederos eucarióticos, tales como levadura, a los hospederos bacterianos para expresar muchos genes de mamífero. El problema de glucosilación es el objeto de una constante investigación. Otro problema es menos entendido. La traducción continua de un gen sintético, aun cuando se acople a un promotor fuerte, actúa en forma mucho menos eficiente de lo que se esperaría. Lo mismo es cierto con frecuencia para los genes exógenos extraños al organismo de expresión. Aun cuando el gen sea transcrito de una manera suficientemente eficiente como para que las cantidades recuperables del producto de traducción sean producidas, la proteína con frecuencia es inactiva o bien, diferente en propiedades a la proteína nativa.

Se sabe que este último problema se debe comúnmente a las diferencias en el doblamiento de proteínas en varios organismos. La solución a este problema ha sido evasiva, y los mecanismos que controlan el doblamiento de proteínas son poco comprendidos. Se cree que los problemas concernientes a la eficiencia de traducción se relacionan con los efectos de contexto de codón. Las regiones codificadoras de proteínas de genes en todos los organismos se encuentran sujetas a una gran variedad de limitaciones funcionales, algunas de las cuales dependen del requisito para codificar una proteína que funcione apropiadamente, así como de señales adecuadas de inicio y detención de traducción. Sin embargo, se han discernido varias características de las regiones de codificación de proteínas que no son fácilmente comprendidas en términos de estas limitaciones. Dos clases importantes de dichas características son las que involucran el uso de codón y el contexto de codones. Se sabe que el uso de codones es altamente polarizado y varía considerablemente entre organismos diferentes. Se ha mostrado que los patrones de uso de codones están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores de ARNt. Los genes que codifican para proteínas de abundancia alta contra baja muestran diferencias en sus preferencias de codones. Se ha descrito ampliamente la posibilidad de que las polaridades en el uso de codones alteren las velocidades de alargamiento de péptidos. Aunque las diferencias en el uso de codones se asocian con diferencias en las velocidades de traducción, los efectos directos de la elección del codón en la traducción han sido difíciles de demostrar. Otras limitaciones propuestas en los patrones de uso de codones incluyen la amplificación de la fidelidad de la traducción y la optimización de la eficiencia cinética de la síntesis de proteínas. Aparte del uso no aleatorio de codones, se ha acumulado suficiente evidencia de que el reconocimiento de codón/anticodón se ve influenciado por secuencias fuera del propio codón, un fenómeno conocido como "contexto de codón". Existe una fuerte influencia de nucleótidos cercanos en la eficiencia de supresión de codones que no son de sentido, así como los codones con falta de sentido. Claramente, la abundancia de actividad supresora en las poblaciones bacterianas naturales, así como el uso de codones de "terminación" para codificar selenocisteína y fosfoserina requieren que la terminación sea dependiente del contexto. Se ha demostrado que los efectos de contexto similares influyen en la fidelidad de la traducción, así como en la eficacia de la iniciación de traducción. Análisis estadísticos de regiones codificadoras de proteína de E. coli demuestran otra manifestación de "contexto de codón". La presencia de un codón particular en una posición influye fuertemente en la frecuencia de ocurrencia de ciertos nucleótidos en codones vecinos, y estas limitaciones de contexto difieren marcadamente para los genes expresados a niveles altos contra bajos. A pesar de que el efecto de contexto ha sido reconocido, el valor que predice las reglas de estadística relacionadas con nucleótidos preferidos adyacentes a los codones es relativamente bajo. Esto ha limitado la utilidad de dichos datos preferidos de nucleótidos para seleccionar codones para producir niveles deseados de eficacia de traducción. El surgimiento de equipo automático de determinación de secuencias de nucleótidos ha puesto a disposición grandes cantidades de datos de secuencia para una gran variedad de organismos. Existen dificultades sustanciales para entender dichos datos. Por ejemplo, es importante identificar las regiones de codificación del genoma para poder relacionar los datos de secuencia genéticos con las secuencias de proteínas. Además, la antigüedad del genoma de ciertos organismos es de interés sustancial. Se sabe que los genomas de ciertos organismos son de antigüedad mixta. Algunas secuencias que son virales de origen ahora se incorporan establemente en el genoma de organismos eucarióticos. Las propias secuencias virales podrían haberse originado en otras especies sustancialmente no relacionadas. El entender la antigüedad de un gen puede ser importante para establecer analogías apropiadas entre los genes relacionados y sus productos de traducción en otros organismos. Existe la necesidad de entender mejor los efectos del contexto de codones en traducción, y de un método para determinar los codones apropiados para cualquier efecto de traducción deseado. También existe la necesidad de encontrar un método para identificar regiones de codificación del genoma de datos de secuencia de nucleótidos. Además se necesita un método para controlar el doblamiento de proteínas y para asegurar que un gen extraño se doble adecuadamente cuando sea expresado en un hospedero. Los genes alterados o construidos de acuerdo con las eficiencias de traducción deseadas serán de gran importancia. Otro aspecto de la práctica de las técnicas de ADN recombinante para la expresión por medio de microorganismos de proteínas de interés industrial y farmacéutico es el fenómeno de "preferencia de codones". Aunque se mencionó antes, la maquinaria existente para la expresión de genes en células hospedero genéticamente transformadas "funcionará" para contsruir cierto producto deseado, los niveles de expresión alcanzados en un microorganismo pueden estar sujetos a una gran variación, dependiendo por una parte de formas alternativas específicas del código genético de especificación de aminoácidos presente en un gen exógeno insertado. Un codón "triplete" de cuatro bases de nucleótidos posibles puede existir en 64 formas de variantes. El hecho de que estas formas provean el mensaje sólo para 20 aminoácidos diferentes (así como la transcripción, iniciación y terminación) significa que algunos aminoácidos pueden ser codificados por más de un codón. De hecho, algunos aminoácidos tienen hasta seis codones alternativos "redundantes", mientras que otros tienen sólo un codón requerido. Por razones que no se entienden por completo, los codones alternativos no se encuentran presentes uniformemente en el ADN endógeno de diferentes tipos de células y parece que existe jerarquía natural variable o "preferencia" para ciertos codones en ciertos tipos de células.

