DE4411718A1

DE4411718A1 - RFB-Retrovirusgenom

Info

Publication number: DE4411718A1
Application number: DE4411718A
Authority: DE
Inventors: Joerg Schmidt; Wolfgang Gimbel; Paul-Guenter Straus; Volker Erfle; Finn Skou Pedersen; Lene Pedersen; Mette Oestergaard
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1994-04-05
Filing date: 1994-04-05
Publication date: 1995-10-12
Also published as: EP0755448A1; WO1995027063A2; WO1995027063A3; AU2305095A

Description

Die Erfindung betrifft die Gensequenz des RFB-Retrovirus, die Verwendung der Gensequenz des RFB-Provirus und die anderer osteoinduktiver Retroviren, die eine Knochenneubildung induzie ren, zur Aktivierung osteoinduktiver Gene und Faktoren von Ske lettzellen, um eine Neubildung von Knochengrundsubstanz zu in duzieren und Verfahren zur Herstellung osteoinduktiver Protei ne.

Seit der Entdeckung eines tumorogenen Retrovirus bei Säugetie ren im Jahr 1936 rückten Retroviren zunehmend ins Zentrum tu morbiologischer und vor allem auch zellbiologischer Untersu chungen bei Tier und Mensch. Eine lebenslange, chronische In fektion von Mäusen mit Retroviren ist zwar eng mit der Entste hung von Tumoren assoziiert; das Auftreten retrovirus-assozi ierter Erkrankungen ist jedoch in den meisten natürlich vorkom menden Mauspopulationen sowie in verschiedenen Labormaus-Kolo nien in der Regel selten. (Kozak, C.A., Ruscetti, S. Retroviru ses in rodents. In: the Retroviridae, J.A. Levy, Ed. Plenum Press, New York, London 1992).

Die Infektion einer Säugetierzelle mit einem Retrovirus bein haltet die Integration des Virusgenoms in die Chromosomen der Zelle und hat neben Veränderungen in der Wachstumsregulation der Zelle auch verschiedene Einflüsse auf die Zelldifferenzie rung zur Folge. Am Beispiel von Skelettzellen konnten diese Einflüsse in den vergangenen Jahren für folgende Mäuse-Retrovi ren aus verschiedenen Skelettgeweben aufgezeigt werden.

Isolierung osteoinduktiver Retroviren aus Mäusen

Retroviren mit osteoinduktiven Eigenschaften wurden isoliert:

- direkt aus dem Mausgenom klonierte Retroviren (AKV, Murray et al. 1991, Luz et al. 1991; OTS, Pedersen et al. 90),
- aus normalem Knochengewebe, (OL-6 MLV, Schmidt et al. 1988),
- aus bestrahltem Knochengewebe im Verlauf der Knochentumorent stehung, (OL-1, QL-2, OL-7, OL-8 MLV, Schmidt et al. 1988),
- aus spontan entstehenden, benignen Knochentumoren (QA MLV, Schmidt et al. 1984; RFB, Pedersen et al. 1992),
- aus Osteosarkomen, (OS-5 MLV, Erfle et al. 1986; RFB MLV, Pedersen et al. 1992; Finkel et al., 1973).

Als gemeinsames Merkmal induzieren diese Viren nach Injektion in neugeborene Mäuse, in Abhängigkeit vom Mäuse-Teststamm, Kno chenveränderungen wie Osteopetrose und Osteome und in unter schiedlichem Maße auch Lymphome. Die stärkste biologische Wirksamkeit dieser Retroviren auf Skelettzellen hat das RFB- Virus. Im Teststamm CBA ist acht Monate nach der Infektion mit RFB-Virus noch keine Lymphombildung feststellbar, während zu diesem Zeitpunkt bereits in über 50% der Mäuse Osteome ent standen.

Bevor diese Knochenveränderungen voll ausgeprägt sind, stirbt in anderen Mäusestämmen, wie z. B. in NMRI-Mäusen, ein hoher Prozentsatz der Tiere an den durch die osteoinduktiven Retrovi ren induzierten Lymphomen. Nicht nur das RFB-Retrovirus, son dern auch die anderen, obengenannten osteoinduktiven Retroviren sind demnach für bestimmte infizierte Mäuse pathogen, und sie führen zum frühzeitigen Tod.

Aber nicht nur die Lymphominduktion ist pathologischer Natur; auch die von den osteoinduktiven Retroviren verursachten Kno chenveränderungen (Osteopetrose und Osteome) sind unphysiologi scher, pathologischer Natur und gehen mit einer unkontrollier ten Zunahme an Knochengrundsubstanz einher.

Osteopetrose ist gekennzeichnet durch eine Verdickung des Kno chenschafts im Bereich langer Röhrenknochen und einer fokalen Verdickung der Knochenbälkchen im Spongiosa-Bereich der Wirbel körper. In stärker ausgeprägten Formen kann es zum vollständi gen Verlust der Knochenmarkhöhle und Ersatz von Knochenmark durch kompaktes Knochengewebe kommen. In diesen Fällen kommt es auch durch massiven Zuwachs von Knochengewebe an den Knochen bälkchen im Spongiosabereich der Wirbelkörper zum vollständigen Verlust der Spongiosastruktur und zur Entstehung eines soliden, "petrosierten" Knochens (A.B. Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteo petrosis induced by retrovirus, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Systems, T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.) Springer, 1991).

Osteome sind gutartige, langsam wachsende Knochengeschwülste. Sie sind erkennbar als gelblich-weiße, harte, lokal begrenzte Knochenknoten, die parosteal, d. h. an der Oberfläche von reifem Knochen, entstehen. Im Röntgenbild sind sie als klar um schriebene, dichte Knochenmasse mit einem sich scharf abzeich nenden Rand erkennbar. Im histologischen Bild ist reife, kom pakte Knochensubstanz erkennbar. An der Oberfläche von rasch wachsenden Osteomen befinden sich häufig sogenannte "aktive" Knochenzellen, von denen die Neubildung von Knochengrundsub stanz ausgeht und die dadurch zum stetigen, sich expansiv ver größerndem Wachstum des Osteoms beitragen (A. Luz, A.B. Murray, J. Schmidt, Osteoma, spontaneous and virus-induced, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Systems, T.C. Jones, U. Mohr, RD. Hunt (Eds.) Springer, 1991).

Knochengewebe

Knochengewebe ist ein hochspezialisiertes Bindegewebe, das zu sammen mit Knorpelgewebe das Skelett bildet. Das Knochengewebe besteht aus Zellen und extrazellulärer Matrix. Es erfüllt drei verschiedene Funktionen:

1) eine Stütz- und Bewegungsfunktion;
2) eine Schutzfunktion für Organe und Knochenmark und
3) eine metabolische Funktion, als Reservoir insbesondere von Kalzium und Phosphat für den ganzen Körper.

Die Knochenmatrix ist einem ständigen Umbau unterworfen. Der normale Knochen ist charakterisiert durch die im Gleichgewicht stehenden Vorgänge des Knochenaufbaus und Knochenabbaus. Ver antwortlich für den Knochenaufbau sind die Osteoblasten, wäh rend ein anderer Zelltyp, die Osteoklasten-, den Knochenabbau betreiben. Die Bilanz zwischen den gegensätzlich wirkenden zel lulären Aktivitäten kann von beiden Zelltypen reguliert werden. Während des Alterungsprozesses, z. B., verschiebt sich das Gleichgewicht auf die Seite des Knochenabbaus aufgrund ineffi zienter Aktivierung von Osteoblasten. Dies führt zur altersbe dingten Osteoporose.

Osteoporose

Osteoporose ist eine Erkrankung, die durch eine geringe Kno chenmasse und daraus folgenden Frakturen gekennzeichnet ist. Infolge des wachsenden Anteils älterer Menschen in der Gesamt bevölkerung wird die medizinische und sozioökonomische Bedeu tung der Osteoporose in Zukunft erheblich zunehmen. Es wird geschätzt, daß z. B. in den USA die Kosten allein für die Nach sorge von Schenkelhalsbrüchen, die auf Osteoporose zurückzufüh ren sind, pro Jahr 8 Milliarden Dollar übersteigen.

Neben der altersbedingten Osteoporose gibt es auch Osteoporose mit anderer Ätiologie. Die Entstehung von Osteoporose ist mul tifaktoriell, so daß beim individuellen Patienten oft ganz un terschiedliche primäre oder sekundäre Defekte im Vordergrund stehen, die zwar zum gleichen Endresultat "Osteoporose" führen, aber möglicherweise unterschiedlicher Therapien bedürfen. Dies ist vermutlich die Ursache für die große Zahl der "Nonrespon der" bei jeder der gängigen Therapieformen der Osteoporose.

Die gegenwärtigen therapeutischen Möglichkeiten bei der Osteo porose sind begrenzt. Die aus dem Stand der Technik gebräuchli chen therapeutischen Ansätze, wie z. B. Bewegungstherapie, Hor mon- und Mineraliensubstitution oder die Applikation verschie dener Pharmazeutika, sind von unterschiedlichem Erfolg und mit Nachteilen wie einer geringen Wirksamkeit oder mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden.

Die wichtigsten Therapien, die Applikation von Östrogen und Calcitonin, verlangsamen zwar unter bestimmten Bedingungen den Verlust der Knochenmasse; eine Verringerung der Frakturhäufig keiten durch die Behandlung ist jedoch nicht eindeutig nachge wiesen. Daneben gibt es bei diesen Therapeutika Probleme mit Nebenwirkungen, Unverträglichkeit oder mangelnder Akzeptanz durch den Patienten.

Eine kausale Behandlung der Osteoporose hat deshalb zum Ziel, die Syntheseleistung von knochensubstanz-aufbauenden Zellen (Osteoblasten) zu erhöhen und die Knochenneubildung und Ske lettstabilisierung zu verstärken ("Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism", An Official Publication of The American Society of Bone and Mineral Re search, M.J.Favus et al., (eds), Raven Press, New York, 1993).

In J. Schmidt et al., Induction of osteogenic maturation and neoplastic transformation of "in-vitro" differentiating skele toblasts by c-type retroviruses from radiation-induced osteo sarcomas, workshop on Cell Transformation Systems relevant to Radiation-induced Cancer in Man, Dublin, 1989, Seiten 239- 249; E. Livne et al., Effects of Leukemogenic Retroviruses on Condylar Cartilage In Vitro: An Ultrastructural Study, Calcif. Tissue Int. (1989) 44: Seiten 25-35; J. Schmidt et al., Retro virus-Induced Osteopetrosis in Mice, American Journal of Patho logy, Vol. 124, Seiten 319-323; J. Schmidt et al., Retrovirus- Induced Osteopetrosis in Mice, American Journal of Pathology, Vol. 129, Nr. 3, Dezember 1987, Seiten 503-510; G. Flögel, Einfluß knochenpathogener muriner Retroviren auf Proliferation und Differenzierung osteogener Zellen "in vitro", Diss. rer. nat. München, 1990 wurde darauf hingewiesen, daß das RFB-Virus nach der Infektion eine erhöhte Aktivität der Osteoblasten und Osteozyten sowie eine verstärkte Produktion und Mineralisation der Knochenmatrix induziert. Diese Vorgänge werden stets in Zusammenhang mit neoplastischen Veränderungen am Knochen oder im weißen Blutbild beschrieben. Diese Neoplasien sind auf Fehl steuerungen im Metabolismus der betreffenden Zellen zurückzu führen, die in der medizinischen Therapie selbstverständlich unerwünscht sind und deshalb bis heute ausschließlich Gegen stand pathologischer Untersuchungen waren. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dieser Druckschriften lag es deshalb für den Fachmann fern, ausgehend von den dort beschriebenen pathologi schen Veränderungen auf die Möglichkeit zur Entwicklung eines Therapeutikums zu schließen.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Mit tel zur Entwicklung von Arzneimitteln zur therapeutischen Be handlung von Osteoporose und anderen mit dem Verlust von Kno chengrundsubstanz einhergehenden Krankheiten bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die vollständige Nukleotidsequenz des RFB-14-Provirusgenoms gem. Abb. 1 bereitgestellt wird. Die Zellinie RFB MBK 6a, die das RFB-14-Provirusgenom enthält, dessen Nucleotidsequenz die Abb. 1 zeigt, wurde am 18. 8. 1993 bei der DSM hinterlegt und er hielt die Zugangsnummer DSM ACC2146.

Die vorliegende Erfindung wird auch durch solche DNA-Sequenzen des RFB-14-Provirus, die mit der oben erwähnten DNA-Sequenz hybridisieren und für ein Polypeptid oder mehrere Polypeptide mit osteoinduktiven Aktivitäten codieren, gelöst. Der Begriff "Hybridisierung" betrifft in diesem Zusammenhang übliche Hybri disierungsbedingungen, vorzugsweise Hybridisierungsbedingungen, die Sequenzen mit mindestens 70%iger Homologie, weiterhin be vorzugt mit einer Homologie vom 75% oder 80% oder 85% oder 90%, noch erkennen. Besonders bevorzugt betrifft der Begriff "Hybridisierung" stringente Hybridisierungsbedingungen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Abbil dungen näher erläutert werden. Die Abbildungen zeigen:

Abb. 1 die Nukleinsäuresequenz des RFB-Provirus (8892 Basen pare);

Abb. 2 Virusrekombinanten zwischen RFB-14 und SL3-3 im Plas mid;

Abb. 3 Provirus-Rekombinanten der Plasmid-Rekombinanten aus Abb. 2 nach Transfektion;

Abb. 4 Knochenneubildung in CBA Mäusen 8 Monate nach Infek tion (Stand 26. 2. 1994);

Abb. 5 Sequenzhomologie der gag-Vorläuferproteine verschie dener knochenpathogener (AKV), potentiell knochen pathogener (RadLV/VL3) und nicht knochenpathogener Mäuseleukämieviren (Moloney MuLV, Friend MuLV und Cas-BR-E MuLV) in Abschnitten zu je 25 Aminosäuren;

Abb. 6 Sequenzhomologie der pol-Vorläuferproteine verschie dener knochenpathogener (AKV), potentiell knochen pathogener (RadLV/VL3) und nicht knochenpathogener Mäuse-Leukämieviren (Moloney MuLV, Friend MuLV und Cas-BR-E MuLV) in Abschnitten zu je 25 Aminosäuren;

Abb. 7 Sequenzhomologie der env-Vorläuferproteine verschie dener knochenpathogener (AKV), potentiell knochen pathogener (RadLV/VL3) und nicht knochenpathogener Mäuse-Leukämieviren (Moloney MuLV, Friend MuLV und Cas-BR-E MuLV) in Abschnitten zu je 25 Aminosäuren.

Wie oben bereits näher dargestellt wurde, zeigt das RFB-Virus in vivo zwei verschiedene biologische Aktivitäten:

a) Induktion von Lymphomen (abhängig vom Mäusestamm) und
b) Induktion von Osteomen und Osteopetrose.

Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt, daß das dem RFB-Virus und den anderen osteoinduktiven Retroviren eigene Potential einer unkontrollierten und damit an sich krankhaften Zunahme der Knochenneubildung auch zur Entwicklung eines The rapeutikums zur Behandlung von Knochenerkrankungen einsetzbar ist. Dieser Schritt war insofern erstaunlich und unerwartet, als diese Viren in den infizierten Mäusen pathogen sind und nicht nur die Veränderungen des lymphatischen, sondern auch die des knochenbildenden Systems unphysiologischer, pathogener Na tur sind.

Es mußte deshalb eine Möglichkeit geschaffen werden, die bio logische Aktivität, die die Knochenzellfunktionen stimuliert, von der tumorinduzierenden Aktivität des Virus abzutrennen.

