CA2435949A1 - Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un matériel biologique comprenant au moins (i) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps, ledit anticorps étant exprimé à la surface de la cellule hôte et capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule et (ii) un acide nucléique codant pout tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper, ledit polypeptide étant sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation. La présente invention concerne également une cellule hôte et une composition pharmaceutique comprenant ledit matériel biologique ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques.

Description

MATERIEL BIOLOGIQUE POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS
PHARMACEUTIQUES DESTINEES AU TRAITEMENT DE MAMMIFERES
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique appliquée à
l'immunothérapie (ou immunothérapie génique) spécifique ou non-spécifique, plus particulièrement dans le cadre du traitement de maladies dont l'agent responsable est un organisme pathogène, tel que notamment un agent bactérien, parasitaire ou viral, ou dans le cadre du traitement du cancer ou de maladies à prion. Plus particulièrement, l'invention concerne un matériel biologique comprenant au moins (i) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps et (ü) un acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou influençant les cellules effectrices cytotoxiques et/ou les lymphocytes T helper. La présente invention concerne également une cellule hôte et une composition comprenant ledit matériel biologique ainsi que leur utilisation à des fins médicales, plus particulièrement thérapeutiques ou prophylactiques.
Depuis longtemps, la thérapie génique a été proposée pour corriger les désordres observés dans le cadre des maladies génétiques. Ces maladies s'expliquent en particulier par un dysfonctionnement de l'expression de gènes spécifiques ou par l'expression de polypeptides mutés non fonctionnels dans au moins un type cellulaire. La thérapie génique consiste à transférer dans le patient à traiter, l'information génétique capable de corriger le défaut observé. Il pourra s'agir, par exemple, du gène codant pour la protéine CFTR dans le cas de la mucoviscidose ou du gène codant pour la dystrophine dans le cas de la myopathie de Duchenne. Dans le cadre de cette approche, l'information génétique est introduite soit in vitro dans une cellule hôte spécifique extraite de l'organe, la cellule modifiée étant ensuite réintroduite dans l'organisme (procédé ex vivo), soit directement in vivo dans ou à proximité du tissu approprié (e.g. organe affecté). De nombreuses publications décrivent la mise en oeuvre de protocoles de thérapie génique afin d'obtenir dans les cellules hôtes l'expression d'une protéine présentant un intérêt par introduction de l'information génétique correspondante.
Toutefois, l'intérêt de ce type d'approche ne se borne pas au traitement des affections purement génétiques et peut également permettre ou contribuer à la réduction ou à l'élimination de tumeurs, de cellules tumorales isolées, d'agents pathogènes, tels que les

2 agents bactériens, parasites ou viraux, ou de cellules infectées par de tels agents pathogènes.
A défaut, un tel traitement permet de retarder la progression des affections indiquées, ou causées par les agents mentionnés ci-dessus.
Dans le cas particulier des cancers, Hellstrom et al. (1969, Adv. Cancer Res.
12, 167-223) ont montré que la défense de l'organisme à l'égard des tumeurs repose tout particulièrement sur la réponse immunitaire mettant en jeu les lymphocytes T, notamment les lymphocytes T cytotoxiques. Toutefois, de nombreux travaux ont montré que la plupart des effecteurs immunitaires, spécifiques ou non, sont inefficaces pour permettre l'élimination ou même l'arrêt de la progression d'une tumeur. Il est par conséquent souhaitable de disposer d'une méthode de stimulation de la réponse immune dirigée contre les tumeurs ou leurs antigènes, et plus particulièrement de la réponse faisant intervenir les lymphocytes cytotoxiques CTL, afm de disposer de méthodes' de prévention ou de traitement des états cancéreux plus efficaces. De manière identique, il a été
montré que le système immunitaire est souvent inefficace dans le cas d'infections, virales notamment, comme (illustre le cas des infections dues au VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine).
La réponse immune dirigée contre un antigène spécifique peut être divisée en deux catégories distinctes : l'une mettant en jeu les anticorps (réponse immune de type humoral), l'autre les cellules effectrices cytotoxiques telles que par exemple les macrophages, les lymphocytes cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses (NK et NKT) ainsi que les lymphocytes T helper, notamment les LTCD4 (réponse immune de type cellulaire).
Plus particulièrement, les deux types de réponse se distinguent en ce que les anticorps reconnaissent les antigènes sous leur forme tridimensionnelle alors que les lymphocytes T, par exemple, reconnaissent des portions peptidiques desdits antigènes, associés à des glycoprotéines codées par les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH), notamment les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I qui sont exprimés de façon ubiquitaire à la surface des cellules ou les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type II qui sont exprimés de façon spécifique à la surface des cellules impliquées dans la présentation des antigènes (APC). Ces éléments fondamentaux de la réponse immune sont bien connus de (homme de l'art.
La réponse immune de type cellulaire est caractérisée en ce que les cellules T
de type CD4+ (cellules T ohelpem), suite à un phénomène d'activation bien connu (pour une

3 revue voir Alberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15, 125-154), produisent des cytokines qui, à leur tour, induisent la prolifération de cellules APC capables de produire cesdites cytokines ; la différenciation cellulaire des lymphocytes B capables de produire des anticorps spécifiques ; et la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Selon un second aspect de la réponse immune cellulaire, les cellules effectrices cytotoxiques telles que par exemple les lymphocytes de type CD8+ (CTL) sont activés a) après interaction avec des peptides antigéniques fixés sur et présentés par les glycoprotéines portées par les cellules ubiquitaires et codées par les gènes appartenant au système CMH I, et b) éventuellement par les cytokines produites par les CD4+. Les CTL ainsi activés sont alors capables de détruire les cellules exprimant ledit peptide antigénique.
Il a été proposé d'adapter les procédés de thérapie génique déjà bien connus et de transférer dans les cellules hôtes, plus particulièrement des cellules cancéreuses, des gènes codant pour des immunostimulateurs (immunothérapie) susceptibles d'induire ou d'activer une réponse immune à médiation cellulaire à l'égard de la tumeur. De nombreuses approches antitumorales ont été décrites à ce jour basées sur l'utilisation de gènes codant pour des cytokines (Colombo et al., 1994, Immunology Today, 15, 48-51), pour des chimiokines, de gènes cytotoxiques conférant une toxicité aux cellules les exprimant, par exemple le gène tk du virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1), d'ami-oncogènes, comme par exemple le gène associé au rétinoblastome ou p53, ou encore de séquences capables d'inhiber l'activité d'un oncogène, tel que par exemple une molécule antisens ou un ribozyme capable de dégrader un ARN messager spécifique d'un oncogène.
Les cytokines sont des molécules naturellement produites à la suite d'une stimulation antigénique ou d'une réaction inflammatoire (Gillis and Williams, 1998, Curr.
Opin. Immunol., 10, 501-503) dont l'utilité dans le cadre du traitement de certains cancers a été montrée notamment par Oettger (1991, Curr. Opin. Immunol., 3, 699-705).
Leroy et al. (1998, Res. Immunol., 149, 681-684) ont décrit que la production de cytokines au site de la tumeur, après administration intra-tumorale de vecteurs viraux recombinants permet l'induction d'une réponse immunitaire associée à une inhibition de la croissance tumorale.
Néanmoins, cette réponse antitumorale bien qu'encourageante ne permet pas la disparition définitive des cellules tumorales et, par conséquent, la mise en muvre d'un traitement antitumoral satisfaisant.

4 Les chimiokines constituent pour leur part une sous classe de la famille des cytokines. Elles se distinguent des autres cytokines par leur propriété chimio-attractive, notamment lors des processus naturels de chimiotactisme, et notamment d'attraction des cellules du système immunitaire vers les tissus dans lesquels siège l'inflammation ou l'infection, elles se distinguent également par leurs propriétés anti-angiogéniques. Les chimiokines sont des protéines de petite taille (de 70 à 80 acides aminés) dont les séquences en acides aminés présentent un faible taux d'homologie (variant de 10 à 70 %
selon les chimiokines considérées). A ce jour, une cinquantaine de chimiokines différentes ont été
identifiées (voir par exemple Zlotnik et Yoshie, 2000, Immunity 12, 121-127 qui décrit la classification des chimiokines et leur rôle respectif dans le mécanisme immunitaire). Quatre familles ont été définies sur la base de la position des résidus cystéines qu'elles renferment.
Les familles oc dont l'extrémité N-terminale comprend 2 cystéines séparées par un acide aminé unique (i.e. les chimiokines de type IL-8, NAP-2, GCP-2) et ~ dont l'extrémité N-terminale comprend 2 cystéines adjacentes (i.e. les chimiokines de type RANTES, MIP-l, MCP1) sont les mieux caractérisées (Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, 159-165 ; Murphy, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 593-633).
Des approches antitumorales utilisant les chimiokines ont déjà été proposées dans l'état de la technique. Ainsi, le groupe de Dilloo et al. (1996, Nature Medicine 2 (10), 1090-1095) a montré que l'administration de fibroblastes modifiés ex vivo à l'aide de vecteurs rétroviraux co-exprimant une chimiokine particulière, la lymphotactine (Lptn), et finterleukine-2 (IL-2), permet de stimuler la réponse immune antitumorale de l'animal traité. Toutefois, cet effet est limité dans le temps, et ne permet qu'un contrôle transitoire du volume tumoral. La demande internationale WO 00/74629 décrit une approche reposant sur l'association d'une chimiokine MIP-1 et d'une cytokine (IL-2 ou IFNy). Les résultats obtenus suite à l'administration infra-tumorale de vecteurs adénoviraux exprimant les deux types de polypeptides mettent en évidence un retard de la prolifération tumorale et une amélioration du taux de survie. Néanmoins, cette réponse antitumorale bien qu'encourageante ne permet pas une rémission complète chez les animaux traités.
Par ailleurs, l'activation des cellules T est déclenchée par l'interaction entre le complexe TCR (ou TCR/CD3) et un peptide antigénique présenté par les CPA dans le contexte du complexe majeur d'histocompatibilité. Il est bien établi que les cellules T

CD4+ naïves requièrent 2 signaux pour l'induction d'une réponse immunitaire efficace un premier faisant intervenir la reconnaissance spécifique du CMH/peptide par le complexe TCR/CD3 et le co-récepteur CD4, et un second dit de costimulation. La costimulation permet d'amplifier et de prolonger l'activation primaire par le TCR, mais également

