ES2313807A1 - Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de ankara (mva) como vacunas contra la leishmaniasis. - Google Patents
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Abstract
Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) como vacunas contra la leishmaniasis. Los vectores de la invención contienen secuencias codificantes de la proteína LACK, preferentemente insertadas en el locus de hemaglutinina del virus y bajo el control de un promotor que permite su expresión a lo largo del ciclo de infección del virus. Son vectores seguros, estables, que dan lugar a una potente respuesta inmune que confiere protección frente a la leishmaniasis, por lo que son buenos candidatos para ser utilizados en vacunación frente a esta enfermedad, especialmente en seres humanos.
Description
Vectores recombinantes basados en el virus
vaccinia modificado de ankara (MVA) como vacunas contra la
leishmaniasis.
La presente invención se refiere a la
utilización de virus recombinantes basados en el virus vaccinia
modificado de Ankara (MVA) en vacunación. Más concretamente, la
invención se refiere a virus recombinantes derivados del MVA que
actúan como sistemas de expresión de la proteína LACK o de
fragmentos inmunogénicos de la misma y a su uso en la vacunación
frente a la leishmaniasis.
La leishmaniasis es una antropozoonosis que
abarca un complejo grupo de cuadros clínicos producidos por
protozoos del género Leishmania, los cuales parasitan
células del sistema monocito-macrófago.
Leishmania es un protozoo flagelado que pertenece al orden
Kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae. La
clasificación del género Leishmania en sus diferentes
especies es compleja y en la actualidad se realiza mediante el
análisis de los fragmentos de restricción del ADN del Kinetoplasto.
Es la siguiente:
ORDEN:\nc{Kinetoplastida}
FAMILIA:\nc{Trypanosomatidae}
GÉNERO:\nc{Leishmania}
- \quad
- SUBGÉNERO:\nc{Leishmania}
- \quad
- Complejo:\nc{L. donovani}
- \quad
- L. donovani; L. infantum; L. chagasi; L. archibaldi
- \quad
- Especies fuera del complejo\nc{L. donovani}
- \quad
- L. tropica; L. aethiopica; L. major; L. gerbilli
- \quad
- Complejo:\nc{L. mexicana}
- \quad
- L. mexicana; L. amazonensis; L. venezuelensis; L. aristidesi
- \quad
- SUBGÉNERO:\nc{Viannia}
- \quad
- Complejo:\nc{L. braziliensis}
- \quad
- L. braziliensis; L. panamensis; L. guyanensis; L. peruviana.
El ciclo vital se desarrolla en dos huéspedes,
uno vertebrado (mamífero) y un vector invertebrado (mosquito hembra
de la familia Phlebotomidae, un díptero del género
Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomya en el Nuevo Mundo
también conocido como beatilla de las arenas). En el huésped
vertebrado, Leishmania es un parásito intracelular obligado
que se encuentra en los macrófagos en forma de amastigote. Los
amastigotes son formas redondeadas con unas dimensiones de
3-5 \mum x 2-3 \mum, con un
flagelo rudimentario que no sobresale del soma y que se reproducen
por fisión binaria. Los amastigotes pasan al insecto, con la
picadura al ingerir sangre de un mamífero parasitado. En la bolsa
peritrófica del intestino medio del insecto, los amastigotes se
transforman en promastigotes, forma móvil y alargada con un único
flagelo en su polo anterior, que se multiplican activamente en el
intestino medio del mosquito. Al cabo de 15-20 días
de su ingestión comienzan a desprenderse de la cutícula intestinal
invadiendo la hipofaringe. Por la picadura a un nuevo huésped, el
insecto inocula los promastigotes, denominados metacíclicos,
quienes una vez en el interior del huésped vertebrado serán
fagocitados por las células del sistema
monocito-macrófago, donde se transformarán y
multiplicarán como amastigotes.
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad
varían dependiendo de la respuesta inmune del hospedador, la cepa y
la virulencia del parásito, observándose desde lesiones cutáneas
que curan espontáneamente, hasta una forma visceral de la
enfermedad que puede conducir a la muerte en caso de no recibir
tratamiento.
La leishmaniasis cutánea, típicamente, es
causada por Leishmania tropica, Leishmania major y
Leishmania aethiopica (especies del "Viejo Mundo") y por
Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis, Leishmania panamensis,
Leishmania guyanensis, Leishmania peruviana, Leishmania chagasi
y otras especies en el Nuevo Mundo. Se presenta, con frecuencia, en
forma de úlceras superficiales con bordes elevados, que surgen por
lo común en zonas localizadas o expuestas de la cara y las
extremidades y que pueden acompañarse de lesiones cutáneas y
adenopatía regional. Las manifestaciones clínicas de la
leishmaniasis cutánea en el Viejo y en el Nuevo Mundo son
similares. Se necesita que transcurran anos para la resolución
espontánea de las lesiones y suele quedar una cicatriz plana
atrófica.
La leishmaniasis visceral, conocida también como
Kala-azar o fiebre Dum-Dum, es
causada por las especies L. donovani, L. chagasi y
L. infantum. Su sintomatología característica en humanos
consiste en cefaleas, fiebre a intervalos, astenia, diarrea,
dolores abdominales, cólicos, adenopatías, hepatomegalia,
esplenomegalia, anemia, leucopenia, trombocitopenia, lesiones
oculares, crecimiento excesivo de uñas y pestañas así como la
aparición de infecciones oportunistas. En España y Sudoeste de
Europa la leishmaniasis es una zoonosis, siendo los perros su
reservorio principal. Estudios epidemiológicos revelan que hasta el
80% de los perros en zonas endémicas están infectados (3, 31), de
los cuales el 50% desarrolla la forma visceral de la enfermedad (3,
17).
La especie tradicionalmente conocida como
causante de la leishmaniasis visceral en la zona mediterránea es
Leishmania infantum. Sin embargo, su distribución se
extiende hacia el este de Europa y países asiáticos. En la
actualidad se considera como sinónimo de Leishmania chagasi
(22), por lo que su distribución se ampliaría hasta América latina
y posiblemente hasta la zona sur de Estados Unidos (10).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha
estimado que la prevalencia mundial de la enfermedad en humanos
alcanza los 12 millones de personas, con una incidencia anual de
1,5 a 2 millones de nuevos casos de leishmaniasis cutánea y 500000
nuevos casos de leishmaniasis visceral (WHO 2000). Existe además una
elevada incidencia de la enfermedad en pacientes de SIDA, ya que la
infección con HIV incrementa el riesgo de desarrollar leishmaniasis
de 100 a 1000 veces (21), lo que provoca una elevada mortalidad. La
OMS estima que entre el 2 y el 9% de todos los pacientes de SIDA en
la zona sur de Europa desarrollarán leishmaniasis visceral (WHO
1995). Aunque existen fármacos que pueden utilizarse para tratar la
enfermedad, las variantes del parásito en casos de leishmaniasis
visceral y cutánea que son resistentes a esos fármacos son cada vez
más comunes, por lo que es importante el desarrollo de estrategias
alternativas para la lucha contra esta enfermedad como puedan ser el
desarrollo de vacunas. El hecho de que pacientes que se han
recuperado de una infección natural desarrollan una fuerte
respuesta inmune frente a Leishmania sugiere la posibilidad
del desarrollo de una vacuna contra este complejo parásito (19).
Diferentes antígenos han sido utilizados
confiriendo distintos grados de protección. Un estudio reciente en
el que se comparan diferentes candidatos en forma de ADN ha
demostrado que el gen de la proteína LACK es el más prometedor (1).
El antígeno LACK (Leishmania homolog for receptors for
Activated C Kinase) es una proteína de 36 KDa de peso molecular
altamente conservada entre las diferentes especies de
Leishmania, y que se expresa tanto en el promastigote como en
el amastigote. La proteína LACK es una diana preferencial de la
respuesta temprana anti-parasitaria, de forma que
dirige la expansión de células secretoras de IL-4
que conducen a la enfermedad. Los estudios indican que la
administración de vectores de ADN desnudo que codifican el antígeno
LACK son capaces de proporcionar protección frente a L.
major aunque, a pesar de su alta inmunogenicidad, no logran
proteger frente a la leishmaniasis visceral (VL) murina cuando son
inoculados por vía intradérmica o intravenosa (36), lo que podría
interpretarse como indicación de que LACK podría no ser un antígeno
útil para vacuna general contra la leishmaniasis basada en vectores
de ADN desnudo.
Sin embargo, el sistema utilizado para hacer
llegar la secuencia codificante del antígeno y posibilitar la
presencia de éste en la célula puede ser un elemento crítico que
determina la eficacia antigénica, por lo que LACK puede ser un
antígeno útil cuando su presencia en la célula viene determinada
por la inclusión de su secuencia codificante en un vector que
posibilite su expresión que no sea ADN desnudo. Los vectores basados
en virus Vaccinia han demostrado ser un buen sistema de aporte de
antígenos para el control de enfermedades infecciosas en estudios
con modelos animales (37) y, en particular, han demostrado gran
capacidad para aumentar la respuesta inmune celular específica
cuando a los animales se les administra una primera dosis de
inmunización (priming) que contiene diversos vectores
recombinantes (ej. ADN desnudo, proteínas, seudopartículas,
vectores virales distintos al virus vaccinia) seguida posteriormente
de una segunda dosis de refuerzo (booster) con un Virus
Vaccinia recombinante, expresando los vectores de la primera y de
la segunda dosis el mismo antígeno (18, 35). Los protocolos que
combinan los vectores Vaccinia recombinantes en la segunda dosis
con la administración de vectores recombinantes de ADN desnudo en la
primera dosis (5, 8, 12-15, 20, 28, 30, 33) están
permitiendo lograr resultados esperanzadores en distintos modelos
animales, obteniéndose protección que se correlaciona con la
activación de una respuesta inmune celular, especialmente la
activación de células T CD8+ secretoras de
IFN-\gamma. La inmunización con ADN promueve la
respuesta inmune tanto humoral como celular, confiriendo protección
en modelos experimentales (34). Este método ofrece la posibilidad
de manipular la respuesta inmune inducida con la coadministración de
adyuvantes, como puedan ser citoquinas, para aumentar la eficacia
de la vacunación (11, 16).
Un ejemplo de la utilización de estas
estrategias en las que se combinan citoquinas con virus
recombinantes derivados de Vaccinia lo constituye la solicitud de
patente española ES2171360, en la que se describe la utilización de
un virus recombinante derivado de la cepa de tipo salvaje Western
Reserve (WR) de Vaccinia, que incorpora la secuencia codificante de
la proteína LACK bajo el control del promotor p7.5 del virus,
realizándose pruebas de administración a ratones tanto de distintas
dosis de este vector como combinándolo con otro que contenía,
además de la secuencia de LACK, la secuencia codificante de la
citoquina IL-12 bajo el control del promotor pE/L.
Por su parte, en la solicitud de adición a la patente española
anterior, ES2172482, se describe la administración a perros del
primero de los recombinantes, el que incorpora únicamente la
secuencia codificante de LACK, en la segunda dosis de vacunación que
forma parte de un protocolo de inmunización en el que se administra
en la primera dosis un ADN desnudo recombinante que contiene
igualmente la secuencia codificante de la proteína LACK. Tanto en
la primera solicitud citada como en la adición a la misma, se
propone la utilización de los vectores recombinantes derivados de la
cepa virulenta (WR, Western Reserve) del virus Vaccinia tipo
salvaje como vacunas para animales, admitiendo la necesidad de
desarrollar vectores más seguros para poder ser utilizados para la
vacunación de seres humanos proponiendo al virus MVA como candidato
para ser utilizado para la generación de vectores recombinantes de
vacunación adecuados para la utilización en seres humanos. Hasta
ahora, sin embargo, seguía sin haberse generado un vector
recombinante análogo basado en MVA con capacidad para generar
protección frente a Leishmania y cuya estabilidad
permitieran plantearse su uso como vacuna frente a la leishmaniasis
en seres humanos.
