WO2002059291A2 - Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes - Google Patents

Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of gene therapy applied to specific or non-specific immunotherapy (or gene immunotherapy), more particularly in the context of the treatment of diseases in which the agent responsible is a pathogenic organism, such as in particular an agent bacterial, parasitic or viral, or in the treatment of cancer or prion diseases. More particularly, the invention relates to a biological material comprising at least (i) a nucleic acid coding for all or part of an antibody and (ii) a nucleic acid coding for all or part of a polypeptide involved in the stimulation of immune response and / or influencing cytotoxic effector cells and / or helper T lymphocytes.
  • the present invention also relates to a host cell and a composition comprising said biological material as well as their use for medical purposes, more particularly therapeutic or prophylactic.
  • gene therapy has been proposed to correct the disorders observed in the context of genetic diseases. These diseases are explained in particular by a dysfunction of the expression of specific genes or by the expression of nonfunctional mutated polypeptides in at least one cell type.
  • Gene therapy consists in transferring genetic information capable of correcting the observed defect to the patient to be treated. It may be, for example, the gene coding for the CFTR protein in the case of cystic fibrosis or the gene coding for dystrophin in the case of Duchenne muscular dystrophy.
  • genetic information is introduced either in vitro into a specific host cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism (ex vivo process), or directly in vivo in or at proximity to the appropriate tissue (eg affected organ).
  • Many publications describe the implementation of gene therapy protocols in order to obtain in host cells the expression of a protein of interest by introducing the corresponding genetic information.
  • the advantage of this type of approach is not limited to the treatment of purely genetic disorders and can also allow or contribute to the reduction or elimination of tumors, isolated tumor cells, pathogens, such as the bacterial, parasitic or viral agents, or cells infected with such pathogens. Otherwise, such treatment can delay the progression of the conditions indicated, or caused by the agents mentioned above.
  • the immune response directed against a specific antigen can be divided into two distinct categories: one involving antibodies (immune response of humoral type), the other cytotoxic effector cells such as for example macrophages, cytotoxic lymphocytes (CTL ) or killer cells ( ⁇ K and ⁇ KT) as well as helper T lymphocytes, in particular LTCD4 (cell type immune response).
  • cytotoxic effector cells such as for example macrophages, cytotoxic lymphocytes (CTL ) or killer cells ( ⁇ K and ⁇ KT) as well as helper T lymphocytes, in particular LTCD4 (cell type immune response).
  • the two types of response are distinguished in that the antibodies recognize the antigens in their three-dimensional form whereas the T lymphocytes, for example, recognize peptide portions of said antigens, associated with glycoproteins coded by the genes of the major complex d histocompatibility (MHC), in particular the genes of the major histocompatibility complex of type I which are expressed ubiquitously on the surface of cells or the genes of the major histocompatibility complex of type II which are expressed in specific manner on the surface cells involved in the presentation of antigens (APC).
  • MHC major complex d histocompatibility
  • APC antigens
  • the cellular type immune response is characterized in that CD4 + type T cells (“helpeo” T cells), following a well-known activation phenomenon (for a review see Alberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15, 125-154), produce cytokines which, in turn, induce the proliferation of APC cells capable of producing said cytokines; cell differentiation of B lymphocytes capable of producing specific antibodies; and stimulation of cytotoxic T lymphocytes (CTL).
  • helpeo T cells CD4 + type T cells
  • APC cells capable of producing said cytokines
  • B lymphocytes capable of producing specific antibodies
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • cytotoxic effector cells such as for example CD8 + lymphocytes (CTL) are activated a) after interaction with antigenic peptides fixed on and presented by the glycoproteins carried by ubiquitous cells and encoded by genes belonging to the MHC I system, and b) possibly by the cytokines produced by CD4 +.
  • CTLs thus activated are then capable of destroying the cells expressing said antigenic peptide.
  • Cytokines are molecules naturally produced following antigenic stimulation or an inflammatory reaction (Gillis and Williams, 1998, Curr. Opin. Immunol., 10, 501-503) whose usefulness in the context of treatment of certain cancers has been shown in particular by Oettger (1991, Curr. Opin. Immunol., 3, 699-705). Leroy et al. (1998, Res. Immunol., 149, 681-684) have described that the production of cytokines at the tumor site, after intra-tumor administration of recombinant viral vectors allows the induction of an immune response associated with inhibition of tumor growth.
  • Chemokines are a subclass of the cytokine family. They are distinguished from other cytokines by their chemo-attractive property, in particular during the natural processes of chemotaxis, and in particular of attraction of the cells of the immune system towards the tissues in which the inflammation or the infection are located, they are also distinguished by their anti-angiogenic properties. Chemokines are small proteins (70 to 80 amino acids) whose amino acid sequences have a low rate of homology (varying from 10 to 70% depending on the chemokines considered).
  • chemokines have been identified (see for example Zlotnik and Yoshie, 2000, Immunity 12, 121-127 which describes the classification of chemokines and their respective role in the immune mechanism).
  • Four families have been defined on the basis of the position of the cysteine residues which they contain.
  • the ⁇ families whose N-terminal end comprises 2 cysteines separated by a single amino acid (ie chemokines of the IL-8, NAP-2, GCP-2 type) and 3 whose N-terminal end comprises 2 adjacent cysteines (ie the chemokines of RANTES type, MIP-1, MCP1) are the best characterized (Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, 159-165; Murphy, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12 , 593-633).
  • T cells Na ⁇ ve CD4 + require 2 signals for the induction of an effective immune response: a first involving the specific recognition of MHC / peptide by the TCR / CD3 complex and the CD4 co-receptor, and a second called costimulation. Costimulation makes it possible to amplify and prolong the primary activation by the TCR, but also to inhibit the apoptosis of T cells after activation.
  • the TCR is made up of two functionally distinct units.
  • a heterodimer ( ⁇ or ⁇ ) specific for each lymphocyte is necessary for antigenic recognition.
  • the engagement of the TCR with its CD3 ligand initiates a cascade of intracellular signals which results in the adhesion, proliferation, differentiation into mature cells and the increase in the transcriptional activity of cytokine genes, cytokine receptors and proto-oncogenes.
  • Another therapeutic strategy has also been proposed combining the advantages of gene therapy and the use of specific antibodies.
  • the production by genetic engineering of antibodies, antibody fragments or derivatives of antibodies such as chimeric antibodies, in eukaryotic cells is now a standard technique (EP 0 120 694 or EP 0 125 023).
  • international patent application WO 00/24896 describes a method for the treatment or prevention of cancer, based on the expression on the surface of tumor cells of antibodies specific for the TCR / CD3 complex in order to induce stimulation of T cells and the anti-tumor immune response.
  • compositions allowing in particular the implementation of effective anti-tumor treatments, easy to set up and allowing a prolonged control of the tumor volume and an increase in the survival rate of the treated patients.
  • the depositor has now identified new compositions, the different constituents of which are chosen so as to obtain a synergistic effect from their activities. respective and improved properties of said constituents. More particularly, such compositions allow better recruitment of the various effectors of the anti-tumor immune response (T cells, NK, dendritics, macrophages, etc.) thus making it possible to inhibit or delay cell proliferation and to induce apoptosis (cell death) of target cells.
  • the present invention offers an advantageous and effective alternative to the approaches of the prior art, in particular for treating or preventing cancer of man or animal.
  • the present invention relates firstly to a biological material comprising at least a first and at least a second nucleic acid sequence, said nucleic acid sequences being placed under the control of the elements ensuring their expression in a host cell, according to which:
  • Said first nucleic acid sequence codes for all or part of an antibody, characterized in that when this said antibody or this said part of antibody is expressed, it is located on the surface of said host cell and in that said antibody or said part of antibody is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a T helper lymphocyte, said polypeptide being involved in the process of activation of such a cell,
  • Said second nucleic acid sequence codes for all or part of a polypeptide involved in the stimulation of the immune response and / or in the attraction to the expression site and in the activation of cytotoxic effector cells and / or of lymphocytes T helper.
  • said polypeptide is selected from chemokines and co-stimulation molecules.
  • nucleic acid sequence is intended to denote a fragment of DNA and / or RNA, double strand or single strand, linear or circular, natural isolated or synthetic, designating a precise sequence of nucleotides, modified or not. , making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid without limitation of size. According to a preferred embodiment, it is a nucleic acid chosen from the group consisting of a cDNA; genomic DNA; plasmid DNA; a messenger RNA.
  • said “first nucleic acid sequence” in particular codes all or part of a native antibody, or for a derivative of such an antibody, provided that said antibody, fragment or derivative of antibody is expressed at the surface of the host cell in which a said first nucleic acid sequence has been introduced and in that said antibody is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a T helper lymphocyte and involved in the process of activation of such a cell.
  • fragment of antibodies is intended to denote the fragments F (ab) 2 , Fab ', Fab, Fv, sFv (Blazar et al., 1997, J.
  • derivatives of antibodies is intended to denote, for example, a chimeric derivative of such an antibody (see for example the chimeras the anti CD3 Mouse / Man antibodies in Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657- 662 or immunotoxins such as sFv-toxin from Chaudary et al., 1989, Nature, 339, 394-397).
  • antibody expressed on the surface of the host cell is meant an antibody whose at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the host cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies used in the context of the present invention consist of fusion polypeptides comprising at least the amino acids defining said functional region and a peptide capable of conferring on the antibody a transmembrane localization in the host cell.
  • transmembrane localization refers to an anchoring within the double lipid membrane layer of the host cell or on the external surface of this bilayer. The nucleic acid sequences encoding many transmembrane peptides are described in the literature.
  • said transmembrane peptide is isolated or derived from a glycoprotein, a lipoprotein, or a membrane receptor.
  • the transmembrane peptide is isolated from a glycoprotein such as the glycoprotein F of the measles virus (European patent EP 0 305 229), CD4 (Weijtens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203), the gpl60 of the HIV virus (Polydefkis et al, 1990, J. Exp. Med., 171, 875-887), Fc (see below) and more particularly the glycoprotein of the rabies virus (French patent application FR 97 09152).
  • a glycoprotein such as the glycoprotein F of the measles virus (European patent EP 0 305 229), CD4 (Weijtens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203), the gpl60 of the HIV virus (Polydefkis et al, 1990, J. Exp
  • the first nucleic acid sequence contains a gene coding for the heavy chain of said antibody fused with the nucleic acid sequence coding for a transmembrane peptide as defined above.
  • the first nucleic acid sequence may contain a gene encoding the light chain of said antibody.
  • the expression of the heavy and light chains can be controlled by independent regulatory elements but it is also possible to have recourse to common elements (bicistronic cassette) and possibly, to reinitiate the translation of the second cistron (for example the sequences coding for the light chain) by means of an IRES (WO 98/49334).
  • the antibody expressed on the surface of host cells is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a T helper lymphocyte, in particular a CD4 T helper lymphocyte, and involved in the process for activating such a cell, and more particularly at a receptor directly involved in such a process.
  • this phenomenon of activation of cytotoxic effector cells or of helper T lymphocytes is a determining element of the cell-mediated immune reaction.
  • this antibody can also bind to the polypeptides present on cytotoxic effector cells or already activated helper lymphocytes.
  • cytotoxic effector cell is meant the macrophages, cytotoxic T lymphocytes (CTL) and killer cells (NK), as well as their derived cells such as for example LAK, (Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244-247; Brittende et al., 1996, Cancer, 77, 1226-1243; Poplack et al., 1976, Blood, 48, 809-816).
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • NK killer cells
  • helper T lymphocyte is intended to denote in particular the CD4 cells which, after activation, allow the secretion of activation factors of the effector cells of the immune response (see below).
  • polypeptides, and in particular the receptors, expressed on the surface of these cells and which are involved in the activation of such cells consist in particular all or part of the TCR complex, more particularly TCR- ⁇ , TCR- ⁇ or CD3, all or part of the complexes CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur. J.
  • cytokine receptors Finke et al., 1998, Gene Therapy, 5, 31- 39
  • IL-7 IL-4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 or GM-CSF
  • NK cells such as for example N ⁇ l4NKT (Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693), NKAR, Nkp46 (Pessino et al., 1998, J. Exp.
  • Nkp44 all or part of the receptors macrophages such as for example the Fc receptor (Deo et al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135).
  • the cytotoxic effector cells or the T helper lymphocytes so that they express on their surface a polypeptide, naturally not expressed by these cells, and capable of inducing the activation process of such cells, by the introduction into these cells of nucleic acid sequences containing the gene coding for such a polypeptide.
  • the present invention is then possible to select a nucleic acid sequence coding for all or part of an antibody capable of being expressed on the surface of the target cells of the patient to be treated, said antibody being capable of binding to such a polypeptide naturally not expressed by these cytotoxic effector cells or helper T lymphocytes. More particularly, the present invention is based on the possibility of cloning the genes coding for all or part of an antibody and of expressing said antibody in cells after transfer of said genes into said cells from conventional expression vectors (see below). -after).
  • the literature offers a large number of examples of genes coding for antibodies capable of reacting with such polypeptides or receptors. It is within the ability of those skilled in the art to obtain the nucleic acid sequences encoding such antibodies.
  • hybridomas can also be cited as being particularly suitable for isolating the first nucleic acid sequence as defined above:
  • - TR310 hybridoma (murine anti-N ⁇ 7 rat (IgG2b); ATCC HB-219; I. L. Weissman; murine myeloma / rat splenocyte fusion); - H57-597 hybridoma (anti-murine TCR ⁇ hamster (IgG); ATCC HB-218; Kubo et al., 1989, J. Immunology, 142, 2736-2742; murine myeloma / hamster splenocyte fusion);
  • nucleic acid sequences encoding the heavy and / or light chains of these different antibodies can be obtained by conventional methods in the art, in particular amplification (PCR, RT-PCR, ...), cloning using specific oligonucleotides or techniques using cAD ⁇ libraries (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual.
  • nucleic acid sequence coding for the heavy chain of the antibody is fused with the nucleic acid sequence coding for a transmembrane peptide such as the rabies glycoprotein.
  • the "second nucleic acid sequence” codes for all or part of a polypeptide involved in the stimulation of the immune response and / or in the attraction to the expression site and the activation cytotoxic effector cells and / or helper T cells.
  • said polypeptide is selected from chemokines and co-stimulation molecules.
  • stimulation of the immune response makes it possible to induce or activate an immune response directed specifically against a cell, in particular a tumor or a cell infected with a virus, or to inhibit growth and / or division. of such a cell.
  • Attraction to the expression site and activation of cytotoxic effector cells or helper T cells can be defined by the ability to increase the migration of immune cells to the expression site of a chemokine to develop or prolong a response immune.
  • the term “chemokine” can be defined as a cytokine with a chemoattractor effect (ability to attract immune cells to the expression site of said chemokine).
  • the chemokine in use in the context of the present invention has one or more complementary functions, in particular the activation of immune cells making it possible to stimulate the immune response and / or an anti-angiogenic function making it possible to inhibit vascularization within of a tumor.
  • the chemoattraction activity of a given polypeptide, in particular derived from the chemokine MIP, on cells involved in immune reactions can be evaluated by a test.
  • co-stimulation molecules refers to a molecule making it possible to amplify an immune response and / or to prolong the state of activation of an immune cell or involved in an immune response , in particular by stabilizing the TCR complex after recognition of the peptide linked to the MHC.
  • the co-stimulation activity can be evaluated by conventional techniques such as those described in the example part of the present application (for example by measuring the proliferation of naive splenocytes after incorporation of thymidine H as described in point 5 of the example 2).
  • nucleic acid sequence coding for the entirety of said polypeptide in question or only part of this polypeptide, or a derived or mutated polypeptide, insofar as the function and properties in terms of stimulation of the immune response, of attraction to the site of expression and / or activation of cytotoxic effector cells or of helper T lymphocytes are conserved.
  • mutation refers to the deletion and / or substitution and / or addition of one or more nucleotides or any combination of this type of mutation.
  • sequence coding for a hybrid polypeptide originating from the fusion of sequences of various origins for example coding for two different chemokines).
  • a preferred chemokine is a chemokine of the MIP-1 type, and more particularly selected from the group consisting of the chemokines MIP-la and MlP-l ⁇ , the properties of which have been demonstrated by Wolpe et al. (1988, J. Exp. Med. 167, 570-581).
  • MIP 1 ⁇ is produced by T lymphocytes and monocytes. It allows chemoattraction of eosinophils and T lymphocytes during respiratory tract infections; monocytes and neutrophils in rheumatoid arthritis, inflammation of the digestive system or meningitis of bacterial origin. In addition, it inhibits the proliferation of hematopoietic precursors.
  • MlPl ⁇ The nucleotide and amino acid sequences of MlPl ⁇ are described in Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894), the content of which is incorporated by reference in the present application.
  • MlP-l ⁇ whose nucleotide and amino acid sequences are described in Brown et al. (1989, J. Immunol. 142, 679-88, the content of which is incorporated by reference in the present application), is also produced by T lymphocytes and monocytes. It exerts its chemoattractive properties on monocytes and neutrophils in cases of bone arthritis and bacterial meningitis. Like MIP-la, it inhibits the proliferation of hematopoietic precursors.
  • MIP- la and MlP-l ⁇ There are natural variants of said proteins MIP- la and MlP-l ⁇ which are known to those skilled in the art and which bear, for example, the names GOS19, LD78, pAT464, TY5 (for mice) or SIS ⁇ (for mice) for MIP-la and pAT744, Act-2, G-26, H- 400 (mouse) or hSIS ⁇ (mouse) for MlP-l ⁇ .
  • the sequence corresponding to Act-2 will preferably be chosen (Lipes et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9704-9708, the content of which is incorporated herein by reference).
  • co-stimulation molecules which can be used in the context of the present invention, it is preferred to use those acting on the co-stimulation of T cells and, in particular B7-1 (GenBank XM002948) and B7-H1 (GenBank AF 177937) .
  • the costimulation of T cells decreases their apoptosis generated by the first activation signal (AICD; Activation-Induced Cell Death), by inducing the expression of anti-apoptotic factors such as Bcl-2, c-FLIP, Bcl-xL and by reducing the activity of the Fas apoptotic complex and procaspase-8. It also makes it possible to promote the differentiation of activated T cells into memory cells.