Como un ejemplo, el aminoácido leucina es especificado por cualquiera de los seis codones de ADN que incluyen CTA, CTC, CTG, CTT, TTA y TTG (que corresponden, respectivamente, a los codones de ARNm, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA y UUG). El análisis exhaustivo de frecuencias de codón de genoma para microorganismos ha revelado que el ADN endógeno de E. coli contiene muy comúnmente el codón de especificación de leucina CTG, mientras que el ADN de levaduras y mohos mucilaginosos incluye muy comúnmente un codón de especificación de leucina TTA. Con respecto a esta jerarquía, generalmente se cree que la probabilidad de obtener niveles altos de expresión de un polipéptido rico en leucina por un hospedero de E. coli dependerá hasta cierto punto en la frecuencia de uso de codones. Por ejemplo, un gen rico en codones de TTA en toda probabilidad será expresado deficientemente en E. coli, mientras que un gen rico en CTG probablemente expresará altamente al polipéptido. De manera similar, cuando las células de levadura son las células hospederas de transformación proyectada para la expresión de un polipéptido rico en leucina, un codón preferido para usarse en un ADN insertado sería TTA. Las implicaciones de los fenómenos de preferencia de codones en técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y los fenómenos podrían servir para explicar muchos fracasos anteriores para lograr altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos hospederos transformados con éxito. Un codón menos "preferido" puede estar presente repetidamente en el gen insertado y la maquinaria de la célula hospedera para expresión podría no funcionar tan eficientemente. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que han sido diseñados para incluir codones preferidos de las células hospedero proyectadas, proveen una forma preferida de material genético extraño para la practica de técnicas de ADN recombinante. La diversidad de función que caracteriza a las células eucarióticas depende de la diferenciación estructural de sus límites de membrana. Para generar y mantener esas construcciones, las proteínas deben ser transportadas desde su sitio de síntesis en el retículo endoplásmico hasta destinos predeterminados a lo largo de la célula. Esto requiere que las proteínas de tráfico muestren señales de salida que sean reconocidas por la maquinaria molecular responsable de la selección de rutas localizada en los puntos de acceso a las vías de tráfico principales. Las decisiones de salida para la mayoría de las proteínas necesitan hacerse sólo una vez mientras atraviesan sus vías biosintéticas, ya que su destino final, la localización celular en la cual realizan su función, se convierte en su residencia permanente. El mantenimiento de la integridad intracelular depende en parte de la salida selectiva y del transporte preciso de proteínas a sus destinos correctos. En los últimos años se ha estudiado con ahínco la disección de la maquinaria molecular para identificar y localizar las proteínas. Los motivos de secuencia definidos han sido identificados en proteínas que pueden actuar como "marcas de dirección". Los péptidos líder o de señal, tales como los de la proteína activadora de plasminógeno específica de tejido, tPA, sirven para transportar una proteína en la vía de secreción celular a través del retículo endoplásmico y el aparato de golgi. Un número de señales de salida se ha asociado con los dominios citoplásmicos de las proteínas de la membrana, tales como los motivos del aminoácido di-Leucina o secuencias a base de tirosina que pueden dirigir proteínas a los compartimentos lisosomáticos. Para el VIH, el transporte y la extrusión de la célula de las partículas virales depende de la miristoilación del residuo de glicina número dos en el grupo amino terminal de gag.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen moléculas de ADN sintéticas que codifican para gag de VIH y modificaciones de gag de VIH. Los codones de las moléculas sintéticas incluyen los codones preferidos de las células hospederas proyectadas. Las moléculas sintéticas proveen formas preferidas de material genético extraño. Las moléculas sintéticas pueden utilizarse como una vacuna de polinucleótidos que provea inmunoprofilaxis efectiva contra la infección por VIH neutralizando la inmunidad de anticuerpo y mediada por células. Esta invención provee polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado ]n vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y humanos, inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la expresión relativa de gag y tPA gag en transfectantes de línea celular (293) después de la transfección con el ADN del gag de VIH. La figura 2 muestra respuestas anti-gag de suero mediadas por vacunas de ADN del tPA-gag y gag de VIH optimizadas en ratones. La figura 3 muestra respuestas de CTL anti-gag de esplenocitos obtenidos de ratones después de su vacunación con ADN del tPA-gag o gag VIH optimizadas. La figura 4 muestra secreción de citocina especifica del antígeno gag de esplenocitos obtenidos de ratones después de la vacunación con ADN del tPA-gag o gag de VIH. La figura 5 muestra gag de CTL de anti-VIH de ratones vacunados con ADNs del gag p55 de VIH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proveen moléculas de ADN sintéticas que codifican para gag de VIH y moléculas de ADN sintéticas que codifican para formas modificadas gag de VIH. Los codones de las moléculas sintéticas son diseñados para usar los codones preferidos por la célula hospedera proyectada. Las moléculas sintéticas pueden utilizarse como una vacuna de polinucleótidos que provea inmunoprofilaxis efectiva contra la infección por VIH a través de la neutralización de inmunidad de anticuerpos y mediada por células. Las moléculas sintéticas pueden utilizarse como una composición ¡nmunógena.