El MVA (Modified Vaccinia Virus Ankara)
es una forma atenuada de Vaccinia derivada de la estirpe Ankara
obtenida mediante más de 500 pases en fibroblastos embrionarios de
pollo, que ha sido utilizada en unos 120000 individuos caucásicos
sin efectos adversos (23). Durante la atenuación se ha delecionado
el 15% del genoma parental (25), incluyendo genes implicados en la
inmunorregulación (4) y el rango de hospedadores (2, 25). Este
virus es incapaz de replicarse en líneas celulares y en cultivos
primarios humanos (6). Sin embargo, no se produce alteración en los
niveles de expresión de las proteínas virales o recombinantes (32).
Su baja virulencia y su buena capacidad para desencadenar
respuestas celulares (27) lo convierten en un buen candidato para
ser utilizado para la generación de formas recombinantes que
permitan la expresión de antígenos contra los cuales se quiera
desencadenar una respuesta
inmune.
inmune.
Por ello, en la presente invención se decidió
elegir este virus como base para conseguir crear un recombinante
capaz de expresar una secuencia codificante de la proteína LACK de
L. infantum o de un fragmento inmunogénico de la misma. Sin
embargo, a diferencia de los vectores recombinantes basados en la
cepa WR descritos en la solicitud ES2171360 y en la adición a la
misma ES2172482, en la realización descrita de la invención se ha
elegido para la inserción de la secuencia codificante de LACK el
locus de hemaglutinina (HA) en lugar del locus de
timidina quinasa (TK), pues la inactivación del gen de la
hemaglutinina en el vector MVA facilita el proceso de fusión
célula-célula (38), lo que aumenta la presentación
antigénica después de una inoculación por vía intramuscular o
intradérmica. Además, en dicha realización se ha elegido como
promotor que regula la expresión de la secuencia el promotor
sintético temprano/tardío pE/L (early/late) (39), en lugar
del promotor p7.5 que se utiliza en los vectores descritos en las
citadas solicitudes, lo que asegura la síntesis continuada del
antígeno durante el proceso de infección y da lugar a altos niveles
de producción del mismo, facilitándose la generación de una
respuesta inmune contra dicho antígeno. También a diferencia de la
anterior invención, la infección con MVA produce una menor
destrucción celular que la infección con la cepa salvaje WR,
aumentando la presentación antigénica. Con todo ello se ha
conseguido un vector que da lugar a una mayor estimulación
inmunológica, una buena protección frente a la leishmaniasis con
respecto a los vectores conocidos en el estado de la técnica
utilizados frente a dicha enfermedad. Es más, a diferencia de otros
vectores basados en MVA conocidos en la técnica que se han intentado
utilizar para la vacunación de seres humanos frente a otras
enfermedades, el vector de la invención ha demostrado ser estable y
mantener el inserto que contiene tras someterlo a sucesivos pases.
Estas características y los resultados de respuesta inmune y
protección frente a Leishmania obtenidos en las pruebas
realizadas en el modelo murino demuestran que se ha conseguido un
vector adecuado para ser considerado para la vacunación de seres
humanos frente a Leishmania, en especial si se administra en
la dosis de refuerzo de un protocolo de vacunación en el que se
administra, en la primera dosis de desencadenamiento de la respuesta
inmune un vector recombinante diferente, a partir del cual puede
expresarse el mismo antígeno, como puede ser un ADN desnudo.
La invención proporciona un vector recombinante
derivado del virus MVA que lleva inserta una secuencia codificante
de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma,
secuencia que se encuentra bajo el control de un promotor que
permite su expresión durante el proceso de infección del virus
MVA.
En la realización descrita de la invención, la
secuencia codificante de LACK se encuentra insertada, en el vector
derivado de MVA, en el locus de hemaglutinina, de forma que
se inactiva dicho gen. Sin embargo, están incluidos también dentro
del alcance de la invención los vectores recombinantes derivados
del virus MVA en los que la secuencia codificante de LACK o de un
fragmento inmunogénico de la misma está insertada en otros sitios
de inserción del vector, como puede ser el locus de timidina
quinasa.
En la realización descrita de la invención, la
expresión de la secuencia codificante de LACK está regulada por el
promotor sintético pE/L, que permite la expresión tanto a tiempos
tempranos, como tardíos, de la infección del virus MVA, aunque
podría utilizarse cualquier otro promotor de poxvirus.
La secuencia codificante de LACK presente en el
vector recombinante de la invención puede codificar la proteína
completa o un fragmento inmunogénico de la misma. Con el término
"fragmento inmunogénico" se hace referencia a un fragmento de
la proteína que comprende, al menos, un 20% o, preferentemente, al
menos un 50% de la secuencia de aminoácidos de la proteína y que es
capaz de desencadenar una respuesta inmune contra la misma. En la
realización concreta de la invención cuya construcción se describe
con detalle, la secuencia codificante presente en el vector
recombinante de la invención codifica la proteína LACK completa de
Leishmania infantum, cuya clonación y caracterización ha
sido descrita por González-Aseguinolaza et
al. (7). El gen de LACK fue cedido por el coordinador de dicho
grupo, el Dr. Vicente Larraga del Centro de Investigaciones
Biológicas de Madrid.
La invención se refiere también a composiciones
que comprenden al menos un vector recombinante de la invención y,
opcionalmente, al menos un adyuvante o vehículo farmacéuticamente
aceptable. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables
que pueden utilizarse para formar parte de una composición que
comprende al menos un vector recombinante de la invención son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia,
que se elegirán de acuerdo con la vía de administración que se
pretenda utilizar de forma que se obtenga una composición adecuada
para ser suministrada por dicha vía. En realizaciones particulares
de la invención, la vía de administración se elige entre la vía
intraperitoneal, la vía intradérmica o la vía intramuscular,
prefiriéndose especialmente la vía intramuscular. En esos casos, se
tiene preferencia por las composiciones en forma de solución o de
suspensión acuosa, por lo que la composición contendría un
diluyente farmacéuticamente aceptable tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS) o cualquier otro
diluyente farmacéuticamente aceptable.
El vector de la invención es un vector seguro y
estable, que da lugar a una potente respuesta inmune celular contra
el antígeno LACK y que, como se muestra posteriormente en los
Ejemplos, es capaz de inducir protección en el modelo murino frente
a leishmaniasis. Es por ello que otro aspecto de la invención lo
constituye el uso del vector de la invención para la fabricación de
un medicamento destinado a proteger de la leishmaniasis a un
mamífero susceptible de desarrollarla. Cuando se realizan ensayos
en los que se evalúa la protección generada frente a Leishmania
infantum, la utilización del vector de la invención en
protocolos de inmunización en los que se administra en la primera
dosis un ADN desnudo recombinante que expresa también la proteína
LACK, formando parte el vector de la invención de la segunda dosis
de refuerzo, da lugar a una protección similar a la que se observa
cuando el virus que se utiliza en la dosis de refuerzo es un virus
recombinante que expresa también la proteína LACK, derivado de la
estirpe Western Reserve de Vaccinia, mientras que en los ensayos en
los que se evalúa la protección generada frente a Leishmania
major el vector de la invención da lugar a una protección
superior en general a la generada por los virus recombinantes
derivados de la estirpe Western Reserve y en particular superior al
virus recombinante ya conocido en el que la secuencia codificante
de LACK se encuentra inserta en el locus de TK. Es por ello 1 que el
medicamento puede estar destinado a la protección frente a la
leishmaniasis visceral o frente a la leishmaniasis cutánea. La
seguridad del vector de la invención y los resultados de protección
observados en el modelo murino, que se considera predictivo de las
respuestas que pueden observarse al realizar pruebas en primates no
humanos, hacen del vector de la invención un buen candidato para
ser utilizado en seres humanos para la protección frente a la
leishmaniasis, aunque es también una opción para ser administrado
en combinación con o reemplazando a virus recombinantes derivados de
la estirpe Western Reserve de Vaccinia que expresan también la
proteína LACK, cuyo uso ha sido propuesto para la protección de
otros animales como los perros.
Un aspecto adicional de la invención lo
constituyen los métodos de vacunación en los que se administra el
vector de la invención. Aunque la administración de una única dosis
del vector de la invención permite observar una respuesta inmune
celular, se tiene preferencia por los métodos en los que se
administra más de una dosis, espaciadas en el tiempo. El hecho de
que el virus de la invención, derivado de MVA, induzca una baja
respuesta frente a los antígenos propios de Vaccinia en comparación
con virus recombinantes como los derivados de la estirpe Western
Reserve, hace posible su utilización tanto en la primera dosis de
iniciación de la respuesta inmune como en dosis posteriores de
refuerzo. Se prefieren, sin embargo, los métodos de vacunación
heterólogos en los que el virus de la invención se administra en la
segunda y/o en dosis posteriores de refuerzo, mientras que en la
primera dosis se administra otro vector recombinante diferente que,
preferentemente, constituye también un sistema de expresión de la
proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma. Se
prefieren especialmente aquellos métodos de vacunación en los que el
vector recombinante que se administra en la primera dosis es un ADN
desnudo capaz de expresar la proteína LACK de Leishmania
infantum, que han demostrado dar lugar a una buena protección
en los ejemplos que se describen posteriormente. Una realización
particular especialmente preferida de estos métodos de vacunación de
la invención es aquella en la que el vector de ADN recombinante
utilizado es el plásmido al que se ha aludido en la memoria como
DNA-LACK (pCI-neo_LACK), cuya
combinación con el vector de la invención ha dado lugar a buenos
resultados de protección frente a Leishmania major y frente
a Leishmania infantum, aunque es posible la utilización de
otros diversos plásmidos como, por ejemplo, pMOK.
La invención se describirá ahora con más detalle
a partir de las Figuras y Ejemplos que se describen a
continuación.
La Figura 1 muestra un esquema de la
construcción del vector pHLZ_LACK (parte inferior de la figura) a
partir de los plásmidos pHLZ (parte superior izquierda) y pUC_LACK
(parte superior derecha).
La Figura 2 muestra, en su parte superior, un
esquema del virus MVA-LACK y la localización de las
zonas con las que se aparean los oligonucleótidos utilizados como
cebadores en las PCR de análisis de los locus HA y TK (para
identificación de los oligonucleótidos, ver Tabla 1). En la parte
inferior se muestran fotografías de los geles obtenidos al realizar
dicho análisis por PCR; la parte izquierda corresponde al análisis
del locus HA y la parte derecha al análisis del locus
TK. En ambos las calles corresponden a las siguientes muestras: +:
pHLZ LACK; 1: VV_LACK HA-; 2: MVA-LACK; 3:VV_LACK
TK; WR: estirpe Western Reserve.
La Figura 3 muestra las fotografías obtenidas
tras la inmunotinción de placas generadas por infección de células
CEF con el stock P4 de MVA-LACK, utilizando un
anticuerpo policlonal anti-LACK (fotografía de la
izquierda) o anti-WR (fotografía de la derecha).