  • the present invention also relates to any other molecule allowing said co-stimulation of T cells.
  • the second nucleic acid sequence codes for a polypeptide secreted from the host cell.
  • the means for obtaining the secretion of a polypeptide from the host cell are known to those skilled in the art.
  • Many functional signal peptides in eukaryotic cells, and in particular mammals, are disclosed in the state of the art.
  • the biological material according to the present invention also comprises at least a third nucleic acid sequence coding for all or part of a polypeptide having cytotoxic activity.
  • polypeptide having cytotoxic activity means any polypeptide capable of inhibiting the growth and / or division of a host cell, in particular a tumor cell (the cytotoxic activity is then called anti-tumor activity) or infected (cytotoxic activity is then called antiviral, parasitic or bacterial activity depending on the infecting pathogen). According to a preferred case, the cytotoxic activity results in the death of said cell. According to a particular case, it would also be possible to use the biological material according to the present invention in pathological cases associated with cell proliferation, such as for example restenosis phenomena.
  • the cytotoxic activity of a given polypeptide in particular with regard to tumor cells, can be evaluated in vitro by measuring cell survival either by viability tests in the short term (such as for example the tryptan blue test or MTT), either by clonogenic survival tests (colony formation) (Brown and Wouters, 1999, Cancer Research 59, 1391-1399) or in vivo by measuring tumor growth (size and / or volume) in an appropriate animal model (Ovejera and Houchens, 1981, Semin. Oncol. 8, 386-393).
  • said polypeptide having cytotoxic activity is chosen from cytokines, proteins encoded by suicide genes and anti-angiogenic protein factors.
  • said polypeptide is a cytokine
  • it is preferably a cytokine chosen from interferons ⁇ , ⁇ and ⁇ , interleukins, and in particular IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, ⁇ IL-IO, IL-12, 1TL-15, 1TL-18 or riL-21, tumor necrosis factors (TNF) and colony stimulating factors (GM-CSF, C-CSF, M -CSF, .
  • said cytokine is selected from interleukin-2 (IL-2) and interleukin-12 (IL-12).
  • Interleukin-2 is in particular responsible for the proliferation of activated T lymphocytes, the multiplication and activation of cells of the immune system (for the nucleic acid sequence see in particular FR 85 09480).
  • Interleukin-12 has been identified and isolated in macrophages as a stimulating factor for cytotoxic and NK T cells, which induces the differentiation of CD4 + T lymphocytes by participating in the homeostasis of the Thl and Th2 populations.
  • Two cell types (NK and NKT cells) are involved in the anti-tumor activity mediated by 1TL-12, depending on the dose used or its injection scheme.
  • the polypeptide product of expression of a suicide gene exhibits at least one enzymatic activity selected from thymidine kinase activity, purine nucleoside phosphorylase activity, guanine or uracil activity or orotate phosphoribosyl transferase and the cytosine deaminase activity.
  • polypeptides are not toxic as such but have catalytic enzymatic properties capable of transforming an inactive substance (predrogue), for example a nucleoside or a nucleoside analog, into a substance which is highly toxic to the cell, for example a modified nucleoside which may be incorporated into the DNA or RNA chains in elongation, with the consequence, in particular, of the inhibition of cell division or of cellular dysfunctions leading to the death of the cell containing such polypeptides.
  • the genes coding for such polypeptides are called "suicide genes". Of Many suicide / predrole gene couples are currently available.
  • TK HSN-1 herpes simplex virus type 1
  • GCN Pacyclovir or ganciclovir
  • FCY1 genes of Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) and codA of E.
  • CDase is used in combination with the enzyme uracilephosphoribosyl transferase (UPRTase) which has the property of converting the 5-FU produced by the action of CDase into highly toxic 5-FUMP.
  • UPRTase uracilephosphoribosyl transferase
  • the upp and FUR1 genes coding for UPRTase respectively from E. coli and S. cerevisiae have been cloned and sequenced (Andersen et al., 1992, ⁇ ur. J.
  • the biological material according to the invention comprises a first nucleic acid sequence coding for the antibody KT3 expressed in transmembrane form and capable of fixing the TCR complex and a second nucleic acid sequence coding for the chemokine MlP-l ⁇ .
  • Another preferred biological material comprises a first nucleic acid sequence coding for the antibody KT3 expressed in transmembrane form and capable of fixing the TCR complex and a second nucleic acid sequence coding for the chemokine BRAK.
  • the biological material also includes at least a third nucleic acid sequence coding for 1TL-2 or 1TL-12.
  • each nucleic acid sequence can be directed by elements (identical or different, homologous or heterologous with respect to the nucleic acid sequence in question, constitutive or inducible) which are specific to it, but it is possible to use common elements to direct the expression of two, or even three, nucleic acid sequences used in the part of the present invention. In this case, we can use merged sequences or IRES to reinitiate the translation of cistrons.
  • elements ensuring expression is intended to denote the elements necessary to ensure the expression of the nucleic acid sequence after its transfer into a target cell.
  • These include promoter sequences and / or regulatory sequences effective in said cell.
  • the promoter used can be a viral or cellular, ubiquitous or tissue-specific promoter or even a synthetic promoter. Of course, it can be modified with respect to the native promoter sequence in order to include or delete one or more restriction sites or else to delete negative sequences reducing the levels of transcription, etc.
  • viral promoters in particular RSN (Rous Sarcoma Virus), SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus), early adenoviral (Ela, E3, ...) and late (MLP) viruses.
  • RSN Raster Sarcoma Virus
  • SV40 Simian Virus
  • CMV Cytomegalovirus
  • Ela, E3, ...) and late (MLP) viruses for Major Late Promoter
  • retroviral LTRs like that of the MLV virus for Murine Leukemia Virus
  • TK-HSV-1 promoter the TK-HSV-1 promoter.
  • the promoters that can be used can be chosen from promoters 7.5K, H5R, TK, p28, pl i, K1L of vaccinia virus as well as early-late hybrid promoters and synthetic promoters (Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23, 1094-1097; Hammond et al., 1997, J. Virological Methods 66, 135-138; Kumar and Boyle, 1990, Virology 179, 151-158). It is also possible to choose a promoter sequence specific for a given cell type, or activatable under defined conditions. The literature provides a great deal of information relating to such promoter sequences.
  • promoters of the MT genes (metallothionein; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), and those coding for ⁇ -1 antitrypsin, CFTR, the pulmonary surfactant , immunoglobulins, muscle creatine kinase, ⁇ -actin, SR ⁇ , protein SM22 (Moessler et al, 1996, Development, 122, 2415-2425) and desmin (WO 96/26284). It is also possible to use a promoter which can be activated in dividing cells, for example governing the transcription of genes overexpressed in tumor cells.
  • the elements ensuring expression can also include so-called enhancer sequences, LCR (for Locus Control Region) making it possible to improve or stabilize the expression of the nucleic acid sequence in the host cell or to confer expression tissue-specific.
  • the elements ensuring the expression of said nucleic acid sequences may also include sequences required for intracellular transport, for replication and / or for integration, for transcription or translation.
  • the literature provides a great deal of information relating to such regulatory elements.
  • the nucleic acid sequences used in the context of the present invention may include “neutral” sequences or introns which do not interfere with transcription and are spliced before the translation step. Such sequences and their uses are described in the literature (WO 94/29471).
  • nucleic acids which can be used according to the present invention can also be nucleic acids modified so that it is not possible for them to integrate into the genome of the target cell or nucleic acids stabilized using agents, such as for example spermine, which as such have no effect on the efficiency of the transfection.
  • Said nucleic acid sequences can be controlled by identical or different elements, can be located in relation to one another in a contiguous, distant, in the same direction or in opposite directions, provided that their expression in the cell host is not affected.
  • the biological material according to the invention is in the form of naked DNA or RNA, that is to say free of any compound facilitating its introduction into cells (transfer nucleic acid sequence).
  • said first and second (and optionally third) nucleic acid sequences of the biological material according to the invention can be included in at least one vector allowing their transfer into the host cell.
  • they can be included in the same vector or, according to a preferred embodiment, in independent vectors allowing their transfer into the host cell.
  • such a vector could be a plasmid.
  • plasmids which can be used in the context of the present invention is vast. They may be cloning and / or expression vectors. In general, they are known to those skilled in the art and many of them are commercially available. However, it is also possible to construct or modify them by genetic manipulation techniques. Examples of plasmids derived from pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) or even p Poly (Lathe et al., 1987, Gene, 57) , 193-201).
  • a plasmid used in the context of the present invention contains an origin of replication ensuring the initiation of replication in a producer cell and / or a host cell (for example, the ColEl origin will be retained for a plasmid intended to be produced in E. coli and the oriP / EBNAl system if it is desired to be self-replicating in a mammalian host cell, Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol, 5, 2533-2542; Yates and al., 1985, Nature 313, 812-815). It can also comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells (complementation of an auxotrophy mutation, gene coding for resistance to an antibiotic, etc.).
  • cer sequence which promotes the monomeric maintenance of a plasmid (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequences of integration into the cell genome).
  • the vectors used in the context of the present invention are viral vectors, for example selected from adenoviral, retroviral, poxviral vectors, in particular derived from the vaccinia virus (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol., 196, 381-401), from the Modifed Virus Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol., 244, 365-396 ) or canarypox, or vectors derived from herpes viruses, alphaviruses, foamyviruses or viruses associated with adenoviruses.
  • adenoviral, retroviral, poxviral vectors in particular derived from the vaccinia virus (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol., 196, 381-401), from
  • a non-replicative and non-integrative vector will be used.
  • the nature of the vector is of little importance since the transfer only takes place to allow the transfer of the sequences (first, second, even third ) of acids nucleic acids inside host cells.
  • transfer models are widely used in the literature.
  • the basic technology for inserting a nucleic acid sequence and its regulatory elements into a poxviral genome is described in numerous documents accessible to those skilled in the art (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology, 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587 and US 5,179,993).
  • This technique is based on homologous recombination between the common sequences present in the viral genome and a transfer plasmid carrying the nucleic acid sequence to be transferred.
  • the insertion site in the poxviral genome preferably consists of a nonessential locus.
  • nonessential loci reside in the non-coding intergenic regions or within a gene whose deletion or non-functionality has little or no effect on viral growth, replication or infection. It is also possible to consider insertion into an essential locus provided that the affected function is complemented in trans during the production of the viral particles, by means for example of a complementation line or of a helper virus carrying the sequences. coding for deficient function.
  • a preferred insertion site is located within the thymidine kinase (TK) gene (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3411-3415; Weir et al, 1983, J.
  • TK thymidine kinase
  • Virol, 46, 530-537 Being an MVA vector, the insertion of the nucleic acid sequence will take place within one of deletions I to VII, and preferably within deletion II or III (Meyer et al, 1991, J. Gen. Virol, 72, 1031-1038; Sutter et al, 1994, Vaccine, 12, 1032-1040).
  • the conditions for constructing a recombinant vaccinia virus are known to those skilled in the art (see for example EP 83,286 and EP 206,920 for the vaccinia virus, and Mayr et al, 1975, Infection, 3, 6 -14 and Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851 for MVA).
  • Retroviruses have the property of infecting and integrating mainly in dividing cells and in this respect are particularly suitable for cancer application.
  • a recombinant retrovirus according to the invention generally comprises the LTR sequences, an encapsidation region and at least one of the nucleic acid sequences in use in the context of the invention, placed under the control of the retroviral LTR or of a promoter internal such as those described below. It can be derived from a retrovirus of an origin any (murine, primate, feline, human, etc.) and in particular MoMuLV (Moloney murine leukemia virus; Gilboa et al, 1988, Adv. Exp. Med.
  • the retroviral vector according to the invention may include modifications in particular at the level of the LTRs (replacement of the promoter region with a eukaryotic promoter) or of the packaging region (replacement with a heterologous packaging region, for example of the VL30 type). (see French applications 94 08300 and 97 05203 and US 5,747,323).
  • an adenoviral vector can be non-defective but preferably replicative in a conditional manner (CRAd; Heise and Kirn, 2000, J. Clin. Invest, 105, 847851; Alemany et al, 2000, Nature Biotechnology, 18, 723-727; Hernandez- Alcoceba et al, 2000, Human Gene Ther, 11, 2009-2024) or defective for replication, that is to say devoid of all or part of at least one region essential for replication selected from the El regions, E2, and E4. A deletion from the El region is preferred.
  • the adenoviral vector can also be devoid of all or part of the non-essential E3 region. According to another alternative, it is possible to use a minimal adenoviral vector retaining the sequences essential for the packaging, namely the ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5 'and 3' and the packaging region. Furthermore, the origin of the adenoviral vector according to the invention can be varied both from the point of view of the species and of the serotype.
  • adenovirus of human or animal origin canine, avian, bovine, murine, ovine, porcine, simian, ...) or a hybrid comprising fragments of the adenoviral genome from at least two different origins.
  • Mention may more particularly be made of the adeno virus CAV-1 or CAV-2 of canine origin, DAV of avian origin or else Bad of type 3 of bovine origin (Zakharchuk et al, Arch. Virol, 1993, 128: 171- 176; Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol, 1989, 70: 165-172; Jouvenne et al.
  • an adenoviral vector of human origin preferably deriving from a serotype C adenovirus, in particular of type 2 or 5, is preferred.
  • An adenoviral vector according to the present invention can be generated in vitro in Escherichia coli (E. coli) by homologous ligation or recombination (see for example international application WO 96/17070) or alternatively by recombination in a complementation line (see for example Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, vol. 7, p 109-128; Ed .: EJ Murey, The Human Press Inc.).
  • the first nucleic acid sequence is carried by a poxviral vector derived from the Modifed Virus Ankara (MVA) strain of the vaccinia virus and the second nucleic acid sequence is carried by an adenoviral vector.
  • the biological material according to the invention comprises a third nucleic acid sequence, this is preferably carried by an adenoviral vector.
  • the term “biological material” includes the viral vector (recombinant genome) and the infectious viral particles comprising said viral vector.
  • a viral particle can be generated from a viral vector according to any conventional technique in the art. Its propagation is carried out in particular in a complementation cell adapted to the deficiencies of said vector.
  • an adenoviral vector use will be made, for example, of a complementation line as described in application WO 94/28152, to line 293 established from human embryonic kidney cells, which effectively complements the El function (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol.
  • helper viruses can also be used to at least partially complement defective functions.
  • cell complementation means a cell capable of providing in trans the early and / or late factors necessary for the packaging of the viral genome in a viral capsid to generate a viral particle containing the recombinant vector.
  • Said cell may not by itself complement all the defective functions of the vector and in this case may be transfected / transduced by a vector / helper virus providing the complementary functions.
  • the viral particles containing poxviral vectors are prepared by infection of permissive cells (for example primary fibroblasts of chicken embryos) according to the techniques of the art widely detailed in the documents cited in the field of poxviruses.
  • the invention also relates to a process for preparing a viral particle, according to which:
  • a biological material according to the invention is introduced into a cell, in particular a complementation cell capable of complementing said vector in trans, so as to obtain a said transfected cell, (ii) culturing said transfected cell under appropriate conditions to allow the production of said viral particle, and
  • the viral particle can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods consists in lysing the cells (chemical lysis, freezing / thawing, osmotic shocks, mechanical shocks, sonication, etc.), to collect the virions in the lysis supernatant. These can be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifugation in particular through a cesium chloride gradient, ).
  • the vector used according to the invention can be a non-viral vector such as for example a vector consisting of at least one said nucleic acid sequence or a plasmid vector as defined above, complexed or conjugated to at least one molecule or carrier substance selected from the group consisting of a cationic amphiphile, in particular a cationic lipid, a cationic or neutral polymer, a polar protic compound in particular chosen from propylene glycol, polyethylene glycol, glycerol, ethanol, 1-methyl L -2-pyrrolidone or their derivatives, and an aprotic polar compound chosen in particular from dimethylsulfoxide (DMSO), diethylsulfoxide, di-n-propylsulfoxide, dimethylsulfone, sulfolane, dimethylformamide, dimethylacetamide, tetramethylurea, acetonitrile or their derivatives.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DMSO dimethylsul
  • cationic lipids have a great affinity for nucleic acids and have the capacity to interact with the cell membrane (Felgner et al, 1989, Nature, 337, 387-388).
  • the cationic lipids which are particularly suitable for the implementation of the present invention include in particular DOTMA (Felgner et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417), DOGS or Transfectam TM ( Behr et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the polymers which are suitable for implementing the invention are preferably cationic, such as polyamidoamine (Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem, 4, 372-379), dendritic polymers (WO 95/24221), polyethylene imine or polypropylene imine (WO 96/02655), polylysine (US 5,595,897 or FR 2,719,316), chitosan (US 5,744,166) or DEAE dextran (Lopata et al, 1984, Nucleic Acid Res, 12, 5707- 5717).
  • polyamidoamine Hyensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem, 4, 372-379
  • dendritic polymers WO 95/24221
  • polyethylene imine or polypropylene imine WO 96/02655
  • polylysine US 5,595,897 or FR 2,719,316
  • chitosan US 5,744,166
  • the vectors used in the context of the present invention may also comprise targeting elements which can make it possible to direct the transfer of said nucleic acid sequences to certain cell types or certain particular tissues (tumor cells, cells of the pulmonary epithelium, hematopoietic cell, muscle cell, nerve cell, ). They can also make it possible to direct the transfer of an active substance to certain preferred intracellular compartments such as the nucleus and the mitochondria. They may also be elements which facilitate penetration into the interior of the cell or the lysis of endosomes. Such targeting elements are widely described in the literature.
  • lectins may for example be all or part of lectins, peptides, in particular the peptide JTS-1 (see patent application WO 94/40958), oligonucleotides, lipids, hormones, vitamins, antigens, antibodies, ligands specific for membrane receptors, ligands capable of reacting with an anti-ligand, fusogenic peptides, nuclear localization peptides, or a combination of such compounds.