Esta invención provee polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y humanos, inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal. Como se utiliza aquí, un polinucleótido es un ácido nucleico que contiene elementos regulatorios esenciales para que cuando sea introducido en una célula viva de vertebrado, sea capaz de dirigir la maquinaria celular para crear productos de traducción codificados por los genes que comprendan al polinucleótido. En una modalidad de la invención, el polinucleótido es un ácido polidesoxirribonucleico que contiene por lo menos un gen de VIH unido operativamente a un promotor de transcripción. En otra modalidad de la invención, la vacuna de polinucleótidos (PNV) comprende ácido polirribonucleico que codifica por lo menos para un gen de VIH que es sujeto a la traducción por la maquinaria celular eucariótica (ribosomas, moléculas de ARNt, y otros factores de traducción). Cuando la proteína codificada por el polinucleótido es una que no ocurre normalmente en el animal excepto en condiciones patológicas (es decir, una proteína heteróloga) tales como proteínas asociadas con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), el sistema inmunológico del animal es activado para emprender una respuesta inmunológica protectora. Debido a que estas proteínas exógenas son producidas por los tejidos del animal, las proteínas expresadas se procesan por el sistema de histocompatibilidad principal, MHC, de una manera análoga a cuando ocurre una infección real con el organismo relacionado (VIH). El resultado, como se muestra en esta descripción, es la inducción de respuestas inmunes contra el patógeno cognado. En consecuencia, los presentes inventores han preparado ácidos nucleicos que, cuando se introducen en el sistema biológico, inducen la expresión de proteínas y epítopes de VIH. La respuesta de anticuerpos inducida es específica para la proteína de VIH expresada, y neutraliza el VIH. Además, se inducen linfocitos T citotóxicos, los cuales de manera específica reconocen y destruyen las células infectadas por VIH. La presente invención provee un método para utilizar un polinucleótido que, cuando se introduce en ei tejido de mamíferos, induce la expresión en una sola célula, in vivo, de productos de gen discretos. La presente invención provee una solución diferente que no requiere manipulaciones múltiples de genes de VIH rev dependientes para obtener genes rev independientes. El sistema de expresión rev independiente descrito aquí es útil por derecho propio y es un sistema para demostrar la expresión ¡n vivo en una sola célula de un solo producto de gen deseado. Debido a que muchos de los usos de la presente invención se aplican a la vacunación antiviral, los polinucleótidos son frecuentemente referidos como una vacuna de polinucleótidos, o PNV. Esto no quiere decir que las utilidades adicionales de estos polinucleótidos, en la estimulación inmune y terapias anti-tumores, se consideren fuera del alcance de la invención. En una modalidad de esta invención, un gen que codifica un producto de gen de VIH se incorpora en un vector de expresión. El vector contiene un promotor de transcripción reconocido por una ARN polimerasa eucariótica, y un terminador de transcripción al final de la secuencia de codificación del gen de VIH. En una modalidad preferida, el promotor es el promotor citomegalovirus con la secuencia de intrón A (CMV-intA), aunque los expertos en la técnica reconocerán que pueden usarse cualquiera de un número de otros promotores conocidos tales como la inmunoglobulina fuerte, u otros promotores de gen eucarióticos. Un terminador de transcripción preferido es el terminador de hormona de crecimiento de bovino. La combinación del terminador CMVintA-BGH es particularmente preferida. Para ayudar en la preparación de los polinucleótidos en células procarióticas, también se incluye preferiblemente un marcador de resistencia a antibióticos en el vector de expresión, bajo el control transcripcional de un promotor procariótico para que la expresión del antibiótico no ocurra en células eucarióticas. Pueden utilizarse genes resistentes a ampicilina, genes resistentes a neomicina y otros marcadores resistentes a antibióticos farmacéuticamente aceptables. Para ayudar en la producción de alto nivel del polinucleótido mediante la fermentación en organismos procarióticos, es una ventaja que el vector contenga un origen procariótico de replicación y sea de un número de copia alto. Un número de vectores de clonación procarióticos disponibles comercialmente provee estos beneficios. Es recomendable remover secuencias de ADN no esenciales. También se recomienda que los vectores no se repliquen en las células eucarióticas. Esto reduce al mínimo el riesgo de integración de secuencias de vacuna de polinucleótidos en el genoma del receptor. Los promotores o mejoradores específicos de tejido pueden utilizarse cuando se desee limitar la expresión del polinucleótido a un tipo de tejido particular. En una modalidad, se utiliza el vector de expresión pnRSV, en donde la repetición terminal larga (LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) se utiliza como el promotor. En otra modalidad, V1 , se utiliza un vector mutado pBR322, en donde el promotor de CMV y el terminador de transcipción de BGH fueron clonados. En otra modalidad, los elementos de V1 y pUC19 han sido combinados para producir un vector de expresión llamado V1 J. En el V1 J u otro vector de expresión deseable se clona un gen de VIH, tal como pg120, pg41 , pg160, gag, pol, env, o cualquier otro gen de VIH que pueda inducir respuestas inmunes anti-VIH. En otra modalidad, el gen resistente a la ampicilina se remueve del V1J y se reemplaza con un gen resistente a la neomicina para generar VU-neo en diferentes genes de VIH que han sido clonados para usarse de conformidad con esta invención. En otra modalidad, el vector es VUns, que es el mismo que VUneo excepto porque un sitio de restricción único Sfil ha sido diseñado en el sitio Kpnl individual en la posición 2114 de VU-neo. La incidencia de sitios Sfil en ADN genómico humano es muy baja (aproximadamente 1 sitio por 100,000 bases). Por lo tanto, ese vector permite el monitoreo cuidadoso para la integración del vector de expresión en el ADN hospedero, simplemente mediante la digestión con Sfil de ADN genómico extraído. En una modalidad adicional, el vector es V1 R. En este vector, tanto ADN no esencial como fuera posible fue "cortado" del vector para producir un vector sumamente compacto. Este vector es un derivado de VUns. Este vector permite utilizar insertos más grandes, sin preocuparse de que las secuencias no deseadas sean codificadas, y optimiza la captación por las células. Una modalidad de esta invención incorpora genes que codifican para gag de VIH de cepas de VIH adaptadas en laboratorio tales como IIIB o CAM-1. Los expertos en la técnica reconocerán que el uso de genes de otras cepas de VIH-1 o VIH-2 que tengan una función análoga a los genes de VIH-1 generarán respuestas inmunes análogas a aquellas descritas aquí para construcciones de VIH-1. Los métodos de clonación y manipulación para obtener estos genes son conocidos por los expertos en la técnica. Las secuencias para muchos genes de muchas cepas de VIH ahora se encuentran disponibles al público en GENBANK y dichos aislados de campo primarios de VIH se encuentran disponibles en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NI AID), el cual tiene contrato con Quality Biological, Inc., [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879] para poner a disposición estas cepas. Dichas cepas también se encuentran disponibles en la Organización Mundial de la Salud (OMS) [Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Geneva 27, Switzerland]. De este trabajo, los expertos en la técnica reconocerán que una de las utilidades de la presente invención es proveer un sistema para pruebas y análisis in vivo así como in vitro, para que pueda establecerse una correlación de diversidad de secuencia de VIH con la serología de la neutralización de VIH, así como otros parámetros. La incorporación de genes de aislados primarios de cepas de VIH provee un inmunógeno que induce respuestas inmunes contra aislados clínicos del virus, y de esta manera cubre una necesidad que todavía no se ha cumplido en el campo. Además, conforme cambian los aislados virulentos, el ¡nmunógeno puede ser modificado para reflejar nuevas secuencias como sea necesario. Para mantener consistente la terminología, se sigue la siguiente convención en la presente para describir construcciones de ¡nmunógeno de polinucleótido: "elementos génicos adicionales de la cepa de VIH con nombre de vector". Los elementos adicionales que se agregan a la construcción se describen con mayor detalle posteriormente. Conforme la cepa etiológica del virus cambia, puede modificarse el gen preciso que es óptimo para la incorporación en el producto farmacéutico. Sin embargo, como se demuestra más adelante, debido a que las respuestas de CTL son inducidas y son capaces de proteger contra cepas heterólogas, la variabilidad de la cepa es menos crítica en el inmunógeno y vacunas de esta invención, comparada con las vacunas a base de virus enteros o polipéptidos de subunidad. Además, ya que el producto farmacéutico se manipula fácilmente para insertar un nuevo gen, éste es un ajuste que se realiza de manera fácil por las técnicas estándares de biología molecular. El término "promotor" como se utiliza aquí, se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN a la que se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con ARN polimerasa para iniciar y manejar actividad de transcripción. El complejo puede ser modificado activando las secuencias conocidas como "mejoradoras" o secuencias inhibidoras llamadas "silenciadores". El término "líder" como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de ADN en el extremo 5' de un gen estructural que se transcriba junto con el gen. El líder comúnmente resulta en la proteína que tiene una extensión de péptido N-terminal a veces llamado una prosecuencia. Para las proteínas destinadas ya sea para la secreción del medio extracelular o de una membrana, esta secuencia de señal, que generalmente es hidrofóbica, dirige la proteína al retículo endoplásmico en donde se descarga al destino apropiado. El término "intrón" como se utiliza aquí, se refiere a una sección de ADN que ocurre en medio de un gen que no codifica para un aminoácido en el producto de gen. El precursor de ARN del intrón es cortado y por lo tanto no se transcribe en el ARNm ni se traduce en la proteína. El término "cassette" se refiere a la secuencia de la presente invención que contiene la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. El cassette es similar a una cinta magnética. Cada cassette tendrá su propia secuencia. De esta manera, al intercambiar el cassette, el vector expresará una secuencia diferente. Debido a los sitios de restricción en los extremos 5' y 3', el cassette puede insertarse, removerse o remplazarse fácilmente con otro cassette. El término "región no traducida 3' " o "3' UTR" se refiere a la secuencia en el extremo 3' de un gen estructural que normalmente se transcribe con el gen. Esta región 3' UTR normalmente contiene la secuencia de poli A. Aunque la 3' UTR se transcribe del ADN, ésta se corta antes de la traducción en la proteína. El término "Región No Codificadora" o "NCR" se refiere a la región contigua a la región 3' UTR del gen estructural. La región NCR contiene una señal de terminación de transcripción. El término "sitio de restricción" se refiere a un sitio de digestión específico de secuencia de endonucleasas de restricción. El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales fragmentos de ADN pueden ser introducidos en un organismo hospedero o tejido hospedero. Existen varios tipos de vectores que incluyen plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. El término "cantidad efectiva" significa que suficiente PNV se inyecta para producir los niveles adecuados del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerá que este nivel puede variar. Para proveer una descripción de la presente invención, se proveen los siguientes antecedentes del VIH. El virus de inmunodeficiencia humana tiene un genoma de ácido ribonucleico (ARN). Este genoma de ARN debe transcribirse inversamente de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica para poder producir una copia de ADNc para la clonación y manipulación de acuerdo con los métodos aquí mostrados. En cada extremo del genoma existe una repetición terminal larga que actúa como un promotor.