La Figura 4 muestra el patrón de bandas obtenido
al hacer reaccionar con un anticuerpo policlonal
anti-LACK membranas de nitrocelulosa a las que
habían transferido las bandas resultantes de fraccionar en un gel
SDS-PAGE extractos celulares recogidos a los
tiempos post-infección indicados sobre cada una de
las calles. M: muestra en la que se había simulado la infección
tomada tras 48 horas. LACK-HIS: muestra de control
positivo obtenida a partir de una cepa de E. coli que expresa
una proteína LACK que lleva una cola de histidina.
La Figura 5 muestra el número de células
secretoras de IFN-\gamma detectados mediante
ELISPOT por cada 10^{6} esplenocitos de ratones Balb/c estimulados
con los vectores indicados en abscisas, que son: VVp36: VV_LACK
HA-; MVAp36: MVA-LACK; VVLuc: vector derivado de la
cepa WR que contiene el gen de la luciferasa. P: primera dosis; B:
dosis de refuerzo. La parte A corresponde a las células secretoras
de IFN-\gamma específicas para la proteína LACK y
la parte B a las células secretoras específicas para antígenos
virales.
La Figura 6 muestra la concentración de
IFN-\gamma, en ng/ml, detectada en el
sobrenadante del cultivo de esplenocitos aislados de ratones
inoculados con los vectores indicados en abscisas y reestimulados
con la proteína LACK (primera barra, que aparece sombreada) o con
un péptido inmunoestimulante de clase II (segunda barra, que aparece
rellena en negro). Las denominaciones de los vectores corresponden
a: VVp36: VV_LACK HA^{-}; MVAp36: MVA-LACK;
VVLuc: vector derivado de la cepa WR que contiene el gen de la
luciferasa. P: primera dosis; B: dosis de refuerzo.
La Figura 7 muestra los valores de densidad
óptica, medidos a 450 nm, obtenidos al realizar la detección de
anticuerpos específicos para LACK en sueros de ratones Balb/c
diluidos 1/10, recogidos 8 días después de la segunda dosis de un
protocolos de inmunización con dos dosis de inmunización, cada una
de las cuales incluía los vectores que se indican en abscisas,
indicando P el vector inoculado en la primera dosis y B el
inoculado en la dosis de refuerzo. Las denominaciones de los
vectores corresponden a: VVp36: VV_LACK HA^{-}; MVAp36:
MVA-LACK; VVLuc: vector derivado de la cepa WR que
contiene el gen de la luciferaza. La primera barra de cada protocolo
de vacunación, marcada con líneas inclinadas, corresponde a los
anticuerpos del isotipo IgG1; la segunda barra, rellena en negro, a
los anticuerpos del isotipo IgG2a.
La Figura 8 muestra la estructura del plásmido
pCI-neo-LACK
(DNA-LACK).
La Figura 9 muestra el número de células
secretoras de IFN-\gamma detectados mediante
ELISPOT por cada 10^{6} esplenocitos de ratones Balb/c estimulados
con los vectores indicados en abscisas. P: primera dosis; B: dosis
de refuerzo. La parte A corresponde a las células secretoras de
IFN-\gamma específicas para la proteína LACK y la
parte B a las células secretoras específicas para antígenos
virales.
La Figura 10 muestra el patrón de citoquinas
secretado tras la reestimulación con la proteína LACK (gráficos de
la parte superior) o con un péptido inmunodominante de clase II
(gráficos de la parte inferior) de esplenocitos aislados de ratones
Balb/c inmunizados con combinaciones de vectores recombinantes, en
las que el primer vector citado se administró en la primera dosis y
el segundo vector en la segunda dosis. Las combinaciones son:
DNA-CONTROL/VVLUC-HA- (primera
barra), DNA-LACK/MVA-LACK (segunda
barra), DNA-LACK/VV_LACK-HA-
(tercera barra) y
DNA-LACKIVV_LACK-TK- (cuarta barra).
Los gráficos situados a la izquierda muestra la concentración de
IL-4 detectada en cada uno de los casos, mientras
que los de la parte derecha corresponden a la concentración de
IFN-\gamma.
La Figura 11 corresponde a la evaluación de la
protección frente a un desafío de L. major a ratones Balb/c
inmunizados con distintos protocolos de vacunación. La parte A
superior muestra un gráfico en el que, en ordenadas, se indica el
tamaño de la lesión, expresada en milímetros, detectada
transcurridas las semanas que se indican en abscisas tras el
desafío con promastigotes de L. major a ratones Balb/c
inmunizados con DNA-LACK (100 microgramos) en la
primera dosis y, en la segunda dosis con 1 x 10^{7} ufp/ratón de:
(\ding{117}): VV_LACK TK-; (\blacksquare): VV_LACK HA-;
(\blacktriangle): MVA-LACK. Los puntos marcados
con el símbolo (\medbullet) corresponden a datos de ratones a los
que se les administró un ADN de control en la primera dosis y VV
Luc HA- en la segunda. En la parte B se muestra el logaritmo en
base 10 de la carga parasitaria correspondiente al mismo
experimento, detectada en los ganglios poplíteos de los ratones
Balb/c. De izquierda a derecha, la barra 1, corresponde a la mezcla
de bazos de 8 ratones inmunizados con
DNA-LACK/VV-LACK TK-; barra 3,
mezcla de bazos de 8 ratones inmunizados con
DNA-LACKIVV-LACK HA-; barras 3 a 10,
cada barra representa un bazo de un ratón inmunizado con
DNA-LACK/MVA-LACK HA-; barra 11,
mezcla de bazos de 7 ratones inmunizados con
DNA-control (plásmido vacío)/VV Luc HA-.
La Figura 12 muestra, en la parte A, un gráfico
en el que, en ordenadas, se indica el tamaño de la lesión,
expresada en milímetros, detectada transcurridas las semanas que se
indican en abscisas tras el desafío con promastigotes de L.
major a ratones Balb/c inmunizados con: pMOK en la primera y en
la segunda dosis (datos indicados con un círculo, \medbullet;
MIDGE-NLS en la primera dosis y VV_Luc en la segunda
dosis (datos indicados con el símbolo 102 );
pMOCK-LACK en la primera dosis y
MVA-LACK en la segunda dosis (datos indicados con
el símbolo \times). En la parte B de la Figura se indica la carga
parasitaria, expresada en número de parásito/mg, detectada en los
mismos animales; la barra uno corresponde a la inmunización con
pMOCK-LACK y MVA-LACK, la barra 2 a
la inmunización con MIDGE-NLS y
VV-Luc y la barra 3 a la inmunización con pMOK en
la primera y en la segunda dosis.
La Figura 13 muestra un gráfico en el que se
indican, en ordenadas, el número de células secretores de
IL-2, específicas para la proteína LACK, detectadas
por cada 10^{6} esplenocitos de ratones Balb/c inmunizados con:
DNA-LACK en la primera dosis y 1 x 10^{7}
ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis (primera
barra); DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 10^{7}
ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis (segunda
barra); DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 10^{7}
ufp/ratón de VV_LACK en la segunda dosis (tercera barra); DNA
Control en la primera dosis y 5 x 10^{7} ufp/ratón de
VV-Luc en la segunda (cuarta barra); PBS tanto en
la primera como en la segunda dosis (quinta barra).
La Figura 14 muestra un gráfico en el que, en
ordenadas, se indica el tamaño de la lesión, expresada en
milímetros, detectada transcurridas las semanas que se indican en
abscisas tras el desafío con promastigotes (5 x 10^{4}) de L.
major a ratones Balb/c inmunizados con DNA-LACK
en la primera dosis y, en la segunda dosis con: (\ding{117}): 1 x
10^{7} ufp/ratón de MVA-LACK; (\blacksquare): 5
x 10^{7} ufp/ratón de MVA-LACK;
100 5 x 10^{7} ufp/ratón de VV_LACK; (\times): 5
x 10^{7} ufp/ratón de VV-Luc. Los puntos marcados
con el símbolo 101 corresponden a datos de ratones a
los que se les administró PBS tanto en la primera como en la
segunda dosis.
La Figura 15 muestra fotografiar tomadas de
ratones sometidos a distintos protocolos de inmunización,
trascurridas 8 semanas del desafío con Leishmania major. Los
signos "+" indican las patas en las que se inocularon los
promastigotes (5 x 10^{4}), mientras que los signos "-"
corresponden a las patas que sirven como control, donde no se
inocularon promastigotes. Las inmunizaciones se realizaron con:
Panel A: DNA-LACK en la primera dosis y 1 x 10^{7}
ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; panel B:
DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 10^{7}
ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; panel C:
DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 10^{7}
ufp/ratón de VV_LACK en la segunda dosis; panel D: ADN de control
en la primera dosis y 5 x 10^{7} ufp/ratón de
VV-Luc en la segunda dosis; Panel E: PBS tanto en la
primera como en la segunda dosis (grupo N: naive).
La Figura 16 muestra gráficos que representan la
carga de parásitos detectada en distintos órganos de ratones
Balb/c, inmunizados con distintos tratamientos, detectadas un mes
después de un desafío intradérmico de 10^{7} promastigotes
metacíclicos con L. infantum. Gráfico A: carga detectada en
bazo; gráfico B: carga detectada en hígado; gráfico C: carga
detectada en nódulo linfático drenante. En cada uno de ellos, las
barras corresponden a los siguientes protocolos de vacunación:
primera barra (sombreada), DNA-LACK en primera
dosis y 10^{7} ufp/ratón de VV_LACK en la segunda dosis; segunda
barra (con retícula), DNA-LACK en la primera dosis y
5x10^{7} ufp/ratón de VV_LACK en la segunda dosis; tercera barra
(con líneas inclinadas), DNA-LACK en la primera
dosis y 10^{7} ufp/ratón de MVA_LACK en la segunda dosis; cuarta
barra, DNA-LACK en la primera dosis y 5x 10^{7}
ufp/ratón de MVA_LACK en la segunda dosis; quinta barra (rellena en
negro), plásmido pCI-neo en la primera dosis y
5x10^{7} ufp/ratón VV_Luc en la segunda dosis; última barra (con
líneas verticales), PBS en ambas dosis. Los asteriscos sobre las
barras indican la existencia de diferencias significativas
estadísticamente entre los datos: ***: p<0,001; **: p<0,01; *:
p<0,05.
La Figura 17 muestra gráficos que corresponden a
la respuesta inmune detectada a partir de esplenocitos de ratones
Balb/c sometidos a distintos tratamientos de inmunización, a los
que no se les había inoculado L. infantum. El gráfico A
corresponde a los niveles de IFN-\gamma, en
ng/ml, detectados en el sobrenadante de cultivos de esplenocitos
reestimulados con la proteína LACK. El gráfico B corresponde al
número de células productoras de IFN-\gamma
específicas para LACK, detectadas mediante ELISPOT, presentes por
cada 10^{6} esplenocitos. El gráfico C corresponde a los niveles
de TNF\alpha/LT, en ng/ml, detectados en el sobrenadante de
cultivos de esplenocitos reestimulados con la proteína LACK. El
gráfico D corresponde a los niveles de IL-10, en
ng/ml, detectados igualmente en el sobrenadante de cultivos de
esplenocitos reestimulados con la proteína LACK. En cada uno de los
gráficos, las barras corresponden a los siguientes protocolos de
vacunación: primera barra, DNA-LACK en primera dosis
y 10^{7} ufp/ratón de I VV_LACK en la segunda dosis; segunda
barra, DNA-LACK en la primera dosis y 5x10^{7}
ufp/ratón de VV_LACK en la segunda dosis; tercera barra,
DNA-LACK en la primera dosis y 10^{7} ufp/ratón
de MVA_LACK en la segunda dosis; cuarta barra,
DNA-LACK en la primera dosis y 5x10^{7} ufp/ratón
de MVA_LACK en la segunda dosis; quinta barra, plásmido
pCI-neo en la primera dosis y VV_Luc en la segunda
dosis; última barra, PBS en ambas dosis.