Hierzu hat es sich als zielführend erwiesen, die gesamte pro virale Sequenz eines Vertreters dieser Klasse osteoinduktiver Retroviren, nämlich des RFB-14-Virus, zu bestimmen. Erst diese Sequenzdaten, die erfindungsgemäß bereitgestellt wurden, ermög lichen es dem Fachmann zum ersten Mal, in zielgerichteter wie derholbarer Weise, diejenigen retroviralen subgenomischen Frag mente zu identifizieren, die für die Induktion der Knochenneu bildung verantwortlich sind. Diese Region bzw. Regionen, oder Teile hiervon, können dann beispielsweise therapeutisch zur Stimulation von degenerativem Knochengewebe, wie osteoporoti schem Knochen, eingesetzt werden. Durch die Kenntnis der Se quenz des RFB-14-Provirus ist es somit nunmehr möglich, die unerwünschten, neoplastischen Effekte der Mäuseleukämieviren, insbesondere des RFB-Virus, von therapeutischen nutzbringenden Wirkungen gezielt und überprüfbar abzutrennen und Sequenzen im Virusgenom abzuleiten, die ausschließlich die anabolische Akti vität der Osteoblasten und Osteozyten steigern, ohne dabei pa thologische Prozesse, wie z. B. Tumore, hervorzurufen.

Die Identifikation dieser subgenomischen Bereiche kann bevor zugt durch direkte Sequenzvergleiche und/oder durch die Kon struktion von Rekombinanten von RFB-Provirusgenom und nicht osteoinduktiven retroviralen Genomen erfolgen.

Diese retrovirale Gensequenz(en) und die unter den obengenann ten Bedingungen mit dieser bzw. diesen RFB-14-Gensequenz(en) hybridisierenden Sequenzen sind mittelbar und/oder unmittelbar für die Induktion von Zellmatrix- und Strukturgenen in Skelett zellen und damit für den Aufbau von Knochengrundsubstanz ver antwortlich. Sie können deshalb auch dazu verwendet werden, Stoffe (Struktur- und Effektorproteine, Rezeptoren, Rezeptor antagonisten, Wachstumsfaktoren) zu identifizieren und in den therapeutisch erforderlichen Mengen bereitzustellen, die dege nerativen Skeletterkrankungen, z. B. der Osteoporose, entgegen wirken.

Zur Induktion und Produktion dieses osteoinduktiven Proteins bzw. dieser osteoinduktiven Proteine werden menschliche oder murine Osteoblasten infiziert bzw. transfiziert und das so induzierte Protein aus den Zellen isoliert. Das erfindungs gemäß bereitgestellte RFB-Retrovirusgenom eignet sich auf grund seiner hohen biologischen Wirksamkeit besonders gut für die Induktion und Isolation osteoinduktiver Proteine.

Das RFB-Provirusgenom und insbesondere die für die Induktion der Knochenneubildung verantwortlichen Teilsequenzen des RFB-Provirusgenoms oder damit verwandte, hybridisierende Sequenzen können auch zur somatischen Gentherapie eingesetzt werden.

Die Erfindung ist jedoch nicht nur auf das RFB-Provirusgenom beschränkt; erfindungsgemäß können auch andere, mit dem RFB- Retrovirus verwandte Retroviren, die in der Lage sind, Osteome und/oder Osteopetrose zu induzieren, oder damit ver wandte, hybridisierende Sequenzen oder Teilsequenzen hiervon zur Induktion und Isolation osteoinduktiver Proteine verwen det werden.

Ausgehend von der vollständigen Gensequenz des RFB-14-Provi rus konnte nunmehr zum ersten Mal getestet werden, welche Genomabschnitte osteoinduktiver Retroviren, insbesondere des RFB-14-Retrovirus, für die spezifische Induktion der Kno chenveränderungen und damit für die Induktion bzw. Synthese knochenspezifischer Faktoren, insbesondere knochenspezifi scher Proteine, verantwortlich sind.

Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Beobachtung, daß das RFB-MuLV, wie andere nahe verwandte Viren (z. B. AKV, OA- MuLV), Knochentumoren hervorruft, während weniger verwandte MuLVs diese Veränderungen nicht bewirken. Deshalb kommt der Betrachtung der Unterschiede der beiden Gruppen besondere Bedeutung zu.

Der erste Schritt im Replikationszyklus eines Retrovirus ist die Adsorption an einen zellulären Rezeptor. Diesbezüglich fällt überraschenderweise auf, daß die Region im Oberflä chenprotein, die für die Bindung an den Rezeptor verantwort lich ist (Hunter und Swanstrom, 1990), bei den nahe verwand ten, in Mäusen Knochentumoren bildenden Retroviren hoch ho molog ist, gegenüber den fern verwandten aber große Abwei chungen aufweist. Dies spricht dafür, daß in der Membran der Knochenzellen möglicherweise ein alternativer Rezeptor vor handen ist, der vom RFB-Virus zur Anheftung an die Zellmem bran verwandt wird.

Bei neueren Untersuchungen im Institut für Molekulare Viro logie konnten in retrovirus-infizierten Mäusen in allen un tersuchten Zelltypen Retroviren nachgewiesen werden. Daher liegt keine zellspezifische Wirkung aufgrund einer zellspe zifischen Infektion vor, wie bisher vermutet wurde. So be schreiben beispielsweise noch Behnisch, Diss. und Murray et al., 1986, daß die Targetzellen für osteoinduktive Retrovi ren Knochenzellen seien.

In der Proteinsequenz der Integrase konnten überraschender weise, wiederum getrennt in den beiden unterschiedlichen MuLV-Gruppen, Abweichungen festgestellt werden. Dies könnte ein unterschiedliches Integrationsverhalten der betrachteten MuLVs bedeuten. Unterschiede wären in einer verschiedenen Wahl der Integrationsorte denkbar. Da die Integrationsorte der untersuchten MuLVs nicht umfassend beschrieben sind, kann die Auswirkung der Abweichungen nicht beurteilt werden.

Die dritte Möglichkeit für eine unterschiedliche Pathogeni tät ist die Transkription des Provirus. Diese wird durch den Promotor und den Enhancer in der LTR geregelt, wobei die Transkriptionsfaktoren nicht nur durch ein unterschiedliches Aktivierungsvermögen, sondern auch durch eine spezifische Präsenz in verschiedenen Zelltypen Einfluß auf die Virusre plikation nehmen können. Für viele identifizierte Bindestel len ist ein Vorhandensein der Transkriptionsfaktoren in Lym phozyten beschrieben. Für Knochenzellen liegen aber nur we nige Untersuchungen vor. Behnisch (Diss. 1988) vermutete, ausgehend von Untersuchungen mit Hilfe des CAT-Gens, eine präferentielle Aktivität der Enhancerregionen osteoindukti ver Retroviren in Knochenzellen.

Die Untersuchung der offenen Leserahmen konnte keine Hinwei se auf die Entstehung weiterer proviraler Proteine geben, die entweder Einfluß auf die Regulation der Transkription nehmen oder oncogen wirken könnten. Auch die Bildung von Fusionsproteinen mit oncogener Wirkung, wie sie für das Oberflächenprotein gp55 des Friend SFFV beschrieben ist (Li et al., 1990, Yoshimura et al., 1990), scheint nicht der Fall zu sein. Denn dieses Fusionsprotein entsteht dadurch, daß im env-Gen des Friend SFFV 585 Basen fehlen. Da in die sem Bereich die Schnittstelle liegt, an der das env-Gen pro zessiert würde, entsteht ein Protein, bei dem der N-termina le Abschnitt des Oberflächenproteins mit dem C-terminalen Ende des Transmembranproteins verbunden ist (Clark und Mak, 1983). Dieses Protein ist in der Lage, den Erythropoetinre zeptor zu besetzen und eine Erythroleukämie zu verursachen (Li et al., 1990).

Zur spezifischen Identifikation der für die Stimulation der Knochenzellreifung verantwortlichen Genomabschnitte wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt:

Bei Sequenzanalysen von Mäuseleukämieviren haben verschiede ne Autoren in der retroviralen Kontrollregion des "Long Ter minal Repeats" (LTR) Sequenzen gefunden, die dafür verant wortlich sind, daß diese Viren insbesondere in Lymphozyten aktiv sind und deshalb Lymphome hervorrufen. Durch Sequen zierung des RFB Virus in unserem Labor konnten in der LTR- Region ebenfalls solche Bindungssequenzen nachgewiesen wer den (Diss. Berthold, 1989; Diss. Gimbel, 1993); die RFB-LTR weist überdies starke Ähnlichkeiten mit den LTRs der Mäuse- Leukämieviren AKV und SL3-3 auf.

Durch den erfindungsgemäß durchgeführten Sequenzvergleich der Mäuse-Leukämieviren RFB, AKV, MoMuLV, Friend MuLV und CasBR LuLV wurde erfindungsgemäß überraschend gefunden, daß, obwohl alle diese Retroviren Lymphome induzieren, das kno chenpathogene RFB und das ebenfalls, wenn auch in geringerem Ausmaß, knochenpathogene AKV untereinander eine sehr hohe Homologie aufweisen und sich dadurch von den nur Lymphome induzierenden Retroviren MoMuLV, Friend MuLV und CasBR MuLV in ihrer Gensequenz deutlich unterscheiden.

Diese Unterschiede liegen in begrenzten Regionen der drei viralen Proteine, gag, pol, env, und sind in den Abb. 5-7 dargestellt. Die Abbildungen zeigen für die einzelnen Gene verschiedener MuLVs die Homologie ihrer Proteine - in Abschnitten zu jeweils 25 Aminosäuren - im Vergleich zur Sequenz des RFBV. In den Auswertungen wird deutlich, daß RFBV und AKV hochhomologe Proteine translatieren. Für Molo ney MuLV, Friend MuLV und Cas-BR-E zeigt sich überraschen derweise, daß im gag-Gen jeweils ein deutlich begrenzter Sequenzabschnitt vom C-terminalen Ende des Matrixproteines bis in das Protein p12 existiert, der eine geringere Homolo gie zum RFBV aufweist. Das gleiche Phänomen tritt im pol-Gen am N-terminalen Ende der Integrase sowie im env-Gen am N- terminalen Ende des Oberflächenproteines auf. Dies bedeutet, daß sich das knochenpathogene RFBV deutlich von den nicht knochenpathogenen MuLVs abgrenzen läßt.

Daraus ergab sich der erste Hinweis, daß die entsprechenden Sequenzen die für die knocheninduzierende Eigenschaft ver antwortlich sind, sich in definierten Bereichen der kodie renden Region des RFB befinden. Dies steht im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten, von Behnisch (Diss. 1988) durchgeführten Untersuchungen, die im Ergebnis den nicht-kodierenden LTR-Regionen das knocheninduzierende Po tential zuweisen.

Zu dieser Überprüfung der biologischen Funktion von viralen Teilsequenzen in vivo wurden Virus-Rekombinanten erstellt, in denen die kodierenden Regionen zwischen RFB und SL3-3, einem weiteren AKV-verwandtem, hauptsächlich Leukämien indu zierenden, Mäuse-Leukämievirus, ausgetauscht wurden. Vom SL3-3 Virus ist bekannt, daß es in NMRI- und CBA-Mäusen Lymphome induziert. RFB und AKV dagegen induzieren in CBA- Mäusen jedoch hauptsächlich Osteome.

Mit der Kombination RFB und SL3-3 ist es dadurch in diesem Mäusestamm möglich, biologisch die Aktivität der Tumorinduk tion von der der Knochenstimulation zu trennen. Die biologi sche Wirkung der anderen erwähnten MuLVs in CBA Mäusen ist nicht bekannt. Deshalb wurde zur Konstruktion der Rekombi nanten das SL3-3 Virus verwendet. Da die LTR-Bereiche der beiden Viren große Ähnlichkeiten aufweisen und die Sequenz analyse von RFB Hinweise darauf gab, daß die knocheninduzie rende Aktivität in kodierenden Bereichen des RFB liegt, wur den Rekombinanten konstruiert, die entweder die gesamte LTR oder nur die Enhancerregion der SL3-3 LTR und die (intakten) Gene des RFB Virus enthält. Weitere Rekombinanten enthalten analog die RFB LTR oder die Enhancer-Region der RFB LTR, aber die Gene des SL3-3 Virus. Die Details der Rekombinanten werden nachfolgend dargestellt.

Ausgangsmaterial Provirusrekombinanten auf der Basis von RFB-14 und SL3-3

pA2: Plasmid-Vektor der auf der Basis von pBR327, pBR322 und pGEM1 konstruiert wurde.

pWOG1: Plasmidkonstrukt, welches das provirale Genom des RFB (RFB-14) (Pedersen et al., 1992) enthält und zusätzlich flankierende zelluläre Sequenzen. Die viralen und zellulären Sequenzen wurden in das Plasmid pUC120 eingefügt.

T464: Plasmid-Konstrukt, welches das provirale Genom des SL3-3 Virus und zusätzlich flankierende zelluläre Sequenzen enthält. Diese Sequenzen wurden in das Plasmid PBR328 eingefügt.

pL6cat: Grundkonstrukt eines Expressionsvektors mit dem bakteriellen Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)-Gen. Der Vektor wurde benutzt, um die Pst1- Kpn1 Fragmente zwischen den beiden viralen LTRs auszutauschen. Der Vektor selbst enthält keine Pst1 oder Kpn1 Schnittstelle.

Zur Verfügung stehende Virusrekombinanten (Abb. 2)

pA4-RFB-14: Pst1-Pst1 Fragment des Plasmids pWOG1, welches das provirale Genom des RFB-14 enthält, das in den pA2 Vektor ligiert wurde.

pA4-SL3-3: Pst1-Pst1 Fragment des Vektors T464, welches das provirale Genom des SL3-3 enthält, das in den Vektor pA2 ligiert wurde.

pR-S1: Das kleine Pvu1-Pvu1 Fragment des Plasmids pA4-RFB-14. Dieses Fragment wurde mit dem großen Pvu1-Pvu1 Fragment des Plasmids pA4-SL3-3 ligiert. Das bedeutet, das Konstrukt enthält die LTR und nicht translatierte Sequenzen des RFB-14 Provirus und die kodierenden Sequenzen des SL3-3 Virus.

pR-S2: Reziprokes Konstrukt zum Plasmid PR-S1. Das Kon strukt enthält die LTR des SL3-3 und die kodieren den Sequenzen des RFB-14 Provirus.

pR-S3: Dieses Konstrukt wurde mit Hilfe des Vektors pL6- cat hergestellt. Dabei wurde das Pvu1-Pvu1 Frag ment, das die viralen LTRs der beiden pA4 Kon strukte enthält, in den pL6cat Expressionsvektor ligiert. Die beiden Vektoren wurden dann mit Pst1 und Kpn1 geschnitten, und die kleinen Pst1 und Kpn1 Fragmente, die jeweils einen Teil des RFB und SL3-3 LTRs enthalten, wurden ausgetauscht. Nun wurden die Pvu1-Pvu1 Fragmente mit der ausgetau schten LTR Region zu den großen Pvu1 Fragmenten von pA4-RFB-14 zurückligiert. Dabei entstanden Virusrekombinanten, die die U3 Region und einen Teil der R Region des einen Virus und den Rest des viralen Genoms vom anderen Virus enthalten. Das Plasmid pR-S3 enthält den RFB-14 Enhancer und SL3-3 kodierende Regionen.

pR-S4: Reziprokes Konstrukt zum pR-S3. Das Plasmid ent hält SL3-3 Enhancer und RFB-14 kodierende Sequen zen.

Die Konstrukte wurden mit Pst1 geschnitten und zu kompletten zirkulären proviralen Genomen religiert. Die Plasmide wurden in NIH3T3 Zellen transfiziert. Biologisch aktive virale Re kombinanten wurden erhalten. Diese enthalten jeweils zwei identische LTRs.

Die dargestellten rekombinanten Proviren, bei denen die Re gulationseinheiten und die Gene zwischen RFB Virus und SL3-3 MuLV untereinander ausgetauscht wurden, gehen auf die Plas midkonstrukte pA4-RFB-14 (RFB-14), pA4-SL3-3 (SL3-3), pR-S1 (R-S1), pR-S2 (R-S2), pR-S3 (R-S3) und pR-S4 (R-S4) zurück. Dabei sind die Anteile des RFB-Virus schwarz und die Anteile des SL3-3 MuLV grau dargestellt. Kpn I, Pst I und Pvu I sind die Restriktionsschnittstellen, welche die jeweiligen Virus abschnitte begrenzen.