Entre estos términos, el genoma codifica, en varios conjuntos de lectura, para gag-pol-env como los productos de gen principales: gag es un grupo antígeno específico; pol es la transcriptasa inversa, o polimerasa; también codificada por está región, en un conjunto de lectura alternativo, se encuentra la proteasa viral que es responsable del procesamiento de postraducción, por ejemplo, de gp160 a gp120 y gp41 ; env es la proteína de la cubierta; vif es el factor de infectividad de virión; rev es el regulador de la expresión de proteína de virión; nef es el factor regulatorio negativo; vpu es el factor de productividad de virión "u"; tat es el transactivador de transcripción; vpr es la proteína viral r. La función de cada uno de estos elementos ha sido descrita. En una modalidad de esta invención, un gen que codifica una proteína de gag de VIH se encuentra ligado directamente a un promotor de transcripción. Sin embargo, la expresión de gag se ve reprimida en la ausencia de rev debido a ia falta de exportación desde el núcleo de genes no empalmados. Para entender este sistema, el ciclo de vida del VIH debe describirse con mayor detalle. En el ciclo de vida del VIH, en la infección de una célula hospedero, el genoma de ARN de VIH se transcribe inversamente en un ADN proviral que se integra en el ADN genómico hospedero como una unidad de transcripción simple. El LTR provee el promotor que transcribe genes de VIH de la dirección 5' a 3' (gag, pol, env), para formar un transcripto no empalmado del genoma entero. El transcripto no empalmado funciona al mismo tiempo que se traducen el gag y pol del ARNm, mientras debe ocurrir el empalme limitado para la traducción de genes codificados de env. Para que se exprese el producto del gen regulatorio rev, debe ocurrir más de un evento de empalme debido al traslape del conjunto de secuencias genómico, rev y env, como se muestra en la figura 1. Para que ocurra la transcripción de env, la transcripción de rev debe detenerse, y viceversa. Además, la presencia de rev se requiere para exportar ARN no empalmado del núcleo. No obstante, para que el rev funcione de esta manera, debe presentarse un elemento de respuesta rev (RRE) en el transcripto [Malim y otros, Nature 338:254-257 (1989)]. En la vacuna de polinucleótidos de esta invención, el empalme obligatorio de ciertos genes de VIH es eliminado al proveer genes completamente empalmados (es decir: la provisión de un conjunto completo de lectura abierto para el producto de gen deseado sin la necesidad de cambios en los conjuntos de lectura o la eliminación de regiones no codificadora; los expertos en la técnica reconocerán que cuando se empalma un gen particular, existe una latitud en la secuencia precisa resultante; sin embargo, si se obtiene la secuencia codificadora funcional, esto es aceptable). Por lo tanto, en una modalidad, la secuencia codificadora completa para gag se empalma para que no se requiera la expresión intermitente de cada producto de gen. Las respuestas humorales y celulares inmunes que se generan de acuerdo con la invención son particularmente importantes para inhibir la infección por VIH, dada la propensión del VIH para mutarse dentro de la población, así como en individuos infectados. Para poder formular una vacuna protectora efectiva de VIH es recomendable generar tanto una respuesta de anticuerpo multivalente, por ejemplo a gp160 (env es de aproximadamente 80% conservado en varios VIH-1 , cepas clade B, que son las cepas que prevalecen en las poblaciones humanas de Estados Unidos), como el blanco de neutralización principal en el VIH, así como células T citotóxicas que reaccionan a las porciones conservadas de gp160 y, proteínas virales internas codificadas por gag. Se ha hecho una vacuna contra el VIH que consta de genes gp160 elegidos de cepas de laboratorio común, de aislados virales primarios predominantemente encontrados dentro de la población infectada; a partir de gp160 mutados diseñados para cepa cruzada no cubierta, epítopes de anticuerpo neutralizantes; y otros genes representantes de VIH tales como los genes gag y pol (-95% conservados a io largo de los aislados de VIH). Virtualmente todos los pacientes seropositivos con VIH que no han presentado un estado inmunodeficiente, portan CTL anti-gag mientras cerca de 60% de estos pacientes muestran CTL específicos gp160 de cepa cruzada. Sin embargo, es mucho menor la cantidad de CTL específicos de VIH encontrados en individuos infectados que han alcanzado el estado de enfermedad conocido como SIDA, demostrando la importancia de los hallazgos de que se pueden inducir respuestas CTL de cepa cruzada. Las respuestas inmunes inducidas por las construcciones de vacuna de polinucleótidos de env y gag se han demostrado en ratones y primates. El monitoreo de la producción de anticuerpos a env en ratones permite la confirmación de que una construcción dada es adecuadamente inmunógena, es decir, una gran proporción de animales vacunados muestran una respuesta de anticuerpos. Los ratones también proveen el modelo animal adecuado más factible para probar la inducción de CTL mediante las construcciones y por lo tanto se utilizan para evaluar si una construcción particular puede generar tal actividad. Los monos (mono verde africano, mono rhesus, chimpancés) proveen especies adicionales que incluyen primates para la evaluación de anticuerpos en animales superiores y no roedores. Estas especies también se prefieren a los ratones por los análisis de neutralización antisuero debido a los altos niveles de actividades neutralizantes endógenas comparadas con los retrovirus observados en el suero de ratón. Estos datos demuestran que mediante estas vacunas se genera una ¡nmunogenicidad suficiente para lograr la protección en experimentos en un modelo chimpancé/VIHniB de reto basado en niveles conocidos de protección de anticuerpos neutralizantes para este sistema. Sin embargo, la definición que actualmente está tomando fuerza y cada vez es más aceptada de protección entre la comunidad científica se desplaza de la llamada "inmunidad esterilizante", la cual indica una protección completa de la infección por VIH, a la prevención de la enfermedad. Un número de correlaciones para esta meta incluye un título viral sanguíneo reducido, según se midió por PCR, la actividad de transcriptasa inversa de VIH, por infectividad de muestras de suero, por el análisis ELISA de p24 u otras concentraciones antígenas de VIH en la sangre, concentración incrementada de células T CD4+, y por tasas de supervivencia extendidas [véase, por ejemplo, Cohén, J., Science 262:1820- 1821 , 1993, para obtener un análisis de la definición evolutiva de la eficacia de la vacuna anti-VIH]. Los inmunógenos de la presente invención también generan respuestas neutralizantes inmunes contra aislados infecciosos (clínicos, de campo primario) por VIH. Se usa un análisis ELISA para determinar si los vectores de vacuna optimizada de gag que expresan ya sea tPA-gag secretado o gag nativo son eficaces para la producción de anticuerpos específicos-gag. La caracterización inicial ín vitro de las expresiones gag mediante los vectores de vacunación de la presente invención se provee mediante análisis de inmunoblot de lisados de célula transfectada por gag optimizado. Estos datos confirman y cuantifican las expresiones de gag utilizando antisuero anti-VIH para visualizar la expresión de gag de célula transfectada. Generación de respuestas a CTL. Las proteínas virales que se sintetizan dentro de las células elevan las respuestas CTL a MHC I restringido. Cada una de estas proteínas produce CTL en los pacientes seropositivos. Las vacunas también pueden producir CTL en ratones y monos rhesus. La inmunogenética de las cepas de ratón son favorables para tales estudios, como se demostró con la influenza NP, [véase Ulmer y otros, Science 259:1745-1749, 1993]. Se han definido diversos epítopes para las proteínas de env, rev, nef y gag de VIH (Frankel, F.R., y otros, J. Immunol. 155, 4775-82 (1995)) en ratones Balb/c, facilitando de esta manera el cultivo in vitro de CTL, así como los análisis de citotoxicidad. De manera alternativa, puede utilizarse la codificación completa de genes gp160, pg120, pol, o gag.