5 d'inhiber l'apoptose des cellules T après activation. Le TCR est composé de deux unités fonctionnellement distinctes. Un hétérodimère (a,j3 ou y8) spécifique pour chaque lymphocyte est nécessaire à la reconnaissance antigénique. L'engagement du TCR
avec son ligand CD3 initie une cascade de signaux intracellulaires qui résulte dans l'adhésion, la prolifération, la différenciation en cellules matures et l'augmentation de l'activité
transcriptionnelle des gènes de cytokines, des récepteurs aux cytokines et des proto-oncogènes.
Une autre stratégie thérapeutique a également été proposée alliant les avantages de la thérapie génique et la mise en oeuvre d'anticorps spécifiques. La production par génie génétique d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps tels que les anticorps chimères, dans des cellules eucaryotes est maintenant une technique standard (EP
0 120 694 ou EP 0 125 023). Par exemple, la demande de brevet internationale WO
00/24896 décrit une méthode pour le traitement ou la prévention de cancer, reposant sur l'expression à la surface des cellules tumorales d'anticorps spécifiques du complexe TCRlCD3 dans le but d'induire une stimulation des cellules T et de la réponse immunitaire anti-tumorale. Toutefois, les données expérimentales montrent que cette approche est efficace dans le cas de certains modèles de cancer, permettant d'attirer les lymphocytes T
et cellules dendritiques au niveau du site tumoral et ainsi d'induire un rejet de la tumeur greffée, ils montrent également que cette approche ne permet qu'une régression transitoire du volume tumoral et qu'aucune rémission complète chez les animaux traités n'a pu être obtenue.
Il est donc souhaitable de disposer de nouvelles compositions permettant notamment la mise en oeuvre de traitements anti-tumoraux efficaces, aisés à
mettre en place et permettant un contrôle prolongé du volume tumoral et une augmentation du taux de survie des patients traités.
Le déposant a maintenant identifié de nouvelles compositions dont les différents constituants sont choisis de manière à obtenir un effet synergique de leurs activités

6 respectives et des propriétés améliorées desdits constituants. Plus particulièrement, de telles compositions permettent un meilleur recrutement des différents effecteurs de la réponse immunitaire antitumorale (cellules T, NK, dendritiques, macrophages, ...) permettant ainsi d'inhiber ou de retarder la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose (mort cellulaire) des cellules cibles. La présente invention offre une alternative avantageuse et efficace aux approches de l'art antérieur, notamment pour traiter ou prévenir le cancer de l'homme ou de l'animal.
La présente invention concerne en premier lieu un matériel biologique comprenant au moins une première et au moins une seconde séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans une cellule hôte, selon lequel - ladite première séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un anticorps, caractërisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, - ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et dans (activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper. Selon un cas préféré, ledit polypeptide est sélectionné
parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation.
Par «séquence d'acide nucléique», on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille.
Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un ADNc ; un ADN génomique ; un ADN plasmidique ; un ARN messager.
Selon l'invention, ladite «première séquence d'acide nucléique» code notamment tout ou partie d'un anticorps natif, ou pour un dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface de la cellule hôte

7 dans laquelle une dite première séquence d'acide nucléique a été introduite et en ce que ledit anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé
d'activation d'une telle cellule. Plus particulièrement, par «fragment» d'anticorps on entend désigner les fragments F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv (Blazar et al., 1997, J. of Immunology, 159, 5821-5833 ; Bird et al., 1988, Science, 242, 423-426) et dAbs (Ward et al., 1989, Nature, 341, 544) d'un anticorps natif qu'il soit d'origine polyclonale ou monoclonale (voir par exemple Monoclonal Antibodies : A manual of Techniques and Applications H. Zola (CRC
Press, 1988) et Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, J.
Hurrell (CRC Press, 1982)). Par ailleurs, une revue générale des techniques concernant la synthèse de fragments d'anticorps qui retiennent la spécificité de liaison de l'anticorps natif est accessible dans Winter et al. (1991, Nature, 349, 293-299). Par «dérivé»
d'anticorps on entend désigner par exemple un dérivé chimérique d'un tel anticorps (voir par exemple les chimères les anticorps anti CD3 Souris/Homme dans Arakawa et al., 1996, J.
Biochem., 120, 657-662 ou les immunotoxines telles que sFv-toxine de Chaudary et al., 1989, Nature, 339, 394-397).
Par «anticorps exprimé à la surface de la cellule hôte», on entend désigner un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules hôtes pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps utilisés dans le cadre de la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant au moins les acides aminés définissant ladite région fonctionnelle et un peptide capable de conférer à
l'anticorps une localisation transmembranaire dans la cellule hôte. Le terme «localisation transmembranaire » fait référence à un ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule hôte ou à la surface externe de cette bi-couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux peptides transmembranaires sont décrites dans la littérature. Avantageusement, ledit peptide transmembranaire est isolé ou dérive d'une glycoprotéine, d'une lipoprotéine, ou d'un récepteur membranaire. Selon un cas préféré de l'invention, le peptide transmembranaire est isolé d'une glycoprotéine telle que la glycoprotéine F du virus de la rougeole (brevet européen EP 0 305 229), le CD4 (Weijtens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203), la gp160 du virus VIH (Polydefkis et al., 1990,

8 J. Exp. Med., 171, 875-887), le Fc (voir ci-après) et plus particulièrement la glycoprotéine du virus de la rage (demande de brevet français FR 97 09152).
Selon un cas tout à fait avantageux, la première séquence d'acide nucléique contient un gène codant pour la chaîne lourde dudit anticorps fusionnée avec la séquence d'acide nucléique codant pour un peptide transmembranaire tel que défini ci-dessus. En outre, la première séquence d'acide nucléique peut contenir un gène codant pour la chaîne légère dudit anticorps. L'expression des chaînes lourdes et légères peut être contrôlée par des éléments de régulation indépendants mais il est également possible d'avoir recours à
des éléments communs (cassette bicistronique) et éventuellement, de réinitier la traduction du second cistron (par exemple les séquences codant pour la chaîne légère) au moyen d'un IRES (W0 98/49334).
Selon l'invention, l'anticorps exprimé à la surface des cellules hôtes est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, notamment un lymphocyte T helper CD4, et impliqué dans le procédé
d'activation d'une telle cellule, et plus particulièrement à un récepteur directement impliqué
dans un tel procédé. Comme cela est décrit précédemment, ce phénomène d'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper est un élément déterminant de la réaction immunitaire à médiation cellulaire. Toutefois, il convient de remarquer que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, il n'est pas indispensable que le procédé d'activation ait lieu après la fixation par l'anticorps exprimé à la surface des cellules hôtes. En effet, conformément à l'invention, cet anticorps peut également se lier aux polypeptides présents sur des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes helper déjà activés.
Par «cellule effectrice cytotoxique», on entend désigner les macrophages, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses (NK), ainsi que leurs cellules dérivées telles que par exemple les LAK, (Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244-247 ; Brittende et al., 1996, Cancer, 77, 1226-1243 ; Poplack et al., 1976, Blood, 48, 809-816). Par «lymphocyte Thelper», on entend désigner notamment les CD4 qui permettent après activation la sécrétion de facteurs d' activation des cellules effectrices de la réponse immune (voir plus avant). Les polypeptides, et notamment les récepteurs, exprimés à la surface de ces cellules et qui sont impliqués dans l'activation de telles cellules consistent

9 notamment en tout ou partie du complexe TCR, plus particulièrement le TCR-a, le TCR-(3 ou le CD3, tout ou partie des complexes CDB, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28, 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, tout ou partie des récepteurs de cytokines (Finke et al., 1998, Gene Therapy, 5, 31-39), telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 ou GM-CSF, tout ou partie du complexe récepteur des cellules NK tel que par exemple VaI4NKT (Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693), NKAR, Nkp46 (Pessino et al., 1998, J. Exp. Med., 188, 953-960), Nkp44, tout ou partie des récepteurs de macrophages tels que par exemple le récepteur Fc (Deo et al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135).
Selon un mode de réalisation particulier, il est également possible d'envisager de modifier génétiquement, notamment in vivo, les cellules effectrices cytotoxiques ou les lymphocytes T helper de façon à ce qu'elles expriment à leur surface un polypeptide, naturellement non exprimé par ces cellules, et capable d'induire le procédé
d'activation de telles cellules, par l'introduction dans ces cellules de séquences d'acide nucléique renfermant le gène codant pour un tel polypeptide. Conformément à la présente invention, il est alors possible de sélectionner une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps susceptible d'être exprimé à la surface des cellules cibles du patient à traiter, ledit anticorps étant capable de se fixer à un tel polypeptide naturellement non exprimé par ces cellules effectrices cytotoxiques ou lymphocytes T helper.
Plus particulièrement, la présente invention repose sur la possibilité de cloner les gènes codant pour tout ou partie d'un anticorps et d'exprimer ledit anticorps dans des cellules après transfert desdits gènes dans lesdites cellules à partir de vecteurs d'expression conventionnels (voir ci-après). La littérature propose un grand nombre d'exemples de gènes codant pour des anticorps capables de réagir avec de tels polypeptides ou récepteurs. Il est à la portée de l'homme de l'art d'obtenir les séquences d'acide nucléique codant pour de tels anticorps. Citons pour exemple les gènes codant pour les chaînes légère et lourde de l'anticorps YTH 12.5 (anti CD3) (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21, 2717-2725), de l'ami CD3 selon Arakawa et al. (1996, J. Biochem., 120, 657-662). Les séquences d'acide nucléique de tels anticorps sont aisément identifiables à partir des bases de données communément utilisées par l'homme du métier.
A titre illustratif, on peut également citer les hybridomes suivants comme étant particulièrement appropriés pour isoler la première séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus - hybridome TR310 (rat anti-V(37 marin (IgG2b) ; ATCC HB-219 ; I.
L.Weissman ; fusion myélomes murin/splénocytes rat) ;
5 - hybridome H57-597 (hamster anti-TCRa[3 marin (IgG) ; ATCC HB-218 ; I~ubo et al., 1989, J. Immunology, 142, 2736-2742 ; fusion myélomes murin/splénocytes hamster) ;
- hybridome KT3 (rat anti-CD3s, marin (IgG2a) ; Tomonari et al., 1988, Immunogenetics, 28, 455-458 ; fusion myélomes murin/splénocytes rat).

10 Les séquences d'acide nucléique codant pour les chaînes lourdes et/ou légères de ces différents anticorps peuvent être obtenues par les méthodes conventionnelles dans le domaine de l'art, notamment d'amplification (PCR, RT-PCR, ...), de clonage à
l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou les techniques mettant en oeuvre des banques de cADN
(Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C.S.H.
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), à partir d'hybnidomes disponibles auprès de collections habilitées (comme l'ATCC) et qui sécrètent des anticorps spécifiques de polypeptides présents à la surface de cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T
helper et impliqués dans le procédé d'activation de telles cellules (par exemple un hybridome excrétant des immunoglogulines Gy2b+K dirigées contre les récepteurs du TCR ou un de ceux cités ci-dessus). Les séquences ainsi clonées sont alors disponibles pour leur clonage dans des vecteurs. Comme mentionné précédemment, selon un cas préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour la chaîne lourde de l'anticorps est fusionnée avec la séquence d'acide nucléique codant pour un peptide transmembranaire tel que la glycoprotéine rabique. Les techniques de biologie moléculaire sont parfaitement décrites dans la demande de brevet français FR 97 09152).
Dans le cadre de la présente invention, la "seconde séquence d'acide nucléique"
code pour tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit polypeptide est sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation.