Para la construcción de un virus MVA
recombinante que contiene una secuencia codificante de la proteína
LACK de L. infantum, fue necesario un paso intermedio de
construcción de un plásmido, pHLZ LACK, que permitió la inserción de
la secuencia codificante de la proteína LACK en el locus HA del
genoma de MVA. Este plásmido contiene las regiones flanqueantes
derecha e izquierda del gen de la hemaglutinina (HA), y el gen de
resistencia a ampicilina. Entre las dos regiones flanqueantes del
gen HA se encuentran dos promotores de Vaccinia en orientación
opuesta: el promotor viral p7.5 que dirige la expresión del gen de
\beta-gal, y el promotor sintético temprano/tardío
(pE/L), que dirige la expresión del gen de la proteína LACK de
L. infantum. Para su construcción se utilizaron otros dos
plásmidos:
- pUC LACK: plásmido derivado del vector
pUC 19 que contiene el gen codificante de la proteína LACK de L.
infantum en el sitio de corte EcoRI, además de los elementos
necesarios para la replicación y selección en E. coli. Este
vector fue generado por la Dra. Gloria
González-Aseguinolaza a partir de un molde de ADN
genómico de L. infantum mediante PCR. El producto de PCR
tiene una longitud de 942 pares de bases (pb) y la región
codificante 312 aminoácidos (7).
- pHLZ: (7400 pb). Plásmido generado en
el laboratorio de los inventores que permite la inserción de
genes en el genoma de Vaccinia por recombinación homóloga en la
región codificadora de la HA. Tras la adición del sustrato de la
\beta-galactosidasa, X-gal, el
desarrollo de placas azules permite la selección de virus
recombinantes.
A partir de estos dos plásmidos se generó el
vector pHLZ-LACK de la siguiente manera:
Un fragmento de ADN de 942 pb que contiene la
secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum se
purificó a partir del plásmido pUC LACK. Para ello, el vector pUC
LACK se digirió con la enzima de restricción EcoRI, y el
fragmento correspondiente al gen LACK se purificó en geles de
agarosa. Los extremos de dicho fragmento se hicieron romos por
tratamiento con Klenow y se clonó en el plásmido de
inserción en Vaccinia pHLZ (previamente digerido con Sma I, y
defosforilado mediante la incubación con Fosfatasa Alcalina (CIP)),
generándose de este modo el vector de inserción pHLZ_LACK (8342 pb)
La selección de plásmidos recombinantes se realizó mediante
análisis de la actividad \beta-gal.
La construcción de este vector de inserción
pHLZ-LACK aparece esquematizada en la Figura 1.
Células primarias procedentes de embriones de
pollo (CEF: chicken embryo fibroblast) obtenidas de huevos SPF de
11 días de edad (INTERVET), fueron infectadas con MVA
(concretamente con MVA-F6, pase 586, proporcionado
por Gerd Sutter) a una multiplicidad de infección de 0,05
ufp/célula. Tras una hora de adsorción, se transfectaron las
células con 5 \mug de ADN del plásmido pHLZ-LACK
utilizando lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (INVITROGEN). 72 horas post-infección
las células se recogieron en 1 ml de medio, se realizaron tres
rondas de congelación/descongelación, se sonicó y se utilizó para
la selección de virus recombinantes.
Los virus recombinantes que contenían el gen
LACK de L. infantum y el gen \beta-gal
fueron seleccionados mediante pases de purificación consecutivos en
células CEF y tinción con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactosidasa
(300 \mug/ml). Tras 6 rondas de purificación se obtuvo el virus
recombinante purificado, sin contaminación de virus MVA salvaje. El
recombinante, llamado 3.111.2.1.1.2 (MVA pase 592) fue utilizado
para preparar un segundo stock, P2, con título 3 x 10^{7} ufp/ml.
El stock P3 se preparó a partir de células CEF infectadas a una
multiplicidad 0,05 ufp/célula y se purificó por dos colchones de
sacarosa al 36%. El título de este stock es 0,975x 10^{9} ufp/ml.
La secuenciación del inserto presente en su genoma dio lugar a la
secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:6.
Para confirmar la homogeneidad y la integridad
de los genes incluidos en el virus recombinante
MVA-LACK se llevó a cabo un análisis por PCR. El ADN
viral fue purificado a partir de células CEF infectadas con el
virus MVA LACK (stock P2) a una multiplicidad de infección de 5
ufp/célula. Tras comprobar la integridad del ADN mediante análisis
en gel de agarosa, se llevaron a cabo análisis de PCR para los
locus de hemaglutinina y timidina quinasa, utilizando como
cebadores los oligonucleótidos que se indican en la Tabla 1, cuya
localización respecto a los locus de hemaglutinina y timidina
quinasa se muestra en la parte superior de la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar el análisis, con fines
comparativos, se utilizó como control negativo el ADN extraído de
células CEF infectadas con la estirpe salvaje de Western Reserve
(WR) y como control positivo el plásmido pHLZ-LACK.
Se incluyó también en el análisis el virus recombinante VV_LACK
HA^{-}, que fue preparado de forma análoga al
MVA-LACK y que contiene la misma secuencia
codificante de LACK insertada igualmente en el locus HA
aunque, ha diferencia del MVA-LACK, se utilizó para
su construcción la estirpe Western Reserve, competente para
replicación, de Vaccinia. A lo largo de la presente memoria,
siempre que se habla del virus VV-LACK se hará
referencia a este virus recombinante, denominándole
VV-LACK HA^{-} en aquellos casos en los que se le
quiera distinguir del virus VV-LACK TK^{-} en el
que la secuencia de LACK está insertada en el locus de
timidina quinasa.
Las fotografías de los geles obtenidos se
muestran en la parte inferior de la Figura 2. En la parte
izquierda de la misma, que corresponde a la PCR de análisis del
locus de hemaglutinina se observa que tanto el
MVA-LACK (calle 2) como el virus recombinante
VV_LACK HA^{-}, dan lugar a bandas que se localizan a la altura
de la control positivo pHLZ-LACK, lo que es
compatible con la presencia del inserto completo integrado en el
sitio HA. En la parte de la derecha, correspondiente a las PCR de
análisis del locus TK, se comprueba que tanto
MVA-LACK (calle 2) como VV_LACK HA^{-} (calle 1)
dan lugar a bandas de tamaños idénticos a las generadas a partir
del ADN extraído de células infectadas con la estirpe salvaje WR,
mientras que el vector VV_LACK TK^{-} (calle 3), que contiene la
misma secuencia pero insertada en el locus TK, da lugar a una
banda mucho mayor.
Para verificar que MVA LACK puede ser
amplificado sin la pérdida de la expresión del gen exógeno, se
llevó a cabo un test de estabilidad. El virus recombinante fue
amplificado desde el stock P2 al P4 en células CEF a una
multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula. Las placas generadas
con el stock P4 fueron analizadas por inmunomarcaje con un
anticuerpo policlonal anti-WR y
anti-LACK. Los resultados, mostrados en la Figura
3, muestran que el 100% de las placas reconocidas por el anticuerpo
anti-WR son también positivas para LACK. El gen
LACK, por tanto, se mantiene de forma estable en el virus
recombinante MVA-LACK.
Para evaluar la expresión de la proteína LACK en
el tiempo, monocapas de células BHK-21 se
infectaron con 5 ufp/célula de MVA-LACK. Los
extractos celulares se recogieron a diferentes tiempos
post-infección, se fraccionaron en geles
SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con un anticuerpo policlonal
anti-LACK (generado en el laboratorio de los
inventores inmunizando conejos con la proteína LACK purificada)-
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4. En ella puede
apreciarse que se detecta altos niveles del antígeno LACK a partir
de las 4 horas después de la infección, acumulándose su producción
con el tiempo hasta las 48 horas.
Para evaluar la respuesta inmune inducida por
MVA-LACK en comparación con la inducida por
VV_LACK, se inmunizaron ratones hembra de la especie susceptible
Balb/C (n=4) con una (1 x 10^{7} ufp/ratón) o dos (5 x 10^{7}
ufp/ratón) dosis de VV_LACK HA^{-}, MVA-LACK o VV
Luc como control. 8 días después de la segunda inmunización, los
animales fueron sacrificados y los bazos fueron procesados mediante
la técnica de ELISPOT. Se realizaron dos ensayos utilizando la
técnica de ELISPOT, (que se ha descrito previamente (33), para
evaluar el número de células secretoras de
IFN-\gamma: en el primero, mostrado en la parte A
de la Figura 5, se detectó el número de células secretoras de
IFN-\gamma específicas para LACK; en el segundo,
mostrado en la parte B de la Figura 5, se detectó el número de
células CD8+ secretoras de IFN-\gamma específicas
para los antígenos virales de los propios vectores MVA y VV.
Adicionalmente se realizó un ensayo en el que
los esplenocitos aislados de los animales inoculados fueron
cultivados y reestimulados con la proteína LACK, detectándose a
continuación mediante ELISA la cantidad de
IFN-\gamma secretada por los esplenocitos
presente en los sobrenadantes de los cultivos. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 6.
Los resultados del ELISPOT muestran que el
número de células CD8+ secretoras de IFN-\gamma
específicas para LACK es 3,15 veces menor en los animales inoculados
con MVA-LACK en comparación con los que recibieron
VV_LACK cuando recibieron una única dosis. En consonancia con ello,
la cantidad de IFN-\gamma secretada por los
esplenocitos reestimulados con la proteína fue 5 veces menor. Sin
embargo, el número de células CD8+ secretoras de
IFN-\gamma específicas para los antígenos virales
fue aproximadamente 5 veces mayor en los animales inoculados con
VV_LACK. El hecho de que la respuesta inmune inducida frente al
vector en el caso de MVA permite un efecto de refuerzo (booster)
después de una segunda dosis de inmunización. Dos dosis de VV_LACK
disminuyen dramáticamente el número de células CD8+ secretoras de
IFN-\gamma; sin embargo, cuando los animales
recibieron en la primera dosis MVA-LACK y
MVA-LACK o VV_LACK en la segunda dosis de refuerzo,
tanto el uno como el otro vector recombinante fueron capaces de
amplificar la respuesta inmune. Aunque el número de células CD8+
secretoras de IFN-\gamma fue similar en ambos
casos, la cantidad de IFN-\gamma secretado y
medido por ELISA fue 70 veces mayor cuando la dosis de refuerzo se
realizó con MVA-LACK, y 86 veces mayor que cuando
se recibió una única dosis de MVA-LACK.
A continuación se evaluó el patrón de
anticuerpos generado tras la inmunización. Diferentes isotipos de
IgGs se consideran indicadores de la respuesta frente a L.
infantum. IgG2a está asociado con condiciones asintomáticas
mientras que el isotipo IgG1 se relaciona con enfermedad. 8 días
después de la segunda inmunización se recogió el suero de los
animales y se evaluó la presencia de anticuerpos específicos para
LACK y sus isotipos. En la Figura 7 se muestran los resultados
obtenidos en una dilución 1/10 de los sueros. En ellos puede
apreciarse que los niveles más altos de IgG2a (asociado a una
respuesta de tipo Th1) se encontraron tras dos dosis con
MVA-LACK.
Tomados en conjunto, los resultados obtenidos
demuestran que dos dosis de MVA-LACK inducen una
fuerte respuesta de tipo Th1 frente al antígeno LACK.