Para una revisión adicional sobre este tema, véase por ejemplo, VIH Molecular Immunology Datábase 1995, Korber y otros, eds., Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, EUA. Según se utiliza en este documento, la función efectora de células T se asocia con el fenotipo de células T maduras, por ejemplo, citotoxicidad, secreción de citocina para la activación de células B, y/o reclutamiento o estimulación de macrófagos y neutrófilos. Medición de actividades TH. LOS cultivos de células del bazo derivados de los animales vacunados se prueban para obtener los antígenos específicos mediante la adición de, ya sea una recombinación de proteínas o epítopes de péptidos. La activación de células T por antígenos, presentados por células acompañantes que presentan antígeno esplénico, APC, se monitorea mediante la proliferación de estos cultivos o mediante la producción de citocina. El patrón de producción de citocina también permite la clasificación de la respuesta TH como tipo 1 o tipo 2. Debido a que aparecen respuestas dominantes TH2 para correlacionar con la exclusión de inmunidad celular en los pacientes seropositivos con compromiso inmune, es posible definir el tipo de respuesta generada mediante un PNV dado en pacientes, permitiendo la manipulación de las respuestas inmunes resultantes. Con base en los estudios inmunológicos mencionados anteriormente, se puede decir que las vacunas de la presente invención son efectivas en vertebrados contra el ataque por VIH virulento. Estos estudios se realizaron en un modelo VIH???B/chimpancé de ataque después de una vacunación suficiente de estos animales con una construcción PNV, o una mezcla de construcciones de PNV que consta de gp160mB, gagmß, nefwB y REVHIB. La cepa IIIB es útil a este respecto, ya que se ha establecido el título de chimpancé de dosis letales de esta cepa. Sin embargo, se han contemplado los mismos estudios utilizando cualquier cepa de VIH y los epítopes específicos o heterólogos a la cepa dada. Un segundo modelo de vacunación/de ataque, además de los chimpancés, es el ratón scid-hu PBL. Este modelo permite probar el sistema inmune de linfocitos humanos y la vacuna de la presente invención con el ataque subsecuente de VIH en un ratón hospedero. Este sistema tiene ventajas ya que se adapta fácilmente al uso con cualquier cepa de VIH y provee evidencia de protección contra múltiples cepas de aislados de campo primario de VIH. Un tercer modelo de reto utiliza virus híbridos de VIH/VIS (VIHS), algunos de los cuales han mostrado que infectan a los monos rhesus y llevan a la enfermedad de inmunodeficiencia, resultando en muerte [véase Li, J., y otros, J. AIDS 5:639-646, 1992]. La vacunación del rhesus con las construcciones de vacuna de polinucleótido protege contra la amenaza subsecuente con dosis letales de VIHS. Existen diversos genes obtenidos de virus y bacterias que no utilizan codones que están optimizados para la expresión en células de mamíferos. Una razón, entre otras, es el hecho de que estos microorganismos proveen sus propias polimerasas o proveen proteínas específicas o factores que facilitan la transcripción/traducción de sus productos genéticos. Para las bacterias, pueden existir diferentes abundancias relativas para ARNt específicos. La expresión clara in vivo de tales genes en el contexto de la vacuna de ADN es substancialmente diferente. Los componentes representativos de la construcción incluyen (pero no se restringen a): VIH env, VIH gag, VIH pol, VIH rev, VIH upr, y VIH nef. Los genes que codifican para antígenos expresados mediante los patógenos diferentes al VIH, tales como, pero no limitados a, nucleoproteína del virus de influenza, hemaglutinina, matriz, neuraminidasa, y otras proteínas antígenas; genes de virus de herpes simplex; genes del virus de papiloma humano; antígenos de tuberculosis; antígenos del virus de la hepatitis A, B o C. La eficacia protectora de los inmunógenos de polinucleótido de VIH contra el ataque viral subsecuente se ha demostrado mediante la inmunización con ADN de plásmido sin réplica, a la cual se refiere la presente invención. Esto es de gran ventaja debido a que no se ha involucrado a ningún agente infeccioso, no se requiere la unión de partículas de virus, y se permite la selección determinante. Además, debido a la secuencia de gag y proteasa y otros diversos productos de genes virales se conserva entre diversas cepas de VIH, se permite la protección contra el reto subsecuente por una cepa virulenta de VIH que es homologa, así como las cepas heterólogas a la cepa de la cual se obtiene el gen clonado. La invención ofrece medios para inducir inmunidad protectora de cepa cruzada sin la necesidad de agentes auto-replicantes o auxiliares.

Además, la inmunización con los polinucleótidos de esta invención ofrece muchas otras ventajas. Este enfoque de vacunación debe ser aplicable para tumores así como agentes infecciosos, ya que la respuesta CD8 + CTL es importante para ambos procedimientos patofisiológicos [K. Tanaka y otros, Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Por lo tanto, producir una respuesta inmune contra una proteína crucial en el procedimiento de transformación puede ser un medio efectivo para la protección contra el cáncer o la inmunoterapia. La generación de anticuerpos de título alto en comparación con las proteínas expresadas después de la inyección de proteína viral y ADN de la hormona de crecimiento humano sugiere que es un medio factible y altamente efectivo para crear vacunas basadas en anticuerpos, ya sea de manera separada o en combinación con vacunas de linfocitos T citotóxicas dirigidas hacia los antígenos conservados. La facilidad de producción y purificación de construcciones de ADN se compara favorablemente con los métodos tradicionales de purificación de proteína, facilitando de esta manera la generación de vacunas de combinación. Por lo tanto, se puede preparar, mezclar o co-administrar construcciones múltiples, por ejemplo codificación de genes gp160, gp120, gp41 , gag, o cualquier otro gen de VIH. Debido a que la expresión de proteína se mantiene después de la inyección de ADN, la persistencia de memoria de células B y T puede mejorarse, produciendo de esta manera inmunidad humoral de larga vida mediada por células. Las técnicas normales de biología molecular para preparar y purificar construcciones de ADN permiten la preparación de los ¡nmunógenos de ADN de esta invención. Aunque las técnicas comunes de biología molecular son por lo tanto suficientes para la producción de los productos de esta invención, las construcciones específicas descritas en este documento proveen ¡nmunógenos de polinucleótidos novedosos que sorprendentemente producen neutralización aislada de VIH primario de cepa cruzada, un resultado hasta ahora no obtenido con virus enteros inactivos estándares o vacunas de proteína de subunidad. La cantidad de ADN o ARN transcrito expresable que se presentará en un receptor de vacuna dependerá de la fuerza de los promotores de transcripción y traducción utilizados y en la inmunogenicidad del producto genético expresado. En general, una dosis efectiva inmunológica o profilácticamente de aproximadamente 1 ng a 100 mg, y preferiblemente de cerca de 10 µg a 300 µg se administra directamente en el tejido muscular. También se contempla la inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel, y otros modos de administración tales como intraperitoneal, intravenosa o suministro por inhalación. También se contempla la provisión de vacunaciones de refuerzo. Después de la vacunación con el ¡nmunógeno de polinucleótido de VIH también se contempla el refuerzo con inmunógenos de proteína de VIH como productos de gen gp160, gp120, y gag. También es útil la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios de administración de proteína interleucina 12, junto con, o subsecuente a la introducción parenteral de PNV de esta invención. El polinucleótido puede estar desnudo, esto es, no asociado con ninguna proteína, auxiliares u otros agentes que ¡mpacten el sistema inmunológico del receptor. En este caso, es deseable que el polinucleótido esté en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero no limitado a, solución salina estéril o solución salina de pH regulado. De manera alternativa, el ADN puede asociarse con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros líposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN-liposoma, o el ADN puede asociarse con un auxiliar conocido en la técnica para fomentar las respuestas inmunes, tales como una proteína u otro portador. Los agentes que ayudan en la absorción celular de ADN, tales como, pero no limitados a, iones de calcio, pueden también utilizarse en forma ventajosa. Estos agentes son llamados generalmente en este documento reactivos facilitadores de transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Las técnicas para cubrir micro-proyectiles cubiertos con polinucleótido se conocen en la técnica y también son útiles junto con esta invención. Los siguientes ejemplos se ofrecen como medio de ilustración y no tienen la intención de limitar la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1 Expresión heteróloqa de productos de gen tardío de VIH Los genes estructurales de VIH tales como env y gag requieren expresión del gen regulador de VIH, rev, para producir de manera eficiente proteína de longitud completa. Se ha descubierto que las expresiones dependientes de rev de gag produjeron niveles bajos de proteínas y que rev por si mismo puede ser tóxico para las células. Aunque se lograron niveles relativamente altos de expresión dependiente de rev de gp160 in vitro, esta vacuna produjo niveles bajos de anticuerpos para gp160 después de la inmunización in vivo con ADN rev/gp160. Esto puede ser el resultado de los efectos citotóxicos conocidos de rev, así como una dificultad aumentada para obtener la función rev en miotúbulos que contengan cientos de núcleos (la proteína rev necesita estar en el mismo núcleo que la transcripción dependiente de rev para que se presente la expresión de proteína gag o env).

No obstante, ha sido posible obtener expresiones independientes de rev utilizando modificaciones elegidas del gen env.