11 Au sens de la présente invention, la stimulation de la réponse immunitaire permet d'induire ou d'activer une réponse immune dirigée spécifiquement contre une cellule, notamment tumorale ou une cellule infectée par un virus ou d'inhiber la croissance et/ou la division d'une telle cellule. L'attraction au site d'expression et (activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper peuvent être définies par la capacité
à augmenter la migration des cellules immunitaires vers le site d'expression d'une chimiokine pour développer ou prolonger une réponse immunitaire.
Au sens de la présente invention, le terme « chimiokine » peut être défini comme une cytokine à effet chimioattracteur (capacité à attirer des cellules immunitaires au site d'expression de ladite chimiokine). De preférence, la chimiokine en usage dans le cadre de la présente invention présente une ou plusieurs fonctions complémentaires, notamment l'activation des cellules immunitaires permettant de stimuler la réponse immune et/ou une fonction anti-angiogénique permettant d'inhiber la vascularisation au sein d'une tumeur.
L'activité de chimioattraction d'un polypeptide donné, notamment dérivé de la chimiokine MIP, sur des cellules impliquées dans les réactions immunes (telles que par exemple des eosinophiles, des lymphocytes T, des monocytes ou des neutrophiles) peut être évaluée par un test de chimiotactisme (Maghazachi, 1993, Nature Immunity, 12, 57). De même, ce type de chimiokines inhibant, la prolifération des précurseurs hématopoïétiques, il est possible d'évaluer une telle propriété in vitro selon Graham et al. (1992, Growth Factors, 7, 151).
Au sens de la présente invention, le terme « molécules de co-stimulation »
fait référence à une molécule permettant d'amplifier une réponse immunitaire etlou de prolonger l'état d'activation d'une cellule immune ou impliquée dans une réponse immunitaire, notamment en stabilisant le complexe TCR après la reconnaissance du peptide lié au CMH. L'activité de co-stimulation peut être évaluée par les techniques conventionnelles telles que celles décrites dans la partie exemple de la présente demande (par exemple en mesurant la prolifération de splénocytes naïfs après incorporation de thymidine 3H comme décrit au point 5 de l'exemple 2).
Dans le cadre de la présente invention, il est possible de mettre en oeuvre une seconde séquence d'acide nucléique codant pour l'intégralité dudit polypeptide en question ou une partie seulement de ce polypeptide, ou un polypeptide dérivé ou muté, dans la mesure où la fonction et les propriétés en terme de stimulation de la réponse immunitaire,

12 d'attraction au site d'expression et/ou d'activation des cellules efFectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper sont conservées. Comme mentionné précédemment, le terme « mutation » fait référence à la délétion et/ou la substitution et/ou l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou toute combinaison de ce type de mutation. De même, il est envisageable d'utiliser une séquence codant pour un polypeptide hybride provenant de la fusion de séquences d'origines diverses (par exemple codant pour deux chimiokines différentes).
Parmi les chimiokines utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer RANTES (GenBank M21121), MIG (GenBank M34815), IL-8 (GenBank M28130), MCP-1 (GenBank X14788), BRAK (Frederick et al., 2000, Am. J. Pathol., 156, 1937-50 ;
Sleeman et al., 2000, Int. Immunol., 12, 677-689) et MIP de type 1 (MIP-1) ou 2 (MIP-2).
Une chimiokine préférée est une chimiokine de type MIP-l, et plus particulièrement sélectionnée parmi le groupe consistant en les chimiokines MIP-la et MIP-1(3 dont les propriétés ont été mises en évidence par Wolpe et al. (1988, J. Exp. Med. 167, 570-581).
MIP 1 a est produite par les lymphocytes T et les monocytes. Elle permet la chimioattraction des éosinophiles et des lymphocytes T au cours des infections des voies respiratoires ; des monocytes et des neutrophiles au cours d'arthrites rhumatoïdales, d'inflammations du système digestif ou de méningites d'origine bactérienne. En outre, elle inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Les séquences en nucléotidiques et acides aminés de MIPla sont décrites dans Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894), dont le contenu est incorporé par référence dans la présente demande. MIP-1(3, dont les séquences en nucléotidiques et acides aminés sont décrites dans Brown et al. (1989, J.
Immunol. 142, 679-88, dont le contenu est incorporé par référence dans la présente demande), est également produite par les lymphocytes T et les monocytes. Elle exerce ses propriétés chimioattractives sur les monocytes et les neutrophiles dans les cas arthrites osseuses et les méningites bactériennes. Comme MIP-la, elle inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Il existe des variants naturels desdites protéines MIP-la et MIP-1(3 qui sont connus de l'homme de l'art et qui portent par exemple les noms GOS19, LD78, pAT464 , TYS (de souris) ou SIS a (de souris) pour MIP-la et pAT744, Act-2, G-26, H-400 (de souris) ou hSIS y (de souris) pour MIP-1~3. Dans le cas particulier de MIP-1(3, on choisira de préférence la séquence correspondant à Act-2 (Liges et al., 1988, Proc. Natl.

13 Acad. Sci. USA 85, 9704-9708, dont le contenu est incorporé ici en référence).
Parmi les molécules de co-stimulation utilisables dans le cadre de la présente invention, on préfère mettre en oeuvre celles agissant sur la co-stimulation des cellules T
et, notamment B7-1 (GenBank XM002948) et B7-Hl (GenBank AF177937). La costimulation des cellules T diminue leur apoptose engendrée par le premier signal d'activation (AICD ; Activation-Induced Cell Death), en induisant l'expression de facteurs anti-apoptotiques comme Bcl-2, c-FLIP, Bcl-xL et en réduisant l'activité du complexe apoptotique Fas et de la procaspase-8. Elle permet également de favoriser la différenciation de cellules T activées en cellules mémoires. La présente invention concerne également toute autre molécule permettant ladite co-stimulation des cellules T.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la seconde séquence d'acide nucléique code pour un polypeptide sécrété de la cellule hôte. Les moyens pour obtenir la sécrétion d'un polypeptide hors de la cellule hôte sont connus de l'homme de l'art. On peut notamment mettre en oeuvre un peptide signal qui peut être celui naturellement utilisé par le polypeptide en question (homologue) ou être hétérologue à ce polypeptide et isolé d'une protéine naturellement sécrétée. De nombreux peptides signal fonctionnels dans les cellules eucaryotes et, notamment mammifères, sont divulgués dans l'état de la technique.
Selon une autre variante de la présente invention par ailleurs préférée, le matériel biologique selon la présente invention comprend en outre au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité
cytotoxique.
Par « polypeptide ayant une activité cytotoxique », on entend désigner tout polypeptide capable d'inhiber la croissance et/ou la division d'une cellule hôte, en particulier tumorale (l'activité cytotoxique est alors appelée activité anti-tumorale) ou infectée (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antivirale, parasitaire ou bactérienne selon l'agent pathogène infectant). Selon un cas préféré, l'activité cytotoxique se traduit par la mort de ladite cellule. Selon un cas particulier, il serait également possible d'utiliser le matériel biologique selon la présente invention dans des cas pathologiques associés à une prolifération cellulaire, comme par exemple les phénomènes de restenose.
L'activité cytotoxique d'un polypeptide donné, notamment à l'égard de cellules tumorales, peut être évaluée in vitro par la mesure de la survie cellulaire soit par des tests de viabilité

14 à court terme (tel que par exemple le test au bleu tryptan ou MTT), soit par des tests de survie clonogénique (formation de colonies) (Brown et Wouters, 1999, Cancer Research 59, 1391-1399) ou ira vivo par la mesure de la croissance des tumeurs (taille et/ou volume) dans un modèle animal approprié (Ovejera et Houchens, 1981, Semin. Oncol. 8, 386-393).
Avantageusement, ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est choisi parmi les cytokines, les protéines codées par les gènes suicides et les facteurs protéiques anti-angiogéniques.
Lorsque ledit polypeptide est une cytokine, il s'agit préférentiellement d'une cytokine choisie parmi les interférons a, (3 et y, les interleukines, et notamment l'IL-2, l'IL-4 fIL-6, l'IL-7, l'IL-10, fIL-12, fIL-15, l'IL-18 ou l'IL-21, les facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et les facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF, ...).
Selon un mode de réalisation préféré, ladite cytokine est sélectionnée parmi l'interleukine-2 (IL-2) et l'interleukine-12 (IL-12). L'interleukine-2 est notamment responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, de la multiplication et de l'activation des cellules du système immunitaire (pour la séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09480). L'interleukine-12 a été identifiée et isolée dans les macrophages comme un facteur de stimulation des cellules T cytotoxiques et NK, qui induit la différenciation des lymphocytes T CD4+ en participant à l'homéostasie des populations Thl et Th2. Deux types cellulaires (cellules NK et NKT) sont impliqués dans l'activité
antitumorale médiée par l'IL-12, suivant la dose utilisée ou son schéma d'injection.
Selon la seconde variante, le polypeptide produit d'expression d'un gène suicide présente au moins une activité enzymatique sélectionnée parmi l'activité
thymidine kinase, l'activité purine nucléoside phosphorylase, l'activité guanine ou uracile ou orotate phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase. Ces polypeptides ne sont pas toxiques en tant que tels mais présentent des propriétés enzymatiques catalytiques capables de transformer une substance inactive (prédrogue), par exemple un nucléoside ou un analogue de nucléoside, en substance hautement toxique pour la cellule, par exemple un nucléoside modifié qui peut être incorporé dans les chaînes d'ADN ou d'ARN en élongation, avec pour conséquence, notamment, l'inhibition de la division cellulaire ou des dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort de la cellule renfermant de tels polypeptides. Les gènes codant pour de tels polypeptides sont dits « gènes suicides ». De nombreux couples gène suicide/prëdrogue sont actuellement disponibles. On peut citer plus particulièrement la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 (TK HSV-1) et l'acyclovir ou le ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 90, 7024-7028 ; Culver et al., 1992, Science, 256, 1550-1552 ; Ram et al., 1997, Nat. Med., 3, 5 1354-1361) ; et la cytosine dësaminase (CDase) et la 5-fluorocytosine (5-FC). Les gènes FCYl de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et codA d'E. coli codant respectivement pour la CDase de ces deux organismes sont connus et leurs séquences publiées (EP 0 402 108 ; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6 ; W093/01281). Avantageusement, la CDase est employée de manière associêe à f enzyme uracile phosphoribosyl transférase (LTPRTase) 10 qui a la propriété de convertir le 5-FU produit par l'action de la CDase en hautement toxique. Les gènes upp et FURI codant pour l'UPRTase respectivement d'E.
coli et de S cef°evisiae ont été clonés et séquencés (Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem., 204, 51-56 ; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157). Il est possible d'avoir recours à des mutants de ces produits d'expression de gènes suicides comme ceux décrits dans les

15 demandes de brevet WO96/16183 et W099/54481.
Selon un mode de réalisation préféré, le matériel biologique selon l'invention comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour L'anticorps KT3 exprimé
sous forme transmembranaire et capable de fixer le complexe TCR et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour la chimiokine MIP-1(3. Un autre matériel biologique préféré
comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour l'anticorps KT3 exprimé
sous forme transmembranaire et capable de fixer le complexe TCR et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour la chimiokine BRAK. Selon un cas encore plus préféré, le matériel biologique inclut en outre au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant pour l'IL-2 ou l'IL-12.
Bien entendu, les différentes séquences d'acide nucléique mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans la cellule hôte. De préférence, chaque séquence d'acide nucléique peut être dirigée par des éléments (identiques ou différents, homologues ou hétérologues vis-à-vis de la séquence d'acide nucléique en question, constitutifs ou inductibles) qui lui sont propres mais il est possible d'avoir recours à des éléments communs pour dïriger l'expression de deux, voire des trois, séquences d'acide nucléique mises en oeuvre dans le