  • they may be galactosyl residues making it possible to target the asialoglycoprotein receptor on the surface of liver cells, ligands which can interact with receptors such as growth factor receptors, cytokine receptors, lectins, adhesion proteins, it can also be an antibody fragment such as the Fab fragment, a fusogenic peptide INF-7 derived from the HA-2 subunit of the hemagglutinin of the influenza virus (Plank and al, 1994, J. Biol. Chem, 269, 12918-12924), of a nuclear localization signal derived from the T antigen of the SV40 virus or of the EBNA-1 protein of the Epstein Barr virus.
  • tumor cells cells infected with a viral, parasitic or even bacterial pathogen.
  • the expression on the surface of these cells of all or part of an antibody capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a T helper lymphocyte and involved in the method of activating such a cell makes it possible to direct the cytotoxic immune response towards a given target, and more particularly to direct this response at the level of a tumor or an infectious focus.
  • the invention also relates to a host cell comprising a biological material according to the invention. It is preferably a tumor mammalian cell or a mammalian cell infected with a viral pathogen or a mammalian cell infected with a bacterial pathogen.
  • the host cell according to the invention does not naturally express said first nucleic acid sequence (coding for an antibody).
  • a said cell is present in a form allowing its administration in the organism of a mammal, human or animal, as well as possibly its prior culture and said cell being genetically modified in vitro by introduction:
  • At least one said second nucleic acid sequence encoding all or part of a polypeptide allowing the activation of the immune response and / or the chemoattraction of a cytotoxic effector cell and / or of a T helper lymphocyte.
  • said polypeptide is selected from chemokines and co-stimulation molecules, and
  • nucleic acid sequence encoding all or part of a polypeptide having cytotoxic activity.
  • said host cell comes either from the mammal to be treated, or from a mammal other than that to be treated. In the latter case, it should be noted that said host cell will have undergone a treatment making it compatible with the mammal to be treated. According to a preferred case, by “mammal” is intended to denote a human mammal.
  • Such biological material when administered to a patient, and more particularly administered intratumorally, is capable of inducing or stimulating in the latter a cell-mediated immune response which can lead to the production of cytokines and to cytotoxic effect of effector cells which result not only in the elimination of the administered cells but also in the elimination of neighboring cells presenting the antigens, in particular tumor, capable of being recognized by said activated cytotoxic effector cells.
  • the invention also relates to a method for preparing a cell according to the invention, characterized in that said first and second nucleic acid sequences as described above are introduced by any suitable means into a mammalian cell. , and, optionally, said third nucleic acid sequence, said nucleic acid sequences being placed under the control of the elements ensuring their expression in said host cell, then in that one selects from these cells those genetically modified by said nucleic acid sequences.
  • the invention further relates to the use of a biological material or of a cell according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment or prevention of cancers or viral infections. More specifically, the invention relates to the co-use on the one hand, of a nucleic acid sequence coding for all or part of an antibody expressed on the surface of said target cell and capable of binding to a polypeptide present at the surface of a cytotoxic effector cell or a helper T lymphocyte and involved in the activation process of such a cell and, on the other hand, of a second nucleic acid sequence coding for a polypeptide of chemokine type or co-stimulation molecule, involved in the stimulation of the immune response or in the attraction to the expression site and the activation of cytotoxic effector cells or T helper lymphocytes, for the preparation of pharmaceutical compositions intended for treating a mammal by gene transfer.
  • the invention also relates to the use of said first and second nucleic acid sequences and of a third nucleic acid sequence encoding a polypeptide having cytotoxic activity.
  • a preferred use relates to (i) a vector or a viral particle MVA comprising a nucleic acid sequence coding for the antibody KT3 expressed in transmembrane manner, (ii) a vector or an adenoviral particle comprising a nucleic acid sequence coding for the Act-2 variant of the chemokine MlP-l ⁇ and (iii) a vector or an adenoviral particle comprising a nucleic acid sequence coding for IL-2 or lTL-12.
  • compositions comprising a biological material or a cell as previously described, advantageously combined with a pharmaceutically acceptable vehicle for administration to the man or animal.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle for administration to the man or animal.
  • This pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength, such as for example a sucrose solution.
  • said composition may contain solvents, aqueous or partially aqueous vehicles such as sterile water, free of pyrogenic agent and dispersion media for example.
  • the pH of these pharmaceutical compositions is suitably adjusted and buffered according to conventional techniques.
  • the medicament can be administered directly in vivo (for example in an accessible tumor or at its periphery, intravenously, in the vascular system by means of an appropriate probe).
  • vivo for example in an accessible tumor or at its periphery, intravenously, in the vascular system by means of an appropriate probe.
  • host cells from the mammal to be treated (bone marrow stem cells, peripheral blood lymphocytes, etc.), in transfecting or infecting them in vitro according to the techniques of the art and in re-administer to said mammal.
  • the biological material according to the invention can be administered in vivo in particular in injectable form, in particular by intratumoral route.
  • intratracheal intranasal, epidermal, intravenous, intraarterial, intracardiac, intramuscular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral by syringe or any other equivalent means.
  • systems suitable for the treatment of the airways or mucous membranes such as inhalation, instillation, or aerosolization, topically, by oral administration or any other perfectly known means of those skilled in the art and applicable to the present invention.
  • the administration can take place in single or repeated dose, one or more times after a certain interval of interval.
  • compositions based on viral particles can be formulated in the form of doses of between 10 4 and 10 14 iu (infectious units) or pfu (particles forming plaques), preferably 10 6 to 10 12 iu or pfu and , most preferably, 10 7 to 10 11 iu or pfu.
  • doses comprising from 0.01 to 100 mg of DNA, preferably 0.05 to 10 mg and, most preferably, from 0.5 to 5 mg can be considered.
  • a preferred use is to treat or prevent cancers, tumors and diseases resulting from unwanted cell proliferation.
  • cancers of the breast, the uterus in particular those induced by papillomaviruses
  • the prostate in particular those induced by papillomaviruses
  • the lung the bladder
  • the liver in particular those induced by papillomaviruses
  • the lung the bladder
  • the liver in particular those induced by papillomaviruses
  • the stomach the liver, the colon, the pancreas, the stomach
  • esophagus larynx
  • central nervous system and blood lymphomas, leukemia
  • cardiovascular diseases for example to inhibit or delay the proliferation of smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis).
  • infectious diseases application to AIDS, hepatitis, cancer induced by viruses (retrovirus, papillomavirus, etc.) can be considered.
  • a composition according to the invention is more particularly intended for preventive or curative treatment of diseases by
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used in combination with at least one compound naturally responsible for the co-stimulation of cytotoxic effector cells or of lymphocytes
  • T helper According to this embodiment, it is possible to envisage administering said composition with a polypeptide of the cytokine or chemokine type, for example 1TL-2 or 1TL-12.
  • the invention also extends to a method for the treatment and prevention of diseases by gene transfer (gene therapy), characterized in that a host organism or cell, in particular a mammal, in need of administration is administered.
  • a biological material or a host cell according to the invention When the treatment method implements a biological material or a host cell comprising a third nucleic acid sequence coding for a cytotoxic gene of the suicide gene type, the treatment method also comprises an additional step according to which acceptable amounts of d are administered. '' a pharmaceutical point of view of the predrogue acting in concert with the selected suicide gene.
  • a cytosine analog such as 5-FC is preferably used.
  • the predrogue is administered according to standard practices and this in a prior manner, concomitant or even after that of the therapeutic agent according to the invention.
  • the oral route is preferred.
  • Either a single dose of the pre-drug or repeated doses may be administered long enough to allow the production of the toxic metabolite within the host organism or cell.
  • the therapeutic use or the method of treatment can be associated with a second treatment of the patient by surgery (in particular by removing the tumor partially or totally), by radiotherapy or chemotherapy.
  • the treatment according to the invention is applied beforehand, concomitantly or following said second treatment.
  • this treatment will be applied following said second treatment.
  • the therapeutic use or the treatment method according to the invention can be combined with additional treatment of the patient with molecules intended to reduce the inflammatory response induced at the tumor site (for example a vasoactive compound such as serotonin) or a molecule that inhibits reactive forms of oxygen (for example histamine).
  • molecules intended to reduce the inflammatory response induced at the tumor site for example a vasoactive compound such as serotonin
  • a molecule that inhibits reactive forms of oxygen for example histamine.
  • the treatment according to the invention is applied beforehand, concomitantly or following said additional treatment of the patient.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the combined strategies using the vector MVA-KT3 and the vectors Ad-cytokines and / or Ad-chemokines in the RenCa model.
  • the injection protocol is 2x10 iu of adenovirus injected at OJ, J2 and J4 and 2x10 7 pfu of MVA virions injected at D2, J3 and J4.
  • the statistical values are calculated between the 2 curves linked by a brace (Statistica 5.1 software, Mat & Met). A p value ⁇ 0.05 is considered to be statistical.
  • FIG. 2 is a schematic representation of the combined strategies using the MVA-KT3 vector and the Ad-cytokines and / or Ad-chemokines vectors in the RenCa model.
  • the injection protocol is 1x10 iu of adenoviruses injected on D0, D1 and D2 and lxl O 7 pfu of MVA virions injected on D2, D3 and D4.
  • the statistical values are calculated between the 2 curves linked by a brace (Statistica 5.1 software, Mat & Met). A p value ⁇ 0.05 is considered to be statistical.
  • the constructions described below are carried out according to the general techniques of genetic engineering and molecular cloning, detailed in Maniatis et al, (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or according to the recommendations of the manufacturer when using a commercial kit.
  • the homologous recombination steps are preferably carried out in the E. coli BJ 5183 strain. (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol, 166, 557-580).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I from E. coli (Klenow).
  • the adenoviral genome fragments used in the various constructions described below are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 genome as disclosed in the Genbank database under the reference M73260.
  • the cells are transfected or transduced and cultured according to standard techniques well known to those skilled in the art. I. Tumor models
  • P815 mastocytoma H-2d, described in Dunn et al, 1957, J. Natl. Cancer Inst, 18, 587-590
  • B16FO melanoma H-2b, described in Wu et al, 1996, Cancer Res, 56, 21-26
  • RENCA renal cell carcinoma H-2d, described in Murphy et al, 1973, J. Natl. Cancer Inst, 50, 1013-1025.
  • mice In order to establish tumors in mice, the tumor cells P815, B16F10 or RENCA are trypsinized, washed 3 times in PBS and resuspended at 3 x 10 cells / ml. 100 ⁇ l of this cell suspension are then injected into the right flank of immunocompetent B6D2 mice [(C57BL / 6 x DBA / 2) F1] aged 6-7 weeks. After the appearance of a tumor with a palpable volume of between 5 and 25 mm 3 , each mouse receives three intratumoral injections (100 ⁇ l) of a defined quantity of virus in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl 2 . Each condition is evaluated in groups of 10 mice. The tumor volume and the survival of the mice are determined twice a week. After a primary rejection, the mice are reinjected on the opposite flank, with the same dose of tumor cells (3E + 5 cells / mouse).
  • composition of the invention administered is controlled by measuring the size of the tumors as well as by measuring the survival time of the mice treated with, if necessary, a control of the immunological status of the animal by ELISPOT, test CTL, ....
  • the animals can then be subjected to a lateral challenge during which a lethal dose of tumor cells is administered to the pre-treated animal.
  • the cloning of the sequences coding for the entire heavy and light chains of the antibodies KT3 and H57 is described in international application WO 00/24896.
  • the chains thus isolated are subcloned by recombination in a recombinant MVA virus containing the nucleic acid sequence coding for the transmembrane region of the rabies virus (Modified Vaccinia Ankara; Antoine et al, 1998, Virology, 244, 365-396 and French patent application FR 97 09152), in order to obtain the MVATG14240 virus expressing the rat antibody KT3 (rat anti-CD3 epsilon) and MVATG14237 expressing the hamster antibody H57-597 (anti TCR alpha / beta of hamster).
  • the expression cassettes are introduced into deletion II of MVA as described in application WO 00/24896. Briefly, the light chain of the antibodies is placed under the control of the early late promoter p7.5 (Goebel et al, 1990, Virol, 179, 247-266). The sequence encoding the heavy chain is placed under the control of the early late promoter pH5R (Goebel et al, 1990, Virol, 179, 247-266). The C-terminal end of the heavy chain is fused with the transmembrane and intracytoplasmic domain of the rabbit glycoprotein in order to allow the anchoring of the antibody in the plasma membrane.
  • KT3 and H57 antibodies in infected cells are verified by Western blot and flow cytometry. The results observed show that there is indeed expression of immunoglobulin of the IgG type of rat and hamster on the surface of the infected cells (see example 2 of WO 00/24896).
  • the functionality of MVA viruses expressing anti TCR / CD3 antibodies is tested by proliferation tests on murine spenocytes.
  • the expression of the antibody KT3 or H57 on the surface of the murine cells makes it possible to induce a strong proliferation of naive T cells (see example 2 of WO 00/24896).
  • the human chemokine genes used were reconstituted by assembly of oligonucleotides according to their sequence published in the database of the "National Center for Biotechnology Information”. This cloning strategy consists of the assembly, in two stages, of 8 oligonucleotides of approximately 80 bases each. The set covers the entire nucleotide sequence of the cDNA of the Act-2 variant MlP-l ⁇ genes (Accession: J04130, described in application WO 00/74629, hereinafter called MIP-1 ⁇ ), IP-10 (Accession N °: X02530), and DC-CK1 (Accession N °: AB000221).
  • IL-18 does not have a natural signal sequence and is produced as a mature protein only after cleavage by caspase-1.
  • the sequence encoding the mature protein (nucleotides 108-582) has therefore been cloned in phase with the signal peptide BM40 previously described (Yamaguchi et al, 1999, EMBO J, 18, 4414-1423).
  • the chemokine BRAK was cloned on the basis of the sequence described by Frederick et al. (2000, Am. J. Pathol, 156, 1937-50) and Sleeman et al. (2000, Int. Immunol, 12, 677-689). These genes were cloned into an adenoviral transfer vector.
  • the transfer vectors expressing the genes of human 1TL-2, of the two murine 1TL-12 subunits (p40 and p35) separated by a ribosome entry site, the mGM-CSF (leader sequence human in phase with the murine sequence) and murine B7-1 were constructed by inserting into the transfer vector the cloned sequence on the basis of the published sequence.
  • the transfer vector consists of an expression cassette containing the promoter / enhancer sequences of human cytomegalo virus (CMV), a chimeric ⁇ -globin / human IgG unintron and a polyadenylation sequence of the SV40 virus.
  • CMV human cytomegalo virus
  • the flanking sequences of the E1 region (5 ′ nucleotide fragment (nt) 1 to 458 and 3 ′ fragment nt 3328 to 5788) of the human adenovirus type 5 were placed on either side of this cassette. These sequences make it possible to generate an "infectious" plasmid by homologous recombination, with the complete adenoviral genome ⁇ E1 / ⁇ E3 containing the candidate gene, in E.
  • Coli (Chartier et al, 1996, J. Virol, 70, 4805-4810)
  • the adenoviruses recombinants are then produced by transfection of a Pacl digestion of the "infectious" plasmid in a complementation line (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol, 36, 59-74)
  • a recombinant adenovirus not containing a transgene in the expression cassette (Ad-empty) will be used control adenovirus in all experiments.
  • the propagation of the virions, their purification and the titration were carried out according to standard techniques (Lusky et al, 1998, J. Virol, 72, 2022-32).
  • the purified viruses are stored at ⁇ 80 ° C. in 1M sucrose, 10 mM Tris-HCl pH8.5, 1 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 0.005% Tween 80. 2. Cell lines and primary cells.
  • the murine tumor lines P815, B16F0 and B 16F 10 were obtained from the ATCC (American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA).
  • the P815 cells (ATCC number: TIB-64) originate from a mouse mastocytoma DBA / 2 (H2-K d ).
  • the highly metastatic B16-F10 (ATCC, CRL-6475) come from a mouse melanoma C57BL / 6J (H2-K). RenCa cells are derived from a murine renal cell carcinoma (BalB / cCr (H2-K d )).
  • the tumor line A549 (ATCC, CCL-185) comes from a human pulmonary carcinoma.
  • Human monocytes are obtained by leukapheresis and elutriation. The cells were cultured in DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (SVF) at 37 ° C, 5% CO 2 . Human dermal microvascular cells (HDMEC) were cultured as recommended by the supplier (PromoCell, Heidelberg, Germany).
  • the in vitro expression of the huIP-10 proteins, huMIP-l ⁇ and huIL-18 was analyzed on culture supernatants of infected HDMEC cells for 48 h at an MOI of 50. Indeed, the supernatants of HDMEC are much less rich in contaminating proteins than those of other cell lines.
  • the RENCA cells are infected at MOI 50 with Ad.huB7H-1 and then treated for 1 hour with 50 ⁇ g / ml of mitomycin C (SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin
  • naive splenocytes are prepared from a spleen of DBA / 2 mice (Paul et al, 1999, Cancer Immunol. Immunother, 48, 22-28). After washing, the tumor cells and the splenocytes are co-cultured.
  • the positive and negative controls consist of splenocytes activated with 10 ⁇ g / ml of ConA or unstimulated respectively (R&D Systems, Minneapolis, USA). After 96 hours at 37 ° C and 5% CO2,
  • thymidine [ 3 H] / well 1 ⁇ Ci of tritiated thymidine [ 3 H] / well is added.
  • the quantity of thymidine incorporated is measured after 8 hours by precipitating the cellular DNA on glossy filter paper (PHD harvester, Cambridge Technologie, Plainfield, USA).
  • the radioactivity emitted is measured using a ⁇ counter (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, USA).
  • mice In order to establish tumors in mice, the P815, B16F10 or RENCA tumor cells are trypsinized, washed 3 times in PBS and resuspended at 3 ⁇ 10 6 cells / ml. 100 ⁇ l of this cell suspension are then injected into the right flank of immunocompetent B6D2 mice [(C57BL / 6 x DBA 2) F1] aged 6-7 weeks. After the appearance of a tumor with a palpable volume of between 5 and 25 mm, each mouse receives three intratumoral injections (100 ⁇ l) of a defined quantity of virus in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl 2 . Each condition is evaluated in groups of 10 mice.