En general, las vacunas de la presente invención han utilizado principalmente genes env y gag de VIH (IIIB, MN o CAM-1 ) para la optimización de expresiones dentro del vector de vacunación generalizado, VUns, que consta de un promotor inmediato-temprano (IE) de CMV, sitio de poliadenilación de BGH y una construcción de base de pUC. Variaciones en las eficiencias, dependiendo de la longitud del segmento de gen utilizado (por ejemplo pg120 en comparación con gp160), de una expresión independiente de rev- puede lograrse para env mediante el reemplazo de su péptido líder secretor nativo con el del gen activador plasminógeno específico de tejido (tPA) y expresando el gen quimérico resultante junto al promotor de CMVIE con el intrón A de CMV. Como se indicó anteriormente, se considera la realización de los siguientes objetivos esenciales para elevar al máximo las oportunidades para obtener un resultado satisfactorio con este programa: (1) vectores basados en env- capaces de generar respuestas a anticuerpos neutralizantes más fuertes en primates; (2) vectores gag y env que produzcan respuestas de linfocito T fuertes como las caracterizadas por CTL y funciones efectoras de ayuda en primates; (3) uso de genes env y gag a partir de cepas de VIH-1 clínicamente importantes en las vacunas de la presente invención y la caracterización de las respuestas inmunológicas, especialmente la neutralización de aislados primarios que ellos producen; (4) demostración de la protección en un modelo de reto animal como el modelo chimpancé/VIH (I I IB) o rhesus/VIHS utilizando las vacunas optimizadas adecuadas; y (5) determinación de la duración de las respuestas inmunes adecuadas al uso clínico. Se han realizado importantes avances en los primeros tres objetivos y se están realizando experimentos para determinar si las recientes construcciones de vacunación de la presente invención para gp160 y gag mejorarán estos resultados iniciales.

EJEMPLO 2 Vectores para la producción de vacunas A. Vector de expresión V1 Jneo Fue necesario eliminar el gen ampr utilizado para la selección antibiótica de la bacteria portadora de V1J debido a que la ampicilina no puede utilizarse en fermentadores de gran escala. El gen ampr de la construcción de base pUC de V1J se eliminó por digestión con enzimas de restricción Sspl y Eam11051. El plásmido restante se purificó por electroféresis con gel de agarosa, extremos rasurados con ADN polimerasa de T4, y después se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera. El gen comercialmente disponible kanr, derivado de transposon 903 y contenido en el plásmido pUC4K, se cortó utilizando la enzima de restricción Pstl, se purificó mediante electroféresis con gel de agarosa, y se rasuraron los extremos con ADN polimerasa de T4. Este fragmento se ligó con la construcción de base V1 J y los plásmidos con el gen kanr en cualquier orientación se derivaron y se designaron como VUneo # 1 y 3. Cada uno de estos plásmidos se confirmó mediante análisis con enzima de restricción de digestión, la determinación de la secuencia de ADN de las regiones de unión, y se demostró que producen cantidades similares de plásmido como V1 J. La expresión de los productos de gen heterólogos también fue comparable con V1J para estos vectores V1 Jneo. Se eligió arbitrariamente V1 Jneo#3, referido como V1 Jneo de aquí en adelante, que contiene el gen kanr en la misma orientación que el gen ampr en V1 J como la construcción de expresión.

B. Vector de expresión VIJns: Se añadió un sitio Sfi I a VUneo para facilitar los estudios de integración. Se añadió un adaptador Sfi I de 13 pares de bases disponible comercialmente (New England BioLabs) al sitio Kpn I en la secuencia BGH del vector. VUneo se linearizó con Kpn I, gel purificado, rasurado por ADN polimerasa de T4, y se ligó al adaptador Sfi I rasurado. Los aislados clónales se eligieron por mapeo de restricción y se verificaron por secuencias a través del adaptador. El vector nuevo se designó VUns. La expresión de los genes heterólogos en V1 Jns (con Sfi I) a la expresión de los mismos genes en V1 Jne (con Kpn I).

C. VUns-tPA: Para proveer una secuencia de péptidos líder heteróloga a las proteínas secretadas y/o de membrana se modificó VUn para incluir el líder activador plasminógeno específico de tejido (tPA) humano. Se fijaron dos oligómeros complementarios sintéticos y después se ligaron en VUn, el cual había sido digerido por Bglll. Estos oligómeros tienen bases colgantes compatibles para ligación con las secuencias digeridas por Bglll. Después de la ligación el sitio Bglll hacia el extremo 5' se destruye, mientras el Bglll hacia el extremo 3' se retiene para ligaciones posteriores. Tanto los sitios de unión como la secuencia líder tPA entera se verificaron para la secuencia de ADN.

Adicionalmente, para conformar con el vector optimizado de consenso V1Jns(=V1 Jneo con un sito Sfil), un sitio de restricción Sfil se colocó en el sitio Kpnl dentro de la región del terminador de BGH de VUn-tPA mediante la rasuración del sitio Kpnl con ADN de polimerasa de T4 seguida por la ligación con un adaptador y Sfil (catálogo #1138, New England Biolabs). Esta modificación se verificó por restricción de digestión y electroforesis con gel de agarosa.

D. Preparación del vector V1 R: En un esfuerzo por continuar optimizando el vector de vacunación básica, se preparó un derivado de V1 Jns, al que se designó como V1R. El objetivo de esta construcción de vector fue obtener un vector de vacuna de tamaño mínimo, es decir, sin secuencias innecesarias de ADN, que, sin embargo, retuvieran las características de expresión de gen heterólogo optimizadas generales y los rendimientos de plásmido elevados que dieran V1J y VUns. Se determinó a partir de la literatura así como por medio de experimentos que (1) las regiones dentro de la construcción de base pUC que consten del origen E. Coli de replicación puede eliminarse sin afectar la producción de plásmido de la bacteria; (2) la región 3' del gen karí que sigue al marco de lectura abierto de kanamicina puede eliminarse si un terminador bacteriano se inserta en su sitio; y (3) -300 pb desde la mitad 3'-del terminador de BGH puede eliminarse sin afectar su función de regulación (posterior al sitio de enzima de restricción Kpnl original dentro del elemento BGH). Se construyó V1 R utilizando PCR para sintetizar tres segmentos de ADN de V1 Jns representando el promotor de CMVintA/terminador de BGH origen de replicación y elementos de resistencia a la kanamicina, respectivamente. Las enzimas de restricción únicas para cada segmento se añadieron a cada extremo de segmento utilizando los oligómeros de PCR: Sspl y Xhol para CMVintA/BGH; EcoRV y BamHl para el gen karí; y Bcll y Salí para el orí. Estos sitios de enzima se eligieron debido a que permiten la ligación direccional de cada uno de los segmentos de ADN derivados de PCR con una pérdida subsecuente de cada sitio: EcoRV y Sspl dejan ADN rasurados, los cuales son compatibles para ligación mientras BamHl y Bcll dejan colgantes complementarios como lo hacen Salí y Xhol. Después de obtener estos segmentos mediante PCR cada segmento se digirió con las enzimas de restricción adecuadas indicadas anteriormente y después se ligaron juntos en una mezcla de reacción sencilla que contenía los tres segmentos de ADN. El extremo 5' de orí se designó para que incluyera la secuencia terminadora independiente rho T2 que normalmente se encuentra en esta región, por lo que puede proveer información de terminación para el gen de resistencia a la kanamicina. El producto ligado se confirmó mediante la digestión de enzima de restricción (enzimas >8) así como la secuencia de ADN para las uniones de ligación. Los rendimientos plásmidos de ADN y la expresión heteróloga utilizando genes virales dentro de V1 R parecen ser similares a VUns. La reducción neta en el tamaño de vector lograda fue de 1346 pb (VUns = 4.86 kb; V1 R = 3.52 kb).