16 cadre de la présente invention. Dans ce cas, on peut avoir recours à des séquences fusionnées ou à des IRES pour réinitier la traduction des cistrons.
Par «éléments assurant l'expression», on entend désigner les éléments nécessaires afin d'assurer l'expression de la séquence d'acide nucléique après son transfert dans une cellule cible. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule. Le promoteur utilisé peut être un promoteur viral ou cellulaire, ubiquitaire ou spécifique de tissu ou encore un promoteur synthétique. Bien entendu, il peut être modifié par rapport à la séquence promotrice native afin d'inclure ou déléter un ou plusieurs sites de restriction ou encore déléter des séquences négatives réduisant les niveaux de transcription, etc..
A titre d'exemples, on mentionnera les promoteurs viraux, notamment des virus RSV (Rous Sarcome Virus), SV40 (Simien Virus), CMV (Cytomegalovirus), les promoteurs adénoviraux précoces (Ela, E3, ...) et tardifs (MLP pour Major Late Promoter), les LTRs rétroviraux (comme celui du virus MLV pour Murine Leukemia Virus) et le promoteur TK-HSV-1. Dans le cadre d'un vecteur poxviral, les promoteurs utilisables peuvent être choisis parmi les promoteurs 7.5K, HSR, TK, p28, p1 l, K1L du virus de la vaccine ainsi que les promoteurs hybrides précoces-tardifs et les promoteurs synthétiques (Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23, 1094-1097 ; Hammond et al., 1997, J.
Virological Methods 66, 135-138 ; Kumar et Boyle, 1990, Virology 179, 151-158).
Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices. On peut citer plus particulièrement les promoteurs des gènes MT (métallothionéine ; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), et ceux codant pour l'a-1 antitrypsin, le CFTR, le surfactant pulmonaire, les immunoglobulines, la créatine kinase musculaire, la (3-actin, SRa,, la protéine SM22 (Moessler et al., 1996, Development, 122, 2415-2425) et la desmine (W0 96/26284). On peut également mettre en oeuvre un promoteur activable dans les cellules en division, par exemple gouvernant la transcription des gènes surexprimés dans les cellules tumorales. A cet égard, on mentionnera les promoteurs des gènes codant pour surexprimé dans le cancer du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J.
Clin. Invest. 96, 2775-2782), pour CEA (Carcinome Embryonic Antigen) surexprimé dans le cancer du

17 colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 2738-2748), pour ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancreas (Harns et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175) et pour l'a-foetoprotéine surexprimé dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res., 57, 461-465).
Par ailleurs, les éléments assurant l'expression peuvent également inclure des séquences dites enhancer, LCR (pour Locus Control Region) permettant d'améliorer ou de stabiliser l'expression de la séquence d'acide nucléique dans la cellule hôte ou de conférer une expression tissu-spécifique. Les éléments assurant l'expression desdites séquences d'acide nucléique peuvent également comprendre des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration, pour la transcription ou la traduction. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à
de tels éléments de régulation. De même, les séquences d'acide nucléique utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent comprendre des séquences «neutres» ou introns qui ne nuisent pas à la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction.
De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature (W0 94/29471). Par ailleurs, les acides nucléiques utilisables selon la présente invention peuvent également être des acides nucléiques modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des acides nucléiques stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine, qui en tant que tels n'ont pas d'effet sur l'efficacité
de la transfection.
Lesdites séquences d'acides nucléique peuvent être contrôlées par des éléments identiques ou différents, être situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que leur expression dans la cellule hôte ne soit pas affectée.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le matériel biologique selon l'invention est sous la forme d'ADN ou d'ARN nu, c'est-à-dire libre de tout composé
facilitant son introduction dans les cellules (transfert de séquence d'acide nucléique).
Toutefois, afin de favoriser leur introduction dans les cellules hôtes et ainsi l'obtention de cellules hôtes génétiquement modifiées, lesdites première et seconde (et optionnellement troisième) séquences d'acide nucléique du matériel biologique selon l'invention peuvent être comprises dans au moins un vecteur permettant leur transfert dans la cellule hôte. Comme déjà mentionné, elles peuvent être comprises dans un même vecteur

18 ou, selon un mode de réalisation préféré, dans des vecteurs ïndépendants permettant leur transfert dans la cellule hôte.
Dans ce contexte, selon l'invention, un tel vecteur pourra être un plasmide.
Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement.
Toutefois, il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmïdes dérivés de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de replication assurant (initiation de la replication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNA1 si (on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2533-2542 ; Yates et al., 1985, Nature 313, 812-815).
Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique, ...). Bien entendu, il peut comprendre des élëments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence ce~° qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).
De préférence, les vecteurs mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont des vecteurs viraux, par exemple sélectionnés parmi les vecteurs adénoviraux, rétroviraux, poxviraux, notamment dérivés du virus de la vaccine (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266 and 517-563 ; Johnson et al., 1993, Virol., 196, 381-401), du Modifed Virus Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol., 244, 365-396) ou du canarypox, ou des vecteurs dérivés des virus de l'herpès, alphavirus, foamyvirus ou virus associé à
l'adénovirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif et non intégratif.
Toutefois, il convient de noter ici que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, la nature du vecteur revêt peu d'importance car le transfert n'intervient que pour permettre le transfert des séquences (première, deuxième, voire troisième) d'acides

19 nucléiques à (intérieur des cellules hôtes. De tels modèles de transfert son largement utilisés dans la littérature.
La technologie de base pour insérer une séquence d'acide nucléique et ses éléments de régulation dans un génome poxviral est décrite dans de nombreux documents accessibles à l'homme de l'art (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology, 153, 545-563 US 4,769,330 ; US 4,772,848 ; US 4,603,112 ; US 5,100,587 et US 5,179,993).
Cette technique est basée sur la recombinaison homologue entre les séquences communes présentes dans le génome viral et un plasmide de transfert portant la séquence d'acide nucléique à transférer. Le site d'insertion dans le génome poxviral est de préférence constitué par un locus non essentiel. De tels locus non essentiels résident dans les régions intergéniques non codantes ou au sein d'un gène dont la délétion ou la non fonctionnalité
n'affecte pas ou peu la croissance virale, la réplication ou l'infection. On peut également envisager l'insertion dans un locus essentiel à condition que la fonction touchée soit complémentée en Crans pendant la production des particules virales, au moyen par exemple d'une lignée de complémentation ou d'un virus auxiliaire (helper) portant les séquences codant pour la fonction déficiente. S'agissant d'un virus de la vaccine de la souche Copenhagen, un site d'insertion préféré est localisé au sein du gène thymidine kinase (TK) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3411-3415 ; Weir et al., 1983, J. Virol., 46, 530-537). S'agissant d'un vecteur MVA, l'insertion de la séquence d'acide nucléique se fera au sein d'une des délétions I à VII, et, de préférence, au sein de la délétion II ou III
(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol., 72, 1031-1038 ; Sutter et al., 1994, Vaccine, 12, 1032 1040). Les conditions pour construire un virus de la vaccine recombinant sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple EP 83 286 et EP 206 920 pour le virus de la vaccine, et Mayr et al., 1975, Infection, 3, 6-14 et Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851 pour MVA).
Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un rétrovirus recombinant selon l'invention comporte généralement les séquences LTR, une région d'encapsidation et au moins une des séquences d'acide nucléique en usage dans le cadre de l'invention, placée sous le contrôle du LTR rêtroviral ou d'un promoteur interne tels que ceux décrits ci-après. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, felin, humain, etc.) et en particulier du MoMuLV
(Moloney mucine leukemia virus ; Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol., 241, 29), MVS (Mucine sarcoma virus) ou Friend mucine retrovirus (Fb29 ; WO 95!01447). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en tr°ans les polypeptides viraux gag, po! et/ou 5 env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12, etc.). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTR (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) 10 (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203 et US 5,747,323).
On pourra également avoir recouxs à un vecteur adénoviral. Il peut être non défectif mais de préférence replicatif d'une manière conditionnelle (CRAd ;
Heise et Kirn, 2000, J. Clin. Invest., 105, 847851 ; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 723-727 ; Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther., 11, 2009-2024) ou défectif 15 pour la réplication, c'est-à-dire dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions El, E2, et E4. Une délétion de la région El est préférée. Mais elle peut être combinée à d'autres modification(s)/délétion(s) touchant notamment tout ou partie des régions E2, E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont complémentées en trans au moyen d'une lignée de

20 complémentation et/ou d'un virus auxiliaire afin d'assurer la production des particules virales d'intérêt. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales WO
94/28152 et WO
97/04119). A titre illustratif, la délétion de la majorité de la région E1 et de tout ou partie de (unité de transcription E4 est tout particuliërement avantageuse (EP 974 668). Dans le but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adénoviral peut en outre étre dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle. Selon une autre alternative, on peut mettre en oeuvre un vecteur adénoviral minimal retenant les séquences essentielles à
fencapsidation, à savoir les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d'encapsidation. Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon (invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, mucine, ovine,

21 porcine, simienne, ...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128:171-176 ;
Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70:165-172 ; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60:21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré in vitro dans Eschericlaia coli (E. coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO 96/17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de complémentation (voir par exemple Graham et Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, vol. 7, p 109-128 ; Ed. : E.J. Murey, The Human Press Inc.).
Selon un cas préféré, la première séquence d'acide nucléique est portée par un vecteur poxviral dérivé de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine et la seconde séquence d'acide nucléique est portée par un vecteur adénoviral.
Lorsque le matériel biologique selon l'invention comprend une troisième séquence d'acide nucléique, celle-ci est de préférence portée par un vecteur adénoviral.
' On indique que dans le cadre de la présente invention, le terme « matériel biologique » comprend le vecteur viral (génome recombinant) et les particules virales ~ infectieuses comprenant ledit vecteur viral. Une telle particule virale peut être générée à
partir d'un vecteur viral selon toute technique conventionnelle dans le domaine de fart. Sa propagation est effectuée notamment dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences dudit vecteur. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à une lignée de complémentaion telle que décrite dans la demande WO 94/28152, à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), la lignée A549-E1 (Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84) ou une lignée permettant une double complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783 ;
demande internationale WO 97/04119). On peut également employer des virus auxiliaires pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives. Par cellule de