Se evaluó también la respuesta inmune generada
por el virus recombinante MVA-LACK en un protocolo
de inmunización heterólogo basado en una primera dosis de
inmunización con un vector recombinante de ADN desnudo que permite
la expresión de la proteína LACK en células de mamífero y una
segunda dosis con virus recombinantes derivados de Vaccinia. Para
ello, se utilizó en las primeras inmunizaciones del plásmido
pCI-neo_LACK, al que en adelante se hará referencia
como DNA-LACK, que es un vector de expresión en
células de mamífero que, al igual que el MVA-LACK,
expresa la proteína LACK de L. infantum. Este plásmido fue
generado por inserción del gen LACK en el sitio SmaI de
pCI-neo, y difiere del patentado por el Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) como vector
ADN-LACK en el sitio de inserción de LACK, pues el
vector del CSIC fue clonado en el sitio EcoRI/XbaI de
pCI-neo. Contiene el promotor de citomegalovirus y
los genes de resistencia a ampicilina y neomicina, dispuestos según
se muestra en la Figura 8.
Hembras de ratones Balb/c de 6-8
semanas de edad fueron inoculadas por vía intradérmica con el
vector plasmídico de ADN, DNA-LACK. 15 días después
se realizó una segunda inoculación con 1 x 10^{7} ufp/ratón por
vía intraperitoneal de MVA-LACK (stock P3). Como
controles se inocularon VV_LACK TK- (previamente utilizado y
generado en el laboratorio) y que ha demostrado conferir cierto
grado de protección cuando se usa a una dosis de 5 x 10^{7}
ufp/ratón (9), VV_LACK HA- y VV Luc. Tres semanas después de la
última inmunización los animales fueron sacrificados y los bazos
fueron procesados mediante la técnica de ELISPOT. Se realizó un
ELISPOT para evaluar tanto el número de células secretoras de
IFN-\gamma específicas para la proteína LACK como
el de las específicas para antígenos de Vaccinia.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 9. En la parte A de la misma puede apreciarse que el grupo
inmunizado con MVA-LACK en la segunda dosis (tercera
barra de cada uno de los gráficos) demostró desarrollar una
respuesta inmune celular frente a LACK mayor que los virus basados
en la estirpe salvaje WR. La parte B de la figura muestra que la
respuesta anti-viral fue mucho menor en ese mismo
grupo inmunizado con MVA-LACK, como era de esperar
al tratarse de un vector atenuado.
Al ser el balance de la respuesta inmune entre
los tipos Th1 (relacionado con protección) y Th2 (asociado a
susceptibilidad) critico para el control de la leishmaniasis, se
evaluó el tipo de respuesta celular inducida tras la inmunización
descrita más arriba. Para ello, los esplenocitos aislados de los
ratones inmunizados fueron reestimulados con la proteína LACK
(parte superior de la Figura 10) o con un péptido inmunodominante de
clase II de la misma (parte inferior de la Figura 10). Tras 72
horas de restimulación, los sobrenadantes se recogieron y se
determinó la presencia de citoquinas de tipo Th1
(IFN-\gamma) o Th2 (IL-4) en los
mismos mediante ELISA. Los gráficos de la Figura 10 muestran que
los esplenocitos de los ratones inmunizados con
DNA-LACK en la primera dosis y
MVA-LACK en la segunda produjeron más
IFN-\gamma e IL-4 que los demás
grupos. A pesar de los niveles más altos de IL-4,
el balance Th1/Th2, medido indirectamente como la cantidad de
IFN-\gamma/IL-4, fue mayor en el
grupo que recibió MVA-LACK en la segunda dosis
(IFN-\gamma/IL-4 = 1641 en el caso
de la reestimulación con la proteína LACK e
IFN-\gamma/IL-4 = 1163 en el caso
del péptido de clase II), indicando un desarrollo de una respuesta
inmune de tipo Th1.
El siguiente paso fue determinar qué población
de células T (CD4+ o CD8+) estaba implicada en la secreción de
citoquinas de tipo Th1 (IFN-\gamma y
TNF-\alpha). Con este propósito se inmunizaron
animales con regímenes de inmunización análogos a los utilizados
para obtener los resultados representados en la Figura 8, es decir,
una primera dosis de iniciación de la respuesta con
DNA-LACK y una segunda dosis de refuerzo de la
respuesta con MVA-LACK (dosis de 1 x10^{7} ufp o
de 5 x 10^{7} ufp) o VV_LACK-HA^{-} (dosis de 1
x10^{7} ufp o de 5 x 10^{7} ufp), mientras que los animales
utilizados como controles recibieron ADN-CONTROL
(el vector plasmídico pCI-neo, sin secuencia de
LACK) en la primera dosis de iniciación de la respuesta y
VV_LUC-HA- en la segunda dosis, de refuerzo de la
respuesta. 14 días después de la administración de la dosis de
refuerzo, se recogieron los bazos y los esplenocitos fueron
reestimulados con proteína LACK o con RPMI como control. Durante
las últimas 5 horas de reestimulación se añadió nuevo estímulo
junto con Brefeldina A. Posteriormente se llevó a cabo una tinción
de citoquinas intracelulares y se realizó un análisis por citometría
de flujo. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de la Tabla 2 demuestran que la
respuesta inmune celular es debida principalmente a la población
CD8+. Como conclusión, la inmunización basada en DNA
LACKIMVA-LACK confiere mayores porcentajes de
células específicas CD4+ y CD8+ secretoras de
IFN-\gamma y TNF-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo establecido que la inmunización con
MVA-LACK es una potente 5 inductora de una respuesta
inmune celular y estando ésta relacionada con protección frente a
la leishmaniasis, se realizó a continuación un ensayo de protección
frente a Leishmania major, utilizando un régimen de
inmunización heterólogo basado en
DNA-LACK/MVA-LACK. Hembras de
ratones Balb/c 6-8 semanas de edad fueron inoculadas
por vía intradérmica con 100 \mug del vector plasmídico de ADN
que expresa la proteína LACK DNA-LACK o con un ADN
vacío (sin inserto) como control. 15 días después se realizó una
segunda inoculación con 1 x l0^{7} ufp/ratón por vía
intraperitoneal de MVA-LACK, VVLACK TK-, VV_LACK HA-
o VV Luc. Tres semanas después de la última inmunización los
animales fueron desafiados con 5 x 10^{4} promastigotes de L.
major por vía subcutánea en la almohadilla plantar. Como
parámetros de protección se consideraron el desarrollo de lesión en
el lugar de inoculación y la carga parasitaria en el ganglio que
drena la almohadilla plantar (ganglio poplíteo) medida 7 semanas
después del desafío.
Los resultados obtenidos al representar la
evolución del tamaño de la lesión con el tiempo se muestran en la
parte superior de la Figura 11. En ella puede observarse que el
grupo inmunizado con
DNA-LACK/MVA-LACK presentó una
reducción del 20% comparado con los grupos inmunizados con
DNA-LACK y uno de los vectores
VV_LACK.
VV_LACK.
Para confirmar que la reducción en el tamaño de
la lesión se correlaciona con protección, y no únicamente con
inflamación, se midió la carga parasitaria en los ganglios
poplíteos, obteniéndose los resultados que se representan en la
parte inferior de la Figura 11. Los ratones que recibieron
DNA-LACK/MVA-LACK presentaron una
reducción en la carga parasitaria mayor (hasta 1000 veces) que los
grupos inmunizados con DNA-LACK/VV_LACK.
Se realizó otro experimento para evaluar
protección frente a L. major. Los animales fueron
inmunizados con un vector de ADN que expresa la proteína LACK
distinto de DNA-LACK, pMOK-LACK, y
como controles el vector minimalístico MIDGE (minimalistic,
immunologically defined gene expresión: expresión minimalística
de genes inmunológicamente definida) MIDGE-NLS
(MOLGEN®) o el vector vacío sin inserto pMOK. 15 días después, el
grupo al que se había inoculado pMOK recibió una segunda dosis con
pMOK, el grupo que había recibido el MIDGE-NLS
recibió VV-LUC en la segunda dosis de refuerzo de
la respuesta y el grupo que había recibido pMOK-LAK
recibió MVA-LACK. Tres semanas después de la
administración de la dosis de refuerzo los animales fueron
desafiados con 5 x 10^{4} promastigotes de L. major por vía
subcutánea en la almohadilla plantar. Como parámetros de protección
se consideraron el desarrollo de lesión en el lugar de inoculación y
la carga parasitaria en el ganglio que drena la almohadilla plantar
(ganglio poplíteo) medida 7 semanas después del desafío.
Los resultados obtenidos al representar la
evolución del tamaño de la lesión con el tiempo se muestran en la
parte A de la Figura 12. Los correspondientes a la carga de
parásitos detectada en los ganglios poplíteos de cada uno de los
grupos, expresada como número de parásitos detectados por
miligramo, en la parte B de dicha Figura.
Como se aprecia en dichas figuras, el grupo
inmunizado con pMOK-LACK/MVA LACK resultó estar
protegido frente a leishmaniasis producida por L. major, ya
que los ratones que lo integraban no desarrollaron apenas lesión.
Esta medida se correlaciona con una disminución en la carga
parasitaria: presentan 4 veces menos parásitos que los grupos
controles.
Tras haber demostrado que la inmunización con
MVA-LACK es una potente inductora de una respuesta
inmune celular y que ésta se correlaciona con protección frente a
la infección por Leishmania major, se llevó a cabo un
experimento adicional para determinar la dosis viral óptima de
MVA-LACK en un protocolo de inmunización
heterólogo: una primera dosis de inmunización (priming)
basada en ADN y una segunda dosis de refuerzo de la inmunización
(booster) con virus recombinantes derivados de Vaccinia.
Como modelo animal se utilizaron de nuevo
ratones BALB/c, al tratarse de una cepa altamente susceptible a la
infección por Leishmania. Hembras de nueve semanas de edad
fueron inoculadas por vía intradérmica con 100 \mug del vector
plasmídico de ADN que expresa la proteína DNA-LACK
(pCINeo-DNA_LACK) o ADN Control. Quince días
después recibieron la segunda dosis de inmunización, por vía
intraperitoneal, con 1 x 10^{7} ufp/ratón o 5 x 10^{7}
ufp/ratón de MVA-LACK, 5 x 10^{7} ufp/ratón de
VV-LACK o 5 x 10^{7} ufp/ratón de VV_LUC, siendo
suministrado este último al grupo que había recibido el ADN
Control. Se incluyó un grupo control que recibió PBS tanto en la
primera como en la segunda dosis de inmunización, al que se denominó
N ("naive", denominación habitual en Biología Molecular
para designar a lo que no ha tenido contacto con algo. Los grupos
de inmunización están representados en la Tabla 3.
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Tres semanas después de la última inmunización
los animales fueron desafiados con 5 x 10^{4} promastigotes de
L. major por vía subcutánea en la almohadilla plantar. Para
asegurar la infectividad de los promastigotes, estos fueron aislados
utilizando aglutinina de cacahuete
(\beta-D-galactosa-(1\rightarrow3)-N-acetil-D-galactosamina,
PNA). La PNA aglutina específicamente los promastigotes no
infectivos, mientras que no aglutina a los promastigotes
metacíclicos, que es la forma infectiva de Leishmania. Estos
promastigotes infectivos se recogieron en el sobrenadante después de
una centrifugación diferencial y fueron utilizados como dosis
infectiva.