EJEMPLO 3 Diseño de segmentos de gen sintéticos para la expresión icrementada del gen aaa Los segmentos de gen se convirtieron en secuencias que tenían secuencias de traducción idénticas pero con un uso de codón alternativo como lo define R. Lathe en un artículo de investigación de J. Molec. Biol. Vol. 183, pp. 1-12 (1985) titulado "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations". La metodología descrita a continuación para incrementar la expresión del gen gag de VIH se basó en la hipótesis de que la incapacidad conocida para expresar este gen eficientemente en células de mamíferos es una consecuencia de la composición de transcripción general. De esta manera, el uso de codones alternativos que codifiquen la misma secuencia de proteína puede eliminar las represiones en la expresión de gag. El método de reemplazo de codón específico empleado puede describirse como se indica a continuación: 1. Identificar la colocación de los codones para un marco de lectura abierto adecuado. 2. Comparar el codón de tipo silvestre para la frecuencia observada del uso por genes humanos. 3. En caso de que el codón no sea el que se utilice más comúnmente, reemplazarlo por un codón óptimo para una expresión alta en células humanas. 4. Repetir este procedimiento hasta que el segmento de gen completo haya sido reemplazado. 5. Inspeccionar la nueva secuencia del gen para obtener secuencias no deseadas generadas por los reemplazos de codones (por ejemplo secuencias "ATTTA", creación inadvertida de sitios de reconocimiento de porción de intrón, sitios de enzima de restricción no deseados, etc.) y codones sustitutos que eliminen dichas secuencias. 6. Formar segmentos de gen sintéticos y probarlos para una expresión mejorada. Estos métodos se utilizaron para crear los siguientes segmentos de gen sintéticos para gag de VIH en la creación de un gen comprendido completamente en el uso de codón óptimo para la expresión. Mientras el procedimiento anterior provee un resumen de la metodología para el diseño de genes de codón optimizado para vacunas de ADN, un experto en la técnica comprenderá que una eficacia de vacuna similar o una expresión aumentada de genes puede lograrse mediante variaciones menores en el procedimiento o mediante variaciones menores en la secuencia.

EJEMPLO 4 I. Construcciones de vacuna de aaa de VIH Este es un marco de lectura abierto (orf) completo de gag (CAM1 ) de VIH-1 que consta de codones óptimos. 1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA 51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC 101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC 151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT 201 CCAGCCCTCC CTGACAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA 251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC 301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA 351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA 401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC 451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT 501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC 551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC 601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG 651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC 701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT 751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG 801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT 851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG 901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA 951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA 1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG 1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC 1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG 1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG 1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG 1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG 1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC 1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG 1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA 1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC 1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT (SEQ ID NO:1 ) EJEMPLO 5 Expresión de vacuna gag in vitro La expresión in vitro se probó en un rabdomiosarcoma (RD) humano transfectado o 293 células para estas construcciones. La cuantificación de gag a partir de 293 células transfectadas demostró que el vector VUns-opt-gag y V1 Jns-tPA-opt gag produjo gag secretado.

EJ MPLO 6 Análisis para linfocitos T citotóxicos de gag de VIH Los métodos descritos en esta sección ¡lustran los análisis como se utilizaron para ratones vacunados. Puede utilizarse un análisis esencialmente similar con primates, con la excepción de que las líneas de células B autólogas deben establecerse para utilizarse como células objetivo para cada animal. Esto puede lograrse para humanos utilizando el virus Epstein-Barr y para monos rhesus utilizando el virus de herpes B. Las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) se derivan ya sea de sangre recién extraída o del bazo utilizando centrifugación de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos de los glóbulos blancos. También deben utilizarse nodulos linfáticos para los ratones,. Los CTL efectores pueden prepararse a partir de PBMC ya sea por un cultivo in vitro en IL-2 (20 U/ml) y concanavalina A (2 µg/ml) durante 6 a 12 días o mediante el uso de un antígeno específico utilizando un número igual de células que presentan antígeno irradiado. El antígeno específico puede constar ya sea de péptidos sintéticos (usualmente ácidos amino 9-15) que son epítopes conocidos para el reconocimiento CTL para el haplotipo de HMC para los animales que se utilizan, o construcciones de virus de vaccinia diseñadas para expresar el antígeno adecuado. Las células objetivo pueden ser singénicas o líneas celulares igualadas al haplotipo de MHC, las cuales pueden sacarse para presentar el antígeno adecuado según se describió para la estimulación in vitro de CTL. Para los ratones Balb/c el péptido gag de Paterson (J.

Immunol., 1995), se utilizó a una concentración de 10 µM para volver a estimular el CTL in vitro utilizando esplenocitos singénicos irradiados y puede utilizarse para sensibilizar las células objetivo durante los análisis de citotoxicidad a 1-10 µM mediante incubación a 37°C durante aproximadamente 2 horas antes del análisis. Para estos ratones haplotipo MHC H-2d, la línea celular de mastocitoma murina, P815, provee buenas células objetivo. Las células objetivo sintetizadas de antígenos se cargan con Na51CrO4, el cual se libera del interior de las células objetivo al aniquilarlas por CTL, mediante incubación de blancos durante 1 a 2 horas a 37°C (0.2 mCi para células -5 x 106) seguida por diversos lavados de las células objetivo. Las poblaciones de CTL se mezclan con células objetivo a diferentes proporciones de efectores a blancos tales como 100:1 , 50:1 , 25:1 , etc., se forman en pellas, y se incuban durante 4 a 6 horas a 37°C antes de la cosecha de los supernadantes que entonces se analizan para la liberación de radioactividad utilizando un contador gama. La citotoxicidad se calcula como un porcentaje de las cuentas liberables totales a partir de las células objetivo (obtenidas utilizando un tratamiento 0.2% Tritón X-100) del cual se ha restado la liberación espontánea de células objetivo.

EJEMPLO 7 Análisis para anticuerpos específicos de gag de VIH Los análisis de ELISA se diseñaron para detectar los anticuerpos generados contra VIH utilizando ya sea la proteína gag p24 recombinante específica como antígenos de substrato. Se cubrieron placas de micro titulación de 96 cavidades a 4°C durante la noche con un antígeno recombinante a 2 µg/ml en una solución PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato) utilizando 50 µl/cavidad en una plataforma de oscilación. Los antígenos constaban de gag p24 recombinante (¡ntracelular). Las placas se enjuagaron 4 veces utilizando regulador de pH de lavado (PBS/0.05% Tween-20) seguido por la adición de 200 µl/cavidad de un regulador de pH de bloqueo (solución de leche Camation al 1 % en PBS/0.05% Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente con oscilación. El suero previo y el suero inmune se diluyeron en un regulador de pH de bloqueo en el margen deseado de diluciones, y se añadieron 100 µl por cavidad. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con oscilación y después se lavaron 4 veces con un regulador de pH del lavado. Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (Ig, antirhesus, Southern Biotechnology Associates; Igs, anti-ratón anti-conejo, Jackson Immuno research) con una dilución de 1 :2000 en regulador de pH de bloqueo, se agregaron entonces a cada muestra a 100 µl/cavidad y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con oscilación. Las placas se lavaron 4 veces con amortiguador de pH de lavado y después se desarrollaron mediante la adición de 100 µl/cavidad de una solución de o-fenilendiamina (o-PD, Calbiochem) a 1 mg/ml en 100 mM de amortiguador de pH de citrato a pH 4.5. Las placas se leyeron para obtener la absorbencia a 450 nm tanto cinéticamente (los primeros diez minutos de la reacción) y en los puntos finales de 10 y 30 minutos (lector de microplaca Thermo-max, Molecular Devices).

EJEMPLO 8 Análisis de proliferación de células T Los PBMC se obtienen y prueban para inducir respuestas al antígeno específico según se determina mediante la proliferación dentro de la población de PBMC. La proliferación se monitorea 3H-timidina que se agrega a los cultivos celulares durante las últimas 18 a 24 horas de incubación antes de la cosecha. Los cosechadores celulares retienen ADN que contiene isótopos en filtros si la proliferación se ha presentado mientras las células quiescentes no incorporen el isótopo que no se haya retenido en el filtro de manera libre. Ya sea para las especies roedoras o primates se colocan células 4 X 105 en placas de micro títulos de 96 cavidades en un total de 200 µl de medio completo (suero de ternera fetal RPMI/10%). Las respuestas de proliferación anterior se determinan utilizando PBMC y medios solos mientras se generan respuestas no específicas por el uso de lectinas como fitohemagglutina (PHA) o concanavalina A (ConA) a concentraciones 1-5 µl/ml para servir como un control positivo. El antígeno específico consta, ya sea de epítopes pépticos conocidos, de proteína purificada o de virus inactivos. Las concentraciones de antígenos varían de 1 a 10 µM para los péptidos y de 1 a µl/ml para las proteínas. La proliferación inducida por Lectina alcanza su máximo de 3 a 5 días de incubación del cultivo de células, mientras las respuestas de antígeno específico alcanzan su máximo de 5 a 7 días. La proliferación específica ocurre cuando los conteos de radiación que se obtienen son por lo menos tres veces superiores al medio de fondo y se da con frecuencia como una relación con respecto al fondo, o un índice de estimulación (Sl).