  • mice The tumor volume and the survival of the mice are determined twice a week. For ethical reasons, animals are sacrificed when the tumor volume becomes greater than or equal to 3000 mm 3 . After a primary rejection, the mice are re-injected on the opposite flank, with the tumor cells (3 ⁇ 10 5 cells / mouse). Statistical studies on the figures obtained make it possible to draw a Kaplan-Meier type survival curve. Statistical significance is calculated using Fisher's exact test (Statistica 5.1-Statsoft Inc. software, Tulsa, USA). Results.
  • RENCA cells were infected with Ad-vacuum or Ad-B7-Hl for 48 h, then treated with mitomycin C in order to stop their proliferation. The infected cells were then brought into contact with naive splenocytes (of the same haplotype as the RenCa cells), in order to assess whether the membrane expression of B7-H1 on the surface of tumor cells enabled the proliferation of lymphocytes. .
  • naive splenocytes proliferate (stimulation factor: 12x) in the presence of RenCa / Ad-B7-Hl cells but no RenCa / Ad-empty cells, indicating that the vector Ad-B7-Hl is functional in vitro .
  • the established protocol consists in injecting a dose of adenoviral vector (from 1.10 to 4.10 iu depending on the tumor models) on D0, D1 and D2 and a dose of MNA vector (1.10 7 or 2.10 7 pfu depending on the tumor models) on D2 , J3 and J4.
  • This protocol considerably reduces the anti-tumor activity induced by the co-injection of control viruses in the three tumor models.
  • the simple change consisting in injecting adenovirus first makes it possible to reduce from 20 to 0 the percentage of mice having rejected their tumor (comparison of FIGS. 1 and 2).
  • the results obtained in these combined antitumor strategies are always compared with those obtained in the groups treated with the viruses alone for the double combinations and with those obtained in the groups treated with two of the three viruses for the combinations triplets.
  • cytokines IL-2, IL-12 and IL-18
  • IL-2, IL-12 and IL-18 have been described as molecules allowing the activation of unrestricted effector cells by MHC of the NK or LAK type.
  • the antitumor efficacy of these molecules could be added to that of the vectors MVA-KT3 and MVA-H57.
  • the co-injection of Ad-huIL-2 and MVA-H57 increases the survival of the animals by 30 to 45 days compared to the groups treated with MNA-H57 or Ad-huIL-2 alone and improves statistically animal survival (15 to 35-40% rejection depending on experience).
  • the results obtained show that, in different models of murine tumors, the co-injection of an adenoviral vector coding for 1TL-12 increases the anti-tumor effect induced by the in vivo membrane expression of the vector MVA-KT3. This synergy can be explained by several non-exclusive mechanisms.
  • the apparent anti-tumor efficacy of 1TL-12 can be mediated by macrophages, NK cells (CD3 " ) and / or NKT cells (NK1.1 + , CD3 + , TCR ⁇ + , CD4 + , CD8 " , CD28 + , V ⁇ l4).
  • CMHI and CD 1 d on the surface of these different models of tumors could also influence the importance of NK and NKT cells in the process of tumor rejection mediated by 1TL-12
  • the anti-angiogenic activity of 1TL-12 mediated by the induction of the chemokine IP-10 could reduce tumor growth by inhibiting its birth This would allow the different immune effectors induced by 1TL-12 and KT3 on a tumor whose growth is slowed down.
  • the anti-tumor effect of triple combinations was evaluated by adding an adenoviral vector expressing chemokines to these interesting double combinations.
  • the adenoviral vectors were administered on D0, D1 and D2 (1 to 2 x 10 8 iu vector / injection) and the vector MVA-KT3 to D2, D3 and D4 (1 to 2 x 10 7 / injection).
  • the injection of the Ad-huMIPl ⁇ + Ad-huIL-2 + MVA-KT3 viruses slightly increases the survival (by 15 to 25%) of the animals in the P815 model.
  • the survival rate of the animals was also increased after administration of the triple combination MVA-KT3 / Ad-huBRAK / Ad-huIL-2 reaching 75%, while the survival rates observed after administration of Ad -huBRAK and Ad-huIL-2, Ad-huIL-2 alone and MVA-KT3 alone are 63%, 50% and 20% respectively.
  • adenoviral vectors coding for a chemokine (MlP-1 ⁇ or BRAK) and for a cytokine (IL-12 or IL-2) in combination with the vector MNA- coding for the antibody KT3 expressed in transmembrane form heals 75 to 100% of animals in the RenCa model ( Figure 1 and above).

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Abstract

La présente invention concerne un matériel biologique comprenant au moins (i) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps, ledit anticorps étant exprimé à la surface de la cellule hôte et capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule et (ii) un acide nucléique codant pout tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper, ledit polypeptide étant sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation. La présente invention concerne également une cellule hôte et une composition pharmaceutique comprenant ledit matériel biologique ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques.

Description

MATERIEL BIOLOGIQUE POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES DESTINEES AU TRAITEMENT DE MAMMIFERES
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique appliquée à l'immunothérapie (ou immunothérapie génique) spécifique ou non-spécifique, plus particulièrement dans le cadre du traitement de maladies dont l'agent responsable est un organisme pathogène, tel que notamment un agent bactérien, parasitaire ou viral, ou dans le cadre du traitement du cancer ou de maladies à prion. Plus particulièrement, l'invention concerne un matériel biologique comprenant au moins (i) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps et (ii) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou influençant les cellules effectrices cytotoxiques et/ou les lymphocytes T helper. La présente invention concerne également une cellule hôte et une composition comprenant ledit matériel biologique ainsi que leur utilisation à des fins médicales, plus particulièrement thérapeutiques ou prophylactiques. Depuis longtemps, la thérapie génique a été proposée pour corriger les désordres observés dans le cadre des maladies génétiques. Ces maladies s'expliquent en particulier par un dysfonctionnement de l'expression de gènes spécifiques ou par l'expression de polypeptides mutés non fonctionnels dans au moins un type cellulaire. La thérapie génique consiste à transférer dans le patient à traiter, l'information génétique capable de corriger le défaut observé. Il pourra s'agir, par exemple, du gène codant pour la protéine CFTR dans le cas de la mucoviscidose ou du gène codant pour la dystrophine dans le cas de la myopathie de Duchenne. Dans le cadre de cette approche, l'information génétique est introduite soit in vitro dans une cellule hôte spécifique extraite de l'organe, la cellule modifiée étant ensuite réintroduite dans l'organisme (procédé ex vivo), soit directement in vivo dans ou à proximité du tissu approprié (e.g. organe affecté). De nombreuses publications décrivent la mise en oeuvre de protocoles de thérapie génique afin d'obtenir dans les cellules hôtes l'expression d'une protéine présentant un intérêt par introduction de l'information génétique correspondante.
Toutefois, l'intérêt de ce type d'approche ne se borne pas au traitement des affections purement génétiques et peut également permettre ou contribuer à la réduction ou à l'élimination de tumeurs, de cellules tumorales isolées, d'agents pathogènes, tels que les agents bactériens, parasites ou viraux, ou de cellules infectées par de tels agents pathogènes. A défaut, un tel traitement permet de retarder la progression des affections indiquées, ou causées par les agents mentionnés ci-dessus.
Dans le cas particulier des cancers, Hellstrom et al. (1969, Adv. Cancer Res. 12, 167-223) ont montré que la défense de l'organisme à l'égard des tumeurs repose tout particulièrement sur la réponse immunitaire mettant enjeu les lymphocytes T, notamment les lymphocytes T cytotoxiques. Toutefois, de nombreux travaux ont montré que la plupart des effecteurs immunitaires, spécifiques ou non, sont inefficaces pour permettre l'élimination ou même l'arrêt de la progression d'une tumeur. Il est par conséquent souhaitable de disposer d'une méthode de stimulation de la réponse immune dirigée contre les tumeurs ou leurs antigènes, et plus particulièrement de la réponse faisant intervenir les lymphocytes cytotoxiques CTL, afin de disposer de méthodes de prévention ou de traitement des états cancéreux plus efficaces. De manière identique, il a été montré que le système immunitaire est souvent inefficace dans le cas d'infections, virales notamment, comme l'illustre le cas des infections dues au NIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine).
La réponse immune dirigée contre un antigène spécifique peut être divisée en deux catégories distinctes : l'une mettant enjeu les anticorps (réponse immune de type humoral), l'autre les cellules effectrices cytotoxiques telles que par exemple les macrophages, les lymphocytes cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses (ΝK et ΝKT) ainsi que les lymphocytes T helper, notamment les LTCD4 (réponse immune de type cellulaire). Plus particulièrement, les deux types de réponse se distinguent en ce que les anticorps reconnaissent les antigènes sous leur forme tridimensionnelle alors que les lymphocytes T, par exemple, reconnaissent des portions peptidiques desdits antigènes, associés à des glycoprotéines codées par les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), notamment les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I qui sont exprimés de façon ubiquitaire à la surface des cellules ou les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type II qui sont exprimés de façon spécifique à la surface des cellules impliquées dans la présentation des antigènes (APC). Ces éléments fondamentaux de la réponse immune sont bien connus de l'homme de l'art. La réponse immune de type cellulaire est caractérisée en ce que les cellules T de type CD4+ (cellules T «helpeo>), suite à un phénomène d'activation bien connu (pour une revue voir Alberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15, 125-154), produisent des cytokines qui, à leur tour, induisent la prolifération de cellules APC capables de produire cesdites cytokines ; la différenciation cellulaire des lymphocytes B capables de produire des anticorps spécifiques ; et la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Selon un second aspect de la réponse immune cellulaire, les cellules effectrices cytotoxiques telles que par exemple les lymphocytes de type CD8+ (CTL) sont activés a) après interaction avec des peptides antigéniques fixés sur et présentés par les glycoprotéines portées par les cellules ubiquitaires et codées par les gènes appartenant au système CMH I, et b) éventuellement par les cytokines produites par les CD4+. Les CTL ainsi activés sont alors capables de détruire les cellules exprimant ledit peptide antigénique.
Il a été proposé d'adapter les procédés de thérapie génique déjà bien connus et de transférer dans les cellules hôtes, plus particulièrement des cellules cancéreuses, des gènes codant pour des immunostimulateurs (immunothérapie) susceptibles d'induire ou d'activer une réponse immune à médiation cellulaire à l'égard de la tumeur. De nombreuses approches antitumorales ont été décrites à ce jour basées sur l'utilisation de gènes codant pour des cytokines (Colombo et al., 1994, Immunology Today, 15, 48-51), pour des chimiokines, de gènes cytotoxiques conférant une toxicité aux cellules les exprimant, par exemple le gène tk du virus Herpès Simplex de type 1 (HSN-1), d'anti-oncogènes, comme par exemple le gène associé au rétinoblastome ou p53, ou encore de séquences capables d'inhiber l'activité d'un oncogène, tel que par exemple une molécule antisens ou un ribozyme capable de dégrader un ARΝ messager spécifique d'un oncogène.
Les cytokines sont des molécules naturellement produites à la suite d'une stimulation antigénique ou d'une réaction inflammatoire (Gillis and Williams, 1998, Curr. Opin. Immunol., 10, 501-503) dont l'utilité dans le cadre du traitement de certains cancers a été montrée notamment par Oettger (1991, Curr. Opin. Immunol., 3, 699-705). Leroy et al. (1998, Res. Immunol., 149, 681-684) ont décrit que la production de cytokines au site de la tumeur, après administration intra-tumorale de vecteurs viraux recombinants permet l'induction d'une réponse immunitaire associée à une inhibition de la croissance tumorale. Néanmoins, cette réponse antitumorale bien qu'encourageante ne permet pas la disparition définitive des cellules tumorales et, par conséquent, la mise en œuvre d'un traitement antitumoral satisfaisant. Les chimiokines constituent pour leur part une sous classe de la famille des cytokines. Elles se distinguent des autres cytokines par leur propriété chimio-attractive, notamment lors des processus naturels de chimiotactisme, et notamment d'attraction des cellules du système immunitaire vers les tissus dans lesquels siège l'inflammation ou l'infection, elles se distinguent également par leurs propriétés anti-angiogéniques. Les chimiokines sont des protéines de petite taille (de 70 à 80 acides aminés) dont les séquences en acides aminés présentent un faible taux d'homologie (variant de 10 à 70 % selon les chimiokines considérées). A ce jour, une cinquantaine de chimiokines différentes ont été identifiées (voir par exemple Zlotnik et Yoshie, 2000, Immunity 12, 121-127 qui décrit la classification des chimiokines et leur rôle respectif dans le mécanisme immunitaire). Quatre familles ont été définies sur la base de la position des résidus cystéines qu'elles renferment. Les familles α dont l'extrémité N-teπninale comprend 2 cystéines séparées par un acide aminé unique (i.e. les chimiokines de type IL-8, NAP-2, GCP-2) et 3 dont l'extrémité N- terminale comprend 2 cystéines adjacentes (i.e. les chimiokines de type RANTES, MIP-1, MCP1) sont les mieux caractérisées (Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, 159- 165 ; Murphy, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 593-633).
Des approches antitumorales utilisant les chimiokines ont déjà été proposées dans l'état de la technique. Ainsi, le groupe de Dilloo et al. (1996, Nature Medicine 2 (10), 1090- 1095) a montré que l'administration de fibroblastes modifiés ex vivo à l'aide de vecteurs rétroviraux co-exprimant une chimiokine particulière, la lymphotactine (Lptn), et l'interleukine-2 (IL-2), permet de stimuler la réponse immune antitumorale de l'animal traité. Toutefois, cet effet est limité dans le temps, et ne permet qu'un contrôle transitoire du volume tumoral. La demande internationale WO 00/74629 décrit une approche reposant sur l'association d'une chimiokine MIP-1 et d'une cytokine (IL-2 ou IFNy). Les résultats obtenus suite à P administration intra-tumorale de vecteurs adénoviraux exprimant les deux types de polypeptides mettent en évidence un retard de la prolifération tumorale et une amélioration du taux de survie. Néanmoins, cette réponse antitumorale bien qu'encourageante ne permet pas une rémission complète chez les animaux traités.
Par ailleurs, l'activation des cellules T est déclenchée par l'interaction entre le complexe TCR (ou TCR/CD3) et un peptide antigénique présenté par les CPA dans le contexte du complexe majeur d'histocompatibilité. Il est bien établi que les cellules T CD4+ naïves requièrent 2 signaux pour l'induction d'une réponse immunitaire efficace : un premier faisant intervenir la reconnaissance spécifique du CMH/peptide par le complexe TCR/CD3 et le co-récepteur CD4, et un second dit de costimulation. La costimulation permet d'amplifier et de prolonger l'activation primaire par le TCR, mais également d'inhiber l'apoptose des cellules T après activation. Le TCR est composé de deux unités fonctionnellement distinctes. Un hétérodimère (αβ ou γδ) spécifique pour chaque lymphocyte est nécessaire à la reconnaissance antigénique. L'engagement du TCR avec son ligand CD3 initie une cascade de signaux intracellulaires qui résulte dans l'adhésion, la prolifération, la différenciation en cellules matures et l'augmentation de l'activité transcriptionnelle des gènes de cytokines, des récepteurs aux cytokines et des proto- oncogènes.
Une autre stratégie thérapeutique a également été proposée alliant les avantages de la thérapie génique et la mise en oeuvre d'anticorps spécifiques. La production par génie génétique d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps tels que les anticorps chimères, dans des cellules eucaryotes est maintenant une technique standard (EP 0 120 694 ou EP 0 125 023). Par exemple, la demande de brevet internationale WO 00/24896 décrit une méthode pour le traitement ou la prévention de cancer, reposant sur l'expression à la surface des cellules tumorales d'anticorps spécifiques du complexe TCR/CD3 dans le but d'induire une stimulation des cellules T et de la réponse immunitaire anti-tumorale. Toutefois, les données expérimentales montrent que cette approche est efficace dans le cas de certains modèles de cancer, permettant d'attirer les lymphocytes T et cellules dendritiques au niveau du site tumoral et ainsi d'induire un rejet de la tumeur greffée, ils montrent également que cette approche ne permet qu'une régression transitoire du volume tumoral et qu'aucune rémission complète chez les animaux traités n'a pu être obtenue.
Il est donc souhaitable de disposer de nouvelles compositions permettant notamment la mise en œuvre de traitements anti-tumoraux efficaces, aisés à mettre en place et permettant un contrôle prolongé du volume tumoral et une augmentation du taux de survie des patients traités. Le déposant a maintenant identifié de nouvelles compositions dont les différents constituants sont choisis de manière à obtenir un effet synergique de leurs activités respectives et des propriétés améliorées desdits constituants. Plus particulièrement, de telles compositions permettent un meilleur recrutement des différents effecteurs de la réponse immunitaire antitumorale (cellules T, NK, dendritiques, macrophages, ...) permettant ainsi d'inhiber ou de retarder la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose (mort cellulaire) des cellules cibles. La présente invention offre une alternative avantageuse et efficace aux approches de l'art antérieur, notamment pour traiter ou prévenir le cancer de l'homme ou de l'animal.
La présente invention concerne en premier lieu un matériel biologique comprenant au moins une première et au moins une seconde séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans une cellule hôte, selon lequel :
- ladite première séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un anticorps, caractérisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule,
- ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et dans l'activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper. Selon un cas préféré, ledit polypeptide est sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation.
Par «séquence d'acide nucléique», on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un ADNc ; un ADN génomique ; un ADN plasmidique ; un ARN messager.