Cinco días después del desafío se sacrificaron 3
animales de cada grupo para evaluar cómo era la respuesta inmune
temprana frente a la infección por L. major en los animales
inmunizados. Se realizó un ensayo de ELISPOT para evaluar el número
de células secretoras de IL-2 por cada 10^{6}
esplenocitos específicos para la proteína LACK. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 13. En ella se aprecia que el
único grupo que presentó cantidades significativas de
IL-2 fue el grupo inmunizado con DNA_LACK y 1 x
10^{7} ufp de MVA_LACK.
Como parámetro de protección se evaluó el
desarrollo de lesión en el lugar de inoculación, obteniéndose el
gráfico de evolución del tamaño de la lesión con respecto a las
semanas transcurridas desde el desafío que se muestra en la Figura
14. Adicionalmente, se obtuvieron fotografías del estado de la
lesión en la semana 8 posterior al desafío de ratones inmunizados
siguiendo cada uno de los distintos protocolos indicados.
Como se aprecia en el gráfico de la Figura 13,
los grupos inmunizados con 1 x 10^{7} ufp de
MVA-LACK en la dosis de refuerzo no desarrollan
lesión. De los ratones inmunizados con 5 x 10^{7} ufp de
MVA-LACK, un ratón de cinco desarrolló una pequeña
lesión en el lugar de inoculación a partir de la semana 7 posterior
al desafío. Desde la cuarta semana posterior al desafío la lesión
presentada es significativamente diferente en los grupos
inmunizados con vectores recombinantes derivados de Vaccinina con
respecto a los grupos control. El grupo inmunizado con 5 x 10^{7}
ufp de VV_LACK, presenta cierto grado de lesión, aunque ésta es
significativamente diferente al grupo control a partir de la semana
8 posterior al desafío. La lesión en los grupos control sigue
aumentando exponencialmente mientras que en el grupo inmunizado con
DNA-LACK/VV_LACK la lesión comienza a
estabilizarse.
Los porcentajes de reducción en el tamaño de la
lesión están representados en la Tabla 4.
En las fotografías de la Figura 15 se demuestra
que, claramente, aquellos ratones inmunizados con
MVA-LACK demostraron un alto grado de protección
frente a leishmaniasis cutánea, mayor que los inmunizados con el
vector VV-LACK. En la figura se observa el grado de
lesión en la pata derecha, marcada con un signo "+" encima de
la cada una de las fotografías por haber sido donde se inocularon
los promastigotes, mientras que la pata izquierda, marcada con un
signo "-", sirve como control, sin inocular promastigotes.
Como se observa en las fotografías de la Figura
15, los animales inmunizados con DNA-LACK en la
primera dosis, de inicio de la respuesta, y 1 x 10^{7} ufp de
MVA-LACK en la dosis de refuerzo de la respuesta, no
presentan lesión 8 semanas después del desafío (panel A). Cuando se
utilizaron 5 x 10^{7} ufp de MVA-LACK en la dosis
de refuerzo, solamente uno de los cinco ratones empezó a
desarrollar lesión en la semana séptima después el desafío (panel B
izquierda). En el grupo que recibió VV_LACK en el booster el grado
de protección fue menor y se observaron lesiones en el 75% de los
animales, aunque significativamente menores que en los grupos
controles (panel C). Los grupos control presentaban lesión en el
lugar de inoculación (paneles D y E).
Los animales de los grupos control fueron
sacrificados por razones éticas 9 semanas después del desafío. En
el mismo tiempo se sacrificaron los animales del grupo inmunizado
con DNA LACK y VV_LACK. Los animales de los grupos que recibieron
MVA-LACK permanecen sin lesión durante al menos 11
semanas, y están bajo observación para analizar si la protección se
mantiene en el tiempo.
Se procedió también a ensayar si la potente
inducción de respuesta inmune celular provocada por
MVA-LACK cuando se administra en la segunda dosis de
refuerzo de la inmunización, tras haber sido los sujetos
inmunizados en la primera dosis con un vector de ADN que expresa
igualmente el antígeno LACK, se correlacionaba también con la
generación de protección frente a Leishmania infantum, que
causa mayoritariamente leishmaniasis visceral, utilizando de nuevo
un régimen de inmunización heterólogo basado en
DNA-LACK/MVA-LACK. Dado que estudios
previos sobre la vacunación frente a la leishmaniasis han
demostrado que el modelo murino puede ser predictivos de los
resultados que se obtienen en los ensayos de vacunación realizados
con modelos de primates no humanos (40, 41, 42), se utilizó el
modelo murino intradérmico para ensayar el potencial de los
regímenes de vacunación heterólogos con vectores de ADN y virus
recombinantes derivados de Vaccinia.
Ratones Balb/c de 4 a 6 semanas de edad fueron
inoculadas por vía intradérmica con 100 \mug del vector
plasmídico de ADN que expresa la proteína LACK
DNA-LACK (pCINeo-DNA_LACK) o ADN
Control. Quince días después recibieron la segunda dosis de
inmunización, por vía intraperitoneal, con 1 x 10^{7} ufp/ratón o
5 x 10^{7} ufp/ratón de MVA-LACK o del virus
recombiante derivado de la estirpe salvaje Western Reserve que
lleva insertado igualmente el antígeno LACK en el locus de
hemaglutinina (VV_LACK), suministrándose 5 x 10^{7} ufp/ratón de
VV_Luc al grupo que había recibido el ADN Control. Se incluyó un
grupo control que recibió PBS tanto en la primera como en la
segunda dosis de inmunización.
Tres semanas y media después de la
administración de la dosis de refuerzo, los ratones fueron
infectados por vía intradérmica en el pabellón auditivo utilizando
10^{7} promastigotes metacíclicos de L. infantum tal como
se ha descrito previamente (43). Un mes después de la infección, se
evaluaron las cargas parasitarias mediante el análisis por dilución
limitante en los grupos de ratones inmunizados y de control,
evaluaciones que se realizaron en el bazo, el hígado y el nódulo
linfático drenante. Los resultados obtenidos, que se muestran en la
Figura 16, en la que se representan los valores medios obtenidos a
partir de al menos 4 ratones por grupo, demuestran que los ratones
que fueron inmunizados siguiendo un régimen de vacunación con una
primera dosis de iniciación de la respuesta y una segunda dosis de
refuerzo utilizando vectores capaces de expresar el antígeno LACK
resultaron protegidos de forma significativa frente a la infección.
El nivel de protección en cada tejido era comparable entre los
diversos grupos de ratones que habían recibido vectores capaces de
expresar el antígeno y no diferían estadísticamente entre los
ratones que recibieron VV-LACK o
MVA-LACK. Sin embargo, sí se observaron variaciones
en el nivel de protección entre los distintos órganos, observándose
los niveles de protección más elevados en el nódulo linfático
drenante (parte C de la Figura 16). El nivel de protección en este
órgano oscilaba entre un factor de reducción de 144 a 244 veces en
las cargas parasitarias en comparación con los ratones control. En
el bazo (parte A de la Figura 15) y en el hígado (parte B de la
Figura 16) se observaron niveles de protección más bajos, que
oscilaban entre factores de reducción de 6 a 9 veces en las cargas
parasitarias en el hígado y de 9 a 30 veces en el bazo. En el bazo
se observó también un pequeño efecto protector en el caso de los
ratones que recibieron el ADN control y el virus VV_Luc, que puede
ser debido a la baja respuesta de IFN-\gamma
observada en estos animales, tal como se muestra posteriormente.
Aún así, las diferencias entre las cargas parasitarias observadas en
los ratones inmunizados con VV_Luc y los que recibieron
VV-LACK o MVA-LACK fueron
significativos (p<0,02-0,05), lo que demuestra un
efecto específico del antígeno LACK.
Dado que el IFN-\gamma y la
relación TNF-\alpha/LT parecen estar implicados en
la resistencia a la infección en la leishmaniasis visceral murina
(27,29,30,46), mientras que la IL-10 parece estar
asociada a la susceptibilidad (26,33), se extrajeron bazos de
ratones inmunizados y no inmunizados tanto antes de proceder al
desafío con L. infantum como un mes después de haber
realizado éste. Con ellos se procedió tanto a realizar un ensayo de
ELISPOT para evaluar el número de células secretoras de
IFN-\gamma específicas para LACK presentes por
cada 10^{6} esplenocitos, como a realizar ensayos de niveles de
citoquinas producidas presentes en los sobrenadantes de cultivos de
dichos esplenocitos aislados de ratones reestimulados con la
proteína LACK durante su cultivo. Los resultados obtenidos con los
esplenocitos extraídos antes de proceder al desafío se muestran en
la Figura 17. La parte A, correspondiente a la concentración de
IFN-\gamma, en ng/ml, detectada en los
sobrenadantes de los cultivos de esplenocitos reestimulados,
muestra que los ratones que recibieron 10^{7} ufp de VV_LACK o
5x10^{7} ufp de MVA-LACK parecen producir niveles
algo más elevado de IFN-\gamma
(100-113 ng/ml), comparados con los ratones que
recibieron en la dosis de refuerzo 5x 10^{7} ufp de VV_LACK o
10^{7} ufp de MVA-LACK (55-67
ng/ml). La evaluación de las células productoras de
IFN-\gamma específicas para LACK realizado
mediante el ELISPOT, que aparece representado en la parte B de la
Figura 17, indica que el número de células secretoras de
IFN-\gamma se correlaciona con los niveles de
IFN-\gamma detectados por ELISA, oscilando la
frecuencia de células productoras de IFN-\gamma
entre 380 y 640 células/10^{6} esplenocitos. Además, se
observaron niveles significativos de TNF\alpha/LT (58 y 134
pg/ml) en los ratones que habían recibido VV_LACK, mientras que los
niveles de TNF\alpha/LT producidos en respuesta al antígeno LACK
por los ratones que habían recibido MVA-LACK eran
más bajos (27 pg/ml y 8 pg/ml, respectivamente). Estas diferencias
en la inducción de TNF\alpha pueden reflejar, en parte, la
diferente capacidad del WR y el MVA para inducir respuestas
inflamatorias y activación de NF-\kappaB, lo que
da como resultado perfiles de citoquinas diferentes: MVA potencia
la activación de NF-\kappaB mientras que WR
parece inhibirlo. Las cantidades de IL-10 producidas
por los esplenocitos aislados antes del desafío, representadas en
la parte D de la Figura 17, también variaban según el protocolo de
inmunización utilizado, oscilando entre 0,1 ng/ml en los ratones
que habían recibido 5x10^{7} ufp de VV_LACK en la dosis de
refuerzo y 0,7 ng/ml en los que habían recibido 10^{7} ufp de
VV-LACK o MVA_LACK.
Las respuestas de citoquinas detectadas en
esplenocitos aislados un mes después de ser sometidos ratones a un
desafío con L. infantum mostraban variaciones entre las
muestras paralelas a las encontradas antes del desafío, aunque eran
algo superiores. También se produjeron niveles significativos de
IL-10 y TNF\alpha/LT. Las concentraciones de
IFN-\gamma detectadas por ELISA en los
sobrenadantes de los esplenocitos sometidos a reestimulación, la
relación IFN-\gamma/IL-10 y los
factores de reducción en la carga de parásitos en los tejidos
analizados, evaluado todo ello un mes después del desafío con L.
infantum, se representan a continuación en la Tabla 5, donde se
puede observar que tanto el nivel de IFN-\gamma
como la relación IFN-\gamma/IL-10
parecen correlacionarse con la protección encontrada.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se examinó la inducción de
NO/nítrico un mes después del desafío, pues se ha demostrado que el
óxido nítrico es critico para la actividad leishmanicida de los
macrófagos murinos (44,45,46). Se observó que en los ratones que
habían recibido vectores capaces de expresar LACK se detectaban
cantidades significativas de este agente antimicrobiano, que
oscilaban entre 6 y 7 \muM, mientras que en los grupos control
los niveles de NO/nitrito eran mucho más reducido, oscilando entre
0,5 \muM y 1 \muM. Por tanto, los ratones vacunados, en
consonancia con los niveles de IFN-\gamma
detectados, presentan niveles más elevados de inducción de
producción de óxido nítrico y mayor actividad potencial
leishmanicida. Estos resultados son consistentes con la protección
hallada en los ratones vacunados con DNA-LACK y
VV_LACK o MVA-LACK.