EJEMPLO 9 Las estrategias que se emplearon están diseñadas para inducir tanto al linfocito T citotóxico (CTL) como para neutralizar las respuestas de anticuerpo para VIH, principalmente dirigido en los productos de gag (-95% conservados) y env (gp160 o gp120; 70-80% conservado) de VIH. El gp160 contiene los únicos epítopes anticuerpos neutralizantes conocidos en la partícula de VIH, mientras la importancia de las respuestas de CTL ant\-env y anti-gagr se señalan por la asociación conocida del inicio de estas inmunidades celulares con depuración de viremia primaria posterior a la infección, lo que se presenta antes de la aparición de anticuerpos neutralizantes (Koup y otros., J. Virol. 68: 4650 (1994)), así como un rol para CTL al mantener un estado sin enfermedad. Aunque el VIH es notorio debido a su diversidad genética, se espera obtener una mayor extensión de anticuerpos neutralizantes tanto incluyendo diversos genes representativos obtenidos de aislados clínicos como gp41 (-90% conservado; y contiene el epítope de neutralización 2F5 más conservado), mientras el gen gag muy conservado debe generar respuestas CTL de cepa cruzada amplia. Debido a que esta estrategia de vacuna genera inmunidad fuerte tanto humoral como celular contra el VIH (en primates no humanos) este enfoque ofrece ventajas únicas en comparación con otras estrategias de vacunación disponibles contra el VIH.

A. Desarrollo de la vacuna de polinucleótidos de gag de VIH-1 : En base a los experimentos sobre la expresión de gen env del VIH, utilizando genes que constan de codones óptimos para expresión humana, se diseñó un gen gag p55 sintético (opt gag) y se sintetizó conteniendo un uso de codón óptimo en todo respecto resultando en mutaciones silenciosas -350 (de 1500 nt total) y se clonaron en V1 R. También se construyó una segunda forma de vector opt gag, el cual contenía la secuencia de codificación del péptido de señal tPA en el término NH2 similar al descrito anteriormente para env de VIH y también se eliminó un motivo de secuencia de localización nuclear ubicado en esta posición en el gen tipo silvestre. Esta modificación se diseñó para probar si al alterar los patrones de trafico intracelular normal para gag en la vía secretora del retículo endoplásmico/aparato de Golgi podría alterar la inmunogenicidad de la vacuna de gag de DNA. La adición del péptido libre tPA gag ocasionó niveles mucho mayores de gag secretado y la proteína secretada migró como una forma de peso molecular más alto en comparación al gag de tipo silvestre. Esto indicó que la modificación posterior a la traducción, probablemente glucosilación, se presentó como un resultado de la modificación con el péptido líder tPA. Los ratones que se habían inmunizado con algunas de las dos construcciones gag p55 (VIR-opt gag ± tPA líder) o VIR-gag (tipo silvestre) se probaron para obtener las respuestas de CTL péptido anti-gag después de una inyección (dosis de vacunación igual a 10,3.3, o 1 µg/ratón). Se generaron niveles altos de CTL anti-gag por ambos ADN gag VIR-opt en todas las dosis con el gag VIR-tPA-opt dando la aniquilación específica más alta (-85% @ E/T = 3 con una dosis de 1 µg). La comparación de las curvas de citotoxicidad en cada dosis de DNA demostró que la vacunación gag VIR-tPA-opt produjo respuestas de CTL -100 veces más fuertes que lo que logro VIR-gag (topo silvestre). En general, las respuestas inmunes para los tres grupos de vacuna demostraron las mismas potencias relativas para CTL, ayuda T, y respuestas anticuerpo (en un orden de respuesta mayor a menor): gag >VIR-tPA-opt > gag VIR-opt > gag > VIR (tipo silvestre). En resumen, las respuestas CTL, humoral y de célula T auxiliar son mucho mayores para las construcciones opt gag, especialmente con un líder tPA.

EJEMPLO 10 Método de tratamiento Una persona que necesite inmunización terapéutica o profiláctica contra una infección del virus de inmunodeficiencia humana recibe una inyección de ADN de VIH que codifique para todos o parte de los genes env, gag o pol, o combinaciones de los mismos. La inyección puede ser i.p., subcutánea, intramuscular o intradérmica. El ADN de VIH puede utilizarse como un iniciador de la respuesta inmune o puede utilizarse como un fomentador de la respuesta inmune. La inyección de ADN puede ser anterior, al mismo tiempo, o posterior a la inyección de la persona con una composición farmacéutica que consté de VIH inactivado, VIH atenuado, composiciones que contengan proteínas derivadas de VIH, o combinaciones de los mismos.

EJEMPL0 11 Método de tratamiento Una persona que necesite tratamiento terapéutico contra infección por el virus de inmunodeficiencia humana se trata con un agente antiviral anti-VIH o combinaciones del mismo. El individuo tratado es inyectado con composiciones farmacéuticas de ADN de VIH de esta descripción.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleótido sintético que comprende una secuencia de ADN que codifica para una proteína que no es de mamífero o un fragmento de la misma, la secuencia de ADN comprende codones optimizados para la expresión en un hospedero mamífero.

2.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína se elige a partir de proteínas de VIH proteínas de VSH, proteínas de VAH, proteínas de VBH, proteínas de VCH, proteínas de VPH, proteínas de VSH, proteínas de Plasmodium, proteínas de Mycobacterium, proteínas de Borrelia y proteínas de rotavirus.

3.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la proteína es una proteína de VIH.

4.- El polinucleótido de la reivindicación 3, que tiene la siguiente secuencia de ADN: 1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA 51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC 101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC 151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT 201 CCAGCCCTCC CTGACAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA 251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC 301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA 351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA 401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC 451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT 501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC 551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC 601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG 651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC 701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT 751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG 801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT 851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG 901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA 951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA 1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG 1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC 1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG 1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG 1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG 1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG 1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC 1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG 1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA 1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC 1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT (SEQ ID NO:1)

5.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado además porque induce un anticuerpo de neutralización anti-VIH, respuestas inmunes específicas de célula T de VIH o respuestas inmunoprotectoras después de la introducción in vivo en tejido de vertebrados, incluyendo tejido humano, en donde el polinucleótido comprende además un gen que codifica para un producto de gen gag, gag-proteasa o env de VIH.

6.- El uso del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inducir respuestas inmunes en un vertebrado, en donde el medicamento obtenido con dicho polinucleótido provee entre 1 ng y 100 mg al tejido de dicho vertebrado.

7.- El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polinucleótido se administra junto con un patógeno atenuado, patógeno aniquilado, vacunas de subunidad, vacunas de proteína y combinaciones de los mismos.

8.- Una composición ¡nmunógena para inducir respuestas inmunes contra la infección por VIH, que comprende al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, un auxiliar.

9.- El uso del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3 para la fabricación de un medicamento para inducir respuestas inmunes anti-VIH en un primate, caracterizado además porque dicho polinucleótido se administra en el tejido de dicho primate, concurrentemente con una citocina que se administra por vía parenteral.

10.- El uso del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3 para la fabricación de un medicamento para inducir una célula de presentación de antígeno para estimular la proliferación y funciones efectoras de células T citotóxicas y auxiliares, incluyendo la secreción de linfocina específica para antígenos de VIH en un vertebrado.

11.- El uso del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, en combinación con un agente antiviral anti-VIH, en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que requiera de dicho tratamiento.

12.- Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.