Induktion von Knochenneubildung

Durch Rekombination der LTRs von RFB und SL3-3 Virus und von Teilbereichen dieser LTRs, welche die Enhancer und Promotor bereiche enthalten, konnten somit für die Knochenneubil dung relevanten Bereiche im RFB Virus identifiziert werden. Dazu wurden neugeborene CBA Mäuse mit den in Abb. 3 gezeig ten Viren infiziert und die Knochenneubildung 8 Monate spä ter durch Röntgenanalyse des Skeletts untersucht. Die Ergeb nisse sind in Abb. 4 dargestellt. Unabhängig von der LTR bzw. vom U3 Bereich der LTRs induzierten Viren, welche das RFB Genom enthalten, 8 Mon. nach der Infektion in etwa der Hälfte der Mäuse eine Knochenneubildung. Dagegen war in Mäu sen, die mit Viren infiziert werden, welche das SL3-3 Genom enthalten, unabhängig von der LTR, nur vereinzelt die Bil dung von neuem Knochen feststellbar.

Diese Ergebnisse lassen erkennen, daß der für die Knochen neubildung primär verantwortliche Bereich im codierenden Bereich des RFB Virus lokalisiert ist. Dies war überra schend, da man zunächst aufgrund der von Behnisch (Diss. 1988) und anderen Autoren vorgenommenen Untersuchungen davon ausgegangen war, daß den LTR-Bereichen mit ihren Steuerse quenzen das osteom-induzierende Potential zukommt. Dies konnte durch die vorliegenden Versuchsergebnisse klarge stellt und widerlegt werden. Rekombinante Proviren, die die LTR-Bereiche des RFB-14 Provirus und die codierenden Sequen zen des SL3-3 Provirusgenoms enthalten, zeigten keine Kno chenneubildung, während das reziproke Konstrukt mit den LTR- Bereichen des SL3-3 Virus und den codierenden Sequenzen des RFB-14 Provirus praktisch die gleiche Häufigkeit zur Kno chenneubildung zeigte wie das RFB-14 Provirus.

Die vorliegenden Versuchsergebnisse zeigen somit, daß die codierenden Sequenzen des RFB-14 Provirusgenoms für die Ak tivierung osteoinduktiver Gene und Faktoren von Skelettzel len zur Neubildung von Knochengrundsubstanz verantwortlich sind. Ausgehend von diesen erfindungsgemäßen Untersuchungs ergebnissen kann nunmehr eine eng umgrenzte Lokalisation des Teilbereichs bzw. der Teilbereiche der codierenden Sequenzen des RFB-14 Genoms vorgenommen werden, die für die Knochen neubildung verantwortlich sind. Weiterhin steht dem Fachmann durch die erfindungsgemäße Bereitstellung derjenigen Regio nen des RFB Virus, die für die Knochenneubildung verantwort lich sind, zum ersten Mal ein Mittel zur Verfügung, um ein Therapeutikum zur Behandlung von Knochenerkrankungen, ins besondere zur Induktion der Knochenneubildung, zu ent wickeln.

Nachfolgend werden die Schritte, die zur Aufklärung der Se quenz des RFB-14 Virus führten, detailliert wiedergegeben.

Klonierung des RFB-Virus

Die eigenen Untersuchungen am RFB-Provirusgenom (Gimbel. 1993) nahmen ihren Ausgang von dem Virus-Klon RFB/MBK 6. Dabei handelt es sich um einen Klon in dem Phagenvektor "Lambda Charon 4a" (Blattner et al., 1977), der ein 14 kb großes Stück DNA der Zellinie RFB/NIH enthält. Diese zellu läre DNA beinhaltet neben Sequenzen des Genoms von NIH3T3-Zellen auch die gesamte Sequenz des RFB-Provirus (Behnisch, 1988). Um die Nomenklatur zu vereinfachen, wurde dem Phagenklon die Bezeichnung "RFB-14" gegeben (Pedersen et al., 1992).

Die Herkunft der proviralen Sequenz ließ sich auf ein Viru sisolat der "American Type Culture Collection" (ATCC VR-909) zurückführen, zu dem die Veröffentlichung von Finkel et al. (1973) als Referenz angegeben wird. Mit diesem Virusisolat waren NIH3T3-Zellen infiziert worden, die ursprünglich keine endogenen ecotropen Retroviren enthielten (Coffin, 1984). Aus der Klonierung ging ein Zellklon hervor, der an zwei verschiedenen Stellen seines Genoms je ein RFB Provirus in tegriert hatte. Diese beiden Sequenzabschnitte wurden iso liert und in Lambda-Phagen "Charon 4a" überführt, so daß die molekularen Phagenklone RFB-18 und RFB-14 entstanden waren (Behnisch, 1988; Pedersen et al., 1992).

Das RFB-Provirus wurde zunächst aus dem Phagenvektor in ei nen Plasmidvektor überführt. Von diesem Plasmid wurden dann Fragmente des Inserts wiederum in Plasmidvektoren subklo niert. Dabei wurden die Fragmente so ausgewählt, daß sie sich gegenseitig überlappen, damit bei der Sequenzierung sichergestellt werden konnte, daß das Provirus fortlaufend analysiert wurde. Mit dem Plasmid, welches das gesamte Pro virus enthielt, und einem Plasmid, in dem die bereits be kannte LTR-Sequenz vorkam, wurde durch eine Restriktionsana lyse, die Hybridisierung gegen eine spezifische DNA-Sonde und die Sequenzierung der LTR nachgewiesen, daß die Klone das Provirus des RFB Virus auch wirklich enthalten.

Sequenzierungsstrategie

Die Sequenzanalyse wurde anfänglich mit einer Deletionsstra tegie verbunden, da nur Primer aber keine Terminatoren zur Verfügung standen, die mit fluoreszierenden Farbstoffen mar kiert waren. Dazu wurden die Plasmide zwischen der Primer bindungsstelle und dem Insert geschnitten. Das Insert wurde anschließend mit Exonuklease III abgebaut, wobei aus dem Reaktionsansatz fortlaufend Aliquots in Zeitabständen ent nommen wurden, in denen jeweils weitere 300 Basen entfernt wurden. Die Plasmide mit den verkürzten Inserts wurden re zirkularisiert und kloniert. Somit bewirkte die Deletion, daß Plasmide entstanden, bei denen jeweils ein anderer Se quenzabschnitt vor eine standardisierte Primerschnittstelle zu liegen kommt. Um beide DNA-Stränge sequenzieren zu kön nen, wurde die Deletion sowohl von der Bindungsstelle des "universal primer" (-21M13) als auch des "reverse primer" (M13RP1) aus durchgeführt.

Mit der Einführung farbstoffmarkierter Terminatoren wurde das "primer hopping"-Verfahren angewandt, bei dem aus den Resultaten einer Sequenzierungsreaktion der Primer für die nachfolgende Reaktion entwickelt wurde. Dadurch wird fort laufend mit jeweils neuen Primerbindungsstellen die Sequenz der Inserts bestimmt. Die aus den einzelnen Reaktionsansät zen der beiden Verfahren hervorgegangenen Einzelsequenzen wurden zur Gesamtsequenz zusammengesetzt und mit der Sequenz des Gegenstranges abgeglichen.

Umklonierung des RFB-Provirus in den Plasmidvektor pUC120

Von der Phagenstammlösung RFB-14 wurde zunächst der Phagen titer bestimmt. Mit der quantitativen Methode wurden 5 · 10⁹ Plaque-bildende Einheiten pro Milliliter Phagensuspension gefunden. Anschließend wurden die Phagen in einem Großansatz vermehrt, dessen Titer am Ende der Inkubation 1,2 · 10¹⁰ pfu/ml betrug. Aus diesem "high titer stock" (HTS) wurde ein Aliquot entnommen, um die DNA der Phagen zu gewinnen. Ins gesamt konnten aus 56 ml Phagen-HTS-Lösung 9 Mikrogramm DNA gewonnen werden.

Ein Aliquot der Phagen-DNA wurde mit der Restriktionsendonu klease EcoR I geschnitten. Da die zelluläre DNA als EcoR I-EcoR I-Fragment in die Phagen-DNA eingebaut worden war (Behnisch, 1988), mußte nun das Insert wieder von den beiden Vektorarmen getrennt werden. Nachdem die Fragmente anschlie ßend in einer Agarose-Gelelektrophorese ihrer Größe entspre chend aufgetrennt worden waren, waren der rechte (11 kb) beziehungsweise linke Arm des Phagen (19 kb), sowie die zel luläre DNA (14 kb) zu sehen, die das RFB-Provirus enthalten mußte. Für die Umklonierung in den Plasmidvektor pUC120 wur den dann 8 Mikrogramm Phagen-DNA mit EcoRI geschnitten und in einem Agarosegel aufgetrennt. Die 14kb-Bande wurde aus dem Gel geschnitten und anschließend in einer BIOTRAP®-Appa ratur aus der Agarose eluiert. Für die nachfolgende Ligation wurde die gesamte DNA verwendet.

Parallel dazu wurde der Plasmidvektor pUC120 zunächst mit EcoR I linearisiert und anschließend noch mit Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Ein Aliquot dieser Präparation wurde zur Überprüfung der vollständigen Dephosphorylierung ohne Insert-DNA einer Ligation unterzo gen. Aus der nachfolgenden Transformation gingen keine Transformanten hervor.

Die isolierte Banden-DNA wurde in den linearisierten und de phosphorylierten Vektor pUC120 ligiert und dann durch Trans formation in transformationskompetente Bakterien JM109 ver bracht. Aus drei Klonen, die in einer Übernachtkultur ver mehrt worden waren, wurde die DNA isoliert und wiederum mit EcoR I geschnitten. Die anschließende elektrophoretische Auftrennung der Fragmente zeigte, daß alle drei Klone Plas mide mit integrierter zellulärer DNA beinhalteten, die das RFB-Genom enthalten mußte. Ein Klon wurde als Glyzerinkultur konserviert, und sein Plasmid fortan als pWOG1 bezeichnet.

Charakterisierung des Plasmides pWOG1

Für die weiteren Experimente wurde zunächst eine größere Menge des Plasmides pWOG1 isoliert. Die Methode nach Melton und Krieg erbrachte aus 250 ml Bakterienkultur 3,7 mg Plas mid-DNA, die - aliquotiert und bei -70°C gelagert - für die gesamte Dauer der Arbeit eine hervorragende Qualität be hielt. Die DNA-Konzentration wurde auch hier mit Hilfe einer Agaroseplatte bestimmt.

Um das erhaltene Plasmid näher zu charakterisieren, wurde es mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen geschnitten, deren Schnittstellen im RFB-Genom bereits bekannt waren (Behnisch, 1988). Die entstandenen DNA-Fragmente wurden in einer Agarose-Gelelektrophorese getrennt und im UV-Licht dargestellt.

Nachdem die DNA-Banden aus den Agarosegelen auf Nitrozellu lose-Filter transferiert und fixiert worden waren (Southern, 1975), war die DNA der Hybridisierung mit einer Retrovirus spezifischen Probe zugänglich. Es handelt sich dabei um ein 400 Basenpaare großes Sma I-Fragment aus dem env-Gen des AK-Virus der AKR-Maus, das nur mit der DNA ecotroper Retro viren der Maus hybridisiert (Chattopadhyay et al., 1980).

Die Sonden-DNA lag als HPLC-gereinigtes Isolat vor (Strauß et al., 1988) und wurde in einer "nick translation" radio aktiv markiert. Nachdem die überschüssigen radioaktiven Nu kleotide in einer Ausschlußchromatographie mit handelsübli chen Säulen entfernt worden waren, wurde die Sonde in einem Hybridisierungsexperiment unter stringenten Bedingungen mit den auf Nitrozellulose fixierten DNA-Fragmenten zusammenge bracht. Die Autoradiogramme der präparierten Filter zeigten alle erwarteten Banden.

Subklonierung des 5′-LTR-gag-Fragments in puC120

Die Subklonierung des RFB Virus wurde mit dem etwa 3 kb gro ßen Pst I/Hind III-Fragment begonnen, das - von den ersten 33 Basenpaaren abgesehen - die 5′-LTR, die gesamte gag-Re gion und 418 Basen des pol-Genes umfaßt. Das Fragment wurde mit Hilfe der BIOTRAP®-Methode aus dem Plasmid pWOG1 gewon nen und in das ebenfalls mit Pst I und Hind III geschnitte ne, dephosphorylierte Vektorplasmid pUC120 überführt. Das entstandene Plasmid wurde als pWOG3 bezeichnet und in JV30- Zellen kloniert, die in Form einer Glyzerinkultur konser viert wurden.

Nachdem der Erfolg der Subklonierung in einem Restriktions verdau mit nachfolgender Agarose-Gelelektrophorese überprüft worden war, wurden die im Vektorbereich beidseits der "mul tiple cloning site" befindlichen Primerbindungsstellen für den "universal" bzw. "reverse primer" benutzt, um von beiden Seiten aus in das Insert hineinzusequenzieren. Dabei kam die Sequenzierung mit radioaktiv markierten Nukleotiden zur An wendung. Die Auswertung der Autoradiogramme ergab für den "universal primer" folgende Sequenz, die aus dem Bereich des pol-Genes stammt:

Diese Sequenz wurde in einer Dotmatrix mit der Sequenz ver glichen, die im Genom des sehr nahe verwandten AKV im glei chen Bereich vorkommt. Die Homologie der beiden Sequenzen betrug 95%.

Die 240 Basen umfassende Sequenz, die aus der Sequenzie rungsreaktion mit dem "reverse primer" erhalten wurde, zeig te in 13 Positionen Abweichungen von der bereits bekannten LTR-Sequenz (Behnisch, 1988). Diese Abweichungen bestanden in Wiederholungen gleicher Basen, die in der früheren Se quenzierung nicht enthalten waren (z. B. CCC anstatt CC)

Umklonierung des -5′LTR-gag-Fragmentes in pUC119

Mit der Einführung der nichtradioaktiven Sequenzierung wurde auch eine Umklonierung des LTR-gag-Fragmentes vom Vektor pU- C120 (pWOG3) in den pUC119 (Vieira und Messing, 1987) not wendig, weil der von Applied Biosystems gelieferte, mit fluoreszierenden Farbstoffen markierte "reverse primer" (M13RP1) nicht mit pUC120 hybridisieren konnte.

In einem gestaffelten Doppelverdau wurde ein halbes Mikro gramm des Plasmides pWOG3 mit den Restriktionsendonukleasen Pst I und Hind III geschnitten, um das Insert vom Vektor zu trennen. Danach wurde die verdaute DNA mit alkalischer Phos phatase aus Kälberdarm dephosphoryliert, und anschließend mit 250 ng des Vektors pUC119 ligiert, der zuvor mit den gleichen Enzymen behandelt worden war. Die Ligationsprodukte wurden in transformationskompetente JV30-Zellen überführt, wobei aus der Transformation 130 Klone hervorgingen. Von sechs Klonen, die zufällig ausgewählt und einer Minipräpara tion nach Birnboim und Horowicz unterzogen wurden, enthielt keiner ein Plasmid mit einer Größe von 6 kb. Ferner wurden alle Plasmide mit der Restriktionsendonuklease Nco I linea risiert, deren Schnittstelle im Plasmid pUC119 nicht vorhan den ist.

Um einen größeren Probenumfang analysieren zu können, wurde die Mikro-Plasmidisolierung eingeführt, die während allen weiteren Klonierungen stets zuerst zur Auswahl der Transfor manten eingesetzt wurde. Mit dieser Methode wurden weitere 64 Klone untersucht, von denen 11 ein Plasmid enthielten, das sich bei der Gelelektrophorese langsamer bewegte als das Referenzplasmid pUC119. Daraus wurde geschlossen, daß diese Plasmide größer als ein reines Vektorplasmid sein mußten. Eine Aussage über die genaue Zusammensetzung der Konstrukte mußte allerdings noch getroffen werden. Deshalb wurde in Schnellaufschlüssen von allen größeren Klonen Plasmid-DNA isoliert. Diese wurde wiederum mit Nco I geschnitten und anschließend in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufge trennt.

Mit einem korrekt zusammengesetzten Plasmid, das weiterhin unter der Bezeichnung pWOG4 geführt wird, wurden die Metho den etabliert bzw. verfeinert, die für den Weg vom Subklon zu den Sequenzdaten benötigt wurden, nämlich Deletion, Kolo niehybridisierung, DNA-Isolierung, DNA-Konzentrationsbestim mung und Sequenzierung. Obwohl die Ergebnisse anschließend in der angegebenen Reihenfolge abgehandelt werden, wurden sie selbstverständlich weitgehend parallel nebeneinander bearbeitet und aufeinander abgestimmt.