22 complémentation, on entend une cellule capable de fournir en triais les facteurs précoces et/ou tardifs nécessaires à l'encapsidation du génome viral dans une capside virale pour générer une particule virale contenant le vecteur recombinant. Ladite cellule peut ne pas complémenter à elle seule toutes les fonctions défectives du vecteur et dans ce cas peut être transfectéeltransduite par un vecteur/virus auxiliaire apportant les fonctions complémentaires. Les particules virales contenant des vecteurs poxviraux sont préparées par infection de cellules permissives (par exemple des fibroblastes primaires d'embryons de poulet) selon les techniques de l'art largement détaillées dans les documents cités dans le domaine des poxvirus.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel (i) on introduit un matériel biologique selon l'invention dans une cellule, notamment une cellule de complémentation capable de complémenter esa trais ledit vecteur, de manière à obtenir une dite cellule transfectée, (ü) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également à partir des cellules. LJne des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules (lyse chimique, congélation/décongélation, chocs osmotiques, chocs mécaniques, sonication, etc.), pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de fart (procédé
chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium, ...).
Selon une variante, le vecteur mis en oeuvre selon l'invention peut étre un vecteur non-viral tel que par exemple un vecteur consistant en au moins une dite séquence d'acide nucléique ou un vecteur plasmidique tel que défini ci-dessus, complexé ou conjugué à au moins une molécule ou substance porteuse sélectionnée parmi le groupe consistant en un amphiphile cationique, notamment un lipide cationique, un polymère cationique ou neutre, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, l'éthanol, la 1-méthyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, et un composé
polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO), le

23 diéthylsulfoxide, le di-n-propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacétamide, la tétraméthylurée, l'acétonitrile ou leurs dérivés.
D'une manière générale, les lipides cationiques ont une grande affinité pour les acides nucléiques et ont la capacité d'interagir avec la membrane cellulaire (Felgner et al., 1989, Nature, 337, 387-388). Les lipides cationiques qui conviennent tout particulièrement à la mise en aeuvre de la présente invention comprennent notamment le DOTMA
(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417), le DOGS or TransfectamTM (Behr et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986), le DMRIE or DORIE
(Felgner et al., 1993, Methods, 5, 67-75), le DC-CHOL (Gao and Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), le DOTAPTM (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622), la LipofectamineTM et les composés glycérolipides (voir par exemple EP 901 463 et WO 98137916).
Les polymères qui conviennent à la mise en oeuvre de l'invention sont de préférence cationiques, tels que la polyamidoamine (Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379), les polymères dendritiques (W0 95/24221), le polyéthylène imine ou le polypropylène imine (W0 96/02655), la polylysine (LTS
5,595,897 ou FR 2 719 316), le chitosan (US 5,744,166) ou le DEAE dextran (Lopata et al., 1984, Nucleic Acid Res., 12, 5707-5717).
Par ailleurs, les vecteurs mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peuvent en outre comprendre des éléments de ciblage pouvant permettre de diriger le transfert desdites séquences d'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus particuliers (cellules tumorales, cellules de l'épithélium pulmonaire, cellule hématopoïétique, cellule musculaire, cellule nerveuse, ...). Ils peuvent également permettre de diriger le transfert d'une substance active vers certains compartiments intracellulaires préférés tels que le noyau et les mitochondries. Il peut en outre s'agir d'éléments facilitant la pénétration à l'intérieur de la cellule ou la lyse des endosomes. De tels éléments de ciblage sont largement décrits dans la littérature. Il peut par exemple s'agir de tout ou partie de lectines, de peptides, notamment le peptide JTS-1 (voir demande de brevet WO
94/40958), d'oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogéniques, de peptides de localisation nucléaire,

24 ou d'une combinaison de tels composés. En particulier, il peut s'agir de résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur des asialoglycoprotéines à la surface des cellules hépatiques, de ligands pouvant interagir avec des récepteurs tels que des récepteurs de facteurs de croissance, des récepteurs de cytokines, de lectines, de protéines d'adhésion, il peut également s'agir d'un fragment d'anticorps tel que le fragment Fab, d'un peptide fixsogénique INF-7 dérivé de la sous unité HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plané et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 1291 ~-12924), d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr.
Parmi les cellules de mammifère que l'invention se propose d'éliminer ou de limiter dans leur progression, on peut citer plus spécifiquement les cellules tumorales, les cellules infectées par un agent pathogène viral, parasitaire ou encore bactérien. Selon l'invention, l'expression à la surface de ces cellules de tout ou partie d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule efFectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procëdé d'activation d'une telle cellule, permet de diriger la réponse immune cytotoxique vers une cible donnée, et plus particulièrement de diriger cette réponse au niveau d'une tumeur ou d'un foyer infectieux.
A titre d'agent pathogène viral, on peut par exemple citer le virus VIH, EBV, CMV, les virus de l'hépatite B et C et les papillomavirus. A titre d'agent pathogène parasitaire, on peut par exemple citer Leishmania lesmaniae et Plasmodium falciparum.
L'invention concerne également une cellule hôte comprenant un matériel biologique selon l'invention. Il s'agit de préférence d'une cellule de mammifère tumorale ou d'une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène viral ou d'une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène bactérien.
Avantageusement, la cellule hôte selon l'invention n'exprime pas naturellement ladite première séquence d'acide nucléique (codant pour un anticorps).
Préférentiellement, une dite cellule est présente sous une forme permettant son administration dans l'organisme d'un mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable et ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par introduction - d'au moins une dite première séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un anticorps, caractérisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à
la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué
dans le procédé d'activation d'une telle cellule, et - d'au moins une dite seconde séquence d'acide nucléique codant tout ou partie 5 d'un polypeptide permettant l'activation de la réponse immunitaire et/ou la chimioattraction d'une cellule effectrice cytotoxique et/ou d'un lymphocyte T helper. Selon un cas préféré, ledit polypeptide est sélectionné parmi les chimiokines et les molécules de co-stimulation, et - de manière optionnelle au moins une troisième séquence d'acide nucléique 10 codant tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.
Plus particulièrement, ladite cellule hôte provient soit du mammifère à
traiter, soit d'un autre marrunifère que celui à traiter. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule hôte aura subi un traitement la rendant compatible avec le mammifère à
traiter.
Selon un cas préféré, par «mammifère» on entend désigner un mammifère humain.
1 S Un tel matériel biologique, lorsqu'il est administré à un patient, et plus particulièrement administré par voie intratumorale, est capable d'induire ou stimuler chez celui-ci une réponse immunitaire à médiation cellulaire pouvant conduire à la production de cytokines et à l'effet cytotoxique des cellules effectrices qui se traduisent non seulement par l'élimination des cellules administrées mais également à (élimination des cellules 20 voisines présentant les antigènes, notamment tumoraux, susceptibles d'étre reconnus par lesdites cellules effectrices cytotoxiques activées.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention, caractérisé en ce que l'on introduit par tout moyen approprié
dans une cellule de mammifère lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique telles que décrites

25 ci-dessus, et, de manière optionnelle, ladite troisième séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans ladite cellule hôte, puis en ce que l'on sélectionne parmi ces cellules celles génétiquement modifiées par lesdites séquences d'acide nucléique.
L'invention concerne par ailleurs l'utilisation d'un matériel biologique ou d'une cellule selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de cancers ou d'infections virales. Plus particulièrement,

26 l'invention porte sur la co-utilisation d'une part, d'une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un anticorps exprimé à la surface de ladite cellule cible et capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule et, d'autre part, d'une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide de type chimiokine ou molécule de co-stimulation, impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire ou dans l'attraction au site d'expression et l'activation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper, pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à traiter un mammifère par transfert de gène.
L'invention concerne également l'utilisation desdites première et seconde séquences d'acide nucléique et d'une troisième séquence d'acide nucléique codant pour polypeptide ayant une activité
cytotoxique. Une utilisation préférée concerne (i) un vecteur ou une particule virale MVA
comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'anticorps KT3 exprimé
de manière transmembranaire, (ü) un vecteur ou une particule adénovirale comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour le variant Act-2 de la chimiokine MIP-1 ~3 et (iii) un vecteur ou une particule adénovirale comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'IL-2 ou l'IL-12.
Pour la mise en oeuvre de l'utilisation thérapeutique mentionnée dans la présente invention, il est possible de disposer de compositions pharmaceutiques comprenant un matériel biologique ou une cellule tel que précédemment décrit, avantageusement associé
avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour l'administration à l'homme ou à
l'animal. L'utilisation de tels véhicules est décrite dans la littérature. Ce véhicule pharmaceutiquement acceptable est préférentiellement isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, ladite composition peut contenir des solvants, des véhicules aqueux ou partiellement aqueux tels que de l'eau stérile, libre d'agent pyrogène et des milieux de dispersion par exemple. Le pH de ces compositions pharmaceutiques est convenablement ajusté et tamponné selon les techniques conventionnelles.
Selon une première possibilité, le médicament peut étre administré directement in vivo (par exemple dans une tumeur accessible ou à sa périphérie, par voie intraveineuse, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée). On peut également adopter

27 l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules hôtes au mammifère à
traiter (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, etc.), à les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et à les réadministrer audit mammifère.
Le matériel biologique selon l'invention peut être administré in vivo notamment sous forme injectable, notamment par voie intratumorale. On peut également envisager une injection par voie intratrachéale, intranasale, épidermique, intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intramusculaire, intrapleurale, intrapéritonéale, intracérébrale par seringue ou tout autre moyen équivalent. Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou l'aérosolisation, par voie topique, par administration orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art et applicable à la présente invention.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage les mieux appropriés varient en fonction de différents paramètres tels que par exemple l'individu ou la maladie à traiter, ou encore de l'acide nucléique à transférer ou de l'organeltissus hôte. A
titre indicatif, les compositions à base de particules virales peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 iu (unités infectieuses) ou pfu (particules formant des plages), de préférence 106 à 1012 iu ou pfu et, de manière tout à fait préférée, 107 à
1011 iu ou pfix.
Pour ce qui est des compositions à base de vecteur plasmidique, des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, de 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées.
Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomavirus), de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du larynx, du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie). Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose). Enfin, pour ce qui est des maladies infectieuses, l'application au SIDA, hépatites, cancers induits par les virus (rétrovirus, papillomavirus, etc.) peut être envisagée. Une composition selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives et d'origine infectieuse précitées.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention peut être utilisée en association avec au moins un composé
naturellement responsable de la co-stimulation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper. Selon ce mode de réalisation, on peut envisager d'administrer ladite composition avec un polypeptide de type cytokine ou chimiokine, par exemple l'IL-2 ou l'IL-12.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement et la prévention des maladies par transfert de gène (thérapie génique), caractérisée en ce que l'on administre à un organisme ou à une cellule hôte notamment de mammifère, ayant besoin d'un tel traitement un matériel biologique ou une cellule hôte selon l'invention.
Lorsque la méthode de traitement met en oeuvre un matériel biologique ou une cellule hôte comprenant une troisième séquence d'acide nucléique codant pour un gène cytotoxique de type gène suicide, la méthode de traitement comprend également une étape supplémentaire selon laquelle on administre des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique de la prédrogue agissant en concert avec le gène suicide retenu. S'agissant d'un gène codant pour l'enzyme CDase et/ou UPRTase, on emploie de préférence un analogue de la cytosine tel que la 5-FC. A titre indicatif, une dose de 50 à 500 mg/kg/jour peut être employée avec une préférence pour 200 mglkg/jour. Dans le cadre de la présente invention, la prédrogue est administrée selon les pratiques standards et ceci de manière préalable, concomitante ou encore postérieure à celle de l'agent thérapeutique selon l'invention. La voie orale est préférée. On peut administrer une dose unique de prédrogue ou des doses répétées pendant un temps suffisamment long pour permettre la production du métabolite toxique au sein de l'organisme ou de la cellule hôte.
Selon une mode avantageux de l'invention, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement peut être associée à un second traitement du patient par chirurgie (notamment par ablation de la tumeur partiellement ou totalement), par radiothérapie ou chimiothérapie. Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit second traitement. De manière préférée, ce traitement sera appliqué suite audit second traitement.
Par ailleurs, pour améliorer l'effet anti-tumoral, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement selon l'invention peut être associée à un traitement supplémentaire du patient par des molécules visant à réduire la réponse inflammatoire induite au site tumoral (par exemple un composé vasoactif comme la sérotonine) ou une molécule inhibitrice des formes réactives de l'oxygène (par exemple l'histamine). Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit traitement supplémentaire du patient.
Le contenu de l'état de la technique cité dans la présente demande, y compris les demandes de brevet publiées, les brevets, les publications et les séquences identifiées par un numéro d'accession de banque de données est incorporé par référence dans la présente demande.
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif.
La figure 1 est une représentation schématique des stratégies combinées mettant en oeuvre le vecteur MVA-I~T3 et les vecteurs Ad-cytokines et/ou Ad-chimiokines dans le modèle RenCa. Le protocole d'injection est de 2x108 iu d'adénovirus injectées à J0, J2 et J4 et 2x10' pfu de virions MVA injectés à J2, J3 et J4. Les valeurs statistiques sont calculées entre les 2 courbes reliëes par une accolade (logiciel Statistica 5.1, Mat&Met).
Une valeur p<0,05 est considérée comme statistique.
La figure 2 est une représentation schématique des stratégies combinées mettant en oeuvre le vecteur MVA-I~T3 et les vecteurs Ad-cytokines et/ou Ad-chimiokines dans le modèle RenCa. Le protocole d'injection est de 1x108 iu d'adénovirus injectées à J0, J1 et J2 et 1x107 pfix de virions MVA injectés à J2, J3 et J4. Les valeurs statistiques sont calculées entre les 2 courbes reliées par une accolade (logiciel Statistica 5.1, Mat&Met).
Une valeur p<0,05 est considérée comme statistique.
EXEMPLES
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial.
Les étapes de recombinaison homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ

(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions 5 décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de fAdS telle que divulguée dans la banque de données Genbank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites et cultivées selon les techniques standards bien connues de (homme du métier.
10 I. Modèles tu»aoraux Trois modèles de cellules tumorales ont été choisis afin d'évaluer l'activité
de la composition de l'invention : P815 (mastocytome H-2d, décrite dans Dunn et al, 1957, J.
Natl. Cancer Inst., 18, 587-590), B16F0 (mélanome H-2b, décrite dans Wu et al, 1996, Cancer Res., 56, 21-26) et RENCA (carcinome rénal H-2d, décrite dans Murphy et al, 1973, 15 J. Natl. Cancer Inst., 50, 1013-1025).
Afin d'établir des tumeurs dans des souris, les cellules tumorales P815, ou RENCA sont trypsinées, lavées 3 fois dans du PBS et resuspendues à 3 x 106 celluleslml. 100 ~l de cette suspension cellulaire sont alors injectés dans le flanc droit de souris immunocompétentes B6D2 [(C57BL/6 x DBA/2)F1] âgées de 6-7 semaines.
Après 20 l'apparition d'une tumeur de volume palpable compris entre 5 et 25 mm3, chaque souris reçoit trois injections (100 ~,1) intratumorales d'une quantité définie de virus dans 10 mM
Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2. Chaque condition est évaluée dans des groupes de souris. Le volume tumoral et la survie des souris sont déterminés 2 fois par semaine. Après un rejet primaire, les souris sont réinjectées sur le flanc opposé, avec la même dose de 25 cellules tumorales (3E + 5 cellules/souris).
L'efficacité de la composition de l'invention administrée est contrôlée par la mesure de la taille des tumeurs ainsi que par la mesure du temps de survie des souris traitées avec le cas échéant un contrôle du statut immunologique de l'animal par ELISPOT, test CTL, .... Les animaux peuvent être ensuite soumis à un challenge contre latéral au 30 cours duquel une dose létale de cellules tumorales est administrée à
l'animal pré-traité.