Por tanto, los ensayos descritos en este ejemplo
demuestran que la administración de virus recombinantes derivados
de Vaccinia capaces de expresar el antígeno LACK como parte de
protocolos de inmunización en los que se suministran en la segunda
dosis de refuerzo, mientras que la primera dosis se suministra un
vector de ADN que expresa el mismo antígeno, es altamente
inmunogénica y confiere protección frente a la infección de L.
infantum en ratones, mientras que el efecto protector no se
consigue con vacunaciones con vectores de ADN en las dos dosis. El
vector derivado de la estirpe altamente atenuada MVA y el derivado
de la estirpe virulenta de Vaccinia competente para replicación
Western Reserve dieron lugar a niveles comparables de protección.
Sin embargo, el hecho de que la estirpe altamente atenuada MVA
garantiza mayor seguridad para su uso en seres humanos convierte a
este vector en un buen candidato para ser utilizado para la
protección de seres humanos frente a la leishmaniasis visceral.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Ahmed, S. B., C. Bahloul, C.
Robbana, S. Askri, and K. Dellagi. 2004.
A comparative evaluation of different DNA vaccine candidates
against experimental murine leishmaniasis due to L. major.
Vaccine 22:1631-9.
2. Altenburger, W., C. P. Suter,
and J. Altenburger. 1989. Partial deletion of the
human host range gene in the attenuated vaccinia virus MVA. Arch
Virol 105:15-27.
3. Berrahal, F., C. Mary, M.
Roze, A. Berenger, K. Escoffier, D.
Lamouroux, and S. Dunan. 1996. Canine
leishmaniasis: identification of asymptomatic carriers by
polymerase chain reaction and immunoblotting. Am J Trop Med
Hyg 55:273-7.
4. Blanchard, T. J., A. Alcami, P.
Andrea, and G. L. Smith. 1998. Modified
vaccinia virus Ankara undergoes limited replication in human cells
and lacks several immunomodulatory proteins: implications for use
as a human vaccine. J Gen Virol 79 (Pt
5):1159-67.
5. Caver, T. E., T. D. Lockey, R.
V. Srinivas, R. G. Webster, and J. L. Hurwitz.
1999. A novel vaccine regimen utilizing DNA, vaccinia virus
and protein immunizations for HIV-1 envelope
presentation. Vaccine 17:1567-72.
6. Drexler, I., K. Heller, B.
Wahren, V. Erfle, and G. Sutter. 1998.
Highly attenuated modified vaccinia virus Ankara replicates in baby
hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but
not in various human transformed and primary cells. J Gen
Virol 79 (Pt 2):347-52.
7. González-Aseguinolaza,
G., S. Taladriz, A. Marquet, and V. Larraga.
1999. Molecular cloning, cell localization and binding
affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective
antigen from Leishmania infantum. Eur J Biochem
259:909-16.
8. Gonzalo, R. M., G. del Real, J.
R. Rodriguez, D. Rodriguez, R. Heljasvaara, P.
Lucas, V. Larraga, and M. Esteban. 2002.
A heterologous prime-boost regime using DNA and
recombinant vaccinia virus expressing the Leishmania infantum
P36/LACK antigen protects BALB/c mice from cutaneous leishmaniasis.
Vaccine 20:1226-
31.
31.
9. Gonzalo, R. M., J. R.
Rodriguez, D. Rodriguez, G.
González-Aseguinolaza, V. Larraga,
and M. Esteban. 2001. Protective immune response
against cutaneous leishmaniasis by prime/booster immunization
regimens with vaccinia virus recombinants expressing Leishmania
infantum p36/LACK and IL-12 in combination with
purified p36. Microbes Infect
3:701-11.
10. Gradoni, L. 2001. An update on
antileishmanial vaccine candidates and prospects for a canine
Leishmania vaccine. Vet Parasitol
100:87-103.
11. Gurunathan, S., D. L. Sacks,
D. R. Brown, S. L. Reiner, H. Charest, N.
Glaichenhaus, and R. A. Seder. 1997.
Vaccination with DNA encoding the immunodominant LACK parasite
antigen confers protective immunity to mice infected with
Leishmania major. J Exp Med
186:1137-47.
12. Hanke, T., T. J. Blanchard, J.
Schneider, C. M. Hannan, M. Becker, S. C.
Gilbert, A. V. Hill, G. L. Smith, and A.
McMichael. 1998. Enhancement of MHC class
I-restricted peptide-specific T cell
induction by a DNA prime/MVA boost vaccination regime.
Vaccine 16:439-45.
13. Hanke, T., and A. McMichael.
1999. Pre-clinical development of a
multi-CTL epitope-based DNA prime
MVA boost vaccine for AIDS. Immunol Lett
66:177-81.
14. Hanke, T., V. C. Neumann, T.
J. Blanchard, P. Sweeney, A. V. Hill, G. L.
Smith, and A. McMichael. 1999. Effective
induction of HIV-specific CTL by
multi-epitope using gene gun in a combined
vaccination regime. Vaccine
17:589-96.
15. Kent, S. J., A. Zhao, S. J.
Best, J. D. Chandler, D. B. Boyle, and I. A.
Ramshaw. 1998. Enhanced T-cell
immunogenicity and protective efficacy of a human immunodeficiency
virus type 1 vaccine regimen consisting of consecutive priming with
DNA and boosting with recombinant fowlpox virus. J Virol
72:10180-8.
16. Kim, J. J., M. L. Bagarazzi,
N. Trivedi, Y. Hu, K. Kazahaya, D. M.
Wilson, R. Ciccarelli, M. A. Chattergoon, K.
Dang, S. Mahalingam, A. A. Chalian, M. G.
Agadjanyan, J. D. Boyer, B. Wang, and D. B.
Weiner. 1997. Engineering of in vivo immune
responses to DNA immunization via codelivery of costimulatory
molecule genes. Nat Biotechnol
15:641-6.
17. Lanotte, G., J. A. Rioux, J.
Perieres, and Y. Vollhardt. 1979. [Ecology of
leishmaniasis in the south of France. 10. Developmental stages and
clinical characterization of canine leishmaniasis in relation to
epidemiology. (author's transl)]. Ann Parasitol Hum Comp
54:277-95.
18. Li, S., M. Rodrigues, D.
Rodriguez, J. R. Rodriguez, M. Esteban, P.
Palese, R. S. Nussenzweig, and F. Zavala.
1993. Priming with recombinant influenza virus followed by
administration of recombinant vaccinia virus induces CD8+
T-cell-mediated protective immunity
against malaria. Proc Natl Acad Sci USA
90:5214-8.
19. Liew, F. Y., and C. A.
O'Donnell. 1993. Immunology of leishmaniasis. Adv
Parasitol 32:161-259.
20. Lopez-Fuertes, L., E.
Perez-Jimenez, A. J.
Vila-Coro, F. Sack, S. Moreno,
S. A. Konig, C. Junghans, B. Wittig, M.
Timon, and M. Esteban. 2002. DNA vaccination
with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against
Leishmania major infection in mice. Vaccine
21:247-57.
21. Lopez-Velez, R., J.
A. Perez-Molina, A. Guerrero, F.
Baquero, J. Villarrubia, L. Escribano, C.
Bellas, F. Perez-Corral, and J.
Alvar. 1998. Clinicoepidemiologic characteristics,
prognostic factors, and survival analysis of patients coinfected
with human immunodeficiency virus and Leishmania in an area
of Madrid, Spain. Am J Trop Med Hyg
58:436-43.
22. Mauricio, I. L., J. R.
Stothard, and M. A. Miles. 2000. The strange
case of Leishmania chagasi. Parasitol Today
16:188-9.
23. Mayr, A., H. Stickl, H. K.
Muller, K. Danner, and H. Singer. 1978.
[The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure,
experience gained with the parenteral vaccination and behavior in
organisms with a debilitated defence mechanism (author's transl)].
Zentralbl Bakteriol [B]
167:375-90.
\newpage
24. McMahon-Pratt, D., D.
Rodriguez, J. R. Rodriguez, Y. Zhang, K.
Manson, C. Bergman, L. Rivas, J. F.
Rodriguez, K. L. Lohman, N. H. Ruddle, and
et al. 1993. Recombinant vaccinia viruses expressing
GP46/M-2 protect against Leishmania
infection. Infect Immun 61:3351-9.
25. Meyer, H., G. Sutter, and A.
Mayr. 1991. Mapping of deletions in the genome of the
highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on
virulence. J Gen Virol 72 (Pt
5):1031-8.
26. Paoletti, E. 1996.
Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc
Natl Acad Sci USA 93:11349-53.
27. Ramirez, J. C., M. M.
Gherardi, and M. Esteban. 2000. Biology of
attenuated modified vaccinia virus Ankara recombinant vector in
mice: virus fate and activation of B- and T-cell
immune responses in comparison with the Western Reserve strain and
advantages as a vaccine. J Virol
74:923-33.
28. Robinson, H. L., D. C.
Montefiori, R. P. Johnson, K. H. Manson, M. L.
Kalish, J. D. Lifson, T. A. Rizvi, S.
Lu, S. L. Hu, G. P. Mazzara, D. L.
Panicali, J. G. Herndon, R. Glickman, M. A.
Candido, S. L. Lydy, M. S. Wyand, and H. M.
McClure. 1999. Neutralizing
antibody-independent containment of
immunodeficiency virus challenges by DNA priming and recombinant pox
virus booster immunizations. Nat Med
5:526-34.
29. Sacks, D., and N.
Noben-Trauth. 2002. The immunology of
susceptibility and resistance to Leishmania major in mice.
Nat Rev Immunol 2:845-58.
30. Sedegah, M., T. R. Jones, M.
Kaur, R. Hedstrom, P. Hobart, J. A.
Tine, and S. L. Hoffman. 1998. Boosting with
recombinant vaccinia increases immunogenicity and protective
efficacy of malaria DNA vaccine. Proc Natl Acad Sci USA
95:7648-53.
31. Solano-Gallego, L.,
J. Llull, G. Ramos, C. Riera, M. Arboix,
J. Alberola, and L. Ferrer. 2000. The Ibizian
hound presents a predominantly cellular immune response against
natural Leishmania infection. Vet Parasitol
90:37-45.
32. Sutter, G., and B. Moss.
1992. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses
recombinant genes. Proc Natl Acad Sci USA
89:10847-51.
33. Tapia, E., E.
Perez-Jimenez, L.
Lopez-Fuertes, R. Gonzalo, M. M.
Gherardi, and M. Esteban. 2003. The
combination of DNA vectors expressing IL-12 +
IL-18 elicits high protective immune response
against cutaneous leishmaniasis after priming with
DNA-p36/LACK and the cytokines, followed by a
booster with a vaccinia virus recombinant expressing p36/LACK.
Microbes Infect 5:73-84.
34. Xu, D., and F. Y. Liew.
1994. Genetic vaccination against leishmaniasis.
Vaccine 12:1534-6.