Deletion des Plasmides pwOG4

Das Grundprinzip der Deletion beruht darauf, daß das Insert eines Plasmides mit Exonuklease III von der Primerbindungs stelle aus in mehreren Schritten um jeweils 300 Basenpaare verkürzt wird (Linxweiler und Hörz, 1982), wodurch immer neue Sequenzabschnitte vor die Primerbindungsstelle zu lie gen kommen (Henikoff, 1984; Yanisch-Perron et al., 1985; Xie und Potts, 1989). Dazu wird das Plasmid nahe der Primerbin dungsstelle geschnitten, so daß das linearisierte Plasmid an einem Ende das Insert und am anderen die Primerbindungsstel le enthält. Damit die Exonuklease III aber nicht die Primer bindungsstelle degradiert, werden die 5′-überhängenden Enden mit Thionukleotiden (alpha-Phosphothionate) aufgefüllt (Put ney et al., 1981), und die 3′-überhängenden Enden mit Thio nukleotiden verlängert (Deng und Wu, 1983). Weil jetzt beide Enden des Plasmides gegen die Exonuklease resistent sind, müssen die Thionukleotide nahe des Inserts durch einen wei teren Schnitt wieder entfernt werden. Dadurch ist die Pri merbindungsstelle geschützt, während das Insert vom 3′-Ende her durch die Exonuklease III nach und nach degradiert wer den kann. Immer wenn etwa 300 Basen entfernt worden sind, wird die Reaktion gestoppt und der verbliebene Gegenstrang wird mit S1 Nuklease abgebaut (Vogt, 1973). Das deletierte Plasmid, das beidseits glatte Enden besitzt, wird rezirkula risiert und in transformationskompetente Bakterien kloniert.

Die Deletion wurde zunächst nach Herstellerangaben durchge führt. In der Agarosegelelektrophorese konnte eine Deletion festgestellt werden, aber die Banden waren kaum zu sehen. Durch die Verdoppelung des Ansatzes konnte dann ein gutes Ergebnis erzielt werden. Allerdings waren 5 Minuten nötig, um etwa 300 Basenpaare zu deletieren. Versuche, die Dele tionsgeschwindigkeit zu erhöhen, schlugen fehl weder über die Erhöhung der Temperatur noch über die Absenkung der Salzkonzentration konnten größere Deletionen erzielt werden; die Reaktion kam ferner nach etwa 15 Minuten zum Stillstand. Für die geringe Geschwindigkeit der Deletionsreaktion wurde eine verminderte Aktivität der Exonuklease verantwortlich gemacht. Der konstante Abbruch der Reaktion nach 15 Minuten ließ den Schluß zu, daß das Enzym im Reaktionsansatz geschä digt wurde. Das Fehlen von Dithiotreithol im Reaktionspuffer führte möglicherweise zu einer Oxidation der Exonuklease. Erst die Einführung eines eigens nach der Referenzliteratur hergestellten Exonuklease-Puffers (Smith, 1979; Henikoff, 1984; Yanisch-Perron et al., 1985; Xie und Potts, 1989) be wirkte, daß etwa 300 Basenpaare in 30 Sekunden deletiert werden konnten, wobei Plasmidinserts bis 5 kb vollständig degradiert wurden. Über größere Reichweiten der Reaktion kann keine Aussage getroffen werden, weil keine umfangrei cheren Plasmide verwandt wurden.

In einem weiteren Experiment, bei dem zwei nebeneinanderlie gende Schnittstellen für das Deletionsverfahren verwandt wurden, fand keine Deletion statt, weil die Thionukleotide am insertnahen Ende der Plasmide mit dem zweiten Restrik tionsenzym nicht entfernt worden waren. Die Schwierigkeiten wurden darauf zurückgeführt, daß die Restriktionsendonuklea sen auch über die Erkennungssequenz hinaus noch DNA benöti gen, um einen stabilen Komplex ausbilden zu können. Außerdem könnten die Thionukleotide selbst die Anlagerung der DNA im aktiven Zentrum des Enzymes behindert haben. Die Wiederho lung des Experimentes, bei dem die insertnahe Schnittstelle um 12 Basen von der primerbindungsstellennahen Schnittstelle entfernt ausgewählt wurde, verlief dann planmäßig.

In der Sequenzierung der deletierten Klone konnten aber nur bei etwa 20% Sequenzen erhalten werden. Der Verdacht lag nahe, daß der Thionukleotidschutz unvollständig durchgeführt worden war, wodurch die Primerbindungsstelle in der nachfol genden Deletion zerstört wurde. In den folgenden Reaktions ansätzen wurde deshalb die Thionukleotidmenge um einen Mi kroliter erhöht. Außerdem wurde zur Selektion der Klone, die eine intakte Primerbindungsstelle enthielten, die Koloniehy bridisierung eingeführt (Grunstein und Hogness, 1975).

Koloniehybridisierung

Die Koloniehybridisierung der Transformanden, die von dele tierter Plasmid-DNA erzeugt worden waren, ergab nach 1-3 Tagen ein Autoradiogramm, das die positiven Klone als inten siv schwarze, die Negativen als schwache, graue Punkte dar stellte. Das Verhältnis von positiven zu negativen Kolonien betrug im Durchschnitt 37% (n = 12; s = 28). Mit den nicht radioaktiven Sonden konnten die gleichen Resultate in 5 Mi nuten erreicht werden. Zudem waren pro Filter nur noch etwa 2 Signale zu finden, die nicht einer Kolonie entsprachen, während mit radioaktiven Sonden bis zu 15 Hintergrundsignale auftraten.

Problematisch war bei dieser Methode jedoch der Filterab druck, denn häufig waren die Bakterienkolonien quantitativ entweder auf der Platte oder auf dem Filter, so daß nach der Hybridisierung entweder keine Signale zu sehen waren oder zwar Signale vorhanden waren, aber die dazugehörigen Kolo nien nicht mehr angezüchtet werden konnten. In den nächsten Experimenten wurden mit einem Lederberg-Stempel Duplikate von den Bakterien-haltigen Agarplatten angelegt. Abgesehen davon, daß auf diese Weise Duplikate angefertigt wurden, die später zur Identifizierung der positiven Klone verwandt wer den konnten, lockerte die Textur des Samtes die Kolonien soweit auf, daß der Filterabdruck, der von der Ursprungs platte angefertigt wurde, nur noch einen Teil der Bakterien aufnahm, so daß auch hier noch genügend Bakterien auf dem Nährboden verblieben, die zur weiteren Selektion verwandt werden konnten.

DNA-Isolierung

Fünf verschiedene Protokolle zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien wurden auf ihre Verwendbarkeit im Rahmen des Sequenzierungsprojektes überprüft. Alle Methoden wurden mit dem Klon JV30/pWOG4 durchgeführt. Die DNA wurde anschließend mit dem "Dye Primer Taq Sequencing Kit" (7.7.5) sequenziert. Die Isolierung der Plasmide über einen Cäsiumchloridgradien ten erbrachte zwar die beste Qualität, jedoch ist die Metho de apparativ und zeitlich aufwendig. Weniger Aufwand erfor dert die Gewinnung der Plasmide mit dem Protokoll nach Mel ton und Krieg. Die Ergebnisse der Sequenzierungen standen denen der CsCl-gereinigten Plasmid-DNA in keiner Weise nach. Gute Resultate konnten auch mit Plasmidpräparationen nach Birnboim und Horowiz (Heinrich, 1986) erzielt werden, wenn gleich diese Methode nur geringe Mengen DNA liefert. Bei der Verwendung einer Säule, die mit einem Ionenaustauschharz bestückt war, konnten in der Sequenzierung nur etwa 60% der Basen identifiziert werden, die mit den zuvor beschriebenen Methoden gelesen werden konnten. Die Überprüfung der DNA- Qualität im Agarosegel läßt vermuten, daß die DNA degradiert war, ein Zustand, an dem auch Variationen in der Handhabung bzw. in den Mengen der eingesetzten Bakteriensuspension kei ne Änderung bewirken konnten. Ferner machten die unter schiedlichen Fließgeschwindigkeiten der Proben in den ein zelnen Säulen die synchrone Präparation mehrerer Plasmide schwierig. Nach Herstellerangaben hing dies mit einer schwankenden Packungsdichte der Säulen zusammen, die mitt lerweile automatisiert und damit gleichmäßiger sei. Die Ex perimente fanden im März 1990 statt, so daß die neue Säulen generation für diese Arbeit nicht mehr berücksichtigt wurde. Eine andere Säule, die nach dem Prinzip der Ausschlußchroma tographie arbeitete, ergab zwar gute Sequenzierungsergebnis se, allerdings nur mit Bakterien, die nach der Transforma tion noch nicht in einer Glyzerinkultur gehalten wurden. Ein Grund für das Absinken der Ausbeute und Qualität der Plasmi de bei Verwendung von Bakterien, die einer Dauerkultur ent nommen wurden, konnte nicht gefunden werden. Da das Glyzerin des Lagerungspuffers möglicherweise die Säulenmatrix verkle ben konnte, wurden die Bakterien nach der Langzeitkultur erst auf einer Agarplatte inkubiert, bevor ihre Plasmide isoliert wurden. Doch diese Präparationen zeigten ebenfalls schlechte Ausbeuten und Sequenzierungsergebnisse.

DNA-Konzentrationsbestimmung

Zur Bestimmung der DNA-Konzentration wurden vier verschiede ne Methoden in Betracht gezogen und auf ihre Verwendbarkeit überprüft:

Konzentrationsbestimmung mit Agaroseplatten
Konzentrationsbestimmung durch Elektrophorese
Konzentrationsbestimmung durch Photometrie
Konzentrationsbestimmung durch Fluorometrie.

Die Genauigkeit der Meßergebnisse wurde jeweils dadurch ve rifiziert, daß 100 ng linearisierte Plasmid-DNA mit der gleichen Menge des zirkulären Plasmides in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen wurden. Wenn die gemessene Konzentration richtig war, dann durfte die entstandene Bande der geschnittenen DNA makroskopisch nur gerade deutlich sichtbar sein. Ferner wurde aus dem Erfolg des Restriktions verdaus auf die Sequenzierbarkeit der präparierten DNA ge schlossen, denn unverdaubare DNA läßt sich in der Regel auch nicht sequenzieren.

Die Agaroseplatten waren in ihrer Handhabung recht einfach, wenn die Verdünnungsreihe der Standard-DNA-Lösungen einmal hergestellt war. Da jedoch der Erfolg dieser Methode vom Eintrocknungsverhalten der Standard- und Probentropfen ab hängt, spielte die Qualität der Tüfelplatten eine sehr große Rolle. Hierbei waren insbesondere Alter und Feuchtigkeit des ethidiumbromidhaltigen Geles von Bedeutung. Platten, die älter als 4 Wochen waren, wurden keinesfalls verwendet, weil dann der DNA-Gehalt der untersuchten Proben häufig unter schätzt wurde. Die Konzentrationsbestimmung konnte auch nur dann durchgeführt werden, wenn sowohl die Standards als auch die Proben Ringe gebildet hatten. Unversehrte DNA bildete beim Eintrocknen des Tropfens einen Ring, während degradier te DNA und Verunreinigungen mit Proteinen oder Salzen die Ausbildung einer Scheibe hervorriefen. Die Beurteilung der Form der eingetrockneten Probe ließ zwar Rückschlüsse auf den Zustand der DNA und die Sauberkeit der Präparation zu, aber über die Verdaubarkeit mit Restriktionsenzymen und die Sequenzierbarkeit konnte keine weitere Aussage gemacht wer den.

Bei der Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der Agarosegel- Elektrophorese wurde durch den Molekulargewichtsmarker, der in drei verschiedenen Konzentrationen auf das ethidiumbro midhaltige Agarosegel aufgetragen wurde, ein Spektrum von Banden unterschiedlicher Helligkeit erzeugt, deren DNA-Ge halt bekannt war. Die vier Banden der Proben konnten einer der Standardbanden zugeordnet werden. Die Konzentrationsbe stimmung mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese war aller dings sehr arbeits- und zeitaufwendig; denn die DNA-Konzen tration der Proben mußte zuvor mit einer Tüpfelplatte zumin dest näherungsweise bestimmt werden. Die Zuordnung der Pro ben zu den Standards war durch das größere Helligkeitsspek trum der Standardbanden leichter als bei der Tüpfelplatte, wodurch die Ergebnisse sehr genau waren. Im Gegensatz zur Tüpfelmethode konnte hier neben dem Organisationsgrad der DNA und der Güte der Präparation auch die Schneidbarkeit mit Restriktionsendonukleasen begutachtet werden.

Die spektralphotometrische und fluorometrische Konzentra tionsbestimmung lieferten beide reproduzierbare Ergebnisse sowohl für Poly- als auch für Oligonukleotide. Das Spektral photometer gab für jede untersuchte Präparation die opti schen Dichten bei den Wellenlängen von 260 und 280 nm, sowie den Quotienten aus diesen Meßwerten an. In der Regel mußte bei diesem Verfahren nur eine Verdünnung pro Probe angelegt werden. Dagegen konnte für die fluorometrische Konzentra tionsbestimmung auf eine Verdünnung verzichtet werden. Das Fluorometer wurde dabei mit einem DNA-Standard kalibriert, wodurch sofort die DNA-Konzentration abgelesen werden konn te. Damit konnte zwar einerseits der Rechenaufwand verrin gert werden, andererseits war die Genauigkeit der Ergebnisse wiederum von der exakten Konzentration und Intaktheit des Standards abhängig. Daher wurden für alle weiteren Experi mente die DNA-Konzentrationen spektralphotometrisch be stimmt.

Sequenzierung

Zur Etablierung der nichtradioaktiven Sequenzierung (Smith et al., 1986, Prober et al., 1987) wurde die LTR-Sequenz verwandt, die im Plasmid pWOG4 hinter der Bindungsstelle des "universal primer" liegt. Zunächst waren nur farbstoffmar kierte Primer verfügbar, deren Eigenschaften im Anhang auf geführt sind (7.2.2). Die ersten Sequenzierungen mit Plasmi den, die nach Melton und Krieg präpariert worden waren, wur den sowohl mit der radioaktiven als auch mit der nicht ra dioaktiven Methode sequenziert. Dabei stimmten die Ergebnis se überein. Sowohl in den Autoradiogrammen als auch in den Plots traten bisweilen synchron in den gleichen Positionen Signale für alle vier Basen auf. Während bei den Plots re gelmäßig dieses Phänomen etwa 10-20 Basen nach dem Primersi gnal zu beobachten war, waren in den Autoradiogrammen zu sätzlich solche Signale über die gesamte erfaßte Sequenz verteilt. Die Reichweiten der radioaktiven Sequenzreaktionen betrugen etwa 250-300 Basen, wobei allerdings zwei Gelelek trophoresen durchgeführt werden mußten. Bei der nichtradio aktiven Sequenzierung mit dem "Dye Primer Taq Sequencing Kit" (vgl. 7.7.5) konnten dagegen 500-550 Basen identifi ziert werden. Neben einem erhöhten Arbeitsaufwand mußten für die ³⁵S-Sequenzierung mindestens drei Tage angesetzt werden, gegenüber einem Tag bei Verwendung des Sequenzierautomaten. Nach dem Übergang auf den "Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit" konnten nur noch etwa 450-500 Basen je Reaktion ermit telt werden.