EXEMPLE 1 : Construction et fonctionnalité des vecteurs selon l'invention 1. Construction d'un MVA recombinant porteur de la première séquence nucléotidique codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme membranaire et capable de fixer le complexe TCR/CD3 présent à la surface des cellules T (voir WO
00!24896).
Le clonage des séquences codant pour l'intégralité des chaînes lourdes et légères des anticorps KT3 et H57 est décrit dans la demande internationale WO
00/24896. Les chaînes ainsi isolées sont sous-clonées par recombinaison dans un virus MVA
recombinant renfermant la séquence d'acide nucléique codant pour la région transmembranaire du virus de la rage (Modified Vaccinia Ankara ; Antoine et al, 1998, Virology, 244, 365-396 et demande de brevet français FR 97 09152), afin d'obtenir le virus MVATG14240 exprimant l'anticorps de rat KT3 (anti-CD3 epsilon de rat) et MVATG14237 exprimant l'anticorps de hamster H57-597 (anti TCR alpha/bêta de hamster). Les cassettes d'expression sont introduites dans la délétion II du MVA comme décrit dans la demande WO
00/24896.
Brièvement, la chaîne légère des anticorps est placée sous le contrôle du promoteur early late p7.5 (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266). La séquence codant pour la chaîne lourde est placée sous le contrôle du promoteur early lace pHSR (Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266). L'extrémité C-terminale de la chaîne lourde est fusionnée avec le domaine transmembranaire et intracytoplasmique de la glycoprotéine rabbique afin de permettre l'ancrage de l'anticorps dans la membrane plasmique.
La production des anticorps KT3 et H57 dans les cellules infectées est vérifiée par Western blot et cytométrie de flux. Les résultats observés montrent qu'il y a bien expression d'immunoglobuline de type IgG de rat et de hamster à la surface des cellules infectées (voir exemple 2 de WO 00/24896).
La fonctionnalité des virus MVA exprimant les anticorps anti TCR/CD3 est testée par tests de prolifération sur spénocytes murins. L'expression de l'anticorps KT3 ou H57 à la surface des cellules mucines permet d'induire une forte prolifération de cellules T
naïves (voir exemple 2 de WO 00/24896).
EXEMPLE 2 : Construction et fonctionnalité des adénovirus recombinants 1. Construction des adénovirus recombinants.
Les gènes de chimiokines humaines utilisés ont été reconstitués par assemblage d'oligonucléotides suivant leur séquence publiée dans la base de données du "National Center for Biotechnology Information". Cette stratégie de clonage consiste en (assemblage, en deux étapes, de 8 oligonucléotides d'environ 80 bases chacun. L'ensemble couvre la totalité de la séquence nucléotidique de l'ADNc des gènes MIP-1(3 variant Act-(Accession: J04130, décrit dans la demande WO 00174629, ci-après dénommé MIP-1 (3), IP-10 (N° Accession: X02530), et DC-CKl (N° Accession:
AB000221). Le clonage des gènes codant fIL-18 humaine (N° Accession: 4504652) et B7-Hl humain (N° Accession:
AF 177937) a été réalisé par RT-PCR à partir d'ARN de macrophages humains.
L'IL-18 ne possède pas de séquence signal naturelle et n'est produite à l'état de protéine mature qu'après clivage par la caspase-1. La séquence codant la protéine mature (nucléotides 108-582) a donc été clonée en phase avec le peptide signal BM40 précédemment décrit (Yamaguchi et al., 1999, EMBO J., 18, 4414-1423). La chimiokine BRAN a été
clonée sur la base de la séquence décrite par Frederick et al. (2000, Am. J. Pathol., 156, 1937-50) et Sleeinan et al. (2000, Int. Immunol., 12, 677-689). Ces gènes ont été clonés dans un vecteur de transfert adénoviral.
Les vecteurs de transfert exprimant les gènes de l'IL-2 humaine, des deux sous unités de l'IL-12 mutine (p40 et p35) séparées par un site d'entrée ribosomique (Interne Ribosome Entry Site), le mGM-CSF (séquence leader humaine en phase avec la séquence mutine) et B7-1 mutin ont été construits en insérant dans le vecteur de transfert la séquence clonée sur la base de la séquence publiée.
Le vecteur de transfert est constïtué d'une cassette d'expression contenant les séquences promoteur/enhancer du cytomégalovirus humain (CMV), un intron chimérique (3-globine/IgG humaine et une séquence de polyadénylation du virus SV40. Les séquences flanquantes de la région E1 (fragment 5' nucléotide (nt) 1 à 458 et fragment 3' nt 3328 à
5788) de fadénovirus humain type 5 ont été placées de part et d'autre de cette cassette. Ces séquences permettent de générer un plasmide «infectieux» par recombinaison homologue, avec le génome adénoviral complet ~E1/DE3 contenant le gène candidat, dans E.Goli (Chartier et al., 1996, J. Virol., 70, 4805-4810) Les adénovirus recombinants sont alors produits par transfection d'une digestion Pacf du plasmide « infectieux » dans une lignée de complémentation (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-74) Un adénovirus recombinant ne contenant pas de transgène dans la cassette d'expression (Ad-vide) servira d'adénovirus témoin dans toutes les expériences. La propagation des virions, leur purification et la titration ont été réalisées selon les techniques standards (Lusky et al., 1998, J. Virol., 72, 2022-32). Les virus purifiés sont conservés à -80°C dans 1M sucrose, mM Tris-HCl pH8.5, 1 mM MgCla, 150 mM NaCI, 0,005 % Tween 80.
5 2. Lignées cellulaires et cellules primaires.
Les lignées tumorales murines P815, B 16F0 et B 16F 10 ont été obtenues de fATCC (American Type Culture Collection ; Rockville, MD, USA). Les cellules (N° ATCC: TIB-64) proviennent d'un mastocytome de souris DBA/2 (H2-I~d). Les B 16-F 10, hautement métastatiques, (ATCC, CRL-6475) proviennent d'un mélanome de souris 10 C57BL/6J (H2-Kb). Les cellules RenCa sont issues d'un carcinome rénal murin (BaIB/cCr (H2-I~d)). La lignée tumorale A549 (ATCC, CCL-185) provient d'un carcinome pulmonaire humain. Des monocytes humains sont obtenus par leukaphérèse et élutriation.
Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (Gibco-BRL) complémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (SVF) à 37°C, 5 % CO2. Les cellules microvasculaires dermales humaines (HDMEC) ont été cultivées comme préconisé par le fournisseur (PromoCell, Heidelberg, Allemagne).
3. Analyse de l'expression protéique ih vitro.
La présence des protéines huIL-18, MIP-1(3, a été analysée sur des surnageants de culture de cellules A549 infectées pendant 48 h à une multiplicité d'infection (MOI) de 5.
La quantification des surnageants a été réalisée par immunoessai (Quantikine;
RAD
Systems, Minneapolis, USA). L'expression in vitro des protéines huIP-10, huMIP-lai et huIL-18, a été analysée sur des surnageants de culture de cellules HDMEC
infectées pendant 48 h à une MOI de 50. En effet, les surnageants de HDMEC sont beaucoup moins riches en protéines contaminantes que ceux d'autres lignées cellulaires. La quantification des molécules recombinantes a été estimée sur gel de polyacrylamide 12 % (SDS-PAGE) coloré au bleu de Coomassie (Neuhoff et al., 1988, Electrophoresis, 9, 255-62).
4. Evaluation de la fonctionnalitë in vitro des adénovirus recombinants.
Le test de chimiotactisme dérive de la méthode publiée par Senger et al.
(1983, Science, 219, 983-5) utilisant des chambres de migration de Boyden modifiées.
Les membranes de chambres de migration de 6,5 mm de diamètre (TRANSWELL Corning Costar Corporation, Badhoevedorp, Pays-Bas) contenant des pores de 5 wm sont inversées et recouvertes de collagène (SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) afin d'empêcher le passage des cellules (100 p.g/ml). Après 60 minutes de polymérisation à
température ambiante, les chambres sont rincées dans du PBS. Les membranes sont alors saturées à l'aide d'albumine sérique bovine (BSA ; 100 mg/ml; Sigma Alldrich), incubées durant 60 minutes à température ambiante puis rincées dans du PBS. Les surnageants des cellules infectées sont supplémentés de 10 mg/ml de BSA, sont déposés dans les puits à
raison de 300 ~l/puits et recouverts d'une cupule. 300 p1 d'une suspension de 3 x 105 monocytes humains/ml sont ajoutés dans la partie supérieure de la cupule.
Après 4 heures d'incubation, à 37°C, 5 % CO2, les cupules sont retirées des puits, le surnageant aspiré et la membrane est nettoyée 2 fois au PBS. Elle est ensuite colorée avec une solution de cristal violet 0,2 %, éthanol 2 % pendant 5 minutes, rincée au PBS et le nombre de cellules présentes déterminé au microscope optique.
5. Costimulation par l'expression membranaire de B7-Hl.
La prolifération de splénocytes naïfs induite par la molécule de costimulation 1 S B7H-1 a été évaluée selon la technique décrite dans Dong et al. (1999, Nat. Med, 5, 1365-1369). Brièvement, les cellules RENCA sont infectées à MOI 50 par fAd.huB7H-1 puis traitées pendant 1 heure avec 50 ~g/ml de mitomycine C (SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). Parallèlement, des splénocytes naïfs sont préparés à
partir d'une rate de souris DBA/2 (Paul et al., 1999, Cancer Immunol. Immunother., 48, 22-28).
Après lavage, les cellules tumorales et les splénocytes sont co-cultivés. Les témoins positif et négatif consistent en des splénocytes activés avec 10 pg/ml de ConA ou non stimulés respectivement (R&D Systems, Minneapolis, USA). Après 96 heures à 37°C
et 5 % C02, 1 p.Ci de thymidine tritiée [3H]/puits est ajouté. La quantité de thymidine incorporée est mesurée après 8 heures en précipitant l'ADN cellulaire sur papier filtre glacé
(PHD
harvester, Cambridge Technologie, Plainfield, USA). La radioactivité émise est mesurée à l'aide d'un compteur ~3 (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, USA).
6. Evaluation des stratégies combinatoires in vivo.
Afin d'établir des tumeurs dans des souris, les cellules tumorales P815, ou RENCA sont trypsinées, lavées 3 fois dans du PBS et re-suspendues à 3 x 106 cellules/ml. 100 p1 de cette suspension cellulaire sont alors injectés dans le flanc droit de souris immunocompétentes B6D2 [(C57BL/6 x DBA/2)F1] âgées de 6-7 semaines.
Après l'apparition d'une tumeur de volume palpable compris entre 5 et 25 rnin3, chaque souris reçoit trois injections (100 ~.1) intratumorales d'une quantité définie de virus dans 10 mM
Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2. Chaque condition est évaluée dans des groupes de souris. Le volume tumoral et la survie des souris sont déterminés 2 fois par semaine. Pour 5 des raisons éthiques, les animaux sont sacrifiës lorsque le volume de la tumeur devient supérieur ou égal à 3000 mm3. Après un rejet primaire, les souris sont ré-injectées sur le flanc opposé, avec les cellules tumorales (3 x 105 cellules/souris). Les études statistiques sur les chiffres obtenus permettent de tracer une courbe de survie de type Kaplan-Meier.
La signifiance statistique est calculée en utilisant le test exact de Fisher (Logiciel Statistica 10 5.1-Statsoft Inc., Tulsa, USA).
Résultats.
7. Fonctionnalité des vecteurs adénoviraux in vitro.
7.1 Analyse de l'expression protéique in vitro L'infection de ces cellules par les adénovirus codant les cytokines huIL-2, mIL-12, 15 huIL-18 et mGM-CSF permet d'obtenir des taux de sécrétion compris entre 20 ng et 7 ~,g/ml/106 cellules/48 h. L'analyse sur gel de polyacrylamide de surnageants de HDMEC
récoltés 48 h après infection avec les Ad-huMIP 1 (3, Ad-huIP 10, et Ad-huIL-18 permet de détecter des bandes de la taille attendue (MIP-1 (3 (6,7 kDa) huIP-10 (8,7 kDa) et de huIL-18 (18,2 kDa)).
20 7.2 Costimulatio~a par l'expression membrahaire de B7-HI
La prolifération de splénocytes naïfs syngéniques induite par la molécule membranaire B7-Hl a été évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée. Dans ce but, des cellules RENCA ont été infectées par l'Ad-vide ou l'Ad-B7-Hl pendant 48 h, puis traitées à la mitomycine C afin de stopper leur prolifération. Les cellules infectées ont 25 ensuite été mises en contact avec des splénocytes naïfs (du même haplotype que les cellules RenCa), afin d'évaluer si l'expression membranaire de B7-H1 à la surface de cellules tumorales permettaient d'induire la prolifération des lymphocytes. Les résultats observés montrent que les splénocytes naïfs prolifèrent (facteur de stimulation : 12x) en présence de cellules RenCa/Ad-B7-H1 mais pas de cellules RenCa/Ad-vide, indiquant que le vecteur 30 Ad-B7-H1 est fonctionnel in vite°o.
7.3 Activité clzimiotactiqzce ira vitro La fonctionnalité des chimiokines/cytokines exprimées grâce à un vecteur adénoviral a été évaluée sur des monocytes humains. Les résultats observés montrent que les surnageants de cellules A549 infectées avec les vecteurs Ad-huMIP-1(3, Ad-huDC-CKl font migrer de 2,5 et 5 fois plus de monocytes que le surnageant d'infection témoin (Ad vide). Les surnageants d'infection obtenus avec les vecteurs Ad-muIL-12, Ad-huMIP-la et Ad-huIP 10 sont inefficaces dans ce test. De manière surprenante, le surnageant obtenu avec l'Ad-huIL-18 permet la chimioattraction de 13 fois plus de monocytes que le surnageant d'infection témoin. Cette activité chimiotactique de l'IL-18 n'a jamais été
rapportée.
EXEMPLE 3 : Activité antitumorale iti vivo Dans le but d'améliorer l'efficacité antitumorale des vecteurs MVA-KT3 et MVA
H57 (voir la demande WO 00/24896), ces anticorps ont été co-exprimés avec des cytokines, des chimiokines ou des molécules de costimulation. L'activité antitumorale a été
déterminée dans trois modèles souris implantées avec respectivement des tumeurs P815, B 16F 10 et RenCa.
Afin de réduire au maximum l'inflammation induite par l'injection des deux virus, différents protocoles d'immunothérapie ont été évalués. En effet, la co-injection de 2.107 pfu de MVA-vide et 4.108 iu d'Ad-vide à J0, Jl, et J2, élimine la tumeur dans 40 à 50 des souris traitées. Afin d'évaluer l'efficacité antitumorale que des combinaisons des molécules exprimées, un protocole d'immunothérapie a été établi afin de déterminer les conditions expérimentales pour lesquelles la co-injection des vecteurs vides n'induit pas ou peu de rejet tumoral in vivo. Le protocole établi consiste à injecter une dose de vecteur adénoviral (de 1.10$ à 4.108 iu selon les modèles de tumeurs) à J0, J1 et J2 et une dose de vecteur MVA (1.107 ou 2.10' pfu selon les modèles de tumeurs) à J2, J3 et J4.
Ce protocole permet de réduire considérablement l'activité antitumorale induite par la co-injection des virus témoins dans les trois modèles de tumeurs. Par exemple, dans le modèle RenCa, le simple changement consistant à injecter d'abord l'adénovirus permet de réduire de 20 à 0 le pourcentage de souris ayant rejeté leur tumeur (comparaison des figures 1 et 2). Les résultats obtenus dans ces stratégies antitumorales combinées sont toujours comparés à
ceux obtenus dans les groupes traités avec les virus seuls pour les combinaisons doubles et à ceux obtenus dans les groupes traités avec deux des trois virus pour les combinaisons triples.
1. Effets antitumoraux des doubles combinaisons.
Certaines cytokines (IL-2, IL-12 et IL-18) ont été décrites comme des molécules permettant l'activation de cellules effectrices non restreintes par le CMH de type NK ou LAK. L'efficacité antitumorale de ces molécules, pourrait s'ajouter à celle des vecteurs MVA-KT3 et MVA-H57. Dans le modèle P815, la co-injection d'Ad-huIL-2 et de MVA-H57 augmente la survie des animaux de 30 à 45 jours par rapport aux groupes traités avec MVA-H57 ou Ad-huIL-2 seuls et améliore statistiquement la survie des animaux (de 15 à
35-40 % de rejet selon les expériences). Dans le modèle B16F10, la combinaison MVA-KT3+Ad-hulL-2, augmente sensiblement (de 10 à 20 %) le nombre de souris ayant rejeté
leur tumeur par rapport aux groupes contrôles. Enfin, une forte synergie entre les anticorps anti-TCR/CD3 et les cytokines est observée dans le modèle RenCa (figures 1 et 2). Dans ce modèle, la combinaison de MVA-KT3 avec Ad-mIL-12 augmente le nombre d'animaux guéris par rapport aux groupes traités avec l'un des deux vecteurs. En effet, comme le montre la figure 1, le taux de survie des animaux traités passe de 60 % après administration de MVA-KT3 seul à 70 % après administration de MVA-KT3 et d'Ad-IL-12. Selon le protocole d'injection utilisé pour l'expérience représentée à la figure 2, le taux de survie des animaux traités passe de 30 °lo après administration de Ad-IL-12 seul et 40 % après administration de MVA-KT3 seul à 60 % après administration de MVA-KT3 et d'Ad-IL-12. Cet effet synergique (p<0,005) est reproductible avec d'autres protocoles d'injection.
Pour les autres cytokines testées (GM-CSF et IL-18), aucune synergie n'a pu être mise en évidence dans les conditions expérimentales utilisées.
La co-injection de vecteurs adénoviraux exprimant des molécules de costimulation B7-1 et B7-H1, améliore sensiblement l'efficacité antitumorale du vecteur MVA-KT3 dans les modèles RenCa et B 16F 10. En effet, le taux de survie des animaux passe de 60 % après administration de MVA-KT3 à 65 % après administration de MVA KT3 et Ad-huB7-1 (figure 1 ).
Les résultats obtenus montrent que, dans différents modèles de tumeurs murines, la co-injection d'un vecteur adénoviral codant pour l'IL-12 augmente l'effet antitumoral induit par l'expression membranaire in vivo du vecteur MVA-KT3. Cette synergie peut être expliquée par plusieurs mécanismes non-exclusifs. L'apparente efficacité
antitumorale de l'IL-12 peut être médiëe par les macrophages, les cellules NK (CD3-) et/ou les cellules NKT (NK1.1+, CD3+, TCRa[3+, CD4+, CD8-, CD28+, Val4). Il est envisageable que dans le modèle RenCa, qui est très permissif à une infection adénovirale et qui sécrète probablement des quantités importantes de cytokines, l'effet antitumoral synergique de fIL-12 avec le KT3 soit le reflet de l'activation des cellules NK (CD3-) par l'IL-12 et des cellules CD3+ (T et NKT) par l'Ac KT3. Dans le modèle B16F10, moins permissif à
l'infection adénovirale (faibles quantités de cytokines), l'effet antitumoral de l'IL-12 pourrait être médié par l'activation des cellules NK mais aussi par celle d'un plus grand nombre de cellules NKT due à la diffusion de la cytokine. La surexpression du CMHI et du CD 1 d à la surface de ces différents modèles de tumeurs pourrait également influencer l'importance des cellules NK et NKT dans le processus de rejet tumoral médié
par l'IL-12.
Enfin, l'activité anti-angiogénique de l'IL-12 médiée par l'induction de la chimiokine IP
10, pourrait réduire la croissance de la tumeur en inhibant sa néovascularisation. Ceci permettrait aux différents effecteurs immunitaires induits par l'IL-12 et le KT3 sur une tumeur dont la croissance est ralentie.
2. Effets antitumoraux des triples combinaisons.
L'effet antitumoral de triples combinaisons a été évalué en ajoutant un vecteur adénoviral exprimant des chimiokines à ces doubles combinaisons intéressantes:
Les vecteurs adénoviraux ont été administrés à J0, Jl, et J2 (1 à 2 x 108 iu/vecteur/injection) et le vecteur MVA-KT3 à J2, J3 et J4 (1 à 2 x 107/injection). L'injection des virus Ad-huMIPla+Ad-huIL-2+MVA-KT3 augmente légèrement la survie (de 15 à 25 %) des animaux dans le modèle P815. Dans le modèle RenCa, les triples combinaisons MVA-KT3/Ad-muIL-12/Ad-huMIPl(3 et MVA-KT3/Ad-huIL-2/Ad-huMIPI(3 permettent d'induire 100 et 90 % respectivement de survie des souris traitées (Figure 1).
Dans ces expériences, une dose de vecteur Ad-huMIP 1 [3 réduite de moitié par rapport à
celle utilisée lors des doubles combinaisons Ad-chimiokine et MVA-KT3 a été utilisée.
Dans le modèle RenCa, le taux de survie des animaux a également été augmenté
après administration de la triple combinaison MVA-KT3/Ad-huBRAK/Ad-huIL-2 atteignant 75 %, alors que les taux de survie observés après administration d'Ad-huBRAK
et d'Ad-huIL-2, Ad-hulL-2 seul et MVA-KT3 seul sont respectivement de 63 %, 50 % et 20 %.