Selon l'invention, ladite «première séquence d'acide nucléique» code notamment tout ou partie d'un anticorps natif, ou pour un dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface de la cellule hôte dans laquelle une dite première séquence d'acide nucléique a été introduite et en ce que ledit anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule. Plus particulièrement, par «fragment» d'anticorps on entend désigner les fragments F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv (Blazar et al., 1997, J. of Immunology, 159, 5821- 5833 ; Bird et al., 1988, Science, 242, 423-426) et dAbs (Ward et al., 1989, Nature, 341, 544) d'un anticorps natif qu'il soit d'origine polyclonale ou monoclonale (voir par exemple Monoclonal Antibodies : A manual of Techniques and Applications H. Zola (CRC Press, 1988) et Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, J. Hurrell (CRC Press, 1982)). Par ailleurs, une revue générale des techniques concernant la synthèse de fragments d'anticorps qui retiennent la spécificité de liaison de l'anticorps natif est accessible dans Winter et al. (1991, Nature, 349, 293-299). Par «dérivé» d'anticorps on entend désigner par exemple un dérivé chimérique d'un tel anticorps (voir par exemple les chimères les anticorps anti CD3 Souris/Homme dans Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657-662 ou les immunotoxines telles que sFv-toxine de Chaudary et al., 1989, Nature, 339, 394-397).
Par «anticorps exprimé à la surface de la cellule hôte», on entend désigner un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules hôtes pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps utilisés dans le cadre de la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant au moins les acides aminés définissant ladite région fonctionnelle et un peptide capable de conférer à l'anticorps une localisation transmembranaire dans la cellule hôte. Le terme «localisation transmembranaire » fait référence à un ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule hôte ou à la surface externe de cette bi-couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux peptides transmembranaires sont décrites dans la littérature. Avantageusement, ledit peptide transmembranaire est isolé ou dérive d'une glycoprotéine, d'une lipoprotéine, ou d'un récepteur membranaire. Selon un cas préféré de l'invention, le peptide transmembranaire est isolé d'une glycoprotéine telle que la glycoprotéine F du virus de la rougeole (brevet européen EP 0 305 229), le CD4 (Weijtens et al., 1998, Gène Therapy, 5, 1195-1203), la gpl60 du virus VIH (Polydefkis et al, 1990, J. Exp. Med., 171, 875-887), le Fc (voir ci-après) et plus particulièrement la glycoprotéine du virus de la rage (demande de brevet français FR 97 09152).
Selon un cas tout à fait avantageux, la première séquence d'acide nucléique contient un gène codant pour la chaîne lourde dudit anticorps fusionnée avec la séquence d'acide nucléique codant pour un peptide transmembranaire tel que défini ci-dessus. En outre, la première séquence d'acide nucléique peut contenir un gène codant pour la chaîne légère dudit anticorps. L'expression des chaînes lourdes et légères peut être contrôlée par des éléments de régulation indépendants mais il est également possible d'avoir recours à des éléments communs (cassette bicistronique) et éventuellement, de réinitier la traduction du second cistron (par exemple les séquences codant pour la chaîne légère) au moyen d'un IRES (WO 98/49334).
Selon l'invention, l'anticorps exprimé à la surface des cellules hôtes est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, notamment un lymphocyte T helper CD4, et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, et plus particulièrement à un récepteur directement impliqué dans un tel procédé. Comme cela est décrit précédemment, ce phénomène d'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper est un élément déterminant de la réaction immunitaire à médiation cellulaire. Toutefois, il convient de remarquer que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, il n'est pas indispensable que le procédé d'activation ait lieu après la fixation par l'anticorps exprimé à la surface des cellules hôtes. En effet, conformément à l'invention, cet anticorps peut également se lier aux polypeptides présents sur des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes helper déjà activés.
Par «cellule effectrice cytotoxique», on entend désigner les macrophages, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses (NK), ainsi que leurs cellules dérivées telles que par exemple les LAK, (Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244- 247 ; Brittende et al., 1996, Cancer, 77, 1226-1243 ; Poplack et al., 1976, Blood, 48, 809- 816). Par «lymphocyte T helper», on entend désigner notamment les CD4 qui permettent après activation la sécrétion de facteurs d'activation des cellules effectrices de la réponse immune (voir plus avant). Les polypeptides, et notamment les récepteurs, exprimés à la surface de ces cellules et qui sont impliqués dans l'activation de telles cellules consistent notamment en tout ou partie du complexe TCR, plus particulièrement le TCR-α, le TCR-β ou le CD3, tout ou partie des complexes CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28, 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, tout ou partie des récepteurs de cytokines (Finke et al., 1998, Gène Therapy, 5, 31-39), telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 ou GM-CSF, tout ou partie du complexe récepteur des cellules NK tel que par exemple Nαl4NKT (Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693), NKAR, Nkp46 (Pessino et al., 1998, J. Exp. Med., 188, 953- 960), Nkp44, tout ou partie des récepteurs de macrophages tels que par exemple le récepteur Fc (Deo et al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135). Selon un mode de réalisation particulier, il est également possible d'envisager de modifier génétiquement, notamment in vivo, les cellules effectrices cytotoxiques ou les lymphocytes T helper de façon à ce qu'elles expriment à leur surface un polypeptide, naturellement non exprimé par ces cellules, et capable d'induire le procédé d'activation de telles cellules, par l'introduction dans ces cellules de séquences d'acide nucléique renfermant le gène codant pour un tel polypeptide. Conformément à la présente invention, il est alors possible de sélectionner une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps susceptible d'être exprimé à la surface des cellules cibles du patient à traiter, ledit anticorps étant capable de se fixer à un tel polypeptide naturellement non exprimé par ces cellules effectrices cytotoxiques ou lymphocytes T helper. Plus particulièrement, la présente invention repose sur la possibilité de cloner les gènes codant pour tout ou partie d'un anticorps et d'exprimer ledit anticorps dans des cellules après transfert desdits gènes dans lesdites cellules à partir de vecteurs d'expression conventionnels (voir ci-après). La littérature propose un grand nombre d'exemples de gènes codant pour des anticorps capables de réagir avec de tels polypeptides ou récepteurs. Il est à la portée de l'homme de l'art d'obtenir les séquences d'acide nucléique codant pour de tels anticorps. Citons pour exemple les gènes codant pour les chaînes légère et lourde de l'anticorps YTH 12.5 (anti CD3) (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21, 2717-2725), de l'anti CD3 selon Arakawa et al. (1996, J. Biochem., 120, 657-662). Les séquences d'acide nucléique de tels anticorps sont aisément identifiables à partir des bases de données communément utilisées par l'homme du métier.
A titre illustratif, on peut également citer les hybridomes suivants comme étant particulièrement appropriés pour isoler la première séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus :
- hybridome TR310 (rat anti-Nβ7 murin (IgG2b) ; ATCC HB-219 ; I. L.Weissman ; fusion myélomes murin/splénocytes rat) ; - hybridome H57-597 (hamster anti-TCRαβ murin (IgG) ; ATCC HB-218 ; Kubo et al., 1989, J. Immunology, 142, 2736-2742 ; fusion myélomes murin/splénocytes hamster) ;
- hybridome KT3 (rat anti-CD3ε, murin (IgG2a) ; Tomonari et al., 1988, Immunogenetics, 28, 455-458 ; fusion myélomes murin/splénocytes rat). Les séquences d'acide nucléique codant pour les chaînes lourdes et/ou légères de ces différents anticorps peuvent être obtenues par les méthodes conventionnelles dans le domaine de l'art, notamment d'amplification (PCR, RT-PCR, ...), de clonage à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou les techniques mettant en oeuvre des banques de cADΝ (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C.S.H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), à partir d'hybridomes disponibles auprès de collections habilitées (comme l'ATCC) et qui sécrètent des anticorps spécifiques de polypeptides présents à la surface de cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper et impliqués dans le procédé d'activation de telles cellules (par exemple un hybridome excrétant des immunoglogulines Gγ2b+κ dirigées contre les récepteurs du TCR ou un de ceux cités ci-dessus). Les séquences ainsi clonées sont alors disponibles pour leur clonage dans des vecteurs. Comme mentionné précédemment, selon un cas préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour la chaîne lourde de l'anticorps est fusionnée avec la séquence d'acide nucléique codant pour un peptide transmembranaire tel que la glycoprotéine rabique. Les techniques de biologie moléculaire sont parfaitement décrites dans la demande de brevet français FR 97 09152).
Dans le cadre de la présente invention, la "seconde séquence d'acide nucléique" code pour tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit polypeptide est sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation. Au sens de la présente invention, la stimulation de la réponse immunitaire permet d'induire ou d'activer une réponse immune dirigée spécifiquement contre une cellule, notamment tumorale ou une cellule infectée par un virus ou d'inhiber la croissance et/ou la division d'une telle cellule. L'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper peuvent être définies par la capacité à augmenter la migration des cellules immunitaires vers le site d'expression d'une chimiokine pour développer ou prolonger une réponse immunitaire.
Au sens de la présente invention, le terme « chimiokine » peut être défini comme une cytokine à effet chimioattracteur (capacité à attirer des cellules immunitaires au site d'expression de ladite chimiokine). De préférence, la chimiokine en usage dans le cadre de la présente invention présente une ou plusieurs fonctions complémentaires, notamment l'activation des cellules immunitaires permettant de stimuler la réponse immune et/ou une fonction anti-angiogénique permettant d'inhiber la vascularisation au sein d'une tumeur. L'activité de chimioattraction d'un polypeptide donné, notamment dérivé de la chimiokine MIP, sur des cellules impliquées dans les réactions immunes (telles que par exemple des eosinophiles, des lymphocytes T, des monocytes ou des neutrophiles) peut être évaluée par un test de chimiotactisme (Maghazachi, 1993, Nature Immunity, 12, 57). De même, ce type de chimiokines inhibant, la prolifération des précurseurs hématopoïétiques, il est possible d'évaluer une telle propriété in vitro selon Graham et al. (1992, Growth Factors, 7, 151). Au sens de la présente invention, le terme « molécules de co-stimulation » fait référence à une molécule permettant d'amplifier une réponse immunitaire et/ou de prolonger l'état d'activation d'une cellule immune ou impliquée dans une réponse immunitaire, notamment en stabilisant le complexe TCR après la reconnaissance du peptide lié au CMH. L'activité de co-stimulation peut être évaluée par les techniques conventionnelles telles que celles décrites dans la partie exemple de la présente demande (par exemple en mesurant la prolifération de splénocytes naïfs après incorporation de thymidine H comme décrit au point 5 de l'exemple 2).
Dans le cadre de la présente invention, il est possible de mettre en œuvre une seconde séquence d'acide nucléique codant pour l'intégralité dudit polypeptide en question ou une partie seulement de ce polypeptide, ou un polypeptide dérivé ou muté, dans la mesure où la fonction et les propriétés en terme de stimulation de la réponse immunitaire, d'attraction au site d'expression et/ou d'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper sont conservées. Comme mentionné précédemment, le terme « mutation » fait référence à la délétion et/ou la substitution et/ou l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou toute combinaison de ce type de mutation. De même, il est envisageable d'utiliser une séquence codant pour un polypeptide hybride provenant de la fusion de séquences d'origines diverses (par exemple codant pour deux chimiokines différentes).
Parmi les chimiokines utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer RANTES (GenBank M21121), MIG (GenBank M34815), IL-8 (GenBank M28130), MCP-1 (GenBank X14788), BRAK (Frederick et al., 2000, Am. J. Pathol, 156, 1937-50 ; Sleeman et al., 2000, Int. Immunol., 12, 677-689) et MIP de type 1 (MIP-1) ou 2 (MIP-2). Une chimiokine préférée est une chimiokine de type MIP-1, et plus particulièrement sélectionnée parmi le groupe consistant en les chimiokines MIP- la et MlP-lβ dont les propriétés ont été mises en évidence par Wolpe et al. (1988, J. Exp. Med. 167, 570-581). MIP 1 α est produite par les lymphocytes T et les monocytes. Elle permet la chimioattraction des éosinophiles et des lymphocytes T au cours des infections des voies respiratoires ; des monocytes et des neutrophiles au cours d'arthrites rhumatoïdales, d'inflammations du système digestif ou de méningites d'origine bactérienne. En outre, elle inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Les séquences en nucléotidiques et acides aminés de MlPlα sont décrites dans Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894), dont le contenu est incorporé par référence dans la présente demande. MlP-lβ, dont les séquences en nucléotidiques et acides aminés sont décrites dans Brown et al. (1989, J. Immunol. 142, 679-88, dont le contenu est incorporé par référence dans la présente demande), est également produite par les lymphocytes T et les monocytes. Elle exerce ses propriétés chimioattractives sur les monocytes et les neutrophiles dans les cas arthrites osseuses et les méningites bactériennes. Comme MIP- la, elle inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Il existe des variants naturels desdites protéines MIP- la et MlP-lβ qui sont connus de l'homme de l'art et qui portent par exemple les noms GOS19, LD78, pAT464 , TY5 (de souris) ou SIS α (de souris) pour MIP- la et pAT744, Act-2, G-26, H- 400 (de souris) ou hSIS γ (de souris) pour MlP-lβ. Dans le cas particulier de MlP-lβ, on choisira de préférence la séquence correspondant à Act-2 (Lipes et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9704-9708, dont le contenu est incorporé ici en référence).
Parmi les molécules de co-stimulation utilisables dans le cadre de la présente invention, on préfère mettre en œuvre celles agissant sur la co-stimulation des cellules T et, notamment B7-1 (GenBank XM002948) et B7-H1 (GenBank AF 177937). La costimulation des cellules T diminue leur apoptose engendrée par le premier signal d'activation (AICD ; Activation-Induced Cell Death), en induisant l'expression de facteurs anti-apoptotiques comme Bcl-2, c-FLIP, Bcl-xL et en réduisant l'activité du complexe apoptotique Fas et de la procaspase-8. Elle permet également de favoriser la différenciation de cellules T activées en cellules mémoires. La présente invention concerne également toute autre molécule permettant ladite co-stimulation des cellules T.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la seconde séquence d'acide nucléique code pour un polypeptide sécrété de la cellule hôte. Les moyens pour obtenir la sécrétion d'un polypeptide hors de la cellule hôte sont connus de l'homme de l'art. On peut notamment mettre en œuvre un peptide signal qui peut être celui naturellement utilisé par le polypeptide en question (homologue) ou être hétérologue à ce polypeptide et isolé d'une protéine naturellement sécrétée. De nombreux peptides signal fonctionnels dans les cellules eucaryotes et, notamment mammifères, sont divulgués dans l'état de la technique.
Selon une autre variante de la présente invention par ailleurs préférée, le matériel biologique selon la présente invention comprend en outre au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.
Par « polypeptide ayant une activité cytotoxique », on entend désigner tout polypeptide capable d'inhiber la croissance et/ou la division d'une cellule hôte, en particulier tumorale (l'activité cytotoxique est alors appelée activité anti-tumorale) ou infectée (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antivirale, parasitaire ou bactérienne selon l'agent pathogène infectant). Selon un cas préféré, l'activité cytotoxique se traduit par la mort de ladite cellule. Selon un cas particulier, il serait également possible d'utiliser le matériel biologique selon la présente invention dans des cas pathologiques associés à une prolifération cellulaire, comme par exemple les phénomènes de restenose. L'activité cytotoxique d'un polypeptide donné, notamment à l'égard de cellules tumorales, peut être évaluée in vitro par la mesure de la survie cellulaire soit par des tests de viabilité à court terme (tel que par exemple le test au bleu tryptan ou MTT), soit par des tests de survie clonogénique (formation de colonies) (Brown et Wouters, 1999, Cancer Research 59, 1391-1399) ou in vivo par la mesure de la croissance des tumeurs (taille et/ou volume) dans un modèle animal approprié (Ovejera et Houchens, 1981, Semin. Oncol. 8, 386-393). Avantageusement, ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est choisi parmi les cytokines, les protéines codées par les gènes suicides et les facteurs protéiques anti- angiogéniques.
Lorsque ledit polypeptide est une cytokine, il s'agit préférentiellement d'une cytokine choisie parmi les interférons α, β et γ, les interleukines, et notamment l'IL-2, l'IL-4 l'IL-6, l'IL-7, ΓIL-IO, l'IL-12, 1TL-15, 1TL-18 ou riL-21, les facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et les facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF, ...).
Selon un mode de réalisation préféré, ladite cytokine est sélectionnée parmi l'interleukine-2 (IL-2) et l'interleukine-12 (IL-12). L'interleukine-2 est notamment responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, de la multiplication et de l'activation des cellules du système immunitaire (pour la séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09480). L'interleukine-12 a été identifiée et isolée dans les macrophages comme un facteur de stimulation des cellules T cytotoxiques et NK, qui induit la différenciation des lymphocytes T CD4+ en participant à l'homéostasie des populations Thl et Th2. Deux types cellulaires (cellules NK et NKT) sont impliqués dans l'activité antitumorale médiée par 1TL-12, suivant la dose utilisée ou son schéma d'injection.
Selon la seconde variante, le polypeptide produit d'expression d'un gène suicide présente au moins une activité enzymatique sélectionnée parmi l'activité thymidine kinase, l'activité purine nucléoside phosphorylase, l'activité guanine ou uracile ou orotate phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase. Ces polypeptides ne sont pas toxiques en tant que tels mais présentent des propriétés enzymatiques catalytiques capables de transformer une substance inactive (prédrogue), par exemple un nucléoside ou un analogue de nucléoside, en substance hautement toxique pour la cellule, par exemple un nucléoside modifié qui peut être incorporé dans les chaînes d'ADN ou d'ARN en élongation, avec pour conséquence, notamment, l'inhibition de la division cellulaire ou des dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort de la cellule renfermant de tels polypeptides. Les gènes codant pour de tels polypeptides sont dits «gènes suicides ». De nombreux couples gène suicide/prédrogue sont actuellement disponibles. On peut citer plus particulièrement la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 (TK HSN-1) et Pacyclovir ou le ganciclovir (GCN) (Caruso et al., 1993, Proc. Νatl. Acad. Sci., USA 90, 7024-7028 ; Culver et al., 1992, Science, 256, 1550-1552 ; Ram et al., 1997, Νat. Med., 3, 1354-1361) ; et la cytosine désaminase (CDase) et la 5-fluorocytosine (5-FC). Les gènes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et codA d'E. coli codant respectivement pour la CDase de ces deux organismes sont connus et leurs séquences publiées (ΕP 0402 108 ; Εrbs et al., 1997, Curr. Genêt. 31, 1-6 ; WO93/01281). Avantageusement, la CDase est employée de manière associée à l'enzyme uracilephosphoribosyl transférase (UPRTase) qui a la propriété de convertir le 5-FU produit par l'action de la CDase en 5-FUMP hautement toxique. Les gènes upp et FUR1 codant pour l 'UPRTase respectivement d'E. coli et de S. cerevisiae ont été clones et séquences (Andersen et al., 1992, Εur. J. Biochem., 204, 51-56 ; Kern et al., 1990, Gène 88, 149-157). Il est possible d'avoir recours à des mutants de ces produits d'expression de gènes suicides comme ceux décrits dans les demandes de brevet WO96/16183 et WO99/54481.