Konstruktion des beidseitig deletier- und sequenzierbaren Vektors pBIDEL

Nachdem die gesamte Strategie etabliert und optimiert worden war, wurde die Subklonierung des verbleibenden Provirus vor bereitet. Die Auswahl der Fragmente gestaltete sich schwie rig, weil die Plasmide nach dem Einbau dieser Fragmente zwi schen dem Insert und den beidseits befindlichen Primerbin dungsstellen noch jeweils zwei Restriktionsschnittstellen aufweisen mußten, die eine beidseitige Deletion des Inserts ermöglichten. Das heißt daß die Schnittstellen weit genug auseinander liegen mußten, um eine sichere Funktion der En zyme zu gewährleisten, und außerdem keine 5′-überhängenden Enden erzeugen sollten, die gegen die Exonuklease resistent sein sollten. Wegen des Fehlens einer zweiten Restriktions schnittstelle konnte daher das Plasmid pWOG4 nicht von der Bindungsstelle des "reverse-primer" her deletiert werden. Deshalb wurden in den Vektor pUC119 beidseits im Anschluß an die "multiple cloning site" (MCS) zwei Schnittstellen einge fügt, die sehr selten vorkommen. Dabei wurden die Erken nungssequenzen der Enzyme Sfi I und Not I ausgewählt, die nicht im pUC119 enthalten und statistisch gesehen rar sind, weil sie acht Basen umfassen (Kessler und Höltke, 1986). Der Einbau konnte leicht über die Integration zweier, jeweils eine der beiden Schnittstellen tragender Oligonukleotide in die randständigen Restriktionsschnittstellen der Enzyme EcoR I und Hind III bewerkstelligt werden. Da bei der Insertion jeweils die verwendete Schnittstelle verdoppelt würde, wur den die synthetischen Oligonukleotide, aus denen die beiden doppelsträngigen DNA-Moleküle erzeugt wurden, so ausgelegt, daß der für die Hybridisierung und Ligation nötige Basen überhang korrekt vorhanden war, während die fünfte Base, die für die Erkennung durch das Enzym vorliegen muß, verändert wurde. Dies bewirkte, daß die Integrationsschnittstelle auch weiterhin im Vektor nur einmal vorkam und somit zukünftig sowohl für die beidseitige Insertion als auch die beidseiti ge Deletion zur Verfügung stand.

Die Reihenfolge der beiden Klonierungen wurde anhand der Schnittmuster festgelegt, die an den neuen Restriktions schnittstellen erzeugt wurden. Als erstes wurde die Not I-Sequenz eingesetzt, weil an ihr ein 5′-Überhang entsteht, für den bereits ein funktionierendes Deletionsprotokoll er arbeitet wurde. Für den 3′-Überhang der Sfi I-Schnittstelle war dies jedoch noch nicht der Fall, so daß bei Versagen die Schnittstelle das Plasmid pUC119Not als Ausgangspunkt einer weiteren Klonierung hätte dienen können.

Zunächst wurden die Oligonukleotide Not 1 und Not 2 mitein ander hybridisiert und anschließend phosporyliert, indem eine Endmarkierungsreaktion durchgeführt wurde, bei der nicht radioaktiv markiertes Adenosintriphosphat verwandt wurde. Nachdem die überschüssigen Nukleotide durch eine Säu lenausschlußchromatographie entfernt worden waren, wurde das doppelsträngige, phosphorylierte Oligonukleotid in das zu erst mit EcoR I linearisierte und dann dephosphorylierte Vektorplasmid pUC119 ligiert. Mit den Ligationsprodukten wurden anschließend kompetente JV30-Zellen transformiert.

Obwohl die Vollständigkeit der Dephosphorylierung des Vek tors in einer Null-Ligation mit anschließender Bakterien transformation durch das Fehlen von Transformanden bestätigt worden war, konnte in der Plasmid-DNA von vier präparierten Klonen kein Einbau der Oligonukleotide festgestellt werden. Deshalb wurde zur Selektion auf Klone, deren Plasmide Oligo nukleotide eingebaut hatten, auch in diesem Falle die Kolo niehybridisierung eingesetzt, wobei die Sonde Not 1 jedoch nochmals radioaktiv markiert wurde, weil für eine Hybridis ierung nur wenige Pikomol des Oligonukleotids benötigt wur den. Von einem Klon, dessen DNA mit der Sonde hybridisiert hatte, wurde Plasmid-DNA isoliert, die mit dem Restrik tionsenzym Not I geschnitten werden konnte. Die anschließen de Sequenzierung zeigte, daß das Oligonukleotid nur einfach und in richtigen Orientierung in pUC119 eingebaut worden war. Zur besseren Auflösung der Sequenz wurde der weiter entfernt bindende "reverse primer" zur Sequenzierung be nutzt, weil bei der Sequenzierung mit farbstoffmarkierten Primern die ersten zwanzig Basen sehr engstehende und über höhte Peaks aufwiesen. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pUC119Not.

In einem analogen Arbeitsgang wurden die Oligonukleotide Sfi 1 und Sfi 2 in die Hind III-Schnittstelle des Plasmides pUC119Not eingebaut. Aufgrund des Autoradiogrammes der Kolo niehybridisierung, bei der das Oligonukleotid Sfi 1 als Son de eingesetzt wurde, wurden allerdings Klone isoliert, deren Plasmide das doppelsträngige Oligonukleotid als Di- bzw. Trimer integriert hatten. Jedoch waren in einem Klon die Oligonukleotide so orientiert, daß die überschüssigen Se quenzen in einer Agarose-Gelelektrophorese entfernt werden konnten, nachdem die Plasmid-DNA mit Hind III geschnitten worden war. Die Vektor-DNA wurde aus dem Agarosegel iso liert, rezirkularisiert und anschließend in, transformations kompetente JV30-Bakterien überführt. Die abschließende Se quenzierung des modifizierten Plasmides, das pBIDEL genannt wurde, zeigte, daß die beiden neuen Schnittstellen in der korrekten Position angeordnet sind. Auf LB-Festmedium, das IPTG und X-gal enthielt, wuchs der Klon JV30/pBIDEL mit wei ßen Kolonien. Eine Analyse der DNA-Sequenz im Bereich der MCS ergab, daß in allen Leserastern des pBIDEL Stopcodons (TAG, TAA, TGA) vorhanden sind. Deshalb können die Bakterien keine Galaktosidase produzieren, die farbloses X-gal in ei nen blauen Indigofarbstoff umsetzen könnte (Winnacker, 1987).

Subklonierung des verbleibenden Genoms und Umklonierung des 5′LTR-gag-Fragmentes in pBIDEL

Nach Erhalt des Plasmides pBIDEL wurden weitere Abschnitte des Plasmides pWOG1 subkloniert. Dabei wurden die DNA-Frag mente, die aus der Spaltung des pWOG1 mit verschiedenen Re striktionsenzymen hervorgegangen waren, nach der gelelektro phoretischen Trennung analog zur Subklonierung des Plasmides pWOG3 mit der BIOTRAP®-Apparatur aus dem Agarose-Gel extra hiert, in den mit den entsprechenden Enzymen geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pBIDEL ligiert und in trans formationskompetenten JV30-Bakterien kloniert. Der Grad der Dephosphorylierung der Vektorplasmide wurde jeweils durch einen Rezirkularisierungsversuch mit anschließender Trans formation überprüft. Für die Selektion der erwarteten Klone wurde stets die Mikroplasmidisolierung angewandt. In diesem Verfahren wurde das Wanderungsverhalten der superspirali sierten Plasmide der Proben mit dem des reinen Vektorplasmi des verglichen: denn mit der Veränderung der Plasmidgröße variiert auch der Stoke′sche Radius des Plasmides, so daß im Agarosegel die Wanderungsgeschwindigkeit eines Plasmides, das ein Insert enthält, von dem des Vektors abweicht. Die korrekte Zusammensetzung der Klonierungsprodukte mußte ab schließend mit einer Sequenzierung der Insertenden nachge wiesen werden.

Das BamH I-BamH I-Fragment aus dem pol-Bereich des RFB MuLV (Pos. 4008-7006) konnte in drei Klonierungsexperimenten zwar mit der BIOTRAP®-Apparatur aus dem Agarose-Gel isoliert wer den, aber anschließend konnte es nicht in einen Vektor li giert werden. Die erfolglose Ligation könnte darauf beruhen, daß die Enden des DNA-Fragmentes bei der Diffusion durch die Membran der Elutionskammer derart beschädigt wurden, daß eine Hybridisierung mit den überhängenden Enden des Vektors nicht mehr möglich war. Auf jeden Fall war ein Methodenwech sel angezeigt, und mit dem Freeze-Squeeze-Verfahren konnte dann auch dieses Fragment zügig kloniert werden. Zur Selek tion auf einen Klon, der ein Plasmid mit dem eingebauten DNA-Stück enthielt, wurde eine Koloniehybridisierung mit dem radioaktiv markierten Oligonukleotid RFB 5 durchgeführt. Von einem positiven Klon wurde in einer Makropräparation Plas mid-DNA gewonnen, die sich mit dem Restriktionsenzym XhoI schneiden ließ, wie es aufgrund der bekannten Restriktions enzymkarte erwartet wurde (Behnisch, 1988). Die darauffol gende Sequenzierung der beiden Enden des Plasmidinserts er gab Sequenzen, die mit denen übereinstimmten, die von den Plasmiden pWOG6 und pWOC12 erhalten worden waren. Das Plas mid wurde pWOG8 genannt.

Das Pst I-Hind III-Fragment (Pos. 34-3128) wurde aus dem Plasmid pWOG4 in pBIDEL überführt. Die Plasmide pWOG4 (2 µg) und pBIDEL (2 µg) wurden dazu mit den Restriktionsenzymen Pst I und Hind III behandelt, so daß das Insert wieder vom Plasmidvektor pUC119 getrennt bzw. die Klonierungsstellen des Plasmides pBIDEL freigelegt wurden. Außerdem wurde mit dem Enzym EcoR I der Vektor pUC119 nochmals geschnitten, während pBIDEL mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurde. Anschließend wurde das dephosphorylierte Plasmid pBI- DEL (600 ng) mit dem präparierten pWOG4 in einem Ligations experiment eingesetzt. Nachdem die Ligationsprodukte in transformationskompetente Bakterien JV30 überführt worden waren, wurden die erhaltenen Klone in einer Mini-Plasmidis olierung auf die Größe des inkorporierten Plasmides über prüft. Als Standard diente ein Klon, der den reinen Vektor pBIDEL enthielt. 80% der überprüften 34 Klone enthielten ein Plasmid, das größer war als der Vektor. Von dreien die ser Klone konnten in einer DNA-Präparation Plasmide gewonnen werden, die mit dem Enzym Not I linearisiert werden konnten und eine Größe von 6,2 kb aufwiesen. Das neu entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pWOG5.

Um die Sequenz der 3′-LTR des RFB Provirus erfassen zu kön nen, wurden auch die zellulären Abschnitte des Inserts von pWOG1 subkloniert. Hierzu wurde das Plasmid pWOG1 (6 µg) mit dem Restriktionsenzym Pst I geschnitten, mit Phenol und Chloroform gereinigt und anschließend mit T4-Ligase rezirku larisiert. Mit den entstandenen Plasmiden wurden wiederum kompetente Bakterien JV30 transformiert. Von den Transfor manden wurden 14 Klone zu einer Mini-Plasmidisolierung her angezogen, bei der nur 2 Klone deutlich größer waren als das Plasmid des Standardklones JV30/pBIDEL. Die kleineren Plas mide, die den Namen pWOG11 erhielten, mußten aus dem Vektor pUC120 und wenigen zellulären Basenpaaren bestehen, die sich jeweils zwischen der vektornahen Pst I-Schnittstelle des Inserts von pWOG1 und der das Insert begrenzenden EcoR I-Schnittstelle des Vektors befanden. Das größere Plasmid, das pWOG2 genannt wurde, mußte zusätzlich zu den Sequenzen von pwOG11 das circa 4,7 kb große Pst I-Pst I-Fragment von pwOG1 enthalten. Diese Zusammensetzung der Plasmide konnte in einer Agarose-Gelelektrophorese verifiziert werden.

Die Plasmide pWOG6-pWOG8 und pWOG12 wurden in beiden Rich tungen deletiert und sequenziert. Die Transformanden, die aus der Deletion hervorgegangen waren, wurden dabei in einer Koloniehybridisierung mit nichtradioaktiv markierten Oligo nukleotiden selektiert. Diese Methode zeigte gegenüber der radioaktiven weniger punktförmige Hintergrundsignale (ein bis zwei pro Filter), die positive Kolonien vortäuschen kön nen.

Das Restriktionsenzym Sfi I verursacht beim Schneiden der DNA 3′-überhängende Enden. Diese sollten gegen den Angriff der Exonuklease III resistent sein (Pharmacia). Die Prüfung der Stabilität des Sfi I-geschnittenen Plasmides pWOG5 zeig te jedoch eindeutig, daß die DNA durch die Exonuklease abge baut wird, wobei auch eine Verringerung der Temperatur keine Abhilfe schaffen konnte. In der Literatur ist dazu beschrie ben, daß der 3′-Überhang mindestens 20 Basen betragen muß, um eine Resistenz zu erhalten (Guo und Wu, 1989). Der Schutz der Primerbindungsstelle mußte ebenfalls mit Thionukleotiden bewerkstelligt werden, die mit Hilfe der Terminalen Trans ferase an die überhängenden Basen gebunden wurden (Deng und Wu, 1983). Unter den gewählten Bedingungen wurde erwartet, daß der drei Basen umfassende 3′-Überhang um etwa 15-20 Gua ninthionukleotide verlängert wurde, so daß die Wirkung des Thionukleotidschutzes auch durch die Verlängerung unter stützt wurde. Das Ausmaß des Poly-G-Schwanzes wurde jedoch nicht experimentell bestimmt.

Sequenzierung der Plasmidinserts

Für DNA-Bereiche, die nicht von Deletionsklonen abgedeckt wurden, wurden Oligonukleotide synthetisiert, die dann als Startmoleküle zunächst zur radioaktiven Sequenzierung ver wandt wurden (RFB1-23). Die Oligonukleotide RFB1-4 wurden im O,2µmol-Maßstab synthetisiert und anschließend in einer Aus schlußchromatographie gereinigt. Alle anderen Oligonukleoti de (RFB24-77) wurden im 40-nmol-Maßstab hergestellt. Ein pho tometrisches Spektrum zeigte, daß der Anteil an Restchemika lien sehr gering war. Dies legte den Schluß nahe, daß die Sequenzierung auch mit ungereinigten Primern funktionieren könnte. Nachdem keine Unterschiede im Sequenzierungsverhal ten der ungereinigten Startmoleküle auftraten, wurden zu künftig alle Primer sofort nach der Synthese verwandt, so daß die Zeit und der Arbeitsaufwand für die Reinigung einge spart werden konnten.

An die Primer wurden verschiedene Anforderungen gestellt:

Die Oligonukleotide mußten mindestens 15 Basen lang sein, damit die Spezifität gewährleistet war. Für das 3′-Ende des Primers, das den Startpunkt für die Polymerase darstellt, wurden die Basen Cytosin und Guanin bevorzugt, da durch die Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken diese Bindung stabi ler war als bei den Basen Adenin und Thymin. Beim "primer hopping"-Verfahren mußten die Primer von Sequenzdaten abge leitet werden, die noch nicht durch den Gegenstrang abgesi chert waren. Deshalb wurde darauf geachtet, daß die letzten 4 Basen am 3′-Ende der Oligonukleotide sicher binden konn ten. Einzelne abweichende Basen in den restlichen Positio nen, die sich in der Routine zwangsläufig ergaben, waren für die Sequenzierung ohne Bedeutung.

Da die Bindung der Primer an die Template-DNA kinetischen Gesetzen folgt, wurde für jeden Primer die thermodynamische Schmelztemperatur bestimmt (Rychlik et al., 1990). Dies ist die Temperatur, bei der im Mittel die Hälfte der Primer ge bunden ist. Die Primer wurden so ausgelegt, daß die Schmelz temperatur der Primer für die Sequenzierung mit Sequenase® über 37°C und mit Taq DNA-Polymerase über 52°C lag, weil die Temperatur des Reaktionsansatzes zur Bindung der Primer auf 30°C bzw. 50°C absenkt wurde.

Bei der Sequenzierung mit farbstoffmarkierten Terminatoren wurden DNA-Templates eingesetzt, die über CsCl-Gradienten gereinigt worden waren. Wenn DNA verwandt wurde, die nach Melton und Krieg isoliert worden war, konnte mit dem Sequen cer lediglich ein gelb fluoreszierender Streifen über die gesamte Länge des Geles festgestellt werden. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß Rückstände des Polyethylen glykols die Enzymaktivität stören.