Ainsi, l'utilisation de vecteurs adénoviraux codant pour une chimiokine (MIP-1 (3 ou BRAK) et pour une cytokine (IL-12 ou IL-2) en combinaison avec le vecteur MVA-codant pour l'anticorps KT3 exprimé sous forme transmembranaire, permet de guérir 75 à 100 % des animaux dans le modèle RenCa (figure 1 et ci-dessus). L'efficacité
des triples combinaisons MVA-KT3+Ad-huMIP-lj3+Ad-mIL-12 et MVA-KT3+Ad-huMIPl(3+Ad-huIL-2, pourrait s'expliquer par l'induction d'un mécanisme multiple que nous avons appelé AAD (Attraction Activation and Death). Dans ce modèle, l'injection du vecteur MVA-KT3 induit l'activation des cellules CD3~ (T et NKT) et L'infiltration de cellules dendritiques au site tumoral. L'inj action des vecteurs adénoviraux Ad-huMIP 1 (3 et Ad-mIL-12 permet quant à elle, d'attirer et d'activer des cellules NK, NKT et des macrophages in situ. D'autres combinaisons sont également envisageables.

Claims (30)

REVENDICATIONS

1. Matériel biologique comprenant au moins une première et au moins une seconde séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression dans une cellule hôte, selon lequel :
- ladite première séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un anticorps, caractérisée en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule, - ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide impliqué dans la stimulation de la réponse immunitaire et/ou dans l'attraction au site d'expression et dans l'activation des cellules effectrices cytotoxiques et/ou de lymphocytes T helper.

2. Matériel biologique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous la forme d'ADN ou d'ARN nu.

3. Matériel biologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique et/ou ladite seconde séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur permettant leur transfert.

4. Matériel biologique selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique sont comprises dans des vecteurs indépendants permettant le transfert desdites séquences d'acide nucléique dans ladite cellule hôte.

5. Matériel biologique selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit ou lesdits vecteurs sont des vecteurs viraux.

6. Matériel biologique selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits vecteurs viraux sont des vecteurs adénoviraux, rétroviraux ou poxviraux, notamment dérivés du virus de la vaccine ou de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine.

7. Matériel biologique selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur poxviral dérivé de la souche Modifed Virus Ankara (MVA) du virus de la vaccine et que ladite seconde séquence d'acide nucléique est comprise dans un vecteur adénoviral.

8. Matériel biologique selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que lesdits vecteurs sont complexés ou conjugués à au moins une molécule ou substance porteuse sélectionnée parmi le groupe consistant en un amphiphile cationique, notamment un lipide cationique, un polymère cationique ou neutre, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, l'éthanol, la 1-méthyl L-2-pyrrolidone ou leurs dérivés, et un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO), le diéthylsulfoxide, le di-n-propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacétamide, la tetraméthylurée, l'acétonitrile ou leurs dérivés.

9. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique contient un gène codant pour la chaîne lourde d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, et impliqué dans le procédé
d'activation d'une telle cellule, fusionnée avec un peptide capable de conférer audit anticorps une localisation transmembranaire.

10. Matériel biologique selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première séquence d'acide nucléique contient en outre un gène codant pour la chaîne légère d'un anticorps capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, et impliqué dans le procédé
d'activation d'une telle cellule.

11. Matériel biologique selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ledit peptide capable de conférer une localisation transmembranaire est isolé
d'une glycoprotéine, d'une lipoprotéine ou d'un récepteur membranaire.

12. Matériel biologique selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine est sélectionnée parmi le groupe consistant en la glycoprotéine du virus de la rage, la glycoprotéine F du virus de la rougeole, la gp 160 du virus HIV et le CD4.

13. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule est un récepteur.

14. Matériel biologique selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite cellule effectrice cytotoxique est sélectionnée parmi le groupe consistant en les macrophages, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses (NK), ou leurs cellules dérivées.

15. Matériel biologique selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit récepteur est sélectionné parmi le groupe consistant en tout ou partie du complexe TCR, plus particulièrement le TCR-.alpha., le TCR-.beta. ou le CD3, le CDB, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB, CD47, CD2, CD9, CD45, CD30, CD40, les récepteurs de cytokines, telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, ou GM-CSF, le V.alpha.14NKT, le NKAR, le NKp44 et le récepteur Fc.

16. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'une chimiokine sélectionnée parmi RANTES, MIG, IL-8, MCP-1, BRAK, MIP-1.alpha., MIP-1.beta.
et MIP-2.

17. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'une molécule de co-stimulation sélectionnée parmi B7-1 et B7-H1.

18. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ladite seconde séquence d'acide nucléique code tout ou partie d'un polypeptide secrété
de ladite cellule hôte.

19. Matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une troisième séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.

20. Matériel biologique selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est l'IL-2 ou l'IL-12.

21. Matériel biologique selon la revendication 20, caractérisé en ce que :
- ladite première séquence d'acide nucléique code le peptide transmembranaire de la glycoprotéine du virus de la rage, la chaîne lourde et la chaîne légère de l'anticorps KT3, - ladite seconde séquence d'acide nucléique code la chimiokine MIP-1.beta. ou BRAK, et - ladite seconde troisième séquence d'acide nucléique code l'IL-2 ou l'IL-12.

22. Cellule hôte comprenant un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 21.

23. Cellule hôte selon la revendication 22, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule de mammifère tumorale, une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène viral ou une cellule de mammifère infectée par un agent pathogène bactérien.

24. Cellule hôte selon la revendication 22 ou 23, n'exprimant pas naturellement ladite première séquence d'acide nucléique (codant pour un anticorps) sous une forme permettant son administration dans l'organisme d'un mammifère ainsi qu'éventuellement sa culture préalable et ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par introduction :
- d'au moins une dite première séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un anticorps, caractérisé en ce que lorsque ce dit anticorps ou cette dite partie d'anticorps est exprimé, il est localisé à la surface de ladite cellule hôte et en ce que ledit anticorps ou ladite partie d'anticorps est capable de se fixer à un polypeptide présent à
la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T helper, ledit polypeptide étant impliqué
dans le procédé d'activation d'une telle cellule, et - d'au moins une dite seconde séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide permettant l'activation de la réponse immunitaire et/ou la chimioattraction d'une cellule effectrice cytotoxique et/ou d'un lymphocyte T helper, - et de manière optionnelle au moins une troisième séquence d'acide nucléique codant tout ou partie d'un polypeptide ayant une activité cytotoxique.

25. Cellule hôte selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'elle provient du mammifère à traiter.

26. Cellule hôte selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'elle provient d'un autre mammifère que celui à traiter et a subi un traitement la rendant compatible.

27. Procédé de préparation de cellules selon la revendication 24, caractérisé
en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère par tout moyen approprié, lesdites première et seconde séquences d'acide nucléique et, de manière optionnelle, ladite troisième séquence d'acide nucléique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments assurant leur expression, puis en ce que l'on sélectionne parmi ces cellules celles génétiquement modifiées par lesdites séquences d'acide nucléique.

28. Utilisation d'un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à
21, ou d'une cellule selon l'une des revendications 22 à 26, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention de cancers ou d'infections virales.

29. Composition pharmaceutique comprenant un matériel biologique selon l'une des revendications 1 à 21 ou une cellule selon l'une des revendications 22 à
26, avantageusement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

30. Composition pharmaceutique selon la revendication 29, comprenant en outre au moins un composé naturellement responsable de la costimulation des cellules effectrices cytotoxiques ou de lymphocytes T helper.