Selon un mode de réalisation préféré, le matériel biologique selon l'invention comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme transmembranaire et capable de fixer le complexe TCR et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour la chimiokine MlP-lβ. Un autre matériel biologique préféré comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme transmembranaire et capable de fixer le complexe TCR et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour la chimiokine BRAK. Selon un cas encore plus préféré, le matériel biologique inclut en outre au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant pour 1TL-2 ou 1TL-12. Bien entendu, les différentes séquences d'acide nucléique mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans la cellule hôte. De préférence, chaque séquence d'acide nucléique peut être dirigée par des éléments (identiques ou différents, homologues ou hétérologues vis-à-vis de la séquence d'acide nucléique en question, constitutifs ou inductibles) qui lui sont propres mais il est possible d'avoir recours à des éléments communs pour diriger l'expression de deux, voire des trois, séquences d'acide nucléique mises en œuvre dans le cadre de la présente invention. Dans ce cas, on peut avoir recours à des séquences fusionnées ou à des IRES pour réinitier la traduction des cistrons.
Par «éléments assurant l'expression», on entend désigner les éléments nécessaires afin d'assurer l'expression de la séquence d'acide nucléique après son transfert dans une cellule cible. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule. Le promoteur utilisé peut être un promoteur viral ou cellulaire, ubiquitaire ou spécifique de tissu ou encore un promoteur synthétique. Bien entendu, il peut être modifié par rapport à la séquence promotrice native afin d'inclure ou déléter un ou plusieurs sites de restriction ou encore déléter des séquences négatives réduisant les niveaux de transcription, etc..
A titre d'exemples, on mentionnera les promoteurs viraux, notamment des virus RSN (Rous Sarcoma Virus), SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus), les promoteurs adénoviraux précoces (Ela, E3, ...) et tardifs (MLP pour Major Late Promoter), les LTRs rétroviraux (comme celui du virus MLV pour Murine Leukemia Virus) et le promoteur TK-HSV-1. Dans le cadre d'un vecteur poxviral, les promoteurs utilisables peuvent être choisis parmi les promoteurs 7.5K, H5R, TK, p28, pl i, K1L du virus de la vaccine ainsi que les promoteurs hybrides précoces-tardifs et les promoteurs synthétiques (Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23, 1094-1097 ; Hammond et al., 1997, J. Virological Methods 66, 135-138 ; Kumar et Boyle, 1990, Virology 179, 151-158). II est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices. On peut citer plus particulièrement les promoteurs des gènes MT (métallothionéine ; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), et ceux codant pour l'α-1 antitrypsin, le CFTR, le surfactant pulmonaire, les immunoglobulines, la créatine kinase musculaire, la β-actin, SRα, la protéine SM22 (Moessler et al, 1996, Development, 122, 2415-2425) et la desmine (WO 96/26284). On peut également mettre en œuvre un promoteur activable dans les cellules en division, par exemple gouvernant la transcription des gènes surexprimés dans les cellules tumorales. A cet égard, on mentionnera les promoteurs des gènes codant pour MUC-1 surexprimé dans le cancer du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), pour CEA (Carcinoma Embryonic Antigen) surexprimé dans le cancer du colon (Schrewe et al, 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 2738-2748), pour ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gène Therapy 1, 170-175) et pour l'α-foetoprotéine surexprimé dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res., 57, 461-465). Par ailleurs, les éléments assurant l'expression peuvent également inclure des séquences dites enhancer, LCR (pour Locus Control Région) permettant d'améliorer ou de stabiliser l'expression de la séquence d'acide nucléique dans la cellule hôte ou de conférer une expression tissu-spécifique. Les éléments assurant l'expression desdites séquences d'acide nucléique peuvent également comprendre des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration, pour la transcription ou la traduction. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de tels éléments de régulation. De même, les séquences d'acide nucléique utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent comprendre des séquences «neutres» ou introns qui ne nuisent pas à la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature (WO 94/29471). Par ailleurs, les acides nucléiques utilisables selon la présente invention peuvent également être des acides nucléiques modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des acides nucléiques stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine, qui en tant que tels n'ont pas d'effet sur l'efficacité de la transfection. Lesdites séquences d'acides nucléique peuvent être contrôlées par des éléments identiques ou différents, être situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que leur expression dans la cellule hôte ne soit pas affectée.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le matériel biologique selon l'invention est sous la forme d'ADN ou d'ARN nu, c'est-à-dire libre de tout composé facilitant son introduction dans les cellules (transfert de séquence d'acide nucléique).
Toutefois, afin de favoriser leur introduction dans les cellules hôtes et ainsi l'obtention de cellules hôtes génétiquement modifiées, lesdites première et seconde (et optionnellement troisième) séquences d'acide nucléique du matériel biologique selon l'invention peuvent être comprises dans au moins un vecteur permettant leur transfert dans la cellule hôte. Comme déjà mentionné, elles peuvent être comprises dans un même vecteur ou, selon un mode de réalisation préféré, dans des vecteurs indépendants permettant leur transfert dans la cellule hôte.
Dans ce contexte, selon l'invention, un tel vecteur pourra être un plasmide. Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement. Toutefois, il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gène, 57, 193-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNAl si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol, 5, 2533-2542 ; Yates et al., 1985, Nature 313, 812-815). Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique, ...). Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).
De préférence, les vecteurs mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont des vecteurs viraux, par exemple sélectionnés parmi les vecteurs adénoviraux, rétroviraux, poxviraux, notamment dérivés du virus de la vaccine (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266 and 517-563 ; Johnson et al., 1993, Virol., 196, 381-401), du Modifed Virus Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol., 244, 365-396) ou du canarypox, ou des vecteurs dérivés des virus de l'herpès, alphavirus, foamyvirus ou virus associé à l'adénovirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif et non intégratif. Toutefois, il convient de noter ici que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, la nature du vecteur revêt peu d'importance car le transfert n'intervient que pour permettre le transfert des séquences (première, deuxième, voire troisième) d'acides nucléiques à l'intérieur des cellules hôtes. De tels modèles de transfert son largement utilisés dans la littérature.
La technologie de base pour insérer une séquence d'acide nucléique et ses éléments de régulation dans un génome poxviral est décrite dans de nombreux documents accessibles à l'homme de l'art (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology, 153, 545-563 ; US 4,769,330 ; US 4,772,848 ; US 4,603,112 ; US 5,100,587 et US 5,179,993). Cette technique est basée sur la recombinaison homologue entre les séquences communes présentes dans le génome viral et un plasmide de transfert portant la séquence d'acide nucléique à transférer. Le site d'insertion dans le génome poxviral est de préférence constitué par un locus non essentiel. De tels locus non essentiels résident dans les régions intergéniques non codantes ou au sein d'un gène dont la délétion ou la non fonctionnalité n'affecte pas ou peu la croissance virale, la réplication ou l'infection. On peut également envisager l'insertion dans un locus essentiel à condition que la fonction touchée soit complémentée en trans pendant la production des particules virales, au moyen par exemple d'une lignée de complémentation ou d'un virus auxiliaire (helper) portant les séquences codant pour la fonction déficiente. S'agissant d'un virus de la vaccine de la souche Copenhagen, un site d'insertion préféré est localisé au sein du gène thymidine kinase (TK) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3411-3415 ; Weir et al, 1983, J. Virol, 46, 530-537). S'agissant d'un vecteur MVA, l'insertion de la séquence d'acide nucléique se fera au sein d'une des délétions I à VII, et, de préférence, au sein de la délétion II ou III (Meyer et al, 1991, J. Gen. Virol, 72, 1031-1038 ; Sutter et al, 1994, Vaccine, 12, 1032- 1040). Les conditions pour construire un virus de la vaccine recombinant sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple EP 83 286 et EP 206 920 pour le virus de la vaccine, et Mayr et al, 1975, Infection, 3, 6-14 et Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851 pour MVA).
Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un rétrovirus recombinant selon l'invention comporte généralement les séquences LTR, une région d'encapsidation et au moins une des séquences d'acide nucléique en usage dans le cadre de l'invention, placée sous le contrôle du LTR rétroviral ou d'un promoteur interne tels que ceux décrits ci-après. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, félin, humain, etc.) et en particulier du MoMuLV (Moloney murine leukemia virus ; Gilboa et al, 1988, Adv. Exp. Med. Biol, 241, 29), MVS (Murine sarcoma virus) ou Friend murine rétrovirus (Fb29 ; WO 95/01447). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12, etc.). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTR (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203 et US 5,747,323).
On pourra également avoir recours à un vecteur adénoviral. Il peut être non défectif mais de préférence replicatif d'une manière conditionnelle (CRAd ; Heise et Kirn, 2000, J. Clin. Invest, 105, 847851 ; Alemany et al, 2000, Nature Biotechnology, 18, 723- 727 ; Hernandez-Alcoceba et al, 2000, Human Gène Ther, 11, 2009-2024) ou défectif pour la réplication, c'est-à-dire dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions El, E2, et E4. Une délétion de la région El est préférée. Mais elle peut être combinée à d'autres modification(s)/délétion(s) touchant notamment tout ou partie des régions E2, E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont complémentées en trans au moyen d'une lignée de complémentation et/ou d'un virus auxiliaire afin d'assurer la production des particules virales d'intérêt. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales WO 94/28152 et WO 97/04119). A titre illustratif, la délétion de la majorité de la région El et de tout ou partie de l'unité de transcription E4 est tout particulièrement avantageuse (EP 974 668). Dans le but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adénoviral peut en outre être dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle. Selon une autre alternative, on peut mettre en oeuvre un vecteur adénoviral minimal retenant les séquences essentielles à l'encapsidation, à savoir les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d'encapsidation. Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine, simienne, ...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adéno virus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al, Arch. Virol, 1993, 128:171-176 ; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol, 1989, 70:165-172 ; Jouvenne et al. Gène, 1987, 60:21-28 ; Mittal et al, J. Gen. Virol, 1995, 76:93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO 96/17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de complémentation (voir par exemple Graham et Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, vol. 7, p 109-128 ; Ed. : E.J. Murey, The Human Press Inc.).
Selon un cas préféré, la première séquence d'acide nucléique est portée par un vecteur poxviral dérivé de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine et la seconde séquence d'acide nucléique est portée par un vecteur adénoviral. Lorsque le matériel biologique selon l'invention comprend une troisième séquence d'acide nucléique, celle-ci est de préférence portée par un vecteur adénoviral.
On indique que dans le cadre de la présente invention, le terme « matériel biologique » comprend le vecteur viral (génome recombinant) et les particules virales infectieuses comprenant ledit vecteur viral. Une telle particule virale peut être générée à partir d'un vecteur viral selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art. Sa propagation est effectuée notamment dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences dudit vecteur. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à une lignée de complémentaion telle que décrite dans la demande WO 94/28152, à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), la lignée A549- El (Imler et al, 1996, Gène Therapy 3, 75-84) ou une lignée permettant une double complémentation (Yeh et al, 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gène Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al, 1995 Gène Therapy 2, 775-783 ; demande internationale WO 97/04119). On peut également employer des virus auxiliaires pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives. Par cellule de complémentation, on entend une cellule capable de fournir en trans les facteurs précoces et/ou tardifs nécessaires à l'encapsidation du génome viral dans une capside virale pour générer une particule virale contenant le vecteur recombinant. Ladite cellule peut ne pas complémenter à elle seule toutes les fonctions défectives du vecteur et dans ce cas peut être transfectée/transduite par un vecteur/virus auxiliaire apportant les fonctions complémentaires. Les particules virales contenant des vecteurs poxviraux sont préparées par infection de cellules permissives (par exemple des fibroblastes primaires d'embryons de poulet) selon les techniques de l'art largement détaillées dans les documents cités dans le domaine des poxvirus. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel :
(i) on introduit un matériel biologique selon l'invention dans une cellule, notamment une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une dite cellule transfectée, (ii) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et
(iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également à partir des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules (lyse chimique, congélation/décongélation, chocs osmotiques, chocs mécaniques, sonication, etc.), pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium, ...).
Selon une variante, le vecteur mis en œuvre selon l'invention peut être un vecteur non-viral tel que par exemple un vecteur consistant en au moins une dite séquence d'acide nucléique ou un vecteur plasmidique tel que défini ci-dessus, complexé ou conjugué à au moins une molécule ou substance porteuse sélectionnée parmi le groupe consistant en un amphiphile cationique, notamment un lipide cationique, un polymère cationique ou neutre, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, l'éthanol, la 1-méthyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, et un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO), le diéthylsulfoxide, le di-n-propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacétamide, la tétraméthylurée, Pacétonitrile ou leurs dérivés.
D'une manière générale, les lipides cationiques ont une grande affinité pour les acides nucléiques et ont la capacité d'interagir avec la membrane cellulaire (Felgner et al, 1989, Nature, 337, 387-388). Les lipides cationiques qui conviennent tout particulièrement à la mise en œuvre de la présente invention comprennent notamment le DOTMA (Felgner et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417), le DOGS or Transfectam™ (Behr et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986), le DMRIE or DORIE (Felgner et al, 1993, Methods, 5, 67-75), le DC-CHOL (Gao and Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), le DOTAP™ (McLachlan et al, 1995, Gène Therapy, 2, 674-622), la Lipofectamine™ et les composés glycérolipides (voir par exemple EP 901 463 et WO 98/37916).
Les polymères qui conviennent à la mise en œuvre de l'invention sont de préférence cationiques, tels que la polyamidoamine (Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem, 4, 372-379), les polymères dendritiques (WO 95/24221), le polyéthylène imine ou le polypropylène imine (WO 96/02655), la polylysine (US 5,595,897 ou FR 2 719 316), le chitosan (US 5,744,166) ou le DEAE dextran (Lopata et al, 1984, Nucleic Acid Res, 12, 5707-5717).
Par ailleurs, les vecteurs mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent en outre comprendre des éléments de ciblage pouvant permettre de diriger le transfert desdites séquences d'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus particuliers (cellules tumorales, cellules de l'épithélium pulmonaire, cellule hématopoïétique, cellule musculaire, cellule nerveuse, ...). Ils peuvent également permettre de diriger le transfert d'une substance active vers certains compartiments intracellulaires préférés tels que le noyau et les mitochondries. Il peut en outre s'agir d'éléments facilitant la pénétration à l'intérieur de la cellule ou la lyse des endosomes. De tels éléments de ciblage sont largement décrits dans la littérature. Il peut par exemple s'agir de tout ou partie de lectines, de peptides, notamment le peptide JTS-1 (voir demande de brevet WO 94/40958), d'oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogéniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés. En particulier, il peut s'agir de résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur des asialoglycoprotéines à la surface des cellules hépatiques, de ligands pouvant interagir avec des récepteurs tels que des récepteurs de facteurs de croissance, des récepteurs de cytokines, de lectines, de protéines d'adhésion, il peut également s'agir d'un fragment d'anticorps tel que le fragment Fab, d'un peptide fusogénique INF-7 dérivé de la sous unité HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al, 1994, J. Biol. Chem, 269, 12918-12924), d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr. Parmi les cellules de mammifère que l'invention se propose d'éliminer ou de limiter dans leur progression, on peut citer plus spécifiquement les cellules tumorales, les cellules infectées par un agent pathogène viral, parasitaire ou encore bactérien. Selon l'invention, l'expression à la surface de ces cellules de tout ou partie d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, permet de diriger la réponse immune cytotoxique vers une cible donnée, et plus particulièrement de diriger cette réponse au niveau d'une tumeur ou d'un foyer infectieux.
A titre d'agent pathogène viral, on peut par exemple citer le virus VIH, EBV, CMV, les virus de l'hépatite B et C et les papillomavirus. A titre d'agent pathogène parasitaire, on peut par exemple citer Leishmania lesmaniae et Plasmodium falciparam. L'invention concerne également une cellule hôte comprenant un matériel biologique selon l'invention. Il s'agit de préférence d'une cellule de mammifère tumorale ou d'une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène viral ou d'une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène bactérien.
Avantageusement, la cellule hôte selon l'invention n'exprime pas naturellement ladite première séquence d'acide nucléique (codant pour un anticorps). Préférentiellement, une dite cellule est présente sous une forme permettant son administration dans l'organisme d'un mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable et ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par introduction :
- d'au moins une dite première séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un anticorps, caractérisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, et
- d'au moins une dite seconde séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide permettant l'activation de la réponse immunitaire et/ou la chimioattraction d'une cellule effectrice cytotoxique et/ou d'un lymphocyte T helper. Selon un cas préféré, ledit polypeptide est sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation, et
- de manière optionnelle au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.
Plus particulièrement, ladite cellule hôte provient soit du mammifère à traiter, soit d'un autre mammifère que celui à traiter. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule hôte aura subi un traitement la rendant compatible avec le mammifère à traiter. Selon un cas préféré, par «mammifère» on entend désigner un mammifère humain. Un tel matériel biologique, lorsqu'il est administré à un patient, et plus particulièrement administré par voie intratumorale, est capable d'induire ou stimuler chez celui-ci une réponse immunitaire à médiation cellulaire pouvant conduire à la production de cytokines et à l'effet cytotoxique des cellules effectrices qui se traduisent non seulement par l'élimination des cellules administrées mais également à l'élimination des cellules voisines présentant les antigènes, notamment tumoraux, susceptibles d'être reconnus par lesdites cellules effectrices cytotoxiques activées.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention, caractérisé en ce que l'on introduit par tout moyen approprié dans une cellule de mammifère lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique telles que décrites ci-dessus, et, de manière optionnelle, ladite troisième séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans ladite cellule hôte, puis en ce que l'on sélectionne parmi ces cellules celles génétiquement modifiées par lesdites séquences d'acide nucléique.