Nachdem das Plasmid pWOG9 die Basen 1-39 des RFB MuLV ent hielt, mußten die letzten 107 Basen in den Plasmiden pWOG2 und pWOG11 enthalten sein, deren Inserts ebenfalls Fragmente aus dem Plasmid pWOG1 darstellen, das mit dem Restriktions enzym Pst I geschnitten worden war. Daher wurden die beiden Plasmide pWOG2 und pWOG11 in Sequenzierungsexperimenten ein gesetzt, bei denen jeweils die Oligonukleotide RFB 27 und RFB 28 als Primermoleküle verwandt wurden. Diese Oligonu kleotide waren von der Sequenz im Bereich der 5′-LTR des RFB MuLV bestimmt worden und mußten deshalb auch in der 3′-LTR binden. Wie erwartet konnten nur von einem Plasmid - in die sem Fall von pWOG2 - Sequenzdaten erhalten werden, die als Sequenzen der 3′-LTR identifiziert wurden. Mit den Primern RFB 67 und RFB 77 wurde anschließend im gleichen Abschnitt des Plasmides pWOG2 die Basenfolge des Gegenstranges ermit telt.

Die Sequenz, die sich im Bereich der Restriktionsschnitt stelle Hind III befindet, wurde mit dem Plasmid pWOG1 be stimmt. Damit wurde der Übergang der Plasmide pWOG5 und pWOG12 bestätigt und sichergestellt, daß hier beim Subklonieren kein Sequenzabschnitt verlorengegangen ist.

Auswertung der Nukleinsäuresequenz

Die Sequenzierungsexperimente ergaben eine Sequenz von 9600 Basenpaaren, die d35 RFB Provirus enthält. Anfang und Ende der proviralen Sequenz wurden durch die Basenfolgen TGAAA- GACCCC und GGGGTCTTTCA bestimmt, die den "inverted repeat" darstellen, mit dem die beiden endständigen LTRs beginnen bzw. enden (Varmus, 1982). Das RFB Provirus, umfaßt demnach 8889 Basenpaare, deren Sequenz dargestellt ist.

Durch die Sequenz der "inverted repeats" wurden auch die LTRs eingegrenzt, die sich immer an den beiden Enden der Retroviren befinden. Die Sequenz einer LTR umfaßt 605 Basen paare und ist für beide LTRs völlig identisch. Dies ist aufgrund der Entstehungsweise der LTRs im Verlaufe der re versen Transkription zu erwarten (Varmus, 1982), muß aber nicht so sein, weil das Provirus während der Klonierungen keinem Selektionsdruck mehr ausgesetzt war. Daher kann die Homologie der LTRs als Indiz für die Stabilität der DNA wäh rend der Experimente zu dieser Arbeit gewertet werden. Da gegen zeigt ein Alignment gegen eine bisher bereits bekannte Sequenz der RFB-LTR (Behnisch, 1988) in vier Positionen ein deutige Abweichungen: während an drei Stellen andere Basen ermittelt wurden (Position 63, 481 und 569), wurde nach dem Cytosin in Position 343 kein weiteres Cytosin gesehen. Diese Abweichungen konnten von Pedersen et al. (1992) bestätigt werden.

Anhand der Sequenz des AKV wurden die LTRs in die U3-, die R- und US-Region unterteilt. Die LTRs sind für die Regula tion der Virusreplikation und -expression verantwortlich. Deshalb werden in der U3-Region (Pos. 1-463) die DNA-Motive erwartet, an die verschiedene Transkriptionsfaktoren binden. In dieser Region, die mit einem "inverted repeat" beginnt, hatte Behnisch (1988) bereits die Sequenzen für die CCAAT- und die TATAAA-Box die Bindungsstellen für die Transkrip tionsfaktoren NF1 (nuclear factor 1), LVa und LVb (leukemia virus factor a, b), die "enhancer cores" und die "glucocor ticoid responsive elements" (GRE) beschrieben.

Ein Vergleich der LTR-Sequenz mit der Datenbank "Keytool 10" zeigte nun überraschenderweise weitere potentielle Protein- Bindestellen (Faisst und Meyer, 1992; Turpaev und Vasetskii, 1990). In Position 31 befindet sich das Sequenzmotiv TAACTG, an das das Oncogen myb binden könnte (Biedenkapp et al., 1988). In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, daß myb, das im Zellkern vorkommt (Klempnauer et al., 1984; Boyle et al., 1984), eine Rolle bei der Induktion hämatopoetischer Tumoren spielt (Howe et al., 1990). Die Bindestelle konnte noch in der LTR des Moloney MuLV (Pos. 508) gefunden werden. Im AKV und Friend MuLV liegen die Bindestellen außerhalb der LTR im viralen Genom.

Stromabwärts vom Myb-Motiv wurden die Sequenzen für die Bin dungsstellen UCR-L (Pos. 39-51) und UCR-U (Pos. 33-54) der UCR-Faktoren festgestellt (upstream conserved region). Für den Faktor UCR-L konnte eine negative Regulation der Trans kription nachgewiesen werden (Flanagan et al., 1989). Im gleichen Bereich liegt eine Bindestelle für den Transkrip tionsfaktor NF-IL6 (Pos 49-56). Der Faktor NF-IL6 bindet an das "IL1-responsive element" des IL6-Genes. IL6 ist ein Cy tokin, das in vielen biologischen Aktivitäten beteiligt ist, unter anderem auch an der Proliferation hämatopoetischer Progenitorzellen. Insbesondere bei bakteriellen und viralen Infektionen wird es in verschiedenen Zellen wie Fibro blasten, Makrophagen, T- und B-Lymphocyten exprimiert. Eine Aktivierung von Proviren analog zur Stimulation des IL6-Ge nes durch NF-IL6 wird diskutiert (Akira et al., 1990).

Mit der von Behnisch (1988) bereits beschriebenen Bindestel le für den "leukemia virus factor a" LVa (Pos 107-112) über schneidet die Bindestelle PEA3 (Pos. 102-108), über die die Protooncogene ets-1 und ets-2 eine Aktivierung der Tran skription bewirken. Diese Proteine kommen vornehmlich im Zellkern proliferierender B- und T-Lymphocyten vor (Ghysda el, 1986; Pognonec, 1989). Die bereits beschriebene "core"-Sequenz TGGAAA (Behnisch, 1988; Pos. 119-124) ist mit der Bindestelle für den hepatocytenspezifischen Faktor H-APF-1 identisch. Diese Bindungsstelle wurde im Promotor des Genes für das "C-reactive protein" gefunden, dessen Transkription bei akuten Entzündungen durch Interleukin 6 aktiviert wird (Majello et al., 1990).

Innerhalb des Motives für das "glucocorticoid responsive element" (GRE; Miksicek et al., 1986; Behnisch, 1988), das in der RFB-LTR dreifach vorhanden ist, ist auch eine E2-Box mit der Sequenz ACAGATG enthalten. An dieses Motiv binden die Transkriptionsfaktoren E12 und E47, die von dem Gen E2A exprimiert werden. Die Unterbindung der Expression dieses Genes führt beim Menschen zur Entstehung eines Prä-B Lymp homs (Nourse et al., 1990). An diese Bindestelle können wei tere Kernfaktoren binden, die sich alle durch eine "helix loop-helix"-Struktur auszeichnen. Deshalb wird für diese Familie von Proteinen eine vielfältige Rolle bei Differen zierung von Säugetierzellen angenommen (Murre et al., 1991). Für die "enhancer cores" wurde die Sequenz TGTGGTTAAG ange nommen, die am 3′- und 5′-Ende um jeweils eine Base länger ist, als die von Behnisch angegebene. Für diese "enhancer core"-Sequenz wurde ein hohes Aktivierungspotential be schrieben (Behnisch, 1988). Dabei kommt es auf das vierte Thymin an (fett gedruckt): liegt an dieser Stelle eine Tran sition nach Cytosin vor, so ist die Aktivierungsfähigkeit des "enhancer" sehr viel geringer (Villemur, 1983; Brown, 1990). Dies konnte in Experimenten mit Rekombinanten zwi schen dem stark oncogenen Gross A Virus und dem schwach on cogenen BALB/c MuLV gezeigt werden (DesGroseillers und Joli coeur, 1984). Das Teilmotiv TGTGGTTA wird durch den Trans kriptionsfaktor AP3 erkannt (Mercurio und Karin, 1989). An die Teilsequenz CTGTGGTTAA können die Kernfaktoren S-CBF (SL3-3 core binding factor; Boral et al., 1989) und SEF-1 (SL3-3 enhancer factor; Thornell et al., 1988) binden.

In der RFB-LTR könnte an drei Stellen der Transkriptionsfak tor AP2 binden. Dieser Faktor aktiviert in den Promotoren des Virus SV40 und des menschlichen Metallothionein II A-Ge nes die Transkription der mRNA (Mitchell et al., 1987). Das bereits beschriebene NF1-Motiv (Behnisch, 1988) enthält noch eine Sequenz, an welche der Transkriptionsfaktor GCF (GC factor) binden könnte. Dieses Kernprotein, dessen Bindung in einer GC-reichen Region des EGF-Rezeptors (epidermal growth factor) beschrieben wurde, führt in epidermalen Zellen zu einer Repression der Transkription, wobei allerdings eine mögliche Aktivierungsfunktion auch nicht ausgeschlossen wur de (Kageyama und Pastan, 1989). GCF könnte in der RFB LTR auch am Übergang von der U3- zur R-Region binden, so daß ein direkter Einfluß auf die Expression des RFB-Provirus durch aus möglich erscheint.

Am Übergang der R- zur US-Region könnten die Transkriptions faktoren NF-W1 und NF-W2 binden. Beide Nuklearfaktoren bin den im Ealpha Gen an das W-Motiv (GTTGCATC), das Teil eines komplexen Enhancers ist. Sie unterscheiden sich aber in ih ren Affinitäten und Molekulargewichten. NF-W1 konnte nur in B- und Prä-B-Lymphomzellinien gefunden werden, während NF-W2 auch in T-Lymphom-, Fibroblasten-, Epithel- und makrophagen ähnlichen Zellinien sowie in Gewebeextrakten (Milz, Leber und Teratokarzinom der Maus) nachgewiesen wurde. Die Rolle der beiden Transkriptionsfaktoren ist noch unbekannt (Dorn et al., 1989).

Weiterhin erscheine zwischen der CCAAT- und TATAAA-Box drei mal die Sequenz CGCTT. Diese ist bei den Retroviren hoch konserviert und gehört zum Promotor (Majors, 1990). An das CCAAT-Motiv kann das Protein C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein) binden. Dieser Transkriptionsfaktor kann aber auch die beiden "enhancer cores" in Position 173-180 bzw. 237-244 zur Bindung benutzen. (Landschulz et al., 1988). Die TATAAA- Box dient dem Faktor TBD (TATAAA-box binding factor) als Bindestelle. Dieses Protein ist eine Untereinheit des aus mehreren Einheiten bestehenden Transkriptionsfaktors IID (TFIID), der zur Initiation der Transkription durch die RNA polymerase II benötigt wird (Greenblatt, 1991).

In der R-Region (Pos. 464-531) befindet sich lediglich das Poly-A-Signal AATAAA (Pos. 510), das für die posttranskrip tionelle Polyadenylierung der viralen RNA verantwortlich ist. Da die Transkription der viralen mRNA an der ersten Base der R-Region der 5′-LTR beginnt und mit der letzten Base der R-Region der 3′-LTR endet, umfaßt das virale Genom vor der Polyadenylierung 8352 Basen. Die US-Region (Pos. 532-605) ist in den LTRs der MuLVs sehr hoch konserviert und schließt die LTR mit einem "inverted repeat" ab. In diesem Abschnitt der LTR ist ein DNA-Motiv vorhanden, das bis auf eine Base mit der Konsenssequenz des "poly-A downstream ele ment" (YGTGTTYY) übereinstimmt (CGTGGTCT; Pos. 539-546).

McLauchlan et al. (1985) haben das 3′-Ende zahlreicher mRNAs von Säugetieren auf ähnliche Motive hin untersucht. 100 der untersuchten mRNAs (67%) enthielten solche Motive, aus de nen die Konsensussequenz erstellt wurde. Die Motive lagen immer 24-30 Nukleotide stromabwärts vom Polyadenylierungs signal. In Experimenten mit Sequenzen aus dem Herpes simplex Virus konnte gezeigt werden, daß das "poly-A downstream ele ment" - möglicherweise im Zusammenhang mit anderen Sequenzen - für die korrekte Polyadenylierung der mRNA benötigt wurde (McLauchlan et al., 1985). Sequenzen der US-Region bilden außerdem einen "inverted repeat" mit Sequenzen in der "lea der" -Region, die sich an die LTR anschließt. Diese beiden Sequenzabschnitte können eine Haarnadelstruktur ausbilden, in der während der reversen Transkription die Primerbin dungsstelle für die tRNA^Pro wie in einem Nadelöhr freiliegt (Aiyar et al., 1992).

Um zu untersuchen, ob tierartliche Unterschiede in der tRNA ^Pro-Sequenz einen Einfluß auf die Virusreplikation ausüben könnten, wurde ein Alignment von allen derzeit verfügbaren tRNA^Pro-Sequenzen angefertigt. Abb. 24 zeigt, daß für Huhn, Rind und Maus die Primerbindungsstelle homolog ist, während bei den anderen aufgeführten Spezies die RNA um 3 Basen verkürzt ist. Damit würde bei diesen Tierarten während der reversen Transkription eine provirale DNA entstehen, die am 3′-Ende nicht wie üblich mit TT, sondern mit TTTGG endet. Ob und mit welcher Effizienz diese proviralen DNA-Moleküle von der Integrase in das Genom der Wirtszellen eingebaut werden können, wurde bisher nicht untersucht. Albritton et al. (1989) konnte humane Hepatocyten, die den Rezeptor für ecotrope MuLVs exprimierten, mit einem MuLV infizieren, wo bei allerdings die Effizienz gegenüber murinen Zellen nied riger war.

In Position 672 befindet sich die potentielle "splice donor site", die zusammen mit der "splice acceptor site" (Pos. 5964) den Sequenzabschnitt umfaßt, der beim Spleißen der viralen RNA ausgeschnitten wird. Die Sequenz der gespleißten RNA wurde bisher lediglich für das Moloney MuLV bestimmt (Mann und Baltimore, 1985; Lazo et al., 1987). Da aber ein Alignment der bisher vorhandenen MuLV-Sequenzen zeigt, daß diese beiden Bereiche hoch konserviert sind, kann ein analo ger Spleißmechanismus für das RFB MuLV und die anderen un tersuchten MuLVs angenommen werden.

Die gesamte Sequenz des RFB MuLV wurde anschließend auf die Existenz kodierender Sequenzen überprüft, indem die Vertei lung der Start- und Stopcodons untersucht wurde. Dabei fie len zwei große Leserahmen auf, die sich in zwei verschiede nen Leserastern befinden und teilweise überlappen. Der grö ßere der beiden, der durch ein "amber termination codon" (TAG) unterbrochen ist, enthält den gag-pol-Bereich, wobei das Stopcodon die gag- von der pol-Region trennt (Herr, 1984). Der kleinere Leserahmen kodiert dagegen für das env- Gen.

Im Bereich des "amber termination codon" befindet sich ein 56 Basen langer, bei allen bisher untersuchten MuLVs hoch konservierter Sequenzabschnitt, in dem sich bei der trans kribierten RNA zwei Haarnadelstrukturen ausbilden könnten (Shinnick et al., 1981; Herr, 1984). Dabei konkurrieren die se allerdings um 10 Basen, so daß sich möglicherweise immer nur eine der beiden Strukturen ausbilden kann. Beide Kon formationen wurden jeweils mit dem Überlesen des Stopcodons in Verbindung gebracht. Eine neuere Arbeit stellt dies in Frage und macht neben der Existenz der "suppressor tRNA", die für Glutamin codiert, eine 50 Basen lange Sequenz strom abwärts des Stopcodons für das Überlesen verantwortlich (Ho nigman et al., 1991). Das Stopcodon kann zwar auch die Se quenz TAA oder TGA besitzen, aber die Effizienz läßt deut lich nach (Feng et al., 1989; Odawara et al., 1991).

Stromabwärts des env-Genes befindet sich zwei Basen vor der 3′-LTR der polypurine track" (Pos. 8270-8282). Bei der reversen Transkription wird die komplementäre Sequenz der viralen RNA an dieser Stelle nicht von der RNase H angegrif fen und dient dann der DNA-Polymerase als Startmolekül für die Synthese des Plusstranges (Smith et al., 1984).