35. Zavala, F., M. Rodrigues, D.
Rodriguez, J. R. Rodriguez, R. S. Nussenzweig,
and M. Esteban. 2001. A striking property of
recombinant poxviruses: efficient inducers of in vivo
expansion of primed CD8(+) T cells. Virology
280:155-9.
36. Melby, P.C., J. Yang, W.
Zhao, L.E. Pérez y J. Cheng. 2001.
Leishmania donovani p36(LACK) DNA vaccine is highly
immunogenic but not protective against experimental visceral
leishmaniasis. Infect Immun 69:4719-
4725.
4725.
37. Moss, B. 1996. Genetically
engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination,
and safety. Proc. Natl. Acad. Sci USA
93:11341-11348.
38. Seki, M., M. Oie, Y.
Ichihashi, y H. Shida. 1990. Hemadsoption and
fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia
virus mutants. Virology 175,
372-384.
39. Chakrabarti, S, J.R. Sisler,
B. Moss. 1997. Compact, synthetic, vaccina virus
early/late promoter for protein expression. BioTechniques
23:1094-1097.
40. Belli, S., A. Formenton, T.
Noll, A. Ivens, R. Jacquet, C. Desponds,
D. Hofer, y N. Fasel. 1999. Leishmania
major: histone H1 gene expression from the sw3 locus.
Exp. Parasitol 91:151-160.
41. Campos-Neto, A., R.
Porozzi, K. Greeson, R.M. Coler, J.R.
Webb, Y.A. Seiky, S.G. Reed, y G.
Grimaldi, Jr. 2001. Protection against cutaneous
leishmaniasis induced by recombinant antigens in murine and
nonhuman primate models of the human disease. Infect. Immun.
69:4103-4108.
42. Masina, S., M.G.M., S.O.
Demotz, y N.J. Fasel. 2003. Protection against
cutaneous leishmaniasis in outbred brevet monkeys using a recombinat
histone H1 antigen. J. Infect. Dis.
188:1250-1257.
\newpage
43. Ahmed, S., M. Colmenares, L.
Soong, K. Goldsmith-Pestana, L.
Munstermann, R. Molina y D.
McMahon-Pratt. 2003. Intradermal
infection model for patogénesis and vaccine studies of murine
visceral leishmaniasis. Infect Immun
71:401-10.
44. Bhakuni, V., U.K. Singha, G.P.
Dutta, H.B. Levy, y R.K. Maheshawari.
1996. Killing of Leishmania donovani amastigotes by
poly ICLC in hamsters. J. Interferon Cytokine Res.
16:321-325.
45. Green, S.J., M.S. Meltzer,
J.B. Hibbs, Jr., y C.A. Nacy. 1990. Activated
macrophages destroy intracellular Leishmania major
amastigotes by and
L-arginine-dependent killing
mechanism. J. Immunol 144:278-283.
46. Liew, F., Y.S. Millot, C.
Parkinson, R.M. Palmer, y S. Moncada.
1990. Macropage killing of Leishmania parasite in
vivo is mediated by nitric oxide from
L-arginine. J. Immunol.
144:4791-4797.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL
VIRUS VACCINIA MODIFICADO DE ANKARA (MVA) COMO VACUNAS CONTRA LA
LEISHMANIASIS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-100291
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TK-L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TK-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HA-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HA-2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HA-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 939
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Inserto del
MVA-LACK
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LACK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm55
Claims (25)
1. Un vector recombinante derivado del virus
atenuado MVA que lleva inserta una secuencia codificante de la
proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma secuencia
que se encuentra bajo el control de un promotor que permite su
expresión durante el proceso de infección del virus MVA.
2. Un vector recombinante derivado del virus MVA
según la reivindicación 1, en el que la secuencia codificante de la
proteína LACK o del fragmente inmunogénico de la misma está
insertada en el locus de hemaglutinina, de forma que se
inactiva dicho gen.
3. Un vector recombinante derivado del virus MVA
según la reivindicación 2, en el que la secuencia codificante de la
proteína LACK o del fragmento inmunogénico de la misma está bajo el
control del promotor sintético pE/L.
4. Un vector recombinante derivado del virus MVA
según la reivindicación 3, en el que la secuencia codificante de la
proteína LACK o el fragmento inmunogénico de la misma se derivan de
la especie Leishmania infantum.
5. Un vector recombinante derivado del virus MVA
según la reivindicación 4, en el que la secuencia codificante de la
proteína LACK da lugar al expresarse a una forma de la proteína
LACK que contiene la totalidad de sus aminoácidos y se localiza en
el citoplasma celular.
6. Una composición que comprende un vector
recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y, opcionalmente, al menos un adyuvante o
vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la
fabricación de un medicamento destinado a ser administrado a un
mamífero susceptible de ser infectado por una especie del género
Leishmania, para la prevención o el tratamiento en dicho
mamífero de una enfermedad provocada por una especie del género
Leishmania.
8. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 7 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible
de ser infectado por una especie del género Leishmania, para
la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una
leishmaniasis visceral.
9. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 8 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible
de ser infectado por una especie del género Leishmania, para
la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una
leishmaniasis visceral provocada por Leishmania
infantum.
10. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 9 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado para la prevención o el
tratamiento de una leishmaniasis visceral provocada por
Leishmania infantum, en el que el mamífero susceptible de ser
infectado por dicha especie del género Leishmania al que
está destinado el medicamento es un ser humano.
11. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 7 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible
de ser infectado por una especie del género Leishmania, para
la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una
leishmaniasis cutánea.
12. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 11 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible
de ser infectado por una especie del género Leishmania, para
la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una
leishmaniasis cutánea provocada por Leishmania major.
13. Uso de un vector recombinante derivado del
virus MVA según la reivindicación 12 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser administrado para la prevención o el
tratamiento de una leishmaniasis visceral provocada por
Leishmania major, en el que el mamífero susceptible de ser
infectado por dicha especie del género Leishmania al que
está destinado el medicamento es un ser humano.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
7 a 13 en el que el medicamento está destinado a ser administrado
en una única dosis de vacunación.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
7 a 13 en el que el medicamento está destinado a ser administrado
en al menos una de las dosis de vacunación que constituyen un
protocolo de vacunación constituido por al menos dos dosis de
vacunación, cada una de las cuales se administra espaciadas en el
tiempo.
16. Uso según la reivindicación 15 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado tanto en la primera
dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune como en al
menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera.
17. Uso según la reivindicación 15 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado solamente en la
primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune,
estando ausente de las dosis de vacunación posteriores a la
primera.
18. Uso según la reivindicación 17 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado solamente en la
primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune,
conteniendo al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la
primera de las que está ausente el medicamento un vector
recombinante diferente que es también un sistema de expresión de la
proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.
19. Uso según la reivindicación 15 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de
las dosis de vacunación posteriores a la primera, estando ausente
de la primera dosis de vacunación.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de
las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la
primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un
vector recombinante diferente que es también un sistema de
expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la
misma.
21. Uso según la reivindicación 20 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de
las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la
primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un
ADN desnudo que es también un sistema de expresión de la proteína
LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.
22. Uso según la reivindicación 21 en el que el
medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de
las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la
primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento el
vector DNA-LACK.
23. Un procedimiento de obtención de un plásmido
para ser utilizado para la construcción de un vector recombinante
derivado del virus MVA según la reivindicación 5, que comprende las
etapas de:
- a)
- obtener un fragmento de ADN puro que contiene la secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum escindiéndolo del plásmido pUC LACK mediante digestión con la enzima de restricción EcoRI y purificándolo en geles de agarosa;
- b)
- convertir en romos los extremos del fragmento obtenido en la etapa anterior por tratamiento con Klenow;
- c)
- obtener un fragmento del plásmido de inserción en Vaccinia pHLZ que permita la unión al fragmento de ADN de extremos romos mediante la digestión con SmaI y la desfosforilación con fosfatasa alcalina (CIP);
- d)
- ligar el fragmento del plásmido pHLZ al fragmento de ADN puro de extremos romos que contiene la secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum;
- e)
- seleccionar los plásmidos recombinantes mediante análisis de la actividad \beta-gal, comprobando que las bacterias en las que estén presentes muestren actividad de la enzima \beta-galactosidasa, mientras que las bacterias en las que no se encuentre el plásmido sean negativas para dicha actividad.
24. Plásmido pHLZ-LACK
representado en la Figura 1, obtenible según el procedimiento de la
reivindicación 23, caracterizado por comprender un gen de
resistencia a ampicilina y las regiones flanqueantes derecha e
izquierda del gen de la hemaglutinina (HA) flanqueando una
secuencia en cuya parte más alejada de los extremos se encuentran,
en orientación opuesta, los promotores de Vaccinia p7.5, al que
está unido un gen de \beta-gal de forma que el
promotor p7.5 dirige su expresión, y el promotor sintético
temprano/tardío pE/L, al que está unida una secuencia codificante de
la proteína LACK de Leishmania infantum de forma que el
promotor dirige la expresión de dicha secuencia codificante para
dar lugar a la proteína LACK.
25. Uso del plásmido de la reivindicación 24 en
la construcción de vectores recombinantes derivados del virus MVA
que llevan inserta en el locus de hemaglutinina una
secuencia que codifica una forma de la proteína LACK que contiene
la totalidad de sus aminoácidos, secuencia que está bajo el control
del promotor sintético pE/L.
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| WO (1) | WO2007014977A1 (es) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988006182A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-25 | Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha | Bovine leukemia virus vaccine prepared by using recombinant vaccinia virus |
| WO1992022327A1 (en) * | 1991-06-17 | 1992-12-23 | The Regents Of The University Of California | Double recombinant vaccinia virus vaccines |
| US5212057A (en) * | 1988-10-26 | 1993-05-18 | University Of Florida | Biological system for constructing and testing viral vaccines |
| WO2000034494A1 (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| WO2002059291A2 (fr) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Transgene S.A. | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| ES2171360A1 (es) * | 2001-02-21 | 2002-09-01 | Consejo Superior Investigacion | Vacuna para la proteccion de animales frente a la leishmania. |
| WO2003047617A2 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Isis Innovation Limited | Vaccine |
| WO2004005523A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-15 | Imperial College Innovations Limited | Recombinant poxvirus not having a functional 3beta-hsd gene |
-
2005
- 2005-07-30 ES ES200501886A patent/ES2313807B1/es not_active Expired - Fee Related
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2006
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988006182A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-25 | Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha | Bovine leukemia virus vaccine prepared by using recombinant vaccinia virus |
| US5212057A (en) * | 1988-10-26 | 1993-05-18 | University Of Florida | Biological system for constructing and testing viral vaccines |
| WO1992022327A1 (en) * | 1991-06-17 | 1992-12-23 | The Regents Of The University Of California | Double recombinant vaccinia virus vaccines |
| WO2000034494A1 (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| WO2002059291A2 (fr) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Transgene S.A. | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| ES2171360A1 (es) * | 2001-02-21 | 2002-09-01 | Consejo Superior Investigacion | Vacuna para la proteccion de animales frente a la leishmania. |
| WO2003047617A2 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Isis Innovation Limited | Vaccine |
| WO2004005523A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-15 | Imperial College Innovations Limited | Recombinant poxvirus not having a functional 3beta-hsd gene |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VAZQUEZ et al., "Identification of functional domains in the 14- kilodalton envelope protein (A27L) of Vaccinia Virus" . Journal of Virology 1999 vol. 73, no 11, pp 9098-9109. * |
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