L'invention concerne par ailleurs l'utilisation d'un matériel biologique ou d'une cellule selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de cancers ou d'infections virales. Plus particulièrement, l'invention porte sur la co-utilisation d'une part, d'une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps exprimé à la surface de ladite cellule cible et capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule et, d'autre part, d'une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide de type chimiokine ou molécule de co-stimulation, impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper, pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à traiter un mammifère par transfert de gène. L'invention concerne également l'utilisation desdites première et seconde séquences d'acide nucléique et d'une troisième séquence d'acide nucléique codant pour polypeptide ayant une activité cytotoxique. Une utilisation préférée concerne (i) un vecteur ou une particule virale MVA comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'anticorps KT3 exprimé de manière transmembranaire, (ii) un vecteur ou une particule adénovirale comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour le variant Act-2 de la chimiokine MlP-lβ et (iii) un vecteur ou une particule adénovirale comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'IL-2 ou lTL-12.
Pour la mise en oeuvre de l'utilisation thérapeutique mentionnée dans la présente invention, il est possible de disposer de compositions pharmaceutiques comprenant un matériel biologique ou une cellule tel que précédemment décrit, avantageusement associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour l'administration à l'homme ou à l'animal. L'utilisation de tels véhicules est décrite dans la littérature. Ce véhicule pharmaceutiquement acceptable est préférentiellement isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, ladite composition peut contenir des solvants, des véhicules aqueux ou partiellement aqueux tels que de l'eau stérile, libre d'agent pyrogène et des milieux de dispersion par exemple. Le pH de ces compositions pharmaceutiques est convenablement ajusté et tamponné selon les techniques conventionnelles.
Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple dans une tumeur accessible ou à sa périphérie, par voie intraveineuse, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules hôtes au mammifère à traiter (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, etc.), à les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et à les réadministrer audit mammifère.
Le matériel biologique selon l'invention peut être administré in vivo notamment sous forme injectable, notamment par voie intratumorale. On peut également envisager une injection par voie intratrachéale, intranasale, épidermique, intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intramusculaire, intrapleurale, intrapéritonéale, intracérébrale par seringue ou tout autre moyen équivalent. Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou l'aérosolisation, par voie topique, par administration orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art et applicable à la présente invention. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage les mieux appropriés varient en fonction de différents paramètres tels que par exemple l'individu ou la maladie à traiter, ou encore de l'acide nucléique à transférer ou de l' organe/tissus hôte. A titre indicatif, les compositions à base de particules virales peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 iu (unités infectieuses) ou pfu (particules formant des plages), de préférence 106 à 1012 iu ou pfu et, de manière tout à fait préférée, 107 à 1011 iu ou pfu. Pour ce qui est des compositions à base de vecteur plasmidique, des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, de 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées.
Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomavirus), de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'œsophage, du larynx, du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie). Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose). Enfin, pour ce qui est des maladies infectieuses, l'application au SIDA, hépatites, cancers induits par les virus (rétrovirus, papillomavirus, etc.) peut être envisagée. Une composition selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives et d'origine infectieuse précitées.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention peut être utilisée en association avec au moins un composé naturellement responsable de la co-stimulation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes
T helper. Selon ce mode de réalisation, on peut envisager d'administrer ladite composition avec un polypeptide de type cytokine ou chimiokine, par exemple 1TL-2 ou 1TL-12.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement et la prévention des maladies par transfert de gène (thérapie génique), caractérisée en ce que l'on administre à un organisme ou à une cellule hôte notamment de mammifère, ayant besoin d'un tel traitement un matériel biologique ou une cellule hôte selon l'invention. Lorsque la méthode de traitement met en œuvre un matériel biologique ou une cellule hôte comprenant une troisième séquence d'acide nucléique codant pour un gène cytotoxique de type gène suicide, la méthode de traitement comprend également une étape supplémentaire selon laquelle on administre des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique de la prédrogue agissant en concert avec le gène suicide retenu. S'agissant d'un gène codant pour l'enzyme CDase et/ou UPRTase, on emploie de préférence un analogue de la cytosine tel que la 5-FC. A titre indicatif, une dose de 50 à 500 mg/kg/jour peut être employée avec une préférence pour 200 mg/kg/jour. Dans le cadre de la présente invention, la prédrogue est administrée selon les pratiques standards et ceci de manière préalable, concomitante ou encore postérieure à celle de l'agent thérapeutique selon l'invention. La voie orale est préférée. On peut administrer une dose unique de prédrogue ou des doses répétées pendant un temps suffisamment long pour permettre la production du métabolite toxique au sein de l'organisme ou de la cellule hôte. Selon une mode avantageux de l'invention, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement peut être associée à un second traitement du patient par chirurgie (notamment par ablation de la tumeur partiellement ou totalement), par radiothérapie ou chimiothérapie. Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit second traitement. De manière préférée, ce traitement sera appliqué suite audit second traitement.
Par ailleurs, pour améliorer l'effet anti-tumoral, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement selon l'invention peut être associée à un traitement supplémentaire du patient par des molécules visant à réduire la réponse inflammatoire induite au site tumoral (par exemple un composé vasoactif comme la sérotonine) ou une molécule inhibitrice des formes réactives de l'oxygène (par exemple l'histamine). Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit traitement supplémentaire du patient.
Le contenu de l'état de la technique cité dans la présente demande, y compris les demandes de brevet publiées, les brevets, les publications et les séquences identifiées par un numéro d'accession de banque de données est incorporé par référence dans la présente demande.
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif.
La figure 1 est une représentation schématique des stratégies combinées mettant en oeuvre le vecteur MVA-KT3 et les vecteurs Ad-cytokines et/ou Ad-chimiokines dans le modèle RenCa. Le protocole d'injection est de 2x10 iu d'adenovirus injectées à JO, J2 et J4 et 2x107 pfu de virions MVA injectés à J2, J3 et J4. Les valeurs statistiques sont calculées entre les 2 courbes reliées par une accolade (logiciel Statistica 5.1, Mat&Met). Une valeur p<0,05 est considérée comme statistique.
La figure 2 est une représentation schématique des stratégies combinées mettant en oeuvre le vecteur MVA-KT3 et les vecteurs Ad-cytokines et/ou Ad-chimiokines dans le modèle RenCa. Le protocole d'injection est de 1x10 iu d'adenovirus injectées à J0, Jl et J2 et lxl O7 pfu de virions MVA injectés à J2, J3 et J4. Les valeurs statistiques sont calculées entre les 2 courbes reliées par une accolade (logiciel Statistica 5.1, Mat&Met). Une valeur p<0,05 est considérée comme statistique.
EXEMPLES
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al, (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de recombinaison homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol, 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genbank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites et cultivées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. I. Modèles tumoraux
Trois modèles de cellules tumorales ont été choisis afin d'évaluer l'activité de la composition de l'invention : P815 (mastocytome H-2d, décrite dans Dunn et al, 1957, J. Natl. Cancer Inst, 18, 587-590), B16FO (mélanome H-2b, décrite dans Wu et al, 1996, Cancer Res, 56, 21-26) et RENCA (carcinome rénal H-2d, décrite dans Murphy et al, 1973, J. Natl. Cancer Inst, 50, 1013-1025).
Afin d'établir des tumeurs dans des souris, les cellules tumorales P815, B16F10 ou RENCA sont trypsinées, lavées 3 fois dans du PBS et resuspendues à 3 x 10 cellules/ml. 100 μl de cette suspension cellulaire sont alors injectés dans le flanc droit de souris immunocompétentes B6D2 [(C57BL/6 x DBA/2)F1] âgées de 6-7 semaines. Après l'apparition d'une tumeur de volume palpable compris entre 5 et 25 mm3, chaque souris reçoit trois injections (100 μl) intratumorales d'une quantité définie de virus dans 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2. Chaque condition est évaluée dans des groupes de 10 souris. Le volume tumoral et la survie des souris sont déterminés 2 fois par semaine. Après un rejet primaire, les souris sont réinjectées sur le flanc opposé, avec la même dose de cellules tumorales (3E + 5 cellules/souris).
L'efficacité de la composition de l'invention administrée est contrôlée par la mesure de la taille des tumeurs ainsi que par la mesure du temps de survie des souris traitées avec le cas échéant un contrôle du statut immunologique de l'animal par ELISPOT, test CTL, .... Les animaux peuvent être ensuite soumis à un challenge contre latéral au cours duquel une dose létale de cellules tumorales est administrée à l'animal pré-traité. EXEMPLE 1 : Construction et fonctionnalité des vecteurs selon l'invention
1. Construction d'un MVA recombinant porteur de la première séquence nucléotidique codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme membranaire et capable de fixer le complexe TCR/CD3 présent à la surface des cellules T (voir WO 00/24896).
Le clonage des séquences codant pour l'intégralité des chaînes lourdes et légères des anticorps KT3 et H57 est décrit dans la demande internationale WO 00/24896. Les chaînes ainsi isolées sont sous-clonées par recombinaison dans un virus MVA recombinant renfermant la séquence d'acide nucléique codant pour la région transmembranaire du virus de la rage (Modified Vaccinia Ankara ; Antoine et al, 1998, Virology, 244, 365-396 et demande de brevet français FR 97 09152), afin d'obtenir le virus MVATG14240 exprimant l'anticorps de rat KT3 (anti-CD3 epsilon de rat) et MVATG14237 exprimant l'anticorps de hamster H57-597 (anti TCR alpha/bêta de hamster). Les cassettes d'expression sont introduites dans la délétion II du MVA comme décrit dans la demande WO 00/24896. Brièvement, la chaîne légère des anticorps est placée sous le contrôle du promoteur early late p7.5 (Goebel et al, 1990, Virol, 179, 247-266). La séquence codant pour la chaîne lourde est placée sous le contrôle du promoteur early late pH5R (Goebel et al, 1990, Virol, 179, 247-266). L'extrémité C-terminale de la chaîne lourde est fusionnée avec le domaine transmembranaire et intracytoplasmique de la glycoprotéine rabbique afin de permettre l'ancrage de l'anticorps dans la membrane plasmique.
La production des anticorps KT3 et H57 dans les cellules infectées est vérifiée par Western blot et cytométrie de flux. Les résultats observés montrent qu'il y a bien expression d'immunoglobuline de type IgG de rat et de hamster à la surface des cellules infectées (voir exemple 2 de WO 00/24896). La fonctionnalité des virus MVA exprimant les anticorps anti TCR/CD3 est testée par tests de prolifération sur spénocytes murins. L'expression de l'anticorps KT3 ou H57 à la surface des cellules murines permet d'induire une forte prolifération de cellules T naïves (voir exemple 2 de WO 00/24896). EXEMPLE 2 : Construction et fonctionnalité des adénovirus recombinants 1. Construction des adénovirus recombinants.
Les gènes de chimiokines humaines utilisés ont été reconstitués par assemblage d'oligonucléotides suivant leur séquence publiée dans la base de données du "National Center for Biotechnology Information". Cette stratégie de clonage consiste en l'assemblage, en deux étapes, de 8 oligonucléotides d'environ 80 bases chacun. L'ensemble couvre la totalité de la séquence nucléotidique de l'ADNc des gènes MlP-lβ variant Act-2 (Accession: J04130, décrit dans la demande WO 00/74629, ci-après dénommé MIP-1 β), IP-10 (N° Accession: X02530), et DC-CK1 (N° Accession: AB000221). Le clonage des gènes codant l'IL-18 humaine (N° Accession: 4504652) et B7-H1 humain (N° Accession: AF177937) a été réalisé par RT-PCR à partir d'ARN de macrophages humains. L'IL-18 ne possède pas de séquence signal naturelle et n'est produite à l'état de protéine mature qu'après clivage par la caspase- 1. La séquence codant la protéine mature (nucléotides 108- 582) a donc été clonée en phase avec le peptide signal BM40 précédemment décrit (Yamaguchi et al, 1999, EMBO J, 18, 4414-1423). La chimiokine BRAK a été clonée sur la base de la séquence décrite par Frederick et al. (2000, Am. J. Pathol, 156, 1937-50) et Sleeman et al. (2000, Int. Immunol, 12, 677-689). Ces gènes ont été clones dans un vecteur de transfert adénoviral.
Les vecteurs de transfert exprimant les gènes de 1TL-2 humaine, des deux sous- unités de 1TL-12 murine (p40 et p35) séparées par un site d'entrée ribosomique (Interne Ribosome Entry Site), le mGM-CSF (séquence leader humaine en phase avec la séquence murine) et B7-1 murin ont été construits en insérant dans le vecteur de transfert la séquence clonée sur la base de la séquence publiée.
Le vecteur de transfert est constitué d'une cassette d'expression contenant les séquences promoteur/enhancer du cytomégalo virus humain (CMV), unintron chimérique β-globine/IgG humaine et une séquence de polyadénylation du virus SV40. Les séquences flanquantes de la région El (fragment 5' nucléotide (nt) 1 à 458 et fragment 3' nt 3328 à 5788) de l'adénovirus humain type 5 ont été placées de part et d'autre de cette cassette. Ces séquences permettent de générer un plasmide «infectieux» par recombinaison homologue, avec le génome adénoviral complet ΔE1/ΔE3 contenant le gène candidat, dans E.Coli (Chartier et al, 1996, J. Virol, 70, 4805-4810) Les adénovirus recombinants sont alors produits par transfection d'une digestion Pacl du plasmide « infectieux » dans une lignée de complémentation (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol, 36, 59-74) Un adénovirus recombinant ne contenant pas de transgène dans la cassette d'expression (Ad-vide) servira d'adenovirus témoin dans toutes les expériences. La propagation des virions, leur purification et la titration ont été réalisées selon les techniques standards (Lusky et al, 1998, J. Virol, 72, 2022-32). Les virus purifiés sont conservés à - 80°C dans 1M sucrose, 10 mM Tris-HCl pH8.5, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0,005 % Tween 80. 2. Lignées cellulaires et cellules primaires.
Les lignées tumorales murines P815, B16F0 et B 16F 10 ont été obtenues de l'ATCC (American Type Culture Collection ; Rockville, MD, USA). Les cellules P815 (N° ATCC: TIB-64) proviennent d'un mastocytome de souris DBA/2 (H2-Kd). Les B16- F10, hautement métastatiques, (ATCC, CRL-6475) proviennent d'un mélanome de souris C57BL/6J (H2-K ). Les cellules RenCa sont issues d'un carcinome rénal murin (BalB/cCr (H2-Kd)). La lignée tumorale A549 (ATCC, CCL-185) provient d'un carcinome pulmonaire humain. Des monocytes humains sont obtenus par leukaphérèse et élutriation. Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (Gibco-BRL) complémente avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) à 37°C, 5 % CO2. Les cellules microvasculaires dermales humaines (HDMEC) ont été cultivées comme préconisé par le fournisseur (PromoCell, Heidelberg, Allemagne).
3. Analyse de l'expression protéique in vitro.
La présence des protéines huIL-18, MlP-lβ, a été analysée sur des surnageants de culture de cellules A549 infectées pendant 48 h à une multiplicité d'infection (MOI) de 5. La quantification des surnageants a été réalisée par immunoessai (Quantikine; R&D Systems, Minneapolis, USA). L'expression in vitro des protéines huIP-10, huMIP-lβ et huIL-18, a été analysée sur des surnageants de culture de cellules HDMEC infectées pendant 48 h à une MOI de 50. En effet, les surnageants de HDMEC sont beaucoup moins riches en protéines contaminantes que ceux d'autres lignées cellulaires. La quantification des molécules recombinantes a été estimée sur gel de polyacrylamide 12 % (SDS-PAGE) coloré au bleu de Coomassie (Neuhoff et al, 1988, Electrophoresis, 9, 255-62).
4. Evaluation de la fonctionnalité in vitro des adénovirus recombinants.
Le test de chimiotactisme dérive de la méthode publiée par Senger et al. (1983,
Science, 219, 983-5) utilisant des chambres de migration de Boyden modifiées. Les membranes de chambres de migration de 6,5 mm de diamètre (TRANSWELL Corning
Costar Corporation, Badhoevedorp, Pays-Bas) contenant des pores de 5 μm sont inversées et recouvertes de collagène (SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) afin d'empêcher le passage des cellules (100 μg/ml). Après 60 minutes de polymérisation à température ambiante, les chambres sont rincées dans du PB S. Les membranes sont alors saturées à l'aide d'albumine sérique bovine (BSA ; 100 mg/ml; Sigma Alldrich), incubées durant 60 minutes à température ambiante puis rincées dans du PB S. Les surnageants des cellules infectées sont supplémentés de 10 mg/ml de BSA, sont déposés dans les puits à raison de 300 μl/puits et recouverts d'une cupule. 300 μl d'une suspension de 3 x 10 monocytes humains/ml sont ajoutés dans la partie supérieure de la cupule. Après 4 heures d'incubation, à 37°C, 5 % CO2, les cupules sont retirées des puits, le surnageant aspiré et la membrane est nettoyée 2 fois au PBS. Elle est ensuite colorée avec une solution de cristal violet 0,2 %, éthanol 2 % pendant 5 minutes, rincée au PBS et le nombre de cellules présentes déterminé au microscope optique.