Im Vergleich zum AK Provirus (Herr, 1984; Etzerodt et al., 1984) ist die Verteilung der Start- und Stopcodons homolog. Lediglich die Lage der offenen Leserahmen in den Leserastern unterscheidet sich durch die unterschiedliche Länge der LTRs. Die Nukleotidsequenzen der Proviren des RFB MuLV und des AKV weisen eine Homologie von 97% auf. Die Homolgie ver schiedener Regionen sind Gene des RFB MuLV mit den analogen Sequenzen anderer MuLVs kann der Tabelle 9 entnommen werden. Die Abweichungen liegen im wesentlichen in zwei Gruppen vor. Eine Häufung von zusätzlichen und abweichenden Basenpaaren befindet sich im Bereich der U3-Region der LTR. Die zweite Anhäufung von Sequenzunterschieden befindet sich zwischen Position 7263 und 7543, die sich - wie später dargelegt - in der Sequenz des Oberflächenproteines (SU) widerspiegelt.

Auswertung der translatierten Proteinsequenzen

Die Translation des gag-Leserahmens ergibt, ein Vorläuferpro tein von 537 Aminosäuren, das durch die Protease in einzelne Strukturproteine zerschnitten wird. Anhand der für das Molo ney MuLV bekannten Sequenzen (Oroszlan und Luftig, 1990; Shinnick et al., 1981) konnten alle für die Prozessierung notwendigen Schnittstellen ausfindig gemacht werden. Die Erkennungssequenzen wichen aber zwischen den Proteinen MA und p12 um eine, sowie zwischen p12 und CA um zwei Aminosäu ren voneinander ab. Anhaltspunkte, daß dies zu einem unter schiedlichen Schnittverhalten der Protease und damit eventu ell zu Fusionsproteinen führt, liegen nicht vor. Die Homolo gie zu der Sequenz des AKV beträgt 99%, wobei 6 Abweichungen gleichmäßig im Kapsidprotein und 2 im Matrixprotein verteilt sind. Im Vergleich zu anderen ecotropen Mäuse-Retroviren zeigen sich überraschenderweise starke Abweichungen der Ami nosäuresequenz in Proteinen CA und p12. Im Kapsidprotein begründet ein Argininmolekül in Position 324 den N-Tropismus des RFB MuLV (Boone et al., 1988), und im Nukleokapsidpro tein befindet sich zwischen den Positionen 503 und 516 die Cystidin-Histidin-Box, die für die Verpackung der RNA in das Viruspartikel wichtig ist (Green und Berg, 1990).

Die Proteine des pol-Genes sind nach der Translation Be standteil des 1734 Aminosäuren umfassenden gag-pol-Vorläu ferproteins. Dabei wurde durch Sequenzierung der Protease nachgewiesen, daß das Stopcodon für ein Glutamin kodiert (Yoshinaka et al., 1985). Bei der posttranslationellen Pro zessierung ist die Proteaseschnittstelle am C-Terminus des Nukleokapsidproteins gleichzeitig die Schnittstelle für den N-Terminus der Protease. Daraus folgt, daß sich die DNA-Se quenzen der ersten vier Aminosäuren der retroviralen Protea se noch im gag-Leserahmen befinden (Yoshinaka et al., 1985). Insgesamt besteht die Protease des RFB MuLV aus 124 Amino säuren, wobei die Aminosäuren 32 bis 34 das aktive Zentrum bilden. Im Bereich des pol-Genes treten unter den verschie denen MuLVs am N-Terminus der Integrase gehäuft Sequenzun terschiede auf, wobei zwei Gruppen hoch homologer Sequenzen entstehen: einerseits RFB MuLV, AKV und RadLV/VL3 (T+L+) und andererseits Friend MuLV, Moloney MuLV und Cas-Br-E MuLV. Diese Unterschiede könnten vielleicht einen Einfluß auf die Integrationsmöglichkeiten der Retroviren in verschiedenen Zelltypen haben, da bekannt ist, daß Retroviren zwar keine spezifische Erkennungssequenz besitzen, aber auch nicht an völlig zufälligen Stellen in das Wirtsgenom eingebaut werden (Brown, 1990).

Die Gene der env-Region werden in ein eigenes Vorläuferpro tein übersetzt, das 664 Aminosäuren umfaßt. Die Unterteilung des Vorläuferproteins anhand der für das Moloney MuLV be kannten Proteaseschnittstellen (Oroszlan und Luftig, 1990; Shinnick et al., 1981) ergab, daß lediglich für das C-termi nale Ende des Transmembranproteins (TM) eine vollständig homologe Schnittstellensequenz nachgewiesen werden kann. Die Schnittstelle zwischen Oberflächen- (SU) und Transmembran protein ist zwar vorhanden, weicht aber in drei Aminosäuren von der Sequenz des Moloney MuLV ab, während für das C-ter minale Ende des Oberflächenproteins überhaupt keine Schnitt stelle ausfindig gemacht werden kann. Diese konnte nur auf grund der vom AKV bekannten Daten festgelegt werden. Aus dem Vorläuferprotein gehen demnach ein 438 Aminosäuren umfaßen des Oberflächen- und ein 180 Aminosäuren langes Transmem branprotein hervor. Ferner werden N-terminal 32 Aminosäuren, die das Signalpeptid bilden, und C-terminal 14 Aminosäuren (R-Peptid) abgetrennt. Eine Analyse der Proteinsequenz mit dem Kyte-Doolittle-Algorithmus legte dann auch die in unmit telbarer Nähe der Schnittstellen erwarteten hydrophoben Be reiche offen (Kyte und Doolittle, 1982).

Während im Vergleich zur Sequenz des env Proteines des AKV (98% Homologie) nur im Bereich des C-terminalen Endes des Oberflächenproteines acht abweichende Aminosäuren auftreten, ist im Bereich des N-Terminus eine überraschend große Anhäu fung von Abweichungen gegenüber Friend MuLV, Moloney MuLV und Cas-Br-E MuLV. Dies ist die Region, die bei der Adsorp tion und Penetration mit dem zellulären Rezeptor in Wechsel wirkung tritt (Hunter und Swanstrom, 1990). Daraus wird ge schlossen, daß von MuLVs, die Knochentumoren verursachen, möglicherweise ein alternativer Rezeptor verwandt wird.

Beim Vergleich der drei Proteinsequenzen verschiedener MuLVs fällt auf, daß bei den abweichenden Aminosäuren dennoch häu fig Homologien zwischen bestimmten MuLVs bestehen. Daraus lassen sich zwei Gruppen bilden: eine Gruppe enthält das RFB MuLV, das AKV und das RadLV/VL3, die zweite das Moloney und das Friend MuLV sowie das Cas-BR-E. Mit dem AKV und dem RFB MuLV enthält die erste Gruppe zwei Viren, die Knochentumoren verursachen. Für das RadLV/VL ist dies nicht beschrieben (Merregaert et al., 1985; Janowski et al., 1985; Merregaert et al., 1987). Die Viren der zweiten Gruppe verursachen Tu moren des hämatopoetischen Systems (Moloney und Friend MuLV; Teich, 1984; Teich et al., 1984) bzw. neurodegenerative Er krankungen (Cas-BR-E; Perryman, 1991). Auf der Ebene der Aminosäuren kann die Zuordnung zu diesen Gruppen außerhalb der LTRs im Bereich der untranslatierten Sequenzen ebenfalls beobachtet werden, während sie in den kodierenden Bereichen weitgehend verschwimmt.

Bewertung der Ergebnisse

Die Proviren der Retroviren werden in der Regel von zwei Regulationseinheiten (LTRs) eingeschlossen. Da die LTRs an ihren Enden "inverted repeats" besitzen, die zudem noch eine für einzelne Genera spezifische Sequenz aufweisen (Varmus, 1982), konnten diese zur genauen Definition sowohl der Pro virus- als auch der LTR-Sequenz verwandt werden. Dabei konn te eine Sequenz der LTR, die bereits früher ermittelt wurde (Pedersen et al., 1992) bestätigt werden. Lediglich an den Enden waren die Basenfolgen von Behnisch (1988) und Pedersen et al. (1992) um je zwei Basenpaare länger. Der Unterschied liegt in verschiedenen Zeitpunkten, die der Darstellung zu Grunde gelegt werden: Die von den beiden Autoren dargelegte Konstellation kommt weder im Retrovirus, in dem die Enden der RNA lediglich die R- und U3- bzw. die US- und R-Region aufweisen, noch im Provirus vor, bei dem die endständigen Basenpaare fehlen, weil sie bei der Integration in die Wirts-DNA durch die Integrase entfernt werden. Nur in der Zeit zwischen der reversen Transkription und der Integration in das Zellgenom besitzen die beiden LTRs diese Sequenz, und bei der vorliegenden Arbeit konnten die Basenpaare deshalb auch nicht gefunden werden. Die Entstehung der zusätzlichen TT und AA beruht darauf, daß sowohl die Primerbindungsstelle als auch die Polypurinregion zu den LTRs einen Abstand von ebenfalls zwei Basen einhalten.

Gegenüber einer bereits früher durchgeführten Analyse (Beh nisch, 1988) konnten in der U3-Region der LTR überraschen derweise weitere Bindestellen für Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Da Transkriptionsfaktoren nicht in allen Zellen vorkommen, sondern jeder Zelltyp sein eigenes Muster an Kernproteinen besitzt, können sie die Ursache für eine zellspezifische Wirkung der MuLVs sein. Für einige Transkriptionsfaktoren wurde ein Vorkommen in Lymphozyten beschrieben. Dies erklärt die Möglichkeit der Virusreplika tio 20262 00070 552 001000280000000200012000285912015100040 0002004411718 00004 20143n in hämatopoetischen Zellen und die Entstehung von Lymp homen. Die Existenz der Faktoren in Knochenzellen ist aller dings nicht vollständig beschrieben.

Prinzipiell sind die Bindestellen nukleärer Proteine ledig lich aufgrund von bestimmten DNA-Motiven identifiziert wor den. Ob diese Bindungsstellen überhaupt biologisch aktiv sind, kann aus der Sequenz nicht beurteilt werden, und be darf einer experimentellen Untersuchung. Einige Motive tre ten so häufig auf, daß der Verdacht nahe liegt, daß zumin dest einige Motive ohne biologische Relevanz, und daher nur zufällig vorhanden sind. Je kürzer ein Motiv ist, um so häu figer muß es - rein statistisch betrachtet - auftreten. Wenn man annimmt, daß unter kontinuierlichem Selektionsdruck kei ne Sequenz zufällig auftritt, so liegen hier möglicherweise Ursachen für die Existenz derartiger DNA-Motive vor, die noch nicht erkannt wurden. So können im Bereich kodierender Sequenzen zum Beispiel Proteine, die durch ihre Funktion hoch konserviert sind, eine Konservierung der DNA-Motive bedingen.

Die Sequenzen der Vorläuferproteine wurden mit Hilfe des Triplettcodes aus der Nukleinsäuresequenz entwickelt, womit die Sicherheit dieser Daten natürlich von der Richtigkeit der Nukleinsäuresequenz abhängt. Die Schnittstellen, an de nen die Vorläuferproteine in die einzelnen Enzyme und Struk turproteine gespalten werden, wurden vom Moloney MuLV abge leitet. Daher sind die Einteilungen nur Vorhersagen, die in weiteren Experimenten geprüft werden müssen. Dabei muß sich auch zeigen inwieweit die Proteine posttranslationell ver ändert werden.

Veröffentlichungen

Murray, A.B., Schmidt, J., Luz, A. Osteopetrosis induced by retrovirus, mouse. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Springer Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.), ILSI, pp. 284-291, 1991.

Luz, A., Murray, A.B., Schmidt, J. Osteoma mouse, spontaneous and virus-induced. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Springer Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.), ILSI, pp. 182-190, 1991.

Pedersen, L., Strauss, P.G., Schmidt, J., Luz, A., Effle, V., Jøgensen, P., Kjeldgaard, N.O., Pedersen, F.S.
Pathogenicity of Balb/c-derived N-tropic murine leukemia viruses.
Virology 179 : 931-935, 1990.

Schmidt, J., Luz, A., Effle, V. (1988):
Endogenous Murine Leukemia Viruses: Frequency of Radiation-Activation and Novel Pathogenic Effects of Viral Isolates.
Leuk.Res., 12, 393-403

Schmidt, J., Erfle, V., Peterson, F., S., Rohnier, H., Schetters, H., Marquart, K.-H., Lutz, A. (1984):
Oncogenic Retrovirus from Spontaneous Mirrine Osteomas. I. Isolation and Biological Characterization.
J. gen. Virol., 65, 2237-2248.

Pedersen, L., Behnisch, W., Strauß, P., G., Schmidt, J., Luz, A., Pedersen, F., S., Erfle, V. (1992):
Molecular cloning of a bone-pathogenic replication-competent murine leukemia Virus from the RFB osteoma Virus stock.
J. Virol., 66, 6186-6190.

Erfle, V., Schmidt, J., Strauß, P. G., Hehlmann, R., Luz, A. (1986):
Activation and biological properties of endogenous retroviruses in radiation osteosarcoma genesis.
Leuk. Res., 10, 905-913.

Behnisch, W. (1988):
Molekulare Klonierung und Charakterisierung der murinen osteotropen Leukämieviren RFB und OS-5.
Diss. rer. nat., München.

Linxweiler, W., Hörz, W. (1982):
Sequence specifity of exonuclease III from E. coli.
Nucl. Acids Res., 10, 4845-4859.

Henikoff, S. (1984):
Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing
Gene, 28, 351-359.

Yanisch-Perron, C., Vieirra, J., Messing, J (1985):
Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors
Gene, 33, 103-119.

Xie, W., Potts, M. (1989):
Quick Screening of Plasmid Deletion Clones Carrying Inserts of Desired Sizes for DNA Sequencing.
Gene Anal. Techn., 6, 17-20.

Putney, S., D., Benkovic, S., J., Schimmel, P., R. (1981):
A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease in and can be replicated in vivo
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7350-7354.

Deng, G.-R., Wu, R. (1983):
Terminal transferase: Use in the tailing of DNA and for in vitro mutagenesis.
Meth. Enzymol., 100, 96-116.

Vogt, V., M. (1973):
Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae
Eur. J. Biochem., 33, 192-200.

Smith, A., J. (1979):
The use of exonuclease in for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.
Nucl. Acids Res., 6, 831-848.

Yanisch-Perron, C., Vieirra, J., Messing, J. (1985):
Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors Gene, 33, 103-119.

Smith, L., M., Sanders, J., Z., Kaiser, R., J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C., R., Heiner, C., Kent, S., B., H., Hood, L., E. (1986):
Flourescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 321, 674-679.

Prober, J., M., Trainor, G., L., Dam, R., J., Hobbs, F., W., Robertson, C., W., Zagursky, R., J., Cocuzza, A., J., Jensen, M., A., Baumeister, K. (1987):
A system for rapid DNA sequencing with föourescent chain-terminating dideoxynucleotides.
Science, 238, 336-341.

Kessler, C., Höltke, H., J. (1986):
Specifity of restriction endonucleases and methylases - a review (Edition 2). Gene, 47, 1-153.

Winnacker, E.-L. (1987):
From clones to genes - Introduction to gene technology. VHC Publishers, New York.

Rychlik, W., Spencer, W., J., Rhoads, R., B. (1990):
Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.
Nucl. Acids Res. 18, 6409-6412.

Varmus, H. (1982):
Form and function of retroviral proviruses. Science, 216, 812-820.

Faisst, S., Meyer, S. (1992):
Compilation of vertebrate-encoded transcription factors. Nucl. Acids Res., 20, 3-26.

Turpaev, K., T., Vasetskii, B., S. (1990):
Nuclear protein factors that interact eith specific DNA sequences. Soviet Genetics, 26, 504- 516.

Biedenkapp, H., Borgmeyer, U., Sippel, A. E., Klempauer, K.-H. (1988):
Viral myb oncogene encodes a specific DNA-binding activity. Nature, 335, 835-837.

Klempnauer, K.-H., Gonda, T., J., Bishop, J., M. (1984):
Subcellular localization of proteins encoded by oncogenes of avian myoblastosis Virus and avian leukemia Virus B26 and by the chicken c-myb gene. Cell, 37, 537-547.

Boyle, W., J., Lampert, M., A., Lipsick, J., S., Baluda, M., A. (1984):
Avian myeloblastosis Virus and E26 Virus oncogene products are nuclear proteins.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8f, 4265-4269.

Howe, K., M., Reakes, C., F., L., Watson, R., J. (1990):
Characterization of the sequence-specific interaction of mouse c-myc protein with DNA.
BMBO J., 9, 161-169.

Flanagan, J., R., Krieg, A., M., Max, E., E., Khan, A. (1989):
Negative control region at the 5′ end of murine leukemia Virus long terminal repeats.
Mol. Cell. Biol., 9, 739-746.

Akira, S., Isshiki, H., Sugita, T., Tanabe, O., Kinoshita, S., Nishio, Y., Nakajima, T., Hirano, T., Kishimoto, T. (1990):
Anuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of C/EBP family.
EMBO J., 9, 1897-1906.

Ghysdael, J., Gegonne, A., Pognonec, P., Boulukus, K., E., Leprince, D., Stehelin, D. (1986):
Identification and preferential expression in thymic and bursal lymphocytes of a c-ets oncogene-encoded Mr 54,000 cytoplasmic protein.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1714-1718.

Pognonec, P., Boulukus, K. E., Ghysdael, J. (1989):
The c-ets-1 protein is chromatin associated and binds to DNA in vitro. Oncogene, 4, 691-697.

Majello, B., Arcone, R., Toniatti, C., Ciliberto, G. (1990):
Constitutive and IL-6-induced nuclear factors that interact with the human C-reactive protein promotor. EMBO J., 9, 457-465.

Miksicek, R., Heber, A., Schmid, W., Danesch, U., Posseckert, G., Beato, M., Schulz, G. (1986):
Glucocorticoid responsiveness of the transcriptional enhancer of Moloney munne sarcoma Virus. Cell, 467, 283-290.

Nourse, J., Mellntin, J., D., Galili, N., Wilkinson, J., Stanbrigde, E., Smith, S. D., Cleary, M., L. (1990):
Chromosomal translaction t(1; 19) results in synthesis of a homeobox fusion mRNA that encodes for a potential chimenc transcnption factor. Cell, 60, 535-545.

Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D; (1991):
B-cell- and myocyte- specific E2-box- binding factors contain E12/E47 like Subunits.
Mol. Cell. Biol., 11, 1156-1160.

Villemur, R., Rassart, E., DesGroseillers, L., Jolicoeur, P. (1983):
Molecular cloning of viral DNA from leukemogenic Gross passage A murine leukemia Virus and nucleotide sequence of its long terminal repeat. J. Virol. 45, 539-546.

Brown, P., O. (1990):
Integration of retroviral DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 157, 19-48.

DesGroseiller, L., Jolicoeur, P. (1984):
The tandem direct repeats within the long terminal repeat of murine leukemia viruses are the primary determinant of their leukemogenic potential. J. Virol., 52, 945-952.

Jolicoeur, P. (1991):
Murine acquired immunodeficiency syndrome (MAIDS) - An animal model to study the AIDS pathogenesis. FASEB J., 5, 2398-2405.

Mercurio, F., Karin, M. (1989):
Transcription factors AP-3 and AP-2 interact with the SV40 enhancer in a mutually exclusive manner. EMBO J., 8, 1455-1460.

Boral, A., L., Okenquist, S., A., Lenz, J. (1989):
Identification of the SL3-3 Virus enhancer core as a T-lymphoma cell-specific element. J. Virol. 63, 76-84.

Thornell, A., Hallberg, B., Grundstrom, T. (1988):
Differential protein binding in lymphocytes to a sequence in the enhancer of mous retrovirus SL3-3. Mol. Cell. Biol., 8, 1625-1637.

Mitchell, P., J., Wang, C., Tjian, R. (1987):
Positive and negative regulation of transcription in vitro: enhancer-binding protein AP-2 is inhibited SV40 T antigen. Cell, 50, 847-861.

Kageyama, R., Pastan, I. (1989):
Molekular cloning and characterization of a human DNA binding factor that represses trans cription. Cell 59, 815-825.

Dorn, A., Bemoist, C., Mathis, D. (1989):
New B-lymphocyte-specific enhancer-binding protein. Mol. Cell. Biol. 9, 312-320, 1989.

Majors, J. (1990):
The strucure and function of retroviral long terminal repeat.
Curr. Top. Microbiol. Immunol., 157, 49-92.

McLauchlan, J., Gaffney, D., Whitton, J., L., Clements, J., B. (1985):
The consensus sequence YGTGTTYY located downstreem from the AATAAA signal is required for efficient formation of mRNA 3′ termini. Nucl. Acids Res. 13, 1347-1368.

Aiyar, A., Cobrinik, D., Ge, Z., Kung, H.-J., Leis, J. (1992):
Interaction between retroviral U5 RNA and the TyC loop of the tRNA^Trp primer is required for efficient initiation of reverse transcription. J. Virol., 66, 2464-2472.

Mann, R., D. (1985):
Varying the Position of a retrovirus packaging sequence results in the encapsidation of both unspliced and spliced RNAs. J. Virol., 54, 401-407.

Lazo, P., A., Prasad, V., Tsichlis, P., N. (1987):
Splice acceptor site for the env message of Moloney marine leukemia Virus.
J. Virol., 61, 2038-2041.

Herr, W. (1984):
Nucleotide Sequence of AKV Marine Leukemia Virus. J. Virol., 49, 471-478.

Shinnick, T., M., Lerner, R., A., Sutcliffe, J., G. (1981):
Nucleotide sequence of Moloney murine leukemia Virus. Nature, 293, 543-548.

Honigman, A., Wolf, D., Yaish, S., Falk, H., Panet, A. (1991):
cis Acting RNA Sequences Control the Gag-Pol Translation Readthrough in Murine Leukemia Virus. Virology, 183, 313-319.

Feng, Y., X., Levine, J., G., Hatfield, D., L., Schaefer, T., S., Gorelick, R., J., Rein, A. (1989):
Suppression of UAA and UGA termination codons in mutant murine leukemia viruses.
J. Virol., 63, 2870-2873.

Odawara, T., Yoshikura, H., Ohshima, M., Tanaka, T., Jones, D., S., Nemoto, F., Kuchino, Y., Iwamoto, A. (1991):
Analysis of Moloney Murine Leukemia Virus Revertants Mutated at the gag-pol Junction.
J. Virol., 65, 6376-6379.

Smith, J., K., Cywinski, A., Taylor, J., M. (1984):
Specificity of initiation of plus-strand DNA by Rous Sarcoma Virus. J. Virol., 52, 314-319.

Etzerodt, M., Mikkelsen, T., Pedersen, F., S., Kjeldgaard, N., O., Jorgensen, P., (1984):
The nucleotide sequence of the AKV marine leukemia Virus genome.
Virology, 134, 196-207

Ororszlan, S., Luftig, R., B. (1990):
Retroviral proteinases. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 157, 153-186.

Boone, L. R., Glover, P., L., Innes, C., L., Niver, L., A., Bondurant, M., C., Yang, W., K. (1988):
Fv-1 N- and B-tropism-specific sequences in marine leukemia Virus and related endogenous proviral genomes. J. Virol., 62, 2644-2650.

Green, L., M., Berg, J., M. (1990):
Retroviral nucleocapsid protein-metal Ion interactions: Folding and sequence variants.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6403-6407.

Yoshinaka, Y., Katoh, I., Copeland, T. D., Oroszlan, S. (1985):
Marine leukemia Virus protease is encoded by the gag-pol gene and is synthesized through suppression of an amber termination codon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1618-1622.

Shinnick, T., M., Lerner, R., A., Sutcliffe, J., G. (1981):
Nucleotide sequence of Moloney marine leukemia virus. Nature, 293, 543-548.

Kyte, J., Doolittle, R., F. (1982):
A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.
J. Mol. Biol., 157, 105-132.

Hunter, E., Swanstrom, R. (1990):
Retrovirus envelope glycoproteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 157, 187-253.

Merregaert, J., Nuyten, M., J., Janowski, M. (1985):
Nucleotide sequence of the envelope gene of radiation leukemia virus. Virollogy, 144, 457-467.

Janowski, M., Merregaert, J., Boniver, J., Maison, J., R. (1985):
Proviral genome of radiation leukemia virus: Molecular cloning of biologically active proviral DNA and nucleotide sequence of its long terminal repeat.
J. Virol., 55, 251-255.

Merregaert, J., Janowski, M., Reddy, E., P. (1987):
Nucleotide sequence of a radiation leukemia virus genome. Virology, 158, 88-102.

Teich, N. (1984):
Taxonomy of retroviruses.
In: RNA Tumor Viruses (ed. R. Weiss, Teich, N., Varmus, H., Coffm, J.), 25-207, Cold Spring Habor Laboratory, New York.

Teich, N., Wyke, J., Bernstein, A., Hardy, W. (1984):
Pathogenesis of retrovirus-induced disease.
In: RNA Tumor Viruses (ed. R. Weiss, Teich, N., Varmus, H., Coffm, J.), 785-998, Cold Spring Habor Laboratory, New York.

Perryman, S., M., Mcatee, F., J., Portis, J., L. (1991):
Complete Nucleotide Sequence of the Neurotropic Marine Retrovirus CAS-BR-E.
Nucleic Acids Res., 19, 1707.

Frischauf, A., M., Garoff, H., Lehrach, H. (1980):
A subcloning strategy for DNA sequencing. Nucl. Acids Res., 8, 5541-5549.

Anderson, S. (1981):
Shotgun DNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments.
Nucl. Asids Res, 9, 3015-3027.

Hong, G., F. (1982):
A Systematic DNA Sequencing Stratey. J. Mol. Biol., 158, 539-549.

Deininger, P., L. (1983):
Approaches to Rapid Sequence Analysis. Anal. Biochem., 135, 247-263.

Li, Q., Wu, G. (1987):
A versatile and simplified non-random strategy for nucleotide sequencing. Gene, 56, 245-252.

Poncz, M., Solowiejczyk, D., Ballantine, M., Schwartz, E., Surrey, S. (1982):
"Nonrandom" DNA sequence analysis in bacteriophage M13 by the dideoxy chain termination method.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4298-4302.

Guo, L., Yang, R., C., A., Wu, R. (1983):
An improved strategy for rapid direct sequencing of both strands of long DNA molecules cloned in a plasmid. Nucl. Asids Res., 11, 5521-5540.

Haltiner, M., Kempe, T., Tjian, R. (1985):
A novel strategy for constructing clustered point mutations. Nucl. Acids Res., 13, 1015-1025.

Misra, T., K. (1985):
A new strategy to create ordered deletions for rapid nucleotide sequencing.
Gene, 34, 263-268.

Barcak, G. J., Wolf Jr. R. E. (1986):
A method for unidirectional deletion mutagenesis with application to nucleotide sequencing and preparation of gene fusions. Gene, 49, 119-128.

Henikoff, S. (1984):
Unidirectional digestion with exonuclease in creates targeted breakpoints for DNA sequencing Gene, 28, 351-359.

Nakayama, K., Nakauchi, H. (1989):
An improved method to make sequential deletion mutants for DNA sequencing.
Trends Genet., 5, 325.

Lee, L., G., Connell, R., R., Woo, S., L., Cheng, R., D., McArdle, B., F., Fuller, C., W., Halloran, N., D., Wilson, R., K. (1992):
DNA sequencing with dye-labeled terminators and T7 DNA polymerase: effect of dyes and dNTPs on incorporation of dye-terminators and probability analysis of termination fragments.
Nucl. Acids Res., 20, 2471-2483.

Li, J., P., D′Andrea, A., D., Lodish, H., F., Baltimore, D. (1990):
Activation of cell growth by binding of Friend spleen focus-forming virus gp55 glycoprotein to the erythropoietin receptor. Nature, 343, 762-764.

Yoshimura, A., D′Andrea, A., D., Lodish, H., F. (1990):
Friend spleen focus-forming virus glycoprotein gp55 interacts with the erythropoietin receptor in the endoplasmic reticulum and affects receptor metabolism.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4139-4143.

Clark, S., P., Mak, T., W. (1983):
Complete nucleotide sequence of an infectious clone of Friend spleen focus-forming provirus:
gp55 is an envelope fusion glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5037-5041.

Finkel, M., P., Reilly Jr., C., A., Biskis, B., O., Greco, I., L. (1973):
Bone tumor viruses.
In: Bone - Certain aspects of neoplasia. Colston Papers No. 24 (ed. Price, C., H., G., Ross, F., G., M.) 353-366, Butterworth, London.

Etzerodt, M., Mikkelsen, T., Pedersen, F., S., Kjeldgaard, N., O., Jorgensen, P., (1984):
The nucleotide sequence of the AKV marine leukemia virus genome.
Virology, 134, 196-207.

Claims

1. Nukleinsäure- und Proteinsequenz des RFB-14-Retrovirus gemäß Abb. 1.

2. Rekombinantesequenz mit einer von der Sequenz nach An spruch 1 abgeleiteten genomischen oder subgenomischen Se quenz.

3. Nukleinsäure- und Proteinsequenz nach Anspruch 1 oder 2, die die codierenden Bereiche oder einen oder mehrere Teil bereiche hiervon umfaßt.

4. Nukleinsäure- und Proteinsequenz nach Anspruch 1 oder 2, die die gag-pol-env-Region oder einen oder mehrere Teilbe reich hiervon umfaßt.

5. Nukleinsäuresequenz nach einem oder mehreren der vorherge henden Ansprüche, die für ein osteoinduktives Protein codiert.

6. Nukleinsäuresequenz nach einem oder mehreren der vorherge henden Ansprüche, die ein osteoinduktives Protein indu ziert.

7. Nukleinsäuresequenz, die mit einer oder mehreren der Se quenzen der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert.

8. Rekombinanter Vektor, der eine Sequenz nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche enthält.

9. Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 8 transformiert wurde.

10. Rekombinantes Expressionssystem, das ein (Poly)-Peptid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche ex primiert.

11. Zelle, die mit einem Expressionssystem nach Anspruch 10 transformiert wurde.

12. Polypeptid, hergestellt von einer Zelle nach Anspruch 11.

13. Sequenz nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, die für ein osteoinduktives Protein codiert oder ein osteoinduktives Protein oder einen osteoindukti ven Faktor induziert.

14. Rekombinantes Polypeptid mit einer Sequenz aus einem Teil bereich des gag-pol-env-Genomabschnitts.

15. Fusionspolypeptid mit einem Polypeptid des gag-pol-env- Genomabschnitts oder einem Teilbereich hiervon.

16. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen ein Epitop einer oder mehrerer der Sequenzen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

17. Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer osteoinduk tiver Proteine unter Verwendung osteoinduktiver Retrovi ren.

18. Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer osteoinduk tiver Proteine unter Verwendung subgenomischer Bereiche des Genoms osteoinduktiver Retroviren, insbesondere des gag-pol-env-Bereichs.

19. Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer osteoinduk tiver Proteine unter Verwendung von durch osteoinduktive Retroviren induzierten zellulären Genen.

20. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, wobei das osteoinduktive Retrovirus das RFB-14- Retrovirus ist.

21. Verwendung von Sequenzen osteoinduktiver Retroviren zur Herstellung eines oder mehrerer virus-codierter Pro teine in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen.

22. Verwendung von Sequenzen osteoinduktiver Retroviren nach einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche zur Her stellung eines oder mehrerer virus-induzierter zellulärer Proteine in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen.

23. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein osteoinduktives Protein ist.

24. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das osteoinduktive Retrovirus das RFB-14- Retrovirus ist.

25. Verwendung einer Sequenz nach einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie und zur Prophylaxe von Knochenerkrankungen.

26. Verwendung einer Sequenz nach einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung des Knochenwachstums.

27. Verwendung einer Sequenz nach einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Gentherapie bei Säugetieren, bevorzugt beim Menschen.

28. Verwendung einer Sequenz nach einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche, ausgewählt aus dem gag-pol-env-Be reich osteoinduktiver Retroviren.