5. Costimulation par l'expression membranaire de B7-H1.
La prolifération de splénocytes naïfs induite par la molécule de costimulation B7H-1 a été évaluée selon la technique décrite dans Dong et al. (1999, Nat. Med, 5, 1365-
1369). Brièvement, les cellules RENCA sont infectées à MOI 50 par l'Ad.huB7H-l puis traitées pendant 1 heure avec 50 μg/ml de mitomycine C (SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin
Fallavier, France). Parallèlement, des splénocytes naïfs sont préparés à partir d'une rate de souris DBA/2 (Paul et al, 1999, Cancer Immunol. Immunother, 48, 22-28). Après lavage, les cellules tumorales et les splénocytes sont co-cultivés. Les témoins positif et négatif consistent en des splénocytes activés avec 10 μg/ml de ConA ou non stimulés respectivement (R&D Systems, Minneapolis, USA). Après 96 heures à 37°C et 5 % CO2,
1 μCi de thymidine tritiée [3H]/puits est ajouté. La quantité de thymidine incorporée est mesurée après 8 heures en précipitant l'ADN cellulaire sur papier filtre glacé (PHD harvester, Cambridge Technologie, Plainfield, USA). La radioactivité émise est mesurée à l'aide d'un compteur β (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, USA).
6. Evaluation des stratégies combinatoires in vivo.
Afin d'établir des tumeurs dans des souris, les cellules tumorales P815, B16F10 ou RENCA sont trypsinées, lavées 3 fois dans du PBS et re-suspendues à 3 x 106 cellules/ml. 100 μl de cette suspension cellulaire sont alors injectés dans le flanc droit de souris immunocompétentes B6D2 [(C57BL/6 x DBA 2)F1] âgées de 6-7 semaines. Après l'apparition d'une tumeur de volume palpable compris entre 5 et 25 mm , chaque souris reçoit trois injections (100 μl) intratumorales d'une quantité définie de virus dans 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2. Chaque condition est évaluée dans des groupes de 10 souris. Le volume tumoral et la survie des souris sont déterminés 2 fois par semaine. Pour des raisons éthiques, les animaux sont sacrifiés lorsque le volume de la tumeur devient supérieur ou égal à 3000 mm3. Après un rejet primaire, les souris sont ré-injectées sur le flanc opposé, avec les cellules tumorales (3 x 105 cellules/souris). Les études statistiques sur les chiffres obtenus permettent de tracer une courbe de survie de type Kaplan-Meier. La signifiance statistique est calculée en utilisant le test exact de Fisher (Logiciel Statistica 5.1-Statsoft Inc., Tulsa, USA). Résultats.
7. Fonctionnalité des vecteurs adénoviraux in vitro. 7.1 Analyse de l'expression protéique in vitro
L'infection de ces cellules par les adénovirus codant les cytokines huIL-2, mIL-12, huIL-18 et mGM-CSF permet d'obtenir des taux de sécrétion compris entre 20 ng et 7 μg/ml/106 cellules/48 h. L'analyse sur gel de polyacrylamide de surnageants de HDMEC récoltés 48 h après infection avec les Ad-huMIPlβ, Ad-huIPlO, et Ad-huIL-18 permet de détecter des bandes de la taille attendue (MlP-lβ (6,7 kDa) huIP-10 (8,7 kDa) et de huIL-18 (18,2 kDa)). 7.2 Costimulation par l 'expression membranaire de B7-H1
La prolifération de splénocytes naïfs syngéniques induite par la molécule membranaire B7-H1 a été évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée. Dans ce but, des cellules RENCA ont été infectées par l' Ad- vide ou l'Ad-B7-Hl pendant 48 h, puis traitées à la mitomycine C afin de stopper leur prolifération. Les cellules infectées ont ensuite été mises en contact avec des splénocytes naïfs (du même haplotype que les cellules RenCa), afin d'évaluer si l'expression membranaire de B7-H1 à la surface de cellules tumorales permettaient d'induire la prolifération des lymphocytes. Les résultats observés montrent que les splénocytes naïfs prolifèrent (facteur de stimulation : 12x) en présence de cellules RenCa/Ad-B7-Hl mais pas de cellules RenCa/Ad-vide, indiquant que le vecteur Ad-B7-Hl est fonctionnel in vitro.
7.3 Activité chimiotactique in vitro La fonctionnalité des chimiokines/cytokines exprimées grâce à un vecteur adénoviral a été évaluée sur des monocytes humains. Les résultats observés montrent que les surnageants de cellules A549 infectées avec les vecteurs Ad-huMIP-lβ, Ad-huDC-CKl font migrer de 2,5 et 5 fois plus de monocytes que le surnageant d'infection témoin (Ad vide). Les surnageants d'infection obtenus avec les vecteurs Ad-muIL-12, Ad-huMIP-lα et Ad-huIPlO sont inefficaces dans ce test. De manière surprenante, le surnageant obtenu avec l'Ad-huIL-18 permet la chimioattraction de 13 fois plus de monocytes que le surnageant d'infection témoin. Cette activité chimiotactique de 1TL-18 n'a jamais été rapportée. EXEMPLE 3 : Activité antitumorale in vivo
Dans le but d'améliorer l'efficacité antitumorale des vecteurs MVA-KT3 et MVA- H57 (voir la demande WO 00/24896), ces anticorps ont été co-exprimés avec des cytokines, des chimiokines ou des molécules de costimulation. L'activité antitumorale a été déterminée dans trois modèles souris implantées avec respectivement des tumeurs P815, B 16F 10 et RenCa.
Afin de réduire au maximum l'inflammation induite par l'injection des deux virus, différents protocoles d'immunothérapie ont été évalués. En effet, la co-injection de 2.107 pfu de MVA- vide et 4.108 iu d'Ad-vide à J0, Jl, et J2, élimine la tumeur dans 40 à 50 % des souris traitées. Afin d'évaluer l'efficacité antitumorale que des combinaisons des molécules exprimées, un protocole d'immunothérapie a été établi afin de déterminer les conditions expérimentales pour lesquelles la co-injection des vecteurs vides n'induit pas ou peu de rejet tumoral in vivo. Le protocole établi consiste à injecter une dose de vecteur adénoviral (de 1.10 à 4.10 iu selon les modèles de tumeurs) à J0, Jl et J2 et une dose de vecteur MNA (1.107 ou 2.107 pfu selon les modèles de tumeurs) à J2, J3 et J4. Ce protocole permet de réduire considérablement l'activité antitumorale induite par la co-injection des virus témoins dans les trois modèles de tumeurs. Par exemple, dans le modèle RenCa, le simple changement consistant à injecter d'abord l'adénovirus permet de réduire de 20 à 0 le pourcentage de souris ayant rejeté leur tumeur (comparaison des figures 1 et 2). Les résultats obtenus dans ces stratégies antitumorales combinées sont toujours comparés à ceux obtenus dans les groupes traités avec les virus seuls pour les combinaisons doubles et à ceux obtenus dans les groupes traités avec deux des trois virus pour les combinaisons triples.
1. Effets antitumoraux des doubles combinaisons.
Certaines cytokines (IL-2, IL- 12 et IL- 18) ont été décrites comme des molécules permettant l'activation de cellules effectrices non restreintes par le CMH de type NK ou LAK. L'efficacité antitumorale de ces molécules, pourrait s'ajouter à celle des vecteurs MVA-KT3 et MVA-H57. Dans le modèle P815, la co-injection d'Ad-huIL-2 et de MVA- H57 augmente la survie des animaux de 30 à 45 jours par rapport aux groupes traités avec MNA-H57 ou Ad-huIL-2 seuls et améliore statistiquement la survie des animaux (de 15 à 35-40 % de rejet selon les expériences). Dans le modèle B 16F 10, la combinaison MNA- KT3+Ad-huIL-2, augmente sensiblement (de 10 à 20 %) le nombre de souris ayant rejeté leur tumeur par rapport aux groupes contrôles. Enfin, une forte synergie entre les anticorps anti-TCR/CD3 et les cytokines est observée dans le modèle RenCa (figures 1 et 2). Dans ce modèle, la combinaison de MVA-KT3 avec Ad-mIL-12 augmente le nombre d'animaux guéris par rapport aux groupes traités avec l'un des deux vecteurs. En effet, comme le montre la figure 1 , le taux de survie des animaux traités passe de 60 % après administration de MVA-KT3 seul à 70 % après administration de MVA-KT3 et d'Ad-IL-12. Selon le protocole d'injection utilisé pour l'expérience représentée à la figure 2, le taux de survie des animaux traités passe de 30 % après administration de Ad-IL-12 seul et 40 % après administration de MNA-KT3 seul à 60 % après administration de MVA-KT3 et d'Ad-IL- 12. Cet effet synergique (p<0,005) est reproductible avec d'autres protocoles d'injection. Pour les autres cytokines testées (GM-CSF et IL-18), aucune synergie n'a pu être mise en évidence dans les conditions expérimentales utilisées.
La co-injection de vecteurs adénoviraux exprimant des molécules de costimulation B7-1 et B7-H1, améliore sensiblement l'efficacité antitumorale du vecteur MVA-KT3 dans les modèles RenCa et B 16F 10. En effet, le taux de survie des animaux passe de 60 % après administration de MVA-KT3 à 65 % après administration de MVA KT3 et Ad-huB7-l (figure 1).
Les résultats obtenus montrent que, dans différents modèles de tumeurs murines, la co-injection d'un vecteur adénoviral codant pour 1TL-12 augmente l'effet antitumoral induit par l'expression membranaire in vivo du vecteur MVA-KT3. Cette synergie peut être expliquée par plusieurs mécanismes non-exclusifs. L'apparente efficacité antitumorale de 1TL-12 peut être médiée par les macrophages, les cellules NK (CD3") et/ou les cellules NKT (NK1.1+, CD3+, TCRαβ+, CD4+, CD8", CD28+, Vαl4). Il est envisageable que dans le modèle RenCa, qui est très permissif à une infection adénovirale et qui sécrète probablement des quantités importantes de cytokines, l'effet antitumoral synergique de l'IL- 12 avec le KT3 soit le reflet de l'activation des cellules NK (CD3") par 1TL-12 et des cellules CD3+ (T et NKT) par l'Ac KT3. Dans le modèle B16F10, moins permissif à l'infection adénovirale (faibles quantités de cytokines), l'effet antitumoral de 1TL-12 pourrait être médié par l'activation des cellules NK mais aussi par celle d'un plus grand nombre de cellules NKT due à la diffusion de la cytokine. La surexpression du CMHI et du CD 1 d à la surface de ces différents modèles de tumeurs pourrait également influencer l'importance des cellules NK et NKT dans le processus de rejet tumoral médié par 1TL-12. Enfin, l'activité anti-angiogénique de 1TL-12 médiée par l'induction de la chimiokine IP- 10, pourrait réduire la croissance de la tumeur en inhibant sa néovascularisation. Ceci permettrait aux différents effecteurs immunitaires induits par 1TL-12 et le KT3 sur une tumeur dont la croissance est ralentie.
2. Effets antitumoraux des triples combinaisons.
L'effet antitumoral de triples combinaisons a été évalué en ajoutant un vecteur adénoviral exprimant des chimiokines à ces doubles combinaisons intéressantes. Les vecteurs adénoviraux ont été administrés à JO, Jl, et J2 (1 à 2 x 108 iu vecteur/injection) et le vecteur MVA-KT3 à J2, J3 et J4 (1 à 2 x 107/injection). L'injection des virus Ad- huMIPlα+Ad-huIL-2+MVA-KT3 augmente légèrement la survie (de 15 à 25 %) des animaux dans le modèle P815. Dans le modèle RenCa, les triples combinaisons MVA- KT3/Ad-muIL-12/Ad-huMIPlβ et MVA-KT3/Ad-huIL-2/Ad-huMIPlβ permettent d'induire 100 et 90 % respectivement de survie des souris traitées (Figure 1). Dans ces expériences, une dose de vecteur Ad-huMIP 1 β réduite de moitié par rapport à celle utilisée lors des doubles combinaisons Ad-chimiokine et MVA-KT3 a été utilisée.
Dans le modèle RenCa, le taux de survie des animaux a également été augmenté après administration de la triple combinaison MVA-KT3/Ad-huBRAK/Ad-huIL-2 atteignant 75 %, alors que les taux de survie observés après administration d'Ad-huBRAK et d'Ad-huIL-2, Ad-huIL-2 seul et MVA-KT3 seul sont respectivement de 63 %, 50 % et 20 %. Ainsi, l'utilisation de vecteurs adénoviraux codant pour une chimiokine (MlP-lβ ou BRAK) et pour une cytokine (IL- 12 ou IL-2) en combinaison avec le vecteur MNA- codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme transmembranaire, permet de guérir 75 à 100 % des animaux dans le modèle RenCa (figure 1 et ci-dessus). L'efficacité des triples combinaisons MNA-KT3+Ad-huMIP-lβ+Ad-mIL-12 et MNA-KT3+Ad-huMIPlβ+Ad- huIL-2, pourrait s'expliquer par l'induction d'un mécanisme multiple que nous avons appelé AAD (Attraction Activation and Death). Dans ce modèle, l'injection du vecteur MNA-KT3 induit l'activation des cellules CD3+ (T et ΝKT) et l'infiltration de cellules dendritiques au site tumoral. L'injection des vecteurs adénoviraux Ad-huMIP lβ et Ad-mlL- 12 permet quant à elle, d'attirer et d'activer des cellules ΝK, ΝKT et des macrophages in situ. D'autres combinaisons sont également envisageables.

Claims

REVENDICATIONS
1. Matériel biologique comprenant au moins une première et au moins une seconde séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans une cellule hôte, selon lequel :
- ladite première séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un anticorps, caractérisée en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule,
- ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et dans l'activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper.
2. Matériel biologique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est sous la forme d'ADN ou d'ARN nu.
3. Matériel biologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique et/ou ladite seconde séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur permettant leur transfert.
4. Matériel biologique selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique sont comprises dans des vecteurs indépendants permettant le transfert desdites séquences d'acide nucléique dans ladite cellule hôte.
5. Matériel biologique selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit ou lesdits vecteurs sont des vecteurs viraux.
6. Matériel biologique selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits vecteurs viraux sont des vecteurs adénoviraux, rétroviraux ou poxviraux, notamment dérivés du virus de la vaccine ou de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine.
7. Matériel biologique selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur poxviral dérivé de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine et que ladite seconde séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur adénoviral.
8. Matériel biologique selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que lesdits vecteurs sont complexés ou conjugués à au moins une molécule ou substance porteuse sélectionnée parmi le groupe consistant en un amphiphile cationique, notamment un lipide cationique, un polymère cationique ou neutre, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, îéthanol, la 1-méthyl L-2-pyrrolidone ou leurs dérivés, et un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO), le diéthylsulfoxide, le di-n-propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacétamide, la tetraméthylurée, l'acétonitrile ou leurs dérivés.
9. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique contient un gène codant pour la chaîne lourde d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, fusionnée avec un peptide capable de conférer audit anticorps une localisation transmembranaire.
10. Matériel biologique selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique contient en outre un gène codant pour la chaîne légère d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule.
11. Matériel biologique selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ledit peptide capable de conférer une localisation transmembranaire est isolé d'une glycoprotéine, d'une lipoprotéine ou d'un récepteur membranaire.
12. Matériel biologique selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine est sélectionnée parmi le groupe consistant en la glycoprotéine du virus de la rage, la glycoprotéine F du virus de la rougeole, la gρl60 du virus HIV et le CD4.
13. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule est un récepteur.
14. Matériel biologique selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite cellule effectrice cytotoxique est sélectionnée parmi le groupe consistant en les macrophages, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses (NK), ou leurs cellules dérivées.
15. Matériel biologique selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit récepteur est sélectionné parmi le groupe consistant en tout ou partie du complexe TCR, plus particulièrement le TCR-α, le TCR-β ou le CD3, le CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB, CD47, CD2, CD9, CD45, CD30, CD40, les récepteurs de cytokines, telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, ou GM-CSF, le Vαl4NKT, le KAR, le Kp44 et le récepteur Fc.
16. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'une chimiokine sélectionnée parmi RANTES, MIG, IL-8, MCP- 1 , BRAK, MIP- la, MIP- 1 β et MIP-2.
17. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'une molécule de costimulation sélectionnée parmi B7-1 et B7-H1.
18. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide sécrété de ladite cellule hôte.
19. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une troisième séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.
20. Matériel biologique selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est 1TL-2 ou 1TL-12.
21. Matériel biologique selon la revendication 20, caractérisé en ce que : - ladite première séquence d'acide nucléique code le peptide transmembranaire de la glycoprotéine du virus de la rage, la chaîne lourde et la chaîne légère de l'anticorps KT3, - ladite seconde séquence d'acide nucléique code la chimiokine MIP- 1 β ou BRAK, et - ladite seconde troisième séquence d'acide nucléique code 1TL-2 ou 1TL-12.
22. Cellule hôte comprenant un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 21.
23. Cellule hôte selon la revendication 22, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule de mammifère tumorale, une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène viral ou une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène bactérien.
24. Cellule hôte selon la revendication 22 ou 23, n'exprimant pas naturellement ladite première séquence d'acide nucléique (codant pour un anticorps) sous une forme permettant son administration dans l'organisme d'un mammifère ainsi qu'éventuellement sa culture préalable et ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par introduction :
- d'au moins une dite première séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un anticorps, caractérisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, et
- d'au moins une dite seconde séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide permettant l'activation de la réponse immunitaire et/ou la chimioattraction d'une cellule effectrice cytotoxique et/ou d'un lymphocyte T helper,
- et de manière optionnelle au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.
25. Cellule hôte selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'elle provient du mammifère à traiter.
26. Cellule hôte selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'elle provient d'un autre mammifère que celui à traiter et a subi un traitement la rendant compatible.
27. Procédé de préparation de cellules selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère par tout moyen approprié, lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique et, de manière optionnelle, ladite troisième séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression, puis en ce que l'on sélectionne parmi ces cellules celles génétiquement modifiées par lesdites séquences d'acide nucléique.
28. Utilisation d'un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 21, ou d'une cellule selon l'une des revendications 22 à 26, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de cancers ou d'infections virales.
29. Composition pharmaceutique comprenant un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 21 ou une cellule selon l'une des revendications 22 à 26, avantageusement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
30. Composition pharmaceutique selon la revendication 29, comprenant en outre au moins un composé naturellement responsable de la costimulation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper.
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